JPH0714348B2 - 細菌生産物の外在化に用いるｄｎａフラグメントおよび細菌 - Google Patents
細菌生産物の外在化に用いるｄｎａフラグメントおよび細菌Info
- Publication number
- JPH0714348B2 JPH0714348B2 JP5184810A JP18481093A JPH0714348B2 JP H0714348 B2 JPH0714348 B2 JP H0714348B2 JP 5184810 A JP5184810 A JP 5184810A JP 18481093 A JP18481093 A JP 18481093A JP H0714348 B2 JPH0714348 B2 JP H0714348B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- lambda
- phage
- dna
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 53
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 115
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 33
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 20
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 20
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 20
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 20
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 20
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 19
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 claims description 11
- 101150034144 ci gene Proteins 0.000 claims description 10
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 9
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150045515 O gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 26
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 15
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 14
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 101100402127 Escherichia coli (strain K12) moaA gene Proteins 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M Chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 10
- 101150036274 kil gene Proteins 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 8
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 8
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 8
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 8
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 8
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 8
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 101710126949 Lysin Proteins 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- -1 red Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 101150060445 uvrB gene Proteins 0.000 description 4
- 101150037092 CHLD gene Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 101150090193 modC gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 241000701950 Bacillus phage phi105 Species 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000008016 Eukaryotic Initiation Factor-3 Human genes 0.000 description 2
- 102100039554 Galectin-8 Human genes 0.000 description 2
- 101001011019 Gallus gallus Gallinacin-10 Proteins 0.000 description 2
- 101000887168 Gallus gallus Gallinacin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 2
- 241000702058 Phage 21 Species 0.000 description 2
- 101150064691 Q gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 244000144992 flock Species 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000870242 Bacillus phage Nf Tail knob protein gp9 Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001137855 Caudovirales Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 239000012623 DNA damaging agent Substances 0.000 description 1
- 101100011399 Danio rerio eif3ea gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101100145155 Escherichia phage lambda cIII gene Proteins 0.000 description 1
- 108010089790 Eukaryotic Initiation Factor-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000813777 Homo sapiens Splicing factor ESS-2 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101150008815 INT6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- SSISHJJTAXXQAX-ZETCQYMHSA-N L-ergothioneine Chemical compound C[N+](C)(C)[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC(=S)N1 SSISHJJTAXXQAX-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 241000406668 Loxodonta cyclotis Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 102100039575 Splicing factor ESS-2 homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000724233 Staphylococcus virus 11 Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 101150038786 chlB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 101150054175 cro gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 101150062334 int gene Proteins 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 101150035026 mobA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 244000000042 obligate parasite Species 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
- A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Optical Fibers, Optical Fiber Cores, And Optical Fiber Bundles (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学の分野、さら
に詳しくは、遺伝子工学的に操作された微生物によって
産生される生産物の外在化法に用いるＤＮＡフラグメン
トおよび細菌に関する。
に詳しくは、遺伝子工学的に操作された微生物によって
産生される生産物の外在化法に用いるＤＮＡフラグメン
トおよび細菌に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
および他の原核性微生物を、所望の蛋白質の表現用宿主
として使用する際に伴なう１つの問題として、しばし
ば、精製のために該宿主細胞から蛋白質を外在化させる
ことが挙げられている。この問題を解消するための試み
には、均質化または超音波処理のような細胞もしくは菌
体の物理的破壊、洗浄剤またはリゾチームによる処理の
ような細胞もしくは菌体の化学的破壊および排泄シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ配列を、所望の生産物を
コードする構造遺伝子へ融合させることが包含される。
例えば、ヨーロッパ特許出願第６１２０号（Ｗｅｉｓｓ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．）は宿主細胞の溶解剤または滲透
剤による処理を開示しており、米国特許第４３３６３３
６号（Ｓｉｌｈａｖｖｅｔ ａｌ．）は、得られるハイ
ブリッド蛋白が宿主細胞表面近く、またはそれを越えて
輸送されるように細胞質蛋白用の遺伝子を非細胞質蛋白
用の遺伝子に融合させる方法を開示し、また、米国特許
第４３３８３９７号（Ｇｉｌｂｅｒｔｅｔ ａｌ．）は
プレ蛋白質用の構造遺伝子を表現ベクターに挿入するこ
とからなる成熟分泌蛋白質の製法を開示している。
および他の原核性微生物を、所望の蛋白質の表現用宿主
として使用する際に伴なう１つの問題として、しばし
ば、精製のために該宿主細胞から蛋白質を外在化させる
ことが挙げられている。この問題を解消するための試み
には、均質化または超音波処理のような細胞もしくは菌
体の物理的破壊、洗浄剤またはリゾチームによる処理の
ような細胞もしくは菌体の化学的破壊および排泄シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ配列を、所望の生産物を
コードする構造遺伝子へ融合させることが包含される。
例えば、ヨーロッパ特許出願第６１２０号（Ｗｅｉｓｓ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．）は宿主細胞の溶解剤または滲透
剤による処理を開示しており、米国特許第４３３６３３
６号（Ｓｉｌｈａｖｖｅｔ ａｌ．）は、得られるハイ
ブリッド蛋白が宿主細胞表面近く、またはそれを越えて
輸送されるように細胞質蛋白用の遺伝子を非細胞質蛋白
用の遺伝子に融合させる方法を開示し、また、米国特許
第４３３８３９７号（Ｇｉｌｂｅｒｔｅｔ ａｌ．）は
プレ蛋白質用の構造遺伝子を表現ベクターに挿入するこ
とからなる成熟分泌蛋白質の製法を開示している。
【０００３】イー・コリは二本鎖ＤＮＡウイルスである
偏性寄生体のラムダ・ファージによって感染される。イ
ー・コリ遺伝学同様、ラムダ遺伝学はよく研究されてい
る(例えば、“Ｔhe Ｂacteriophage Ｌambda",edit．
Ａ．Ｄ．Ｈershey,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborator
y,Ｎew Ｙork,１９７１参照)。ラムダはテンペレート・
ファージで、イー・コリ中で、２相のうちの１つの相で
増殖する。１つの相、溶菌相において、ファージＤＮＡ
は自律的に複製し、キヤプシド蛋白質の形成、包装およ
び宿主細胞の溶解を指令する。溶菌相の間のラムダＤＮ
Ａの表現は非常に効率的である。転写は両方のＤＮＡ鎖
上で、また、１本の鎖上で右側方向へ向って、およびも
う１本の鎖上で左側方向へ向って起る。誘発は３７℃で
５０分間に約１００個のファージ粒子の放出をもたらす
ことができる(前記Ｈershey参照)。
偏性寄生体のラムダ・ファージによって感染される。イ
ー・コリ遺伝学同様、ラムダ遺伝学はよく研究されてい
る(例えば、“Ｔhe Ｂacteriophage Ｌambda",edit．
Ａ．Ｄ．Ｈershey,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborator
y,Ｎew Ｙork,１９７１参照)。ラムダはテンペレート・
ファージで、イー・コリ中で、２相のうちの１つの相で
増殖する。１つの相、溶菌相において、ファージＤＮＡ
は自律的に複製し、キヤプシド蛋白質の形成、包装およ
び宿主細胞の溶解を指令する。溶菌相の間のラムダＤＮ
Ａの表現は非常に効率的である。転写は両方のＤＮＡ鎖
上で、また、１本の鎖上で右側方向へ向って、およびも
う１本の鎖上で左側方向へ向って起る。誘発は３７℃で
５０分間に約１００個のファージ粒子の放出をもたらす
ことができる(前記Ｈershey参照)。
【０００４】もう１つの相、溶原相において、ラムダＤ
ＮＡは宿主細胞ゲノムに組込まれ、宿主複製酵素によ
り、宿主染色体ＤＮＡと共に受動的に複製される。溶原
相におけるファージはプロファージとして知られ、宿主
は溶原菌として知られ、免疫性であるといわれる。免疫
性は溶菌相を誘発する種々の事象の発生により失なわれ
うる。ラムダintおよびxis遺伝子の生産物はイー・コリ
ゲノムからのラムダゲノム除去の触媒作用をし、自律複
製できる共有的に閉じた環を形成する。これらの遺伝子
および、直接的または間接的に、全ての他のラムダ遺伝
子の合成はラムダcＩ遺伝子の生産物により抑制され
る。ある種の化学薬品またはＤＮＡ損傷剤に応答して、
細菌は細菌性rec Ａ遺伝子の生産物の合成を指令する。
該rec Ａ遺伝子生産物は蛋白加水分解的にcＩレプレッ
サ蛋白質を開裂し、溶菌相遺伝子の表現を可能にさせ
る。ついで、ファージの増殖は、最終的にラムダＤＮＡ
の自律複製を開始させるいくつかのラムダ調節因子の相
互作用を必要とする。ラムダＰおよびＯ遺伝子の生産物
がＤＮＡ複製に必要とされる。ＤＮＡ複製についで、フ
ァージはウイルス構造蛋白質、すなわち、頭部および尾
部蛋白質の合成および無垢な中空ウイルス粒子中でのそ
れらの組立を指令しなければならない。これを完了する
には少なくとも１８個の遺伝子の相互作用を必要とす
る。最後に、該ＤＮＡが中空ウイルス粒子中に包装され
て感染性無垢ウイルス粒子が形成され、菌体は、Ｑ遺伝
子の生産物によって活性化されるラムダＳおよびＲ遺伝
子によってコードされた細胞内溶解素によって破壊さ
れ、それにより、ファージが放出する。Ｑ遺伝子はＮ機
能によって活性化される。Ｎ遺伝子はcＩ機能によって
抑制される。
ＮＡは宿主細胞ゲノムに組込まれ、宿主複製酵素によ
り、宿主染色体ＤＮＡと共に受動的に複製される。溶原
相におけるファージはプロファージとして知られ、宿主
は溶原菌として知られ、免疫性であるといわれる。免疫
性は溶菌相を誘発する種々の事象の発生により失なわれ
うる。ラムダintおよびxis遺伝子の生産物はイー・コリ
ゲノムからのラムダゲノム除去の触媒作用をし、自律複
製できる共有的に閉じた環を形成する。これらの遺伝子
および、直接的または間接的に、全ての他のラムダ遺伝
子の合成はラムダcＩ遺伝子の生産物により抑制され
る。ある種の化学薬品またはＤＮＡ損傷剤に応答して、
細菌は細菌性rec Ａ遺伝子の生産物の合成を指令する。
該rec Ａ遺伝子生産物は蛋白加水分解的にcＩレプレッ
サ蛋白質を開裂し、溶菌相遺伝子の表現を可能にさせ
る。ついで、ファージの増殖は、最終的にラムダＤＮＡ
の自律複製を開始させるいくつかのラムダ調節因子の相
互作用を必要とする。ラムダＰおよびＯ遺伝子の生産物
がＤＮＡ複製に必要とされる。ＤＮＡ複製についで、フ
ァージはウイルス構造蛋白質、すなわち、頭部および尾
部蛋白質の合成および無垢な中空ウイルス粒子中でのそ
れらの組立を指令しなければならない。これを完了する
には少なくとも１８個の遺伝子の相互作用を必要とす
る。最後に、該ＤＮＡが中空ウイルス粒子中に包装され
て感染性無垢ウイルス粒子が形成され、菌体は、Ｑ遺伝
子の生産物によって活性化されるラムダＳおよびＲ遺伝
子によってコードされた細胞内溶解素によって破壊さ
れ、それにより、ファージが放出する。Ｑ遺伝子はＮ機
能によって活性化される。Ｎ遺伝子はcＩ機能によって
抑制される。
【０００５】キヤプシド組立に必要な該１８個の遺伝子
は遺伝子地図の右側転写鎖の約３位および３６位の間
（遺伝子地図上の位置は総ラムダＤＮＡのパーセンテイ
ジで表わしている）に存在する。左から右へ、第１の遺
伝子はＡ、ＷおよびＢで、最後はＪである。正常な溶原
菌では、Ｊ遺伝子の右側に８個の細菌遣伝子がある。そ
のうちの５個、ｂｉｏ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦがビオ
チンの生合成に包含される。第６番目のｕｖｒ Ｂは紫
外線照射耐性を与える。最後の２つ、ｃｈｌ Ａおよび
Ｅは塩素酸塩に対する感受性を与える［Ｇｕｅｓｔ．Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１０５：２８５〜２８９
（１９６９）；Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈ
ｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ”，ｅ
ｄ．Ｈｅｒｓｈｅｙ，前出，ｐｐ５１５〜５３４参
照］。天然の宿主細胞溶解において機能する他のラムダ
遺伝子はｋｉｌ遺伝子である。ｋｉｌ遺伝子の機能は余
りよく判明していない。ｋｉｌ遺伝子を表現する細胞は
誘発後、細胞増殖速度が減少する。ｋｉｌ機能の喪失は
細胞の正常な速度での増殖、すなわち、誘発後、溶菌が
起るまで対数期増殖を可能とする。ＳおよびＲ遺伝子と
同様、ｋｉｌ遺伝子はｃＩレプレッサーにより、Ｎ遺伝
子を介し、間接的に制御されている［Ｇｒｅｅｒ，Ｖｉ
ｒｄｏｌｏｇｙ，６６：５８９〜６０４（１９７５）参
照］。
は遺伝子地図の右側転写鎖の約３位および３６位の間
（遺伝子地図上の位置は総ラムダＤＮＡのパーセンテイ
ジで表わしている）に存在する。左から右へ、第１の遺
伝子はＡ、ＷおよびＢで、最後はＪである。正常な溶原
菌では、Ｊ遺伝子の右側に８個の細菌遣伝子がある。そ
のうちの５個、ｂｉｏ Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦがビオ
チンの生合成に包含される。第６番目のｕｖｒ Ｂは紫
外線照射耐性を与える。最後の２つ、ｃｈｌ Ａおよび
Ｅは塩素酸塩に対する感受性を与える［Ｇｕｅｓｔ．Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１０５：２８５〜２８９
（１９６９）；Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈ
ｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｌａｍｂｄａ”，ｅ
ｄ．Ｈｅｒｓｈｅｙ，前出，ｐｐ５１５〜５３４参
照］。天然の宿主細胞溶解において機能する他のラムダ
遺伝子はｋｉｌ遺伝子である。ｋｉｌ遺伝子の機能は余
りよく判明していない。ｋｉｌ遺伝子を表現する細胞は
誘発後、細胞増殖速度が減少する。ｋｉｌ機能の喪失は
細胞の正常な速度での増殖、すなわち、誘発後、溶菌が
起るまで対数期増殖を可能とする。ＳおよびＲ遺伝子と
同様、ｋｉｌ遺伝子はｃＩレプレッサーにより、Ｎ遺伝
子を介し、間接的に制御されている［Ｇｒｅｅｒ，Ｖｉ
ｒｄｏｌｏｇｙ，６６：５８９〜６０４（１９７５）参
照］。
【０００６】温度感受性溶原菌はよく研究されている
[例えば、Ｃampbell,Ｖirology,１４:２２〜３２(１９
６１)参照]。cＩ８５７遺伝子は温度感受性cＩ変異体
で、３８℃以下で機能する[Ｓussman et al．,Ｃ．Ｒ．
Ｈ．Ａcad．Ｓci．Ｐaris,２５４:１５１７〜１５１９
(１９６２)参照]。同様なファージ系が他の属で起るこ
とが知られている。例えば、ロモフスカヤら[Ｌomovska
ya et al．,Ｊ．Ｖirol．,９:２５８〜２６２(１９７
２)]はストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)に感染する
テンペレート・ファージの温度感受性変異株を報告して
いる。フロック[Ｆlock．Ｍol．Ｇen．Ｇenet．,１５
５:２４１〜２４７(１９７７)]はバチルス(Ｂacillus)
に感染するテンペレート・ファージphi−１０５の温度
感受性変異株を報告している。ボトスタインら[Ｂotste
in et al．,Ｎature,２５１:５８４〜５８８(１９７
４)]はサルモネラ(Ｓalmonella)に感染するテンペレー
ト・ファージＰ２２の温度感染性変異株を報告してい
る。ジョストロームら[Ｊostrom et al．,Ｊ．Ｂacteri
ol．,１１９:１９〜３２(１９７４)]およびトムプソン
[Ｔhompson．Ｊ．Ｂacteriol．,１２９:７７８〜７８８
(１９７７)]はスタフイロコッカス(Ｓtaphylococcus)に
感染するテンペレート・ファージphi−１１の温度感受
性変異株を報告している。ミラーら[Ｍiller et al．,
Ｖirol．,５９:５６６〜５６９(１９７４)]はシウドモ
ナス(Ｐseudomonas)のテンペレート・ファージを報告し
ている。
[例えば、Ｃampbell,Ｖirology,１４:２２〜３２(１９
６１)参照]。cＩ８５７遺伝子は温度感受性cＩ変異体
で、３８℃以下で機能する[Ｓussman et al．,Ｃ．Ｒ．
Ｈ．Ａcad．Ｓci．Ｐaris,２５４:１５１７〜１５１９
(１９６２)参照]。同様なファージ系が他の属で起るこ
とが知られている。例えば、ロモフスカヤら[Ｌomovska
ya et al．,Ｊ．Ｖirol．,９:２５８〜２６２(１９７
２)]はストレプトマイセス(Ｓtreptomyces)に感染する
テンペレート・ファージの温度感受性変異株を報告して
いる。フロック[Ｆlock．Ｍol．Ｇen．Ｇenet．,１５
５:２４１〜２４７(１９７７)]はバチルス(Ｂacillus)
に感染するテンペレート・ファージphi−１０５の温度
感受性変異株を報告している。ボトスタインら[Ｂotste
in et al．,Ｎature,２５１:５８４〜５８８(１９７
４)]はサルモネラ(Ｓalmonella)に感染するテンペレー
ト・ファージＰ２２の温度感染性変異株を報告してい
る。ジョストロームら[Ｊostrom et al．,Ｊ．Ｂacteri
ol．,１１９:１９〜３２(１９７４)]およびトムプソン
[Ｔhompson．Ｊ．Ｂacteriol．,１２９:７７８〜７８８
(１９７７)]はスタフイロコッカス(Ｓtaphylococcus)に
感染するテンペレート・ファージphi−１１の温度感受
性変異株を報告している。ミラーら[Ｍiller et al．,
Ｖirol．,５９:５６６〜５６９(１９７４)]はシウドモ
ナス(Ｐseudomonas)のテンペレート・ファージを報告し
ている。
【０００７】ボトスタインら［Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：
６１〜８３（１９８２）］による報告のようにラムダ細
胞内溶解素がファージを吸収できるサルモネラ株を溶解
することが判明している。ペリショーダら［Ｐｅｒｒｉ
ｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，
５６：７〜１１（１９７５）］は、ラムダｉｎｔ、ｘｉ
ｓ）ｒｅｄ、ｇａｍ）ｃＩＩＩおよびＫｉｌ遺伝子を含
むセグメントである遺伝子地図の５８位および７１位の
間（Δ５８〜７１）のラムダ遺伝子の欠失を記載してい
る。ヨーロッパ特許出願２０８４５８４号（Ｈｅｒｓｈ
ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）はプラスミドの安定化お
よび選択のため、宿主細胞として溶原菌の使用を開示し
ている。この発明者らは、例えば、欠損ｃＩ遺伝子を有
する溶原菌の、機能ｃＩ遺伝子を有するプラスミドによ
る形質転換を開示している。１つの開示された具体例に
おいて、該機能ｃＩ遺伝子はｃＩ８５７遺伝子である。
ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：
６１〜８３（１９８２）］による報告のようにラムダ細
胞内溶解素がファージを吸収できるサルモネラ株を溶解
することが判明している。ペリショーダら［Ｐｅｒｒｉ
ｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，
５６：７〜１１（１９７５）］は、ラムダｉｎｔ、ｘｉ
ｓ）ｒｅｄ、ｇａｍ）ｃＩＩＩおよびＫｉｌ遺伝子を含
むセグメントである遺伝子地図の５８位および７１位の
間（Δ５８〜７１）のラムダ遺伝子の欠失を記載してい
る。ヨーロッパ特許出願２０８４５８４号（Ｈｅｒｓｈ
ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）はプラスミドの安定化お
よび選択のため、宿主細胞として溶原菌の使用を開示し
ている。この発明者らは、例えば、欠損ｃＩ遺伝子を有
する溶原菌の、機能ｃＩ遺伝子を有するプラスミドによ
る形質転換を開示している。１つの開示された具体例に
おいて、該機能ｃＩ遺伝子はｃＩ８５７遺伝子である。
【０００８】転置因子、すなわち、宿主の染色体組換機
構とは独立して組換できる遺伝子がマーカーとして宿主
細胞に挿入できることが知られている。ロスら[Ｒoss e
t al．,Ｃell．１６:７２１〜７３１(１９７９)]は、転
置テトラサイクリン耐性因子tn１０によってプロモート
される欠失および逆位の物理的構造を報告している。デ
イビスら[Ｄavis et al．,“Ｂacterial Ｇenetics",Ｃ
old Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎew Ｙork(１９
８０)]は転置因子の使用を記載している。ラブカンら
[Ｒuvkun et al．,Ｎature,２８９:８５〜８８(１９８
１)]は、転置カナマイシン耐性およびネオマイシン耐性
因子tn５を有するプラスミドの接合、ついで、相同組換
によるtn５のリゾビウム・メリロチ(Ｒhizobium melil
oti)染色体ＤＮＡへの組込みを報告している。相同フラ
ンキング配列の存在に由来する組換による非対応遺伝子
の組込もヨーロッパ特許出願第７４８０８号に開示され
ている。
構とは独立して組換できる遺伝子がマーカーとして宿主
細胞に挿入できることが知られている。ロスら[Ｒoss e
t al．,Ｃell．１６:７２１〜７３１(１９７９)]は、転
置テトラサイクリン耐性因子tn１０によってプロモート
される欠失および逆位の物理的構造を報告している。デ
イビスら[Ｄavis et al．,“Ｂacterial Ｇenetics",Ｃ
old Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎew Ｙork(１９
８０)]は転置因子の使用を記載している。ラブカンら
[Ｒuvkun et al．,Ｎature,２８９:８５〜８８(１９８
１)]は、転置カナマイシン耐性およびネオマイシン耐性
因子tn５を有するプラスミドの接合、ついで、相同組換
によるtn５のリゾビウム・メリロチ(Ｒhizobium melil
oti)染色体ＤＮＡへの組込みを報告している。相同フラ
ンキング配列の存在に由来する組換による非対応遺伝子
の組込もヨーロッパ特許出願第７４８０８号に開示され
ている。
【０００９】本発明者らは、テンペレート・ファージか
らの細胞内溶解素コード付け遺伝子を用いる細菌内で生
産物を産生する方法について研究を行い、その結果、温
度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子および機能性フ
ァージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を有し、許容条
件下で該リゾチーム・コード付け遺伝子が抑制され、制
限条件下で表現される温度感受性細菌株を、直接または
間接的に生産物を表現するＤＮＡ分子で形質転換し、許
容条件下で該形質転換株を培養して該生産物を産生さ
せ、温度を上昇させて制限条件を生じさせ、所望によ
り、培養培地またはその濃縮物から該生産物を回収する
方法を見いだし、同時に特許出願した。
らの細胞内溶解素コード付け遺伝子を用いる細菌内で生
産物を産生する方法について研究を行い、その結果、温
度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子および機能性フ
ァージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を有し、許容条
件下で該リゾチーム・コード付け遺伝子が抑制され、制
限条件下で表現される温度感受性細菌株を、直接または
間接的に生産物を表現するＤＮＡ分子で形質転換し、許
容条件下で該形質転換株を培養して該生産物を産生さ
せ、温度を上昇させて制限条件を生じさせ、所望によ
り、培養培地またはその濃縮物から該生産物を回収する
方法を見いだし、同時に特許出願した。
【００１０】本発明者らは、さらに、生産物を産生する
細菌を、温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子およ
びファージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を有し、許
容条件下で該リゾチーム・コード付け遺伝子が抑制さ
れ、制限条件下で表現されるファージＤＮＡ配列で形質
転換して細菌を溶菌性にし、許容条件下で該形質転換細
菌を培養して生産物を産生させ、温度を変化させて制限
条件を生じさせ、所望により、生産物を培養培地または
その濃縮物から回収することからなる細菌生産物の産生
法を見いだした。
細菌を、温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子およ
びファージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を有し、許
容条件下で該リゾチーム・コード付け遺伝子が抑制さ
れ、制限条件下で表現されるファージＤＮＡ配列で形質
転換して細菌を溶菌性にし、許容条件下で該形質転換細
菌を培養して生産物を産生させ、温度を変化させて制限
条件を生じさせ、所望により、生産物を培養培地または
その濃縮物から回収することからなる細菌生産物の産生
法を見いだした。
【００１１】
【００１２】さらには、本発明者らは、有効用量の細菌
生産物を含有する量の温度感受性細菌を哺乳類に投与
し、これにより、細菌が哺乳類の体内で溶解し、該生産
物を放出することからなる哺乳類に細菌生産物を投与す
る方法を見いだした。
生産物を含有する量の温度感受性細菌を哺乳類に投与
し、これにより、細菌が哺乳類の体内で溶解し、該生産
物を放出することからなる哺乳類に細菌生産物を投与す
る方法を見いだした。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）（ｉ）
選択可能な形質をコードしている遺伝子である選択マー
カー；（ｉｉ）温度感受性ｃＩレプレッサー遺伝子およ
びリゾチーム・コード付け遺伝子が許容条件下で抑制さ
れかつ制限条件下で表現されるような機能性リゾチーム
・コード付け遺伝子を有しているラムダ・プロファージ
ＤＮＡ配列であって、該プロファージＤＮＡ配列が機能
性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有し、遺伝子地図の５８
位と７１位との間の遺伝子を欠失し、ＯおよびＰ遺伝を
変異してＯおよびＰ遺伝子機能を損失させるラムダ・プ
ロファージＤＮＡ配列；および（ｉｉｉ）フラグメント
と宿主細胞の染色体との間で組換えを生起させる宿主細
菌細胞の染色体における隣接配列に相同するフランキン
グＤＮＡ配列からなることを特徴とするＤＮＡフラグメ
ント、（２）ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、Ｏ
およびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選択
マーカーがｔｎ１０転置テトラサイクリン耐性因子であ
る上記（１）記載のＤＮＡフラグメント、（３） プロ
ファージＤＮＡ配列が遺伝子地図の３位と７１位との間
の遺伝子を欠失している上記（１）記載のＤＮＡフラグ
メント、（４）ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、
ＯおよびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選
択マーカーがｔｎ１０転置テトラサイクリン耐性因子で
ある上記（３）記載のＤＮＡフラグメント、（５）
（ｉ）選択可能な形質をコードしている遺伝子である選
択マーカー；（ｉｉ）温感受性ｃＩレプレッサー遺伝子
およびリゾチーム・コード付け遺伝子が許容条件下で抑
制されかつ制限条件下で表現されるような機能性リゾチ
ーム・コード付け遺伝子を有しているラムダ・プロファ
ージＤＮＡ配列であって、該プロファージＤＮＡ配列が
機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有し、遺伝子地図の
５８位と７１位との間の遺伝子を欠失し、ＯおよびＰ遺
伝子を変異してＯおよびＰ遺伝子機能を損失させるラム
ダ・プロファージＤＮＡ配列；および（ｉｉｉ）フラグ
メントと宿主細胞の染色体との間で組換えを生起させる
宿主細菌細胞の染色体における隣接配列に相同するフラ
ンキングＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを含有
する細菌、（６）プロファージＤＮＡ配列が遺伝地図の
３位と７１位との間の遺伝子を欠失している上記（５）
記載の細菌、（７）イー・コリである上記（５）記載の
細菌、（８）イー・コリである上記（６）記載の細菌、
（９）ＭＧ株である上記（７）記載の細菌、（１０）Ｍ
Ｇ３株である上記（７）記載の細菌、および（１１）Ｍ
Ｇ４株である上記（８）記載の細菌を提供するものであ
る。
選択可能な形質をコードしている遺伝子である選択マー
カー；（ｉｉ）温度感受性ｃＩレプレッサー遺伝子およ
びリゾチーム・コード付け遺伝子が許容条件下で抑制さ
れかつ制限条件下で表現されるような機能性リゾチーム
・コード付け遺伝子を有しているラムダ・プロファージ
ＤＮＡ配列であって、該プロファージＤＮＡ配列が機能
性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有し、遺伝子地図の５８
位と７１位との間の遺伝子を欠失し、ＯおよびＰ遺伝を
変異してＯおよびＰ遺伝子機能を損失させるラムダ・プ
ロファージＤＮＡ配列；および（ｉｉｉ）フラグメント
と宿主細胞の染色体との間で組換えを生起させる宿主細
菌細胞の染色体における隣接配列に相同するフランキン
グＤＮＡ配列からなることを特徴とするＤＮＡフラグメ
ント、（２）ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、Ｏ
およびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選択
マーカーがｔｎ１０転置テトラサイクリン耐性因子であ
る上記（１）記載のＤＮＡフラグメント、（３） プロ
ファージＤＮＡ配列が遺伝子地図の３位と７１位との間
の遺伝子を欠失している上記（１）記載のＤＮＡフラグ
メント、（４）ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、
ＯおよびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選
択マーカーがｔｎ１０転置テトラサイクリン耐性因子で
ある上記（３）記載のＤＮＡフラグメント、（５）
（ｉ）選択可能な形質をコードしている遺伝子である選
択マーカー；（ｉｉ）温感受性ｃＩレプレッサー遺伝子
およびリゾチーム・コード付け遺伝子が許容条件下で抑
制されかつ制限条件下で表現されるような機能性リゾチ
ーム・コード付け遺伝子を有しているラムダ・プロファ
ージＤＮＡ配列であって、該プロファージＤＮＡ配列が
機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有し、遺伝子地図の
５８位と７１位との間の遺伝子を欠失し、ＯおよびＰ遺
伝子を変異してＯおよびＰ遺伝子機能を損失させるラム
ダ・プロファージＤＮＡ配列；および（ｉｉｉ）フラグ
メントと宿主細胞の染色体との間で組換えを生起させる
宿主細菌細胞の染色体における隣接配列に相同するフラ
ンキングＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを含有
する細菌、（６）プロファージＤＮＡ配列が遺伝地図の
３位と７１位との間の遺伝子を欠失している上記（５）
記載の細菌、（７）イー・コリである上記（５）記載の
細菌、（８）イー・コリである上記（６）記載の細菌、
（９）ＭＧ株である上記（７）記載の細菌、（１０）Ｍ
Ｇ３株である上記（７）記載の細菌、および（１１）Ｍ
Ｇ４株である上記（８）記載の細菌を提供するものであ
る。
【００１４】温度感受性細菌は、温度感受性レプレッサ
ー遺伝子を含み、１つの温度範囲(許容条件)にて培養し
た場合、レプレッサーが機能するが、もう１つの温度範
囲(制限条件)で培養した場合、レプレッサーが機能せ
ず、レプレッサーが表現されず、または安定でないファ
ージＤＮＡ配列を有する細菌である。制限条件下、ファ
ージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を含め、ファージ
遺伝子が表現され、菌体の溶解をもたらす。かかる温度
感受性細菌が溶菌性細菌である。本明細書に記載のよう
ないずれの溶菌性細菌も本発明において使用できる。
ー遺伝子を含み、１つの温度範囲(許容条件)にて培養し
た場合、レプレッサーが機能するが、もう１つの温度範
囲(制限条件)で培養した場合、レプレッサーが機能せ
ず、レプレッサーが表現されず、または安定でないファ
ージＤＮＡ配列を有する細菌である。制限条件下、ファ
ージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を含め、ファージ
遺伝子が表現され、菌体の溶解をもたらす。かかる温度
感受性細菌が溶菌性細菌である。本明細書に記載のよう
ないずれの溶菌性細菌も本発明において使用できる。
【００１５】温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子
は入手することができ、あるいは公知の方法でかかる遺
伝子を変異させることにより調製できる。例えば、キャ
ンベル[Ｃampbell,Ｖirology,１４:２２〜３２(１９６
１)]は温度感受性ファージ変異株の単離を記載してい
る。一般に、この方法は、ファージ感染細菌に、紫外線
照射によるなどして変異誘発処理を行ない、生存菌を高
温でインキュベートして、いずれかの温度感受性レプレ
ッサー変異株の誘導を生じさせることからなる。つい
で、溶解質を感受性細菌の感染に用いる。この新たな溶
原菌を加熱誘発に付し、加熱誘発後に生じたファージを
温度感受性細菌からの溶原菌調製に用いる。このサイク
ル(溶原菌調製、誘発、再調製)はファージ・レプレッサ
ー変異体の同定に通じる。典型的には、３〜４回のかか
るサイクルがかかる変異株を得るのに充分である。
は入手することができ、あるいは公知の方法でかかる遺
伝子を変異させることにより調製できる。例えば、キャ
ンベル[Ｃampbell,Ｖirology,１４:２２〜３２(１９６
１)]は温度感受性ファージ変異株の単離を記載してい
る。一般に、この方法は、ファージ感染細菌に、紫外線
照射によるなどして変異誘発処理を行ない、生存菌を高
温でインキュベートして、いずれかの温度感受性レプレ
ッサー変異株の誘導を生じさせることからなる。つい
で、溶解質を感受性細菌の感染に用いる。この新たな溶
原菌を加熱誘発に付し、加熱誘発後に生じたファージを
温度感受性細菌からの溶原菌調製に用いる。このサイク
ル(溶原菌調製、誘発、再調製)はファージ・レプレッサ
ー変異体の同定に通じる。典型的には、３〜４回のかか
るサイクルがかかる変異株を得るのに充分である。
【００１６】以下の記載は大部分、溶菌性イー・コリ、
ことに、cＩ８５７イー・コリ溶原菌に関する。けれど
も、これに限定するものではなく、ラムダまたは前記し
たテンペレート・ファージのような他のテンペレート・
ファージからのレプレッサーおよび細菌内溶解素コード
付け遺伝子を用いて他の溶菌性イー・コリならびに他の
溶菌性細菌についても同様に行なうことができる。
ことに、cＩ８５７イー・コリ溶原菌に関する。けれど
も、これに限定するものではなく、ラムダまたは前記し
たテンペレート・ファージのような他のテンペレート・
ファージからのレプレッサーおよび細菌内溶解素コード
付け遺伝子を用いて他の溶菌性イー・コリならびに他の
溶菌性細菌についても同様に行なうことができる。
【００１７】cＩ８５７溶原菌は公知であり、一般的に
入手でき、３８℃以下で活性であるが、３８℃を超える
と不活性なcＩレプレッサーを産生する。これらは、レ
プレッサーが３８℃を超えると不活性になる変異に加え
て、cＩ８５７遺伝子が、ラムダrec Ａ遺伝子の生産物
による蛋白加水分解的開裂に対して該cＩレプレッサー
蛋白を不感性にする第２の変異を含有するので他の温度
感受性イー・コリ溶原菌より好ましい。すなわち、許容
条件下で培養した場合、cＩレプレッサー蛋白は安定
で、したがって、免疫性を維持するのに効率的である。
入手でき、３８℃以下で活性であるが、３８℃を超える
と不活性なcＩレプレッサーを産生する。これらは、レ
プレッサーが３８℃を超えると不活性になる変異に加え
て、cＩ８５７遺伝子が、ラムダrec Ａ遺伝子の生産物
による蛋白加水分解的開裂に対して該cＩレプレッサー
蛋白を不感性にする第２の変異を含有するので他の温度
感受性イー・コリ溶原菌より好ましい。すなわち、許容
条件下で培養した場合、cＩレプレッサー蛋白は安定
で、したがって、免疫性を維持するのに効率的である。
【００１８】イー・コリＵＣ５８２２株はcＩ８５７変
異を有する溶原菌である。また、該株はint遺伝子(int
６ am、アンバー変異)およびＰ遺伝子(Ｐ３ am、アンバ
ー変異)に点変異を有する(アンバー変異は翻訳の終止を
合図する。)。一般に、ＵＣ５８２２株は、欠損性、す
なわち、一般に感染性ファージ粒子を生成しないので、
例えば、ＭＭ２９４(cＩ８５７)株よりも好ましい。欠
損性溶原菌は、ことに、ポリペプチドを哺乳類に投与す
るのに用いる場合に好ましい。しかしながら、ＵＣ５８
２２株は低レベルのリゾチームを産生し、これは、多
分、該株が誘発後、ＳおよびＲ遺伝子のより低い複写
数、すなわち、ＭＭ２９４(cＩ８５７)より低い複写
数、すなわち、５０〜１００を有するためであるにもか
かわらず、ＵＣ５８２２株は誘発後、容易に溶解する。
異を有する溶原菌である。また、該株はint遺伝子(int
６ am、アンバー変異)およびＰ遺伝子(Ｐ３ am、アンバ
ー変異)に点変異を有する(アンバー変異は翻訳の終止を
合図する。)。一般に、ＵＣ５８２２株は、欠損性、す
なわち、一般に感染性ファージ粒子を生成しないので、
例えば、ＭＭ２９４(cＩ８５７)株よりも好ましい。欠
損性溶原菌は、ことに、ポリペプチドを哺乳類に投与す
るのに用いる場合に好ましい。しかしながら、ＵＣ５８
２２株は低レベルのリゾチームを産生し、これは、多
分、該株が誘発後、ＳおよびＲ遺伝子のより低い複写
数、すなわち、ＭＭ２９４(cＩ８５７)より低い複写
数、すなわち、５０〜１００を有するためであるにもか
かわらず、ＵＣ５８２２株は誘発後、容易に溶解する。
【００１９】本発明で用いることができる温度感受性細
菌は、直接または間接的に所望の生成物をコードするＤ
ＮＡ分子により形質転換される。この形質転換は、ＤＮ
Ａ分子が宿主細胞に入り、生産物を表現することを可能
にするいずれの技術によっても行なうことができる。こ
れらの技術には、例えば、形質転換、形質導入、接合お
よび細胞融合が包含される。多くの適当な表現ベクター
がよく知られており、生産物用の遺伝子クローニングお
よび細胞のかかる分子による形質転換のための技術と同
様に広く利用されている。一般に、生産物は非排泄性の
非対応遺伝子生産物、すなわち、天然には宿主によって
生産されない、外在化されない物質である。直接表現さ
れる生産物にはポリペプチドが包含され、間接的に表現
される生産物にはポリペプチド、糖蛋白質、抗生物質お
よび、例えば、金属チオネイン産生細菌内に隔離するこ
とのできるような金属イオンのごとき他の分子が包含さ
れる。
菌は、直接または間接的に所望の生成物をコードするＤ
ＮＡ分子により形質転換される。この形質転換は、ＤＮ
Ａ分子が宿主細胞に入り、生産物を表現することを可能
にするいずれの技術によっても行なうことができる。こ
れらの技術には、例えば、形質転換、形質導入、接合お
よび細胞融合が包含される。多くの適当な表現ベクター
がよく知られており、生産物用の遺伝子クローニングお
よび細胞のかかる分子による形質転換のための技術と同
様に広く利用されている。一般に、生産物は非排泄性の
非対応遺伝子生産物、すなわち、天然には宿主によって
生産されない、外在化されない物質である。直接表現さ
れる生産物にはポリペプチドが包含され、間接的に表現
される生産物にはポリペプチド、糖蛋白質、抗生物質お
よび、例えば、金属チオネイン産生細菌内に隔離するこ
とのできるような金属イオンのごとき他の分子が包含さ
れる。
【００２０】形質転換宿主cＩ８５７溶原菌は、所望の
生産物の表現に至適な許容条件下(＜３８℃、通常、３
２〜３６℃)、無際限に増殖できる。充分な増殖が達成
されたとき、すなわち、通常、対数増殖期中期(Ａ650＝
０．５)に達したとき、溶原菌を制限条件下で培養して
ラムダ細胞内溶解素の合成を誘発させる。これは、培養
培地またはその濃縮物の温度を、cＩ８５７株の場合、
３８℃より高く、好ましくは、４２〜４４℃に約９０〜
１２０分間上昇させることにより行なえる。別法とし
て、培養培地またはその濃縮物の温度を３８℃より高
く、好ましくは、４２〜４４℃に短時間、すなわち、フ
ァージＤＮＡを誘発するに充分な時間、好ましくは、少
なくとも約５分間上昇させ、ついで、温度を０〜３８
℃、好ましくは、２〜３６℃に低下させる。
生産物の表現に至適な許容条件下(＜３８℃、通常、３
２〜３６℃)、無際限に増殖できる。充分な増殖が達成
されたとき、すなわち、通常、対数増殖期中期(Ａ650＝
０．５)に達したとき、溶原菌を制限条件下で培養して
ラムダ細胞内溶解素の合成を誘発させる。これは、培養
培地またはその濃縮物の温度を、cＩ８５７株の場合、
３８℃より高く、好ましくは、４２〜４４℃に約９０〜
１２０分間上昇させることにより行なえる。別法とし
て、培養培地またはその濃縮物の温度を３８℃より高
く、好ましくは、４２〜４４℃に短時間、すなわち、フ
ァージＤＮＡを誘発するに充分な時間、好ましくは、少
なくとも約５分間上昇させ、ついで、温度を０〜３８
℃、好ましくは、２〜３６℃に低下させる。
【００２１】溶菌がより効率的で、迅速であるので、制
限条件を９０〜１２０分間維持することが好ましい。し
かしながら、場合により、例えば、所望の蛋白質が熱不
安定性な場合または制限条件を維持する経費をさけるよ
うな場合には後者の方法も好ましい。宿主cＩ８５７株
が機能ラムダcro遺伝子を有する場合、溶菌が起るま
で、細胞は細胞が機能するいずれの温度においてもリゾ
チームを合成しつづける。ラムダ細胞内溶解素は０℃の
ごとき低温でも活性であるが、一般的に、蛋白合成速度
および触媒活性の低下ゆえに、溶菌に要する時間は低温
ではより長くなる。
限条件を９０〜１２０分間維持することが好ましい。し
かしながら、場合により、例えば、所望の蛋白質が熱不
安定性な場合または制限条件を維持する経費をさけるよ
うな場合には後者の方法も好ましい。宿主cＩ８５７株
が機能ラムダcro遺伝子を有する場合、溶菌が起るま
で、細胞は細胞が機能するいずれの温度においてもリゾ
チームを合成しつづける。ラムダ細胞内溶解素は０℃の
ごとき低温でも活性であるが、一般的に、蛋白合成速度
および触媒活性の低下ゆえに、溶菌に要する時間は低温
ではより長くなる。
【００２２】誘発の直前または誘発後、好ましくは、細
胞を、濾過、遠心分離または他の手段により濃縮し、こ
の濃縮物を溶菌するまでインキュベートする。かかる方
法は所望の生産物の収集および精製を容易にする。誘発
につづき、細胞壁は実質的に分解する。プロトプラスト
の形の細胞は所望の生産物を合成しつづけ、生産物は細
胞膜を通して多量に培地中に放出される。培地中への完
全な放出は溶菌によって達成される。溶菌は培養培地ま
たはその濃縮物の清澄化および／または培養培地または
濃縮物の粘度増加によって観察できる。溶菌は、例え
ば、機械的撹拌または急激な培養条件の変化、例えば、
温度を２〜２５℃の間で急激に変化させるか、培地また
は濃縮物の浸透圧強度を変化させることにより増強する
ことができる。好ましくは、細胞を濃縮し、生産物含有
上澄液をデカンテーションした後、誘発細胞を最少塩緩
衝液または０．１Ｍトリス緩衝液、５０mＭ ＮaＣlおよ
び１mＭ ＥＤＴＡに懸濁させ、撹拌して溶菌を行なう。
ついで、公知の方法により、培地またはその濃縮物から
所望の生産物を回収し、所望により、精製する。
胞を、濾過、遠心分離または他の手段により濃縮し、こ
の濃縮物を溶菌するまでインキュベートする。かかる方
法は所望の生産物の収集および精製を容易にする。誘発
につづき、細胞壁は実質的に分解する。プロトプラスト
の形の細胞は所望の生産物を合成しつづけ、生産物は細
胞膜を通して多量に培地中に放出される。培地中への完
全な放出は溶菌によって達成される。溶菌は培養培地ま
たはその濃縮物の清澄化および／または培養培地または
濃縮物の粘度増加によって観察できる。溶菌は、例え
ば、機械的撹拌または急激な培養条件の変化、例えば、
温度を２〜２５℃の間で急激に変化させるか、培地また
は濃縮物の浸透圧強度を変化させることにより増強する
ことができる。好ましくは、細胞を濃縮し、生産物含有
上澄液をデカンテーションした後、誘発細胞を最少塩緩
衝液または０．１Ｍトリス緩衝液、５０mＭ ＮaＣlおよ
び１mＭ ＥＤＴＡに懸濁させ、撹拌して溶菌を行なう。
ついで、公知の方法により、培地またはその濃縮物から
所望の生産物を回収し、所望により、精製する。
【００２３】別法として、溶菌相の誘発前に全細胞を濃
縮し、哺乳類に経口投与する。ついで、体内で誘発が起
り、所望のポリペプチドの放出をもたらす。この方法は
ことに、全細胞ならびに所望の抗原が免疫保護応答を起
させるのに好適な場合に、動物に該抗原を投与するのに
有用である。例えば、ＬＴ−Ｂ抗原のような抗原をコー
ドする遺伝子を有する温度感受性溶原菌は直接ブタおよ
び／またはウシに摂取させることができる。各動物に投
与する菌体の量は有効用量を含有する菌体量である。単
位量の菌体によって産生される蛋白質量は公知の方法で
計算することができる。
縮し、哺乳類に経口投与する。ついで、体内で誘発が起
り、所望のポリペプチドの放出をもたらす。この方法は
ことに、全細胞ならびに所望の抗原が免疫保護応答を起
させるのに好適な場合に、動物に該抗原を投与するのに
有用である。例えば、ＬＴ−Ｂ抗原のような抗原をコー
ドする遺伝子を有する温度感受性溶原菌は直接ブタおよ
び／またはウシに摂取させることができる。各動物に投
与する菌体の量は有効用量を含有する菌体量である。単
位量の菌体によって産生される蛋白質量は公知の方法で
計算することができる。
【００２４】本発明の１つの態様は、本発明における溶
菌性細菌を調製するのに使用できるＤＮＡフラグメント
を提供することである。かかるＤＮＡフラグメントは温
度感受性レプレッサー遺伝子および機能性リゾチーム・
コード付け遺伝子を有する欠損ファージ配列からなる。
かかる欠損ラムダ配列からなるＤＮＡフラグメントは細
胞内溶解素が制限条件下で表現されるような温度感受性
ｃＩ遺伝子および機能性ラムダ細胞内溶解素コード付け
遺伝子（Ｎ）Ｑ、ＳおよびＲ）、選択マーカーおよび、
好ましくは、宿主細胞染色体における隣接ＤＮＡと相同
のフランキングＤＮＡ配列を有する。１つの具体例にお
いて、該ＤＮＡフラグメントは、遺伝子地図の５８位お
よび７１位間の遺伝子が欠失しており、したがって、ｉ
ｎｔ、ｘｉｓおよびｋｉｌ遺伝子を欠き、温度感受性ｃ
Ｉ遺伝子を有し、ＯおよびＰ遺伝子に変異を有し、該ｃ
Ｉ遺伝子がｃＩ８５７変異体で、制限条件下で細胞内溶
解素を産生するラムダＤＮＡからなる。ＯおよびＰ変異
は欠失または点変異とすることができる。Ｏ２９、Ｐ３
およびＰ８０変異のような点変異は、それらが容易に利
用できるので好ましい。Ｐ３変異はＰ８０変異より好ま
しい。
菌性細菌を調製するのに使用できるＤＮＡフラグメント
を提供することである。かかるＤＮＡフラグメントは温
度感受性レプレッサー遺伝子および機能性リゾチーム・
コード付け遺伝子を有する欠損ファージ配列からなる。
かかる欠損ラムダ配列からなるＤＮＡフラグメントは細
胞内溶解素が制限条件下で表現されるような温度感受性
ｃＩ遺伝子および機能性ラムダ細胞内溶解素コード付け
遺伝子（Ｎ）Ｑ、ＳおよびＲ）、選択マーカーおよび、
好ましくは、宿主細胞染色体における隣接ＤＮＡと相同
のフランキングＤＮＡ配列を有する。１つの具体例にお
いて、該ＤＮＡフラグメントは、遺伝子地図の５８位お
よび７１位間の遺伝子が欠失しており、したがって、ｉ
ｎｔ、ｘｉｓおよびｋｉｌ遺伝子を欠き、温度感受性ｃ
Ｉ遺伝子を有し、ＯおよびＰ遺伝子に変異を有し、該ｃ
Ｉ遺伝子がｃＩ８５７変異体で、制限条件下で細胞内溶
解素を産生するラムダＤＮＡからなる。ＯおよびＰ変異
は欠失または点変異とすることができる。Ｏ２９、Ｐ３
およびＰ８０変異のような点変異は、それらが容易に利
用できるので好ましい。Ｐ３変異はＰ８０変異より好ま
しい。
【００２５】他の具体例においては、フラグメントは、
遺伝子地図の３位および７１位の間の遺伝子に実質的な
欠失があるラムダＤＮＡからなる。かかるフラグメント
はラムダ・キヤプシド組立に必須の実質的に全ての遺伝
子ならびにｉｎｔ、ｘｉｓおよびｋｉｌ遺伝子が欠失し
ている。
遺伝子地図の３位および７１位の間の遺伝子に実質的な
欠失があるラムダＤＮＡからなる。かかるフラグメント
はラムダ・キヤプシド組立に必須の実質的に全ての遺伝
子ならびにｉｎｔ、ｘｉｓおよびｋｉｌ遺伝子が欠失し
ている。
【００２６】所望の生産物を産生する、または、例え
ば、遺伝子工学的技術により、予めもしくはその後に所
望の生産物を産生するようにした宿主細胞、イー・コリ
または他の細菌は、公知の技術により、温度感受性ファ
ージ・レプレッサー遺伝子およびファージ・リゾチーム
・コード付け遺伝子を有するファージＤＮＡ配列で形質
転換される。これには、かかる温度感受性レプレッサー
遺伝子を有するテンペレート・ファージ、好ましくは、
欠損ファージでの細菌の感染が包含される。また、公知
の方法、例えば、形質転換、形質導入、接合および融合
により、細菌を本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換
させることが包含される。一般に、形質転換にはファー
ジまたはプラスミドのようなベクターへのフラグメント
の組込が包含される。例えば、フラグメントはｐＢＲ３
２２等のようなプラスミド中でクローンすることがで
き、該フラグメントに隣接する配列に相同する隣接配列
を欠くか、組換事象を欠損している（ｒｅｃ−）適当な
宿主中、ｉｎｖｉｖｏで生育できる。該プラスミドは回
収し、所望の生産物産生用の適当な宿主の形質転換に使
用できる。かかる宿主の形質転換についで、宿主染色体
における隣接ＤＮＡ配列と相同のフランキングＤＮＡ配
列を有するフラグメントを相同隣接配列のサイトで自然
に組換えることにより組込む。別法として、所望の生産
物を産生する適当な宿主は線型または環型の分離ＤＮＡ
フラグメントで形質転換できる。
ば、遺伝子工学的技術により、予めもしくはその後に所
望の生産物を産生するようにした宿主細胞、イー・コリ
または他の細菌は、公知の技術により、温度感受性ファ
ージ・レプレッサー遺伝子およびファージ・リゾチーム
・コード付け遺伝子を有するファージＤＮＡ配列で形質
転換される。これには、かかる温度感受性レプレッサー
遺伝子を有するテンペレート・ファージ、好ましくは、
欠損ファージでの細菌の感染が包含される。また、公知
の方法、例えば、形質転換、形質導入、接合および融合
により、細菌を本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換
させることが包含される。一般に、形質転換にはファー
ジまたはプラスミドのようなベクターへのフラグメント
の組込が包含される。例えば、フラグメントはｐＢＲ３
２２等のようなプラスミド中でクローンすることがで
き、該フラグメントに隣接する配列に相同する隣接配列
を欠くか、組換事象を欠損している（ｒｅｃ−）適当な
宿主中、ｉｎｖｉｖｏで生育できる。該プラスミドは回
収し、所望の生産物産生用の適当な宿主の形質転換に使
用できる。かかる宿主の形質転換についで、宿主染色体
における隣接ＤＮＡ配列と相同のフランキングＤＮＡ配
列を有するフラグメントを相同隣接配列のサイトで自然
に組換えることにより組込む。別法として、所望の生産
物を産生する適当な宿主は線型または環型の分離ＤＮＡ
フラグメントで形質転換できる。
【００２７】該ＤＮＡフラグメントは選択マーカーを有
し、形質転換体の選択を容易にする。選択マーカーは、
典型的には、分析可能な酵素をコードし、栄養要求宿主
に原栄養性を復元するか、致死もしくは抑制化合物、一
般に、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子である。好
ましくは、選択マーカーは抗生物質耐性を与える遺伝子
で、これらは、入手できないか、あるいは自然に原栄養
性に復帰する栄養要求性宿主の使用を要しない。テトラ
サイクリンは安価で、また、テトラサイクリン耐性は通
常、自然には獲得されないので、テトラサイクリン耐性
が好ましい。形質転換体におけるマーカーの存在は宿主
が該ＤＮＡフラグメントからなっていることを示す。該
ＤＮＡフラグメントと宿主細胞ＤＮＡの間の相同はラム
ダＤＮＡに隣接する領域およびマーカー中にのみ存在す
るので、該フラグメントが組込まれれば、全フラグメン
トが組込れる。
し、形質転換体の選択を容易にする。選択マーカーは、
典型的には、分析可能な酵素をコードし、栄養要求宿主
に原栄養性を復元するか、致死もしくは抑制化合物、一
般に、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子である。好
ましくは、選択マーカーは抗生物質耐性を与える遺伝子
で、これらは、入手できないか、あるいは自然に原栄養
性に復帰する栄養要求性宿主の使用を要しない。テトラ
サイクリンは安価で、また、テトラサイクリン耐性は通
常、自然には獲得されないので、テトラサイクリン耐性
が好ましい。形質転換体におけるマーカーの存在は宿主
が該ＤＮＡフラグメントからなっていることを示す。該
ＤＮＡフラグメントと宿主細胞ＤＮＡの間の相同はラム
ダＤＮＡに隣接する領域およびマーカー中にのみ存在す
るので、該フラグメントが組込まれれば、全フラグメン
トが組込れる。
【００２８】ＤＮＡフラグメント中にマーカーがない場
合、形質導入または形質転換操作後、ラムダＤＮＡを有
する宿主細胞の選択は欠損ファージによる推定的形質導
入体の重複感染（非組込み）および免疫性生存細菌の選
択が必要とされる。本発明のＤＮＡフラグメントの組込
みにより溶菌性にしたイー・コリ株には、例えば、ＭＧ
株が包含される。これらの株は、そのラムダＤＮＡが遺
伝子地図の５８位および７１位の間の遺伝子を欠失し、
したがって、ｉｎｔ、ｘｉｓ、ｒｅｄ、ｇａｍ、ｋｉｌ
およびｅＩＩＩ遺伝子を欠き、ｃＩ８５７変異を有し、
ＯおよびＰ遺伝子に遺伝子を有し、制限条件下で細胞内
溶解素が表現されるように機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺
伝子を有する溶原菌である。１つの具体例において、ア
ンバー・サプレッサー、すなわち、ＵＡＧ翻訳終止コー
ドンの翻訳サプレッサーの宿主細胞ＤＮＡによる産生の
ため、点（アンバー）変異株であるＭＧ１株［Ｃ６００
（λΔ５８〜７１，ｃＩ８５７，Ｐ３，Ｏ２９），Ｓｕ
ＩＩ＋，ｇａｌＫ，ＩａｃＺ，ｔｈｉ，ｇａｌ：：ｔｎ
１０ ｔｅｔＲ］が解読され、ＯおよびＰ遺伝子が表現
される。
合、形質導入または形質転換操作後、ラムダＤＮＡを有
する宿主細胞の選択は欠損ファージによる推定的形質導
入体の重複感染（非組込み）および免疫性生存細菌の選
択が必要とされる。本発明のＤＮＡフラグメントの組込
みにより溶菌性にしたイー・コリ株には、例えば、ＭＧ
株が包含される。これらの株は、そのラムダＤＮＡが遺
伝子地図の５８位および７１位の間の遺伝子を欠失し、
したがって、ｉｎｔ、ｘｉｓ、ｒｅｄ、ｇａｍ、ｋｉｌ
およびｅＩＩＩ遺伝子を欠き、ｃＩ８５７変異を有し、
ＯおよびＰ遺伝子に遺伝子を有し、制限条件下で細胞内
溶解素が表現されるように機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺
伝子を有する溶原菌である。１つの具体例において、ア
ンバー・サプレッサー、すなわち、ＵＡＧ翻訳終止コー
ドンの翻訳サプレッサーの宿主細胞ＤＮＡによる産生の
ため、点（アンバー）変異株であるＭＧ１株［Ｃ６００
（λΔ５８〜７１，ｃＩ８５７，Ｐ３，Ｏ２９），Ｓｕ
ＩＩ＋，ｇａｌＫ，ＩａｃＺ，ｔｈｉ，ｇａｌ：：ｔｎ
１０ ｔｅｔＲ］が解読され、ＯおよびＰ遺伝子が表現
される。
【００２９】本発明で用いることができるさらに好まし
い宿主細胞は表現型的にＯ-およびＰ-のものである。１
つの具体例において、ＭＧ３株[Ｎ９９(λ△５８〜７
１,cＩ８５７,Ｐ３,Ｏ２９),galＫ,lacＺ,thi,gal::tn
１０ tetR]はＭＧ１株と同様なラムダＤＮＡを有する。
しかし、この株は表現型的にＯ-およびＰ-で、tetR,△k
il,△intおよび△xisである。
い宿主細胞は表現型的にＯ-およびＰ-のものである。１
つの具体例において、ＭＧ３株[Ｎ９９(λ△５８〜７
１,cＩ８５７,Ｐ３,Ｏ２９),galＫ,lacＺ,thi,gal::tn
１０ tetR]はＭＧ１株と同様なラムダＤＮＡを有する。
しかし、この株は表現型的にＯ-およびＰ-で、tetR,△k
il,△intおよび△xisである。
【００３０】もっとも好ましい溶菌性イー・コリはＭＧ
４株である。これは実質的に全てのラムダ構造蛋白質、
組立遺伝子および正常な右側プロファージー細菌接合
点、すなわち、右側結合サイト（ａｔｔＲ）を欠失する
株である。ことに、これらは遺伝子地図の３位および７
１位間のラムダ遺伝子の実質的に全てを欠失し、Ｏおよ
びＰ遺伝子に点変異を有し、制限条件下で細胞内溶解素
が表現されるように温度感受性ｃＩ遺伝子、機能性Ｎ、
Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有し、選択マーカー、すなわ
ち、ｔｎ１０テトラサイクリン耐性転置因子を有する溶
原菌である。かかる欠損溶原菌はウイルス増殖に対する
４つの独立した遮断を有している。すなわち、（ｉ）Ｏ
およびＰ複製機能の喪失、（ｉｉ）プロファージの重複
感染ファージからのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子による相
補をできなくさせるａｔｔＲの喪失、（ｉｉｉ）ラムダ
構造遺伝子のコード不能および（ｉｖ）ラムダＤＮＡの
大きさが包装に必要な最小の大きさよりはるかに小さい
ことである。これらは、最初に、ＭＧ株のようなｃＩ８
５７、Ｏ−、Ｐ−溶原菌株に塩素酸塩ストレスを加えて
塩素酸塩耐性株を産生し、ＡおよびＢ機能欠損の重複感
染異種免疫もしくはビルレント・ラムダまたはラムドイ
ド・ファージの増殖を相補できない変異株を選択するこ
とにより調製できる。該マーカー、ラムダＤＮＡおよび
該イー・コリ染色体からのフランキング配列からなるＤ
ＮＡフラグメントは、例えば、制限エンドヌクレアーゼ
による処理またはＰ１形質導入によってＭＧ４株から単
離できる。
４株である。これは実質的に全てのラムダ構造蛋白質、
組立遺伝子および正常な右側プロファージー細菌接合
点、すなわち、右側結合サイト（ａｔｔＲ）を欠失する
株である。ことに、これらは遺伝子地図の３位および７
１位間のラムダ遺伝子の実質的に全てを欠失し、Ｏおよ
びＰ遺伝子に点変異を有し、制限条件下で細胞内溶解素
が表現されるように温度感受性ｃＩ遺伝子、機能性Ｎ、
Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有し、選択マーカー、すなわ
ち、ｔｎ１０テトラサイクリン耐性転置因子を有する溶
原菌である。かかる欠損溶原菌はウイルス増殖に対する
４つの独立した遮断を有している。すなわち、（ｉ）Ｏ
およびＰ複製機能の喪失、（ｉｉ）プロファージの重複
感染ファージからのｉｎｔおよびｘｉｓ遺伝子による相
補をできなくさせるａｔｔＲの喪失、（ｉｉｉ）ラムダ
構造遺伝子のコード不能および（ｉｖ）ラムダＤＮＡの
大きさが包装に必要な最小の大きさよりはるかに小さい
ことである。これらは、最初に、ＭＧ株のようなｃＩ８
５７、Ｏ−、Ｐ−溶原菌株に塩素酸塩ストレスを加えて
塩素酸塩耐性株を産生し、ＡおよびＢ機能欠損の重複感
染異種免疫もしくはビルレント・ラムダまたはラムドイ
ド・ファージの増殖を相補できない変異株を選択するこ
とにより調製できる。該マーカー、ラムダＤＮＡおよび
該イー・コリ染色体からのフランキング配列からなるＤ
ＮＡフラグメントは、例えば、制限エンドヌクレアーゼ
による処理またはＰ１形質導入によってＭＧ４株から単
離できる。
【００３１】ＭＧ４は、ウイルス構造成分をコードする
バクテリオファージ遺伝子の全部または大部分を欠失さ
せることによりＭＧ３から誘導できる。これらの遺伝子
の喪失を保証するためには、ＭＧ４中のウイルス・ゲノ
ムが、それ自体これらの遺伝子を欠損している重複感染
ファージを相補および増殖させることができないことを
証明すれば充分である。λシャロン３Ａ(λＡ-,Ｂ- imm
８０)がこの重複感染に使用できるファージの例であ
る。別法として、異種免疫またはビルレント・ファージ
(λvir)の存在下、ＡまたはＢにアンバー変異を有する
か、他のウイルス構造シストロンを有するいずれかのフ
ァージを感受性イー・コリ上で平板培養することができ
る。該２つのファージ間で組換が起り、組換体、例え
ば、virＡ-の形成をもたらす。組換体の頻度は実験条件
に依存して、１〜５０％の間である。組換体は、それら
がサプレッサー含有溶原菌[Ｙmel(λ)]上で平板培養で
きることおよび、それらがＮ９９のような非抑圧、λ感
受性株上でプラークを形成しないことにより認識でき
る。この交差で得られるプラークをＹmel(λ)またはＮ
９９を入れたペトリ皿上で平板培養し、組換体を精製す
る。Ａおよび／またはＢ遺伝子機能を欠損するラムダ・
ファージは、それらのラムダ・ゲノム上の位置ゆえに、
これらの機能を相補できないＭＧ４株が他のラムダ構造
遺伝子の全てを欠失することになるので好ましい。欠損
ファージおよび宿主をこのように使用することは「マー
カー救済」と称され、広く実施されている(例えば、“Ｔ
he Ｂacteriophage Ｌambda",ed．Ａ．Ｄ．Ｈershey,Ｃ
old Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,１９７１,Ｓtevens
et al．,pp５１５〜５３３参照)。
バクテリオファージ遺伝子の全部または大部分を欠失さ
せることによりＭＧ３から誘導できる。これらの遺伝子
の喪失を保証するためには、ＭＧ４中のウイルス・ゲノ
ムが、それ自体これらの遺伝子を欠損している重複感染
ファージを相補および増殖させることができないことを
証明すれば充分である。λシャロン３Ａ(λＡ-,Ｂ- imm
８０)がこの重複感染に使用できるファージの例であ
る。別法として、異種免疫またはビルレント・ファージ
(λvir)の存在下、ＡまたはＢにアンバー変異を有する
か、他のウイルス構造シストロンを有するいずれかのフ
ァージを感受性イー・コリ上で平板培養することができ
る。該２つのファージ間で組換が起り、組換体、例え
ば、virＡ-の形成をもたらす。組換体の頻度は実験条件
に依存して、１〜５０％の間である。組換体は、それら
がサプレッサー含有溶原菌[Ｙmel(λ)]上で平板培養で
きることおよび、それらがＮ９９のような非抑圧、λ感
受性株上でプラークを形成しないことにより認識でき
る。この交差で得られるプラークをＹmel(λ)またはＮ
９９を入れたペトリ皿上で平板培養し、組換体を精製す
る。Ａおよび／またはＢ遺伝子機能を欠損するラムダ・
ファージは、それらのラムダ・ゲノム上の位置ゆえに、
これらの機能を相補できないＭＧ４株が他のラムダ構造
遺伝子の全てを欠失することになるので好ましい。欠損
ファージおよび宿主をこのように使用することは「マー
カー救済」と称され、広く実施されている(例えば、“Ｔ
he Ｂacteriophage Ｌambda",ed．Ａ．Ｄ．Ｈershey,Ｃ
old Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,１９７１,Ｓtevens
et al．,pp５１５〜５３３参照)。
【００３２】本発明はいずれの細菌生産物の製造にも使
用できる。その例は非常に多く、とりわけ、インシュリ
ン、狂犬病糖蛋白質、Ｋ９９および９８７Ｐ抗原、抗生
物質、生長ホルモン、金属チオネイン、α−１−抗トリ
プシン、インフルエンザ抗原、リンフォカインおよびイ
ンターフェロンが包含される。加えて、本発明は、従来
必要とされている溶菌工程を回避して、操作を非常に簡
単に、かつ、操作時間を短縮できるので、コロニー・ス
クリーニング、ＲＮＡ単離およびプラスミド調製にも用
いることができる。
用できる。その例は非常に多く、とりわけ、インシュリ
ン、狂犬病糖蛋白質、Ｋ９９および９８７Ｐ抗原、抗生
物質、生長ホルモン、金属チオネイン、α−１−抗トリ
プシン、インフルエンザ抗原、リンフォカインおよびイ
ンターフェロンが包含される。加えて、本発明は、従来
必要とされている溶菌工程を回避して、操作を非常に簡
単に、かつ、操作時間を短縮できるので、コロニー・ス
クリーニング、ＲＮＡ単離およびプラスミド調製にも用
いることができる。
【００３３】
【実施例】つぎに実施例を挙げて、本発明をさらに詳し
く説明するが、これらに限定されるものではない。実施
例中、全ての出発材料は容易に入手できるか、公知の技
術によって容易に調製できる。形質導入は実質的にエク
スペリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネティックス
[“Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetucs",ed.Ｊ．
Ｈ．Ｍiller,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎew
Ｙork(１９７２),pp．２０１〜２０５]の記載に従って
行なった。
く説明するが、これらに限定されるものではない。実施
例中、全ての出発材料は容易に入手できるか、公知の技
術によって容易に調製できる。形質導入は実質的にエク
スペリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネティックス
[“Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetucs",ed.Ｊ．
Ｈ．Ｍiller,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎew
Ｙork(１９７２),pp．２０１〜２０５]の記載に従って
行なった。
【００３４】実施例１ ＭＧＯの調製 Ｃ６００株(イー・コリＳuＩＩ+,Ｋ１２,galＫ,lacＺ,s
uＩＩ,thi)をλcＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９(ウイスコンシン
大学、Ｗ．Ｓyzbalski氏提供)の存在下でインキュベー
ションした。３２℃で一夜増殖させ、生存細菌を分離、
精製した。これらの細菌の８０％が重複感染に対して免
疫性であり、４４℃で増殖できず、４４℃にさらした
後、λcＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９と区別できないラムダ・
ファージ[該ファージがＣ６００株上ではプラークを生
じるが、Ｎ９９株(イー・コリＫ１２,galＫ,lacＺ,su
Ｏ,thi)上では生じないことで判定]を産生することが判
明した。これらの生存細菌群の１つを精製し、ＭＧＯ
(Ｃ６００株(λcＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９))と命名した。
uＩＩ,thi)をλcＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９(ウイスコンシン
大学、Ｗ．Ｓyzbalski氏提供)の存在下でインキュベー
ションした。３２℃で一夜増殖させ、生存細菌を分離、
精製した。これらの細菌の８０％が重複感染に対して免
疫性であり、４４℃で増殖できず、４４℃にさらした
後、λcＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９と区別できないラムダ・
ファージ[該ファージがＣ６００株上ではプラークを生
じるが、Ｎ９９株(イー・コリＫ１２,galＫ,lacＺ,su
Ｏ,thi)上では生じないことで判定]を産生することが判
明した。これらの生存細菌群の１つを精製し、ＭＧＯ
(Ｃ６００株(λcＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９))と命名した。
【００３５】実施例２ ＭＧＯ−ＡＲ６の調製 Ｎ５１５１株(イー・コリＫ１２,ＳＡ５００,galＫ,lac
Ｚ,pro,thr,his,gal８(λcＩ８５７ △５８〜７１ △Ｈ
１))を、予めＡＲ４株(イー・コリＫ１２,gal::tn１０
(Ｐlcm１００))上で増殖させたＰlcm１００ファージの
存在下でインキュベーションした。Ｎ５１５１およびＡ
Ｒ４上で増殖させたＰlcm１００の交差はテトラサイク
リン耐性、ＵＶ感受性、温度感受性溶原菌を生じさせ
た。これらの単離物の１つを精製し、ＭＧＯ−ＡＲ６
(イー・コリＫ１２,gal８,gal::tn１０λ△５８〜７１
cＩ８５７ △Ｈ１(bio uvrＢ))と命名した。
Ｚ,pro,thr,his,gal８(λcＩ８５７ △５８〜７１ △Ｈ
１))を、予めＡＲ４株(イー・コリＫ１２,gal::tn１０
(Ｐlcm１００))上で増殖させたＰlcm１００ファージの
存在下でインキュベーションした。Ｎ５１５１およびＡ
Ｒ４上で増殖させたＰlcm１００の交差はテトラサイク
リン耐性、ＵＶ感受性、温度感受性溶原菌を生じさせ
た。これらの単離物の１つを精製し、ＭＧＯ−ＡＲ６
(イー・コリＫ１２,gal８,gal::tn１０λ△５８〜７１
cＩ８５７ △Ｈ１(bio uvrＢ))と命名した。
【００３６】実施例３ ＭＧ１の調製 ＭＧＯ−ＡＲ６は、Ｐlcm１００の存在下にインキュベ
ーションしたＡＲ６の生存菌を単離することによりＰlc
m１００溶原菌になった。ＭＧＯ−ＡＲ６のＰlcm１００
溶原菌をＭＧＯ−ＡＲ１８と命名した。ＭＧＯ株を、Ｍ
ＧＯ−ＡＲ１８上で増殖させたＰlcm１００によりＰ１
形質導入して交差させた。ファージを吸収させた後、菌
体を４Ｊ／m2のＵＶ照射(ＵＶ線量計で測定した場合、
２Ｊ／m2／sの割合の２５４nmの光の照射)に付し、テト
ラサイクリンの存在下でインキュベーションした。テト
ラサイクリン耐性コロニーの１１％がＵＶ光に耐性を示
し、それらがＨ１欠失を有せず、したがって、それらが
cＩからファージの右側端までのラムダ遺伝子を有して
いることを示した。ことに、このことはこれらのコロニ
ーがＰ３およびＯ２９変異と、無垢のＳおよびＲ遺伝子
を有していることを意味している。ＵＶ耐性、テトラサ
イクリン耐性菌の１／３はファージを産生しなかった。
したがって、これらはラムダの５８〜７１欠失を獲得
し、それ故、int、xisおよびkil遺伝子を欠失したと判
断された。この群を精製し、ＭＧ１((Ｃ６００)(λ△５
８〜７１,cＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９),ＳuＩＩ+,galＫ,lac
Ｚ,thi,gal::tn１０ tetR)と命名した。
ーションしたＡＲ６の生存菌を単離することによりＰlc
m１００溶原菌になった。ＭＧＯ−ＡＲ６のＰlcm１００
溶原菌をＭＧＯ−ＡＲ１８と命名した。ＭＧＯ株を、Ｍ
ＧＯ−ＡＲ１８上で増殖させたＰlcm１００によりＰ１
形質導入して交差させた。ファージを吸収させた後、菌
体を４Ｊ／m2のＵＶ照射(ＵＶ線量計で測定した場合、
２Ｊ／m2／sの割合の２５４nmの光の照射)に付し、テト
ラサイクリンの存在下でインキュベーションした。テト
ラサイクリン耐性コロニーの１１％がＵＶ光に耐性を示
し、それらがＨ１欠失を有せず、したがって、それらが
cＩからファージの右側端までのラムダ遺伝子を有して
いることを示した。ことに、このことはこれらのコロニ
ーがＰ３およびＯ２９変異と、無垢のＳおよびＲ遺伝子
を有していることを意味している。ＵＶ耐性、テトラサ
イクリン耐性菌の１／３はファージを産生しなかった。
したがって、これらはラムダの５８〜７１欠失を獲得
し、それ故、int、xisおよびkil遺伝子を欠失したと判
断された。この群を精製し、ＭＧ１((Ｃ６００)(λ△５
８〜７１,cＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９),ＳuＩＩ+,galＫ,lac
Ｚ,thi,gal::tn１０ tetR)と命名した。
【００３７】実施例４ ＭＧ１をＰlcm１００の存在下でインキュベーション
し、生存菌を精製した。これらの生存菌のうち、非常に
高い割合でＰlcm１００溶原菌となったＭＧ１菌体が同
定された。ＭＧ１のＰlcm１００溶原菌を精製し、ＭＧ
２と命名した。Ｎ９９株を、ＭＧ２上で増殖させたＰlc
m１００でＰlcm１００形質導入により交差させた。テト
ラサイクリン耐性の形質導入体を選択した。これらの全
てはラムダに対して免疫性で、したがって、ラムダ溶原
菌と判断された。これらの溶原菌の１つを精製し、ＭＧ
３(Ｎ９９(λ△５８〜７１cＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９))と
命名した。ＭＧ３を４４℃に９０〜１２０分間さらして
溶菌を測定した。該温度にさらす前および後、菌体培養
中には全くファージは見出されなかった(３．３×１０8
細胞／mlの培養０．１ml当り＜１)。ファージの存在は
Ｃ６００菌体上で検定した。非欠損ラムダ・プロファー
ジを有するイー・コリ株の対照培養は３．３×１０8細
胞／mlの培養１ml当り、１０5〜１０9個のファージを含
有していた。
し、生存菌を精製した。これらの生存菌のうち、非常に
高い割合でＰlcm１００溶原菌となったＭＧ１菌体が同
定された。ＭＧ１のＰlcm１００溶原菌を精製し、ＭＧ
２と命名した。Ｎ９９株を、ＭＧ２上で増殖させたＰlc
m１００でＰlcm１００形質導入により交差させた。テト
ラサイクリン耐性の形質導入体を選択した。これらの全
てはラムダに対して免疫性で、したがって、ラムダ溶原
菌と判断された。これらの溶原菌の１つを精製し、ＭＧ
３(Ｎ９９(λ△５８〜７１cＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９))と
命名した。ＭＧ３を４４℃に９０〜１２０分間さらして
溶菌を測定した。該温度にさらす前および後、菌体培養
中には全くファージは見出されなかった(３．３×１０8
細胞／mlの培養０．１ml当り＜１)。ファージの存在は
Ｃ６００菌体上で検定した。非欠損ラムダ・プロファー
ジを有するイー・コリ株の対照培養は３．３×１０8細
胞／mlの培養１ml当り、１０5〜１０9個のファージを含
有していた。
【００３８】実施例５ ＭＧ３の調製 実質的に前記実施例と同様に、ただし、Ｎ９９株をλc
Ｉ８５７ Ｐ３ Ｏ２９で直接溶原菌化してＭＧ３株を調
製した。得られた溶原菌をＭＧＯ−ＡＲ１８株でＰ１形
質導入することにより交差させ、温度誘発により溶菌す
るが、ファージを産生しないテトラサイクリン耐性溶原
菌を選択した。
Ｉ８５７ Ｐ３ Ｏ２９で直接溶原菌化してＭＧ３株を調
製した。得られた溶原菌をＭＧＯ−ＡＲ１８株でＰ１形
質導入することにより交差させ、温度誘発により溶菌す
るが、ファージを産生しないテトラサイクリン耐性溶原
菌を選択した。
【００３９】実施例６ ＵＣ５８２２の調製 Ｎ９９株をλint６ red３ cＩ８５７ Ｐ８０およびλhy
５ cＩ imm２１ △b２で感染させてＵＣ５８２２株を調
製した。λhy５ cＩ imm２１ △b２はファージλおよび
ファージ２１のハイブリッドである。この調製における
λhy５ cＩ imm21 △b２の目的は、λint６ red３ cＩ
８５７ Ｐ８０がこの株を溶原菌化するために必要なト
ランス状態でint機能を付与することにある。△b２変異
は△hy５cＩ imm２１ △b２ファージのそれ自体の該株
への組込の指令をできなくする。ラムダの重複感染に免
疫性であるが、ファージ２１に対して感受性を示すこの
交差の生存菌を精製し、ＵＣ５８２２と命名した。この
株は４４℃にさらすと生存しなかった。４４℃における
インキュベーションの前後で、ＵＣ５８２２の培養中に
ファージは全く検出できなかった。
５ cＩ imm２１ △b２で感染させてＵＣ５８２２株を調
製した。λhy５ cＩ imm２１ △b２はファージλおよび
ファージ２１のハイブリッドである。この調製における
λhy５ cＩ imm21 △b２の目的は、λint６ red３ cＩ
８５７ Ｐ８０がこの株を溶原菌化するために必要なト
ランス状態でint機能を付与することにある。△b２変異
は△hy５cＩ imm２１ △b２ファージのそれ自体の該株
への組込の指令をできなくする。ラムダの重複感染に免
疫性であるが、ファージ２１に対して感受性を示すこの
交差の生存菌を精製し、ＵＣ５８２２と命名した。この
株は４４℃にさらすと生存しなかった。４４℃における
インキュベーションの前後で、ＵＣ５８２２の培養中に
ファージは全く検出できなかった。
【００４０】実施例７ ＭＧ４の調製 ＭＧ３の培養菌をルリア(Ｌuria)ブロスまたは他の完全
培地中、Ａ650＝０．５となるまで３２℃で増殖させ
た。培養物は約５×１０8細胞／mlを含有していた。つ
いで、培養物を、０．２％グルコースおよび０．２％Ｋ
ＣlＯ3を補足した栄養寒天平板上で平板培養した。平板
を嫌気性条件下、３２℃でコロニーが形成されるまで
(３〜５日間)インキュベーションした。かかる条件下、
この培地上での増殖により、chlＡ、Ｂ、ＣまたはＤ遺
伝子に変異を有するイー・コリを選択した(“Ｅxpts．i
n Ｍolecular Ｇenetics",Ｊ．Ｍiller,pp．２２６〜２
２７参照)。chlＢ、ＣまたはＤにおける変異はＭＧ４の
単離にはつながらない。変異のうち、chlＡの表現に影
響するのはchlＡにおける点変異およびchlＡの左側また
は右側に伸びる欠失である。chlＡの左側に伸びる欠失
は隣接するuvrＢ遺伝子の破壊をきたし得、それ故、生
物にＵＶ感受性表現型を与える。同じ理由で、chlＤか
ら右側へ伸びる欠失も生物にＵＶ感受性表現型を与え得
る。嫌気性インキュベーションで得られた塩素酸塩耐性
コロニーがＵＶ感受性であるか否かを決定するためにテ
ストする。これは、塩素酸塩耐性コロニーをペトリ皿上
で画線し、ペトリ皿の１／２をカバーし、他の半分を２
５４nmＵＶ光の１０Ｊ／m2照射に付すことにより、都合
よく行なえる。この線量はＵＶ感受性菌体を殺すが、Ｕ
Ｖ耐性変異株は殺さないために充分な量である。ＵＶ感
受性変異株(chlＡまたはchlＤにおける変異からなる)の
欠損ラムダ・ファージの存在をテストする。これは、同
種免疫ファージの画線を介して菌体を交差画線すること
により行なえる。ラムダ感受性細菌は交差画線のところ
でファージによって殺され、ラムダ溶原菌は重複感染に
対して免疫性であり、殺されない。chlＡおよびchlＤ遺
伝子、ラムダ・ゲノムおよびuvrＢ遺伝子の所在の結
果、全てのＵＶ感受性chlＡ変異株はラムダ溶原菌とな
りうる。したがって、ＵＶ感受性、ラムダ溶原菌は左側
にuvrＢ中へ伸びるchlＡの欠失を含む。該欠失がuvrＢ
を通過して伸びる場合、ビオチン・オペロン中、また、
多分、構造ラムダ遺伝子中へ伸びることができる。この
方法により、構造ラムダ遺伝子の欠失が得られている
(Ｇrier,Ｖirology．６６:５８９〜６０４(１９７
５))。全てのuv感受性、chlＡ-、ラムダ溶原菌をλvir
Ａ-で感染させる。２．５時間後、λvirＡ-ファージお
よびλvirＡ+組換体について、溶解物の平板培養を行な
う。λvirＡ-の増殖および／またはλvirＡ+ファージの
産生のあったＭＧ４候補株をすてる。λvirＡ-の相補ま
たはλvirＡ+の産生をしない株はchlＡからラムダのＡ
遺伝子まで伸びる欠失を有している。chlＡからラムダ
のＡ遺伝子までの欠失を有するＭＧ４候補株の溶菌細菌
特性(＞３８℃の増殖の際の溶菌)についてテストする。
欠失を有し、溶菌細菌特性を保持している株をＭＧ４と
して精製する。
培地中、Ａ650＝０．５となるまで３２℃で増殖させ
た。培養物は約５×１０8細胞／mlを含有していた。つ
いで、培養物を、０．２％グルコースおよび０．２％Ｋ
ＣlＯ3を補足した栄養寒天平板上で平板培養した。平板
を嫌気性条件下、３２℃でコロニーが形成されるまで
(３〜５日間)インキュベーションした。かかる条件下、
この培地上での増殖により、chlＡ、Ｂ、ＣまたはＤ遺
伝子に変異を有するイー・コリを選択した(“Ｅxpts．i
n Ｍolecular Ｇenetics",Ｊ．Ｍiller,pp．２２６〜２
２７参照)。chlＢ、ＣまたはＤにおける変異はＭＧ４の
単離にはつながらない。変異のうち、chlＡの表現に影
響するのはchlＡにおける点変異およびchlＡの左側また
は右側に伸びる欠失である。chlＡの左側に伸びる欠失
は隣接するuvrＢ遺伝子の破壊をきたし得、それ故、生
物にＵＶ感受性表現型を与える。同じ理由で、chlＤか
ら右側へ伸びる欠失も生物にＵＶ感受性表現型を与え得
る。嫌気性インキュベーションで得られた塩素酸塩耐性
コロニーがＵＶ感受性であるか否かを決定するためにテ
ストする。これは、塩素酸塩耐性コロニーをペトリ皿上
で画線し、ペトリ皿の１／２をカバーし、他の半分を２
５４nmＵＶ光の１０Ｊ／m2照射に付すことにより、都合
よく行なえる。この線量はＵＶ感受性菌体を殺すが、Ｕ
Ｖ耐性変異株は殺さないために充分な量である。ＵＶ感
受性変異株(chlＡまたはchlＤにおける変異からなる)の
欠損ラムダ・ファージの存在をテストする。これは、同
種免疫ファージの画線を介して菌体を交差画線すること
により行なえる。ラムダ感受性細菌は交差画線のところ
でファージによって殺され、ラムダ溶原菌は重複感染に
対して免疫性であり、殺されない。chlＡおよびchlＤ遺
伝子、ラムダ・ゲノムおよびuvrＢ遺伝子の所在の結
果、全てのＵＶ感受性chlＡ変異株はラムダ溶原菌とな
りうる。したがって、ＵＶ感受性、ラムダ溶原菌は左側
にuvrＢ中へ伸びるchlＡの欠失を含む。該欠失がuvrＢ
を通過して伸びる場合、ビオチン・オペロン中、また、
多分、構造ラムダ遺伝子中へ伸びることができる。この
方法により、構造ラムダ遺伝子の欠失が得られている
(Ｇrier,Ｖirology．６６:５８９〜６０４(１９７
５))。全てのuv感受性、chlＡ-、ラムダ溶原菌をλvir
Ａ-で感染させる。２．５時間後、λvirＡ-ファージお
よびλvirＡ+組換体について、溶解物の平板培養を行な
う。λvirＡ-の増殖および／またはλvirＡ+ファージの
産生のあったＭＧ４候補株をすてる。λvirＡ-の相補ま
たはλvirＡ+の産生をしない株はchlＡからラムダのＡ
遺伝子まで伸びる欠失を有している。chlＡからラムダ
のＡ遺伝子までの欠失を有するＭＧ４候補株の溶菌細菌
特性(＞３８℃の増殖の際の溶菌)についてテストする。
欠失を有し、溶菌細菌特性を保持している株をＭＧ４と
して精製する。
【００４１】実施例８ ＭＭ２９４(cＩ８５７)およびＵＣ５８２２におけるク
ローニング イー・コリＭＭ２９４株をλcＩ８５７の存在下でイン
キュベートした。３２℃で一夜増殖後、生存細菌を単離
し、精製した。重複感染に免疫で、４４℃で増殖でき
ず、ファージを産生できないクローンを分離した。得ら
れたcＩ８５７溶原株、ＭＭ２９４(λcＩ８５７)および
イー・コリＵＣ５８２２株をＣaＣl2処理によってコン
ピテント菌とし、イー・コリＬＴ−Ｂ抗原ならびにアン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性についての遺伝子
を有するプラスミド、pＤＮ５で形質転換した。両方の
溶菌細菌株のアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
形質転換体は標準栄養ブロス中、３０〜３２℃でよく増
殖し、ＬＴ−Ｂ抗原を表現した。細菌を遠心分離により
ペレット化し、４２℃の標準栄養ブロスに移す。約９０
〜１２０分以内に、細胞溶解が明白になり、実質的に完
了した。ＬＴ−Ｂ抗原がブロス中に放出された。４×１
０7細胞／mlからなるＭＭ２９４(cＩ８５７)形質転換体
の試料において、１ml当り、約２×１０8個のラムダ・
ファージを収集した。ＵＣ５８２２形質転換体の同様な
試料中では、全くファージは収集されなかった(＜２０
個／ml)。
ローニング イー・コリＭＭ２９４株をλcＩ８５７の存在下でイン
キュベートした。３２℃で一夜増殖後、生存細菌を単離
し、精製した。重複感染に免疫で、４４℃で増殖でき
ず、ファージを産生できないクローンを分離した。得ら
れたcＩ８５７溶原株、ＭＭ２９４(λcＩ８５７)および
イー・コリＵＣ５８２２株をＣaＣl2処理によってコン
ピテント菌とし、イー・コリＬＴ−Ｂ抗原ならびにアン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性についての遺伝子
を有するプラスミド、pＤＮ５で形質転換した。両方の
溶菌細菌株のアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
形質転換体は標準栄養ブロス中、３０〜３２℃でよく増
殖し、ＬＴ−Ｂ抗原を表現した。細菌を遠心分離により
ペレット化し、４２℃の標準栄養ブロスに移す。約９０
〜１２０分以内に、細胞溶解が明白になり、実質的に完
了した。ＬＴ−Ｂ抗原がブロス中に放出された。４×１
０7細胞／mlからなるＭＭ２９４(cＩ８５７)形質転換体
の試料において、１ml当り、約２×１０8個のラムダ・
ファージを収集した。ＵＣ５８２２形質転換体の同様な
試料中では、全くファージは収集されなかった(＜２０
個／ml)。
【００４２】実施例９ ＵＣ５８２２におけるクローニング イー・コリＬＴ−Ｂ抗原の遺伝子を有するプラスミドp
ＥＳＳ２を含有するイー・コリＵＣ５８２２の種培養を
アンピシリン含有Ｌブロスの５ml試験管中でインキュベ
ートした。６時間後、試験管内容物をアンピシリンを含
有する培地５００mlに移し、３２℃で一夜振とうしなが
らインキュベートした。該一夜培養物４００mlを、バー
テイス(Ｖirtis)・ベンチ・トップ醗酵器中、アンピシ
リン含有培地１０lに移した。培養物を３２℃に保持
し、各時間ごとに試料１００mlについてＡ420における
増殖をモニターした。４時間目に、培養物に５０％デキ
ストロース２００mlおよび消泡剤０．１mlを加えた。８
時間目、培養物は４．８Ａ420単位となり、４３℃に変
化させた。１０時間目、培養物に再び５０％デキストロ
ース２００mlを加え、１４時間目に培養を停止した。４
時間目、６時間目、８時間目、９時間目、１０時間目、
１０．６時間目および１４時間目の細胞濃縮物(ペレッ
ト)および細胞上澄液の試料のＬＴBについて、既知濃度
のＬＴBを標準とするエライサ(ＥＬＩＳＡ)テストを用
いてテストした。
ＥＳＳ２を含有するイー・コリＵＣ５８２２の種培養を
アンピシリン含有Ｌブロスの５ml試験管中でインキュベ
ートした。６時間後、試験管内容物をアンピシリンを含
有する培地５００mlに移し、３２℃で一夜振とうしなが
らインキュベートした。該一夜培養物４００mlを、バー
テイス(Ｖirtis)・ベンチ・トップ醗酵器中、アンピシ
リン含有培地１０lに移した。培養物を３２℃に保持
し、各時間ごとに試料１００mlについてＡ420における
増殖をモニターした。４時間目に、培養物に５０％デキ
ストロース２００mlおよび消泡剤０．１mlを加えた。８
時間目、培養物は４．８Ａ420単位となり、４３℃に変
化させた。１０時間目、培養物に再び５０％デキストロ
ース２００mlを加え、１４時間目に培養を停止した。４
時間目、６時間目、８時間目、９時間目、１０時間目、
１０．６時間目および１４時間目の細胞濃縮物(ペレッ
ト)および細胞上澄液の試料のＬＴBについて、既知濃度
のＬＴBを標準とするエライサ(ＥＬＩＳＡ)テストを用
いてテストした。
【００４３】結果を第１表に示す。最初の４〜８時間、
ＬＴ−Ｂの９０％以上が細胞内に存在していたが、温度
変化後２時間(接種後１０時間)、ＬＴ−Ｂの９０％が上
澄液中の存在した。温度変化後６時間目、ＬＴ−Ｂの９
５％が上澄液中にあり、ＬＴ−Ｂは総蛋白質の８．５％
に相当した。ＬＴ−Ｂの収率はpＥＳＳ２で形質転換し
たイー・コリＭＭ２９４からの収率よりもはるかに大き
かった。温度変化後、２〜４時間以内に培地の粘度上昇
および可視細胞片によって溶菌が明らかとなった。温度
変化後４〜６時間まで、粘度は大いに減少し、培養物は
容易にポンプで限外濾過装置に通して全細胞片および残
った未溶解細胞を除去できた。粘度の増加は高分子量Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡの培地への放出を反映し、内因性ヌク
レアーゼの作用が究極的に著しい粘度の減少をもたら
す。
ＬＴ−Ｂの９０％以上が細胞内に存在していたが、温度
変化後２時間(接種後１０時間)、ＬＴ−Ｂの９０％が上
澄液中の存在した。温度変化後６時間目、ＬＴ−Ｂの９
５％が上澄液中にあり、ＬＴ−Ｂは総蛋白質の８．５％
に相当した。ＬＴ−Ｂの収率はpＥＳＳ２で形質転換し
たイー・コリＭＭ２９４からの収率よりもはるかに大き
かった。温度変化後、２〜４時間以内に培地の粘度上昇
および可視細胞片によって溶菌が明らかとなった。温度
変化後４〜６時間まで、粘度は大いに減少し、培養物は
容易にポンプで限外濾過装置に通して全細胞片および残
った未溶解細胞を除去できた。粘度の増加は高分子量Ｄ
ＮＡおよびＲＮＡの培地への放出を反映し、内因性ヌク
レアーゼの作用が究極的に著しい粘度の減少をもたら
す。
【００４４】
【表１】
【００４５】実施例１０ 溶菌性サルモネラの調製 接合またはＤＮＡ形質転換により、サルモネラおよびＭ
Ｇ３の間で種間交差を行なう。サルモネラ株は正常には
テトラサイクリン感受性であり、ＭＧ３はテトラサイク
リン耐性である。テトラサイクリン耐性となったサルモ
ネラ組換体の４２℃における増殖能力をテストする。こ
の温度で溶解するサルモネラは組換を通じてＭＧ３の溶
菌性細菌機能を獲得する。この実験は、(１)ラムダ溶菌
性機能がサルモネラで表現されること、および(２)サル
モネラとイー・コリ(ＭＧ３)の間に該遺伝子と側面を接
するイー・コリ配列のサルモネラ中への組換を可能にす
る充分な相同性が存在することにより可能である。
Ｇ３の間で種間交差を行なう。サルモネラ株は正常には
テトラサイクリン感受性であり、ＭＧ３はテトラサイク
リン耐性である。テトラサイクリン耐性となったサルモ
ネラ組換体の４２℃における増殖能力をテストする。こ
の温度で溶解するサルモネラは組換を通じてＭＧ３の溶
菌性細菌機能を獲得する。この実験は、(１)ラムダ溶菌
性機能がサルモネラで表現されること、および(２)サル
モネラとイー・コリ(ＭＧ３)の間に該遺伝子と側面を接
するイー・コリ配列のサルモネラ中への組換を可能にす
る充分な相同性が存在することにより可能である。
【００４６】実施例１１ 溶菌性バチルスの調製 第１法 宿主の溶解を指令するに充分な遺伝因子にはλcＩ８５
７、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子およびＰLプロモータが
包含される。これらの遺伝子の制限地図は公知である
(Ｍolecular Ｃloning,Ｍaniatis et al．,Ｃold Ｓpri
ng Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎ．Ｙ．)。これらの遺伝子は
ラムダからプラスミド(例えば、pＢＲ３２２)上にサブ
クローンされる。バチルスからのＤＮＡのフラグメント
をプラスミド中、非必須部分のサイトに挿入する。宿主
株ＤＮＡの性質または機能あるいはそのプラスミド中に
おける方向づけに特性を与える必要はない。ついで、バ
チルスを精製プラスミドＤＮＡと共にインキュベーショ
ンし、抗生物質耐性形質転換体を選択する。これらの形
質転換体をテストし、高温にさらした後、溶菌するか否
かを測定する。これらの形質転換体において、ラムダ遺
伝子を含有するプラスミドは自律的複製単位として存在
するか、プラスミドおよび染色体上の相同バチルスＤＮ
Ａ間の組換事象を介して宿主染色体中に組込まれる。バ
チルス染色体中に複製できないプラスミドによって担持
されるＤＮＡの組込みは公知である(Ｈaldenway et al,
Ｊ．Ｂact．１４２:９０〜９８,１９８０)。この方法は
受容宿主株中でのラムダ溶菌遺伝子の表現を必要とする
が、ＭＧ３のイー・コリ配列と受容細菌株との間の相同
性は要求しない。
７、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子およびＰLプロモータが
包含される。これらの遺伝子の制限地図は公知である
(Ｍolecular Ｃloning,Ｍaniatis et al．,Ｃold Ｓpri
ng Ｈarbor Ｌaboratory,Ｎ．Ｙ．)。これらの遺伝子は
ラムダからプラスミド(例えば、pＢＲ３２２)上にサブ
クローンされる。バチルスからのＤＮＡのフラグメント
をプラスミド中、非必須部分のサイトに挿入する。宿主
株ＤＮＡの性質または機能あるいはそのプラスミド中に
おける方向づけに特性を与える必要はない。ついで、バ
チルスを精製プラスミドＤＮＡと共にインキュベーショ
ンし、抗生物質耐性形質転換体を選択する。これらの形
質転換体をテストし、高温にさらした後、溶菌するか否
かを測定する。これらの形質転換体において、ラムダ遺
伝子を含有するプラスミドは自律的複製単位として存在
するか、プラスミドおよび染色体上の相同バチルスＤＮ
Ａ間の組換事象を介して宿主染色体中に組込まれる。バ
チルス染色体中に複製できないプラスミドによって担持
されるＤＮＡの組込みは公知である(Ｈaldenway et al,
Ｊ．Ｂact．１４２:９０〜９８,１９８０)。この方法は
受容宿主株中でのラムダ溶菌遺伝子の表現を必要とする
が、ＭＧ３のイー・コリ配列と受容細菌株との間の相同
性は要求しない。
【００４７】第２法 ファージphi−１０５はバチルスに感染し、テンペレー
ト・ファージで、変異できるcＩ様レプレッサーを有し
ている。このレプレッサーに影響を及ぼす温度感受性変
異を有するphi−１０５の誘導体を調製することができ
る。除去もしくは複製機能を欠くファージ誘導体は変異
誘発処理または欠損株の単離によって分離できる(Ｆloc
k,Ｍol．Ｇen．Ｇenet．,１５５:２４１〜２４７,１９
７７)。熱不安定性レプレッサーを有するファージ誘導
体を得る。この変異体の溶原菌は、感受性細胞を３０℃
にて該ファージ感染し、生存細胞を分離し、これらの細
胞の重複感染ファージに対する免疫および４０℃におい
て増殖不能なことをテストすることにより調製される。
かかる生物はファージ産生溶菌性細菌である。欠損溶菌
性細菌を分離するため、細菌を変異誘発処理し、生存コ
ロニーを、phi−１０５感受性バチルスの未発達ローン
上でレプリカ平板培養を行なう。高温にさらした後、ロ
ーン上でほとんど、または全くファージを産生しない温
度感受性コロニーはファージ増殖に影響を及ぼす変異を
有している。変異誘発処理のくり返しにより、より多く
のストリンジエント変異株を得ることができる。この構
造を可動化し、この構造の移動を容易に選択するため
に、phi−１０５ゲノムに結合した抗生物質耐性マーカ
ーを有する誘導体を分離することが好ましい。これは、
バチルス染色体のランダム・フラグメントを、pＢＲ３
２２のような、抗生物質耐性決定子を有する、バチルス
中で複製できないプラスミドにクローニングすることに
より行なえる。形質転換した、薬剤耐性細胞が単離さ
れ、これは組込みプラスミドを有している。これらの細
胞のいくつかにおいて、プラスミドはphi−１０５のサ
イトの近くに組込まれている。薬剤耐性コロニーの非分
割プールを普遍バチルス導入ファージ、pＢＳ１で感染
させる。pＢＳ１のストックは、イー・コリにおけるＰl
cm１００が機能すると正確に同じ方法でバチルス中で機
能し、バチルス細胞を薬剤耐性に形質導入するために用
いられる。これらの薬剤耐性形質導入体をテストし、そ
れらが温度感受性で、溶菌性細菌であるか否かを測定す
る。形質導入体の約１％が溶菌性細菌特性を獲得してい
る。以上説明した本発明のＤＮＡフラグメントおよび細
菌は、細菌生産物の産生および外在化に有用である。以
上は本発明の好ましい具体例についての記載であるが、
本発明の精神を逸脱することなく、種々の変形を加える
ことができ、それらも本発明範囲のものである。
ト・ファージで、変異できるcＩ様レプレッサーを有し
ている。このレプレッサーに影響を及ぼす温度感受性変
異を有するphi−１０５の誘導体を調製することができ
る。除去もしくは複製機能を欠くファージ誘導体は変異
誘発処理または欠損株の単離によって分離できる(Ｆloc
k,Ｍol．Ｇen．Ｇenet．,１５５:２４１〜２４７,１９
７７)。熱不安定性レプレッサーを有するファージ誘導
体を得る。この変異体の溶原菌は、感受性細胞を３０℃
にて該ファージ感染し、生存細胞を分離し、これらの細
胞の重複感染ファージに対する免疫および４０℃におい
て増殖不能なことをテストすることにより調製される。
かかる生物はファージ産生溶菌性細菌である。欠損溶菌
性細菌を分離するため、細菌を変異誘発処理し、生存コ
ロニーを、phi−１０５感受性バチルスの未発達ローン
上でレプリカ平板培養を行なう。高温にさらした後、ロ
ーン上でほとんど、または全くファージを産生しない温
度感受性コロニーはファージ増殖に影響を及ぼす変異を
有している。変異誘発処理のくり返しにより、より多く
のストリンジエント変異株を得ることができる。この構
造を可動化し、この構造の移動を容易に選択するため
に、phi−１０５ゲノムに結合した抗生物質耐性マーカ
ーを有する誘導体を分離することが好ましい。これは、
バチルス染色体のランダム・フラグメントを、pＢＲ３
２２のような、抗生物質耐性決定子を有する、バチルス
中で複製できないプラスミドにクローニングすることに
より行なえる。形質転換した、薬剤耐性細胞が単離さ
れ、これは組込みプラスミドを有している。これらの細
胞のいくつかにおいて、プラスミドはphi−１０５のサ
イトの近くに組込まれている。薬剤耐性コロニーの非分
割プールを普遍バチルス導入ファージ、pＢＳ１で感染
させる。pＢＳ１のストックは、イー・コリにおけるＰl
cm１００が機能すると正確に同じ方法でバチルス中で機
能し、バチルス細胞を薬剤耐性に形質導入するために用
いられる。これらの薬剤耐性形質導入体をテストし、そ
れらが温度感受性で、溶菌性細菌であるか否かを測定す
る。形質導入体の約１％が溶菌性細菌特性を獲得してい
る。以上説明した本発明のＤＮＡフラグメントおよび細
菌は、細菌生産物の産生および外在化に有用である。以
上は本発明の好ましい具体例についての記載であるが、
本発明の精神を逸脱することなく、種々の変形を加える
ことができ、それらも本発明範囲のものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェフリイ・イラ・オーエルバッチ アメリカ合衆国メリーランド州20901、シ ルバー・スプリング、セント・アンドリュ ース・レイン600番
Claims (11)
- 【請求項１】 （ｉ）選択可能な形質をコードしている
遺伝子である選択マーカー；（ｉｉ）温度感受性ｃＩレ
プレッサー遺伝子およびリゾチーム・コード付け遺伝子
が許容条件下で抑制されかつ制限条件下で表現されるよ
うな機能性リゾチーム・コード付け遺伝子を有している
ラムダ・プロファージＤＮＡ配列であって、該プロファ
ージＤＮＡ配列が機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有
し、遺伝子地図の５８位と７１位との間の遺伝子を欠失
し、ＯおよびＰ遺伝子を変異してＯおよびＰ遺伝子機能
を損失させるラムダ・プロファージＤＮＡ配列；および
（ｉｉｉ）フラグメントと宿主細胞の染色体との間で組
換えを生起させる宿主細菌細胞の染色体における隣接配
列に相同するフランキングＤＮＡ配列からなることを特
徴とするＤＮＡフラグメント。 - 【請求項２】 ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、
ＯおよびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選
択マーカーがｔｎ１０転置テトラサイクリン耐性因子で
ある請求項１記載のＤＮＡフラグメント。 - 【請求項３】 プロファージＤＮＡ配列が遺伝子地図の
３位と７１位との間の遺伝子を欠失している請求項１記
載のＤＮＡフラグメント。 - 【請求項４】 ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、
ＯおよびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選
択マーカーがｔｎ１０転置テトラサイクリン耐性因子で
ある請求項３記載のＤＮＡフラグメント。 - 【請求項５】 （ｉ）選択可能な形質をコードしている
遺伝子である選択マーカー；（ｉｉ）温度感受性ｃＩレ
プレッサー遺伝子およびリゾチーム・コード付け遺伝子
が許容条件下で抑制されかつ制限条件下で表現されるよ
うな機能性リゾチーム・コード付け遺伝子を有している
ラムダ・プロファージＤＮＡ配列であって、該プロファ
ージＤＮＡ配列が機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有
し、遺伝子地図の５８位と７１位との間の遺伝子を欠失
し、ＯおよびＰ遺伝子を変異してＯおよびＰ遺伝子機能
を損失させるラムダ・プロファージＤＮＡ配列；および
（ｉｉｉ）フラグメントと宿主細胞の染色体との間で組
換えを生起させる宿主細菌細胞の染色体における隣接配
列に相同するフランキングＤＮＡ配列からなるＤＮＡフ
ラグメントを含有する細菌。 - 【請求項６】 プロファージＤＮＡ配列が遺伝地図の３
位と７１位との間の遺伝子を欠失している請求項５項記
載の細菌。 - 【請求項７】 イー・コリである請求項５記載の細菌。
- 【請求項８】 イー・コリである請求項６記載の細菌。
- 【請求項９】 ＭＧ株である請求項７記載の細菌。
- 【請求項１０】 ＭＧ３株である請求項７記載の細菌。
- 【請求項１１】 ＭＧ４株である請求項８記載の細菌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US521517 | 1983-08-09 | ||
| US06/521,517 US4637980A (en) | 1983-08-09 | 1983-08-09 | Externalization of products of bacteria |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59167705A Division JPH0698018B2 (ja) | 1983-08-09 | 1984-08-09 | 細菌生産物の外在化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121691A JPH06121691A (ja) | 1994-05-06 |
| JPH0714348B2 true JPH0714348B2 (ja) | 1995-02-22 |
Family
ID=24077058
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59167705A Expired - Lifetime JPH0698018B2 (ja) | 1983-08-09 | 1984-08-09 | 細菌生産物の外在化法 |
| JP5184810A Expired - Lifetime JPH0714348B2 (ja) | 1983-08-09 | 1993-07-27 | 細菌生産物の外在化に用いるｄｎａフラグメントおよび細菌 |
| JP6071868A Expired - Fee Related JPH0787787B2 (ja) | 1983-08-09 | 1994-04-11 | 温度感受性細菌の産生法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59167705A Expired - Lifetime JPH0698018B2 (ja) | 1983-08-09 | 1984-08-09 | 細菌生産物の外在化法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6071868A Expired - Fee Related JPH0787787B2 (ja) | 1983-08-09 | 1994-04-11 | 温度感受性細菌の産生法 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4637980A (ja) |
| EP (1) | EP0140864B1 (ja) |
| JP (3) | JPH0698018B2 (ja) |
| KR (1) | KR940004545B1 (ja) |
| AT (1) | ATE51024T1 (ja) |
| AU (1) | AU583014B2 (ja) |
| CA (1) | CA1219825A (ja) |
| DE (1) | DE3481629D1 (ja) |
| DK (1) | DK172672B1 (ja) |
| ES (2) | ES8602124A1 (ja) |
| FI (1) | FI89507C (ja) |
| GR (1) | GR80053B (ja) |
| HU (1) | HU197940B (ja) |
| IE (1) | IE57797B1 (ja) |
| IL (1) | IL72623A (ja) |
| NO (1) | NO169242C (ja) |
| NZ (1) | NZ209128A (ja) |
| PT (1) | PT79045A (ja) |
| ZA (1) | ZA846132B (ja) |
| ZW (1) | ZW12684A1 (ja) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894334A (en) * | 1984-03-28 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
| CA1340372C (en) * | 1984-07-09 | 1999-02-02 | John D. Clements | Production of e. coli lt-b enterotoxin subunit |
| US5759816A (en) * | 1984-08-27 | 1998-06-02 | Bio-Technology General Corp. | Expression vectors containing λPL promoter and T1 T2 rRNA termination sequence plasmids containing the vectors hosts containing the plasmids and related methods |
| US5162217A (en) * | 1984-08-27 | 1992-11-10 | Bio-Technology General Corp. | Plasmids for expression of human superoxide dismutase (SOD) analogs containing lambda PL promoter with engineered restriction site for substituting ribosomal binding sites and methods of use thereof |
| TW205070B (ja) * | 1986-06-30 | 1993-05-01 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| US5223407A (en) * | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| US5646015A (en) * | 1988-08-31 | 1997-07-08 | Astra Ab | Excretion of heterologous proteins from E. coli |
| US5198346A (en) * | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
| US5096815A (en) * | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
| DE4023721A1 (de) * | 1990-07-26 | 1992-01-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von vakzinen und ihre verwendung |
| US6177083B1 (en) * | 1990-07-26 | 2001-01-23 | Evax Technologies Gmbh | Process for the production of vaccines and their use |
| GB9223709D0 (en) * | 1992-11-12 | 1992-12-23 | Ici Plc | Process for the separation of protein from microorganisms |
| US5468629A (en) * | 1993-04-13 | 1995-11-21 | Calhoun; Cornelia | Method of promoting in vitro homologous recombination transfection in mammalian cells using the RecA protein |
| SE9702401D0 (sv) | 1997-06-19 | 1997-06-19 | Astra Ab | Pharmaceutical use |
| PT1323820E (pt) * | 1998-10-28 | 2009-03-05 | Genentech Inc | Processo para recuperação facilitada de polipéptidos heterólogos a partir de células bacterianas |
| US7858339B1 (en) | 1998-10-28 | 2010-12-28 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US6268178B1 (en) | 1999-05-25 | 2001-07-31 | Phage Biotechnology Corp. | Phage-dependent super-production of biologically active protein and peptides |
| US6479280B1 (en) * | 1999-09-24 | 2002-11-12 | Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw | Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor |
| WO2002014471A2 (en) * | 2000-08-15 | 2002-02-21 | Phage Biotechnology Corporation | A method of producing biologically active human acidic fibroblast growth factor and its use in promoting angiogenesis |
| AU8491401A (en) * | 2000-08-15 | 2002-02-25 | Phage Biotechnology Corp | Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides |
| US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
| EP2327718B1 (en) | 2003-11-21 | 2016-03-23 | Pfenex, Inc. | Improved expression systems with SEC-system secretion |
| CN101151272A (zh) * | 2003-12-01 | 2008-03-26 | 陶氏环球技术公司 | 在假单胞菌中生产重组二十面体病毒样颗粒 |
| CN101031655A (zh) | 2004-07-26 | 2007-09-05 | 陶氏环球技术公司 | 通过株工程改进蛋白表达的方法 |
| US7892811B2 (en) * | 2004-08-17 | 2011-02-22 | Zymo Research Corporation | Controlled lysis of bacteria |
| KR101491867B1 (ko) | 2007-01-31 | 2015-02-10 | 피페넥스 인크. | 증가된 발현을 위한 박테리아 리더 서열 |
| CN101784655A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-07-21 | 菲尼克斯股份有限公司 | 可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配 |
| WO2008134461A2 (en) | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Dow Global Technologies, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
| US9017966B2 (en) * | 2007-05-23 | 2015-04-28 | Nature Technology Corporation | E. coli plasmid DNA production |
| US8318481B2 (en) * | 2007-12-07 | 2012-11-27 | Pfenex Inc. | High copy number self-replicating plasmids in pseudomonas |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4336336A (en) | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
| US4338397A (en) | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| US4506013A (en) * | 1980-10-03 | 1985-03-19 | Eli Lilly And Company | Stabilizing and selecting recombinant DNA host cells |
| EP0061250A3 (en) * | 1981-03-23 | 1983-09-28 | Biogen N.V. | Improved process for recovering products produced by host organisms |
| CA1185197A (en) * | 1981-04-30 | 1985-04-09 | Akira Furuya | Lysozyme-sensitive microorganism |
| EP0074808A3 (en) * | 1981-09-16 | 1984-07-04 | University Patents, Inc. | Recombinant method and materials |
-
1983
- 1983-08-09 US US06/521,517 patent/US4637980A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-08-06 AU AU31638/84A patent/AU583014B2/en not_active Ceased
- 1984-08-07 EP EP84870113A patent/EP0140864B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-08-07 GR GR80053A patent/GR80053B/el unknown
- 1984-08-07 IE IE2021/84A patent/IE57797B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-08-07 DK DK198403806A patent/DK172672B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-08-07 AT AT84870113T patent/ATE51024T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-08-07 FI FI843104A patent/FI89507C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-08-07 NZ NZ209128A patent/NZ209128A/xx unknown
- 1984-08-07 DE DE8484870113T patent/DE3481629D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1984-08-08 HU HU843033A patent/HU197940B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-08-08 IL IL72623A patent/IL72623A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-08-08 ZA ZA846132A patent/ZA846132B/xx unknown
- 1984-08-08 KR KR1019840004729A patent/KR940004545B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-08-08 ES ES534963A patent/ES8602124A1/es not_active Expired
- 1984-08-08 ZW ZW126/84A patent/ZW12684A1/xx unknown
- 1984-08-08 PT PT79045A patent/PT79045A/pt unknown
- 1984-08-08 NO NO843183A patent/NO169242C/no unknown
- 1984-08-08 CA CA000460500A patent/CA1219825A/en not_active Expired
- 1984-08-09 JP JP59167705A patent/JPH0698018B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-05-16 ES ES543207A patent/ES8703524A1/es not_active Expired
-
1993
- 1993-07-27 JP JP5184810A patent/JPH0714348B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-04-11 JP JP6071868A patent/JPH0787787B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0714348B2 (ja) | 細菌生産物の外在化に用いるｄｎａフラグメントおよび細菌 | |
| US6372478B1 (en) | Recombinant mycobacteria | |
| Mindich et al. | Isolation of nonsense mutants of lipid-containing bacteriophage PRD1 | |
| Schauer et al. | λ N antitermination system: functional analysis of phage interactions with the host NusA protein | |
| JPH11235191A (ja) | 細胞の遺伝的集団において所望の組換え遺伝子を維持する方法 | |
| JP3976685B2 (ja) | タンパク質分泌のためのＣｌｙＡ溶血素の使用 | |
| JPS6137918B2 (ja) | ||
| JP2000300254A (ja) | 寄生体由来抵抗性 | |
| JPS6137917B2 (ja) | ||
| DE69933990T2 (de) | Hocheffiziente und kontrollierte expression von exogenen genen in e. coli | |
| JP2693948B2 (ja) | 侵入性微生物 | |
| Walker et al. | Mutations in coliphage P1 affecting host cell lysis | |
| EP0095934A2 (en) | Novel bacteriophage and method for breeding thereof | |
| US4784952A (en) | Conferred susceptibility to lambda phage in non-coliform procaryotic hosts | |
| WO1995010614A1 (en) | Recombinant staphylococcal nucleases and their use in limiting the survival of genetically engineered microorganisms | |
| JPH0372888A (ja) | 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌 | |
| Jenkins et al. | Male-specific bacteriophage MS2 propagation in fluorophenylalanine-resistant Escherichia coli K12 | |
| US4415660A (en) | Method of making a cloning vector | |
| JPH04501501A (ja) | ９５ｋｂ程度の大きさのｄｎａ断片用ｐ１バクテリオフアージクローニング系 | |
| JPS58501406A (ja) | エシエリヒア・コリ−における蛋白合成発現の高揚 | |
| US4332901A (en) | Cloning vector | |
| JPS60118188A (ja) | 新規な組み換え体ｄνａ | |
| Kano et al. | Polarity in segments of the Escherichia coli trp operon with deleted intraoperonic translational initiation signals | |
| JPH0777555B2 (ja) | 改良された大腸菌宿主ベクター系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19950829 |