DK172672B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt, DNA-fragment, bakteriestamme omfattende DNA-fragment, fremgangsmåde til fr - Google Patents

Description

i DK 172672 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt, et DNA-fragment, en bakteriestamme omfattende DNA-fragmentet, en fremgangsmåde til fremstilling af en temperaturfølsom bakteriestamme samt en fremgangsmåde 5 til fremstilling af et produkt i en bakteriestamme, som producerer eller bringes til at producere produktet.

Et problem med anvendelse af E. coli og andre prokaryotiske mikroorganismer som værter til udtryk af ønskede proteiner har ofte været eksternalisering af proteinerne fra værtscellerne 10 til rensning. Forsøg på at overvinde dette problem indbefatter fysisk sprængning af cellerne, såsom ved homogenisering eller sonikering, kemisk sprængning af cellerne, såsom ved behandling med detergent eller lysozym, og kondensering af en DNA-sekvens, der koder for et ekskretionssignalpeptid med et 15 strukturelt gen, der koder for det ønskede produkt. For eksempel beskriver Weissman m.fl. i europæisk patentansøgning 61.250 behandling af værtsceller med et lysende eller permea-biliserende middel. Silhavy m.fl., amerikansk patent 4.336.336,beskriver en fremgangsmåde til kondensering af et 20 gen for et cytoplasmisk protein med et gen for et ikke-cyto-plasmisk protein, således at et fremkommet hybridprotein transporteres til, nær ved eller ud over værtscellens overflade. Gilbert m.fl. beskriver i amerikansk patent nr. 4.338.297 en fremgangsmåde til fremstilling af færdige udskilte protei-25 ner ved at indsætte et strukturelt gen for et præprotein i en ekspressionsvektor.

E. coli kan inficeres med en obligatorisk parasit, lambdafa-gen, som er en dobbeltstrenget DNA-virus. Lambdagenetik er ligesom E.coli-genetik vel-undersøgt (se f.eks. "The Bacterio-30 phage Lambda", redigeret af A.D.Hershey, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1971) .

Lambda, en moderat fag, formerer sig i E.coli i den ene eller den anden af to faser. I den ene, den lytiske fase, kopieres fag-DNA autonomt og dirigerer dannelse af capsidproteiner, 2 DK 172672 B1 indhylning og lyse af værtscellen. Ekspression af lambda-DNA under den lytiske fase er meget effektiv. Transskription forekommer på begge DNA-strengene, på den ene i højregående retning og på den anden i venstregående retning. Induktion kan 5 resultere i frigørelse af ca. 100 fag-partikler i løbet af 50 minutter ved 37°C (se Hershey ovenfor).

i I den anden fase, den lysogene fase, integreres lambda-DNA i i værtscellegenomet og kopieres passivt sammen med værtens , kromosom-DNA af værtens kopieringsenzymer. En fag i den lyso- 10 gene fase kaldes en profag. Værten kaldes et lysogen og siges « at være immun.

j * Immunitet kan gå tabt ved forekomst af forskellige begivenhe- j der, som inducerer den lytiske fase. Produkterne af lambda- I int- og -xis-geneme katalyserer udskæring af lambda-genomet ; 15 fra E.coli-genomet til dannelse af en covalent lukket cirkel, j som er i stand til autonom kopiering. Syntesen af disse gener, " og, enten direkte eller indirekte, alle lambda-gener under- I trykkes af produktet af lambda-cl-genet. Som reaktion på visse 5 kemikalier eller DNA-skadende midler dirigerer bakterien syn- s 20 tese af produktet af det bakterielle recA-gen. recA-genproduk- m tet spalter proteolytisk det undertrykkende cl-protein og ^ muliggør ekspression af de lytiske fase-gener. Propagering af " fagen kræver så samvirken af flere lambda-regulerende elemen- _ ter, som til sidst igangsætter autonom kopiering af lambda- = 25 DNA. Produkterne af lambda-P- og -O-generne er nødvendige til DNA-kopiering. Efter DNA-kopiering skal fagen dirigere syntese - af virale strukturelle proteiner, d.v.s. hoved- og hale-prote- = iner, og deres samling til intakte tomme virioner. Indvirkning Ξ af mindst 18 gener er nødvendig for at opnå dette. Til sidst ^ 30 indhylles DNA'et i de tomme virioner til fremstilling af in- fektiøse intakte virioner, og cellen sprænges af endolysin, .= som der er kodet for med lambda-S- og -R-generne, der aktive- = res af produktet af Q-genet, således at fagerne frigøres.

Q-genet aktiveres af N-funktionen. N-genet undertrykkes af 35 cl-funktionen.

3 DK 172672 B1

De 18 gener, der kræves til capsidsamling, ligger mellem kortstillingerne ca. 3 og 36 på den højregående transskriptions-streng, idet kortstillingerne er repræsentative for procenter af det totale lambda-DNA. De første gener, fra venstre til 5 højre, er A, W og B, det sidste er J. I normale lysogener er der til højre for J-genet 8 bakterielle gener. 5 af disse, bio A, B, C, D og F, indgår i biosyntesen af biotin. Et sjette, uvrB, bibringer resistens mod ultraviolet stråling. De sidste to, chlA og E, bibringer følsomhed for chlorater [se Guest, 10 Mol.Gen.Genet. 105, 285-289 (1969) og Stevens m.fl. i "The

Bacteriophage Lambda", redigeret af Hershey m.fl., (nævnt ovenfor), side 515-534].

Et andet lambda-gen, der virker ved naturlig værtscellelyse, er kil-genet. Funktionen af kil-genet forstås ikke helt. Cel-15 ler, som udtrykker kil-genet, har en nedsat hastighed af cellevæksten efter induktion. Tab af kil-funktionen muliggør, at celler kan vokse med normale hastigheder, d.v.s. logaritmisk fasevækst, efter induktion, indtil der sker lyse. Ligesom S og R-generne reguleres kil-genet af cl-undertrykkeren indirekte 20 gennem N-genet [se Greer, Virology 66, 589-605 (1975)].

Temperaturfølsomme lysogener et blevet godt undersøgt. De er beskrevet f.eks. af Campbell, Virology 14, 22-32 (1961).

cI857-genet er en temperaturfølsom Ci-mutant. Det er funktionelt ved eller under 38°C [se Sussman m.fl., C.R.H.Acad.Sci., 25 Paris, 254, 1517-1519 (1962)]. Lignende fagsystemer vides at forekomme i andre slægter. For eksempel nævner Lomovskaya m.fl., J.Virol. 9, 258-262 (1972) temperaturfølsomme mutanter af en moderat fag, som inficerer Streptomyces. Flock, Mol.

Gen.Genet. 155, 241-247 (1977) nævner temperaturfølsomme mu-30 tanter af den moderate fag, phi-105, som inficerer Bacillus.

Botstein m.fl., Nature 251, 584-588 (1974) nævner temperaturfølsomme mutanter af den moderate fag, P22, som inficerer Salmonella. Jostrom m.fl., J.Bacteriol. 119, 19-32 (1974) og Thompson, J.Bacteriol, 129, 778-788 (1977) nævner temperatur-35 følsomme mutanter af den moderate fag, phi-11, som inficerer 4 DK 172672 B1

Staphylococcus. Millerm.fi., Virol. 59, 566-569 (1974) nævner moderate fager af Pseudomonas.

Lambda-endolysin har vist sig at lyse Salmonella-stammer, som er i stand til at absorbere fagen, således som nævnt af Bot-5 stein m.fl., Ann.Rev.Genetics 16, 61-83 (1982).

Perricaudet m.fl., FEBS Lett. 56, 7-11 (1975),beskriver ud slettelse af lambda-gener mellem kortstillingerne 58 og 71 (Δ58-71) , hvilket segment indbefatter lambda-int-, xis-, red-, gam-, cIII- og kil-generne.

10 Hersberger m.fl., GB patentansøgning nr. 2.084.584, beskriver brugen af et lysogen som en værtscelle til at stabilisere og selektere for tilstedeværelse af et plasmid. Forfatterne beskriver f.eks. omdannelse af et lysogen, som har et defekt cl-gen, med et plasmid, som bærer et funktionelt cl-gen. I en 15 beskrevet udførelsesform er det funktionelle cl-gen cI857-ge-net.

Det er kendt, at ombyttelige elementer, d.v.s. gener, der kan rekombinere uafhængigt af værtens kromosomale rekombinations-mekanismer, kan indsættes i værtsceller som markører. Ross 20 m.fl,. Cell 16, 721-731 (1979), beskriver fysiske strukturer ] af udslettelser og omvendinger, der er fremmet af det ombytte- [ lige tetracyklinresistente element, tnlO. Davis m.fl., Bacte rial Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980), beskriver brugen af ombyttelige elementer.

25 Ruvkun m.fl., Nature 289, 85-88 (1981), nævner integration af det ombyttelige kanamycinresistens- og neomycinresistensele-ment, tn5, i Rhizobium meliloti-kromosom-DNA ved konjugation af et plasmid, der bærer tn5, efterfulgt af homolog rekombination. Integration af et heterologt gen ved rekombination, 30 der skyldes tilstedeværelse af homologe flankerende sekvenser, er også beskrevet i europæisk patentansøgning 74.808.

' RgF!· * f ?f;· : -ΓΒ 5 DK 172672 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Opfindelsen angår endvidere et DNA-fragment som defineret i 5 krav 15 samt en bakteriestamme, der omfatter DNA-fragmentet.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en temperatur føl som bakteriestamme, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 26's kendetegnende del anførte.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en 10 lytisk bakteriestamme, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 32's kendetegnende del anførte.

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et produkt i en bakteriestamme, som producerer eller bringes til at producere produktet, hvilken fremgangsmåde er ejen-15 domme lig ved det i krav 34's eller krav 35's kendetegnende dele anførte.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til fremstilling af et produkt i bakterier under anvendelse af endolysin-kodende gener fra moderate fager. Fremgangsmåden 20 omfatter omdannelse af en temperaturfølsom bakteriestamme, som bærer et temperaturfølsomt fag-undertrykkende gen, og funktionelle fag-lysozymkodende gener, således at de lysozymkodende gener undertrykkes under permissive betingelser og udtrykkes under restriktive betingelser med et eller flere DNA-moleky-25 ler, som direkte eller indirekte udtrykker produktet, dyrkning af den omdannede stamme under permissive betingelser, således at produktet fremstilles, hævelse af temperaturen for at frembringe restriktive betingelser og, eventuelt, udvinding af produktet af kulturmediet eller et koncentrat heraf.

30 En anden side af opfindelsen er en fremgangsmåde til fremstilling af et produkt i en bakterie, som omfatter omdannelse af 6 DK 172672 B1 en bakterie, der producerer produktet, med en fag-DNA-sekvens, der bærer et temperaturfølsomt fag-undertrykkende gen og fag-lysozymkodende gener, således at de lysozymkodende gener undertrykkes under permissive betingelser og udtrykkes under re-5 striktive betingelser, for at gøre bakterien lytisk, dyrkning af den omdannede bakterie under permissive betingelser, således at produktet fremstilles, ændring af temperaturen for at tilvejebringe restriktive betingelser og, eventuelt, udvinding af produktet af kulturmediet eller et koncentrat deraf.

j 10 En anden side af opfindelsen er et DNA-fragment omfattende en = defekt fag-sekvens, som har et temperaturfølsomt undertrykken- 1 de gen og funktionelle lysozymkodende gener, således at de _ lysozymkodende gener undertrykkes under permissive betingelser s og udtrykkes under restriktive betingelser, en selekterbar 15 markør og, fortrinsvis, flankerende DNA-sekvenser, som er 1 homologe til en tilstødende sekvens i en værtscelles kromoso- | mer.

i Andre sider af opfindelsen er en fremgangsmåde til fremstil- j ling af en lytisk bakterie, som omfatter omdannelse af en " 20 bakterie med DNA-fragmentet ifølge opfindelsen, samt bakterier 'is I omfattende dette DNA-fragment.

s Det essentielle ved den foreliggende opfindelse er, at der “ anvises en metode til produktion af et genprodukt i en bakte- - riestamme, hvor genproduktet eksternaliseres fra en værtscel-25 le. Desuden anvises anvendelsen af et termolabilt undertrykkerprotein (f.eks. cI857) med henblik på udnyttelse af to funktioner. Den funktion er at undertrykke PL-promotoren, der kontrollerer ekspression af heterologe gener, og den anden — funktion er at undertrykke de lytiske fag-gener, som er invol- Ξ. 30 verede i celle-lysis. Således kan en værtscelle, der er trans- ^ formeret med et plasmid, der er i stand'til at udtrykke frem- ^ mede gener, induceres ved en forskydning af temperaturen til ikke blot at udtrykke heterologe proteiner men også til lysis.

7 DK 172672 B1 I modsætning hertil eksemplificeres ifølge ovennævnte GB patentansøgning nr. 2 084 584 E. coli trpE-promotoren til at udtrykke et heterologt gen. Denne promotor induceres ved tilsætning af 3-indoyleddikesyre og ikke vfed en temperaturæn-5 dring, som ved den foreliggende opfindelse. For at udtrykke et heterologt protein som anvist i GB-patentansøgningen er det således nødvendigt at inducere trpE-promotoren ved tilsætning af 3-indoyleddikesyre. Derefter, på et andet tidspunkt, induceres der cellelysis. Dette styres ved at forøge dyrkningsme-10 diets temperatur, hvorved cl-undertrykkerfunktionen går tabt.

Fag-DNA udskæres derefter fra værtscellens genom og får således lov til at replikere. Dette fag-DNA bliver derefter pakket ind i fag-partikler, hvilket til sidst resulterer i cellelysis og frigivelse af fag-partikler.

15 I modsætning hertil muliggør den foreliggende opfindelse eks-ternalisering af et ønsket produkt uden replikation af fag-DNA, uden udskæring af fag-DNA og uden produktion af fag-partikler. I modsætning til den teknik, der er kendt fra GB-pa-tentansøgningen, anvendes der ved den foreliggende opfindelse 20 et defekt lysogen. Som følge heraf er der ingen fag-partikler, som det ellers havde været nødvendigt at adskille fra det ønskede produkt.

En temperaturf ølsom bakterie er en, som bærer en profag-DNA-sekvens, indbefattende et temperaturfølsomt undertrykkende 25 gen, således, at når den dyrkes i et temperaturinterval (permissive betingelser), er undertrykkeren funktionel, men når den dyrkes i et andet temperaturinterval (restriktive betingelser) , er undertrykkeren ikke funktionel. Undertrykkeren udtrykkes ikke eller er ikke stabil. Under restriktive betin-30 gelser udtrykkes fag-generne, herunder fag-lysozymkodende gener, hvilket fører til cellelyse. Sådanne temperaturfølsomme bakterier er lytiske bakterier. Enhver’ lytisk bakterie, som defineret i den foreliggende opfindelse, kan anvendes til fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

DK 172672 B1

B

Temperaturfølsomme moderate fag-undertrykkende gener står til rådighed eller kan fremstilles ved at mutere sådanne gener på i og for sig kendte måder. Som eksempel beskriver Campbell,

Virology 14, 22-32 (1961) en fremgangsmåde til isolering af 5 temperaturfølsomme fag-mutanter. Generelt består fremgangsmåden i at mutagenisere fag-inficerede bakterier, såsom ved ultraviolet bestråling, og derefter inkubere overlevere ved høj temperatur for at bevirke induktion af eventuelle temperaturfølsomme undertrykkende mutanter. Lysatet anvendes så til 10 at inficere følsomme bakterier. De nye lysogener underkastes varmeinduktion, og fag produceret efter varmeinduktionen anvendes til at fremstille lysogener af følsomme bakterier.

Dette kredsløb (lysogen-fremstilling, induktion, genfremstilling) fører til identifikation af fag-undertrykkende mutanter.

15 Typisk er 3 - 4 sådanne kredsløb tilstrækkeligt til at give disse mutanter.

Den følgende beskrivelse angår i vidt omfang lytisk E. coli og især CI857-E. coli-lysogener. Alligevel vil fagfolk på baggrund af beskrivelsen være i stand til at udføre opfindelsen, 20 forsåvidt angår andre lytiske E. coli samt andre lytiske bakterier, under anvendelse af undertrykkende gener og endolysin-kodende gener fra lambda eller fra andre moderate fager, såsom de ovennævnte moderate fager.

cI857-lysogener, der er kendt og er almindeligt tilgængelige, 25 producerer cl-undertrykker, som er aktiv ved eller under 38°C men inaktiv over 38°C. Disse foretrækkes frem for andre temperaturfølsomme E. coli-lysogener, fordi foruden en mutation, som gør undertrykkeren inaktiv over 38°C, indeholder cI857-genet en anden mutation, som forårsager, at cl-undertrykker-30 proteinet er ufølsomt for proteolytisk spaltning med produktet af lambda-recA-genet. Når det dyrkes under permissive betingelser, er cl-undertrykker-proteinet derfor stabilt og følgelig effektivt til at vedligeholde immunitet.

E. coli-stammen UC5822 er et lysogen, som har cI857-mutatio- 9 DK 172672 B1 nen. Den har også en punktmutation i int-genet (int-6 am, en ambermutation) og i P-genet (P3 am, en amber-mutation) . (Ambermutationer signalerer afslutning af translation). UC5822 foretrækkes generelt frem for f.eks. MM294 (c1857), fordi 5 UC5822 er defekt, d.v.s. det producerer i almindelighed ikke infektiøse fag-partikler. Defekte lysogener foretrækkes, især når de anvendes til at administrere et polypeptid til et pattedyr. UC5822 producerer imidlertid lavere mængder af lysozy-met, formodentlig fordi det har et lavere kopital af S- og 10 R-generne, nemlig ét, end MM294 (cI857),nemlig 50 - 100, efter induktion. Alligevel lyser UC5822 let efter induktion.

I en udf ørelsesfortn for fremgangsmåden ifølge opfindelsen omdannes temperaturfølsomme bakterier med DNA-molekyle (r), som direkte eller indirekte koder for et ønsket produkt. Omdannel-15 sen kan udføres ved enhver teknik, som muliggør, at DNA-mole-kylet kan komme ind i værtscellen og udtrykke produktet. En sådan teknik omfatter f.eks. transformation, transduktion, konjugation og cellefusion. Mange egnede ekspressionsvektorer er velkendte og almindeligt tilgængelige, og det samme er 20 teknik til kloning af gener til produkter og omdannelse af celler med sådanne molekyler. I almindelighed vil produktet være et ikke-udskilt heterologt produkt, d.v.s. et produkt, som ikke naturligt produceres af værten, og som ikke eksterna-liseres. Produkter, som udtrykkes direkte, indbefatter poly-25 peptider. Produkter, som udtrykkes indirekte, indbefatter polypeptider, glycoproteiner, antibiotika og andre molekyler, såsom f.eks. metalioner, der kan kompleksbindes inde i en me-tallothionein-producerende bakterie.

Omdannede værts-cI857-lysogener kan opdyrkes uendeligt under 30 permissive betingelser (s38°C, i reglen 32-36°C), som er optimale for udtryk af det ønskede produkt. Når tilstrækkelig vækst er opnået, d.v.s. i reglen, når den midterste logaritmiske fasevækst er opnået (A650 - 0,5), induceres syntese af lambda-endolysin ved dyrkning af lysogenet under restriktive 35 betingelser. Dette kan opnås ved at hæve temperaturen af kul- 10 DK 172672 B1 turmediet eller et cellekoncentrat deraf til, hvis det drejer sig om cI857, mere end 38°C, fortrinsvis 42-44°C, i ca. 90 -120 minutter. Alternativt bliver temperaturen af kulturmediet eller et koncentrat deraf hævet til mere ehd 38°C, fortrinsvis 5 42-44°C, i kortere tid, d.v.s. en tid, der er tilstrækkelig til at inducere fag-DNAret, fortrinsvis mindst ca. 5 minutter, hvorefter temperaturen nedsættes til 0-38°C, fortrinsvis 2-36°C.

Opretholdelse af restriktive betingelser i 90 - 120 minutter 10 foretrækkes, fordi lyse er mere effektiv og hurtigere. Sidstnævnte fremgangsmåde foretrækkes imidlertid til visse anvendelser, f.eks. når et ønsket protein er varmelabilt, eller når prisen for at opretholde de restriktive betingelser er prohibitiv.

15 Hvis værts-cI857-lysogenet har et funktionelt lambda-cro-gen, vil cellerne fortsætte med at syntetisere lysozymet ved enhver temperatur, ved hvilken cellerne fungerer, indtil der sker lyse. Selv om lambda-endolysin er aktivt ved så lav temperatur Ί som 0°C, er den tid, der kræves til lyse, længere ved lav tem- ! 20 peratur på grund af et fald i hastighederne af proteinsyntese og katalytisk aktivitet i almindelighed.

Lige før eller efter induktion bliver cellerne fortrinsvis koncentreret, såsom ved filtrering, centrifugering eller på anden måde, og inkuberet i denne koncentrerede form indtil 25 lyse. Denne fremgangsmåde letter opsamling og rensning af det ønskede produkt. Efter induktion er bakteriecellevæggen i hovedsagen nedbrudt. Cellerne i form af protoplaster vil for-Vr. tsætte med at syntetisere det ønskede produkt, soro stort set P frigøres i mediet gennem cellemembranerne. Fuldstændig frigø- 30 relse i mediet bevirkes ved lyse. Lyse kan iagttages som en ; klaring af kulturmediet eller koncentratet og/eller en forøge lse i viskositeten af kulturmediet eller koncentratet. Lyse r— kan fremmes f.eks. ved mekanisk omrøring eller hurtig ændring af kulturbetingelseme, f.eks. ved hurtigt at ændre temperatu- 11 DK 172672 B1 ren mellem 2 og 25°C, eller ændre den osmotiske styrke af mediet eller koncentratet. Efter koncentrering af cellerne og dekantering af den overliggende væske indeholdende produkt bliver inducerede celler fortrinsvis suspenderet i en minimal 5 saltstødpude eller 0,1M tris-stødpude, 50 mM NaCl og 1 mM EDTA, og omrørt for at bevirke lyse.

Det ønskede produkt kan så udvindes af mediet eller koncentratet og renses, hvis det ønskes, på kendt måde.

I en alternativ fremgangsmåde koncentreres hele celler og ad-10 ministreres oralt til et pattedyr før induktion af den lytiske fase. Induktion vil så ske internt og resultere i frigørelse af det ønskede polypeptid. Denne metode kan være særligt nyttig til administrering af antigener til dyr i tilfælde, hvor både hele celler og det ønskede antigen foretrækkes for at 15 fremkalde den immunobeskyttende reaktion. For eksempel kan temperaturfølsomme lysogener, som bærer gener, der koder for antigener, såsom LT-B-antigenet, gives direkte til svin og/el-ler kalve. Den mængde celler, som administreres til hvert dyr, er den mængde, som indeholder en effektiv dosis. Den mængde 20 protein, som produceres af en enhedsmængde celler, kan beregnes ved kendt teknik.

En side af opfindelsen er et DNA-fragment, der kan anvendes til at konstruere en lytisk bakterie til brug i fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Et sådant DNA-fragment omfatter en defekt 25 fag-sekvens, som har et temperaturfølsomt undertrykker-gen og funktionelle lysozymkodende gener. Et sådant DNA-fragment omfattende en defekt lambda-sekvens har et temperaturfølsomt cl-gen og funktionelle lambda-endolysinkodende gener (N, Q og R), således at endolysinet udtrykkes under restriktive betin-30 gelser, en selekterbar markør og, fortrinsvis, flankerende DNA-sekvenser, som er homologe til en tilstødende DNA-sekvens i et værtscellekromosom. I en særlig udførelsesform omfatter DNA-fragmentet lambda-DNA, som er udslettet i generne, der ligger mellem kortstillingerne 58 og 71, og derfor mangler 12 DK 172672 B1 int-, xis- og kil-generne, har et temperaturfølsomt cl-gen og har mutationer i O- og P-generne, og hvori cl-genet er CI857--mutanten og producerer endolysin under restriktive betingelser. 0- og P-mutationerne kan være udsletningsmutationer eller 5 punktmutationer. Punktmutationer, såsom 029-, P3- og P80-muta-tionerne, foretrækkes, fordi de er let tilgængelige. P3-mu-tationen foretrækkes frem for P80-mutationen.

I en anden særlig udførelsesform omfatter fragmentet lambda-DNA, der i hovedsagen er udslettet mellem generne, der ligger 10 mellem kortstillingerne 3 og 71. Et sådant fragment mangler i hovedsagen alle de gener, der er væsentlige for lambda-capsid-samling, og int-, xis- og kil-generne.

En værtscelle, E. coli eller andre bakterier, som producerer et ønsket produkt, eller som forud eller bagefter bringes til 15 at producere det ønskede produkt, såsom ved gensplejsningsteknik, kan omdannes med en fag-DNA-sekvens, som bærer temperaturfølsomt fag-undertrykker-gen og fag-lysozymkodende gener på kendt måde. Disse indbefatter infektion af bakterien med en moderat fag, der har et sådant temperaturfølsomt undertryk-20 ker-gen, fortrinsvis en defekt fag. De indbefatter også omdannelse af bakterien med DNA-fragmentet ifølge opfindelsen på kendt måde, f.eks. ved transformation, transduktion, konjugation og fusion. Transformation indebærer i almindelighed inkorporering af fragmentet i en vektor, såsom en fag eller et 25 plasmid. For eksempel kan fragmentet klones i et plasmid, såsom pBR322 eller andre, og opdyrkes in vivo i en passende vært, som mangler en tilstødende sekvens homolog til sekven-| ser, som flankerer fragmentet, eller som er defekt, forsåvidt angår rekombinationsfænomener (rec~). Plasmidet kan udvides og 30 anvendes til at omdanne en passende vært til produktion af et ønsket produkt. Efter omdannelse af en sådan vært vil fragmentet, der har flankerende DNA-sekvenser homologe til en tilstødende DNA-sekvens i værtens kromosom, integrere ved spontant at rekombinere på stedet for den homologe tilstødende sekvens.

35 Alternativt kan en passende vært til produktion af et'ønsket

I

*fw I« 1 mm 13 DK 172672 B1 produkt omdannes med det isolerede DNA-fragment i lineær eller cirkulær form.

DNA-fragmentet bærer en selektionsmarkør 'for at lette selektion af transformanter. Selekterbare markører er typisk gener, 5 som koder for målelige enzymer, som gengiver en auksotrop vært prototrofi, og som bibringer modstandsevne mod dødelige eller hæmmende forbindelser, i reglen antibiotika. Fortrinsvis er selektionsmarkøren et gen, som bibringer antibiotisk resistens, da disse ikke kræver anvendelse af en auksotrop vært, 10 der måske ikke står til rådighed, eller som spontant kan omvende til prototrofi. Tetracyklinresistens foretrækkes, fordi tetracyklin er billigt, og fordi resistens mod tetracyklin ikke normalt erhverves spontant.

Tilstedeværelse af markøren i transformanterne viser, at vær-15 ten omfatter DNA-fragmentet. Hvis fragmentet integrerer, vil hele fragmentet integrere, fordi homologien mellem DNA-fragmentet og værtscelle-DNA'et kun eksisterer i områder, der flankerer lambda-DNA'et og markøren.

I fravær af en markør i DNA-fragmentet ville selektion af 20 værtsceller, der bærer lambda-DNA'et, efter transduktion eller anden omdannelse kræve superinfektion af formodede transduk-tanter med en defekt fag (ikke-integrerende) og selektering for immune bakterielle overlevere.

E. coli-stammer, der er gjort lytiske ved integration af et 25 DNA-fragment ifølge opfindelsen, indbefatter f.eks. MG-stam-mer. Disse stammer er lysogener, hvori lambda-DNA'et er udslettet i gener, der ligger mellem kortstillingeme 58 og 71, og som derfor mangler int-, xis-, red-, garn-, kil- og clll-ge-nerne, har cl857-mutationen og har mutationer i O- og P-gener-30 ne og har funktionelle N-, Q-, S- og R-gener, således at endo-lysin udtrykkes under restriktive betingelser. I en udførelsesform bliver stamme MGl [C600 (ΧΔ 58-71, cI857, P3, 029),

SuII+, galK, lacZ, thi, gal::tnl0 tetRJ, punkt(amber)mutation- 14 DK 172672 B1 en, gennemlæst, og 0- og P-generne udtrykkes på grund af værtscellens DNA-produktion af en amber-undertrykker, d.v.s. en translationsundertrykker af UAG-translationsafslutnings-koden .

5 En mere foretrukket værtscelle til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er én, som er fænotypisk 0~ og P”. En udførelsesform, stammen MG3 [N99 (ΧΔ 58-71, cIB57, P3, 029) galK, lacZ, thi, gal::tnl0 tetR], bærer samme lambda-DNA-fragment som stammen MGl. Den er imidlertid fænotypisk O" og P~ 10 ligesom tetR, Akil, Aint og Axis.

De mest foretrukne lytiske E. coli er MG4-stammer. Disse er stammer, som er udslettet i i hovedsagen alt det strukturelle lambda-protein og samlingsgenerne og det normale højre profag-bakterielle knudepunkt, d.v.s. det højre fastgørelsessted 15 (attR). Især er de lysogener, som er udslettet i i hovedsagen alle lambda-generne, der ligger mellem kortstillingerne 3 og 71, har punktmutationer i O- og P-generne, har et temperaturfølsomt cl-gen og har funktionelle N-, Q-, S- og R-gener, således at endolysin udtrykkes under restriktive betingelser, 20 og har en selekterbar markør, nemlig det omdannelige tnlO-te-tracyklinresistens-element. Sådanne defekte lysogener har 4 uafhængige blokke til viral propagering: (i) tab af O- og P- j replikat ions funkt ioner, (ii) tab af attR, som gør prof agen ude ! af stand til at blive fuldendt af int- og xis-gener ud fra en 25 superinficerende fag, (iii) manglende evne til at kode for lambda-strukturelle gener, og (iv) størrelsen af lambda-DNA'et er langt under den minimumstørrelse, som kræves til indhyl-ning. Disse kan til at begynde med fremstilles ved chlorat-belastning af cI857-, O"- og P"-lysogene stammer, såsom MG-30 stammer, til fremstilling af chloratresistente mutanter, og selektere de mutanter, der er ude af stand til komplementpro-pagering af en superinf icerende heteroimmun eller virulent lambda- eller lambdoid fag, som er defekt med hensyn til A- og B-funktioner. Et DNA-fragment omfattende markøren, lambda-35 DNA'et og flankeringssekvenser fra E. coli-kromosomet kan 15 DK 172672 B1 isoleres af MG4-stammer, såsom ved behandling med restrikti-onsendonukleaser eller Pl-transduktion.

MG4 kan afledes af MG3 ved udslettelse af alle eller de fleste af bakteriofag-generne, som koder for de virale strukturelle 5 komponenter. For at bekræfte tabet af disse gener er det tilstrækkeligt at påvise, at det virale genom i MG4 er ude af stand til at fuldstændiggøre og propagere en superinficerende fag, som selv er defekt med hensyn til disse gener. Xcharon 3A (XA", B" imm80) er et eksempel på en fag, der kan anvendes til 10 denne superinfektion. Alternativt kan enhver fag, der bærer ambermutationer i A, B eller en anden viral strukturel cistron udstryges på følsom E. coli i nærværelse af en heteroimmun eller virulent fag (Xvir) . Rekombination vil ske mellem de to fager og føre til dannelse af en rekombinant, f.eks. virA”.

15 Hyppigheden af rekombinanter vil være mellem 1 og 50%, afhængende af forsøgsbetingelserne. Rekombinanter kan kendes på deres evne til at danne plade (plaque) på undertrykkere indeholdende lysogener [Y mel (X) ] og deres manglende evne til at producere plaque på ikke-undertrykkende λ-følsomme stammer, 20 såsom N99. Plaquer fremkommet af ovennævnte krydsning udstryges på Petri-skåle indeholdende Y mel (X) eller N99, og rekombinanter renses. Lambda-fager, der er defekte i A- og/eller B-funktion, foretrækkes, for som følge af deres stilling på lambda-genomet MG4 må kandidater, der ikke kan fuldstændiggøre 25 disse funktioner, mangle alle andre lambda-strukturelle gener.

Brugen af defekte fager og værter på denne måde omtales som "marker rescue" og praktiseres i vidt omfang (se f.eks. "The Bacteriophage Lambda", redigeret af A.D.Hershey, Cold Spring Harbor Laboratory 1971, især Stevens m.fl., side 515-533).

30 Den foreliggende opfindelse kan anvendes til at fremstille ethvert bakterieprodukt. Eksemplerne er mange og indbefatter bl.a. insulin, rabies-glycoprotein, K99- og 987P-antigener, antibiotika, væksthormoner, metallothioneiner, α-1-antitryp-sin, influenza-antigener, lymphokiner og interferon. Desuden 35 kan opfindelsen anvendes til koloni-screening, RNA-isolering 16 DK 172672 B1 og plasmidfremstilling, da opfindelsen meget forenkler og forkorter den tid, der kræves til sådanne fremgangsmåder, ved at omgå det lysetrin, der ellers er nødvendigt.

I de følgende eksempler, som illustrerer opfindelsen, men ikke 5 begrænser denne, er alle udgangsmaterialer let tilgængelige eller kan let fremstilles ved kendt teknik. Transduktioner blev udført i hovedsagen som beskrevet i "Experiments in Molecular Genetics", redigeret af J.H.Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972), side 201-205, som inkorporeres 10 heri gennem denne henvisning.

EKSEMPEL 1.

Konstruktion af MGO.

Stammen C600 (E.coli SuII+ K12 galK lacZ sull thi) blev inku-15 beret i nærværelse af XcI857 P3 029 (gave fra W.Syzbalski, University of Wisconsin). Efter vækst natten over ved 32°C blev overlevende bakterier isoleret og renset. 80% af disse bakterier viste sig at være immune over for superinfektion, at være ude af stand til at vokse ved 44°C og at producere lamb-20 da-fag (efter udsættelse for 44°C), som ikke kunne skelnes fra _j XcI857 P3 029 (bedømt ved fagens evne til at producere plaquer

1 på stamme C600, men ikke på stamme N99 (E. coli K12 galK lacZ

suO thi). En af denne klasse af overlevere blev renset og fik betegnelsen MGO [C600 (XcI857 P3 029)].

25 EKSEMPEL 2.

Konstruktion af MG0-AR6.

Stammen N5151 [E. coli K12 SA500 galK lacZ pro thr his gal8 (XcI857 Δ58-71 ΔΗ1)) blev inkuberet i nærværelse af PlcmlOO-r- 30 fag, der var blevet dyrket på stammen AR4 (E. coli K12 gal:: ~ tnlO (PlcmlOO)]. Krydsningen mellem N5151 og Plcml00, dyrket 17 DK 172672 B1 på AR4, resulterede i isolering af tetracyklinresistente, UV-følsomme, temperaturfølsomme lysogener. Et af disse isola-ter blev renset og betegnet MG0-AR6 [E.coli K12 gal8 gal::tnlO ΧΔ58-71 CI857 ΔΗ1 (bio uvrB)].

5 EKSEMPEL 3.

Konstruktion af MGl.

MG0-AR6 blev gjort til et PicmlOO-lysogen ved isolering af overlevere af AR6, som var blevet inkuberet i nærværelse af 10 PlcmlOO. PlcmlOO-lysogenet af MG0-AR6 blev betegnet MG0-AR18.

Stammen MGO blev krydset ved Pl-transduktion med PlcmlOO, som var dyrket på MG0-AR18. Efter at der var givet tid til fag-absorption, blev cellerne underkastet en UV-påvirkning på 4 J/m2 (bestråling af 254 nm lys var i en mængde af 2J/ m2/s, bestemt 15 ved et uv-dosimeter) og inkuberet i nærværelse af tetracyklin.

11% tetracyklin-resistente kolonier var resistente mod UV-lys, hvilket viser, at de ikke bærer Hl-udslettelsen, og at de derfor havde lambda-generne fra cl gennem den højre ende af fagen. Nærmere betegnet betyder dette, at disse kloner bærer 20 P3- og 029-mutationerne og intakte S- og R-gener. 1/3 af de UV-resistente tetracyklinresistente celler var ude af stand til at producere fag. Disse blev derfor bedømt at have erhvervet 58-71-udslettelsen af lambda og derfor at have tabt int-, xis- og kil-generne. Denne klasse blev renset og betegnet MGl 25 [C600 (ΧΔ5Β-71 cI857 P3 029) SuII+ galK lacZ thi gal::tnl0 tetR].

EKSEMPEL 4.

Konstruktion af MG3.

30 MGl blev inkuberet i nærværelse af PlcmlOO, og overlevere blev 18 DK 172672 B1 renset. Blandt disse overlevere blev identificeret en høj procentmængde MGl-celler, som var blevet PlcmlOO-lysogener. Et PIcmlOO-lysogen af MGl blev renset og betegnet MG2.

Stammen N99 blev krydset ved PlcmlOO-transduktion med PlcmlOO, 5 som havde vokset på MG2. Tetracyklinresistente transduktanter blev udvalgt. Alle disse viste sig at være immune over for lambda og blev derfor bedømt at være lambda-lysogener. En af disse lysogener blev renset og betegnet MG3 [N99 (X Δ58-71 cI857 P3 029)].

10 MG3 blev bestemt at lyse efter eksponering i 44°C i 90 - 120 i minutter. Ingen fag fandtes i cellekulturer, hverken før eller ! efter denne eksponering {<1/0,1 ml af en kultur med 3,3 x 108 celler pr. ml) . Tilstedeværelsen af fag blev bestemt på C600-celler. Kontrolkulturer af E. coli-stanuner, som huser ikke-de-! 15 fekte lambda-profager, indeholdt mellem 105 og 109 fager pr.

ml af en kultur med 3,3 x 10® celler pr. ml.

EKSEMPEL 5.

j Konstruktion af MG3.

20 Stammen MG3 blev konstrueret i hovedsagen som beskrevet i ovenstående eksempler med undtagelse af, at stammen N99 blev lysogeniseret direkte med XcI857 P3 029. Det fremkomne lysogen blev krydset ved Pl-transduktion med stammen MG0-AR18, og der blev udvalgt tetracyklinresistente lysogener, som lysede efter I 25 temperaturinduktion, men som ikke producerer fag.

EKSEMPEL 6.

Konstruktion af UC5822.

_ Stammen UC5822 blev konstrueret ved at inficere stammen N99 i 19 DK 172672 B1 med Xint6 red3 CI857 P80 og Xhy5 climm2l Ab2. Xhy5 climm2l Ab2 er en hybrid mellem fagX og fag 21. Formålet med Xhy5 climm 21 Δ b2 i denne konstruktion er at tilvejebringe int-funktion in trans, som kræves, for at XintG red3 cI857. P80 kan lysogenise-5 re denne stamme. Δ b2-mutationen gør Xhy5 climm2l Ab2-fagen ude af stand til at dirigere sin egen integration i denne stamme. En overlever af denne krydsning, som udviste immunitet over for superinficerende lambda,men var følsom over for fag 21, blev renset og betegnet UC5822. Denne stamme overlever 10 ikke eksponering i 44°C. Ingen fag kunne påvises i kulturer af UC5822, hverken før eller efter inkubation ved 44°C.

EKSEMPEL 7.

Konstruktion af MG4.

15 Kulturer af MG3 dyrkes i Luria-bouillon eller et andet fuldstændigt medium ved 32°C, indtil a650 = 0,5. Kulturen vil indeholde ca. 5 x 108 celler pr. ml. Kulturen udstryges så på nærings-agarplader suppleret med 0,2% glucose og 0,2% KC103.

Pladerne inkuberes under anaerobe betingelser ved 32°C, indtil 20 der dannes kolonier (3-5 dage) . Vækst på dette medium under disse betingelser selekterer for E. coli, som har mutationer i chl A-, B-, C- eller D-genet (se "Expts. in Molecular Genetics", J.Miller, side 226-227).

Mutation i chl B, C eller D vil ikke føre til isolering af 25 MG4. Blandt mutationerne, som påvirker chl A-ekspression, vil være punktmutationer i chl A og udslettelser, der strækker sig til venstre eller højre for chl A. Udslettelser, der strækker sig til venstre for chl A, kan resultere i sprængning af det tilstødende uvrB-gen og derved bibringe organismen en UV-føl-30 som fænotype. Af samme grund kan udslettelser, der strækker sig til højre fra chl D-genet, også bibringe organismen en UV-følsom fænotype. Chlorat-resistente kolonier fremkommet fra den anaerobe inkubation undersøges for at bestemme, om de nu 20 DK 172672 B1 er UV-følsomme. Dette udføres bekvemt ved at udstrege en chlo-ratresistent koloni tværs over en Petri-skål, dækkende halvdelen af skålen, og udsætte den anden halvdel for 10 J/m2 254 nm UV-lys. Denne dosis er tilstrækkelig til at dræbe UV-følsomme 5 celler, men ikke UV-resistente mutanter. De UV-følsomme mutanter (omfattende mutationer i chl A eller chl D) afprøves for tilstedeværelse af den defekte lambda-profag. Dette gøres ved krydsudstregning af cellerne gennem en udstregning af en homo-immun fag. Lambda-følsomme bakterier dræbes af fagen ved 10 krydsstregningen. Lambda-lysogener er immune over for superinfektion og dræbes ikke. Som en følge af beliggenheden af chl A- og chl D-geneme, lambda-genomet og uvrB-genet vil alle UV-følsomme chl D-mutanter være lambdafølsomme, hvorimod nogle UV-følsomme chl A-mutanter kan være lambda-lysogener. UV-føl-15 somme lambda-lysogener indeholder derfor udslettelser af chl A, som strækker sig til venstre ind i uvrB. Hvis udslettelsen strækker sig igennem uvrB, kan den strække sig ind i biotin-o-peronen og muligvis ind i de strukturelle lambda-gener. Udslettelser af strukturelle lambda-gener er opnået på denne 20 måde (Grier, Virology 66, 589-604, 1975) . Alle UV-følsomme chl " A"-lambda-lysogener inficeres med XvirA-. Efter 2 1/2 time udstryges lysateme for XvirA"-fag og for XvirA+-rekombinan-ter. MG4-kandidater, som propagerer XvirA” og/eller producerer 7 XvirA+-fager, kasseres. Kandidater, som ikke kan fuldstændig- 25 gøre XvirA" eller producere virA+, bærer en udslettelse, der strækker sig fra chl A gennem A-genet i lambda. De MG4-kandidater, der har udslettelser fra chl A gennem A-genet i lambda, afprøves for den lytiske bakterieegenskab (lyse efter vækst ved mere end 38°C). Kandidater indeholdende udslettelsen, som 30 har bevaret den lytiske bakterieegenskab, renses som MG4.

EKSEMPEL 8.

Kloning i MM294(cI857) og UC5822.

= E. coli-stammen MM294 blev inkuberet i nærværelse af XcI857.

21 DK 172672 B1

Efter vækst natten over ved 32°C blev overlevende bakterier isoleret og renset. Kloner, som var immune over for superinfektion, og som var ude af stand til at vokse og producerede fag ved 44°C, blev isoleret. Denne fremkomne CI857-lysogene 5 stamme, MM294 (XcI857), og E. coli-stammen UC5822 blev gjort kompetente ved CaCl2-behandling og omdannet med pDN5, et plasmid, som bærer gener for E. coli LT-B-antigenet og for ampi-cillin- og tetracyklin-resistens.

Ampicillin- og tetracyklin-resistente transformanter af begge 10 lytiske bakteriestammer voksede godt i en standard-næringsbouillon ved 30 - 32°C og udtrykte LT-B-antigen. Bakterierne blev pelleteret ved centrifugering og overført til en standardnæringsbouillon ved 42°C. I løbet af ca. 90 - 120 minutter var cellelyse tydelig og i hovedsagen fuldstændig. LT-B-anti-15 gen blev frigjort i bouillonen. I en prøve af MM294 (cI857)-transformant omfattende 4 x 107 celler/ml blev der opsamlet ca. 2 x 108 lambda-fag pr. ml. I en lignende prøve af UC5822-transformanter blev der ikke opsamlet nogen fag (<20/ml).

EKSEMPEL 9.

20 -..........

Kloning i UC5822.

En podekultur af E. coli UC5822 indeholdende plasmidet pESS2, som bærer generne for E. coli LT-B-antigen, blev podet i et 5 ml glas af L-bouillon indeholdende ampicillin. Efter 6 timer 25 blev glassets indhold overført til 500 ml kulturmedium indeholdende ampicillin og inkuberet natten over under rystning ved 32°C. Til at pode 10 liter blev 400 ml af nattens kultur overført til 10 liter medium indeholdende ampicillin i en Virtis forgæringsbeholder. Kulturen blev holdt på 32°C, og 30 hver time blev en 100 ml prøve undersøgt for vækst ved A42o·

Efter 4 timer fik kulturen tilført 200 ml 50% dekstrose og 0,1 ml af et antiskummemiddel. Efter 8 timer var kulturen ved 4,8 A42o"en^e<3er blev flyttet til 43°C. Kulturen fik efter 10 22 DK 172672 B1 timer igen tilført 200 ml 50% dekstrose, og efter 14 timer blev kulturen standset. En prøve af et cellekoncentrat (pille) og af den overliggende cellevæske efter 4, 6, 8, 10, 10,6 og 14 timer blev undersøgt for LTfi ved anvendelse af en ELISA-5 prøve med kendte koncentrationer af LTB som standard.

Resultaterne er vist i tabel I. I de første 4-8 timer befandt mere end 90% af LT-B sig i cellen, men i løbet af 2 timer efter temperaturskiftet (10 timer efter podning) var 90% af LT-B i den overliggende væske. 6 timer efter temperatur-10 skiftet var 95% af LT-B i den overliggende væske. LT-B repræsenterede 8,5% af den samlede mængde protein. Udbyttet af LT-B var langt større end udbyttet fra E. coli MM294 omdannet med pESS2.

Inden for 2-4 timer efter temperaturskiftet kunne lyse tyde-15 ligt ses af den forøgede viskositet af kulturmediet og synligt celleaffald. 4-6 timer efter temperaturskiftet var viskositeten meget reduceret, og kulturen kunne let pumpes gennem et ultrafiltreringsapparat for at fjerne alt affald og eventuelle tilbageværende ikke-lysede celler. Den forøgede viskositet 20 afspejler frigørelse af højmolekylær DNA og RNA i mediet. Indvirkning af endogene nukleaser resulterer til slut i et iagttageligt fald i viskositet.

'F9 : .33 s ! 23 DK 172672 B1 TABEL I.

Total LTg . , sen % af _ mg/Snl samlet n*mgde

Tid efter podning A420 celleprotein “B celleprotein 4 timer pille 0,58 0,734 0,41 4 timer væske 0,06 0,07% 6 timer pille 1,1 6 timer væske 1,8 1,19 0,11 0,1% (Skift) 8 timer pille 4,8 1,24 3,9 (43°) 8 timer væske 0,29 0,3% 10 timer pille 6,2 0,646 1,2 10 timer væske 14,8 2,5% 10.6 time pille 5,0 0,652 1,8 10.6 time væske 39,38 6,3% 14 timer pille 1,8 14 timer raske 4,2 0,652 53,83 8,5% EKSEMPEL 10.

5 Konstruktion af lytisk Salmonella.

Der foretages en interspecies-krydsning mellem Salmonella og MG3, enten ved konjugation eller DNA-transformation. Salmonella-stammer er normalt tetracyklinfølsomme. MG3 er tetra-cyklinresistent. Salmonella-rekombinanter, der har opnået 10 resistens mod tetracyklin, undersøges for deres evne til at vokse ved 42°C. De Salmonella, som lyser ved denne temperatur, har gennem rekombination erhvervet den lytiske bakteriefunktion af MG3. Dette forsøg er muligt, fordi (1) de lambdaly-tiske funktioner udtrykkes i Salmonella, og (2) der eksisterer 15 tilstrækkelig homologi mellem Salmonella og E. coli (MG3) til at muliggøre rekombination af E. coli-sekvenserne, som flankerer generne i Salmonella.

24 DK 172672 B1 EKSEMPEL 11.

Konstruktion af lytisk Bacillus.

Metode 1: De genetiske elementer, der er tilstrækkelige til 5 direkte lyse af en vært, indbefatter Xcl857, N-, Q-, S- og ligenerne og PL-promotoren. Restriktionskortene af disse gener er kendt (Molecular Cloning, Maniatis m.fl., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.). Generne er subklonet fra lambda på et plasmid (f.eks. pBR322). Et fragment af DNA fra Bacillus ind-10 sættes i plasmidet på et sted i et ikke-væsentligt område. Det er ikke nødvendigt at karakterisere naturen eller funktionen af værtsstammens DNA eller dets orientering i plasmidet. Ba-;j cillus inkuberes så med det rensede plasmid DNA, og der udvæl- j ges antibiotika-resistente transformanter. Disse transfor- 15 manter undersøges for at bestemme, om de lyser efter udsættelse for høj temperatur. I disse transformanter er plasmidet indeholdende lambda-generne til stede som en autonomt formerende enhed eller er integreret i værtskromosomet gennem en rekombinationsbegivenhed mellem homolog Bacillus-DNA på plas-20 midet og på kromosomet. Integrationen af DNA båret af plas-i: mider, som ikke kan formere sig i Bacillus-kromosomet, er blevet beskrevet (Haldenway m.fl., J.Bact.142, 90-98, 1980).

Denne metode kræver ekspression af de lambda-lytiske gener i 7] den modtagende vært, men kræver ikke-homologi mellem E. coli- 25 sekvenserne i MG3 og den modtagende bakterie.

Metode 2: Fagen phi-105 inficerer Bacillus, er moderat og har en muterbar cl-lignende undertrykker. Der kan fremstilles derivater af phi-105, som har temperaturfølsomme mutationer, , der påvirker denne undertrykkelse. Fag-derivater, som mangler -r- 30 udskærings- eller replikationsfunktioner, kan isoleres ved mutagenese eller ved isolering af udslettelsesstammer (Flock,

Mol.Gen.Genet. 155, 241-247, 1977). Der fås et fagderivat, som har en termolabil undertrykker. Et lysogen af denne mutant fremstilles ved at inficere følsomme celler med fagen ved 25 DK 172672 B1 30°C, isolere overlevende celler og afprøve disse celler for immunitet over for superinficerende fag og for manglende evne til at vokse ved 40°C. En sådan organisme er en fag-producerende lytisk bakterie. For at isolere en defekt lytisk bakte-5 rie, mutageniseres bakterien, og overlevende kolonier kopiud-stryges på et uudviklet tæppe af phi-105-følsom Bacillus. Temperaturfølsomme kolonier, som efter udsættelse for høj temperatur, producerer få eller ingen fager på disse tæpper, indeholder mutationer, der påvirker fag-propagering. Strengere 10 mutanter kan fås ved at gentage mutagenesen. For at mobilisere denne konstruktion og let selektere for overføring af denne konstruktion foretrækkes det at isolere et derivat, som huser en antibiotikaresistens-markør bundet til phi-105-genomet.

Dette kan opnås ved at klone tilfældige fragmenter af Bacil-15 lus-kromosomet i et plasmid (som er ude af stand til replika-tion i Bacillus), der bærer en antibiotikaresistens-determi-nant (såsom pBF322). Omdannede lægemiddelresistente celler isoleres, som indeholder det integrerede plasmid. I nogle af disse celler vil plasmidet være integreret nær ved stedet for 20 phi-105. Den ufraktionerede samling af lægemiddelresistente kolonier inficeres med den generaliserede Bacillus-transducerende fag, pBSl. Grundstammer af pBSl, der fungerer i Bacillus på nøjagtig samme måde, som PlcmlOO fungerer i E. coli, anvendes til at transducere Bacillus-celler til lægemiddelresi-25 stens. Disse lægemiddelresistente transduktanter afprøves for at bestemme, om de er termofølsomme, lytiske bakterier. Ca. 1% af transduktanterne vil have erhvervet de lytiske bakterie-egenskaber.

Den foregående beskrivelse og eksemplerne viser, at fremgangs-30 måderne og midlerne ifølge opfindelsen er nyttige til at fremstille og eksternalisere produkter i bakterier. Foretrukne udførelsesformer ifølge opfindelsen er illustreret i det foregående, idet opfindelsen er ikke begrænset til de nøjagtigt beskrevne konstruktioner, men indbefatter alle udførelsesfor-35 mer og modifikationer, der ligger inden for rammerne af de følgende krav.

Claims (35)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et genprodukt, k e n - i detegnet ved 5 (I) dyrkning af en temperaturfølsom bakteriestamme, hvilken bakteriestamme: a) udtrykker genproduktet intracellulært, b) er et lysogen med defekt excisions- og replikations-funktion, og - 10 c) inden for profag-DNA-sekvensen indeholder et tempertur- , følsomt fag-undertrykker-gen og funktionelle fag-lysozymkoden- de gener, under permissive betingelser, således at genproduktet udtrykkes intracellulært og de lysozymkodende gener undertrykkes, og 15 derpå r (II) forhøjelse af temperaturen til frembringelse af restrik tive betingelser således, at de lysozymkodende gener udtrykkes .

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at det temperaturfølsomme fag-undertrykker-gen er et temperaturfølsomt lambda-cl-gen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at cl-genet er cI857-mutanten.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, 25 at bakteriestammen er et E. coli lambda lysogen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at bakteriestammen er E. coli-stamraen UC5822 fremstillet som beskrevet i eksempel 6. DK 172672 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at lambda-profag-DNA-sekvensen er udslettet i generne, der ligger mellem kortstillingerne 58 og 71 og er muteret i O- og P-geneme, hvilket giver tab af 0- og P-genfunktioner.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at lambda-profag-DNA-sekvensen er flankeret af en selekterbar markør, der er et gen, der koder for et selekterbart træk, hvorhos O- og P-mutationerne er punktmutationer.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, 10 at lambda-profag-DNA-sekvensen er flankeret på den opadgående ende med det tnlO-omdannelige tetracyklinresistens-element og at O- og P-generne er generne 029 og P3.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at bakteriestammen er afledt af E. coli-stamme MGO, der er 15 fremstillet som beskrevet i eksempel l.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at bakteriestammen er stammen MG3 fremstillet som beskrevet i eksempel 5.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 20 at lambda-profag-DNA-sekvensen er udslettet i generne, der ligger mellem kortstillingerne 3 og 71.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at lambda-profag-DNA-sekvensen er flankeret med en selekterbar markør, som er et gen, der koder for et selekterbart træk, og 25 at O- og P-mutationerne er punktmutationer.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at lambda-profag-DNA-sekvensen er flankeret på den opadgående ende med det tnlO-omdannelige tetracyklinresistens-element og at O- og P-geneme er generne 029 og P3. DK 172672 B1

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at bakteriestammen er en E. coli MG4-stamme fremstillet som beskrevet i eksempel 7.

15. DNA-fragment omfattende 5 (I) en selekterbar marker, som er et gen, der koder for et selekterbart træk; (II) en lambda-profag-DNA-sekvens med et temperaturfølsomt cl-undertrykker-gen og funktionelle lysozymkodende gener, således at de lysozymkodende gener er undertrykt under permissive 10 betingelser og udtrykkes under restriktive betingelser, hvor profag-DNA-sekvensen indbefatter funktionelle N-, Q-, S- og ligener, er i hovedsagen udslettet i generne, der ligger mellem kort s til lingerne 58 og 71 og har mutationer i O- og P-geneme, hvilket giver tab af 0- og P-genfunktionerne; og " 15 (III) flankerende DNA-sekvenser, der er homologe med en tilstødende sekvens i en værtsbakteriecelles kromosom for at tillade, at der sker rekombination mellem fragmentet og værtscellens kromosom.

16. DNA-fragment ifølge krav 15, kendetegnet ved, - 20 at cl-genet er genet cI857, at O- og P-mutanteme er mutanter ne 029 og P3, og at den selekterbare markør er det tnlO-omdannelige tetracyklinresistens-element.

17. DNA-fragment ifølge krav 15, kendetegnet ved, at profag-DNA-sekvensen er i hovedsagen udslettet i generne, 25 der ligger mellem kortstillingerne 3 og 21.

18. DNA-fragment ifølge krav 17, kendetegnet ved, at cl-genet er genet CI857, at O- og P-mutanterne er mutanter- = ne 029 og P3, og at den selekterbare markør er det tnlO-omdan nelige tetracyklinresistens-element. DK 172672 B1

19. Bakteriestamme omfattende DNA-fragmentet ifølge krav 15.

20. Bakteriestamme omfattende DNA-fragmentet ifølge krav 17.

21. Bakteriestamme ifølge krav 19, kendetegnet ved, at det er en E. coli. 5

22, Bakteriestamme ifølge krav 20, kendetegnet ved, at det er en E. coli.

23. Bakteriestamme ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den er afledt af stammen MGO fremstillet som beskrevet i eksempel l.

24. Bakteriestamme ifølge krav 21, kendetegnet ved, at det er stammen MG3 fremstillet som beskrevet i eksempel 4 eller 5.

25. Bakteriestamme ifølge krav 22, kendetegnet ved, at det er stammen MG4 fremstillet som beskrevet i eksem- 15 pel 7.

26. Fremgangsmåde til fremstilling af en temperaturfølsom bakteriestamme, kendetegnet ved, at man transformerer en bakteriestamme med et DNA-fragment, der omfatter (I) en selekterbar markør, som er et gen, der koder for et 20 selekterbart træk; (II) en lambda-profag-DNA-sekvens, der har et temperaturfølsomt cl-undertrykker-gen og funktionelle lysozymkodende gener, således at de lysozymkodende gener er undertrykket under permissive betingelser og udtrykkes under restriktive betingel- 25 ser, hvor profag-DNA-sekvensen indbefatter funktionelle N-, Q-, S- og R-gener, er væsentligt udslettet i generne der ligger mellem kortpositionerne 58 og 71 og har mutationer i O- og P-generne, hvilket giver tab af O- og P-genfunktioner; og DK 172672 B1 (III) flankerende DNA-sekvenser, der er homologe til en tilstødende sekvens i en værtsbakteriecelles kromosom for at tillade, at der sker rekombination mellem fragmentet og værtscellens kromosom.

27. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at cl-genet er genet cI857, at O- og P-mutanteme er mutanterne 029 og P3, og at den selekterbare markør er det tnlO-omdannelige tetracyklinresistens-element.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, 10 at profag-DNA-sekvensen er i hovedsagen udslettet i generne, Ϊ der ligger mellem kortstillingerne 3 og 71. i

29. Fremgangsmåde ifølge krav 28. kendetegnet ved, i at cl-genet er genet cIB57, at O- og P-mutanteme er mutanter- 3 ne 029 og P3, og at den selekterbare markør er det tnlO-omdan- T 15 nelige tetracyklinresistens-element, i

30. Fremgangsmåde ifølge krav 26, kendetegnet ved, at bakterien er en E. coli.

31. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at bakterien er en E. coli. ~ 20

32, Fremgangsmåde til fremstilling af en lytisk bakteriestam- Ξ me, kendetegnet ved, at man transformerer en bakte- m rie med et DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 15 til 18.

33. Fremgangsmåde ifølge krav 32, kendetegnet ved, 25 at bakterien er en E. coli.

34. Fremgangsmåde til fremstilling af et produkt i en bakte- “ riestamme, som producerer eller bringes til at producere pro duktet, kendetegnet ved, at man transformerer bakterien med DNA-fragmentet ifølge et hvilket som helst af kra- DK 172672 B1 vene 15 til 18; dyrker den transformerede bakterie under permissive betingelser således at produktet dannes; ændrer temperaturen for at tilvejebringe restriktive betingelser; og om ønsket udvinder produkter fra dyrkningsmediet eller et koncen-5 trat deraf.

35. Fremgangsmåde til fremstilling af et produkt i en bakteriestamme, der producerer eller bringes til at producere produktet, kendetegnet ved, at man integrerer DNA-fragmentet ifølge et hvilket som helst af kravene 15 til 18 i 10 kromosomet hos en bakteriestamme, dyrker den transformerede bakteriestamme under permissive betingelser, således at poly-peptidet udtrykkes; ændrer temperaturen for at tilvejebringe restriktive betingelser; og om ønsket udvinder polypeptidet fra dyrkningsmediet eller et koncentrat deraf. 15