JP7450189B2 - 植物成長促進剤の製造方法、植物成長促進剤、及び、植物成長促進方法 - Google Patents
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Description
本開示は、植物の成長増進に資する天然代謝産物である植物成長促進剤の製造方法、植物成長促進剤及び植物成長促進方法に関する。
世界人口の増加に伴う食糧増産への要求に伴い、限られた耕作地の中で効率よく農作物を生産するための技術開発が求められている。また、地球温暖化の防止及び環境負荷の低減の観点から、脱化石資源に向けた生物由来原料の利用が増大している。中でも、製造過程における化石エネルギーの消費量が少なく、かつ、施用において環境負荷の少ない天然由来の物質の活用が望まれている。
例えば、天然由来の物質を活用した作物生産の増進手法としては、植物の成長促進に関与する物質（以下、植物成長促進物質ともいう）を産生する微生物又は微生物の培養液などを植物に接種する方法（特許文献１、２及び非特許文献１）が開示されている。また、例えば、有機酸などの天然代謝産物を土壌に添加して土壌中の金属イオンをキレートして、植物による金属イオンの利用性を向上させる方法が開示されている（特許文献３）。また、例えば、天然代謝産物であるアデノシンを含む組成物を植物に適用する方法（特許文献４）、及び、藻類の細胞抽出物含む肥料を植物に施肥する方法（特許文献５）が開示されている。
Jimenez-Gomez et al., "Probiotic activities of Rhizobium laguerreae on growth and quality of spinach", Scientific reports, 2018, Vol. 8, 295
しかしながら、上記の従来技術では、微生物による植物成長促進物質の産生、又は、植物成長促進物質の精製若しくは抽出などのプロセスが煩雑で手間がかかり、コストも嵩む。また、上記の従来技術では、植物成長促進物質を精製及び抽出する際に、当該植物成長促進物質の収率の低下又は活性の低下などの損失が発生する。一方、微生物そのものを植物に接種する場合は、使用する微生物種、対象となる植物種、土壌の性質の組み合わせによりその効果が異なり、汎用性に欠け、植物成長促進の効果が不安定である。
そこで、本開示は、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を、簡便に、かつ、効率良く製造できる植物成長促進剤の製造方法を提供する。また、本開示は、効果的に植物の成長を促進させることができる植物成長促進剤、及び、当該植物成長促進剤を用いた植物成長促進方法を提供する。
本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている改変シアノバクテリアを準備するステップと、前記改変シアノバクテリアに植物の成長促進に関与する分泌物を分泌させるステップと、を含む。
本開示の植物成長促進剤の製造方法によれば、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。また、本開示の植物成長促進剤によれば、効果的に植物の成長を促進させることができる。また、本開示の植物成長促進方法によれば、本開示の植物成長促進剤を用いることにより、効果的に植物の成長を促進させることができる。
（本開示の基礎となった知見）
背景技術で述べたように、限られた耕作地の中で効率よく農作物を生産するための技術が求められている。また、作物生産を促進のために、施用において環境負荷の少ない天然由来の物質の活用が求められている。中でも、当該物質の製造時に化石エネルギーの消費量が少なく、より環境負荷の少ない物質が望まれている。
背景技術で述べたように、限られた耕作地の中で効率よく農作物を生産するための技術が求められている。また、作物生産を促進のために、施用において環境負荷の少ない天然由来の物質の活用が求められている。中でも、当該物質の製造時に化石エネルギーの消費量が少なく、より環境負荷の少ない物質が望まれている。
作物生産を促進する技術として、以下の従来技術が開示されている。
例えば、特許文献１には、植物又は植物の周囲（例えば、土壌）に植物成長促進活性を有する微生物株又は当該微生物株の培養物を適用する方法が開示されている。当該方法を用いることにより、植物の成長促進及び収量増大だけでなく、植物の病原性疾病の発生予防なども可能であることが報告されている。
また、例えば、特許文献２には、細菌培養液と藻類培養液とを混合し、当該混合液を所定条件にてインキュベートすることにより得られた植物成長促進組成物を製造し、当該組成物を植物に適用する方法が開示されている。当該方法では、当該組成物を植物の水耕栽培の栄養液に添加した場合に、トマトの栄養成長を促進することが報告されている。
また、例えば、非特許文献１には、根粒菌の一種を、植物成長促進メカニズムを持つ植物プロバイオティクスバクテリアとしてホウレン草に、より具体的には、ホウレン草の根に適用する方法が開示されている。当該方法では、当該根粒菌を接種したホウレン草の葉数及びサイズが増加するなどの成長促進効果が得られることが報告されている。
また、例えば、特許文献３では、有機酸などの天然代謝産物（代謝に関与する物質であって、天然に存在する物質をいう）を土壌に添加し、土壌中の鉄などの金属イオンをキレートして、植物による金属イオンの利用性を向上させる方法が開示されている。
また、例えば、特許文献４には、天然代謝産物であるアデノシンを主成分として含む組成物を植物に適用する方法が開示されている。
また、例えば、特許文献５には、藻類の細胞抽出物を含む肥料を植物に施肥する方法が開示されている。より具体的には、細胞抽出物は、シアノバクテリア類を水性溶媒（例えば、水）で、６０℃以上で処理されている。
しかしながら、上記の従来技術では、微生物による植物成長促進物質の産生、又は、植物成長促進物質の精製若しくは抽出などのプロセスが煩雑で手間がかかり、コストも嵩む。また、上記の従来技術では、植物成長促進物質を精製及び抽出する際に、当該植物成長促進物質の収率の低下又は活性の低下などの損失が発生する。一方、微生物そのものを植物に接種する場合は、使用する微生物種、対象となる植物種、土壌の性質の組み合わせによりその効果が異なり、汎用性に欠け、植物成長促進の効果が不安定である。このことから、より安価な原料で簡便なプロセスで生産でき、かつ植物成長増進効果の高い天然由来の物質の開発が望まれている。
本発明者らは、植物成長促進物質の製造に使用する微生物として、シアノバクテリアに着目した。シアノバクテリア（藍色細菌又は藍藻とも呼ばれる）は、真正細菌の一群であり、光合成により水を分解して酸素を産生し、得たエネルギーにより空気中のＣＯ２を固定する。シアノバクテリアは、種によっては、空気中の窒素（Ｎ２）も固定できる。このように、シアノバクテリアは、菌体の生育に必要な原料（つまり、栄養分）及びエネルギーの大部分を、空気、水、及び、光から得ることができるため、安価な原料で簡便なプロセスでシアノバクテリアを培養することができる。
また、シアノバクテリアの特性として、生育が早く光利用効率が高いことが知られており、加えてその他の藻類種と比較して遺伝子操作が容易であるため、光合成微生物の中でもシアノバクテリアを利用した物質生産に関して活発な研究開発が行われている。例えば、シアノバクテリアを用いた物質生産の例として、エタノール、イソブタノール、アルカン類、及び、脂肪酸（特許文献６：特許第６３４１６７６号公報）等の燃料の生産が報告されている。また、生物の栄養源となる物質の生産に関する研究開発も行われている。例えば、タンパク質は生物にしか合成できないため、簡便に、かつ、効率良くタンパク質を生産する技術の開発が求められている。当該技術に用いる生物種の１つとして、光エネルギーと大気中のＣＯ２とを利用できるシアノバクテリアの活用が期待され、活発な研究開発が行われている（非特許文献２：Jie Zhou et al., “Discovery of a super-strong promoter enable efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria”, Scientific Reports, Nature Research, 2014, Vol.4, Article No.4500）。
例えば、上記の非特許文献２に記載の技術では、シアノバクテリアにおいて異種遺伝子の効率的な発現を実現することができる。当該技術を用いれば、シアノバクテリアの細胞内（以下、菌体内ともいう）で所望のタンパク質を産生させることができる。しかしながら、シアノバクテリアの細胞内で産生されたタンパク質は、細胞外に分泌されにくいため、シアノバクテリアの細胞を破砕して、細胞内で産生されたタンパク質を抽出する必要がある。
そこで、本発明者らは、シアノバクテリアの細胞壁を被覆する外膜を部分的に細胞壁から脱離させることにより、シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び菌体内代謝産物が菌体外に分泌されやすくなることを見出した。さらに、本発明者らは、シアノバクテリアの分泌物が植物の成長促進効果を有することも発見した。これにより、シアノバクテリアの菌体を破砕することなく、菌体外に分泌された植物成長促進物質を効率よく回収することができる。また、抽出などの操作が不要となることにより、植物成長促進物質の生理活性が損なわれにくくなるため、当該分泌物を含む植物成長促進剤によれば、効果的に植物の成長を促進することができる。
したがって、本開示の植物成長促進剤の製造方法によれば、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。また、本開示の植物成長促進剤によれば、効果的に植物の成長を促進させることができる。また、本開示の植物成長促進方法によれば、本開示の植物成長促進剤を用いることにより、効果的に植物の成長を促進させることができる。
（本開示の概要）
本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
本開示の一態様の概要は、以下の通りである。
本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている改変シアノバクテリアを準備するステップと、前記改変シアノバクテリアに植物の成長促進に関与する分泌物を分泌させるステップと、を含む。
これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁と外膜との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。そのため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（以下、菌体内産生物質ともいう）が外膜の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に分泌されやすくなるため、例えば菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となる。そのため、簡便に、かつ、効率良く、改変シアノバクテリアの分泌物を含む植物成長促進剤を製造することができる。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、改変シアノバクテリアの菌体内産生物質のうち、植物の成長促進に関与する物質（以下、植物成長促進物質ともいう）の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなる。これにより、改変シアノバクテリアの分泌物は、植物の成長促進に関与する効果（以下、植物成長促進効果ともいう）が向上する。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体外に分泌された菌体内産生物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して菌体内産生物質を産生させることができる。そのため、植物成長促進剤の製造の度に新たな改変シアノバクテリアを準備する必要がない。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。
例えば、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法では、前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質は、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つであってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）細胞壁と結合するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁の表面の結合糖鎖をピルビン酸修飾する反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素）の少なくとも１つの機能が抑制若しくは喪失されている、又は、（ｉｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの発現が抑制されている。そのため、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜と細胞壁との結合が低減することにより外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなるため、上記のように菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が菌体外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物成長促進物質を菌体外に分泌する分泌生産性が向上する。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、当該改変シアノバクテリアに植物成長促進物質を効率良く分泌させることができるため、植物成長促進剤を効率良く製造することができる。
例えば、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法では、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるSlr1841、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるNIES970_09470、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_3458、又は、これらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制若しくは喪失されている、又は、（ｉｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｉｉ）外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン）が、細胞壁と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。これにより、菌体内産生物質が菌体外に漏出されやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出されやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物成長促進物質が菌体外に分泌されやすくなるため、植物成長促進剤を効率良く製造することができる。
例えば、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法では、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるSlr0688、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるSynpcc7942_1529、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるAnacy_1623、又は、これらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制又は喪失されている、又は、（ｉｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｉｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。これにより、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁の糖鎖が外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁と外膜との結合力が弱まり、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。これにより、菌体内産生物質が菌体外に漏出されやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出されやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物成長促進物質が菌体外に分泌されやすくなるため、植物成長促進剤を効率良く製造することができる。
例えば、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法では、前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されていてもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁と外膜との結合に関与するタンパク質の発現が抑制されるため、又は、当該タンパク質の機能が抑制若しくは喪失されるため、細胞壁と外膜との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなるため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が外膜の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物成長促進物質の分泌生産性が向上する。これにより、菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、菌体内で産生された植物成長促進物質の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなるため、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を製造することができる。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、当該物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して植物成長促進物質を産生させることができる。そのため、植物成長促進剤の製造の度に新たな改変シアノバクテリアを準備する必要がない。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を、簡便に、かつ、効率良く製造することができる。
例えば、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法では、前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つであってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの発現が抑制される、又は、（ｉｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つの機能が抑制若しくは喪失される。そのため、外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、外膜と細胞壁との結合が弱まった部分において外膜が細胞壁から脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜と細胞壁との結合が低減することにより外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなるため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなる。これにより、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、当該改変シアノバクテリアに植物成長促進物質を効率良く分泌させることができるため、植物成長促進剤を効率良く製造することができる。
例えば、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法では、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号７で示される塩基配列からなるslr1841、配列番号８で示される塩基配列からなるnies970_09470、配列番号９で示される塩基配列からなるanacy_3458、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号７～９で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜が細胞壁と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン）が細胞壁と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物成長促進物質が菌体外に漏出されやすくなるため、植物成長促進剤を効率良く製造することができる。
例えば、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法では、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、配列番号１０で示される塩基配列からなるslr0688、配列番号１１で示される塩基配列からなるsynpcc7942_1529、配列番号１２で示される塩基配列からなるanacy_1623、又は、これらのいずれかの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号１０～１２で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの酵素をコードする遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。これにより、細胞壁の表面の共有結合型の糖鎖がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁の糖鎖が外膜中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質のＳＬＨドメインと結合する結合量及び結合力が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、細胞壁が外膜と結合するための糖鎖がピルビン酸で修飾される量が低減するため、細胞壁と外膜との結合力が弱まり、外膜が細胞壁から部分的に離脱しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物成長促進物質が菌体外に漏出されやすくなるため、植物成長促進剤を効率良く製造することができる。
また、本開示の一態様に係る植物成長促進剤は、シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている改変シアノバクテリアの分泌物を含む。
これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁と外膜との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜が細胞壁から部分的に脱離しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）が外膜の外に（つまり、菌体の外に）漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に分泌されやすくなるため、例えば菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となる。そのため、簡便に、かつ、効率良く、改変シアノバクテリアの分泌物を含む植物成長促進剤を製造することができる。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、改変シアノバクテリアの菌体内産生物質のうち、植物の成長促進に関与する物質（以下、植物成長促進物質ともいう）の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなる。これにより、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を得ることができる。したがって、本開示の一態様に係る植物成長促進剤は、効果的に植物の成長を促進させることができる。
また、本開示の一態様に係る植物成長促進方法は、上記の植物成長促進剤を用いる。
本開示の一態様に係る植物成長促進方法によれば、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を用いるため、効果的に植物の成長を促進することができる。
以下、実施の形態について、図面を参照しながら具体的に説明する。
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、材料、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、本開示を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化される場合がある。
また、以下において、数値範囲は、厳密な意味のみを表すのではなく、実質的に同等な範囲、例えば、タンパク質の量（例えば、数又は濃度等）又はその範囲を計測することなどを含む。
また、本明細書では、菌体と細胞とは、いずれも１つのシアノバクテリアの個体を表している。
（実施の形態）
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズムによって計算される。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のウェブサイトで利用できるBLASTプログラムにてペアワイズ解析を行うことにより算出される。シアノバクテリアの遺伝子及び当該遺伝子がコードするタンパク質に関する情報は、例えば上述のNCBIデータベース及びCyanobase（http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）において公開されている。これらのデータベースから、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びそれらのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を取得することができる。
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）アルゴリズムによって計算される。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のウェブサイトで利用できるBLASTプログラムにてペアワイズ解析を行うことにより算出される。シアノバクテリアの遺伝子及び当該遺伝子がコードするタンパク質に関する情報は、例えば上述のNCBIデータベース及びCyanobase（http://genome.microbedb.jp/cyanobase/）において公開されている。これらのデータベースから、目的のタンパク質のアミノ酸配列及びそれらのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を取得することができる。
［１．植物成長促進剤］
まず、本実施の形態に係る植物成長促進剤について説明する。植物成長促進剤は、植物の成長促進に関与する分泌物を含み、植物成長促進効果、例えば、植物の葉、茎、蕾、花、又は実の数を増加させ、茎又は幹を太くし、背丈を伸長させる効果を有する。また、例えば、植物成長促進剤は、植物の成長促進に関連する種々の効果、例えば、植物の疾病発生の予防、養分の吸収率の向上、又は、植物の細胞内生理活性の向上などの効果を有してもよい。つまり、植物の成長促進に関与するとは、植物成長促進効果を有することであり、植物成長促進効果は、上記の植物成長促進に関連する種々の効果により、植物の成長が促進されることを含んでもよい。これにより、植物成長促進剤は、植物の成長を促進させ、植物の収量を増加させる。
まず、本実施の形態に係る植物成長促進剤について説明する。植物成長促進剤は、植物の成長促進に関与する分泌物を含み、植物成長促進効果、例えば、植物の葉、茎、蕾、花、又は実の数を増加させ、茎又は幹を太くし、背丈を伸長させる効果を有する。また、例えば、植物成長促進剤は、植物の成長促進に関連する種々の効果、例えば、植物の疾病発生の予防、養分の吸収率の向上、又は、植物の細胞内生理活性の向上などの効果を有してもよい。つまり、植物の成長促進に関与するとは、植物成長促進効果を有することであり、植物成長促進効果は、上記の植物成長促進に関連する種々の効果により、植物の成長が促進されることを含んでもよい。これにより、植物成長促進剤は、植物の成長を促進させ、植物の収量を増加させる。
本実施の形態では、植物成長促進剤は、シアノバクテリア（以下、親シアノバクテリアともいう）において外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている改変シアノバクテリアの分泌物を含む。なお、シアノバクテリア（つまり、親シアノバクテリア）及び改変シアノバクテリアについては後述する。
上述したように、当該分泌物は、植物の成長促進に関与する分泌物を含む。当該分泌物は、改変シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）を含む。当該菌体内産生物質には、植物の成長促進に関与する物質（以下、植物成長促進物質ともいう）が含まれている。
植物成長促進物質は、例えば、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、若しくは、フォスファターゼ等の有機物分解酵素、アデノシン若しくはグアノシン等のDNA代謝関連物質、p－アミノ安息香酸若しくはスペルミジンなどの核酸（例えば、DNA又はRNA）合成促進に関与する細胞内分子、3－ヒドロキシ酪酸などのケトン体、又は、グルコン酸などの有機酸である。改変シアノバクテリアの分泌物は、これらの植物成長促進物質の混合物であってもよい。
［２．植物成長促進剤の製造方法］
続いて、本実施の形態に係る植物成長促進剤の製造方法について図１を参照しながら説明する。図１は、本実施の形態に係る植物成長促進剤の製造方法の一例を示すフローチャートである。
続いて、本実施の形態に係る植物成長促進剤の製造方法について図１を参照しながら説明する。図１は、本実施の形態に係る植物成長促進剤の製造方法の一例を示すフローチャートである。
本実施の形態に係る植物成長促進剤の製造方法は、シアノバクテリア（つまり、親シアノバクテリア）において外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている改変シアノバクテリアを準備するステップ（ステップＳ０１）と、当該改変シアノバクテリアに植物の成長促進に関与する分泌物を分泌させるステップ（ステップＳ０２）と、を含む。上述したように、改変シアノバクテリアの分泌物は、改変シアノバクテリアの菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）を含む。これらの菌体内産生物質には、植物の成長促進に関与する物質（つまり、植物成長促進物質）が含まれる。
ステップＳ０１では、上記の改変シアノバクテリアを準備する。改変シアノバクテリアを準備するとは、改変シアノバクテリアが分泌物を分泌できる状態に改変シアノバクテリアの状態を調整することをいう。改変シアノバクテリアを準備するとは、例えば、親シアノバクテリアを遺伝子改変して改変シアノバクテリアを作製することであってもよく、改変シアノバクテリアの凍結乾燥体又はグリセロールストックから菌体を復元することであってもよく、ステップＳ０２で植物成長促進物質を分泌させ終えた改変シアノバクテリアを回収することであってもよい。
ステップＳ０２では、改変シアノバクテリアに植物の成長促進に関与する分泌物を分泌させる。本実施の形態における改変シアノバクテリアは、シアノバクテリア（つまり、親シアノバクテリア）において外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されているため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が外膜の外（つまり、菌体外）に分泌されやすい。これらの菌体内産生物質には、植物の成長促進に関与する物質も含まれる。そのため、ステップＳ０２では、改変シアノバクテリアを所定の条件で培養することにより、植物の成長促進に関与する菌体内産生物質が菌体外に分泌される。
シアノバクテリアの培養は、一般に、BG-11培地（表２参照）を用いた液体培養又はその変法に基づいて実施することができる。そのため、改変シアノバクテリアの培養も同様に実施してもよい。また、植物成長促進剤を製造するためのシアノバクテリアの培養期間としては、十分に菌体が増殖した条件でタンパク質及び代謝産物が高濃度に蓄積するように行える期間であればよく、例えば、１～３日間であってもよく、４～７日間であってもよい。また、培養方法は、例えば、通気攪拌培養又は振とう培養であってもよい。
上記の条件で培養することにより、改変シアノバクテリアは、菌体内でタンパク質及び代謝産物（つまり、菌体内産生物質）を産生し、当該菌体内産生物質を培養液中に分泌する。当該菌体内産生物質は、植物の成長促進に関与する菌体内産生物質（つまり、植物成長促進物質）を含む。培養液中に分泌された菌体内産生物質を回収する場合、培養液をろ過、又は遠心分離等することにより、培養液から細胞（つまり、菌体）等の固形分を除去し、培養上清を回収してもよい。本実施の形態に係る植物成長促進剤の製造方法によれば、植物の成長促進に関与する菌体内産生物質（つまり、植物成長促進物質）を含む分泌物が改変シアノバクテリアの細胞外に分泌されるので、植物成長促進物質の回収のために細胞を破砕する必要がない。そのため、植物成長促進物質の回収後に残った改変シアノバクテリアを繰り返し使用して、植物成長促進剤の製造を行うことができる。
なお、培養液中に分泌された植物成長促進物質の回収方法は、上記の例に限られず、改変シアノバクテリアを培養しながら、培養液中の植物成長促進物質を回収してもよい。例えば、タンパク質を透過させる透過膜を用いることにより、透過膜を透過した植物成長促進物質を回収してもよい。このように、改変シアノバクテリアを培養しながら培養液中の植物成長促進物質を回収することができるため、培養液から改変シアノバクテリアの菌体を除去する処理が不要となる。そのため、より簡便に、かつ、効率良く植物成長促進剤を製造することができる。
また、培養液からの菌体の回収処理及び菌体の破砕処理が不要となることにより、改変シアノバクテリアが受けるダメージ及びストレスを低減することができる。そのため、改変シアノバクテリアの植物成長促進物質の分泌生産性が低減しにくくなり、より長く改変シアノバクテリアを使用することができる。
以上のように、本実施の形態における改変シアノバクテリアを用いることで、植物成長促進剤を簡便に、かつ、効率よく得ることができる。
以下、シアノバクテリア及び改変シアノバクテリアについて説明する。
［３．シアノバクテリア］
シアノバクテリアは、藍藻又は藍色細菌とも呼ばれ、クロロフィルで光エネルギーを捕集し、得たエネルギーで水を電解して酸素を発生しながら光合成をおこなう原核生物の一群である。シアノバクテリアは、多様性に富んでおり、例えば、細胞形状ではSynechocystis sp. PCC 6803のような単細胞性の種及びAnabaena sp. PCC 7120のような多細胞が連なった糸状性の種がある。生育環境についても、Thermosynechococcus elongatusのような好熱性の種、Synechococcus elongatusのような海洋性の種、Synechocystisのような淡水性の種がある。また、Microcystis aeruginosaのようにガス小胞を持ち毒素を産生する種、及び、チラコイドを持たずに原形質膜に集光アンテナであるフィコビリソームと呼ばれるタンパク質を有するGloeobacter violaceusのように、独自の特徴をもつ種も多数挙げられる。
シアノバクテリアは、藍藻又は藍色細菌とも呼ばれ、クロロフィルで光エネルギーを捕集し、得たエネルギーで水を電解して酸素を発生しながら光合成をおこなう原核生物の一群である。シアノバクテリアは、多様性に富んでおり、例えば、細胞形状ではSynechocystis sp. PCC 6803のような単細胞性の種及びAnabaena sp. PCC 7120のような多細胞が連なった糸状性の種がある。生育環境についても、Thermosynechococcus elongatusのような好熱性の種、Synechococcus elongatusのような海洋性の種、Synechocystisのような淡水性の種がある。また、Microcystis aeruginosaのようにガス小胞を持ち毒素を産生する種、及び、チラコイドを持たずに原形質膜に集光アンテナであるフィコビリソームと呼ばれるタンパク質を有するGloeobacter violaceusのように、独自の特徴をもつ種も多数挙げられる。
図２は、シアノバクテリアの細胞表層を模式的に示した図である。図２に示されるように、シアノバクテリアの細胞表層は、内側から順に、原形質膜（内膜１ともいう）、ペプチドグリカン２、及び細胞最外層を形成する脂質膜である外膜５で構成される。ペプチドグリカン２にはグルコサミン及びマンノサミンなどで構成される糖鎖３が共有結合しており、また、これらの共有結合型の糖鎖３にはピルビン酸が結合している（非特許文献３：Jurgens and Weckesser, 1986, J. Bacteriol., 168:568-573）。本明細書では、ペプチドグリカン２と共有結合型の糖鎖３とを含めて細胞壁４と呼ぶ。また、原形質膜（つまり、内膜１）と外膜５との間隙は、ペリプラズムと呼ばれ、タンパク質の分解又は立体構造の形成、脂質又は核酸の分解、若しくは、細胞外の栄養素の取り込み等に関与する様々な酵素が存在する。
ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質（例えば、図中のSlr1841）は、脂質膜（外膜５ともいう）に埋め込まれたＣ末端側領域と、脂質膜から突き出したＮ末端側のＳＬＨドメイン７から成り、シアノバクテリア及びグラム陰性細菌の一群であるNegativicutes綱に属する細菌において広く分布している（非特許文献４：Kojima et al., 2016, Biosci. Biotech. Biochem., 10:1954-1959）。脂質膜（つまり、外膜５）に埋め込まれた領域は、親水性物質の外膜透過を可能にするためのチャネルを形成し、一方でＳＬＨドメイン７は細胞壁４に結合する機能をもつ（非特許文献５：Kowata et al., 2017, J. Bacteriol., 199:e00371-17）。ＳＬＨドメイン７が細胞壁４に結合するためには、ペプチドグリカン２における共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されている必要がある（非特許文献６：Kojima et al., 2016, J. Biol. Chem., 291:20198-20209）。ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子の例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr1841若しくはslr1908、又はAnabaena sp. 90が保持するoprBなどが挙げられる。
ペプチドグリカン２における共有結合型の糖鎖３のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（以下、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９という）は、グラム陽性菌であるBacillus anthracisにおいて同定され、CsaBと命名されている（非特許文献７：Mesnage et al., 2000, EMBO J., 19:4473-4484）。ゲノム塩基配列が公開されているシアノバクテリアにおいて、多くの種がCsaBとアミノ酸配列の同一性が３０％以上となる相同タンパク質をコードする遺伝子を保持している。例としては、Synechocystis sp. PCC 6803が保持するslr0688又はSynechococcus sp. 7502が保持するsyn7502_03092などが挙げられる。
シアノバクテリアでは、光合成により固定されたＣＯ２は多段階の酵素反応を経て各種アミノ酸及び細胞内分子の前駆体に変換される。それらを原料として、シアノバクテリアの細胞質内でタンパク質及び代謝産物が合成される。それらのタンパク質及び代謝産物の中には、細胞質内で機能するものもあるし、細胞質からペリプラズムに輸送されてペリプラズム内で機能するものもある。しかしながら、細胞外にタンパク質及び代謝産物を積極的に分泌するケースは、現在までシアノバクテリアにおいては報告されていない。
シアノバクテリアは、高い光合成能力を有するため、必ずしも有機物を栄養分として外から取り込む必要がない。そのため、シアノバクテリアは、図２の有機物チャネルタンパク質８（例えば、Slr1270）のように、有機物を透過させるチャネルタンパク質を外膜５に非常にわずかにしか有していない。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、有機物を透過させる有機物チャネルタンパク質８は、外膜５の総タンパク質量の約４％しか存在しない。一方、シアノバクテリアは、生育に必要な無機イオン類を高効率で細胞内に取り込むために、図２のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６（例えば、Slr1841）のように、無機イオン類のみを透過させるイオンチャネルタンパク質を外膜５に多く有する。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803では、無機イオンを透過させるイオンチャネルタンパク質は、外膜５の総タンパク質量の約８０％を占める。
このように、シアノバクテリアでは、外膜５におけるタンパク質などの有機物を透過させるチャネルが非常に少ないため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物を菌体外に積極的に分泌することが難しいと考えられている。
［４．改変シアノバクテリア］
続いて、本実施の形態における改変シアノバクテリアについて図２を参照しながら説明する。
続いて、本実施の形態における改変シアノバクテリアについて図２を参照しながら説明する。
本実施の形態における改変シアノバクテリアは、シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質（以下、結合関連タンパク質ともいう）の機能が抑制又は喪失されている。これにより、改変シアノバクテリアでは、外膜５と細胞壁４との結合（例えば、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物を菌体外に分泌する菌体内産生物質の分泌生産性が向上する。上述したように、菌体内産生物質には、植物の成長促進に関与する菌体内産生物質（つまり、植物成長促進物質）が含まれる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物成長促進物質を菌体外に分泌する植物成長促進物質の分泌生産性も向上する。また、菌体を破砕して植物成長促進物質を回収する必要がないため、植物成長促進物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用することができる。なお、本明細書では、改変シアノバクテリアが菌体内でタンパク質及び代謝物を作り出すことを産生と言い、産生されたタンパク質及び代謝物を菌体外に分泌することを分泌生産と言う。
外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つであってもよい。本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つのタンパク質の機能が抑制又は喪失されている。例えば、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能が抑制又は喪失されてもよく、（ｉｉ）細胞壁４と結合するＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の発現、及び、細胞壁４の表面の結合糖鎖のピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９）の発現の少なくとも１つが抑制されてもよい。これにより、外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。そのため、これらの結合が弱まった部分において外膜５が細胞壁４から脱離しやすくなる。外膜５が細胞壁４から部分的に脱離することにより、改変シアノバクテリアの細胞内、特にペリプラズムに存在するタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が細胞の外（外膜５の外）へ漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物成長促進物質を菌体外に分泌する分泌生産性が向上する。
以下、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの結合関連タンパク質の機能が抑制されることにより外膜５が部分的に細胞壁４から脱離するように改変されたシアノバクテリアについてより具体的に説明する。
本実施の形態における改変シアノバクテリアの親微生物となる、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の発現及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の発現の少なくとも１つを抑制する又は喪失させる前のシアノバクテリア（つまり、親シアノバクテリア）の種類は、特に制限はなく、あらゆる種類のシアノバクテリアであってもよい。例えば、親シアノバクテリアは、Synechocystis属、Synechococcus属、Anabaena属、又は、Thermosynechococcus属であってもよく、中でも、Synechocystis sp. PCC 6803、Synechococcus sp. PCC 7942、又は、Thermosynechococcus elongatus BP-1であってもよい。
これらの親シアノバクテリアにおけるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾反応を触媒する酵素（つまり、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９）のアミノ酸配列、それらの結合関連タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列、及び、当該遺伝子の染色体DNA又はプラスミド上での位置は、上述のNCBIデータベース及びCyanobaseで確認することができる。
なお、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアにおいて機能が抑制又は喪失されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、親シアノバクテリアが保有している限り、いずれの親シアノバクテリアのものであってもよく、それらをコードする遺伝子の存在場所（例えば、染色体DNA上又はプラスミド上）により制限されるものではない。
例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、Slr1841、Slr1908、又は、Slr0042等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、NIES970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、Anacy_5815又はAnacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothece属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYANが挙げられ、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。
より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr1841（配列番号１）、Synechococcus sp. NIES-970のNIES970_09470（配列番号２）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122のAnacy_3458（配列番号３）等であってもよい。また、これらのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制若しくは喪失されていてもよく、（ｉｉ）上記の配列番号１～３で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６又はこれらのいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されていてもよい。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｉｉ）外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５が細胞壁４と結合するための結合ドメイン（例えば、ＳＬＨドメイン７）が細胞壁４と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアでは、菌体内産生物質が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。
一般に、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、タンパク質の立体構造の相同性が高いため、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制又は喪失されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６としては、例えば、上記の配列番号１～３で示されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁４の共有結合型の糖鎖３と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、Slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、Syn7502_03092又はSynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ANA_C20348又はAnacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、CsaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothece属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、CsaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。
より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９は、例えば、Synechocystis sp. PCC 6803のSlr0688（配列番号４）、Synechococcus sp. PCC 7942のSynpcc7942_1529（配列番号５）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122のAnacy_1623（配列番号６）等であってもよい。また、これらの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又はこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の機能が抑制又は喪失されていてもよく、（ｉｉ）上記の配列番号４～６で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又はこれらのいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９とアミノ酸配列が５０％以上同一であるタンパク質の発現が抑制されていてもよい。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される、又は、（ｉｉ）細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９又は当該酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現量が低減する。これにより、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４の糖鎖３が外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と結合する結合量及び結合力が低減する。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４と外膜５との結合力が弱まり、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアでは、菌体内産生物質が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。
また、上述したとおり、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、機能が抑制又は喪失される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９としては、例えば、上記の配列番号４～６で示される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９のいずれかのアミノ酸配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、細胞壁４のペプチドグリカン２の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
なお、本明細書において、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６の機能を抑制する又は喪失させるとは、当該タンパク質の細胞壁４との結合能力を抑制する若しくは喪失させること、当該タンパク質の外膜５への輸送を抑制する若しくは喪失させること、又は、当該タンパク質が外膜５に埋め込まれて機能する能力を抑制する若しくは喪失させることである。
なお、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の機能を抑制する又は喪失するとは、当該タンパク質が細胞壁４の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する機能を抑制する又は喪失させることである。
これらのタンパク質の機能を抑制する又は喪失させる手段としては、タンパク質の機能の抑制又は喪失に通常使用される手段であれば特に限定されない。当該手段は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させること、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又は、これらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどであってもよい。
本実施の形態では、改変シアノバクテリアは、外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性されている。これにより、改変シアノバクテリアでは、細胞壁４と外膜５との結合に関与するタンパク質の発現が抑制されるため、又は、当該タンパク質の機能が抑制若しくは喪失されるため、細胞壁４と外膜５との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減する。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなるため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が外膜５の外、つまり、菌体外に漏出しやすくなる。そのため、改変シアノバクテリアは、菌体内で産生された植物成長促進物質を菌体外に分泌する植物成長促進物質の分泌生産性が向上する。これにより、菌体を破砕するなどの、菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、菌体内産生物質の生理活性の低下及び収率の低下が起こりにくくなる。そのため、菌体内で産生された植物成長促進物質の生理活性の低下及び収率の低下も起こりにくくなるため、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤を製造することができる。また、上記の菌体内産生物質の抽出処理が不要となるため、当該物質を回収した後も、改変シアノバクテリアを繰り返し使用して植物成長促進物質を産生させることができる。
外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つであってもよい。改変シアノバクテリアでは、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つの遺伝子が欠失又は不活性化されている。そのため、改変シアノバクテリアでは、例えば、（ｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの発現が抑制される、又は、（ｉｉ）ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能が抑制若しくは喪失される。そのため、外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３との結合（つまり、結合量及び結合力）が低減する。これにより、外膜５と細胞壁４との結合が弱まった部分において外膜５が細胞壁４から脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５と細胞壁４との結合が低減することにより外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなるため、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなる。これにより、改変シアノバクテリアの菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。
本実施の形態では、シアノバクテリアにおけるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つの機能を抑制する又は喪失させるために、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子の少なくとも１つの転写を抑制してもよい。
例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、slr1841、slr1908、又は、slr0042等であってもよく、Synechococcus属の場合、nies970_09470等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、anacy_5815又はanacy_3458等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、A0A0F6U6F8_MICAE等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothece属の場合、A0A3B8XX12_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがLeptolyngbya属の場合、A0A1Q8ZE23_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、A0A1Z4R6U0_9CYAN等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、A0A1C0VG86_9NOSO等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、B1WRN6_CROS5等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、K9TAE4_9CYAN等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
より具体的には、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr1841（配列番号７）、Synechococcus sp. NIES-970のnies970_09470（配列番号８）、Anabaena cylindrica PCC 7122のanacy_3458（配列番号９）、又は、これらの遺伝子とアミノ酸配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号７～９で示されるいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかのＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６若しくはこれらのいずれかのタンパク質と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。その結果、改変シアノバクテリアでは、外膜５が細胞壁４と結合するための結合ドメイン（例えばＳＬＨドメイン７）が細胞壁４と結合する結合量及び結合力が低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に離脱しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。
上述したように、タンパク質のアミノ酸配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有する可能性が高いと言われている。そのため、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制又は喪失されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子としては、例えば、上記の配列番号７～９で示されるＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であり、かつ、細胞壁４の共有結合型の糖鎖３と結合する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
また、例えば、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子は、親シアノバクテリアがSynechocystis属の場合、slr0688等であってもよく、親シアノバクテリアがSynechococcus属の場合、syn7502_03092又はsynpcc7942_1529等であってもよく、親シアノバクテリアがAnabaena属の場合、ana_C20348又はanacy_1623等であってもよく、親シアノバクテリアがMicrocystis属の場合、csaB (NCBIのアクセスID：TRU80220)等であってもよく、親シアノバクテリアがCyanothece属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_107667006.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがSpirulina属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_026079530.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCalothrix属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_096658142.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがNostoc属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_099068528.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがCrocosphaera属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_012361697.1）等であってもよく、親シアノバクテリアがPleurocapsa属の場合、csaB（NCBIのアクセスID：WP_036798735）等であってもよい。これらの遺伝子の塩基配列は、上述したNCBIデータベース又はCyanobaseから入手できる。
より具体的には、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子は、Synechocystis sp. PCC 6803のslr0688（配列番号１０）、Synechococcus sp. PCC 7942のsynpcc7942_1529（配列番号１１）、又は、Anabaena cylindrica PCC 7122のanacy_1623（配列番号１２）であってもよい。また、これらの遺伝子と塩基配列が５０％以上同一である遺伝子であってもよい。
これにより、改変シアノバクテリアでは、上記の配列番号１０～１２で示されるいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子又はこれらのいずれかの酵素をコードする遺伝子の塩基配列と５０％以上同一である遺伝子が欠失又は不活性化される。そのため、改変シアノバクテリアでは、（ｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の発現が抑制される、又は、（ｉｉ）上記のいずれかの細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９若しくはこれらのいずれかの酵素と同等の機能を有するタンパク質の機能が抑制若しくは喪失される。これにより、細胞壁４の表面の共有結合型の糖鎖３がピルビン酸で修飾されにくくなるため、細胞壁４の糖鎖３が外膜５中のＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６のＳＬＨドメイン７と結合する結合量及び結合力が低減する。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアでは、細胞壁４が外膜５と結合するための糖鎖３がピルビン酸で修飾される量が低減するため、細胞壁４と外膜５との結合力が弱まり、外膜５が細胞壁４から部分的に離脱しやすくなる。これにより、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物が菌体外に漏出しやすくなるため、菌体内で産生された植物成長促進物質も菌体外に漏出しやすくなる。
上述したように、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が３０％以上同一であれば、当該タンパク質と同等の機能を有するタンパク質が発現される可能性が高いと考えられる。そのため、機能が抑制又は喪失される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子としては、例えば、上記の配列番号１０～１２で示される細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子のいずれかの塩基配列と、４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは８０％以上、なお好ましくは９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、細胞壁４のペプチドグリカン２の共有結合型の糖鎖３をピルビン酸で修飾する反応を触媒する機能を有するタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子であってもよい。
［５．改変シアノバクテリアの製造方法］
続いて、本実施の形態における改変シアノバクテリアの製造方法について説明する。改変シアノバクテリアの製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能を抑制又は喪失させるステップを含む。
続いて、本実施の形態における改変シアノバクテリアの製造方法について説明する。改変シアノバクテリアの製造方法は、シアノバクテリアにおいて外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能を抑制又は喪失させるステップを含む。
本実施の形態では、外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質は、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９の少なくとも１つであってもよい。
なお、タンパク質の機能を抑制する又は喪失させる手段としては、特に限定されないが、例えば、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質６をコードする遺伝子及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素９をコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化させること、これらの遺伝子の転写を阻害すること、これらの遺伝子の転写産物の翻訳を阻害すること、又はこれらのタンパク質を特異的に阻害する阻害剤を投与することなどであってもよい。
上記遺伝子を欠失又は不活性化させる手段は、例えば、該当遺伝子の塩基配列上の１つ以上の塩基に対する突然変異の導入、該当塩基配列に対する他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入、又は、該当遺伝子の塩基配列の一部若しくは全部の削除などであってもよい。
上記遺伝子の転写を阻害する手段は、例えば、該当遺伝子のプロモーター領域に対する変異導入、他の塩基配列への置換若しくは他の塩基配列の挿入による当該プロモーターの不活性化、又は、CRISPR干渉法（非特許文献８：Yao et al., ACS Synth. Biol., 2016, 5:207-212）等であってもよい。上記の変異導入、又は塩基配列の置換若しくは挿入の具体的な手法は、例えば、紫外線照射、部位特異的変異導入、又は、相同組換え法などであってもよい。
また、上記遺伝子の転写産物の翻訳を阻害する手段は、例えば、RNA（Ribonucleic Acid）干渉法などであってもよい。
以上のいずれかの手段を用いることにより、シアノバクテリアにおける外膜５と細胞壁４との結合に関与するタンパク質の機能を抑制又は喪失させて、改変シアノバクテリアを製造してもよい。
これにより、上記の製造方法で製造された改変シアノバクテリアは、細胞壁４と外膜５との結合（つまり、結合量及び結合力）が部分的に低減するため、外膜５が細胞壁４から部分的に脱離しやすくなる。その結果、改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生されたタンパク質及び代謝産物などの菌体内産生物質が外膜５の外に（つまり、菌体の外に）漏出しやすくなるため、植物の成長促進に関与する物質（つまり、植物成長促進物質）も菌体外に漏出しやすくなる。したがって、本実施の形態における改変シアノバクテリアの製造方法によれば、植物成長促進物質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供することができる。
また、本実施の形態における製造方法で製造された改変シアノバクテリアでは、菌体内で産生された植物成長促進物質が菌体外に漏出するため、当該物質の回収のために菌体を破砕する必要がない。例えば、改変シアノバクテリアを適切な条件で培養し、次いで培養液中に分泌された植物成長促進物質を回収すればよいため、改変シアノバクテリアを培養しながら培養液中の植物成長促進物質を回収することも可能である。そのため、本製造方法により得られる改変シアノバクテリアを使用すれば、効率のよい微生物学的植物成長促進物質の生産を実施することができる。したがって、本実施の形態における改変シアノバクテリアの製造方法によれば、植物成長促進物質を回収した後も繰り返し使用することができる利用効率の高い改変シアノバクテリアを提供することができる。
［６．植物成長促進方法］
本実施の形態に係る植物成長促進方法は、上記の植物成長促進剤を用いる。上述したように、本実施の形態に係る植物成長促進剤は、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤であるため、上記の植物成長促進剤を用いることにより、効果的に植物の成長を促進することができる。
本実施の形態に係る植物成長促進方法は、上記の植物成長促進剤を用いる。上述したように、本実施の形態に係る植物成長促進剤は、植物成長促進効果が向上した植物成長促進剤であるため、上記の植物成長促進剤を用いることにより、効果的に植物の成長を促進することができる。
上記の植物成長促進剤は、そのままは勿論、濃縮又は希釈して使用されてもよい。当該植物成長促進剤の植物への適用にあたっては、植物の種類、土壌の性質、及び、目的などに応じて、適宜、植物成長促進剤の濃度、及び、適用方法を決定してもよい。植物成長促進剤は、例えば、改変シアノバクテリアの培養液そのものであってもよく、当該培養液から改変シアノバクテリアの菌体を除去した溶液であってもよく、当該培養液から所望の物質を膜技術等により抽出した抽出物であってもよい。所望の物質は、土壌中の養分を分解する酵素であってもよく、土壌中の不溶物質（例えば、鉄などの金属）を可溶化する物質（例えば、キレート効果を有する物質）であってもよく、植物の細胞内生理活性を向上させる物質であってもよい。また、植物成長促進剤の植物への適用方法は、例えば、植物又は土壌への噴霧、潅水、又は、混合などであってもよい。より具体的には、植物体1個体あたり数ミリリットルを週１回程度、植物体の根元に添加してもよい。
以下、実施例にて本開示の改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法及び植物成長促進剤の製造方法について具体的に説明するが、本開示は以下の実施例のみに何ら限定されるものではない。
以下の実施例では、シアノバクテリアの外膜を細胞壁から部分的に脱離させる方法として、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子の発現抑制（実施例１）、及び細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現抑制（実施例２）を行い、２種類の改変シアノバクテリアを製造した。そして、これらの改変シアノバクテリアのタンパク質の分泌生産性の測定と、分泌された菌体内産生物質（ここでは、タンパク質及び細胞内代謝産物）の同定とを行った。なお、本実施例で使用したシアノバクテリア種は、Synechocystis sp. PCC 6803（以下、単に、「シアノバクテリア」と呼ぶ）である。
（実施例１）
実施例１では、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアを製造した。
実施例１では、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードするslr1841遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアを製造した。
（１）slr1841遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
遺伝子発現抑制法として、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）干渉法を用いた。本方法では、dCas9タンパク質をコードする遺伝子（以下、dCas9遺伝子という）と、slr1841_sgRNA（single-guide Ribonucleic Acid）遺伝子とを、シアノバクテリアの染色体DNAに導入することにより、slr1841遺伝子の発現を抑制することができる。
遺伝子発現抑制法として、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）干渉法を用いた。本方法では、dCas9タンパク質をコードする遺伝子（以下、dCas9遺伝子という）と、slr1841_sgRNA（single-guide Ribonucleic Acid）遺伝子とを、シアノバクテリアの染色体DNAに導入することにより、slr1841遺伝子の発現を抑制することができる。
本方法による遺伝子発現抑制の仕組みは次の通りである。
まず、ヌクレアーゼ活性を欠損したCas9タンパク質（dCas9）と、slr1841遺伝子の塩基配列に相補的に結合するsgRNA（slr1841_sgRNA）とが、複合体を形成する。
次に、この複合体がシアノバクテリアの染色体DNA上のslr1841遺伝子を認識し、slr1841遺伝子と特異的に結合する。この結合が立体障害となることにより、slr1841遺伝子の転写が阻害される。その結果、シアノバクテリアのslr1841遺伝子の発現が抑制される。
以下、上記の２つの遺伝子の各々をシアノバクテリアの染色体DNAに導入する方法を具体的に説明する。
（１－１）dCas9遺伝子の導入
Synechocystis LY07株（以下、LY07株ともいう）（非特許文献８参照）の染色体DNAを鋳型として、dCas9遺伝子及びdCas9遺伝子の発現制御のためのオペレーター遺伝子、並びに、遺伝子導入の目印となるスペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子を、表１に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１３）及びpsbA1-Rv（配列番号１４）を用いてPCR（Polymerase Chain Reaction）法により増幅した。なお、LY07株では、上記の３つの遺伝子が連結した状態で染色体DNA上のpsbA1遺伝子に挿入されているため、１つのDNA断片としてPCR法により増幅することができる。ここでは、得られたDNA断片を「psbA1::dCas9カセット」と表記する。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、psbA1::dCas9カセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-dCas9プラスミドを得た。
Synechocystis LY07株（以下、LY07株ともいう）（非特許文献８参照）の染色体DNAを鋳型として、dCas9遺伝子及びdCas9遺伝子の発現制御のためのオペレーター遺伝子、並びに、遺伝子導入の目印となるスペクチノマイシン耐性マーカー遺伝子を、表１に記載のプライマーpsbA1-Fw（配列番号１３）及びpsbA1-Rv（配列番号１４）を用いてPCR（Polymerase Chain Reaction）法により増幅した。なお、LY07株では、上記の３つの遺伝子が連結した状態で染色体DNA上のpsbA1遺伝子に挿入されているため、１つのDNA断片としてPCR法により増幅することができる。ここでは、得られたDNA断片を「psbA1::dCas9カセット」と表記する。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、psbA1::dCas9カセットをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-dCas9プラスミドを得た。
得られたpUC19-dCas9プラスミド1μgとシアノバクテリア培養液（菌体濃度OD730=0.5程度）を混合し、自然形質転換によりpUC19-dCas9プラスミドをシアノバクテリアの細胞内に導入した。形質転換された細胞を20 μg/mLのスペクチノマイシンを含むBG-11寒天培地上で生育させることにより、選抜した。選抜された細胞では、染色体DNA上のpsbA1遺伝子と、pUC19-dCas9プラスミド上のpsbA1上流断片領域及びpsbA1下流断片領域との間で相同組み換えが起こっている。これにより、psbA1遺伝子領域にdCas9カセットが挿入されたSynechocystis dCas9株を得た。なお、用いたBG-11培地の組成は表２の通りである。
（１－２）slr1841_sgRNA遺伝子の導入
CRISPR干渉法では、sgRNA遺伝子上のprotospacerと呼ばれる領域に、標的配列と相補的な約20塩基の配列を導入することにより、sgRNAが標的遺伝子に特異的に結合する。本実施例で用いたprotospacer配列は表３に示される。
CRISPR干渉法では、sgRNA遺伝子上のprotospacerと呼ばれる領域に、標的配列と相補的な約20塩基の配列を導入することにより、sgRNAが標的遺伝子に特異的に結合する。本実施例で用いたprotospacer配列は表３に示される。
Synechocystis LY07株では、sgRNA遺伝子（protospacer領域を除く）とカナマイシン耐性マーカー遺伝子とが連結した形で、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子に挿入されている。したがって、当該sgRNA遺伝子をPCR法により増幅する際に用いるプライマーにslr1841遺伝子（配列番号７）と相補的なprotospacer配列（配列番号２１）を付与することにより、slr1841を特異的に認識するsgRNA (slr1841_sgRNA)を容易に得ることができる。
まず、LY07株の染色体DNAを鋳型とし、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１５）及びsgRNA_slr1841-Rv（配列番号１６）のセット、並びに、sgRNA_slr1841-Fw（配列番号１７）及びslr2031-Rv（配列番号１８）のセットを用いて２つのDNA断片をPCR法により増幅した。
続いて、上記のDNA断片の混合溶液を鋳型として、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１５）とslr2031-Rv（配列番号１８）とを用いてPCR法により増幅することにより、（i）slr2030遺伝子断片、（ii）slr1841_sgRNA、（iii）カナマイシン耐性マーカー遺伝子、（iv）slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片（slr2030-2031::slr1841_sgRNA）を得た。In-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、slr2030-2031::slr1841_sgRNAをpUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr1841_sgRNAプラスミドを得た。
上記（１－１）と同様の方法でpUC19-slr1841_sgRNAプラスミドをSynechocystis dCas9株に導入し、形質転換された細胞を30μg/mLカナマイシンを含むBG-11寒天培地上で選抜した。これにより、染色体DNA上のslr2030-slr2031遺伝子にslr1841_sgRNAが挿入された形質転換体Synechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（以下、slr1841抑制株ともいう）を得た。
（１－３）slr1841遺伝子の抑制
上記dCas9遺伝子及びslr1841_sgRNA遺伝子は、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）の存在下で発現誘導されるようにプロモーター配列が設計されている。本実施例では、培地中に終濃度1μg/mL aTcを添加することによりslr1841遺伝子の発現を抑制した。
上記dCas9遺伝子及びslr1841_sgRNA遺伝子は、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）の存在下で発現誘導されるようにプロモーター配列が設計されている。本実施例では、培地中に終濃度1μg/mL aTcを添加することによりslr1841遺伝子の発現を抑制した。
（実施例２）
実施例２では、下記の手順により、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアを得た。
実施例２では、下記の手順により、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードするslr0688遺伝子の発現が抑制された改変シアノバクテリアを得た。
（２）slr0688遺伝子の発現が抑制されたシアノバクテリア改変株の構築
上記（１－２）と同様の手順により、slr0688遺伝子（配列番号４）と相補的なprotospacer配列（配列番号２２）を含むsgRNA遺伝子をSynechocystis dCas9株に導入し、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を得た。なお、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１５）及びsgRNA_slr0688-Rv（配列番号１９）のセット、並びに、sgRNA_slr0688-Fw（配列番号２０）及びslr2031-Rv（配列番号１８）のセットを用いたことと、（i）slr2030遺伝子断片、（ii）slr0688_sgRNA、（iii）カナマイシン耐性マーカー遺伝子、（iv）slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片（slr2030-2031::slr0688_sgRNA）をIn-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、pUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr0688_sgRNAプラスミドを得たこと以外は、上記（１－２）と同様の条件で行った。
上記（１－２）と同様の手順により、slr0688遺伝子（配列番号４）と相補的なprotospacer配列（配列番号２２）を含むsgRNA遺伝子をSynechocystis dCas9株に導入し、Synechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株を得た。なお、表１に記載のプライマーslr2030-Fw（配列番号１５）及びsgRNA_slr0688-Rv（配列番号１９）のセット、並びに、sgRNA_slr0688-Fw（配列番号２０）及びslr2031-Rv（配列番号１８）のセットを用いたことと、（i）slr2030遺伝子断片、（ii）slr0688_sgRNA、（iii）カナマイシン耐性マーカー遺伝子、（iv）slr2031遺伝子断片が順に連結したDNA断片（slr2030-2031::slr0688_sgRNA）をIn-Fusion PCRクローニング法（登録商標）を用いて、pUC19プラスミドに挿入し、pUC19-slr0688_sgRNAプラスミドを得たこと以外は、上記（１－２）と同様の条件で行った。
さらに、上記（１－３）と同様の手順により、slr0688遺伝子の発現を抑制した。
（比較例１）
比較例１では、実施例１の（１－１）と同様の手順により、Synechocystis dCas9株を得た。
比較例１では、実施例１の（１－１）と同様の手順により、Synechocystis dCas9株を得た。
続いて、実施例１、実施例２及び比較例１で得られた菌株について、それぞれ、細胞表層の状態の観察及びタンパク質の分泌生産性試験を行った。以下、詳細について説明する。
（３）菌株の細胞表層の状態の観察
実施例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（つまり、slr1841抑制株）、実施例２で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株（以下、slr0688抑制株ともいう）、及び、比較例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9株（以下、Control株という）のそれぞれの超薄切片を作製し、電子顕微鏡を用いて細胞表層の状態（言い換えると、外膜構造）を観察した。
実施例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr1841_sgRNA株（つまり、slr1841抑制株）、実施例２で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9 slr0688_sgRNA株（以下、slr0688抑制株ともいう）、及び、比較例１で得られた改変シアノバクテリアSynechocystis dCas9株（以下、Control株という）のそれぞれの超薄切片を作製し、電子顕微鏡を用いて細胞表層の状態（言い換えると、外膜構造）を観察した。
（３－１）菌株の培養
初発菌体濃度OD730=0.05となるように、実施例１のslr1841抑制株を、1μg/mL aTcを含むBG-11培地に接種し、光量100μmol/m2/s、30℃の条件下で５日間振盪培養した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株も実施例１と同様の条件で培養した。
初発菌体濃度OD730=0.05となるように、実施例１のslr1841抑制株を、1μg/mL aTcを含むBG-11培地に接種し、光量100μmol/m2/s、30℃の条件下で５日間振盪培養した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株も実施例１と同様の条件で培養した。
（３－２）菌株の超薄切片の作製
上記（３－１）で得られた培養液を、室温にて2,500gで10分間遠心分離し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を回収した。次いで、細胞を-175℃の液体プロパンで急速凍結した後、2%グルタルアルデヒド及び1%タンニン酸を含むエタノール溶液を用いて-80℃で2日間固定した。固定後の細胞をエタノールにより脱水処理し、脱水した細胞を酸化プロピレンに浸透させたあと、樹脂（Quetol-651）溶液中に沈めた。その後60℃で48時間静置し、樹脂を硬化させて、細胞を樹脂で包埋した。樹脂中の細胞を、ウルトラミクロトーム（Ultracut）を用いて70nmの厚さに薄切し、超薄切片を作成した。この超薄切片を、2%酢酸ウラン及び1%クエン酸鉛溶液を用いて染色して、実施例１のslr1841抑制株の透過型電子顕微鏡の試料を準備した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株についてもそれぞれ同様の操作を行い、透過型電子顕微鏡の試料を準備した。
上記（３－１）で得られた培養液を、室温にて2,500gで10分間遠心分離し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を回収した。次いで、細胞を-175℃の液体プロパンで急速凍結した後、2%グルタルアルデヒド及び1%タンニン酸を含むエタノール溶液を用いて-80℃で2日間固定した。固定後の細胞をエタノールにより脱水処理し、脱水した細胞を酸化プロピレンに浸透させたあと、樹脂（Quetol-651）溶液中に沈めた。その後60℃で48時間静置し、樹脂を硬化させて、細胞を樹脂で包埋した。樹脂中の細胞を、ウルトラミクロトーム（Ultracut）を用いて70nmの厚さに薄切し、超薄切片を作成した。この超薄切片を、2%酢酸ウラン及び1%クエン酸鉛溶液を用いて染色して、実施例１のslr1841抑制株の透過型電子顕微鏡の試料を準備した。なお、実施例２のslr0688抑制株及び比較例１のControl株についてもそれぞれ同様の操作を行い、透過型電子顕微鏡の試料を準備した。
（３－３）電子顕微鏡による観察
透過型電子顕微鏡（JEOL JEM-1400Plus）を用いて、加速電圧100kV下で、上記（３－２）で得られた超薄切片の観察を行った。観察結果を図３～図８に示す。
透過型電子顕微鏡（JEOL JEM-1400Plus）を用いて、加速電圧100kV下で、上記（３－２）で得られた超薄切片の観察を行った。観察結果を図３～図８に示す。
まず、実施例１のslr1841抑制株について説明する。図３は、実施例１のslr1841抑制株のＴＥＭ（Transmission Electron Microscope）像である。図４は、図３の破線領域Ａの拡大像である。図４の（ａ）は、図３の破線領域Ａの拡大ＴＥＭ像であり、図４の（ｂ）は、図４の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
図３に示されるように、実施例１のslr1841抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し（つまり、外膜が部分的に剥がれ落ち）、かつ、外膜が部分的に撓んでいた。
細胞表層の状態をより詳細に確認するために、破線領域Ａを拡大観察したところ、図４の（ａ）及び図４の（ｂ）に示されるように、外膜が部分的に剥がれ落ちた部分（図中の一点破線領域ａ１及びａ２）を確認できた。また、一点破線領域ａ１の傍に外膜が大きく撓んだ部分を確認できた。この部分は、外膜と細胞壁との結合が弱められた部分であり、培養液が外膜からペリプラズム内に浸透したため、外膜が外側に膨張されて、撓んだと考えられる。
続いて、実施例２のslr0688抑制株について説明する。図５は、実施例２のslr0688抑制株のＴＥＭ像である。図６は、図５の破線領域Ｂの拡大像である。図６の(ａ)は、図５の破線領域Ｂの拡大ＴＥＭ像であり、図６の（ｂ）は、図６の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
図５に示されるように、実施例２のslr0688抑制株では、外膜が細胞壁から部分的に剥離し、かつ、外膜が部分的に撓んでいた。また、slr0688抑制株では、外膜が部分的に細胞壁から脱離していることが確認できた。
細胞表層の状態をより詳細に確認するために、破線領域Ｂを拡大観察したところ、図６の（ａ）及び図６の（ｂ）に示されるように、外膜が大きく撓んだ部分（図中の一点破線領域ｂ１）、及び、外膜が部分的に剥がれ落ちた部分（図中の一点破線領域ｂ２及びｂ３）を確認できた。また、一点破線領域ｂ１、ｂ２及びｂ３それぞれの近傍に外膜が細胞壁から脱離している部分を確認できた。
続いて、比較例１のControl株について説明する。図７は、比較例１のControl株のＴＥＭ像である。図８は、図７の破線領域Ｃの拡大像である。図８の（ａ）は、図７の破線領域Ｃの拡大ＴＥＭ像であり、図８の（ｂ）は、図８の（ａ）の拡大ＴＥＭ像を描写した図である。
図７に示されるように、比較例１のControl株の細胞表層は整っており、内膜、細胞壁、外膜、及びＳ層が順に積層された状態を保っていた。つまり、Control株では、実施例１及び２のように外膜が細胞壁から脱離した部分、外膜が細胞壁から剥離した（つまり、剥がれ落ちた）部分、及び、外膜が撓んだ部分は見られなかった。
（４）タンパク質の分泌生産性試験
実施例１のslr1841抑制株、実施例２のslr0688抑制株、及び、比較例１のControl株をそれぞれ培養し、細胞外に分泌されたタンパク質量（以下、分泌タンパク質量ともいう）を測定した。培養液中のタンパク質量により、上記の菌株それぞれのタンパク質の分泌生産性を評価した。なお、タンパク質の分泌生産性とは、細胞内で産生されたタンパク質を細胞外に分泌することにより、タンパク質を生産する能力をいう。以下、具体的な方法について説明する。
実施例１のslr1841抑制株、実施例２のslr0688抑制株、及び、比較例１のControl株をそれぞれ培養し、細胞外に分泌されたタンパク質量（以下、分泌タンパク質量ともいう）を測定した。培養液中のタンパク質量により、上記の菌株それぞれのタンパク質の分泌生産性を評価した。なお、タンパク質の分泌生産性とは、細胞内で産生されたタンパク質を細胞外に分泌することにより、タンパク質を生産する能力をいう。以下、具体的な方法について説明する。
（４－１）菌株の培養
実施例１のslr1841抑制株を上記（３－１）と同様の方法で培養した。培養は、独立して３回行った。なお、実施例２及び比較例１の菌株についても実施例１の菌株と同様の条件で培養した。
実施例１のslr1841抑制株を上記（３－１）と同様の方法で培養した。培養は、独立して３回行った。なお、実施例２及び比較例１の菌株についても実施例１の菌株と同様の条件で培養した。
（４－２）細胞外に分泌されたタンパク質の定量
上記（４－１）で得られた培養液を、室温にて2,500gで10分間遠心分離し、培養上清を得た。得られた培養上清を、ポアサイズ0.22μmのメンブレンフィルターを用いてろ過し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を完全に除去した。ろ過後の培養上清に含まれる総タンパク質量をBCA（Bicinchoninic Acid）法により定量した。この一連の操作を、独立して培養した3つの培養液のそれぞれについて行い、実施例１のslr1841抑制株の細胞外に分泌されたタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。なお、実施例２及び比較例１の菌株についても、それぞれ、同様の条件で3つの培養液のタンパク質の定量を行い、3つの培養液中のタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。
上記（４－１）で得られた培養液を、室温にて2,500gで10分間遠心分離し、培養上清を得た。得られた培養上清を、ポアサイズ0.22μmのメンブレンフィルターを用いてろ過し、実施例１のslr1841抑制株の細胞を完全に除去した。ろ過後の培養上清に含まれる総タンパク質量をBCA（Bicinchoninic Acid）法により定量した。この一連の操作を、独立して培養した3つの培養液のそれぞれについて行い、実施例１のslr1841抑制株の細胞外に分泌されたタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。なお、実施例２及び比較例１の菌株についても、それぞれ、同様の条件で3つの培養液のタンパク質の定量を行い、3つの培養液中のタンパク質量の平均値及び標準偏差を求めた。
結果を図９に示す。図９は、実施例１、実施例２及び比較例１の改変シアノバクテリアの培養上清中のタンパク質量（n=3、エラーバー=SD）を示すグラフである。
図９に示されるように、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株のいずれも、比較例１のControl株と比較して培養上清中に分泌されたタンパク質量(mg/L)が約25倍向上していた。
データの記載を省略するが、培養液の吸光度（730nm）を測定し、菌体乾燥重量1gあたりの分泌タンパク質量（mg protein/g cell dry weight）を算出したところ、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株のいずれも、菌体乾燥重量1gあたりの分泌タンパク質量（mg protein/g cell dry weight）は、比較例１のControl株と比較して、約36倍向上していた。
また、図９に示されるように、ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子（slr1841）の発現を抑制した実施例１のslr1841抑制株よりも、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子（slr0688）の発現を抑制した実施例２のslr0688抑制株の方が、培養上清中に分泌されたタンパク質量が多かった。これは、外膜中のSLHドメイン保持型外膜タンパク質（Slr1841）の数よりも細胞壁表面の共有結合型の糖鎖の数の方が多いことが関係していると考えられる。つまり、実施例２のslr0688抑制株の方が、実施例１のslr1841抑制株よりも外膜と細胞壁との結合量及び結合力がより低下したため、分泌されたタンパク質量が実施例１のslr1841抑制株よりも多くなったと考えられる。
以上の結果より、外膜と細胞壁との結合に関連するタンパク質の機能を抑制することにより、シアノバクテリアの外膜と細胞壁との結合が部分的に弱められ、外膜が細胞壁から部分的に脱離することが確認できた。外膜と細胞壁との結合が弱まることにより、シアノバクテリアの細胞内で産生されたタンパク質が細胞外に漏出しやすくなることも確認できた。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリア及びその製造方法によれば、タンパク質の分泌生産性が大きく向上することが示された。
（５）分泌されたタンパク質の同定
続いて、上記（４－２）で得られた培養上清中に含まれる分泌タンパク質を、LC-MS/MSにより同定した。方法を以下に説明する。
続いて、上記（４－２）で得られた培養上清中に含まれる分泌タンパク質を、LC-MS/MSにより同定した。方法を以下に説明する。
（５－１）試料調製
培養上清の液量に対して8倍量の冷アセトンを加え、20℃で2時間静置後、20,000gで15分間遠心分離し、タンパク質の沈殿物を得た。この沈殿物に100mM Tris pH8.5、0.5%ドデカン酸ナトリウム（SDoD）を加え、密閉式超音波破砕機によってタンパク質を溶解した。タンパク質濃度1μg/mLに調整後、終濃度10mMのジチオスレイトール（DTT）を添加して50℃で30分間静置した。続いて、終濃度30mMのヨードアセトアミド（IAA）を添加し、室温（遮光）で30分間静置した。IAAの反応を止めるために、終濃度60mMのシステインを添加して室温で10分間静置した。トリプシン400ngを添加して37℃で一晩静置し、タンパク質をペプチド断片化した。5%TFA（Trifluoroacetic Acid）を加えた後、室温にて15,000gで10分間遠心分離し、上清を得た。この作業によりSDoDが除去された。C18スピンカラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターにより試料を乾固した。その後、3%アセトニトリル、0.1%ギ酸を加え、密閉式超音波破砕機を用いて試料を溶解した。ペプチド濃度200ng/μLになるように調製した。
培養上清の液量に対して8倍量の冷アセトンを加え、20℃で2時間静置後、20,000gで15分間遠心分離し、タンパク質の沈殿物を得た。この沈殿物に100mM Tris pH8.5、0.5%ドデカン酸ナトリウム（SDoD）を加え、密閉式超音波破砕機によってタンパク質を溶解した。タンパク質濃度1μg/mLに調整後、終濃度10mMのジチオスレイトール（DTT）を添加して50℃で30分間静置した。続いて、終濃度30mMのヨードアセトアミド（IAA）を添加し、室温（遮光）で30分間静置した。IAAの反応を止めるために、終濃度60mMのシステインを添加して室温で10分間静置した。トリプシン400ngを添加して37℃で一晩静置し、タンパク質をペプチド断片化した。5%TFA（Trifluoroacetic Acid）を加えた後、室温にて15,000gで10分間遠心分離し、上清を得た。この作業によりSDoDが除去された。C18スピンカラムを用いて脱塩後、遠心エバポレーターにより試料を乾固した。その後、3%アセトニトリル、0.1%ギ酸を加え、密閉式超音波破砕機を用いて試料を溶解した。ペプチド濃度200ng/μLになるように調製した。
（５－２）LC-MS/MS分析
上記（５－１）で得られた試料をLC-MS/MS装置（UltiMate 3000 RSLCnano LC System) を用いて以下の条件で解析を実施した。
上記（５－１）で得られた試料をLC-MS/MS装置（UltiMate 3000 RSLCnano LC System) を用いて以下の条件で解析を実施した。
試料注入量：200ng
カラム：CAPCELL CORE MP 75μm×250mm
溶媒：A溶媒は0.1%ギ酸水溶液、B溶媒は0.1%ギ酸+80%アセトニトリル
グラジエントプログラム：試料注入4分後にB溶媒8%、27分後にB溶媒44%、28分後にB溶媒80%、34分後に測定終了
カラム：CAPCELL CORE MP 75μm×250mm
溶媒：A溶媒は0.1%ギ酸水溶液、B溶媒は0.1%ギ酸+80%アセトニトリル
グラジエントプログラム：試料注入4分後にB溶媒8%、27分後にB溶媒44%、28分後にB溶媒80%、34分後に測定終了
（５－３）データ解析
得られたデータは以下の条件で解析し、タンパク質及びペプチドの同定ならびに定量値の算出を行った。
得られたデータは以下の条件で解析し、タンパク質及びペプチドの同定ならびに定量値の算出を行った。
ソフトウェア：Scaffold DIA
データベース：UniProtKB/Swiss Prot database (Synechocystis sp. PCC 6803)
Fragmentation：HCD
Precursor Tolerance：8ppm
Fragment Tolerance：10ppm
Data Acquisition Type：Overlapping DIA
Peptide Length：8-70
Peptide Charge：2-8
Max Missed Cleavages：1
Fixed Modification：Carbamidomethylation
Peptide FDR：1%以下
データベース：UniProtKB/Swiss Prot database (Synechocystis sp. PCC 6803)
Fragmentation：HCD
Precursor Tolerance：8ppm
Fragment Tolerance：10ppm
Data Acquisition Type：Overlapping DIA
Peptide Length：8-70
Peptide Charge：2-8
Max Missed Cleavages：1
Fixed Modification：Carbamidomethylation
Peptide FDR：1%以下
同定されたタンパク質のうち相対定量値が最も大きかった30種類のタンパク質のうち、明らかな酵素活性を持つと予想されるものを表４に示す。
これら6種類のタンパク質は、全て、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株の培養上清のそれぞれに含まれていた。これらのタンパク質の全てにおいて、ペリプラズム（外膜と内膜との間隙を指す）移行シグナルが保持されていた。この結果により、実施例１及び実施例２の改変株では、外膜が細胞壁から部分的に脱離することによってペリプラズム内のタンパク質が外膜の外（つまり、菌体外）に漏出しやすくなることが確認できた。したがって、本実施の形態に係る改変シアノバクテリアは、タンパク質の分泌生産性が大幅に向上していることが示された。
（６）分泌された細胞内代謝産物の同定
（６－１）試料調製
改変シアノバクテリアの培養上清80μlに対し内部標準物質の濃度を1,000μMとなるよう調整した20μlの水溶液を加えて攪拌し、限外ろ過後、測定に供した。
（６－１）試料調製
改変シアノバクテリアの培養上清80μlに対し内部標準物質の濃度を1,000μMとなるよう調整した20μlの水溶液を加えて攪拌し、限外ろ過後、測定に供した。
（６－２）CE（Capillary Electrophoresis）-TOFMS（Time-Of-Flight Mass Spectrometry）分析
本試験ではカチオンモード、及び、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。
本試験ではカチオンモード、及び、アニオンモードの測定を以下に示す条件で行った。
［カチオンモード］
装置：Agilent CE-TOFMS system
Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm×80cm
測定条件：
Run buffer: Cation buffer solution (p/n: H3301-1001)
CE voltage: Positive, 30kV
MS ionization: ESI positive
MS scan range: m/z 50-1,000
［アニオンモード］
装置：Agilent CE-TOFMS system
Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm×80cm
測定条件：
Run buffer: Anion buffer solution (p/n: H3301-1001)
CE voltage: Positive, 30kV
MS ionization: ESI negative
MS scan range: m/z 50-1,000
装置：Agilent CE-TOFMS system
Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm×80cm
測定条件：
Run buffer: Cation buffer solution (p/n: H3301-1001)
CE voltage: Positive, 30kV
MS ionization: ESI positive
MS scan range: m/z 50-1,000
［アニオンモード］
装置：Agilent CE-TOFMS system
Capillary: Fused silica capillary i.d. 50μm×80cm
測定条件：
Run buffer: Anion buffer solution (p/n: H3301-1001)
CE voltage: Positive, 30kV
MS ionization: ESI negative
MS scan range: m/z 50-1,000
（６－３）データ処理
CE-TOFMSで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアMasterHands（登録商標） ver.2.17.1.11を用いて、シグナル/ノイズ比3以上のピークを自動検出した。検出されたピークに対して、各代謝産物固有の質量電荷比（m/z）と泳動時間の値を元に、HMT（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ（株））の代謝物質ライブラリに登録された全物質の値と照合して、改変シアノバクテリアの培養上清に含まれる代謝産物を検索した。検索のための許容誤差は、泳動時間で+/-0.5min、m/zで+/-10ppmとした。同定された各代謝産物について100μMの一点検量として濃度を算出した。同定された主要な代謝産物を表５に示す。
CE-TOFMSで検出されたピークは、自動積分ソフトウェアMasterHands（登録商標） ver.2.17.1.11を用いて、シグナル/ノイズ比3以上のピークを自動検出した。検出されたピークに対して、各代謝産物固有の質量電荷比（m/z）と泳動時間の値を元に、HMT（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ（株））の代謝物質ライブラリに登録された全物質の値と照合して、改変シアノバクテリアの培養上清に含まれる代謝産物を検索した。検索のための許容誤差は、泳動時間で+/-0.5min、m/zで+/-10ppmとした。同定された各代謝産物について100μMの一点検量として濃度を算出した。同定された主要な代謝産物を表５に示す。
これら12種類の細胞内代謝産物は、全て、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株の培養上清のそれぞれに含まれていた。データは載せていないが、比較例１のControl株の培養上清には、これらの代謝産物は含まれていなかった。この結果により、実施例１及び実施例２の改変株では、外膜が細胞壁から部分的に脱離することによって細胞内代謝産物が外膜の外（つまり、菌体外）に漏出しやすくなることが確認できた。
（７）植物栽培試験
続いて、改変シアノバクテリアの分泌物（ここでは、改変シアノバクテリアの培養上清）の植物成長促進効果を評価するために、以下の植物栽培試験を実施した。具体的には、栄養成長に対する効果を評価するために、ホウレン草栽培試験を実施した。また、生殖成長に対する効果を評価するために、ペチュニア栽培試験を実施した。さらに、果実をつける植物、及び、水耕栽培される植物の成長に対する効果を評価するために、トマト、イチゴ、及び、レタスの栽培試験を行った。以下、これらの栽培試験についてそれぞれ説明する。
続いて、改変シアノバクテリアの分泌物（ここでは、改変シアノバクテリアの培養上清）の植物成長促進効果を評価するために、以下の植物栽培試験を実施した。具体的には、栄養成長に対する効果を評価するために、ホウレン草栽培試験を実施した。また、生殖成長に対する効果を評価するために、ペチュニア栽培試験を実施した。さらに、果実をつける植物、及び、水耕栽培される植物の成長に対する効果を評価するために、トマト、イチゴ、及び、レタスの栽培試験を行った。以下、これらの栽培試験についてそれぞれ説明する。
（７－１）ホウレン草栽培試験
ホウレン草栽培試験では、植物が茎、葉、及び、根などの栄養器官のみを作る栄養成長に対する改変シアノバクテリア分泌物の植物成長促進効果を、以下の実施例３及び比較例２～７により評価した。
ホウレン草栽培試験では、植物が茎、葉、及び、根などの栄養器官のみを作る栄養成長に対する改変シアノバクテリア分泌物の植物成長促進効果を、以下の実施例３及び比較例２～７により評価した。
まず、栽培用ポット（12cm×10cm）に、市販の培養土入れ、ポットあたり3粒のホウレン草の種子を播種した。栽培は、室内温度が23℃、白色光源の光量子束密度が100μmol/m2/sで、明条件10時間及び暗条件14時間の条件で40日間行った。その間、各ポットに、50mLの蒸留水を１日おきに給水した。栽培開始からおよそ１週間後、子葉が展開した段階で間引きし、各ポットにおける個体サイズを揃えた。
（実施例３）
上記のように、各ポットの個体サイズを揃えた後、改変シアノバクテリアの培養上清（以下、改変シアノバクテリアの分泌物と呼ぶ）を１株あたり5mL、１週間に１回、ホウレン草の根元に添加した。そして、栽培40日後にホウレン草を収穫し、総葉長及び地上部乾重量を測定した。総葉長は、葉身と葉柄部を含めた長さを、全葉数分の加算した値である。地上部乾重量は、地上に露出している葉茎部の乾燥重量である。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株であり、実施例３では、実施例１及び実施例２の改変シアノバクテリアの培養上清を使用した。そして、栽培40日後の13ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差（SD）を求めた。
上記のように、各ポットの個体サイズを揃えた後、改変シアノバクテリアの培養上清（以下、改変シアノバクテリアの分泌物と呼ぶ）を１株あたり5mL、１週間に１回、ホウレン草の根元に添加した。そして、栽培40日後にホウレン草を収穫し、総葉長及び地上部乾重量を測定した。総葉長は、葉身と葉柄部を含めた長さを、全葉数分の加算した値である。地上部乾重量は、地上に露出している葉茎部の乾燥重量である。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株であり、実施例３では、実施例１及び実施例２の改変シアノバクテリアの培養上清を使用した。そして、栽培40日後の13ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差（SD）を求めた。
（比較例２）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の13ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の13ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（比較例３）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、シアノバクテリア用培地BG-11を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の6ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、シアノバクテリア用培地BG-11を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の6ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（比較例４）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、親シアノバクテリア（Synechocystis sp. PCC 6803）の培養上清を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の4ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、親シアノバクテリア（Synechocystis sp. PCC 6803）の培養上清を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の4ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（比較例５）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、特許文献５の開示に従って調製した親シアノバクテリア（Synechocystis sp. PCC 6803）の細胞抽出液（熱水抽出）を100ppm含む蒸留水（以下、親シアノバクテリアの熱水抽出物と呼ぶ）を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の5ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、特許文献５の開示に従って調製した親シアノバクテリア（Synechocystis sp. PCC 6803）の細胞抽出液（熱水抽出）を100ppm含む蒸留水（以下、親シアノバクテリアの熱水抽出物と呼ぶ）を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の5ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（比較例６）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、水溶性ホウ素0.005%を含む原液の500倍希釈液）を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の6ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、水溶性ホウ素0.005%を含む原液の500倍希釈液）を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の6ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（比較例７）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、有機肥料（副産動物質肥料であって、植物発酵生産物を含む原液の500倍希釈液）を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の6ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、有機肥料（副産動物質肥料であって、植物発酵生産物を含む原液の500倍希釈液）を使用したこと以外、実施例３と同様に行った。そして、栽培40日後の6ポットのホウレン草のそれぞれについて、総葉長及び地上部乾重量を測定し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（結果）
実施例３及び比較例２～７の結果を図１０に示す。図１０は、ホウレン草栽培試験の結果を示す図である。
実施例３及び比較例２～７の結果を図１０に示す。図１０は、ホウレン草栽培試験の結果を示す図である。
図１０に示される総葉長及び地上部乾重量は、比較例２（図中の添加成分が水）で得られたホウレン草の総葉長及び地上部乾重量の数値（平均値+/-SD）をそれぞれ1として規格化した値である。また、図１０には、葉の付き方、及び、茎の太さなどの生育状態の違いを視覚的に示すために、実施例３及び比較例２～７のそれぞれの代表的な個体の写真を掲載している。
（１）まず、総葉長の結果について説明する。
比較例２（水）の総葉長と同等であった個体は、比較例３（シアノバクテリア用培地）、及び、比較例６（化学肥料）の個体であった。
比較例２（水）の総葉長を下回った個体は、比較例４（親シアノバクテリアの培養液）、及び、比較例７（有機肥料）の個体であった。
比較例２（水）の総葉長を上回った個体は、比較例５（親シアノバクテリアの熱水抽出物）、及び、実施例３（改変シアノバクテリアの分泌物）の個体であった。より具体的には、比較例５（親シアノバクテリアの熱水抽出物）の総葉長は、比較例２（水）の約1.1倍であったが、実施例３（改変シアノバクテリアの分泌物）の総葉長は、比較例２（水）の約1.3倍であった。つまり、改変シアノバクテリア分泌物を与えた実施例３の個体は、親シアノバクテリアの熱水抽出物を与えた比較例５の個体よりも、顕著な成長効果が見られた。
（２）続いて、地上部乾重量の結果について説明する。
比較例２（水）の地上部乾重量と同等であった個体は、比較例７（有機肥料）の個体であった。
比較例２（水）の地上部乾重量を下回った個体は、比較例３（シアノバクテリア用培地）、比較例４（親シアノバクテリアの培養液）、及び、比較例５（親シアノバクテリアの熱水抽出物）の個体であった。
比較例２（水）の地上部乾重量を上回った個体は、比較例６（化学肥料）、及び、実施例３（改変シアノバクテリアの分泌物）の個体であった。より具体的には、比較例６（化学肥料）の地上部乾重量は、比較例２（水）の約1.1倍であったが、実施例３（改変シアノバクテリアの分泌物）の地上部乾重量は、比較例２（水）の約1.5倍であった。つまり、改変シアノバクテリア分泌物を与えた実施例３の個体は、化学肥料を与えた比較例６よりも顕著な増体効果が見られた。
続いて、個体の生育状態を比較した結果について説明する。
比較例４の親シアノバクテリアの培養液を与えた個体は、比較例３のシアノバクテリア用培地を与えた個体よりも生育状態が悪かった。これらの代表的な個体の写真を比較しても、比較例４の個体は、比較例３の個体よりも茎が細く、茎も葉も全体的に張りがない。
比較例５の親シアノバクテリアの熱水抽出物を与えた個体は、比較例４の親シアノバクテリアの培養液を与えた個体よりも生育状態が良かった。これらの代表的な個体の写真を比較しても、比較例５の個体は、比較例４の個体よりも茎が太く、葉の厚みがあり、茎も葉も全体的に張りがある。この結果から、親シアノバクテリアの菌体内では、植物の成長促進に関する物質が産生されており、当該物質は、親シアノバクテリアの菌体を熱水で処理することにより、菌体外に漏出され、ホウレン草の成長促進に関与したと考えられる。
実施例３の改変シアノバクテリア分泌物を与えた個体は、比較例５の親シアノバクテリアの熱水抽出物を与えた個体よりも生育状態が良かった。これらの代表的な個体の写真を比較しても、実施例３の個体は、比較例５の個体よりも茎が太く、葉の厚みがあり、葉の枚数も多く、茎も葉も全体的に張りがある。より具体的には、実施例３の個体の総葉長及び地上部乾重量は、それぞれ、比較例５の個体の約1.2倍、及び、約1.6倍であった。この結果から、親シアノバクテリア及び改変シアノバクテリアの双方の菌体内で産生される物質には、例えばタンパク質のように、熱により変性し、その機能が失われやすい物質が含まれていると考えられる。
また、実施例３の改変シアノバクテリア分泌物を与えた個体は、比較例６の化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%）を与えた個体よりも生育状態が良かった。これらの代表的な個体の写真を比較しても、実施例３の個体は、比較例６の個体よりも茎が太く、葉の厚みがあり、葉数も多く、茎も葉も全体的に張りがある。この結果、改変シアノバクテリア分泌物に含まれる物質がホウレン草の成長促進に関与していると考えられる。
また、実施例３の改変シアノバクテリア分泌物を与えた個体は、比較例７の有機肥料（副産動物質肥料であって、植物発酵生産物を含む）を与えた個体よりも生育状態が良かった。これらの代表的な個体の写真を比較しても、実施例３の個体は、比較例７の個体よりも茎が太く、葉の厚みがあり、葉数も多く、茎も葉も全体的に張りがある。この結果、改変シアノバクテリア分泌物に含まれる物質がホウレン草の成長促進に関与していると考えられる。
以上より、改変シアノバクテリアの分泌物には、植物（ここでは、ホウレン草）の成長促進に関与する物質が複数含まれており、それらの物質には、熱により失活する物質も含まれていることが分かった。また、改変シアノバクテリアの培養上清で植物の成長促進効果が見られ、親シアノバクテリアの培養液では当該効果が見られなかったことから、植物の成長促進に関与する物質は、菌体外に分泌されることにより、植物に成長促進に作用することがわかった。このことから、植物の成長促進のためには、当該分泌物が土または植物体そのものと接触し、何らかの生理活性を作用させる必要があると推察される。事実、親シアノバクテリアの抽出物において、その過程で熱水抽出などの生体成分の変性を伴う手段を用いると植物成長促進効果が大きく損なわれることからも、植物成長促進作用のために何らかの生理活性が必要であることが示唆される。
（７－２）ペチュニア栽培試験
ペチュニア栽培試験では、植物が花芽を作り、花を咲かせ、実を結んで種を作る生殖成長に対する改変シアノバクテリア分泌物の植物成長促進効果を、以下の実施例４及び比較例８により評価した。
ペチュニア栽培試験では、植物が花芽を作り、花を咲かせ、実を結んで種を作る生殖成長に対する改変シアノバクテリア分泌物の植物成長促進効果を、以下の実施例４及び比較例８により評価した。
まず、栽培用ポット（12cm×10cm）に、市販の培養土入れ、ポットあたり3粒のペチュニアの種子を播種した。栽培は、室内温度が23℃、白色光源の光量子束密度が200μmol/m2/sで、明条件16時間及び暗条件8時間の条件で60日間行った。その間、50mLの蒸留水を1日おきに給水した。栽培開始からおよそ1週間後、子葉が展開した段階で間引きし、各ポットにおける個体サイズを揃えた。
（実施例４）
上記のように、各ポットの個体サイズを揃えた後、改変シアノバクテリア分泌物を１株あたり5mL、1週間に１回、ペチュニアの根元に添加した。なお、改変シアノバクテリア分泌物は、実施例２のslr0688抑制株の培養上清である。そして、栽培40日後及び60日後の３ポットのペチュニアのそれぞれについて、花及び蕾の数を計数し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
上記のように、各ポットの個体サイズを揃えた後、改変シアノバクテリア分泌物を１株あたり5mL、1週間に１回、ペチュニアの根元に添加した。なお、改変シアノバクテリア分泌物は、実施例２のslr0688抑制株の培養上清である。そして、栽培40日後及び60日後の３ポットのペチュニアのそれぞれについて、花及び蕾の数を計数し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（比較例８）
上記の比較例６で使用した化学肥料（500倍希釈）を１株あたり50mL、2週間に1回、ペチュニアの根元に添加した。そして、栽培40日後及び60日後の３ポットのペチュニアのそれぞれについて、花及び蕾の数を計数し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
上記の比較例６で使用した化学肥料（500倍希釈）を１株あたり50mL、2週間に1回、ペチュニアの根元に添加した。そして、栽培40日後及び60日後の３ポットのペチュニアのそれぞれについて、花及び蕾の数を計数し、それらの平均値及び標準偏差を求めた。
（結果）
実施例４及び比較例８の結果を図１１に示す。図１１は、ペチュニア栽培試験の結果を示す図である。図１１には、代表的な個体の写真が掲載され、花数及び蕾数（平均値+/-SD）が示されている。
実施例４及び比較例８の結果を図１１に示す。図１１は、ペチュニア栽培試験の結果を示す図である。図１１には、代表的な個体の写真が掲載され、花数及び蕾数（平均値+/-SD）が示されている。
（１）まず、実施例４及び比較例８の栽培40日後の生育状態の比較結果について説明する。
実施例４の個体では、栽培40日後の花数が6.3+/-2.5（n=3）であるのに対し、比較例８の個体では花数が0(n=3)であった。また、実施例４の個体では、蕾数が8.7+/-3.1(n=3)であるのに対し、比較例８の個体では、蕾数が2.7+/-3.8(n=3)であった。つまり、栽培40日後の実施例４の個体の蕾数は、比較例８の個体の蕾数の約3倍であった。これらの代表的な個体の写真を比較しても、実施例４の個体の方が比較例８の個体よりも成長が促進されていることが確認できる。より具体的には、実施例４の個体では、花が12個、蕾が4個確認できるのに対し、比較例８の個体では、花数が0個であり、蕾数が1個しか確認できない。これらの結果から、改変シアノバクテリア分泌物に含まれる物質がペチュニアの成長促進に関与していると考えられる。
（２）続いて、実施例４及び比較例８の栽培60日後の生育状態の比較結果について説明する。
実施例４の個体では、栽培60日後の花数が17.3+/-3.1(n=3)であるのに対し、比較例８の個体では、花数が5.7+/-5.1(n=3)であった。つまり、栽培60日後の実施例４の個体の花数は、比較例８の個体の花数の約3倍であった。また、実施例４の個体では、蕾数が17.6+/-3.8（n=3）であるのに対し、比較例８の個体では、蕾数が11.7+/-3.1(n=3)であった。つまり、栽培60日後の実施例４の個体の蕾数は、比較例８の個体の蕾数の約1.5倍であった。これらの代表的な個体の写真を比較しても、実施例４の個体の方が比較例８の個体よりも成長が促進されていることが確認できる。より具体的には、実施例４の個体では、花が24個、蕾が18個確認できるのに対し、比較例８の個体は、花が6個、蕾が11個しか確認できない。これらの結果から、改変シアノバクテリア分泌物に含まれる物質がペチュニアの成長促進に関与していると考えられる。
（３）続いて、実施例４及び比較例８のそれぞれの生育状態の推移について説明する。
実施例４の個体では、栽培60日後の花数は、栽培40日後の花数の約3倍に増え、栽培60日後の蕾数は、栽培40日後の蕾数の約2倍に増えた。
一方、比較例８の個体では、花数は、栽培40日後の花数0から、栽培60日後の花数5.7+/-5.1(n=3)に増え、蕾数は、栽培60日後には、栽培40日後の蕾数の約4倍に増えた。
比較例８の個体は、実施例３の個体に比べて、花芽が形成されるまでの期間が長い。つまり、比較例８の個体は、実施例３の個体ほど成長が促進されなかったため、栄養成長にかかる時間が長く、生殖成長の開始時期が遅かったと考えられる。
また、実施例４の改変シアノバクテリア分泌物を与えた個体では、比較例８の化学肥料を与えた個体に比べて、顕著な開花促進が見られたことから、当該分泌物には植物の成長促進に関与する物質が含まれることが確認できた。
（７－３）トマト栽培試験
まず、栽培用プランター（22cm×16cm）に、市販の培養土を入れ、プランターあたり3粒のトマトの種子を播種した。栽培は、室内温度が23℃、白色光源の光量子束密度が250μmol/m2/sで、明条件16時間及び暗条件8時間の条件で150日間行った。その間、各プランターに、500mLの蒸留水を2日おきに給水した。栽培開始からおよそ1週間後、子葉が展開した段階で間引きし、各プランターにおける個体サイズを揃えた。また、50日に1回、市販の化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、水溶性ホウ素0.005%を含む原液の500倍希釈液）を各プランターあたり500mL施用した。
まず、栽培用プランター（22cm×16cm）に、市販の培養土を入れ、プランターあたり3粒のトマトの種子を播種した。栽培は、室内温度が23℃、白色光源の光量子束密度が250μmol/m2/sで、明条件16時間及び暗条件8時間の条件で150日間行った。その間、各プランターに、500mLの蒸留水を2日おきに給水した。栽培開始からおよそ1週間後、子葉が展開した段階で間引きし、各プランターにおける個体サイズを揃えた。また、50日に1回、市販の化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、水溶性ホウ素0.005%を含む原液の500倍希釈液）を各プランターあたり500mL施用した。
（実施例５）
上記のように、各プランターの個体サイズを揃えた後、改変シアノバクテリアの分泌物を１株あたり5mL、1週間に1回、根元に添加した。150日間栽培し、その間、トマト果実が赤く成熟したものから順に収穫し、収穫日までの累計収穫数（果実数ともいう）を記録した。また、収穫した果実の重量を測定し、平均値及び標準偏差（SD）を求めた。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
上記のように、各プランターの個体サイズを揃えた後、改変シアノバクテリアの分泌物を１株あたり5mL、1週間に1回、根元に添加した。150日間栽培し、その間、トマト果実が赤く成熟したものから順に収穫し、収穫日までの累計収穫数（果実数ともいう）を記録した。また、収穫した果実の重量を測定し、平均値及び標準偏差（SD）を求めた。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
（比較例９）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例５と同様に行った。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例５と同様に行った。
（結果）
実施例５及び比較例９の結果を図１２及び図１３に示す。図１２及び図１３は、トマト栽培試験の結果を示す図である。
実施例５及び比較例９の結果を図１２及び図１３に示す。図１２及び図１３は、トマト栽培試験の結果を示す図である。
図１２に示されるように、実施例５で栽培された株は、比較例９で栽培された株よりも果実の収穫時期が早まった。さらに、実施例５で収穫された果実数は、比較例９で収穫された果実数よりも約67%増加した。
また、図１３に示されるように、実施例５及び比較例９で収穫された果実1個あたりの平均重量は、殆ど同じであった。
（７－４）イチゴ栽培試験
葉数約9枚、株長約7cmのイチゴ苗を市販の培養土を入れた栽培用ポット（12cm×10cm）に定植した。栽培は、明期温度が20℃、暗期温度が15℃、白色光源の光量子束密度が200μmol/m2/sで、明条件14時間及び暗条件10時間の条件で150日間行った。その間、各ポットに、50mLの蒸留水を1日おきに給水した。また、50日に1回、市販の化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、及び、水溶性ホウ素0.005%を含む原液の500倍希釈液）を各ポットあたり100mL施用した。
葉数約9枚、株長約7cmのイチゴ苗を市販の培養土を入れた栽培用ポット（12cm×10cm）に定植した。栽培は、明期温度が20℃、暗期温度が15℃、白色光源の光量子束密度が200μmol/m2/sで、明条件14時間及び暗条件10時間の条件で150日間行った。その間、各ポットに、50mLの蒸留水を1日おきに給水した。また、50日に1回、市販の化学肥料（窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、及び、水溶性ホウ素0.005%を含む原液の500倍希釈液）を各ポットあたり100mL施用した。
（実施例６）
上記の栽培期間中、改変シアノバクテリアの分泌物を１株あたり5mL、1週間に1回、根元に添加した。イチゴ果実が赤く成熟したものから順に収穫し、収穫日までの累計収穫数（つまり、果実数）を記録した。また、収穫した果実の重量を測定し、平均値及び標準偏差（SD）を求めた。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
上記の栽培期間中、改変シアノバクテリアの分泌物を１株あたり5mL、1週間に1回、根元に添加した。イチゴ果実が赤く成熟したものから順に収穫し、収穫日までの累計収穫数（つまり、果実数）を記録した。また、収穫した果実の重量を測定し、平均値及び標準偏差（SD）を求めた。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
（比較例１０）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例６と同様に行った。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例６と同様に行った。
（結果）
実施例６及び比較例１０の結果を図１４～図１６に示す。図１４～図１６は、イチゴ栽培試験の結果を示す図である。図１５には、果実及び花の付き方などの生育状態の違いを視覚的に示すために、実施例６及び比較例１０で栽培された株の苗の定植後110日後の写真を掲載している。
実施例６及び比較例１０の結果を図１４～図１６に示す。図１４～図１６は、イチゴ栽培試験の結果を示す図である。図１５には、果実及び花の付き方などの生育状態の違いを視覚的に示すために、実施例６及び比較例１０で栽培された株の苗の定植後110日後の写真を掲載している。
図１４に示されるように、実施例６で栽培された株は、比較例１０で栽培された株よりも果実の収穫時期が早まった。さらに、実施例６で収穫された果実数は、比較例１０で収穫された果実数よりも約47%増加した。
また、図１５に示されるように、実施例６で栽培された株は、比較例１０で栽培された株よりも葉が茂り、花、つぼみ及び果実の数も多く、生育が良好であった。
また、図１６に示されるように、実施例６及び比較例１０で収穫された果実１個あたりの平均重量については、有意な変化はなかった。
（７－５）レタス水耕栽培試験
水耕用の培養液は、窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、及び、水溶性ホウ素0.005%を含む市販の培養液原液の500倍希釈液を用いた。光条件は白色光源の光量子束密度200μmol/m2/s、明条件16時間及び暗条件8時間の条件で室温（22℃）にて35日間栽培した。
水耕用の培養液は、窒素全量6%、水溶性リン酸10%、水溶性カリウム5%、水溶性苦土0.05%、水溶性マンガン0.001%、及び、水溶性ホウ素0.005%を含む市販の培養液原液の500倍希釈液を用いた。光条件は白色光源の光量子束密度200μmol/m2/s、明条件16時間及び暗条件8時間の条件で室温（22℃）にて35日間栽培した。
（実施例７）
上記の栽培期間中、改変シアノバクテリアの分泌物を1株あたり5mLとなる分量を1週間に1回、水耕用の培養液に添加した。収穫後、株重量を測定し、平均値及び標準偏差（SD）を求めた。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
上記の栽培期間中、改変シアノバクテリアの分泌物を1株あたり5mLとなる分量を1週間に1回、水耕用の培養液に添加した。収穫後、株重量を測定し、平均値及び標準偏差（SD）を求めた。なお、改変シアノバクテリアは、実施例１のslr1841抑制株及び実施例２のslr0688抑制株である。
（比較例１１）
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例７と同様に行った。
改変シアノバクテリアの分泌物の代わりに、水を使用したこと以外、実施例７と同様に行った。
（結果）
実施例７及び比較例１１の結果を図１７及び図１８に示す。図１７及び図１８は、レタス水耕栽培試験の結果を示す図である。図１７には、葉の付き方などの生育状態の違いを視覚的に示すために、実施例７及び比較例１１で栽培された株の栽培３４日後の写真を掲載している。
実施例７及び比較例１１の結果を図１７及び図１８に示す。図１７及び図１８は、レタス水耕栽培試験の結果を示す図である。図１７には、葉の付き方などの生育状態の違いを視覚的に示すために、実施例７及び比較例１１で栽培された株の栽培３４日後の写真を掲載している。
図１７に示されるように、実施例７で栽培された株は、比較例１１で栽培された株よりも葉数が多く、生育が良好であった。
また、図１８に示されるように、実施例７で収穫された株の平均重量は、比較例１１で収穫された株よりも約21%増加していた。
（まとめ）
ホウレン草栽培試験及びペチュニア栽培試験の結果から、本実施の形態に係る植物成長促進剤は、従来の植物成長促進剤（例えば、化学肥料、有機肥料及び親シアノバクテリアの熱水抽出物など）に比べて高い植物成長促進効果を有することが確認できた。
ホウレン草栽培試験及びペチュニア栽培試験の結果から、本実施の形態に係る植物成長促進剤は、従来の植物成長促進剤（例えば、化学肥料、有機肥料及び親シアノバクテリアの熱水抽出物など）に比べて高い植物成長促進効果を有することが確認できた。
また、トマト栽培試験、及び、イチゴ栽培試験の結果から、果実をつける植物について、従来の植物成長促進剤（例えば、化学肥料）に加えて本実施の形態に係る植物成長促進剤を添加することにより、高い植物成長促進効果が得られることが確認できた。
また、レタス水耕栽培試験の結果から、土壌栽培される植物だけでなく、水耕栽培される植物に対しても高い植物成長促進効果を有することが確認できた。
本開示によれば、植物成長促進物質の分泌生産性が向上した改変シアノバクテリアを提供することができる。また、本開示の改変シアノバクテリアを培養すれば、効率良く上記物質を製造することができ、例えば当該物質を土に添加することにより植物の成長を促進することができ、作物の収穫量増が期待できる。
１ 内膜
２ ペプチドグリカン
３ 糖鎖
４ 細胞壁
５ 外膜
６ ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質
７ ＳＬＨドメイン
８ 有機物チャネルタンパク質
９ 細胞壁－ピルビン酸修飾酵素
２ ペプチドグリカン
３ 糖鎖
４ 細胞壁
５ 外膜
６ ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質
７ ＳＬＨドメイン
８ 有機物チャネルタンパク質
９ 細胞壁－ピルビン酸修飾酵素
Claims (4)
- シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失されている改変シアノバクテリアを準備するステップと、
前記改変シアノバクテリアに植物の生長促進に関与する分泌物を分泌させるステップと、
を含み、
前記シアノバクテリアは、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つを保有し、
前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質は、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質、及び、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つであり、
前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるSlr1841、又は、前記Slr1841とアミノ酸配列が９０％以上同一であるタンパク質であり、
前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるSlr0688、又は、前記Slr0688とアミノ酸配列が９０％以上同一であるタンパク質である、
植物成長促進剤の製造方法。 - シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又
は喪失されている改変シアノバクテリアを準備するステップと、
前記改変シアノバクテリアに植物の生長促進に関与する分泌物を分泌させるステップと、
を含み、
前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子が欠失又は不活性化されており、
前記外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質を発現させる遺伝子は、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つであり、
前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号７で示される塩基配列からなるslr1841、又は、前記slr1841と塩基配列が９０％以上同一である遺伝子であり、
前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素をコードする遺伝子は、配列番号１０で示される塩基配列からなるslr0688、又は、前記slr0688と塩基配列が９０％以上同一である遺伝子である、
植物成長促進剤の製造方法。 - シアノバクテリアにおいて外膜と細胞壁との結合に関与するタンパク質の機能が抑制又は喪失され、生命機能を有する改変シアノバクテリアの分泌物を含み、前記改変シアノバクテリア自体を含まず、
前記シアノバクテリアは、ＳＬＨ（Surface Layer Homology）ドメイン保持型外膜タンパク質、及び、細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つを保有し、
前記外膜と前記細胞壁との結合に関与するタンパク質は、前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質、及び、前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素の少なくとも１つであり、
前記ＳＬＨドメイン保持型外膜タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるSlr1841、又は、前記Slr1841とアミノ酸配列が９０％以上同一であるタンパク質であり、
前記細胞壁－ピルビン酸修飾酵素は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるSlr0688、又は、前記Slr0688とアミノ酸配列が９０％以上同一であるタンパク質である、
植物成長促進剤。 - 請求項３に記載の植物成長促進剤を用いる、
植物成長促進方法。
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