WO2021100642A1 - 改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、タンパク質の製造方法 - Google Patents

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cyanobacteria
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征司 児島
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present disclosure relates to modified cyanobacteria having improved secretory productivity of proteins that secrete proteins produced in the cells to the outside of the cells, methods for producing modified cyanobacteria, and methods for producing proteins.
  • a substance production method that does not depend on fossil fuels and has a low environmental load is required in a wide range of industrial fields from the chemical industry to the agriculture, fishery and livestock industry. Since substance production using microorganisms can be performed in an environment of normal temperature and pressure, and a wide range of compound species can be produced with the development of genetic engineering technology in recent years, it is a production system that meets the above requirements. Attention has been paid. Among them, photosynthetic microorganisms such as cyanobacteria and algae can use carbon dioxide (CO 2 ) in the air as a raw material by using light as an energy source, and therefore, they are particularly expected as a carbon-neutral next-generation substance production system. ing.
  • CO 2 carbon dioxide
  • Non-Patent Document 1 As substances produced using cyanobacteria, ethanol (Non-Patent Document 1), isobutanol (Non-Patent Document 2), alkans (Patent Document 1), fatty acids (Patent Document 2), and proteins (Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 3 As substances produced using cyanobacteria, ethanol (Non-Patent Document 1), isobutanol (Non-Patent Document 2), alkans (Patent Document 1), fatty acids (Patent Document 2), and proteins (Non-Patent Document 2). Patent Document 3) and the like have been reported.
  • Non-Patent Document 4 discloses a method for expressing a protein in cyanobacteria.
  • the present disclosure provides a modified cyanobacteria having improved secretory productivity of a protein, a method for producing a modified cyanobacteria, and a method for producing a protein using the modified cyanobacteria.
  • the modified cyanobacteria according to one aspect of the present disclosure express a channel protein that improves protein permeability of the outer membrane.
  • modified cyanobacteria of the present disclosure and the method for producing modified cyanobacteria, it is possible to provide modified cyanobacteria having improved protein secretion productivity. Further, according to the method for producing a protein of the present disclosure, a protein can be efficiently produced.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria.
  • Cyanobacteria also called blue-green bacteria or blue-green algae
  • Cyanobacteria are a group of eubacteria, which decompose water by photosynthesis to produce oxygen and fix CO 2 in the air with the obtained energy.
  • air nitrogen (N 2 ) can also be fixed.
  • cyanobacteria grow quickly and have high light utilization efficiency, and in addition, genetic manipulation is easier than other algae species. Therefore, regarding the utilization of cyanobacteria among photosynthetic microorganisms. Active research and development is taking place.
  • Non-Patent Document 1 examples of substance production using cyanobacteria include ethanol (Non-Patent Document 1), isobutanol (Non-Patent Document 2), alcans (Patent Document 1), fatty acids (Patent Document 2), and the like. Fuel production has been reported.
  • Non-Patent Document 3 describes a method for producing a protein using the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803.
  • the document discloses a promoter base sequence for activating transcription of an ethylene synthase gene with high efficiency and a ribosome binding sequence for enhancing translation.
  • Non-Patent Document 4 discloses a method of inserting a gene encoding a protein into the NS-pCC2 region on a plasmid held by this strain when expressing a recombinant protein using the Synechocsis sp. PCC 6803 strain as a host. Has been done. It has been reported that by using this method, the expression efficiency of the recombinant protein is improved about 14 times as compared with the case where the gene is inserted on the chromosomal DNA (deoxyribonucleic acid).
  • the present inventor has found that the protein permeability of the outer membrane is improved by expressing the outer membrane channel protein derived from the chloroplast of the plant in the outer membrane of cyanobacteria. It has been found that this increases the amount of protein secreted and produced per cyanobacterial culture medium or per cell.
  • the present disclosure it is possible to provide a modified cyanobacteria having improved protein secretion productivity. Further, by culturing the modified cyanobacteria of the present disclosure, a protein can be efficiently produced.
  • the modified cyanobacteria according to one aspect of the present disclosure express a channel protein that improves protein permeability of the outer membrane.
  • the channel protein is CppS consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, CppF consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or any one of these. It may be a protein having an amino acid sequence of 50% or more identical to that of the channel protein.
  • the modified cyanobacteria have the same function as CppS (SEQ ID NO: 1) or CppF (SEQ ID NO: 2), which is a channel protein that improves the protein permeability of the outer membrane, or any of these channel proteins.
  • the protein is expressed. Therefore, according to the modified cyanobacteria according to one aspect of the present disclosure, the protein permeability of the outer membrane is improved.
  • a gene encoding the channel protein may be introduced.
  • the modified cyanobacteria As a result, channel proteins that improve the protein permeability of the outer membrane are expressed. Therefore, according to the modified cyanobacteria according to one aspect of the present disclosure, it is possible to provide cyanobacteria having improved protein secretion productivity because the protein permeability of the outer membrane is improved.
  • the gene may be a gene derived from chloroplasts.
  • the gene is cppS consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, cppF consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, or any of these genes. It may be a gene whose base sequence is 50% or more identical to that of the gene.
  • the modified cyanobacteria As a result, in the modified cyanobacteria, a gene encoding any of the channel proteins shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 above, or a gene that is 50% or more identical to the base sequence of any of these genes is introduced. To. Therefore, in the modified cyanobacteria, a protein having a function of improving protein permeability in the outer membrane or a protein having a function equivalent to the protein is expressed. Therefore, in the modified cyanobacteria according to one aspect of the present disclosure, the protein permeability of the outer membrane is improved.
  • the method for producing modified cyanobacteria includes a step of expressing a channel protein that improves protein permeability of the outer membrane.
  • modified cyanobacteria having improved protein permeability of the outer membrane can be produced.
  • the method for producing a protein according to one aspect of the present disclosure includes a step of culturing any of the above-mentioned modified cyanobacteria.
  • the protein produced in the cells (also called cells) of the modified cyanobacteria is secreted outside the cells (that is, in the culture medium), so that the protein secreted in the culture medium can be recovered. it can. Therefore, it is not necessary to collect and crush the cells to recover the protein.
  • the cells can be used repeatedly even after the protein is recovered.
  • no special nutrition is required for culturing the modified cyanobacteria, and the modified cyanobacteria can be easily cultivated only by giving light, water, air, and a trace amount of inorganic substances. Therefore, according to the protein production method according to one aspect of the present disclosure, the protein can be efficiently produced.
  • each figure is not necessarily exactly illustrated.
  • substantially the same configuration is designated by the same reference numerals, and duplicate description may be omitted or simplified.
  • the numerical range does not only represent a strict meaning, but also includes measuring a substantially equivalent range, for example, the amount of protein (for example, number or concentration, etc.) or the range thereof.
  • both the bacterial cell and the cell represent one cyanobacterial individual.
  • the identity of the base sequence and the amino acid sequence is calculated by the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algorithm. Specifically, it is calculated by performing pairwise analysis with the BLAST program available on the website of NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). To. Information on genes and proteins of cyanobacteria and plants is published, for example, in the NCBI database described above and Cyanobase (http://genome.microbedb.jp/cyanobase/). From these databases, the amino acid sequence of the protein of interest and the base sequence of the gene encoding those proteins can be obtained.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Cyanobacteria also called cyanobacteria or cyanobacteria, are a group of prokaryotes that collect light energy with chlorophyll and electrolyze water with the obtained energy to generate oxygen while photosynthesizing. Cyanobacteria are rich in diversity, for example, in cell shape, there are unicellular species such as Synechocysis sp. PCC 6803 and multicellular filamentous species such as Anabaena sp. PCC 7120. Regarding the habitat, there are thermophilic species such as Thermosynechococcus elongatus, marine species such as Synechococcus elongatus, and freshwater species such as Synechocystis.
  • Microcystis aeruginosa a species that has gas vesicles and produces toxins
  • Gloeobacter violaceus which has a protein called phycobilisome that is a focusing antenna on the plasma membrane without thylakoids. There are many species that have.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the cell surface layer of cyanobacteria.
  • the cell surface layer of cyanobacteria is composed of a plasma membrane (also referred to as inner membrane 1), peptidoglycan 2, and an outer membrane 5, which is a lipid membrane forming the outermost layer of cells, in this order from the inside.
  • a sugar chain 3 composed of glucosamine, mannosamine, and the like is covalently bound to peptidoglycan 2, and pyruvic acid is bound to these covalently bound sugar chains 3.
  • the peptidoglycan 2 and the covalently bound sugar chain 3 are collectively referred to as a cell wall 4.
  • the outer membrane 5 covers the cell wall 4 by binding the sugar chain 3 of the cell wall 4 to the binding domain 7 of the ion channel protein 6 described later.
  • the gap between the plasma membrane (that is, the inner membrane 1) and the outer membrane 5 is called periplasm, and is called periplasm, which decomposes proteins or forms a three-dimensional structure, decomposes lipids or nucleic acids, or takes up extracellular nutrients.
  • periplasm which decomposes proteins or forms a three-dimensional structure, decomposes lipids or nucleic acids, or takes up extracellular nutrients.
  • a channel protein is a membrane protein that forms a pathway (that is, a channel) for selectively permeating a predetermined substance from the inside to the outside or from the outside to the inside of a lipid membrane (for example, outer membrane 5).
  • the outer membrane of common heterotrophic Gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Salmonella, selectively permeates relatively low-molecular-weight nutrients such as sugars and amino acids from the outside to the inside of the outer membrane into cells.
  • Porin for uptake Non-Patent Document 5: Nikaido, 2003, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67 (4): 593-656).
  • Porin does not exist in the outer membrane 5 of cyanobacteria, and instead, a large amount of ion channel protein 6 that selectively permeates only inorganic ions is present in the outer membrane 5.
  • the ion channel protein 6 accounts for about 80% of the total protein of the outer membrane 5 (Non-Patent Document 6: Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199 (19): e00371-17). Therefore, in cyanobacteria, unless the properties of the outer membrane 5 are significantly modified by using a technique such as gene transfer, a high molecular weight substance such as a protein permeates the outer membrane 5 and is extracellular (that is, the outer membrane 5). It is difficult to spread to (outside).
  • the chloroplasts of plants originated from cyanobacteria that coexisted in the cells of primitive eukaryotic cells about 1.5 to 2 billion years ago, and were transformed into chloroplasts by subsequent evolution (Non-Patent Documents). 7: Ponce-Toledo et al., 2017, Curr. Biol., 27 (3): 386-391).
  • the chloroplasts carried by gray algae, which are the most primitive plants of unicellular algae, have peptidoglycan and retain a surface structure similar to that of cyanobacteria.
  • peptidoglycan does not exist in the chloroplasts of seed plants that have evolved more than unicellular algae.
  • the above-mentioned chloroplast outer membrane protein of Glaucophyte is significantly different from the composition of the outer membrane protein of cyanobacteria.
  • the outer membrane 5 of cyanobacteria contains a large amount of ion channel protein 6 that allows an inorganic substance such as Slr1841 to permeate.
  • the ion channel protein 6 accounts for about 80% of the total protein in the outer membrane 5.
  • the outer membrane of the chloroplast of Glaucophyte contains a large amount of channel proteins (hereinafter, also referred to as organic channel proteins 18) that allow organic substances named CppS and CppF to permeate.
  • the organic channel protein 18 accounts for 80% or more of the total protein in the outer membrane of the chloroplast of Glaucophyte (Non-Patent Document 8: Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291: 20198-20209. ).
  • CppS and CppF are channel proteins having a channel function that selectively permeates relatively high-molecular-weight organic substances (for example, biomolecules such as proteins), and are used to control the inside of chlorophyll in plant cells and the cytoplasm of plant cells. It is thought to function as a connecting substance transport route.
  • CppS and CppF are widely distributed in gray algae.
  • CppS and CppF-like proteins are present only in bacteria belonging to the phylum Planctomycetes. Cyanobacteria do not carry CppS and CppF and their similar proteins (see Non-Patent Document 8).
  • cyanobacteria CO2 immobilized by photosynthesis is converted into various amino acids through a multi-step enzymatic reaction. Using them as raw materials, proteins are synthesized in the cytoplasm of cyanobacteria. Some of these proteins function within the cytoplasm, while others are transported from the cytoplasm to the periplasm and function within the periplasm. However, cases of active secretion of proteins extracellularly have not been reported in cyanobacteria to date.
  • Cyanobacteria have high photosynthetic ability, so it is not always necessary to take in organic matter as nutrients from the outside. Therefore, cyanobacteria have very few channels on the outer membrane 5 that allow organic matter to permeate, such as the organic matter channel protein 8 (eg, Slr1270) in FIG.
  • the organic channel protein 8 for example, Slr1270
  • the organic channel protein 8 that allows organic matter to permeate is present in only about 4% of the total protein content of the outer membrane 5.
  • cyanobacteria like the ion channel protein 6 in FIG.
  • the outer membrane 5 has a large amount of.
  • the ion channel protein 6 that permeates inorganic ions accounts for about 80% of the total protein amount of the outer membrane 5.
  • a channel protein (so-called organic channel protein 18) that improves the protein permeability of the outer membrane 5 is expressed.
  • the protein permeability of the outer membrane 5 is improved, so that the secretory productivity of the protein that secretes the protein produced in the cells to the outside of the cells is improved.
  • the modified cyanobacteria can be repeatedly used to produce the protein even after the protein is recovered.
  • the production of a protein in a cell by modified cyanobacteria is referred to as production, and the secretion of the produced protein outside the cell is referred to as secretory production.
  • the type of cyanobacteria (hereinafter referred to as parent cyanobacteria) before improving the protein permeability of the outer membrane 5, which is the parent microorganism of the modified cyanobacteria according to the present embodiment, is not particularly limited, and all types of cyanobacteria are not particularly limited. It may be a bacterium.
  • the parent cyanobacteria may be of the genus Synechococcus, Synechococcus, Anabaena, or Thermosynechococcus, among which Synechococcus sp. PCC 6803, Synechococcus sp. PCC 7942, or Thermosynechococcus elongatus BP-1. May be good.
  • expressing the organic channel protein 18 on the outer membrane 5 of the cyanobacteria means that the gene encoding the organic channel protein 18 is inserted into the chromosomal DNA or plasmid of the cyanobacteria, and the transcription and translation of the gene are performed.
  • the organic channel protein 18 synthesized through the above is transported to the outer membrane 5 to express a channel function for selectively permeating the protein in the outer membrane 5 of cyanobacteria.
  • the means for inserting and expressing the gene is not particularly limited as long as it is a commonly used means, the base sequence of the promoter for transcription activation, the ribosome binding sequence for translation, and the transport to the outer membrane 5. It is not limited by the type of signal sequence for.
  • the organic channel protein 18 expressed on the outer membrane 5 of cyanobacteria may be an outer membrane channel protein derived from chloroplasts.
  • the organic channel protein 18 may be, for example, CppS (SEQ ID NO: 1) or CppF (SEQ ID NO: 2) of the gray alga Cyanophora paradoxa (hereinafter, also referred to as C. paradoxa).
  • the organic channel protein 18 may be a protein having an amino acid sequence 50% or more identical to that of CppS or CppF.
  • the protein having an amino acid sequence of 50% or more identical to CppS or CppF is not limited to a protein derived from chloroplasts, and may be, for example, a protein similar to Cpps or CppF derived from a microorganism such as a bacterium.
  • CppS SEQ ID NO: 1
  • CppF SEQ ID NO: 2
  • the modified cyanobacteria according to the present embodiment improve the protein permeability of the outer membrane 5.
  • the organic channel protein 18 includes, for example, 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, and further, with the amino acid sequence of any of the proteins shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 above.
  • the modified cyanobacteria may be introduced with a gene encoding the organic channel protein 18.
  • the organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5 is expressed.
  • the above gene may be, for example, a gene derived from a chloroplast.
  • the gene encoding the organic channel protein 18 derived from chloroplast may be, for example, cppS (SEQ ID NO: 3) or cppF (SEQ ID NO: 4) of the gray alga Cyanophora paradoxa.
  • the organic channel protein 18 may be a gene having a base sequence of 50% or more identical to any of these genes.
  • the gene encoding any of the organic channel proteins 18 shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 above, or a gene that is 50% or more identical to the base sequence of any of these genes be introduced. Therefore, a protein having a function of improving protein permeability in the outer membrane 5 or a protein having a function equivalent to that protein is expressed. This improves the protein permeability of the outer membrane 5 in modified cyanobacteria.
  • the gene encoding the organic channel protein 18 is not limited to the chloroplast-derived gene.
  • the gene encoding the organic channel protein 18 includes, for example, 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60 with the base sequence of any of the above genes cppS (SEQ ID NO: 3) and cppF (SEQ ID NO: 4). % Or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and a protein having a function of improving the protein permeability of the outer membrane 5.
  • it may be a gene encoding a polypeptide.
  • the method for producing the modified cyanobacteria comprises the step of expressing the organic channel protein 18 which improves the protein permeability of the outer membrane 5.
  • the organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5 is, for example, a chlorophyll-derived channel protein, and specifically, CppS consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Alternatively, it may be CppF consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Further, the organic channel protein 18 may be a protein having an amino acid sequence 50% or more identical to any of these proteins.
  • a gene encoding the organic channel protein 18 that improves the protein permeability of the outer membrane 5 is inserted into the chromosomal DNA or plasmid of cyanobacteria. Then, the organic channel protein 18 synthesized through transcription and translation of the gene is transported to the outer membrane 5 and expresses the channel function in the outer membrane 5 of cyanobacteria.
  • the means for inserting and expressing the gene is not particularly limited as long as it is a commonly used means, and the base sequence of the promoter for transcriptional activation, the ribosome binding sequence for translation, and the outer membrane 5 are provided. It is not limited by the type of signal sequence for transport.
  • the modified cyanobacteria may be produced by expressing a channel protein that improves the protein permeability of the outer membrane 5 by the above procedure.
  • the organic channel protein 18 that improves protein permeability is expressed in the outer membrane 5, so that the protein permeability of the outer membrane 5 is improved. Therefore, the protein produced in the cells permeates the organic channel protein 18 and is easily secreted to the outside of the outer membrane 5 (that is, to the outside of the cells). Therefore, according to the method for producing modified cyanobacteria according to the present embodiment, it is possible to provide modified cyanobacteria having improved protein secretion productivity.
  • the protein produced in the cells diffuses out of the cells as described above, so that the cells are crushed in order to recover the proteins. No need.
  • the modified cyanobacteria may be cultured under appropriate conditions and then the protein secreted into the culture solution may be recovered, it is possible to recover the protein in the culture solution while culturing the modified cyanobacteria. Therefore, efficient microbiological protein production can be carried out by using the modified cyanobacteria obtained by this production method. Therefore, according to the method for producing modified cyanobacteria according to the present embodiment, it is possible to provide a highly efficient modified cyanobacteria that can be used repeatedly even after the protein is recovered.
  • the modified cyanobacteria produced by the method for producing modified cyanobacteria according to the present embodiment secretes proteins such as peptidase or phosphatase, which are mainly present in periplasm, to the outside of the cell.
  • proteins such as peptidase or phosphatase, which are mainly present in periplasm
  • a gene encoding a protein originally produced in a cyanobacterial cell, such as a group of proteins existing in periplasm is modified and replaced with a gene encoding another protein.
  • the modified cyanobacteria produce the desired protein. Therefore, according to the method for producing modified cyanobacteria according to the present embodiment, it is also possible to provide modified cyanobacteria capable of easily and efficiently producing a desired protein.
  • the method for producing a protein according to the present embodiment includes the step of culturing the above-mentioned modified cyanobacteria.
  • Cyanobacterial culture can generally be carried out based on liquid culture using BG-11 medium (see Table 2) or a modified method thereof. Therefore, the culture of modified cyanobacteria may be carried out in the same manner.
  • the culture period of cyanobacteria for producing the protein may be a period during which the protein can be accumulated at a high concentration under the condition that the cells have sufficiently grown, for example, 1 to 3 days. It may be 4 to 7 days.
  • the culture method may be, for example, aeration stirring culture or shaking culture.
  • the modified cyanobacteria By culturing under the above conditions, the modified cyanobacteria produce a protein in the cells and secrete the protein into the culture medium.
  • the culture solution When recovering the protein secreted in the culture solution, the culture solution is filtered or centrifuged to remove solids such as cells (so-called bacterial cells) from the culture solution, and the culture supernatant is collected. You may.
  • the modified cyanobacteria remaining after the protein recovery can be repeatedly used to produce the protein.
  • the method for recovering the protein secreted in the culture solution is not limited to the above example, and the protein in the culture solution may be recovered while culturing the modified cyanobacteria.
  • the protein that has permeated the permeable membrane may be recovered by using a permeable membrane that permeates the protein.
  • useful microorganisms such as lactic acid bacteria may be cultured using the protein that has permeated the permeable membrane as a nutrient source.
  • the protein in the culture solution can be recovered while culturing the modified cyanobacteria, the treatment for removing the cells of the modified cyanobacteria from the culture solution becomes unnecessary. Therefore, the protein can be produced more easily and efficiently.
  • the damage and stress received by the modified cyanobacteria can be reduced by eliminating the need for the recovery treatment of the bacterial cells from the culture solution and the crushing treatment of the bacterial cells. Therefore, it becomes difficult to reduce the protein secretion productivity of the modified cyanobacteria, and the modified cyanobacteria can be used for a longer period of time.
  • an enzyme for producing a food ingredient raw material or a compound, a diagnostic enzyme or a therapeutic enzyme in the medical field, or a therapeutic enzyme is possible to easily and efficiently obtain a feed enzyme or the like in the field of agriculture, fishery and livestock.
  • the modified cyanobacteria of the present disclosure the method for producing the modified cyanobacteria, and the method for producing the protein will be specifically described in Examples, but the present disclosure is not limited to the following Examples.
  • the chloroplast outer membrane channel protein CppS (SEQ ID NO: 1) retained by the gray alga Cyanophora paradoxa is expressed on the outer membrane of cyanobacteria. I let you. Then, the protein secretion productivity of the modified cyanobacteria expressing the outer membrane channel protein CppS (SEQ ID NO: 1) was measured, and the secreted protein was identified.
  • the cyanobacterial species used in this example is Synechocystis sp. PCC 6803 (hereinafter, simply referred to as “cyanobacteria”).
  • cppS gene expression cassette The cppS gene, the promoter region (PL22) for controlling the expression of the cppS gene, the outer membrane translocation signal sequence (slr0042-signal) in cyanobacteria, and canamycin as a marker for gene transfer.
  • a gene cassette linked to the resistance marker gene (KmR) was prepared by the following procedure.
  • the slr2030-2031 :: slr0042-KmR cassette was inserted into the pUC19 plasmid to obtain the pUC19-slr0042 plasmid.
  • total cDNA was prepared from the gray alga C. paradoxa NIES-547 using the SMART cDNA library synthesis kit (Clontech).
  • amplification was performed by PCR using the primers cppS-Fw (SEQ ID NO: 11) and cppS-Rv (SEQ ID NO: 12) shown in Table 1 to obtain the cppS gene.
  • the cppS gene was inserted into the pUC19-slr0042 plasmid to obtain the pUC19-cppS plasmid.
  • the cppS gene is inserted in a form linked to the 3'end side of the outer membrane transfer signal sequence of the slr0042 gene, and the region other than the outer membrane transfer signal sequence of the slr0042 gene is replaced with the coding region of cppS. Is removed with.
  • the set of (SEQ ID NO: 16) was amplified by the PCR method to obtain the tetR gene and the spectinomycin resistance marker gene (SpcR) as a marker for gene transfer.
  • SpcR spectinomycin resistance marker gene
  • the upstream fragment of the psbA1 gene is linked to the 5'end side of the tetR gene. It is amplified in the form that the downstream fragment of the psbA1 gene is linked to the 3'terminal side of SpcR.
  • amplification by PCR using the primers psbA1-Fw (SEQ ID NO: 13) and psbA1-Rv (SEQ ID NO: 14) shown in Table 1 is used to 5'.
  • a gene cassette (psbA1 :: tetR cassette) in which the upstream fragment of the psbA1 gene, TetR, SpcR, and the downstream fragment of the psbA1 gene were linked in this order was obtained.
  • the psbA1 :: tetR cassette cassette was inserted into the pUC19 plasmid to obtain the pUC19-tetR plasmid.
  • Example 1 (4-1) Culturing of modified strain [Example 1]
  • the cells were shake-cultured for 5 days under the conditions. The culture was independently performed 3 times.
  • Comparative Example 1 In Comparative Example 1, the Synechocystis cppS tetR strain was cultured under the same conditions as in Example 1 except that a BG-11 medium containing no aTc was used. The culture was independently performed 3 times.
  • the Synechocystis cppS tetR strain cultured in the presence of aTc in Example 1 secreted into the culture supernatant as compared with the Synechocystis cppS tetR strain cultured in the absence of aTc in Comparative Example 1.
  • the amount of protein produced (mg / L) was improved about 25 times.
  • IAA iodoacetamide
  • cysteine with a final concentration of 60 mM was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • 400 ng of trypsin was added and allowed to stand overnight at 37 ° C. to fragment the protein into peptide fragments.
  • TFA Trifluoroacetic Acid
  • the sample was dried by a centrifugal evaporator. Then, 3% acetonitrile and 0.1% formic acid were added, and the sample was dissolved using a closed ultrasonic crusher. The peptide concentration was adjusted to 200 ng / ⁇ L.
  • Table 3 shows 10 types of proteins in order from the one with the largest relative quantitative value among the identified proteins.
  • the modified cyanobacteria of the present disclosure secrete proteins existing in the cells (here, in the periplasm) to the outside of the cells.
  • proteins secreted by the modified cyanobacteria it becomes possible to replace these protein-encoding genes with genes encoding other proteins by gene modification.
  • genetically modifying the modified cyanobacteria of the present disclosure so as to produce the desired protein instead of the protein identified above the desired protein can be efficiently produced using the modified cyanobacteria. ..
  • cyanobacteria since cyanobacteria have high photosynthetic ability, they can easily obtain the required protein at the required time by culturing with light, water, air, and a trace amount of inorganic substances, so that the protein can be produced. There is no need to use complicated equipment. In addition, proteins tend to lose their function when processed into, for example, supplements. Therefore, according to the modified cyanobacteria of the present disclosure, it is possible to provide a protein while maintaining the function of the protein. Due to the above advantages, the modified cyanobacteria of the present disclosure are expected to be applied in various fields.
  • modified cyanobacteria The modified cyanobacteria, the method for producing the modified cyanobacteria, and the method for producing the protein according to the present disclosure have been described above based on the embodiments, but the present disclosure is not limited to these embodiments. As long as the gist of the present disclosure is not deviated, various modifications that can be conceived by those skilled in the art are applied to the embodiment, and other forms constructed by combining some components in the embodiment are also included in the scope of the present disclosure. included.
  • the method for producing the modified cyanobacteria and the method for producing a protein using the modified cyanobacteria, water, light, air, and a trace amount of inorganic substances are fed to the modified cyanobacteria for culturing.
  • the protein can be obtained efficiently.
  • an enzyme for producing a raw material or a compound of a food component, a diagnostic enzyme or a therapeutic enzyme in the medical field, a feed enzyme in the agricultural, fishery and livestock field, and the like can be obtained.
  • Inner membrane Peptidoglycan 3 Sugar chain 4 Cell wall 5 Outer membrane 6 Ion channel protein 7 Binding domain 8, 18 Organic channel protein

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Abstract

改変シアノバクテリアは、外膜（５）のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質（１８）が発現されている。

Description

改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、タンパク質の製造方法
　本開示は、菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に分泌するタンパク質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、タンパク質の製造方法に関する。
　化石燃料に依存せず、かつ環境低負荷な物質生産方式が、化学工業から農水畜産業に至る幅広い産業分野で求められている。微生物を用いた物質生産は常温常圧の環境下で行うことができ、かつ近年の遺伝子操作技術の発展に伴い幅広い化合物種を生産できるようになったことから、上記の要求を満たす生産系として注目されている。その中で、シアノバクテリア及び藻類などの光合成微生物は、光をエネルギー源として空気中の二酸化炭素（ＣＯ２）を原料として利用できるため、カーボンニュートラルな次世代の物質生産系として特に期待が持たれている。
　例えば、シアノバクテリアを用いて生産される物質として、エタノール（非特許文献１）、イソブタノール（非特許文献２）、アルカン類（特許文献１）、脂肪酸（特許文献２）、及び、タンパク質（非特許文献３）等が報告されている。
　また、例えば、非特許文献４には、シアノバクテリアにタンパク質を発現させる手法が開示されている。
特開２０１５－１０９８２８号公報 特許第６３４１６７６号公報
Jason Dexter and Pengcheng Fu, "Methabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production", Energy & Environmental Science, Royal Society of Chemistry, 2009, Vol.2, pp.857-864 Shota Atsumi et al., "Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde", Nature Biotechnology, Nature Publishing Group, 2009, Vol.27, pp.1177-1180 Jie Zhou et al., "Discovery of a super-strong promoter enable efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria", Scientific Reports, Nature Research, 2014, Vol.4, Article No.4500 Andrew H. Ng et al., "Fine-Turning of Photoautotrophic Synechocystis sp. Strain PCC 6803", Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, 2015, Vol.81, pp.6857-6863
　しかしながら、上記の従来技術では、シアノバクテリアを用いて効率よくタンパク質を生産することは難しい。
　そこで、本開示は、タンパク質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、改変シアノバクテリアを用いたタンパク質の製造方法を提供する。
　本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアは、外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている。
　本開示の改変シアノバクテリア及び改変シアノバクテリアの製造方法によれば、タンパク質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供することができる。また、本開示のタンパク質の製造方法によれば、効率良くタンパク質を製造することができる。
図１は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。 図２は、実施例１及び比較例１の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量（ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ）を示すグラフである。
　（本開示の基礎となった知見）
　シアノバクテリア（藍色細菌又は藍藻とも呼ばれる）は、真正細菌の一群であり、光合成により水を分解して酸素を産生し、得たエネルギーにより空気中のＣＯ２を固定するなお、シアノバクテリアは、種によっては、空気中窒素（Ｎ２）も固定できる。また、シアノバクテリアの特性として、生育が早く光利用効率が高いことが知られており、加えてその他の藻類種と比較して遺伝子操作が容易であるため、光合成微生物の中でもシアノバクテリアの利用に関して活発な研究開発が行われている。上述のように、シアノバクテリアを用いた物質生産の例として、エタノール（非特許文献１）、イソブタノール（非特許文献２）、アルカン類（特許文献１）、及び、脂肪酸（特許文献２）等の燃料の生産が報告されている。
　また、シアノバクテリアを用いて、生物の栄養源となる物質の生産に関する研究開発も行われている。例えば、タンパク質は生物にしか合成できないため、簡便に、かつ、効率良くタンパク質を生産する生物種の１つとして、光エネルギーと大気中のＣＯ２を利用する光合成微生物が有用であると考えられている。
　例えば、非特許文献３には、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803を用いたタンパク質の生産方法が記載されている。当該文献では、エチレン合成酵素の遺伝子の転写を高効率で活性化させるためのプロモーターの塩基配列と、翻訳を増強するためのリボソーム結合配列とが開示されている。
　また、非特許文献４には、Synechocystis sp. PCC 6803株を宿主として組み換えタンパク質を発現させる場合において、本株が保持するプラスミド上のNS-pCC2領域にタンパク質をコードする遺伝子を挿入する手法が開示されている。当該手法を用いることで、染色体DNA（deoxyribonucleic acid）上に当該遺伝子を挿入した場合と比較して組み換えタンパク質の発現効率が約１４倍に向上することが報告されている。
　しかしながら、上述した従来技術では、タンパク質がPCC6803株の菌体内で産生されたタンパク質を回収するために、PCC6803株の菌体を破砕する必要がある。そのため、タンパク質の回収に手間がかかる。また、菌体内には様々な物質が存在するため、それらの物質を除去して、目的のタンパク質を生成することが必要となる場合がある。そのため、タンパク質の回収率が低くなる。また、タンパク質の生産の度に、新たな菌株を準備する必要があるため、手間がかかり、生産コストも嵩む。このように、上述した従来技術では、シアノバクテリアを用いたタンパク質の生産効率は未だ低いレベルであり、より生産効率の高い技術の開発が望まれている。
　そこで、本発明者は、植物の葉緑体由来の外膜チャネルタンパク質を、シアノバクテリアの外膜に発現させることで、外膜のタンパク質透過性が向上することを見出した。これにより、シアノバクテリアの培養液あたり又は細胞あたりに分泌生産されるタンパク質量が増大することを見出した。
　したがって、本開示によれば、タンパク質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供することができる。また、本開示の改変シアノバクテリアを培養すれば、効率良くタンパク質を製造することができる。
　（本開示の概要）
　本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
　本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアは、外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている。
　これにより、外膜のタンパク質透過性が向上する。したがって、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアによれば、タンパク質の分泌生産性が向上したシアノバクテリアを提供することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアでは、前記チャネルタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるCppS、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるCppF、又は、これらのいずれかのチャネルタンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質であるCppS（配列番号１）又はCppF（配列番号２）、若しくは、これらのいずれかのチャネルタンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される。したがって、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアによれば、外膜のタンパク質透過性が向上する。
　例えば、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアでは、前記チャネルタンパク質をコードする遺伝子が導入されていてもよい。
　これにより、外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現される。したがって、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアによれば、外膜のタンパク質透過性が向上するため、タンパク質の分泌生産性が向上したシアノバクテリアを提供することができる。
　例えば、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアでは、前記遺伝子は、葉緑体由来の遺伝子であってもよい。例えば、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアでは、前記遺伝子は、配列番号３で示される塩基配列からなるcppS、配列番号４で示される塩基配列からなるcppF、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号３及び配列番号４で示されるいずれかのチャネルタンパク質をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が導入される。そのため、改変シアノバクテリアでは、外膜におけるタンパク質透過性を向上させる機能を有するタンパク質又は当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される。したがって、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアでは、外膜のタンパク質透過性が向上する。
　また、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアの製造方法は、外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質を発現させるステップを含む。
　これにより、シアノバクテリアの外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質を発現させることができる。そのため、菌体内で産生されたタンパク質が当該チャネルタンパク質を透過して外膜の外に（つまり、菌体の外に）分泌されやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る改変シアノバクテリアの製造方法によれば、外膜のタンパク質透過性が向上した改変シアノバクテリアを製造することができる。
　また、本開示の一態様に係るタンパク質の製造方法は、上記のいずれかの改変シアノバクテリアを培養するステップを含む。
　これにより、改変シアノバクテリアの菌体（細胞ともいう）内で産生されたタンパク質が菌体外（つまり、培養液中）に分泌されるため、培養液中に分泌されたタンパク質を回収することができる。そのため、タンパク質の回収のために菌体を収集して破砕する必要がない。また、タンパク質を回収した後も、繰り返し菌体を使用することができる。また、改変シアノバクテリアの培養には、特別な栄養は必要ではなく、光、水、空気、及び、微量の無機物を与えるだけで、簡便に培養することができる。したがって、本開示の一態様に係るタンパク質の製造方法によれば、効率良くタンパク質を製造することができる。
　以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
　なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、材料、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
　また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
　また、以下において、数値範囲は、厳密な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば、タンパク質の量（例えば、数又は濃度等）又はその範囲を計測することなどを含む。
　また、本明細書では、菌体と細胞とは、いずれも１つのシアノバクテリアの個体を表している。
　（実施の形態）
　[１．定義]
　本明細書において、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズムによって計算される。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のウェブサイトで利用できるBLASTプログラムにてペアワイズ解析を行うことにより算出される。シアノバクテリア及び植物の遺伝子並びにタンパク質に関する情報は、例えば上述のNCBIデータベース及びCyanobase（http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）において公開されている。これらのデータベースから、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びそれらのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を取得することができる。
　シアノバクテリアは、藍藻又は藍色細菌とも呼ばれ、クロロフィルで光エネルギーを捕集し、得たエネルギーで水を電解して酸素を発生しながら光合成をおこなう原核生物の一群である。シアノバクテリアは、多様性に富んでおり、例えば、細胞形状ではSynechocystis sp. PCC 6803のような単細胞性の種及びAnabaena sp. PCC 7120のような多細胞が連なった糸状性の種がある。生育環境についても、Thermosynechococcus elongatusのような好熱性の種、Synechococcus elongatusのような海洋性の種、Synechocystisのような淡水性の種がある。また、Microcystis aeruginosaのようにガス小胞を持ち毒素を産生する種、及び、チラコイドを持たずに原形質膜に集光アンテナであるフィコビリソームと呼ばれるタンパク質を有するGloeobacter violaceusのように、独自の特徴をもつ種も多数挙げられる。
　図１は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。図１に示されるように、シアノバクテリアの細胞表層は、内側から順に、原形質膜（内膜１ともいう）、ペプチドグリカン２、及び細胞最外層を形成する脂質膜である外膜５で構成される。ペプチドグリカン２にはグルコサミン及びマンノサミンなどで構成される糖鎖３が共有結合しており、また、これらの共有結合型の糖鎖３にはピルビン酸が結合している。本明細書では、ペプチドグリカン２と共有結合型の糖鎖３とを含めて細胞壁４と呼ぶ。細胞壁４の糖鎖３と、後述するイオンチャネルタンパク質６の結合ドメイン７とが結合することにより、外膜５が細胞壁４を被覆している。また、原形質膜（つまり、内膜１）と外膜５との間隙は、ペリプラズムと呼ばれ、タンパク質の分解又は立体構造の形成、脂質又は核酸の分解、若しくは、細胞外の栄養素の取り込み等に関与する様々な酵素が存在する。
　チャネルタンパク質とは、所定の物質を脂質膜（例えば、外膜５）の内側から外側へ、又は、外側から内側へ選択的に透過させるための経路（すなわちチャネル）を形成する膜タンパク質のことをいう。大腸菌及びサルモネラなどの、一般的な従属栄養性のグラム陰性細菌の外膜には、糖及びアミノ酸などの比較的低分子量の栄養素を外膜の外側から内側に選択的に透過させて細胞内に取り込むための、Porinと呼ばれるチャネルタンパク質が多量に存在する（非特許文献５：Nikaido, 2003, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 67(4):593-656）。一方で、シアノバクテリアの外膜５にはPorinは存在せず、そのかわりに無機イオンのみを選択的に透過させるイオンチャネルタンパク質６が外膜５に多量に存在する。当該イオンチャネルタンパク質６は、外膜５の総タンパク質の約８０％を占めている（非特許文献６：Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199(19):e00371-17）。そのため、シアノバクテリアにおいては、遺伝子導入などの技術を用いて外膜５の性質を大きく改変しない限り、タンパク質のような高分子量の物質が外膜５を透過して細胞外（つまり、外膜５の外）に拡散することは難しい。
　植物の葉緑体は、約１５～２０億年前に、原始的な真核細胞の細胞内に共生したシアノバクテリアが起源であり、その後の進化により葉緑体へと変化した（非特許文献７：Ponce-Toledo et al., 2017, Curr. Biol., 27(3):386-391）。最も原始的な植物とされる単細胞藻類である灰色藻が保持する葉緑体は、ペプチドグリカンを有しており、シアノバクテリアとよく似た表層構造を残している。一方で、単細胞藻類よりも進化の進んだ種子植物の葉緑体には、ペプチドグリカンは存在しない。また、シアノバクテリアの外膜タンパク質の多くは、進化の過程で、葉緑体の誕生初期には葉緑体の外膜から失われている。そのため、前述の灰色藻の葉緑体の外膜タンパク質は、シアノバクテリアの外膜タンパク質の構成と大きく異なる。例えば、シアノバクテリアの外膜５には、Slr1841などの無機物を透過させるイオンチャネルタンパク質６が多量に含まれている。当該イオンチャネルタンパク質６は、外膜５の総タンパク質の約８０％を占めている。一方、灰色藻の葉緑体の外膜には、CppS及びCppFと名付けられた有機物を透過させるチャネルタンパク質（以下、有機物チャネルタンパク質１８ともいう）が外膜に多量に含まれている。当該有機物チャネルタンパク質１８は、灰色藻の葉緑体の外膜の総タンパク質の８０％以上を占める（非特許文献８：Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291:20198-20209）。CppS及びCppFは比較的高分子量の有機物（例えば、タンパク質などの生体分子）を選択的に透過させるチャネル機能を有するチャネルタンパク質であり、植物細胞中の葉緑体の内部と植物細胞の細胞質とをつなぐ物質輸送経路として機能していると考えられている。CppS及びCppFは、灰色藻類に広く分布している。一方で、細菌においてはPlanctomycetes門に属する細菌においてのみCppS及びCppFの類似タンパク質が存在している。なお、シアノバクテリアは、CppS及びCppF並びにこれらの類似タンパク質を保持していない（非特許文献８参照）。
　シアノバクテリアでは、光合成により固定されたＣＯ２は、多段階の酵素反応を経て各種アミノ酸に変換される。それらを原料として、シアノバクテリアの細胞質内でタンパク質が合成される。それらのタンパク質の中には、細胞質内で機能するタンパク質もあるし、細胞質からペリプラズムに輸送されてペリプラズム内で機能するタンパク質もある。しかしながら、細胞外にタンパク質を積極的に分泌するケースは、現在までシアノバクテリアにおいては報告されていない。
　シアノバクテリアは、高い光合成能力を有するため、必ずしも有機物を栄養分として外から取り込む必要がない。そのため、シアノバクテリアは、図１の有機物チャネルタンパク質８（例えば、Slr1270）のように、有機物を透過させるチャネルを外膜５に非常にわずかしか有していない。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、有機物を透過させる有機物チャネルタンパク質８（例えば、Slr1270）は、外膜５の総タンパク質量の約４％しか存在しない。一方、シアノバクテリアは、生育に必要な無機イオン類を高効率で細胞内に取り込むために、図１のイオンチャネルタンパク質６（例えば、Slr1841など）のように、無機イオン類のみを透過させるイオンチャネルを外膜５に多く有する。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、無機イオンを透過させるイオンチャネルタンパク質６は、外膜５の総タンパク質量の約８０％を占める。
　このように、シアノバクテリアでは、外膜５におけるタンパク質などの有機物を透過させるチャネルが非常に少ないため、菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に積極的に分泌することが難しいと考えられている。
　［２．改変シアノバクテリア］
　続いて、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアについて図１を参照しながら説明する。
　本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、外膜５のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質（いわゆる、有機物チャネルタンパク質１８）が発現されている。これにより、外膜５のタンパク質透過性が向上するため、菌体内で産生されたタンパク質を菌体外に分泌するタンパク質の分泌生産性が向上する。また、菌体を破砕してタンパク質を回収する必要がないため、タンパク質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用してタンパク質を産生させることができる。なお、本明細書では、改変シアノバクテリアが菌体内でタンパク質を作り出すことを産生と言い、産生されたタンパク質を菌体外に分泌することを分泌生産と言う。
　本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの親微生物となる、外膜５のタンパク質透過性を向上させる前のシアノバクテリア（以下、親シアノバクテリアという）の種類は、特に制限はなく、あらゆる種類のシアノバクテリアであってもよい。例えば、親シアノバクテリアは、Syenechocystis属、Synechococcus属、Anabaena属、又は、Thermosynechococcus属であってもよく、中でも、Synechocystis sp. PCC 6803、Synechococcus sp. PCC 7942、又は、Thermosynechococcus elongatus BP-1であってもよい。
　なお、本明細書において、有機物チャネルタンパク質１８をシアノバクテリアの外膜５に発現させるとは、有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子をシアノバクテリアの染色体DNA又はプラスミドに挿入し、当該遺伝子の転写及び翻訳を経て合成された有機物チャネルタンパク質１８が外膜５に輸送され、シアノバクテリアの外膜５においてタンパク質を選択的に透過させるチャネル機能を発現することである。当該遺伝子の挿入及び発現の手段は、通常使用される手段であれば特に限定されず、転写活性化のためのプロモーターの塩基配列及び翻訳のためのリボソーム結合配列、並びに、外膜５への輸送のためのシグナル配列の種類により制限されるものではない。
　本実施の形態では、シアノバクテリアの外膜５に発現させる有機物チャネルタンパク質１８は、葉緑体由来の外膜チャネルタンパク質であってもよい。当該有機物チャネルタンパク質１８は、例えば、灰色藻Cyanophora paradoxa（以下、C. paradoxaともいう）のCppS（配列番号１）又はCppF（配列番号２）などであってもよい。また、有機物チャネルタンパク質１８は、CppS又はCppFとアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。なお、CppS又はCppFとアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質は、葉緑体由来のタンパク質に限られず、例えば、細菌などの微生物由来のCpps又はCppFの類似タンパク質であってもよい。
　これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８であるCppS(配列番号１)又はCppF（配列番号２）、若しくは、これらのいずれかの有機物チャネルタンパク質１８と同等の機能を有するタンパク質が発現される。そのため、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、外膜５のタンパク質透過性が向上する。
　一般に、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、タンパク質の立体構造の相同性が高いため、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、有機物チャネルタンパク質１８としては、例えば、上記の配列番号１及び配列番号２で示されるタンパク質のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、外膜５のタンパク質の透過性を向上させる機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
　また、本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子が導入されていてもよい。これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８が発現される。
　上記遺伝子は、例えば、葉緑体由来の遺伝子であってもよい。葉緑体由来の有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子は、例えば、灰色藻Cyanophora paradoxaのcppS（配列番号３）又はcppF（配列番号４）であってもよい。また、有機物チャネルタンパク質１８は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号３及び配列番号４で示されるいずれかの有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が導入される。そのため、外膜５におけるタンパク質透過性を向上させる機能を有するタンパク質又は当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される。これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜５のタンパク質透過性が向上する。
　なお、有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子としては、葉緑体由来の遺伝子に限られない。有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子としては、例えば、上記遺伝子cppS（配列番号３）及びcppF（配列番号４）のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、外膜５のタンパク質透過性を向上させる機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
　［３．改変シアノバクテリアの製造方法］
　続いて、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法について説明する。改変シアノバクテリアの製造方法は、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８を発現させるステップを含む。
　本実施の形態では、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８は、例えば、葉緑体由来のチャネルタンパク質であり、具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるCppS、又は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるCppFであってもよい。また、有機物チャネルタンパク質１８は、これらのいずれかのタンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
　有機物チャネルタンパク質１８を発現させるステップでは、まず、外膜５のタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８をコードする遺伝子がシアノバクテリアの染色体DNA又はプラスミドに挿入される。そして、当該遺伝子の転写及び翻訳を経て合成された有機物チャネルタンパク質１８は、外膜５に輸送され、シアノバクテリアの外膜５においてチャネル機能を発現する。なお、遺伝子の挿入及び発現の手段は、通常使用される手段であれば特に限定されず、転写活性化のためのプロモーターの塩基配列及び翻訳のためのリボソーム結合配列、並びに、外膜５への輸送のためのシグナル配列の種類により制限されるものではない。
　以上の手順で、外膜５のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質を発現させて、改変シアノバクテリアを製造してもよい。
　これにより、本実施の形態に係る製造方法で製造された改変シアノバクテリアは、外膜５にタンパク質透過性を向上させる有機物チャネルタンパク質１８が発現するため、外膜５のタンパク質透過性が向上する。そのため、菌体内で産生されたタンパク質が当該有機物チャネルタンパク質１８を透過して外膜５の外に（つまり、菌体の外に）分泌されやすくなる。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法によれば、タンパク質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供することができる。
　また、本実施の形態に係る製造方法で製造された改変シアノバクテリアでは、上述のように菌体内で産生されたタンパク質が菌体外に拡散するため、タンパク質の回収のために菌体を破砕する必要がない。例えば、改変シアノバクテリアを適切な条件で培養し、次いで培養液中に分泌されたタンパク質を回収すればよいため、改変シアノバクテリアを培養しながら培養液中のタンパク質を回収することも可能である。そのため、本製造方法により得られる改変シアノバクテリアを使用すれば、効率のよい微生物学的タンパク質生産を実施することができる。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法によれば、タンパク質を回収した後も繰り返し使用することができる利用効率の高い改変シアノバクテリアを提供することができる。
　なお、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法により製造される改変シアノバクテリアは、ペプチダーゼ又はフォスファターゼなどの、主として元来ペリプラズムに存在するタンパク質群を細胞外に分泌する。本実施の形態では、例えば、ペリプラズムに存在するタンパク質群のように元来シアノバクテリアの細胞内で産生されるタンパク質をコードする遺伝子を改変して、他のタンパク質をコードする遺伝子に置き換えることで、改変シアノバクテリアに所望のタンパク質を産生させることも可能である。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアの製造方法によれば、所望のタンパク質を、簡便に、かつ、効率良く産生可能な改変シアノバクテリアを提供することもできる。
　［４．タンパク質の製造方法］
　続いて、本実施の形態に係るタンパク質の製造方法について説明する。本実施の形態に係るタンパク質の製造方法は、上記の改変シアノバクテリアを培養するステップを含む。
　シアノバクテリアの培養は、一般に、BG-11培地（表２参照）を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施することができる。そのため、改変シアノバクテリアの培養も同様に実施してもよい。また、タンパク質を製造するためのシアノバクテリアの培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件でタンパク質が高濃度に蓄積するように行える期間であればよく、例えば、１～３日間であってもよく、４～７日間であってもよい。また、培養方法は、例えば、通気攪拌培養又は振とう培養であってもよい。
　上記の条件で培養することにより、改変シアノバクテリアは、菌体内でタンパク質を産生し、当該タンパク質を培養液中に分泌する。培養液中に分泌されたタンパク質を回収する場合、培養液をろ過、又は、遠心分離等することにより、培養液から細胞（いわゆる、菌体）等の固形分を除去し、培養上清を回収してもよい。本実施の形態に係るタンパク質の製造方法によれば、タンパク質が改変シアノバクテリアの細胞外に分泌されるので、タンパク質回収のために細胞を破壊する必要がない。そのため、タンパク質回収後に残った改変シアノバクテリアを繰り返し使用して、タンパク質の製造を行うことができる。
　なお、培養液中に分泌されたタンパク質の回収方法は、上記の例に限られず、改変シアノバクテリアを培養しながら、培養液中のタンパク質を回収してもよい。例えば、タンパク質を透過させる透過膜を用いることにより、透過膜を透過したタンパク質を回収してもよい。この場合、透過膜を透過したタンパク質を栄養源として、乳酸菌などの有用微生物を培養してもよい。このように、改変シアノバクテリアを培養しながら培養液中のタンパク質を回収することができるため、培養液から改変シアノバクテリアの菌体を除去する処理が不要となる。そのため、より簡便に、かつ、効率良くタンパク質を製造することができる。
　また、培養液からの菌体の回収処理及び菌体の破砕処理が不要となることにより、改変シアノバクテリアが受けるダメージ及びストレスを低減することができる。そのため、改変シアノバクテリアのタンパク質分泌生産性が低減しにくくなり、より長く改変シアノバクテリアを使用することができる。
　以上のように、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアを用いたタンパク質の製造方法によれば、食品成分原料又は化合物製造のための酵素、医療用分野における診断用酵素又は治療用酵素、若しくは、農水畜産分野における飼料用酵素などを簡便に、かつ、効率良く得ることができる。
　以下、実施例にて本開示の改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法及びタンパク質の製造方法について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
　本実施例では、シアノバクテリアの外膜のタンパク質透過性を向上させる方法として、灰色藻Cyanophora paradoxaが保持する葉緑体の外膜チャネルタンパク質CppS（配列番号１）を、シアノバクテリアの外膜に発現させた。そして、外膜チャネルタンパク質CppS（配列番号１）が発現した改変シアノバクテリアのタンパク質分泌生産性の測定と、分泌されたタンパク質の同定とを行った。なお、本実施例で使用したシアノバクテリア種は、Synechocystis sp. PCC 6803（以下、単に、「シアノバクテリア」と呼ぶ）である。
　（１）cppS遺伝子発現カセットの構築
　cppS遺伝子と、cppS遺伝子の発現制御のためのプロモーター領域（PL22）と、シアノバクテリアにおける外膜移行シグナル配列（slr0042-signal）と、遺伝子導入の目印となるカナマイシン耐性マーカー遺伝子（KmR）と、が連結した遺伝子カセットを、以下の手順で作製した。
　まず、シアノバクテリアの染色体DNAを鋳型とし、表１に記載のプライマーslr0042-Fw（配列番号５）及びslr0042-Rv（配列番号６）を用いてPCR（Polymerase chain reaction）法により増幅し、slr0042遺伝子を得た。続いて、Synechocystis LY07株（非特許文献９：Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5(3):207-212）の染色体DNAを鋳型として、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号７）及びPL22-Rv（配列番号８）のセット並びにKmR-Fw（配列番号９）及びslr2031-Rv（配列番号１０）のセットを用いてPCR法により増幅し、PL22及びKmRを得た。なお、LY07株では、これらが染色体上のslr2030-slr2031遺伝子中に挿入されて存在しているため、上記の４つのプライマーを用いてPCR法により増幅すると、PL22の5′末端側にslr2030遺伝子断片が連結した形で増幅され、KmRの3′末端側にslr2031遺伝子断片が連結した形で増幅される。次に、上記手順で得られたslr0042遺伝子、PL22、及びKmRの混合溶液を鋳型とし、表１に記載の４つのプライマー（配列番号７～１０）を用いてPCR法により増幅することにより、5′末端側から、slr2030遺伝子断片、PL22、slr0042遺伝子、KmR、及びslr2031遺伝子断片が順に連結した遺伝子カセット（slr2030-2031::slr0042-KmRカセット）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、slr2030-2031::slr0042-KmRカセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr0042プラスミドを得た。
　上記手順と並行して、灰色藻C. paradoxa NIES-547よりSMART cDNA ライブラリー合成キット(Clontech) を用いてtotal cDNAを調整した。このcDNAを鋳型に、表１に記載のプライマーcppS-Fw（配列番号１１）及びcppS-Rv（配列番号１２）を用いてPCR法により増幅し、cppS遺伝子を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、cppS遺伝子をpUC19-slr0042プラスミドに挿入し、pUC19-cppSプラスミドを得た。なお、この手順により、cppS遺伝子はslr0042遺伝子の外膜移行シグナル配列の3′末端側に連結した形で挿入され、slr0042遺伝子の外膜移行シグナル配列以外の領域は、cppSのコード領域と入れ替わる形で除去される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）PL22のプロモーター活性制御カセット（tetR）の構築
　上記PL22のプロモーター活性は、TetRリプレッサーを介した制御により、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）の存在下でのみ誘導される。従ってPL22の活性制御のためのtetR遺伝子を改変シアノバクテリアに導入する必要がある。
　まず、LY07株の染色体DNAを鋳型とし、表1に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１３）及びtetR-Rv（配列番号１４）のセット、並びにtetR-Fw（配列番号１５）及びpsbA1-Rv（配列番号１６）のセットを用いてPCR法により増幅してtetR遺伝子と、遺伝子導入の目印となるスペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子（SpcR）を得た。なお、LY07株ではこれらが染色体上のpsbA1遺伝子中に挿入されて存在しているため、上記プライマーを用いてPCR法により増幅すると、tetR遺伝子の5′末端側にpsbA1遺伝子の上流側断片が連結した形で増幅され、SpcRの3′末端側にpsbA1遺伝子の下流側断片が連結した形で増幅される。次に、tetR遺伝子とSpcRの混合溶液を鋳型とし、表1に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１３）及びpsbA1-Rv（配列番号１４）を用いてPCR法により増幅することにより、5′末端側から、psbA1遺伝子上流側断片、TetR、SpcR、psbA1遺伝子下流側断片が順に連結した遺伝子カセット（psbA1::tetRカセット）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、psbA1::tetRカセットカセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-tetRプラスミドを得た。
　（３）cppS遺伝子発現カセットとtetRカセットの導入
　上記手順により得られたpUC19-cppSプラスミド1μgと、シアノバクテリア培養液（菌体濃度OD730 = 0.5程度）とを混合し、自然形質転換によりプラスミドを細胞内に導入した。形質転換された細胞を30 μg/mLのカナマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより、選抜した。選抜された細胞では、染色体上のslr2030-2031遺伝子と、pUC19-cppSプラスミド上のslr2030遺伝子断片領域およびslr2031遺伝子断片領域との間で相同組み換えが起こる。これにより、slr2030-2031遺伝子領域にcppS遺伝子発現カセットが挿入されたSynechocystis cppS株を得た。なお、用いたBG-11培地の組成は表２の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、pUC19-tetRプラスミド 1 μgとSynechocystis cppS培養液（菌体濃度OD730 = 0.5程度）とを混合し、自然形質転換によりプラスミドを細胞内に導入した。形質転換された細胞を30 μg/mLのカナマイシンおよび20 μg/mLのスペクチノマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより選抜し、Synechocystis cppS tetR株を得た。上記と同様に、同株では染色体DNA上のpsbA1遺伝子にtetRカセットが挿入されている。
　（４）タンパク質の分泌生産性試験
　上記（３）で得られたSynechocystis cppS tetR株を、以下の実施例１及び比較例１に記載の条件下でそれぞれ培養し、細胞外に分泌されたタンパク質量（以下、分泌タンパク質量ともいう）を測定した。培養液中のタンパク質量により、タンパク質の分泌生産性を評価した。なお、タンパク質の分泌生産性とは、細胞内で産生されるタンパク質を細胞外に分泌することにより、タンパク質を生産する能力をいう。以下、具体的な方法について説明する。
　（４－１）改変株の培養
　［実施例１］
　実施例１では、初発菌体濃度OD730 = 0.05となるように、Synechocystis cppS tetR株を、1 μg/mL aTcを含むBG-11培地に接種し、光量100 μmol/m2/s、30℃の条件下で5日間振盪培養した。培養は、独立して３回行った。
　［比較例１］
　比較例１では、aTcを含まないBG-11培地を用いたこと以外、実施例１と同条件でSynechocystis cppS tetR株を培養した。培養は、独立して３回行った。
　（４－２）分泌生産されたタンパク質の定量
　上記（４－１）の実施例１で得られた培養液を、室温にて2,500 gで10分間遠心分離し、培養上清を得た。得られた培養上清を、ポアサイズ0.22 μmのメンブレンフィルターを用いてろ過し、Synechocystis cppS tetR株の細胞を完全に除去した。ろ過後の培養上清に含まれる総タンパク質量をBCA（Bicinchoninic acid）法により定量した。この一連の操作を、独立して培養した３つの培養液のそれぞれについて行い、実施例１のSynechocystis cppS tetR株の細胞外に分泌されたタンパク質量の平均値および標準偏差を求めた。なお、比較例１の条件で培養したSynechocystis cppS tetR株についても同様の条件で３つの培養液のタンパク質量の定量を行い、３つの培養液中のタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。
　結果を図２に示す。図２は、実施例１及び比較例１の改変シアノバクテリアの培養液中のタンパク質量（ｎ＝３、エラーバー＝ＳＤ）を示すグラフである。
　図２に示されるように、実施例１のaTc存在下で培養したSynechocystis cppS tetR株では、比較例１のaTc非存在下での培養したSynechocystis cppS tetR株と比較して培養上清中に分泌されたタンパク質量（mg/L）が約25倍向上していた。
　データの記載を省略するが、培養液の吸光度（730nm）を測定し、菌体乾燥重量１ｇあたりの分泌タンパク質量（mg protein/g cell dry weight）を算出したところ、実施例１の条件で培養したSynechocystis cppS tetR株の菌体乾燥重量１ｇあたりの分泌タンパク質量(mg protein/g cell dry weight)は、比較例１の条件で培養したSynechocystis cppStetR株と比較して、約36倍向上していた。
　（５）分泌されたタンパク質の同定
　続いて、上記（４－２）で得られた培養上清中に含まれる分泌タンパク質を、LC-MS/MSにより同定した。方法を以下に説明する。
　（５－１）試料調製
　培養上清の液量に対して8倍量の冷アセトンを加え、20℃で2時間静置後、20,000 gで15分間遠心分離し、タンパク質の沈殿物を得た。この沈殿物に100 mM Tris pH 8.5、0.5%ドデカン酸ナトリウム（SDoD）を加え、密閉式超音波破砕機によってタンパク質を溶解した。タンパク質濃度1 μg/mLに調整後、終濃度10 mMのジチオスレイトール（DTT）を添加して50℃で30分間静置した。続いて、終濃度30 mMのヨードアセトアミド（IAA）を添加し、室温（遮光）で30分間静置した。IAA の反応を止めるために、終濃度60 mMのシステインを添加して室温で10分間静置した。トリプシン400 ngを添加して37℃で一晩静置し、タンパク質をペプチド断片化した。5% TFA（Trifluoroacetic Acid）を加えた後、室温にて15,000 gで10分間遠心分離し、上清を得た。この作業によりSDoDが除去された。C18スピンカラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターにより試料を乾固した。その後、3%アセトニトリル、0.1% formic acidを加え、密閉式超音波破砕機を用いて試料を溶解した。ペプチド濃度 200 ng/μL になるように調製した。
　（５－２）LC-MS/MS分析
　上記（５－１）で得られた試料をLC-MS/MS装置（UltiMate 3000 RSLCnano LC System) を用いて以下の条件で解析を実施した。
　試料注入量：200 ng
　カラム：CAPCELL CORE MP 75 μm × 250 mm
　溶媒：A溶媒は0.1%ギ酸水溶液、B溶媒は0.1%ギ酸+80%アセトニトリル
　グラジエントプログラム：試料注入4分後にB溶媒8%、27分後にB溶媒44%、28分後にB溶媒80%、34分後に測定終了
　（５－３）データ解析
　得られたデータは以下の条件で解析し、タンパク質及びペプチドの同定ならびに定量値の算出を行った。
　ソフトウェア：Scaffold DIA
　データベース：UniProtKB/Swiss Prot database ( Synechocystis sp. PCC 6803)
　Fragmentation：HCD
　Precursor Tolerance：8 ppm
　Fragment Tolerance：1 0 ppm
　Data Acquisition Type：Overlapping DIA
　Peptide Length：8-70
　Peptide Charge：2-8
　Max Missed Cleavages：1
　Fixed Modification：Carbamidomethylation
　Peptide FDR： 1%以下
　同定されたタンパク質のうち相対定量値が最も大きかったものから順に10種類のタンパク質を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　10種類のタンパク質は、全て、実施例１及び比較例１の培養上清のそれぞれに含まれていた。これらのタンパク質の全てにおいて、ペリプラズム（外膜と内膜との間隙を指す）移行シグナルが保持されていた。この結果により、実施例１の改変株では、cppS遺伝子の発現により外膜のタンパク質透過性が向上し、ペリプラズム内のタンパク質がチャネルタンパク質CppSを透過して外膜の外（つまり、菌体外）に分泌されやすくなることが確認できた。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、タンパク質の分泌生産性が大幅に向上していることが示された。
　（６）考察
　本実施例では、本開示の改変シアノバクテリアは、菌体内（ここでは、ペリプラズム内）に存在するタンパク質を菌体外に分泌することを確認できた。また、改変シアノバクテリアが分泌するタンパク質を同定したことにより、これらのタンパク質コードする遺伝子を遺伝子改変により他のタンパク質をコードする遺伝子に置き換えることが可能となる。例えば、上記で同定されたタンパク質の代わりに、所望のタンパク質を産生するように、本開示の改変シアノバクテリアを遺伝子改変することにより、改変シアノバクテリアを用いて所望のタンパク質を効率良く製造可能となる。また、シアノバクテリアは、光合成能が高いため、光、水、空気、及び微量の無機物を与えて培養することにより、必要な時に必要なタンパク質を簡便に得ることができるため、タンパク質の製造のために複雑な装置を用いる必要がない。また、タンパク質は、例えばサプリメントなどへの加工の際にその機能が失われやすい。そのため、本開示の改変シアノバクテリアによれば、タンパク質の機能を維持した状態でタンパク質を提供することが可能となる。以上の利点により、本開示の改変シアノバクテリアは、様々な分野での応用が期待される。
　以上、本開示に係る改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法及びタンパク質の製造方法について、実施の形態に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態に施したものや、実施の形態における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。
　本開示の改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、改変シアノバクテリアを用いたタンパク質の製造方法によれば、水、光、空気、及び、微量の無機物を改変シアノバクテリアに与えて培養することにより、効率良くタンパク質を得ることができる。例えば、食品成分の原料若しくは化合物の製造のための酵素、医療用分野における診断用酵素若しくは治療用酵素、又は、農水畜産分野における飼料用酵素などを得ることができる。
　１　内膜
　２　ペプチドグリカン
　３　糖鎖
　４　細胞壁
　５　外膜
　６　イオンチャネルタンパク質
　７　結合ドメイン
　８、１８　有機物チャネルタンパク質

Claims (7)

  1. 　外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質が発現されている、
    　改変シアノバクテリア。
  2. 　前記チャネルタンパク質は、
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるCppS、
    　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるCppF、又は、
    　これらのいずれかのチャネルタンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質である、
    　請求項１に記載の改変シアノバクテリア。
  3. 　前記チャネルタンパク質をコードする遺伝子が導入されている、
    　請求項１に記載の改変シアノバクテリア。
  4. 　前記遺伝子は、葉緑体由来の遺伝子である、
    　請求項３に記載の改変シアノバクテリア。
  5. 　前記遺伝子は、
    　配列番号３で示される塩基配列からなるcppS、
    　配列番号４で示される塩基配列からなるcppF、又は、
    　これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子である、
    　請求項３又は４に記載の改変シアノバクテリア。
  6. 　外膜のタンパク質透過性を向上させるチャネルタンパク質を発現させるステップを含む、
    　改変シアノバクテリアの製造方法。
  7. 　請求項１から５のいずれか１項に記載の改変シアノバクテリアを培養するステップを含む、
    　タンパク質の製造方法。
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