FI89507C - Foerfarande foer framstaellning av genprodukter - Google Patents

Description

1 39507

Menetelmä geenituotteiden valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee geenitekniikkaa ja tarkemmin sanottuna geenitekniikalla aikaansaatujen mikro-organismien tuotteiden siirtämistä ympäröivään väliaineeseen.

Kun E. colia ja muita prokaryoottisia mikro-organismeja on käytetty isäntinä haluttujen proteiinien ilmentämisessä, on ongelmana usein ollut proteiinien saaminen isäntäsoluista ulos ympäröivään väliaineeseen puhdistusta varten. Tätä ongelmaa on yritetty ratkaista rikkomalla solut fysikaalisesti esim. homogenoinnilla tai sonikaatiolla tai rikkomalla solut kemiallisesti esim. käsittelemällä pinta-aktiivisella aineella tai lysotsyymillä tai liittämällä haluttua tuotetta koodattavaan rakennegeeniin sellainen DNA-sekvenssi, joka koo-dittaa erittymisen signaalipeptidiä. Esimerkiksi eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 61 250 selostetaan isäntäsolu-jen käsittelyä lysoivalla tai läpäiseväksi tekevällä aineella: US-patenttijulkaisussa 4 336 336 selostetaan menetelmää, jossa liitetään sytoplasman proteiinin geeni sytoplasmaan kuulumattoman proteiinin geeniin niin, että saatu yhdistelmä-proteiini kulkeutuu lähelle isäntäsolun pintaa tai sen ulkopuolelle; US-patenttijulkaisussa 4 338 397 selostetaan menetelmää kypsien, erittyneiden proteiinien tuottamiseksi siten, että ilmentämisvektoriin sijoitetaan preproteiinin rakenne-geeni.

E. coli voidaan tartuttaa välttämättömällä loisella, lambda-faagilla, joka on kaksisäikeinen DNA-virus. Lambdan genetiikkaa samoin kuin E. colin genetiikkaa on tutkittu paljon.

Ks. esim. "The Bacteriophage Lambda", ed. A.D. Hershey,

Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1971.

Lambda, joka on "kesy" eli temperate faagi, monistuu E. colis-sa jommassa kummassa kahdesta vaiheesta. Toisessa eli lyyt-tisessä vaiheessa faagin DNA replikoituu autonomiseksi ja ohjaa kapsidiproteiinien muodostumista, pakkautumista ja 2 89507 isäntäsolun lyysiä. Lambda-DNA:n ilmentyminen on lyyttisessä vaiheessa erittäin tehokasta. Transkriptio tapahtuu molemmissa DNA-saikeissä, toisessa oikealle päin toisessa vasemmalle päin. Induktio voi johtaa noin sadan faagipartikkelin vapautumiseen 50 minuutin kuluessa 37°C:ssa. Ks. Hershey, edellä.

Toisessa eli lysogeenisessä vaiheessa lambda-DNA integroituu isäntäsolun perimään ja replikoituu passiivisesti isännän kromosomaal.isen DNA:n kanssa isännän replikaatioentsyymien vaikutuksesta. Lysogeenisessä vaiheessa oleva faagi tunnetaan profaagina ja isäntä tunnetaan lysogeenina ja sen sanotaan olevan immuuni.

Immuunisuus voidaan menettää erilaisten sellaisten tapahtumien ilmetessä, jotka indusoivat lyyttisen vaiheen. Lambdan int- ja xis-geenien tuotteet katalysoivat lambdan genomin irtoamista E. colin genomista niin, että muodostuu kovalentti-sesti sulkeutunut rengas, joka kykenee replikoitumaan autonomisesti. Lambda-cl-geenin tuote tukahduttaa näiden geenien aikaansaaman synteesin ja joko suorasti tai epäsuorasti kaikki muut lambda-geenit. Eräiden kemikaalien tai DNA:ta vahingoittavien aineiden vaikutuksen tuloksena bakteeri ohjaa bakteerin recA-geenin tuotteen synteesiä. RecA-geenin tuote pilkkoo proteolyyttisesti cl-repressoriproteiiniin sallien lyyttisen faasin geenien ilmentymisen. Näin ollen faagin lisääntyminen vaatii useiden lambdaa säätelevien vaikutusten yhteistoimintaa niin, että lopulta lambda-DNA:n autonominen replikoituminen käynnistyy. Lambda-DNA:n replikoitumiseen tarvitaan lambdan P- ja O-geenien tuotteita. DNA:n replikoitu-misen jälkeen pitää faagin ohjata viruksen rakenneproteii-nien eli pää- ja häntäproteiinien syntyä ja niiden järjestymistä ehyiksi, tyhjiksi virioneiksi. Tämän saavuttamiseen tarvitaan vähintään 18 geenin yhteisvaikutus. Lopuksi DNA pakataan tyhjiin virioneihin niin, että syntyy tartuttavia, ehjiä viruksia ja solu rikkoutuu endolysiinin vaikutuksesta, jota lambdan S- ja R-geenit koodittavat, jotka puolestaan aktivoituvat Q-geenin tuotteen vaikutuksesta, ja näin faagit vapautuvat. N-funktio aktivoi Q-geenin. cl-funktio tukahduttaa N-geenin.

3 89507

Kapsidin kokoamiseen vaadittavat 18 geeniä sijaitsevat kartan kohdissa, jotka ovat välillä noin 3-36 säikeessä, jonka transkriptio tapahtuu oikealle, ja kartan kohdat edustavat prosentteja lambdan kokonais-DNA:sta. Ensimmäiset geenit vasemmalta oikealle lukien ovat A, W ja B; ja viimeinen on J. Normaaleissa lysogeeneissä on J-geenin oikealla puolella kahdeksan bakteerigeeniä. Näistä viisi, bio A, B, C, D ja F osallistuvat biotiinin synteesiin. Kuudes eli uvrB antaa vastustuskyvyn ultraviolettisäteilylle. Viimeiset kaksi eli chl A ja E antavat herkkyyden kloraateille. Ks. Guest, Mol. Gen. Genet. 105: 285-289 (1969) ja Stevens et ai., teoksessa "The Bacteriophage Lambda", ed. Hershey et ai., ss. 515-534, joka teos on mainittu edellä.

Vielä eräs lambda-geeni, joka toimii luontaisten isäntäsolu-jen hajottamisessa, on kil-geeni. Kil-geenin toimintaa ei ymmärretä täysin. Kil-geeniä ilmentävien solujen kasvunopeus laskee induktion jälkeen. Kun kil-funktio menetetään, kykenevät solut kasvamaan normaalilla nopeudella eli induktiota seuraa log-vaihe, kunnes tapahtuu lyysi. cl-repressori säätelee epäsuorasti N-geenin kautta kil-geeniä samoin kuin S- ja R-geenejä. Ks. Geer, Virology 6£; 589-604 (1975).

Lämpötilalle herkkiä lysogeenejä on tutkittu paljon. Niitä on selostettu esim. julkaisussa Campbell, Virology 1_4; 22-32 (1961). CI857 on lämpötilalle herkkä cl-mutantti. Se toimii 38°C:ssa tai sen alapuolella. Ks. Sussman et ai., C.R.H.

Acad. Sei. Paris 2 54 : 1517-1519 (1962) . Samanlaisia faagi-systeemejä tunnetaan myös muista suvuista. Esimerkiksi Lomovskaya et ai., J. Virol. _9: 258-262 (1972) mainitsevat temperate faagien-lämpötilalle herkistä mutanteista, jotka tartuttavat Streptomyces-suvun; Flock, Mol. Gen. Genet. 155: 241-247 (1977) mainitsee temperate faagin phi-105 lämpötilalle herkistä mutanteista, jotka tartuttavat Bacillus-suvun; Botstein et ai., Nature 251: 584-588 (1974) mainitsevat temperate faagin P22 lämpötilalle herkistä mutanteista, jotka tartuttavat Salmonella-suvun: Jostrom et ai., J. Bacteriol.

199: 19-32 mainitsevat temperate faagin phi-11 lämpötilalle 4 89507 herkistä mutanteista, jotka tartuttavat Staphylococcus-suvun; ja Miller et ai., Virol. 5j): 566-569 (1974) selostavat Pseudomonas-suvun temperate faageja.

Lambda-endolysiinin on havaittu hajottavan lyysin tuloksena Salmonella-kantoja, jotka kykenevät absorboimaan faagin, kuten Botstein et ai. ovat todenneet julkaisussa Ann. Rev. Genetics 61-83 (1982).

Perricaudet et ai. kuvaavat julkaisussa FEBS Lett. 5^6: 7-11 (1975) lambda-geenien leikkaamista irti kartan asemien 58 ja 71 väliltä (Δ 58-71), joka palanen sisältää lambda-geenit int, xis, red, gam, cIII ja kil.

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 2 084 584 kuvataan lysogeenin käyttöä isäntäsoluna stabilointitarkoituksessa ja läsnä olevan plasmidin valinnassa. Siinä kuvataan esim. vajavaista cl-geeniä kantavan lysogeenin transformointia plas-midilla, joka kantaa toimivaa cl-geeniä. Yhdessä selostetuista toteutustavoista on funktionaalisena geeninä cl857-geeni.

Tiedetään ennestään, että siirrettävissä olevat rakenneosat eli geenit, jotka muodostavat yhdistelmiä riippumatta isännän kromosomaalisista yhdistelymekanismeista, voidaan sijoittaa isäntäsoluihin merkeiksi. Ross. et ai., Cell 16: 721-731 (1979) selostavat sellaisten irtileikattujen palasten ja inversioiden fysikaalisia rakenteita, joissa on käytetty apuna siirrettävää, tetrasykliinille vastustuskyvyn antavaa rakenneosaa, tnlO. Davis et. ai., "Bacterial Genetics" , Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980), kuvaavat siirrettävien rakenneosien käyttöä.

Ruvkun et ai., Nature 289: 85-88 (1981) kuvaavat siirrettävän, kanamysiinille ja neomysiinille vastustuskyvyn antavan rakenneosan tn5 sisällyttämistä Rhizobium melilotin kromoso-maaliseen DNA:han konjugoimalla tn5:ttä kantava plasmidi ja suorittamalla sen jälkeen homologinen rekombinaatio. Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 74 808 selostetaan myös hete- i 5 89507 rogeenisen geenin liittämistä suorittamalla yhdistäminen homogeenisten oheissekvenssien läsnäollessa.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää tuotteen tuottamiseksi bakteerissa käyttämällä temperate faagien eli "kesyjen" faagien endolysiiniä koodittavia geenejä. Menetelmässä transformoidaan lämpötilalle herkkä bakteerikanta, joka sisältää repressorina toimivan, lämpötilalle herkän faagigeenin ja toimivia, lysotsyymiä koodittavia faagigeenejä siten, että lysotsyymiä koodittavat geenit tukahtuvat sallivissa olosuhteissa ja ilmentyvät rajoittavissa olosuhteissa, DNA-molekyy-lillä tai DNA-molekyyleiliä, jotka ilmentävät tuotetta suorasti tai epäsuorasti: viljellään transformoitunutta kantaa sallivissa olosuhteissa niin, että tuotetta valmistuu; kohotetaan lämpötila niin, että saadaan aikaan rajoittavat olosuhteet; ja haluttaessa otetaan tuote talteen kasvualustasta tai sen konsentraatista.

Edelleen keksintö tarjoaa menetelmän tuotteen tuottamiseksi bakteerissa siten, että transformoidaan tuotetta tuottava bakteeri faagin DNA-sekvenssillä, jossa on lämpötilalle herkkä faagin repressorigeeni ja lysotsyymiä koodittavia faagigeenejä niin, että lysotsyymiä koodittavat geenit tukahtuvat sallivissa olosuhteissa ja ilmentyvät rajoittavissa olosuhteissa tehden bakteereista lyyttisen; viljellään transfor-• moitunutta bakteeria sallivissa olosuhteissa niin, että tuo- tetta valmistuu: muutetaan lämpötilaa niin, että saadaan ra-joittavat olosuhteet; ja haluttaessa otetaan tuote talteen kasvualustasta tai sen konsentraatista.

: Edelleen keksintö koskee DNA-jaksoa, joka sisältää puutteel- . lisen faagisekvenssin, jossa on lämpötilalle herkkä repres sorigeeni ja lysotsyymiä koodittavia funktionaalisia geenejä niin, että lysotsyymiä koodittavat geenit tukahtuvat sallivissa olosuhteissa ja ilmentyvät rajoittavissa olosuhteissa, valintamerkin ja mielellään oheis-DNA-sekvenssejä, jotka ovat homologisia isäntäsolun kromosomin naapurisekvenssin kanssa.

6 39507

Edelleen keksintö koskee menetelmää lyyttisten bakteerien valmistamiseksi siten, että transformoidaan bakteeri keksinnön mukaisella DNA-jaksolla, sekä bakteereita, jotka sisältävät kyseisen DNA-jakson.

Edelleen keksintö koskee menetelmää tuotteen antamiseksi nisäkkäälle niin, että annetaan nisäkkäälle lämpötilalle herkkää bakteeria määrä, joka sisältää tehokkaan annokset tuotetta, jolloin bakteeri hajoaa lyysin tuloksena nisäkkäässä ja tuote vapautuu.

Lämpötilalle herkkä bakteeri on sellainen, joka kantaa profaagin DNA-sekvenssiä, jossa on lämpötilalle herkkä rep-ressorigeeni, niin että viljeltäessä yhdellä lämpötila-alueella (sallivat olosuhteet) repressori on toiminnassa, mutta viljeltäessä toisella lämpötila-alueella (rajoittavat olosuhteet repressori ei ole toiminnassa eli repressori ei ilmenny tai se ei ole stabiili. Rajoittavissa olosuhteissa faagigee-nit, faagin lysotsyymigeenit mukaanluettuina, ilmentyvät johtaen solujen lyysiin. Tällaiset lämpötilalle herkät bakteerit ovat lyyttisiä bakteereja. Mitä tahansa tässä määriteltyä lyyttistä bakteeria voidaan käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä .

Lämpötilalle herkkiä temperate faagirepressoreja on saatavissa tai niitä voidaan tehdä mutatoimalla tällaisia geenejä alalla tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi Campbell selostaa julkaisussa Virology 1_4: 22-32 (1961) menetelmää, jolla voidaan eristää lämpötilalle herkkiä faagimutantteja. Yleisesti ottaen menetelmässä käsitellään faagilla infektoituneita bakteereja mutageenisesti esim. ultraviolettisäteilytyksellä ja sen jälkeen inkuboidaan elossa säilyneitä korkeassa lämpötilassa, jotta mahdolliset lämpötilalle herkät repressori-mutantit indusoituvat. Sitten lysaattia käytetään herkkien bakteerien infektointiin. Uusiin lysogeeneihin kohdistetaan lämpöinduktio ja lämpöinduktion seurauksena saatua faagia käytetään lysogeenien tuottamiseen herkistä bakteereista.

Tämä kierto (lysogeenin valmistus, induktio, uudelleenval- mistus) johtaa faagin repressorirautanttien tunnistamiseen.

Tällaisten mutanttien saamiseen riittää tavallisesti 3-4 tällaista sykliä.

7 39507

Seuraava selostus liittyy suurelta osin lyyttiseen E. coliin ja erityisesti cl857 E. coli-lysogeeneihin. Kuitenkin mainitun selostuksen perusteella alan ammatti-ihmiset kykenevät soveltamaan tätä keksintöä myös muihin Ivyttisiin E. coleihin sekä muihin lyyttisiin bakteereihin käyttämällä repressori-geenejä ja endolysiiniä koodittavia geenejä, jotka on saatu lambdasta ja muista temperate faageista, kuten edellä mainituista temperate faageista.

CI857 -lysogeenit, jotka ovat ennestään tunnettuja ja yleisesti saatavissa, tuottavat cl-repressoria, joka on aktiivinen alle 38°C:ssa, mutta inaktiivinen yli 38°C:ssa. Nämä ovat edullisia muihin lämpötilalle herkkiin E. coli-lysogeeneihin verrattuina, koska niissä on ensinnäkin mutaatio, joka tekee repressorista inaktiivisen yli 38°C:ssa, ja toiseksi niissä on mutaatio, joka saa aikaan sen, että cl-rep-ressoriproteiini ei ole herkkä lambda-recA-geenin tuotteen suorittamalle proteolyyttiselle pilkkomiselle. Näin ollen sallivissa olosuhteissa viljeltäessä on cl-repressoriproteiini stabiili ja toimii immuunisuuden ylläpitäjänä.

E. coli-kanta UC5822 on lysogeeni, jossa on mutaatio cI857. Sillä on myös pistemutaatio int-geenissä (int 6 am, amber-mutaatio) ja P-geenissä (P3 am, amber-mutaatio). (Amber-mu-taatiot ovat luennan päättymissignaaleja). UC5822:ta pidetään yleensä parempana kuin esimerkiksi MM294 (cl857):ää, koska UC5822 on vajavainen siten, että se ei yleensä tuota tarttuvia faagipartikkeleita. Vajavaiset lysogeenit ovat edullisia varsinkin annettaessa polypeptidiä nisäkkäille. UC5822 tuottaa kuitenkin pienempiä määriä lysotsyymiä, luultavasti, koska sillä on pienempi S- ja R-geenien kopiomäärä, eli yksi, kuin MM294(cl8 57 ):llä, eli 50-100, induktion jälkeen. Kuitenkin UC5822 hajoaa helposti lyysin kautta induktion seurauksena .

8 89507

Erään tämän keksinnön toteutustavan mukaan lämpötilan suhteen herkät bakteerit transformoidaan DNA-molekyylillä tai DNA-molekyyleillä, jotka koodittavat haluttua tuotetta joko suoraan tai epäsuorasti. Transformointi voidaan suorittaa millä tahansa tekniikalla, joka mahdollistaa DNA-molekyylin tunkeutumisen isäntäsoluun ja ilmentymisen siellä. Tällaisia menetelmiä ovat mm. transformaatio, transduktio, konjugaatio ja solujen fuusio. Monia sopivia ilmentämisvektoreita tunnetaan ennestään samoin kuin tarjolla on menetelmiä tuotegee-nien kloonaamiseksi ja solujen transformoimiseksi tällaisilla molekyyleillä. Yleensä tuote on heterologinen geenituote, jota isäntä ei luonnostaan valmista, ja joka ei erity solun ulkopuolelle. Suoraan ilmentyviä tuotteita ovat mm. polypep-tidit ja epäsuorasti ilmentyviä tuotteita ovat mm. polypep-tidit, glykoproteiinit, antibiootit ja muut molekyylit, kuten metalli-ionit, jotka voivat muodostua metallotioneiinia tuottavissa bakteereissa.

Transformoituneita cl857-lysogeenejä voidaan kasvattaa äärettömästi sallivissa olosuhteissa (£ 38°C, tavallisesti 32-36°C), jotka ovat optimaaliset halutun tuotteen ilmentymiselle. Kun riittävä kasvu on saavutettu, joka tavallisesti tarkoittaa sitä, että keskilogaritmifaasi on saavutettu (Ag£.Q= 0,5), indusoidaan lambda-endolysiinin synteesi kasvattamalla lysogeeniä rajoittavissa olosuhteissa. Tämä voidaan saavuttaa nostamalla kasvualustan tai sen konsentraatin lämpötila cl857:n tapauksessa yli 38°C:een, mielellään 42-44°C:een, noin 90-120 minuutiksi. Vaihtoehtoisesti voidaan kasvualustan tai sen konsentraatin lämpötila nostaa yli 38° C:een, mielellään 42-44°C:eenr lyhyemmäksi ajaksi eli sellaiseksi ajakso, joka riittää indusoimaan faagi-DNA:n, mielellään vähintään noin 5 minuutiksi, jonka jälkeen lämpötila lasketaan 0-38°C:een, mielellään 2-3G°C:een.

Rajoittavien olosuhteiden ylläpito 90-120 minuutin ajan on edullista, koska lyysi on tällöin tehokkaampi ja nopeampi. Kuitenkin viimeksimainittu menettely on edullinen tietyissä sovellutuksissa, kuten siinä tapauksessa, että haluttu pro- 9 895C7 teiini on lämpölabiili, tai kun rajoittavien olosuhteiden ylläpito on liian kallista.

Jos cl857-isäntälysogeenissä on toimiva lambda-cro-geeni, jatkavat solut lysotsyymin syntetisointia missä tahansa lämpötilassa, jossa solut toimivat, kunnes lyysi tapahtuu. Vaikka lambdan endolysiini on aktiivinen jopa 0°C:ssa, on lyysiin tarvittava aika pitempi matalassa lämpötilassa, koska tällöin proteiinien synteesinopeus on pienempi samoin kuin katalyyttinen väkevyys yleensä.

Juuri ennen indusointia tai sen jälkeen on solut edullista kondensoida esim. suodattamalla tai sentrifugoimalla tai muulla tavoin, ja inkuboida tässä väkevöidyssä muodossa lyy-sin tapahtumiseen asti. Tällainen menettely helpottaa halutun tuotteen keräämistä ja puhdistamista. Induktion jälkeen solujen seinä hajoaa oleellisesti. Protoplastien muodossa olevat solut jatkavat halutun tuotteen syntetisointia, joka suurelta osin vapautuu väliaineeseen solukalvojen läpi. Lyysi saa aikaan täydellisen vapautumisen väliaineeseen. Lyysi havaitaan kasvualustan tai konsentraatin kirkastumisena ja/tai kasvualustan tai konsentraatin viskositeetin kasvuna. Lyysiä voidaan edesauttaa esim. mekaanisella sekoittamisella tai muuttamalla viljelyolosuhteita nopeasti esim. muuttamalla lämpötilaa nopeasti 2 ja 25°C:n välillä tai muuttamalla alustan tai konsentraatin osmoottista painetta. Sen jälkeen, kun solut on konsentroitu ja tuotepitoinen emäliuos dekantoi-tu, suspendoidaan indusoidut solut mielellään minimisuolat sisältävään puskuriin tai 0,1 M Tris-puskuriin, jossa on 50 mM NaCl ja 1 mM EDTA, ja sekoitetaan lyysin aikaansaamiseksi .

Haluttu tuote voidaan sen jälkeen haluttaessa ottaa talteen kasvualustasta tai konsentraatista ja puhdistaa tunnettuja menetelmiä käyttämällä.

Vaihtoehtoisessa menetelmässä kokonaiset solut konsentroidaan ja annetaan suun kautta nisäkkäille ja vasta sen jälkeen 10 89507 indusoidaan lyyttinen vaihe. Tällöin induktio tapahtuu sisäisesti ja seurauksena on halutun polypeptidin vapautuminen.

Tämä menetelmä voi olla erityisen hyödyllinen annettaessa antigeenejä eläimille silloin, kun kokonaiset solut sekä haluttu antigeeni ovat edullisia immuunisen suojavasteen aikaansaamisessa. Esimerkiksi sioille ja/tai vasikoille voidaan syöttää suoraan lämpötilalle herkkiä lysogeenejä, jotka kantavat geenejä, jotka koodittavat antigeenejä, kuten LT-B-anti-geeniä. Kullekin eläimelle annetaan sellainen määrä, että se sisältää tehokkaan annoksen. Yhden soluyksikkömäärän tuottama proteiinimäärä voidaan laskea tunnetuilla menetelmillä.

Eräs tämän keksinnön osa koskee DNA-palasta, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyn lyyttisen bakteerin rakentamiseen. Tällainen DNA-palanen sisältää vajavaisen faagisekvenssin, jossa on lämpötilalle herkkä repressorigeeni ja toiminnallisia lysotsyymiä koo-dittavia geenejä. Tällaisessa vajavaisen lambda-sekvenssin sisältävässä DNA-jaksossa on lämpötilalle herkkä cl-geeni ja funktionaalisia lambda-endolysiiniä koodittavia geenejä (N, Q, S ja R) niin, että endolysiini ilmentyy rajoittavissa olosuhteissa, valintamerkki ja mielellään oheis-DNA-sekvens-sejä, jotka ovat homologisia isäntäsolun kromosomin naapuri-DNA-sekvenssin kanssa. Erityisen toteutustavan mukaan DNA-jakso sisältää lambda-DNA:n, josta on poistettu geenit, jotka sijaitsevat kartan asemien 58 ja 71 välillä, ja joista näin ollen puuttuvat int-, xis- ja kil-geenit, ja lisäksi se sisältää lämpötilalle herkän cl-geenin ja mutaatiot O- ja P-geeneissä ja cl-geeni on cI857-mutantti ja tuottaa endolysii-niä rajoittavissa olosuhteissa. O- ja P-mutaatiot voivat olla poistuma- tai pistemutaatioita. Pistemutaatiot, kuten 029-, P3- ja P80-mutaatiot ovat edullisia, koska ne ovat helposti saatavissa. P3-mutaatio on edullisempi kuin P80-mu-taatio.

Toisessa edullisessa toteutustavassa jakso sisältää lambda-DNA: n, josta on oleellisesti ottaen poistettu geenit, jotka sijaitsevat kartan kohtien 3 ja 71 välissä. Tällaisesta I: 11 89507 jaksosta puuttuvat oleellisesti ottaen kaikki lambda-kapsi-din kokoamiseen tarvittavat geenit sekä int-, xis- ja kil-geenit.

Isäntäsolu, kuten E. coli tai jokin muu bakteeri, joka tuottaa haluttua tuotetta, tai joka on aikaisemmin tai myöhemmin, esim. geenitekniikkaa apuna käyttäen, tehty sellaiseksi, että se tuottaa haluttua tuotetta, voidaan tunnetuilla menetelmillä transformoida faagi-DNA-sekvenssillä, joka sisältää lämpötilalle herkän faagirepressorigeenin, ja lysotsyymiä kooditta-via faagigeenejä. Näihin menetelmiin kuuluu mm. bakteerin in-fektointi temperate faagilla, jossa on tällainen lämpötilalle herkkä repressorigeeni, mielellään vajavaisella faagilla. Menetelmiin kuuluvat myös bakteerin transformointi keksinnön mukaisella DNA-jaksolla käyttämällä tunnettuja tapoja, kuten transformointia, transduktiota, konjugointia ja fuusiota. Transformoinnissa yleensä sisällytetään jakso vektoriin, kuten faagiin tai plasmidiin. Esimerkiksi jakso voidaan kloonata plasmidiin, kuten pBR322:een tai johonkin muuhun, ja kasvattaa in vivo sopivassa isännässä, jossa ei ole naapurisek-venssejä, jotka olisivat homologisia jakson oheissekvensseil-le, tai joka on vajaa rekombinaatiotapahtumien suhteen (rec ). Plasmidi voidaan ottaa talteen ja sillä voidaan transformoida sopiva isäntä halutun tuotteen tuottamista varten. Tällaisen isännän transformoinnin jälkeen jakso, jossa on isännän kromosomin sisältämän naapuri-DNA:n kanssa homologisia oheissekvenssejä, integroituu liittämällä spontaanisti kohtaa, jossa on homologinen naapurisekvenssi. Vaihtoehtoisesti voidaan halutun tuotteen tuottamiseen sopiva isäntä transformoida eristetyllä DNA-jaksolla, joka on lineaarisessa tai rengasmaisessa muodossa.

DNA-jakso sisältää valintamerkin, joka helpottaa transfor-manttien valintaa. Valintamerkit ovat tavallisesti geenejä, jotka koodittavat mitattavia entsyymejä tai antavat proto-tropian auksotrooppiselle isännälle tai antavat vastustuskyvyn letaalisten tai inhiboivien yhdisteiden, tavallisesti antibioottien suhteen. Valintamerkki on mielellään geeni, 12 89507 joka antaa vastustuskyvyn antibiootin suhteen, koska nämä eivät vaadi auksotrooppisen isännän käyttöä, jota ei ehkä ole saatavissa, tai joka voi spontaanisti muuttua proto-troofiseksi. Vastustuskyky tetrasykliinin suhteen on edullinen, koska tetrasykliini on halpaa eikä tetrasykliinivastus-tuskykyä tavallisesti saavuteta spontaanisti.

Merkin läsnäolo transformaateissa ilmaisee, että isäntä sisältää DNA-jakson. Jos osa jaksosta integroituu, myös koko jakso integroituu, koska homologia DNA-jakson ja isäntäsolun DNA:n välillä on olemassa vain niillä alueilla, jotka ovat lambda-DNA:n ja merkin ohessa.

Jos DNA-jaksossa ei olisi merkkiä, vaatisi transduktion tai muun transformointitoimenpiteen jälkeinen lambda-DNA:ta kantavien isäntäsolujen valinta oletettujen transduktanttien superinfektoinnin vajavaisella (ei-integroituvalla) faagilla ja immuunien, eloonjääneiden bakteerien valinnan.

Sellaisia E. coli-kantoja, jotka on tehty lyyttisiksi integroimalla keksinnön mukainen DNA-jakso, ovat esim. MG-kan-nat. Nämä kannat ovat lysogeenejä, joissa lambda-DNA:sta on poistettu geenit, jotka ovat kartan asemissa välillä 58-71, ja joista näin ollen puuttuu int-, xis-, red-, gam-, kil- ja clll-geenit, ja joissa on cI857-mutaatio ja mutaatiot O- ja P-geeneissä ja toimivat N-, Q-, S- ja R-geenit niin, että endolysiini ilmentyy rajoittavissa olosuhteissa. Eräässä toteutustavassa kanta MG1 /C600 (λ Δ 58-71, cI857, P3, 029), Suli+, galK, IacZ, thi, gal::tnlO tet^V pistemutaatio (amber) luetaan läpi ja O- ja P-geenit ilmentyvät, koska isäntäsolun DNA tuotta amber-suppressoria, joka on luennan lopettamisen UAG-kodonin translationaalinen supressori.

Vielä edullisempi isäntäsolu tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi on sellainen, jonka fenotyyppi on O ja P . Eräs toteutus eli kanta MG3 (λ Δ 58-71, cI857, P3, 029) galK, IacZ, thi, gal::tnl0 tet ) kantaa samaa lambda- DNA- jaksoa kuin kanta MGl. Kuitenkin se on fenotyyppisesti — _ O ja P sekä tet , Akil, Aint ja Axis.

i.

13 89 507

Edullisimpia lyyttisiä E. coleja ovat MG4-kannat. Nämä ovat kantoja, joista on poistettu oleellisesti ottaen kaikki lambdan rakenneproteiinien geenit ja kokoamisgeenit ja normaali oikea profaagi-bakteeriliitos eli oikea liitoskohta (attR). Tarkemmin sanottuna ne ovat lysogeenejä, joista on poistettu käytännöllisesti katsoen kaikki lambda-geenit, jotka ovat kartan asemien 3 ja 71 välissä, ja niissä on pistemutaa-tioita O- ja P-geeneissä, lämpötilalle herkkä cl-geeni ja toimivat N-, Q-, S- ja R-geenit niin, että endolysiinf ilmentyy rajoittavissa olosuhteissa, ja valintamerkki, joka on siirrettävissä oleva tnlO-tetrasykliinivastustuskykv. Tällaisissa vajavaisissa lysogeeneissa on 4 riippumatonta virusten lisääntymisen estettä: (i) O- ja P-replikoitumisfunktioiden £ menetys, (ii) att :n puuttuminen, josta syystä profaagi ei kykene täydentymään superinfektoivan faagin int- ja xis-gee-neillä, (iii) kykenemättömyys koodittaa lambdan rakennegeene-jä ja (iv) lambda-DNA:n koko on paljon pienempi kuin se minimikoko, joka vaaditaan pakkautumiseen. Nämä voidaan valmistaa kuormittamalla aluksi cl857, O , P -lysogeenisiä kantoja, kuten MG-kantoja, kloraatilla niin, että syntyy kloraatille vastutuskykyisiä mutantteja ja valitsemalla sellaiset mutantit, jotka eivät kykene täydentämään superinfektoivan heteroimmuu-nin tai virulentin lambda- tai lambdoidifaagin lisääntymistä, josta puuttuvat A- ja B-funktiot. DNA-jakso, joka sisältää merkin, lambda-DNA:n ja oheissekvenssit E. colista, voidaan eristää MG4-kannoista käsittelemällä restriktioendonukleaa-seilla tai Pl-transduktiolla.

MG4 voidaan johtaa MG3:sta poistamalla kaikki tai suurin osa niistä bakteriofaagin geeneistä, jotka koodittavat viruksen rakennekomponentteja. Jotta voitaisiin todeta näiden geenien menetys, on tarpeen osoittaa vain, että viruksen genomi on MG4:ssä kykenemätön täydentämään ja saamaan aikaan superinfektoivan faagin lisääntymisen, jolta faagilta itseltään puuttuvat nämä geenit, λ charon 3A (λ A , B imm08O) on esimerkki faagista, jota voidaan käyttää tässä superin-fektoinnissa. Vaihtoehtoisesti voidaan mitä tahansa faagia, joka kantaa amber-mutaatiota A-, B- tai muussa virusrakenne- 14 89507 geenissä, levittää viljelmässä herkän E. colin päälle hete-roimmuunin virulentin faagin (Xvir) läsnäollessa. Näiden kahden faagin välillä tapahtuu rekombinaatio ja muodostuu rekombinantti, esim. virA . Rekombinanttien taajuus on 1-50 % riippuen koeolosuhteista. Rekombinantit voidaan tunnistaa niiden kyvystä kasvaa suppressoria sisältävien lyso-geenien _/Y mel (X)_7 päällä ja niiden kyvyttömyydestä tuottaa täpliä ei-suppressiivisilla, λ-herkillä kannoilla, kuten N99:llä. Täpliä, jotka on saatu edellä mainituista risteytyksistä, kasvatetaan petrimaljoissa, joissa on Y mel (λ):aa tai N99:ää ja rekombinantit puhdistetaan. Lambda-faagit, joilta puuttuu A- ja/tai B-geenitoiminta, ovat edullisia, koska johtuen niiden asemasta lambda-genomissa MG4-kandidaa-teilta, jotka eivät kykene täydentämään näitä toimintoja, täytyy puuttua kaikki muut lambdan rakennegeenit. Vajavaisten faagien ja isäntien käyttöä tällä tavalla nimitetään "merkkipelastukseksi" ("marker rescue") ja se on laajassa käytössä, ks. esim. teosta "The Bacteriophage Lambda", ed.

A.D. Hershey, Cold Spring Harbor Laboratory, 1971, erityisesti Stevens et ai., ss. 515-533.

Esillä olevaa keksintöä voidaan käyttää minkä tahansa bak-teerituotteiden valmistukseen. Esimerkkeinä voidaan mainita mm. insuliini, rabies-glykoproteiini, K99- ja 987P-antigee-nit, antibiootit, kasvuhormonit, metallotioneiinit, alfa-1-antitrypsiini, influenssa-antigeenit, lymfokiinit ja interferoni. Lisäksi keksintöä voidaan käyttää pesäkkeiden seulonnassa, RNA:n eristämisessä ja plasmidien valmistuksessa, koska keksintö yksinkertaistaa ja lyhentää suuresti sitä aikaa, joka näihin toimenpiteisiin tarvitaan, koska näin voidaan ohittaa muuten tarvittava lyysivaihe.

Seuraavissa esimerkeissä, jotka on tarkoitettu keksintöä valaiseviksi eikä rajoittaviksi, ovat kaikki lähtöaineet helposti saatavissa tai ne on helppo valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä. Transduktiot suoritetaan oleellisesti siten, kuin on selostettu teoksessa "Experiments in Molecular Genetics", ed. J.H. Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, New 15 895C7

York, (1972), ss. 201-205, joka sisällytetään tähän viitteeksi kuin täydellisesti esitettynä.

Esimerkki 1 MGO:n rakentaminen

Kantaa C600 (E. coli SuII+ K12 galK IacZ suli thi) inku-boitiin Acl857 P3 029:n läsnäollessa (saatu lahjoituksena W. Sybalskilta, Wisconsinin yliopistosta). Kun oli kasvatettu yön yli 32°C:ssa, elossa olevat bakteerit eristettiin ja puhdistettiin, 8 % näistä bakteereista havaittiin olevan immuuneja superinfektioinnille, olevan kykenemättömiä kasvamaan 44°C:ssa ja tuottavan lambda-faagia (oltuaan alttiina 44° C:lle) , jota ei voitu erottaa Acl857 P3 029:stä /arvosteltaessa faagin kykynä tuottaa täpliä kannalla C600, mutta ei kannalla N99 (E. coli K12 galK IacZ suO thij_7. Yksi tästä eloonjääneiden ryhmästä puhdistettiin ja sille annettiin nimi MGO /C600 ( λ C1857 P3 029]7·

Esimerkki 2 MG0-AR6:n rakentaminen

Kantaa N5151 (E. coli K12 SA500 galK IacZ pro thr his gal8 [_ Acl857 Δ 58-71 Δ Hlj_/ inkuboitiin PlmclOO-faagin läsnäollessa, jota oli kasvatettu AR4-kannalla /E· coli K12 gal::tnlO (PlcmlOOJ_/. N5151:n ja AR4:llä kasvatetun PlcmlOOrn välinen risteytymä saatiin eristämällä tetrasykliinille vastustuskykyiset, UV-herkät, lämpötilalle herkät lysogeenit. Yksi näistä puhdistettiin ja sille annettiin nimi MG0-AR6 /E. coli K12 gal8 gal::tnl0 ΑΔ58-71 cl857 ΔΗ1 (bio uvrBj_/.

Esimerkki 3 MGl:n rakentaminen MGO-AR6 tehtiin PlcmlOO-lysogeeniksi eristämällä eloonjääneet, kun AR6:tta oli inkuboitu Plcml00:n läsnäollessa.

MGO-AR6:n PlcmlOO-lysogeenille annettiin nimi MGO-AR18.

Kanta MGO risteytettiin Pl-transduktiolla Plcml00:n kanssa, jota oli kasvatettu MGO-AR18:11a. Sen jälkeen kun faagille oli annettu riittävästi absorptioaikaa, soluihin kohdistet- 2 16 39507 tiin UV-säteilyä 4 J/m (254 nm:n valon säteilynopeus oli 2 2 J/m /s UV-dosimetrillä mitattuna) ja inkuboitiin tetrasyk-liinin läsnäollessa. 11 % tetrasykliinille vastustuskykyisistä pesäkkeistä oli vastustuskykyisiä UV-valolle, mikä merkitsee, etteivät ne sisältäneet Hl-poistoa ja näin ollen kantoivat lambda-geenejä cl:stä aina faagin oikeanpuoleiseen päähän asti. Tarkemmin sanottuna tämä tarkoittaa, että nämä kloonit kantavat P3- ja 029-mutaatioita ja ehjiä S- ja R-geenejä. Yksi kolmasosa UV:lie ja tetrasykliinille vastustuskykyisistä soluista ei kyennyt tuottamaan faagia. Näin ollen näiden arvioitiin sisältävän lambdan 58-71-poistumakohdan ja näin menettäneen int-, xis- ja kil-geenit. Tämä ryhmä puhdistettiin ja sille annettiin nimeksi MGl (C600) (λΔ58-71 cl857 P3 029) SuII+ galK IacZ thi gal::tnlO tetR).

Esimerkki 4 MG3:n rakentaminen MGl:tä inkuboitiin Plcml00:n läsnäollessa ja eloonjääneet puhdistettiin. Näiden eloonjääneiden joukosta löydettiin suuri määrä MGl-soluja, joista oli tullut PlcmlOO-lysogeene-jä. MGl:n PlcmlOO-lysogeeni puhdistettiin ja sille annettiin nimi MG2.

Kanta N99 risteytettiin PlcmlOO-transduktiolla Plcml00:n kanssa, jota oli kasvatettu MG2:lla. Valittiin tetrasykliinille vastustuskykyiset transduktantit. Nämä kaikki havaitttiin immuuneiksi lambdalle ja näin ollen niiden arvioitiin olevan lambda-lysogeenejä. Yksi näistä lysogeeneistä puhdistettiin ja sille annettiin nimi MG3 _/N99 ( ΑΔ 58-71 cl857 P3 02 9/.

MG3:n lyysi tapahtui, kun se oli saatettu alttiiksi 44°C:n lämpötilalle 90-120 minuutiksi. Mitään faagia ei löydetty soluviljelmistä ennen tätä altistusta eikä sen jälkeen (< 1/0,1 ml viljelmää, jossa oli 3,3 x 10® solua per ml).

Faagin läsnäolo mitattiin C600-soluilla. Viljeltäessä vertailuna E. coli-kantoja, joissa on ehjiä lambda-profaageja, saatiin pitoisuudeksi 10 -10 faagia per ml viljelmää, jossa

O

oli 3,3 x 10 solua per ml.

i 17 39507

Esimerkki 5 MG3:n rakentaminen

Kanta MG3 rakennettiin oleellisesti ottaen samoin kuin edellisissä esimerkeissä on kuvattu paitsi, että kanta N99 lysogenoi-tiin suoraan λ cl857 P3 029:llä. Saatu lysogeeni risteytettiin Pl-transduktiolla kannan MGO-AR18 kanssa ja valittiin tetra-sykliinille vastustuskykyiset lysogeenit, jotka hajosivat lyytti sesti lämpötilainduktion seurauksena, mutta eivät tuottaneet faagia.

Esimerkki 6 UC5822:n rakentaminen

Kanta UC5822 rakennettiin infektoimalla kanta N99 λ int6 red3 cl857 P80 ja λ hy5 climm21 Λ b2:lla. λ hy5 climm21 Δ b2 on lambda-faagin ja 21-faagin välinen hybridi, λ hy5 climm21 Δ b2:n tarkoitus tässä rakentamisessa on antaa int-funktio in trans, joka tarvitaan siihen, että λ int6 red3 cl857 P80 kykenee lysogenisoimaan tämän kannan. Δ b2-mutaatio tekee Δ hy5 climm21 Δ b2-faagin kykenemättömäksi ohjaamaan omaa integroitumistaan tähän kantaan. Tässä risteytyksessä eloonjäänyt, joka oli immuuni superinfektoivalle lambdalle, mutta herkkä faagille 21, puhdistettiin ja sille annettiin nimi UC5822. Kanta ei säilynyt elossa, kun se oli altistettuna 44°C:lle. Mitään faagia ei voitu havaita UC5822-viljelmissä ennen inkubointia 44°C:ssa eikä sen jälkeen.

Esimerkki 7 MG4:n rakentaminen MG3-viljelmiä kasvatettiin Luria-alustassa tai muissa täydellisissä alustoissa, kunnes A^q oli 0,5. Viljelmä sisälsi noin 5 x 10® solua per ml. Sitten viljelmää kasvatettiin ra-vinneagarlevyillä, joihin oli lisätty 0,2 % glukoosia ja 0,2 % KCIO^. Levyjä inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa 32°C:ssa, kunnes muodostui pesäkkeitä (3-5 vuorokautta). Suoritettaessa kasvatus tässä alustassa näissä olosuhteissa saadaan valituksi E. coli, jossa oli mutaatiot chl A-, B-, C- tai D-geenissä. Ks. "Expts. in Molecular Genetics", J.

Miller, ss. 226-227.

is 39507

Mutaatio chlB:ssä, C:ssä tai D:ssä ei johda MG4:n eristämiseen. ChlA:n ilmentymiseen vaikuttavissa mutaatioissa on mm. pistemutaatiot chlArssa ja poistumat, jotka ulottuvat chlA:n oikealle tai vasemmalle puolelle. ChlA:n vasemmalle ulottuvat poistumat voivat johtaa viereisen uvrB-geenin särkymiseen ja näin antaa organismille UV-herkän fenotyypin. Samasta syystä voivat chlD-geenistä oikealle ulottuvat poistumat antaa organismille UV-herkän fenotyypin. Anaerobisessa inku-boinnissa saadut kloraatille vastustuskykyiset pesäkkeet tutkitaan nyt sen suhteen, ovatko ne UV-herkkiä. Tämä on edullista suorittaa viiruttamalla kloraatille vastustuskykyinen pesäke petrimaljan yli ja peittämällä puolet maljasta ja al-tistamalla toinen puoli 10 J/m määrälle UV-säteilyä, jonka aallonpituus on 254 nm. Tämä annos riittää tappamaan UV:lle herkät solut, mutta se ei tapa UV:lie vastustuskykyisiä mutantteja. UV:lie herkät mutantit (sisältävät mutaatioita chlA:ssa tai chlD:ssä) tutkitaan vajavaisen lambda-profaa-gin läsnäolon suhteen. Tämä tehdään viiruttamalla solut homoimmuunia faagia sisältävän viirun läpi. Lambdalle herkät bakteerit kuolevat faagin vaikutuksesta ristikkäisviirussa, kun taas lambda-lysogeenit ovat immuuneja superinfektiolle eivätkä kuole. ChlA- ja chlD-geenien sijainnista, lambda-genomista ja uvrB-geenistä johtuen ovat kaikki UV:lie herkät chlA-mutantit herkkiä lambdalle, kun taas jotkut UV:lie herkät chlA-mutantit voivat olla lambda-lysogeenejä. Näin ollen UV:lle herkät lambda-lysogeenit sisältävät chlA:ssa poistumia, jotka ulottuvat vasemmalle uvrB:hen asti. Jos poistuma ulottuu uvrB:n läpi, se saattaa ulottua biotiini-operoniin ja mahdollisesti lambda-rakennegeeneihin. Tällä tavalla on saatu aikaan poistumia lambda-rakennegeeneissä /'Grier, Virology 6_6:589-604 (1975]_7· Kaikki UV-herkät, chlA , lambda-lysogeenit infektoidaan χ virA :11a. 2-0,5 tunnin kuluttua lysaatteja kasvatetaan levyillä \ virA -faagin tai X virA+-rekombinanttien suhteen. MG4-kandidaatit, jotka kasvattavat χ virA :ta ja/tai tuottavat χ virA+-faageja, heitetään pois; kandidaatit, jotka eivät täydennä χ virA :ta ja/tai tuota virA+:aa, kantavat poistumaa, joka ulottuu 19 39507 chlA:sta lambdan A-geenin läpi. Ne MG4-kandidaatit, joissa on poistumat, jotka ulottuvat chlArsta lambdan A-geenin läpi, testataan lyyttisten bakteeriominaisuuksien suhteen (lyysi kasvatettaessa >38°C:ssa). Poistuman sisältävät kandidaatit, joissa on lyyttinen bakteeriominaisuus säilynyt, puhdistetaan MG4:nä..

Esimerkki 8 MM294(cl857):äan ja UC5822:een tapahtuva kloonaus E. coli-kantaa MM294 inkuboitiin λ cI857:n läsnäollessa. Kasvatettiin yön yli 32°C:ssa ja eloonjääneet bakteerit eristettiin ja puhdistettiin. Kloonit, jotka olivat immuuneja super-infektiolle ja kykenemättömiä kasvamaan ja tuottivat faagia 44°C:ssa, eristettiin. Näin saatu cl857-lysogeeninen kanta MM294 (λ cl857) ja E. coli-kanta UC5822 esikäsiteltiin CaCl2:lla ja transformoitiin pDN5:llä, joka on plasmidi, jossa on geenit E. coli LT-B-antigeenille ja ampisilliini-ja tetrasykliinivastustuskyvylle.

Kummankin lyyttisen bakteerikannan ampisilliinille ja tetra-sykliinille vastustuskykyiset transformantit kasvoivat hyvin tavallisessa ravinneliemessä 30-32°C:ssa ja ilmensivät LT-B-antigeeniä. Bakteerit pelletoitiin sentrifugoimalla ja siirrettiin tavalliseen ravinneliemeen 42°C:ssa. 90-120 minuutin kuluessa solujen lyysi tapahtui selvästi ja käytännöllisesti katsoen täydellisesti. LT-B-antigeeni vapautui kasvuliemeen.

MM294(cl857)-transformanttinäytteestä, jonka suuruus oli 7 8 4 x 10 solua/ml, saatiin noin 2 x 10 lambda-faagia per ml.

Samanlaisesta UC5822-transformanttinäytteestä ei saatu talteen lainkaan faagia (< 20/ml).

Esimerkki 9 UC5822:n kloonaus E. coli UC5822:n siemenviljelmä, jossa kannassa oli plasmidi pESS2, joka kantaa E. coli LT-B-antigeeniä, siirrostettiin 5 ml:n putkeen, jossa oli ampisilliiniä sisältävää L-kasvu-lientä. 6 tunnin kuluttua putken sisältö siirrettiin 500 ml:aan kasvualustaa, jossa oli ampisilliiniä, ja inkuboitiin 20 89507 yön yli ravistelemalla 32°C:ssa. 400 ml yön yli kasvatet tua viljelmää siirrettiin 10 litraan ampisilliiniä sisältävää kasvualustaa, joka oli Virtis-bench-top-fermentorissa. Viljelmää pidettiin 32°C:ssa ja tunnin välein otettiin näyte, josta kasvua seurattiin A^^rssa. 4 tunnin kuluttua viljelmään tuotiin 200 ml 50-prosenttista dekstroosia ja 0,1 ml vaahdonestoainetta. 8 tunnin kuluttua viljelmässä oli 4,8 A42o-y^si^^öä ja lämpötila nostettiin 43°C:een. 10 tunnin kohdalla viljelmään tuotiin vielä 200 ml 50-prosenttista dekstroosia ja 14 tunnin kohdalla kasvatus lopetettiin. Solukonsentraa-tista ("pelletti") ja solujen emäliuoksesta otettiin näytteet 4, 6, 8, 9, 10, 10,6 ja 14 tunnin kohdalla ja niiden LT-B-pitoisuus tutkittiin käyttämällä ELISA-koetta ja siinä tunnettuja LT-B-väkevyyksiä standardeina.

Saadut tulokset on esitetty taulukossa I. Ensimmäisten 4-8 tunnin kuluessa yli 90 % LT-B:stä oli solussa, mutta 2 tunnin kuluessa lämpötilan nostosta (10 tuntia siirrostami-sesta) oli 90 % LT-B:stä emäliuoksessa. 6 tunnin kuluttua lämpötilan nostosta oli 95 % LT-B:stä emäliuoksessa; LT-B edusti 8,5 % kokonaisproteiinimäärästä. LT-B-saanto oli paljon suurempi kuin vastaava pESS2:lla transformoituneella E. coli MM294:llä saatu saanto.

2-4 tunnin kuluessa lämpötilan nostosta lyysi ilmeni kasvu-liuoksen kohonneena viskositeettina ja näkyvinä solupirsta-leina. 4-6 tunnin kuluessa lämpötilan nostosta viskositeetti laski suuresti ja viljelmä voitiin helposti pumpata ultrasuo-datuslaitteen läpi niin, että rikkoutunut solumateriaali ja mahdolliset ehjiksi jääneet solut saatiin poistetuiksi. Kohonnut viskositeetti todistaa suurimolekyylisen DNA:n ja RNA:n vapautumista kasvuliuokseen ja endogeenisten nukleaa-sien toiminta johtaa lopulta havaittavaan viskositeetin laskuun.

1.

21 β 9 5 C 7

Taulukko I

Aika siirrosta- Solun ,ug/ml LT^rn kokonais- misesta lukien A.™ prote- /LT_ ...... , . .

420 .. . B maara prosenttei- 11 n x . . , mg/ml na solun koko na ispro te unimaa - _rästä_ 4 h pelletti 0,58 0,734 0,41 4 h emäliuos 0,06 0,07 % 6 h pelletti 1,1 6 h emäliuos 1,8 1,19 0,11 0,1% (nosto) 8 h pelletti 4,8 1,24 3,9 (43°C) 8 h emäliuos 0,29 0,3 % 10 h pelletti 6,2 0,646 1,2 10 h emäliuos 14,8 2,5 % 10.6 h pelletti 5,0 0,652 1,8 10.6 h emäliuos 39,38 6,3 % 14 h pelletti 1,8 14 h emäliuos 4,2 0,652 53,83 8,5 %

Esimerkki 10

Lyyttisen Salmonellan rakentaminen

Lajien välinen risteytys suoritetaan Salmonellalle ja MG3:lle joko konjugaatiolla tai DNA:n transformaatiolla. Salmonella-kannat ovat tavallisesti herkkiä tetrasykliinille; MG3 on tetrasykliinille vastutuskykyinen. Salmonella-rekombi-nantit, jotka ovat saaneet tetrasykliinivastustuskyvyn, testataan sen suhteen, onko niillä kyky kasvaa 42°C:ssa. Ne Salmonellat, jotka hajoavat lyysin kautta tässä lämpötilassa, ovat saaneet rekombinaation kautta lyyttisen MG3-bakteeri-funktion. Tämä koe on mahdollinen, koska (1) lambdan lyytti-set funktiot ilmentyvät Salmonellassa ja (2) Salmonellan ja E. coli (MG3):n välillä on riittävä homologia, joka sallii E. colin liittymisen oheissekvenssien avulla Salmonellaan.

Esimerkki 11

Lyyttisen Bacilluksen rakentaminen

Menetelmä 1. Niihin geneettisiin rakenneosiin, jotka riittävät ohjaamaan isäntäsolun lyysiä, kuuluvat λ cl857-, N-, Q-, S- ja R-geenit ja P^-promoteri. Näiden geenien restrik- 22 69507 tiokartat tunnetaan (Molecular Cloning, Maniatis et al.,

Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.). Geenit jatkokloonataan lambdasta plasmidiin (esim. pBR322). Bacilluksen DNA-jakso liitetään plasmidiin kohtaan, joka sijaitsee epäoleellisella alueella. Ei ole tarpeen tunnistaa isäntäkannan DNA:n luonnetta tai funktiota tai sen suuntaa plasmidissa. Sitten Ba-cillusta inkuboidaan puhdistetun plasmidi-DNA:n kanssa ja valitaan antibiootille vastustuskykyiset transformantit.

Näistä transformanteista tutkitaan, tapahtuuko niille lyysi korkeassa lämpötilassa. Näissä transformanteissa on lambda-geenit sisältävä plasmidi läsnä joko autonomisesti replikoi-tuvana yksikkönä tai se on integroituneena isännän kromosomiin siten, että on tapahtunut rekombinaatio plasmidin sisältämän homologisen Bacillus-DNA:n ja kromosomin välillä. Rep-likoitumiskyvyttömien plasmidien kantaman DNA:n integroitumista Bacillus-kromosomiin on kuvattu julkaisussa Haldenway et ai., J. Bact. 142;90-98, 1980). Tämä menetelmä vaatii lambdan lyyttisten geenien ilmentymisen vastaanottavassa isännässä, mutta se ei vaadi homologiaa MG3:n E. coli-sek-venssien ja vastaanottavan bakteerin välille.

Menetelmä 2. Faagi phi-105 tartuttaa Bacilluksen, se on temperate faagi ja sisältää cl:n kaltaisen, mutatoituvan repressorin. Phi-105:stä voidaan tehdä johdannaisia, joissa on tähän repressioon vaikuttavia lämpötilalle herkkiä mutaatioita. Faagijohdannaisia, joista puuttuu irrotus- tai rep-likoitumisfunktiota, voidaan eristää mutaatioita aikaansaamalla tai ottamalla talteen deletiokannat (Flock, Mol. Gen.

Genet. 155:241-247 (1977). Näin saadaan faagijohdannainen, jossa on lämpölabiili repressori. Tämän mutantin lysogeeni tehdään infektoimalla herkät solut faagilla 30°C:ssa. eristämällä eloonjääneet solut ja testaamalla nämä solut sen suhteen, ovatko no immuuneja supcrinfektoivalle faagille ja ovatko ne kykenemättömiä kasvamaan 40°C:ssa. Tällainen organismi on faagia tuottava, lyyttinen bakteeri. Vajavaisen lyyttisen bakteerin eristämiseksi bakteeriin kohdistetaan mutageeninen vaikutus ja eloonjääneet pesäkkeet viljellään kopioina levyillä, joissa on mattomaista, kehittymätöntä i 23 39 507 phi-105-herkkää Bacillusta. Korkealle lämpötilalle altistuksen jälkeen tuottavat lämpötilalle herkät pesäkkeet harvoja tai ei lainkaan faageja näillä matoilla ja sisältävät faagin lisääntymiseen vaikuttavia mutaatioita. Täsmällisempiä mutantteja voidaan saada aikaan toistamalla mutageeninen käsittely. Jotta tämä rakenne saataisiin mobilisoiduksi ja se olisi helppo siirtää, on edullista eristää johdannainen, jossa on antibioottivastustuskyvyn antava merkki liittyneenä phi-105-genomiin. Tämä voidaan saada aikaan kloonaamalla Bacillus-kromosomin mielivaltaiset palaset plasmidiin (joka on kykenemätön replikoitumaan Bacilluksessa) , joka kantaa antibioottivastustuskykyä (kuten pBR322). Eristetään transformoituneet, lääkkeelle vastustuskykyiset solut, jotka sisältävät integroituneen plasmidin. Joissakin näistä soluista on plasmidi integroituneena lähelle phi-105-kohtaa. Fraktioi-maton, lääkkeelle vastustuskykyisten pesäkkeiden kokoelma infektoidaan yleisellä Bacilluksen transduktiofaagilla, sBSl. pBSl-varastoa, joka toimii Bacilluksessa juuri samalla tavalla kuin PlcmlOO toimii E. colissa, käytetään transdusoimaan Bacillus-solut lääkkeelle vastustuskykyisiksi. Nämä lääkkeelle vastustuskykyiset transduktantit testataan sen suhteen, ovatko ne lämpöherkkiä, lyyttisiä bakteereita. Noin 1 % transduktanteista on saanut lyyttiset bakteeriominaisuudet.

Edellä oleva selostus ja esimerkit osoittavat, että keksinnön mukaiset menetelmät ja seokset ovat hyödyllisiä haluttaessa tuottaa tuotteita bakteereissa ja saada tuotteet siirtymään bakteerien ulkopuoliseen tilaan. Vaikka keksinnön edullisia toteutustapoja onkin kuvattu edellä tarkasti, ei tämä keksintö rajoitu näihin, vaan sisältää kaikki toteutustavat ja muunnokset, jotka kuuluvat liitteenä olevien patenttivaatimusten kattamaan alaan.

Claims (23)

1. 24 B95C7 Pa t ent tivaat imukset Menetelmä geeni tuot. teen va .1 mi s t ami e ek a i , tunnettu siitä, että menetelmä käsittää <i) lämpötilalle horkkien bakteerien v i 1 j e 1 em i s «n , joka bakteeri : (a) ilmentää geeni tuot. - teen solun sisäisesti, (b) on lysogeeni, josta puuttuvat pilkkomia- ja repi ikoitsmistoirninnot ja (n) sisältää profaagin DNA-sekvenssissä lämpötilalle herkän faagirepressorigeenin ja funktionaalisia lysotsyymia koodattavia faagi geenejä, sallivissa olosuhteissa siten, että geenituote ilmentyy solunsi-eäisesti ja iysnteyymi a koodi ttavat geenit repressoituvat ja sitten (ii; lämpötilaa nostetaan rajoittavien olosuhteiden aikaansaamiseksi, jolloin lysotsyymia koodittsvat geenit, ilmentyvät .
2. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lämpötilalle herkkä faagirepressorigeeni on lämpötilalle herkkä 1ambda-cT-geeni.
3. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että cl-geeni on C. I 857-mutant. t i. .
4. 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on E. co1i-lambda-1ysogeeni.
5. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on E. coli -kanta UC5822, joka on rakennettu infektoimalla kanta N99 (E. coli K12 aa1K IacZ o su thi) faagei 1 la Xln16 red3 c_I_857 £80 ja Xhy5 c I imm 21 Ab2.
6. 6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lambda profaagi-DNA-sekvenssieta on poistettu ; Geenit., jotka sijaitsevat kartan asemien 58 ja 71 välillä ja sen 0- ja P-geenit on mutatoitu, minkä tuloksena 0- ja P- geenien toiminnot on menetetty. 25 895C7
7. 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 1ambda profaagi-DNA - sekvenes in vieressä on valin tamerkki, joka on valikoitavaa ominaisuutta koodittava geeni, ja 0- ja P-mutaatlot ovat pigtemutaatioita.
8. 0. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lambda-profaagi-DNA-sekvenssin vieressä on yläpuo lolls siirrettävissä oleva tetra ay k liiniresistentt i element t. i tnlO ja O- ja P-geenit ovat 029- ja P3-geenejä.
9. 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on E. co 1i-MG-kanta, joka en rakennettu + infektoimalla kanta C600 (E. coii Suli , K12, galK IacZ suli, thii faageilla λ c 1857 . £3, 0.29.
10. 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on kanta MG3 , joka on johdettu N99:sta ja jolla on genotyyppi N99 C λ Δ 58-71, cj.857, £3, 029).
11. 11. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lambda-pro faagi-DNA-3ekvenssistä on poistettu geenit, jotka sijaitsevat kartan asemien 3 ja 71 välissä.
12. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lambda-profaagi-DNA-sekvenssin vieressä on valin-tamerkki, joka on valikoitavaa omainaisuutta koodittava geeni, ja 0- ja P-mutaatiot ovat. pietemutaat ioita . · 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 1 ambda-p r o f aagi - DNA-s ek vens s i n vieressä on yläpuolella siirrettävissä oleva tetrasyk1iiniresistenttie 1emen11i tnlO ja O- ja P-geenit ovat 029- ja P3-geenejä.
13. 14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu . siitä, että bakteeri on E. coli MG4-kanta, joka on johdettu N99:stä ja jolla on genotyyppi MG4 /^99 (λΔ 3-71, cI857 R £3 , £2 9 ) galK , lac7., thi , ga 1 : : tn 1 0 tet J . 26 89507
14. 15. DNA-jakso, tunnettu entä, että se käsittää Ci) va- lintamerkm, joka on valikoitavaa ominaisuutta koodittava geeni; (li ) lambda-prof a ag i-DNA - sekvens s 1 n, jossa on lämpötilalle herkkä cI repressorigeeni ja funktionaalisia .lysotsyy-mia koodattavia geenejä siten, että lysotsyymia koodittavat geenit ovat repressoitunema sallivissa olosuhteissa ja il mentyvät rajoittavissa olosuhteissa, jolloin prof aa gi-DNA-aekvenssi sisältää funktionaaliset N-, Q-, S- ja R-goeriit, ja siitä on oleellisesti ottaen poistettu geenit, jotka ovat. kartan asemien 58 ja 71 välissä, ja siinä on mutaatiot 0-Ja P-geene.issä, minkä seurauksena on menetetty O- ja P-geenien toiminnot; ja (iii) DNA-oheissekvenssit, jotka ovat homologisia i sar. t ä ba k t. ee r i so lun kromosomin jatkuvan sekvenssin kanssa sallien rekombinaation tapahtumisen fragmentin ja isäntasolun k.romoFoni?n välillä.
15. 16· Patenttivaatimuksen 15 mukainen DNA-jakso, tunnettu Riitä, että cT-geeoi on cI857-geeni, 0- ja P-mutantit. ovat 029- ja P3-mutan11e ja ja va1intamerkki on siirrettävissä oleva t. e t. r a sy k 1 i i n i r e s i s t en 11.3 e 1 erien 1.1 i t n 1 0 .
16. 17· Patenttivaatimuksen 15 mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että p r o f a s g; - DNA-s ek ven s s i s t. ä on oleellisesti poistettu geenit, jotka sijaitsevat kartan asemien 3 ja 71 välil-1 ä .
17. 18· Patenttivaatimuksen 17 mukainen DNA-jakso, tunnettu siitä, että cl-geeni on cI857-geeni, 0- ja P-mutantit ovat 029- ja P3-mutantte ja ja va1intamerkki on siirrettävissä oleva tetrasykliiniresistenttieleraentti tn 10.
18. 19. Menetelmä lämpötilalle herkän bakteerin valmistami seksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää bakteerin transformoimi sen DNA-jakso11 a, joka käsittää Ci) valintamer-kin, joka on valikoitavaa ominaisuutta koodittava geeni; (ii) lambda-profaagi-DNA-sekvenssin, jossa on lämpötilalle herkkä i 27 Ö95C7 cl-repressorigpenj ja funktionaalisia 1 y s o t syyrru a koodi t.tavia geenejä oiten, että lysotayymia koodittavat geenit represeoi tuvat sallivissa olosuhteiasa ja ilmentyvät rajoittavissa olosuhteissa, jolloin profaagi-DNA-sekvenssi sisältää funktionaaliset N-, Q-, ,s- ja R-geenit ja siitä on oleellisesti poistettu geenit, jotka sijaitsevat kartan asemien 5Θ ja 7\ välissä, ja siinä on mutaatiot 0- ja P-geeneiseä, minkä seurauksena en menetetty 0- ja P-geenien toiminnot; ja (iii) DNA -ohei e sek venss i n , joka on homologinen i san t ähak t.ee r i solun kromosomin jatkuvan sekvenssin kanssa sallien rekombinaation tapahtumisen isänt.äsolun kromosomin ja jakson välillä.
19. 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että cT-geeni on cT857-geeni, O- ja P-mut.antit ovat 029- ja P3-mutantteja ja va1intamerkki on siirrettävissä oleva tetraeykl i ini real stentt.ielementti tnlO .
20. 21- Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pro f aagi-DNA-eekvenesistä on oleellisesti poistettu geenit, jotka sijaitsevat kartan asemien 3 ja 71 välissä .
21. 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että cI-geeni on cI857-geeni, O- ja P mutantit ovat 029- ja P3-nu.it antt e ja ja va 1 i n tamer k k i on siirrettävissä oleva tetrasyk1iinlresistenttielementti tnlO.
22. 23. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on E. coli.
23. 24. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on E. coli. *8 89507 Pa t. ent krav