ES2318070T3 - Procedimiento para la recuperacion facilitada de proteinas heterologas a partir de celulas bacterianas. - Google Patents
Procedimiento para la recuperacion facilitada de proteinas heterologas a partir de celulas bacterianas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la recuperación de polipéptido heterólogo a partir de células bacterianas, que comprende: (a) cultivar las células, que comprenden un primer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo y una secuencia de señal para la secreción del polipéptido heterólogo, estando dicho primer ácido nucleico unido a un primer promotor inducible, un segundo ácido nucleico que codifica la lisozima fágica, y un tercer ácido nucleico que codifica una proteína que muestra actividad digestora de ADN bajo el control de una secuencia de señal para la secreción de la proteína digestora de ADN, en el que dichos segundo y tercer ácidos nucleicos están operativamente unidos a un segundo promotor que es el mismo para ambos, y en el que ambos están unidos sobre el mismo constructo de ácido nucleico, y en el que el segundo promotor es o bien (i) inducible o (ii) un promotor constitutivamente débil o un promotor con un nivel basal bajo que no requiere la adición de un inductor para funcionar como un promotor, y en el que el primer promotor inducible y el segundo promotor son diferentes entre sí y, cuando el segundo promotor es un promotor inducible, responden a diferentes inductores; (b) añadir un inductor específico para la inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo a partir del primer promotor inducible, (c) únicamente cuando el cultivo se realiza mediante (a)(i) anterior, añadir un segundo inductor específico para el segundo promotor inducible tras la acumulación de aproximadamente 50% o más de la acumulación máxima del polipéptido heterólogo que se debe recuperar, (d) lisar las células, y (e) recuperar el polipéptido heterólogo acumulado del caldo lisado.
Description
Procedimiento para la recuperación facilitada de
proteínas heterólogas a partir de células bacterianas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción y recuperación de polipéptidos
heterólogos a partir de células bacterianas. Más particularmente,
la presente invención se refiere a un procedimiento por el que se
facilita o incrementa la recuperación de polipéptidos heterólogos
recombinantes solubles o agregados procedentes de citoplasma y
periplasma bacteriano.
Escherichia coli ha sido ampliamente
utilizada para la producción de proteínas heterólogas en
laboratorios e industria. E. coli generalmente no excreta
proteínas al medio extracelular aparte de colicinas y hemolisina
(Pugsley y Schwartz, Microbiology, 32:3-38
(1985)). Las proteínas heterólogas expresadas por E. coli
pueden acumularse como producto soluble o como agregados insolubles.
Ver figura 1 en el presente documento. Pueden encontrarse
intracelularmente en el citoplasma o ser secretadas al periplasma si
van precedidas por una secuencia de señal. Cómo iniciar la
recuperación de los productos depende en gran medida de cómo y dónde
se acumula el producto. Generalmente, para aislar las proteínas,
las células pueden someterse a tratamientos para extracción
periplásmica o desintegrarse para liberar productos atrapados que,
de otra manera, serían inaccesibles.
El aislamiento convencional de polipéptidos
heterólogos de bacterias Gram-negativas presenta
problemas debido a las paredes celulares fuertes y rígidas que
rodean a estas células. La pared celular bacteriana mantiene la
forma de la célula y protege el citoplasma de presiones osmóticas
que pueden causar la lisis celular; lleva a cabo estas funciones
como resultado de un esqueleto de peptidoglicano altamente
entrecruzado (también conocido como mureína) que proporciona a la
pared su rigidez característica. Un modelo reciente describe el
espacio entre las membranas citoplasmática y la externa como una
fase continua llena con un gel polisacárido del periplasma interno
que se extiende hacia un gel peptidoglicano externo altamente
entrecruzado (Hobot et al., J.Bact., 160:143 (1984)).
Este sáculo de peptidoglicano constituye una barrera para la
recuperación de cualquier polipéptido heterólogo no excretado por
el bacteria hacia el medio.
Para liberar proteínas recombinantes del
periplasma de E.coli, se han utilizado tratamientos que
implican compuestos químicos tal como cloroformo (Ames et
al., J.Bacteriol., 160:1181-1183 (1984)),
guanidina-HCl, y Triton X-100
(Naglak y Wang, Enzyme Microb.Technol.,
12:603-611 (1990)). Sin embargo, estos compuestos
químicos no son inertes y pueden tener efectos perjudiciales sobre
muchos productos de proteína recombinante o sobre procedimientos
posteriores de purificación. El tratamiento con glicina de las
células de E.coli, que causa la permeabilización de la
membrana externa, también se ha dado a conocer como forma de liberar
el contenido periplasmático (Ariga et al.,
J.Ferm.Bioeng., 68:243-246 (1989)). Estos
métodos de liberación periplasmática a pequeña escala se han
diseñado para sistemas específicos. No se traducen fácilmente ni
eficientemente y generalmente son inadecuados como métodos a gran
escala.
Los métodos más ampliamente utilizados de
liberación periplasmática de proteínas recombinantes son el choque
osmótico (Nosal y Heppel, J.Biol.Chem.,
241:3055-3062 (1966); Neu y Heppel,
J.Biol.Chem., 240:3685-3692 (1965)), el
tratamiento con clara de huevo de gallina
(HEW)-lisozima/etilendiamina ácido tetraacético
(EDTA) (Neu y Heppel, J.Biol.Chem.,
239:3893-3900 (1964); Witholt et al.,
Biochim.Biophys.Acta, 443:534-544 (1976);
Pierce et al., ICheme Research Event,
2:995-997 (1995)), y el tratamiento combinado de
lisozima-HEW/choque osmótico (French et al.,
Enzyme and Microb.Tech., 19:332-338 (1996)).
Típicamente, estos procedimientos incluyen una disrupción inicial
en medio osmóticamente estabilizante, seguido de la liberación
selectiva en medio no estabilizante. La composición de estos medios
(pH, agente protector) y los métodos disruptivos utilizados
(cloroformo, lisozima-HEW, EDTA, sonicación) varían
entre los procedimientos específicos dados a conocer. Una variación
sobre el tratamiento lisozima-HEW/EDTA que hace uso
de un detergente iónico dipolar en lugar de EDTA se discute en
Stabel et al., Veterinary Microbiol.,
38:307-314 (1994). Para una evaluación general de
la utilización de sistemas enzimáticos intracelulares de lisis para
alterar E.coli, ver Dabora y Cooney en Advances in
Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 43, A. Fiechter, ed.
(Springer-Verlag: Berlin, 1990), páginas
11-30.
Los métodos convencionales para la recuperación
de proteína recombinante del citoplasma, como proteína soluble o
como partículas refráctiles, implicaban la desintegración de la
célula bacteriana mediante rotura mecánica. La disrupción mecánica
típicamente implicaba la generación de cavitación local en una
suspensión líquida, agitación rápida con perlas rígidas,
sonicación, o molido de la suspensión celular (Bacterial Cell
Surface Techniques, Hancock y Poxton (John Wiley & Sons
Ltd., 1988), Capítulo 3, página 55). Estos procedimientos requieren
una inversión significativa de capital y suponen un tiempo de
procesamiento largo.
Lisozima-HEW actúa
bioquímicamente para hidrolizar el esqueleto de peptidoglicano de la
pared celular. El método fue inicialmente desarrollado por Zinder y
Arndt, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 42:586-590
(1956), quienes trataron E.coli con albúmina de huevo (que
contiene lisozima-HEW) para producir esferas
celulares redondeadas, conocidas posteriormente como esferoplastos.
Estas estructuras conservaban algunos componentes de la pared
celular pero tenían grandes áreas en las que la membrana
citoplasmática quedaba expuesta.
La patente US nº 5.169.772 da a conocer un
método de purificación de heparinasa a partir de bacterias que
comprende la disrupción de la cubierta de las bacterias en un medio
osmóticamente estabilizado, por ejemplo, en solución de sacarosa al
20%, por ejemplo, EDTA, lisozima, o un compuesto orgánico, liberando
las proteínas no similares a heparinasa del espacio periplásmico de
las bacterias alteradas mediante la exposición de éstas a un tampón
de baja fuerza iónica, y liberando las proteínas similares a
heparinasa mediante la exposición de las bacterias lavadas con
tampón de baja fuerza iónica a una solución salina tamponada.
Existen varias desventajas en la utilización de
la adición lisozima-HEW para aislar proteínas
periplasmáticas. Las células deben tratarse con EDTA, detergente, o
pH elevado, todos los cuales ayudan a debilitar las células.
Además, el método no es adecuado para la lisis de grandes cantidades
de células porque la adición de lisozima es ineficiente y existe la
dificultad de dispersar el enzima en un pellet grande de
células.
Se han utilizado muchas modificaciones
diferentes de estos métodos sobre una amplia variedad de sistemas de
expresión con diversos grados de éxito
(Joseph-Liazun et al., Gene,
86:291-295 (1990); Carter et al.,
Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Aunque
estos métodos han funcionado a escala de laboratorio, implican
demasiadas etapas para un procedimiento de recuperación eficiente a
gran escala.
Se han dado a conocer esfuerzos para inducir en
cultivos celulares recombinantes la producción de lisozima. La
patente nº EP 155.189 da a conocer un medio para inducir un cultivo
celular recombinante a producir lisozimas, que generalmente se
esperaría que serían letales para tales células huésped mediante la
destrucción o lisado de la estructura de la pared celular. Las
patentes rusas nº 2043415, nº 2071503, y nº 2071501 dan a conocer
plásmidos y las cepas correspondientes para producir proteínas
recombinantes y purificar aglomerados proteicos insolubles en agua
que implican el gen de la lisozima. Específicamente, la utilización
de un operón consistente del gen de la lisozima y un gen que
codifica proteína recombinante permite la síntesis concurrente de la
proteína recombinante y de una lisozima que rompe la membrana
polisacárida de E.coli.
La patente US nº 4.595.658 da a conocer un
método para facilitar la externalización de las proteínas
transportadas al espacio periplasmático de E.coli. Este
método permite el aislamiento selectivo de proteínas localizadas en
el periplasma sin necesidad de tratamiento con lisozima, molido
mecánico, o tratamiento de choque osmótico de las células. La
patente US nº 4.637.980 da a conocer la producción de un producto
bacteriano mediante la transformación de un lisógeno sensible a la
temperatura con una molécula de ADN que codifica, directa o
indirectamente, el producto, el cultivo del transformante bajo
condiciones permisivas para expresar el producto génico
intracelularmente, y la externalización del producto mediante la
elevación de la temperatura para inducir funciones codificadas en
el fago. La patente nº JP 61-257931 publicada el 15
de noviembre, 1986, da a conocer un método de recuperación de
IL-2 utilizando lisozima-HEW. Asami
et al., J.Ferment. and Bioeng.,
83:511-516 (1997) dan a conocer la disrupción
sincronizada de células E.coli mediante infección por el fago
T4, y Tanji et al., J.Ferment. and Bioeng.,
85:74-78 (1998) dan a conocer la expresión
controlada de genes de lisis codificados en el fago T4 para la
disrupción suave de las células de E.coli.
El desarrollo de un método enzimático de
liberación para recuperar proteínas periplasmáticas recombinantes
adecuadas para su utilización a gran escala se da a conocer en
French et al., Enzyme and Microbial Technology,
19:332-338 (1996). Este método implica la
resuspensión de las células en un tampón de fraccionamiento seguido
de recuperación de la fracción periplasmática, donde el choque
osmótico sigue inmediatamente al tratamiento con lisozima. También
se discuten los efectos de la sobreexpresión de la proteína
recombinante S. thermoviolaceus
\alpha-amilasa, y la fase de crecimiento del
organismo huésped tras la recuperación.
En un procedimiento a escala de 10 kilolitros
para la recuperación de polipéptido IGF-I (Hart
et al., Bio/Technology, 12:1113 (1994)), los autores
intentaron el procedimiento típico de aislamiento que implica una
etapa de rotura mecánica de las células, seguida de una etapa de
centrifugación para recuperar los sólidos. Los resultados fueron
decepcionantes debido a que casi 40% del producto total se perdió en
el sobrenadante tras tres pasadas por el homogeneizador Gaulin.
Hart et al., Bio/Technology 12:1113 (1994). Ver figura
2 en el presente documento. No se mejoró significativamente la
recuperación de producto incluso cuando se utilizaron las técnicas
clásicas de adición de EDTA y lisozima-HEW.
Si bien la lisozima-HEW es la
única lisozima comercial que resulta práctica para los
procedimientos a gran escala, la lisozima es expresada por
bacteriófagos al infectar las células huésped. La lisis de
E.coli, un huésped natural para los bacteriófagos, por
ejemplo los fagos T4, requiere la acción de dos productos génicos:
e y t. El gen e codifica una lisozima (llamada
lisozima-T4, por el fago T4) que ha sido
identificada como una muramidasa (Tsugita y Inouye,
J.Biol.Chem., 243:391 (1968)), mientras que el gen t parece
que es necesario para la lisis, pero no parece tener actividad de
lisozima. El gen t es necesario para detener el metabolismo celular
que ocurre durante la lisis (Mukai et al., Vir.,
33:398 (1967)) y se cree que degrada o altera la membrana
citoplasmática, permitiendo, de esta manera, que el producto del gen
e alcance el periplasma y tenga acceso a la pared celular (Josslin,
Vir., 40:719 (1970)). Los fagos son formados por mutantes gen
t^{-}, pero la lisis del huésped E.coli no ocurre excepto
por adición de cloroformo (Josslin, supra). La actividad
lisozima-T4 de tipo salvaje es la que primero se
detecta, aproximadamente ocho minutos después de la infección de T4
a 37ºC, y aumenta durante el resto de la infección, incluso si se
reduce la inhibición de lisis. En ausencia de adsorción secundaria,
las células infectadas por mutantes de gen e detienen la producción
de progenie y su metabolismo en el tiempo normal, pero no lisan
(Molecular Genetics of Bacteriophage T4, J.D. Karam, editor
jefe (American Society for Microbiology, Washington DC, ASM Press,
1994), página 398).
Se dio a conocer la recuperación de
IGF-I insoluble utilizando
lisozima-T4 el 28 de octubre de 1997 en la
"Separation Technology VII meeting entitled ``Separations for
Clean Production''" en Davos, Suiza, patrocinado por la
Engineering Foundation.
Tras la lisis celular, el ADN genómico se escapa
del citoplasma al medio y resulta en un incremento significativo en
la viscosidad del líquido que puede impedir la sedimentación de
sólidos en el campo centrífugo. En ausencia de fuerzas
friccionales, tal como las ejercidas durante la disrupción mecánica
para romper los polímeros de ADN, la tasa de sedimentación de
sólidos más lenta en el líquido viscoso resulta en una separación
pobre de sólidos y líquido durante la centrifugación. Aparte de
fuerza mecánica friccional, existen enzimas nucleolíticos que
degradan el polímero de ADN.
En E.coli, el gen endA endógeno codifica
una endonucleasa (peso molecular de la proteína madura es de,
aproximadamente, 24,5 kD) que normalmente es segregada al periplasma
y corta ADN en oligodesoxirribonucleótidos de una manera
endonucleolítica. Se ha sugerido que endA es expresado de manera
relativamente débil por E.coli (Wackernagel et al.,
Gene, 154:55-59 (1995)).
Para controlar el coste de los materiales y
minimizar el tiempo de procesamiento, existe una necesidad
continuada de incrementar la recuperación total de polipéptido
heterólogo de las células. A grandes escalas, existe un incentivo
significativo de evitar la rotura mecánica de las células para
liberar los polipéptidos recombinantes solubles o agregados de los
compartimientos citoplasmático y periplasmático y para preparar el
lisado para la recuperación eficiente de producto en la etapa
posterior.
De acuerdo con lo anterior, la presente
invención da a conocer un procedimiento que utiliza la disrupción
bioquímica para recuperar productos heterólogos solubles e
insolubles de las células bacterianas.
Dicho procedimiento comprende:
- (a)
- cultivar las células, que comprenden
- \quad
- un primer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo y una secuencia de señal para la secreción del polipéptido heterólogo, estando dicho primer ácido nucleico unido a un primer promotor inducible,
- \quad
- un segundo ácido nucleico que codifica la lisozima de fago,
- \quad
- y un tercer ácido nucleico que codifica una proteína que muestra la actividad de digestión de ADN bajo el control de una secuencia de señal para la secreción de la proteína digestora de ADN,
- \quad
- en el que dichos segundo y tercer ácidos nucleicos están unidos funcionalmente a un segundo promotor que es el mismo para ambos y en el que ambos están unidos en el mismo constructo de ácido nucleico, y en el que el segundo promotor es
- (i)
- inducible o
- (ii)
- un promotor constitutivo débil o un promotor con un nivel basal bajo que no requiere la adición de un inductor para funcionar como un promotor,
- \quad
- y en el que el primer promotor inducible y el segundo promotor son diferentes entre sí y, cuando el segundo promotor es un promotor inducible, responden a diferentes inductores;
- (b)
- añadir un inductor específico para la inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo a partir del primer promotor inducible,
- (c)
- únicamente cuando el cultivo es mediante (a) (i) anteriores, añadir un segundo inductor específico para el segundo promotor inducible tras la acumulación de aproximadamente 50% o más de la acumulación máxima del polipéptido heterólogo que se debe recuperar,
- (d)
- lisar las células, y
- (e)
- recuperar el polipéptido heterólogo acumulado a partir del caldo lisado.
La lisis bioquímica o lisis mecánica asistida
bioquímicamente es superior a la disrupción mecánica en la
recuperación de polipéptidos heterólogos de células bacterianas. La
expresión coordinada de ácido nucleico que codifica lisozima de
fago y proteína de digestión de ADN, y de ácido nucleico que
codifica el polipéptido heterólogo de interés, proporciona un
método altamente efectivo para liberar los polipéptidos insolubles o
solubles enredados con la capa de peptidoglicano, así como para
liberar producto atrapado en el citoplasma. Cuando se clona el gen
de lisozima de fago detrás de un promotor de control estricto, por
ejemplo, el promotor pBAD (también denominado promotor ara), puede
inducirse la acumulación citoplasmática de lisozima de fago mediante
la adición de un inductor (tal como arabinosa) en un momento
apropiado cerca del final de la fermentación. Al colocar bajo
control de promotores separados la expresión de los ácidos nucleicos
en polipéptidos heterólogos y en enzimas líticos, uno puede regular
de manera independiente su producción durante la fermentación. Sin
una secuencia de señal, el lisozima de fago acumulado se encuentra
estrictamente encerrado en el compartimiento citoplasmático.
Además, el pH óptimo para la actividad de lisozima de fago T4, la
cual es una realización preferida, es aproximadamente 7,3, que es
aproximadamente el pH neutro para la mayoría de caldos de
cultivo.
La inducción de los genes que codifican la
lisozima de bacteriófago y la proteína de digestión del ADN, tras
la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo, resulta en la recuperación en cantidad significativa
del citoplasma o periplasma de las bacterias. Además del rendimiento
de producto, el éxito de un procedimiento de recuperación se valora
a partir de la simplicidad de la operación, flujo del procedimiento,
y duración del ciclo, así como el coste de la operación. La
presente invención mitiga varios, si no todos, estos cuellos de
botella durante el procedimiento de recuperación a gran escala.
El procedimiento en el presente documento
también permite la utilización de lisis bioquímica de la célula a
elevada densidad celular y escala incrementada. A densidad elevada,
la expresión excesiva de lisozima de T4, y endA podría tener
resultados desastrosos, tal como la lisis celular prematura y la
reducción en la producción de polipéptido heterólogo. Además, no
sería de esperar que la inducción al final de un largo proceso de
fermentación, y tras una acumulación sustancial de producto,
produjese suficientes enzimas líticos para ser efectivo. El
presente procedimiento no plantea problemas a elevadas densidades
celulares, tal como viscosidad incrementada y espumación excesiva
durante el proceso de fermentación. Se espera que el procedimiento
en el presente documento permitirá conseguir elevada densidad
celular, inducción y acción efectiva del sistema, y el procesamiento
de lisados de caldos derivados de cultivos de elevada densidad.
La figura 1 muestra un diagrama esquemático de
cómo se dispone un producto polipeptídico en el citoplasma y en el
periplasma, es decir, si forma un agregado, fragmento proteolítico,
o polipéptido soluble plegado.
La figura 2 muestra la recuperación de agregado
IGF-I del sobrenadante y pellet mediante el
procedimiento típico de aislamiento que implica la disrupción
mecánica celular seguida de centrifugación, tras tres pasadas por
el homogeneizador Gaulin.
La figura 3 muestra un mapa del plásmido pS1130,
un plásmido de expresión para el precursor de la cremallera de
rhuMAb CD18 F(ab')_{2}-leucina (también
denominado en el presente documento fragmento de anticuerpo
anti-CD18).
Las figuras 4A-4B muestran la
secuencia del cassette de expresión de pS1130 (SEC ID nº:1 y
nº:2).
La figura 5 muestra la construcción del plásmido
pJJ154, utilizado para co-expresar el lisozima y
endA de T4 (ADNasa de E.coli).
La figura 6 muestra un mapa del plásmido
pLBIGF57, utilizado para expresar IGF-I.
La figura 7 muestra la construcción del plásmido
pJJ155, utilizado para expresar el lisozima, endA, y gen t de T4,
construido a partir de pJJ154.
La figura 8 muestra un esquema del sistema de
dos plásmidos para la co-expresión de la lisozima de
T4, una lisozima preferente de fago, endA, una proteína digestora
preferente de ADN, y el gen t (pJJ155) con ácido nucleico
codificante de IGF-I de acuerdo con un ejemplo de la
presente invención.
Las figuras 9A-9E dan a conocer
fotografías de microscopía de contraste de fases del caldo de
cultivo y pellets resuspendidos procedentes de la centrifugación de
caldo de fermentación con y sin co-expresión de
lisozima, endA y gen t de T4, antes y después de la adición de
EDTA. Específicamente, las fotografías muestran el pellet
resuspendido procedente de la centrifugación de caldo de control,
sin co-expresión de enzima lítico, antes y después
de la adición de EDTA, respectivamente (figuras 9A y 9B), el caldo
completo no diluido de recolección de la fermentación resultante de
la co-expresión de IGF-I con los
tres enzimas líticos, lisozima, endA y gen t de T4 (figura 9C), el
pellet resuspendido procedente de la centrifugación de caldo de
recolección con co-expresión de
IGF-I con los tres enzimas líticos y sin adición de
EDTA (figura 9D), y el pellet resuspendido procedente de la
centrifugación de caldo de recolección con
co-expresión de IGF-I, con los tres
enzimas líticos y con adición de EDTA (figura 9E).
Las figuras 10A y 10B muestran, respectivamente,
la cuantificación de ácidos nucleicos en el sobrenadante y pellet
mediante determinación de la DO_{260} de E.coli que expresa
IGF-I con co-expresión de los tres
enzimas líticos frente al control, y proteína total en el
sobrenadante y pellet de E.coli que expresan
IGF-I, con co-expresión de los tres
enzimas líticos frente al control de no
co-expresión.
La figura 11 muestra la recuperación de producto
IGF-I mediante centrifugación utilizando tres
enzimas líticos frente al caldo de control sin lisis a varias
velocidades de centrifugación.
La figura 12 muestra la recuperación de sólidos
durante la centrifugación utilizando tres enzimas líticos
co-expresados con IGF-I frente al
caldo control de no lisis para varias velocidades de
centrifugación.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"lisozima de fago" se refiere a un enzima citoplasmático que
facilita la lisis de células bacterianas infectadas por fagos,
liberando de las mismas, partículas replicadas de fago. El lisozima
puede ser de cualquier origen bacteriófago, incluyendo los
bacteriófagos T7, T4, lambda y mu. De éstas, la lisozima preferente
en el presente documento es la lisozima de T4.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"lisozima-T4" o "proteína E" se refiere a
una muramidasa citoplasmática que facilita la lisis de células
bacterianas infectadas por fagos T4, liberando de esta manera
partículas replicadas de fago (Tsugita y Inouye,
J.Mol.Biol., 37:201-12 (1968); Tsugita y
Inouye, J.Biol.Chem., 243:391-97 (1968)).
Está codificado por el gen e del bacteriófago T4 e hidroliza los
enlaces entre los residuos de N-acetilglucosamina y
ácido N-acetilmurámico en la capa rígida de
peptidoglicano de la cubierta celular de E.coli. El enzima
es una cadena polipeptídica única de un peso molecular de 18,3 kDa.
Este enzima es aproximadamente 250 veces más activo que la
lisozima-HEW en su actividad contra el
peptidoglicano bacteriano (Matthews et al.,
J.Mol.Biol., 147:545-558 (1981)). El pH
óptimo para la actividad enzimática del lisozima de T4 es 7,3,
frente a 9 de la lisozima-HEW (The Worthington
Manual; páginas 219-221).
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"gen t" u "holin" se refieren a un gen lítico de
bacteriófago T4 que es necesario para la lisis pero que parece
tener actividad de lisozima. Ver también Molecular Genetics of
Bacteriophage T4, supra, páginas
398-399.
El término "proteína que muestra actividad
digestora de ADN" o "proteína de digestión de ADN" se
refiere a una proteína que digerirá ADN, tal como, por ejemplo,
ADNasa de mamífero o bacteriana. Preferentemente, la proteína
digestora de ADN es una ADNasa humana o endA bacteriana.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "enzimas líticos" se refiere colectivamente a por lo
menos lisozima de fago y proteína digestora de ADN; en su caso,
también se refiere a un producto génico de gen t de fago o
equivalente en combinación con lisozima y proteína digestora de ADN
de fago.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "agente que altera la pared celular externa" de las
bacterias se refiere a una molécula que incrementa la permeabilidad
de la pared celular externa de las bacterias, tal como agentes
quelantes, por ejemplo EDTA, y zwiteriones.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "bacterias" se refiere a cualquier bacteria que
produzca proteínas que sean transportadas al espacio
periplasmático. Generalmente, las bacterias, sean Gram positivas o
Gram negativas, tienen bajo control la expresión de las lisozimas y
nucleasas de fago de manera que sólo se expresan cerca del final de
la fermentación, una realización preferida, o se expresan a nivel
bajo durante la fermentación. La nucleasa es, en general,
relativamente estable cuando es secretada al periplasma o al medio.
El término "bacterias no sensibles térmicamente" se refiere a
cualquier bacteria que no es significativamente sensible a cambios
de temperatura. Una realización preferida en el presente documento
son bacterias que no son sensibles térmicamente. Las bacterias de
mayor preferencia en el presente documento son las bacterias Gram
negativas.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"tiempo suficiente para liberar el polipéptido contenido en el
citoplasma o periplasma" se refiere a una cantidad de tiempo
suficiente para permitir al lisozima digerir el peptidoglicano en
grado suficiente para liberar el polipéptido heterólogo agregado o
soluble, citoplasmático o periplasmático.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"secuencia de señal" o "polipéptido de señal" se refiere a
un péptido que puede ser utilizado para segregar el polipéptido o
proteína heteróloga que muestra actividad digestora de ADN hacia el
periplasma de las bacterias. Las señales para el polipéptido
heterólogo o proteína digestora de ADN pueden ser homólogos a la
bacteria, o pueden ser heterólogos, incluyendo señales nativas al
polipéptido heterólogo o proteína digestora de ADN que se está
produciendo en las bacterias.
Los promotores de la presente invención pueden
ser promotores "inducibles", es decir, promotores que dirigen
la transcripción a tasa incrementada o reducida tras la unión de un
factor transcripcional.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
promotor "con baja expresión basal" o un "promotor de baja
expresión basal" es un promotor que es ligeramente débil, es
decir, proporciona un nivel de expresión basal suficientemente bajo
para no afectar el crecimiento celular o acumulación de producto y
proporciona un nivel suficientemente bajo de promoción para no
resultar en la lisis celular prematura.
"Factores transcripcionales" tal como se
utiliza en la presente memoria incluye cualquier factor que pueda
unirse a un región reguladora o de control de un promotor y, de esta
manera, producir la transcripción. La síntesis o la capacidad de
unión al promotor de un factor transcripcional dentro de la célula
huésped puede controlarse mediante la exposición del huésped a un
"inductor", o eliminando un "represor" del medio de la
célula huésped. De acuerdo con esto, para regular la expresión de un
promotor inducible, se añade un inductor o se elimina un represor
del medio de crecimiento de la célula huésped.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "inducir la expresión" significa incrementar la cantidad
de transcripción de genes específicos mediante la exposición de las
células que contienen tales genes a un efector o inductor.
Un "inductor" es un agente químico o físico
que, al administrarlo a una población de células, incrementará la
cantidad de transcripción de genes específicos. Éstas habitualmente
son moléculas pequeñas cuyos efectos son específicos de operones o
grupos de genes particulares, y pueden incluir azúcares, alcohol,
iones metálicos, hormonas, calor, frío, y similares. Por ejemplo,
isopropiltio-\beta-galactosidasa
(IPTG) y lactosa son inductores del promotor tacII, y la
L-arabinosa es un inductor adecuado del promotor
arabinosa.
Un "represor" es un factor que conduce
directa o indirectamente al cese de la acción del promotor o reduce
ésta. Un ejemplo de un represor es fosfato. Al agotarse el represor
fosfato en el medio, el promotor fosfatasa alcalina (AP) es
inducido.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"polipéptido" o "polipéptido de interés" se refiere
generalmente a péptidos y proteínas con más de, aproximadamente,
diez aminoácidos. Los polipéptidos son "heterólogos", es
decir, foráneos a la célula huésped que se está utilizando, tal como
una proteína humana producida por E.coli. El polipéptido
puede producirse como agregado insoluble o como un polipéptido
soluble en el espacio periplasmático o citoplasma.
Entre los ejemplos de polipéptidos de mamífero
se incluyen moléculas tales como, por ejemplo, la renina, una
hormona del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento
humana; la hormona del crecimiento bovina; el factor de liberación
de la hormona del crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona
estimulante del tiroides; lipoproteínas;
\alpha1-antitripsina; cadena A de la insulina; la
cadena B de la insulina; proinsulina; trombopoyetina; hormona
folículo-estimulante; calcitonina; hormona
luteinizante; glucagón; factores de coagulación tal como el factor
VIIIC, factor IX, factor tisular, y factor de von Willebrands;
factores de anti-coagulación, tal como la Proteína
C; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; un activador
plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador
plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina;
trombina; factor del crecimiento hematopoyético; factor alfa y beta
del tumor necrótico; encefalinasa, una albúmina sérica tal como la
albúmina de suero humana; sustancia inhibidora mulleriana; relaxina
cadena A; relaxina cadena B; prorrelaxina; péptido asociado a
gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como la
beta-lactamasa; ADNasa; inhibina; activina; factor
de crecimiento vascular endotelial (VEGF); receptores de hormonas o
de factores del crecimiento; integrina; proteína A ó D; factores
reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ó
6 (NT-3, NT-4, NT-5,
ó NT-6), o un factor del crecimiento nervioso tal
como NGF-\beta; cardiotrofinas (factor de la
hipertrofia cardíaca) tal como cardiotrofina-1
(CT-1); factor del crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF); factor del crecimiento fibroblástico, tal como aFGF y bFGF;
factor del crecimiento epidérmico (EGF); factor del crecimiento
transformante (TGF), tal como TGF-alfa y
TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1,
TGF-\beta2, TGF-\beta3,
TGF-\beta4 ó TGF-\beta5;
factor-I y factor-II de crecimiento
similar a insulina (IGF-I y IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor del
crecimiento similar a insulina; proteínas CD, tal como
CD-3, CD-4, CD-8, y
CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores;
inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón
tal como interferón-alfa, beta y gamma; factores
estimulantes de colonia (CSF), por ejemplo, M-CSF,
GM-CSF y G-CSF; interleuquinas (IL),
por ejemplo, IL-1 a IL-10;
anticuerpo anti-HER-2; superóxido
dismutasa; receptores de células T; proteínas membranales de
superficie; factor acelerador de la degeneración; antígeno viral
tal como, por ejemplo, una parte de la cubierta de HIV; proteínas de
transporte; receptores de tráfico celular; adresinas; proteínas
reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los
polipéptidos anteriormente mencionados.
Los polipéptidos exógenos preferentes de interés
so polipéptidos de mamífero, con la mayor preferencia polipéptidos
humanos. Entre los ejemplos de tales polipéptidos de mamífero se
incluyen t-PA, VEGF, gp120,
anti-HER-2,
anti-CD11a, anti-CD18, ADNasa,
IGF-I, IGF-II, IGF-I
cerebral, hormona del crecimiento, cadenas de relaxina, factor de
liberación de hormona del crecimiento, cadenas de insulina o
proinsulina, uroquinasa, inmunotoxinas, neurotrofinas, y antígenos.
Entre los polipéptidos de mamífero particularmente preferentes se
incluyen, por ejemplo, IGF-I, ADNasa, ó VEGF, con
la mayor preferencia, IGF-I, si el polipéptido es
producido como un agregado insoluble en el periplasma, y
anticuerpos anti-CD18 o fragmentos de los mismos,
tal como fragmentos de anti-CD18 recombinante
humano Fab, Fab' y (Fab')_{2}, si el polipéptido es producido en
una forma soluble en el periplasma.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"IGF-I" se refiere a factor del crecimiento
similar a insulina de cualquier especie, incluyendo bovina, ovina,
porcina, equina, y preferentemente humana, en secuencia nativa o en
forma variante y producida por recombinación. En un método
preferente, el IGF-I se clona y su ADN se expresa,
por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en la patente nº EP
128.733 publicada el 19 de diciembre de 1984.
La expresión "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped
particular. Las secuencias de control que son adecuadas para
bacterias incluyen un promotor tal como el promotor fosfatasa
alcalina, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de
unión del ribosoma.
Un ácido nucleico está "operativamente
unido" cuando se sitúa en una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una
pre-secuencia o líder secretorio está operativamente
unido a ADN para un polipéptido heterólogo si se expresa como una
preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia
codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un
sitio de unión del ribosoma está operativamente unido a una
secuencia codificante si está situada de manera que facilite la
traducción. En general, "operativamente unido" significa que
las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas y, en el
caso de un líder secretorio, son contiguas y están dentro del marco
de lectura. El unido se consigue por ligación en sitios de
restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se utilizan
adaptores oligonucleotídicos sintéticos o conectores de acuerdo con
la práctica convencional.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las
expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo
celular" se utilizan intercambiablemente, y todas tales
designaciones incluyen la progenie. De esta manera, las palabras
"transformantes" y "células transformadas" incluyen las
células primarias, y los cultivos derivados de las mismas, sin
importar el número de transferencias. También se entiende que toda
la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN,
debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la
progenie mutante con la misma función o actividad biológica según
se ha explorado en la célula originariamente transformada. Cuando
se pretendan denominaciones diferentes, resultarán evidente a partir
del contexto.
La invención proporciona un procedimiento de
recuperación de un polipéptido heterólogo, soluble o insoluble, de
células bacterianas en las que es producido. Este procedimiento
implica, en una primera etapa, el cultivo de células bacterianas,
las cuales comprenden ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo, cuyo ácido nucleico está unido a un primer promotor, y
ácido nucleico que codifica los enzimas líticos, en las que estos
ácidos nucleicos están unidos a un segundo promotor inducible.
El cultivo tiene lugar bajo condiciones en las
que la expresión de los ácidos nucleicos que codifican los enzimas
líticos, cuando son inducidos, comienza después de que se haya
acumulado aproximadamente 50% ó más de polipéptido heterólogo, y
bajo condiciones en las que la lisozima de fago se acumula en un
compartimiento citoplasmático y la proteína digestora de ADN es
secretada hacia el compartimiento periplasmático.
En el procedimiento en la presente memoria,
resulta preferida la inducción de los promotores; sin embargo, el
procedimiento también contempla la utilización de un promotor para
el lisozima de fago y proteína digestora de ADN que es un promotor
de baja expresión basal (ligeramente débil), de manera que no se
lleva a cabo inducción alguna. Este tipo de promotor tiene una
debilidad suficientemente baja para no resultar en la lisis celular
prematura y resulta en un nivel de expresión basal suficientemente
bajo para no afectar al crecimiento celular o acumulación de
producto.
En una segunda etapa, se recupera de las células
bacterianas el polipéptido heterólogo acumulado. Puede añadirse un
agente que incremente la permeabilidad de la pared celular externa
de las células bacterianas, según se describe en detalle
posteriormente, antes de llevar a cabo la etapa de recuperación. La
necesidad de alterar mecánicamente las células para liberar la
lisozima de fago se ve reducida o completamente eliminada. En una
realización preferida, tras la expresión de los enzimas líticos, las
células se incuban durante un tiempo suficiente para liberar el
polipéptido heterólogo contenido en el citoplasma o en el
periplasma.
Si bien el procedimiento puede aplicarse a la
recuperación de agregados insolubles, tal como
IGF-I, VEGF, y ADNasa por sedimentación del
producto, también es aplicable a polipéptidos heterólogos que son
solubles en el citoplasma o en el periplasma, tal como, por
ejemplo, fragmentos de anticuerpo anti-CD18. Entre
las ventajas de la recuperación de polipéptidos heterólogos
solubles por lisis celular bioquímica se incluyen la prevención o
reducción de la necesidad de lisis mecánica, evitando de esta manera
la pérdida de proteínas lábiles térmicamente, y obteniendo una
viscosidad del líquido baja y consistente, compatible con
procedimientos de recuperación corriente abajo, tal como la
tecnología de adsorción de lecho expandido y la centrifugación.
La cromatografía de adsorción de lecho expandido
(EBA), descrita, por ejemplo, en "Expanded Bed Adsorption:
Principles and Methods", Pharmacia Biotech, ISBN
91-630-5519-8), es
útil para la recuperación inicial de proteínas diana de carga de
alimentación o cultivos celulares crudos. Las etapas de
procedimiento de clarificación, concentración, y purificación
inicial pueden combinarse en una operación de unidad única,
mejorando la economía del procedimiento debido al número reducido
de etapas, incrementando el rendimiento, tiempo de procesamiento
global más corto, menores costes laborales, y costes reducidos. En
la cromatografía EBA se expande un adsorbente y se equilibra
mediante la aplicación de un flujo de líquido hacia arriba en la
columna. Se forma un lecho fluidizado estable cuando las partículas
adsorbentes se encuentran suspendidas en el equilibrio debido al
equilibrio entre la velocidad de sedimentación de las partículas y
la velocidad de flujo hacia arriba del líquido. Se aplica al lecho
expandido una mezcla celular o caldo lisado crudo con un flujo hacia
arriba. Las proteínas diana se unen al adsorbente, mientras que los
residuos celulares y otros contaminantes pasan a través sin
dificultad. El material unido débilmente se lava del lecho expandido
utilizando un flujo hacia arriba de un tampón de lavado. A
continuación, se detiene el flujo y se permite que el adsorbente se
deposite en la columna. A continuación, se baja el adaptador de la
columna a la superficie del lecho sedimentado. Se revierte el flujo
y las proteínas capturadas se eluyen del lecho sedimentado
utilizando un tampón apropiado. El eluido consiste en la proteína
diana en un volumen reducido de pool eluido, purificado parcialmente
en preparación de la cromatografía de lecho empaquetado
(Pharmacia Biotech, supra). En la EBA, en la que el
lisado celular completo que contiene el producto soluble se bombea
hacia arriba a través de la columna, la proteína se adsorbe sobre
una resina (lecho fluidizado), y los residuos celulares fluyen a
través y se eluyen, se hace uso de solamente una etapa de
cromatografía, ahorrando de esta manera una etapa.
En el procedimiento anterior, mientras que la
secuencia de señal para la proteína digestora de ADN puede ser
cualquier secuencia, preferentemente es una secuencia nativa de la
proteína digestora de ADN. Además, en una realización preferida, la
proteína digestora de ADN es ADNasa o es bacteriana, por ejemplo,
producto endA de E.coli.
En una forma de realización preferida, la etapa
de cultivo tiene lugar bajo condiciones de elevada densidad
celular, es decir, generalmente a una densidad celular de,
aproximadamente, 15 a 150 g peso seco/litro, preferentemente por lo
menos, aproximadamente, 40, con mayor preferencia, aproximadamente
40-150, con la mayor preferencia, aproximadamente
40 a 100. En densidad óptica, 120 DO_{550} (A_{550}) es,
aproximadamente, 50 g peso seco/litro. Además, el cultivo puede
conseguirse utilizando cualquier escala, incluso escalas muy grandes
de 100.000 litros. Preferentemente, la escala es de,
aproximadamente, 100 litros o mayor, con mayor preferencia de por lo
menos, aproximadamente, 500 litros, y con la mayor preferencia,
aproximadamente entre 500 litros y 100.000 litros.
Los ácidos nucleicos que codifican los enzimas
líticos están unidos a un promotor, es decir, colocados en tándem,
como introduciendo un conector entre los ácidos nucleicos. El
promotor para la expresión del polipéptido heterólogo es diferente
del utilizado para los enzimas líticos, de manera que uno es
inducido antes que el otro. Si bien los promotores puede ser
cualquier promotor adecuado para este fin, preferentemente, los
promotores para los enzimas líticos, con o sin gen t, y polipéptido
heterólogo son, respectivamente, promotor arabinosa, y promotor
fosfatasa alcalina.
Los promotores para el polipéptido heterólogo y
para los enzimas líticos en la presente memoria deben ser
diferentes, de manera que la expresión codificada en ácido nucleico
del polipéptido heterólogo se induzca antes de la expresión de los
enzimas líticos codificados en ácido nucleico, o a un nivel mucho
más alto, cuando los promotores son inducibles. Si bien los
promotores pueden ser cualquier promotor adecuado para este fin,
preferentemente, los promotores para la lisozima de fago y el
polipéptido heterólogo son, respectivamente, el promotor arabinosa
y el promotor fosfatasa alcalina. Alternativamente, la
compartimentalización de la lisozima de fago y la proteína
digestora de ADN puede permitir la utilización de un promotor con
baja expresión basal para la expresión del ácido nucleico que
codifica la lisozima de fago y la proteína digestora de ADN. Si se
utiliza un promotor con baja expresión basal, tal como arabinosa, y
no el promotor tac o el promotor trp, entonces no se
requiere una etapa activa de inducción.
La inducción de la expresión del ácido nucleico
que codifica los enzimas líticos se lleva a cabo preferentemente
mediante la adición de un inductor al medio de cultivo. Si bien, en
este aspecto, los inductores para los promotores pueden añadirse en
cualquier cantidad, preferentemente si el inductor es arabinosa, se
añade en una cantidad de, aproximadamente, 0-1% en
peso, y si se añade inductor, 0,1-1% en peso.
En el procedimiento descrito anteriormente,
típicamente se introducen los elementos de expresión en las células
por transformación, pero también pueden integrarse en el genoma o
cromosoma de las células junto con sus regiones promotoras. Esto es
aplicable a cualquiera de los enzimas líticos o al gen del
polipéptido heterólogo. Las células bacterianas pueden
transformarse con uno o más vectores de expresión que contengan el
ácido nucleico que codifica los enzimas líticos, y el ácido
nucleico que codifica el polipéptido heterólogo. En una realización
como ésta, las células bacterianas son transformadas con dos
vectores que contienen, respectivamente, el ácido nucleico que
codifica los enzimas líticos y el ácido nucleico que codifica el
polipéptido heterólogo. En otra realización, el ácido nucleico que
codifica los enzimas líticos y el ácido nucleico que codifica el
polipéptido heterólogo se introducen en un solo vector con el que
se transforman las células bacterianas. En otra forma de
realización específica que puede ser preferente, la lisozima de fago
y enzima de fago digestor de ADN se introducen en un plásmido para
asegurar un elevado número de copias.
En la primera etapa del procedimiento anterior,
el ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, cADN o ADN genómico) se
inserta adecuadamente en un vector replicable para su expresión en
la bacteria bajo el control de un promotor adecuado para las
bacterias. Hay disponibilidad de muchos vectores para este fin, y la
selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño
del ácido nucleico a insertar en el vector y de la célula huésped
particular a transformar con el vector. Cada vector contiene
diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación del
ADN o expresión del ADN) y de la célula huésped particular con la
que es compatible. Los componentes vector para la transformación
bacteriana pueden incluir una secuencia de señal para el polipéptido
heterólogo e incluirán una secuencia de señal para la proteína
digestora de ADN, y también incluirán un promotor inducible para el
polipéptido heterólogo, y un promotor inducible o uno no inducible
con baja expresión basal para los otros enzimas líticos. También
incluyen generalmente un origen de replicación y uno o más genes
marcadores.
En general, los vectores plásmidos que contienen
replicón y secuencias de control que se derivan de especies
compatibles con la célula huésped se utilizan con huéspedes
bacterianos. El vector habitualmente lleva un sitio de replicación,
así como secuencias marcadoras que pueden permitir la selección
fenotípica de células transformadas. Por ejemplo, E.coli se
transforma típicamente con pBR322, un plásmido derivado de una
especie de E.coli. Ver, por ejemplo, Bolivar et al.,
Gene, 2:95 (1977). pBR322 contiene genes que confieren
resistencia a la ampicilina y tetraciclina y, de esta manera,
proporcionan un medio fácil de identificar las células
transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiana o
fago, también contiene generalmente, o se modifica para que
contenga, promotores que pueden ser utilizados por el organismo
bacteriana para expresar los genes marcadores seleccionables.
Si el polipéptido heterólogo debe secretarse, el
ADN codificante del polipéptido heterólogo de interés en el
presente documento contiene una secuencia de señal, por ejemplo una
en el extremo N-terminal del polipéptido heterólogo
maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente
del vector, o puede ser una parte del ADN insertado en el vector
que codifica el polipéptido heterólogo. La secuencia de señal
heteróloga seleccionada debería ser una secuencia que sea
reconocida y procesada (es decir, cortada mediante una peptidasa de
señal) por la célula huésped. Para las células huésped bacterianas
que no reconocen y procesan la secuencia de señal polipéptido
heterólogo nativo, la secuencia de señal se sustituye por una
secuencia bacteriana de señal seleccionada, por ejemplo entre el
grupo que consiste en los líderes fosfatasa alcalina, penicilasa,
lpp, o enterotoxina termoestable II.
Los vectores de expresión contienen una
secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una
o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien
conocidas en una diversidad de bacterias. El origen de replicación
del plásmido pBR322 es adecuada para la mayoría de bacterias
Gram-negativas.
Los vectores de expresión contienen asimismo
generalmente un gen de selección, también denominado un marcador
seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la
supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas
cultivadas en un medio selectivo de cultivo. Las células no
transformadas con el vector que contiene el gen de selección no
sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos
codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u
otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o
tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c)
suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos,
por ejemplo, el gen que codifica la
D-alanina-racemasa para
Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un
fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas
células que son trasnformadas con éxito con un gen heterólogo,
producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, de
esta manera, sobreviven el régimen de selección.
El vector de expresión para producir un
polipéptido heterólogo también contiene un promotor inducible que
es reconocido por el organismo huésped bacteriana y está
operativamente unido al ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo de interés. También contiene un promotor separado
inducible o de basa expresión basal, que está operativamente unido
al ácido nucleico que codifica los enzimas líticos. Entre los
promotores inducibles adecuados para su utilización con huéspedes
bacterianos se incluyen los sistemas
\beta-lactamasa y promotor lactosa (Chang et
al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,
Nature, 281:544 (1979)), el sistema promotor arabinosa,
incluyendo el promotor araBAD (Guzman et al.,
J.Bacteriol., 174:7716-7728 (1992); Guzman
et al., J.Bacteriol., 177:4121-4130
(1995); Siegele y Hu, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
94:8168-8172 (1997)), el promotor ramnosa (Haldimann
et al., J.Bacteriol., 180:1277-1286
(1998)), el promotor fosfatasa alcalina, un sistema promotor
triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057
(1980), y patente nº EP 36.776), los promotores
P_{Ltet0-1} y P_{lac/ara-1}
(Lutz y Bujard, Nucleic Acids Res.,
25:1203-1210 (1997)), y promotores híbridos, tal
como el promotor tac, deBoer et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80:21-25 (1983). Sin
embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos,
inducibles y de baja expresión basal. Sus secuencias nucleotídicas
han sido publicadas, permitiendo a un experto, de esta manera,
ligarlos operativamente a ADN codificante del polipéptido heterólogo
de interés, o a los ácidos nucleicos que codifican los enzimas
líticos (Siebenlist et al., Cell, 20:269 (1980))
utilizando conectores o adaptadores para suministrar cualquier
sitio de restricción requerido. Si se utiliza un promotor fuerte y
altamente "leaky", tal como el promotor trp, se utiliza
generalmente sólo para la expresión del ácido nucleico que codifica
el polipéptido heterólogo y no para el ácido nucleico que codifica
los enzimas líticos. Los promotores tac y P_{L} podrían
utilizarse para uno entre el polipéptido heterólogo y los enzimas
líticos, pero no para ambos, aunque no son preferentes. Son
preferentes el promotor fosfatasa alcalina para el producto, y el
promotor arabinosa para los enzimas líticos.
Los promotores de uso en sistemas bacterianos
también contienen generalmente una secuencia
Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN
que codifica el polipéptido heterólogo de interés. El promotor puede
ser eliminado del ADN de origen bacteriano mediante digestión con
enzima de restricción e insertado en el vector que contiene el ADN
deseado. El promotor phoA puede ser eliminado del ADN de
origen bacteriano mediante digestión con enzima de restricción e
insertado en el vector que contiene el ADN deseado.
La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de los componentes anteriormente mencionados
utiliza técnicas de ligación estándares. Los plásmidos o fragmentos
de ADN aislados se cortan, adaptan, y re-ligan en
la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.
Para el análisis de confirmación de las
secuencias correctas en los plásmidos construidos, se utilizan las
mezclas de ligación para transformar E.coli K12 cepa 294
(ATCC nº 31.446), u otras cepas, y se seleccionan los
transformantes exitosos utilizando la resistencia a la ampicilina o
tetraciclina según el caso. Se preparan plásmidos a partir de los
transformantes, se analizan mediante digestión de endonucleasa de
restricción, y/o se secuencian mediante el método de Sanger et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463-5467
(1977), o de Messing et al., Nucleic Acids Res.,
9:309 (1981), o mediante el método de Maxam et al.,
Methods in Enzymology, 65:499 (1980).
Entre las bacterias adecuadas para este fin se
incluyen las arqueobacterias y eubacterias, especialmente las
eubacterias, con mayor preferencia las bacterias
Gram-negativas, y con la mayor preferencia, las
Enterobacteriaceae. Entre los ejemplos de bacterias útiles
se incluyen Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia,
Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia,
Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, y Paracoccus. Entre
los huéspedes E.coli se incluyen E.coli W3110 (ATCC nº
27.325), E.coli 294 (ATCC nº 31.446), E.coli B, y
E.coli X1776 (ATCC nº 31.537). Estos ejemplos son
ilustrativos y no limitativos. También pueden utilizarse células
mutantes de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas.
Evidentemente es necesario seleccionar las bacterias apropiadas
teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de
una bacteria. Por ejemplo, las especies de E.coli, Serratia,
o Salmonella pueden ser utilizadas adecuadamente como
huésped cuando se utilicen plásmidos bien conocidos, tal como
pBR322, pBR325, pACYC177, ó pKN410 para suministra el replicón.
E.coli cepa W3110 es un huésped
preferente porque es una cepa huésped común para las fermentaciones
de productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula
huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas
proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para
producir una mutación genética en los genes que codifican
proteínas. Ejemplos de tales huéspedes incluyen E.coli W3110
cepa 1A2, la cual tiene el genotipo completo tonA\Delta (también
conocido como \DeltafhuA); E.coli W3110 cepa 9E4, la
cual tiene el genotipo completo tonA\Delta ptr3;
E.coli W3110 cepa 27C7 (ATCC nº 55.244), la cual tiene el
genotipo completo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15
\Delta(argF-lac)169 ompT\Delta
degp41kan^{r}; E.coli W3110 cepa 37D6, la cual tiene
el genotipo completo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15
\Delta(argF-lac)169 ompT\Delta
degP41kan^{r} rbs7\Delta ilvG; E.coli W3310 cepa
40B4, la cual es la cepa 37D6 con una mutación por deleción
degP de no resistencia a la canamicina; E.coli W3110
cepa 33D3, la cual tiene el genotipo completo tonA prt3 lacIq
LacL8 ompT degP kan^{r}; E.coli W3110 cepa 36F8, la
cual tiene el genotipo completo tonA phoA
\Delta(argF-lac) ptr3 degP kan^{R}
ilvG+, y es termo-resistente a 37ºC;
E.coli W3110 cepa 45F8, la cual tiene el genotipo completo
fhuA(tonA) \Delta(argF-lac) ptr3
degP41 (kanS) \Deltaomp\Delta(nmpc-fepE)
ilvG+ phoA+ phoS*(T10Y); E.coli W3110 cepa 33B8, la cual
tiene el genotipo completo tonA phoA
\Delta(argF-lac) 189 deoC degP
IlvG+(kanS); E.coli W3110 cepa 43E7, la cual tiene el
genotipo completo fhuA(tonA)
\Delta(argF-lac) ptr3 degP41(kanS)
\Deltaompt\Delta(nmpc-fepE) ilvG+
phoA+; y una cepa de E.coli con la o las proteasas
periplasmáticas mutantes que se dan a conocer en la patente US nº
4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990.
Las células huésped se transforman con los
vectores de expresión anteriormente descritos de la presente
invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales,
modificados según resulte apropiado para inducir los diversos
promotores si se lleva a cabo inducción.
Transformación significa introducir ADN en un
organismo de manera que el ADN sea replicable, bien como elemento
extracromosómico, bien como parte integrante de un cromosoma.
Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se
lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para tales
células. Generalmente, se utiliza el tratamiento con calcio, con
cloruro de calcio, según se describe en la sección 1.82 de Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), para células
bacterianas que contengan barreras sustanciales de pared celular.
Otro método de transformación utiliza polietilenglicol/DMSO, según
se describe en Chung y Miller, Nucleic Acids Res., 16:3580
(1988). Aunque otro método es utilizar la técnica denominada
electroporación.
Las células bacterianas utilizadas para producir
el polipéptido heterólogo de interés descrito en la presente
invención, se cultivan en medios adecuados en los que pueden
inducirse los promotores como se describe generalmente en, por
ejemplo, Sambrook et al., supra.
También puede incluirse cualquier otro
suplemento necesario, aparte de las fuentes de carbono, nitrógeno,
y fósforo inorgánico, en concentraciones apropiadas, solos o en
mezclas con otro suplemento o medio, tal como una fuente compleja
de nitrógeno. El pH del medio puede ser cualquier pH en el intervalo
aproximado 5-9, dependiendo, principalmente, del
organismo huésped.
Para la inducción, típicamente las células se
cultivan hasta alcanzar una densidad óptica determinada, por
ejemplo, una A_{550} de, aproximadamente, 80-100,
en cuyo punto se inicia la inducción (por ejemplo, por adición de
un inductor, por agotamiento de un represor, supresor, o componente
del medio, etc.), para inducir la expresión del gen que codifica el
polipéptido heterólogo. Cuando se ha acumulado aproximadamente 50% ó
más del polipéptido heterólogo (según determina, por ejemplo, que
la densidad óptica alcance un cantidad-objetivo que
se ha observado en el pasado que se correlaciona con la acumulación
deseada de polipéptido heterólogo, por ejemplo, una A_{550} de,
aproximadamente, 120-140), se lleva a cabo la
inducción del promotor de los enzimas líticos. La inducción
típicamente tiene lugar en un momento en el tiempo después de la
inoculación de, aproximadamente, 75-90%, con
preferencia aproximadamente 80-90%, del tiempo total
del proceso de fermentación, según la experiencia y ensayos
anteriores. Por ejemplo, la inducción del promotor puede tener lugar
entre las 30 horas aproximadamente, con preferencia las 32 horas, y
hasta aproximadamente las 36 horas después de la inoculación, en un
proceso de fermentación de
40 horas.
40 horas.
La expresión génica puede medirse en una muestra
directamente, por ejemplo, mediante transferencia Northern
convencional, para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77:5201-5205
(1980)). Pueden utilizarse diversos marcajes, más habitualmente
radioisótopos, en particular ^{32}P. Sin embargo, también pueden
utilizarse otras técnicas, tal como la utilización de nucleótidos
modificados con biotina, para su introducción en un polinucleótido.
A continuación, la biotina sirve como sitio de unión para la
avidina o para anticuerpos, los cuales pueden marcarse con una
amplia variedad de marcajes, tal como con radionucleidos,
compuestos fluorescentes, enzimas, o similares.
Para la acumulación de un producto génico
expresado, se cultiva la célula huésped bajo condiciones suficientes
para la acumulación del producto génico. Tales condiciones
incluyen, por ejemplo, las condiciones de temperatura, nutrientes,
y densidad celular que permitan la expresión proteica y acumulación
por parte de la célula. Además, tales condiciones son aquéllas bajo
las que la célula puede llevar a cabo funciones celulares básicas de
transcripción, traducción y transporte de proteínas desde un
compartimiento celular hacia otro de las proteínas secretadas, como
son conocidas por los expertos en la materia.
Tras la acumulación de producto, cuando las
células han sido lisadas por los enzimas líticos expresados,
opcionalmente antes de la recuperación de producto, se incuba el
caldo de lisado durante un periodo de tiempo suficiente para
liberar el polipéptido heterólogo contenido en las células. Este
periodo de tiempo dependerá, por ejemplo, del tipo de polipéptido
heterólogo que se recupera y de la temperatura, pero preferentemente
estará comprendido entre, aproximadamente, 1 y 24 horas, más
preferiblemente entre 2 y 24 horas, y con la mayor preferencia,
entre 2 y 3 horas. Si se da la sobre-digestión con
el enzima, la mejora en la recuperación de producto no será tan
grande.
En la segunda etapa de la presente invención, el
polipéptido heterólogo, como producto soluble o insoluble liberado
de la matriz celular, se recupera del lisado, de una manera que
minimice la co-recuperación de residuos celulares
con el producto. La recuperación puede realizarse de cualquier
manera, pero preferentemente comprende la sedimentación de
partículas refráctiles que contienen el polipéptido heterólogo, o la
recolección de sobrenadante que contenga producto soluble. Un
ejemplo de sedimentación es la centrifugación. En este caso, la
recuperación tiene lugar, preferentemente, antes de la EBA o
sedimentación, en presencia de un agente que altere la pared
celular externa incrementando su permeabilidad y permitiendo una
mayor recuperación de sólidos. Entre los ejemplos de tales agentes
se incluyen un agente quelante, tal como EDTA, o un zwiterión, tal
como, por ejemplo, un detergente iónico dipolar, tal como el
detergente ZWITTERGENT 316^{TM}. Ver Stabel et al.,
supra. Con la mayor preferencia, la recuperación tiene lugar
en presencia de EDTA. Otra técnica de recuperación de producto
soluble es EBA, como se ha descrito anteriormente.
Si se utiliza la centrifugación para la
recuperación, la fuerza relativa de centrifugación (RCF) es un
factor importante. La RCF se ajusta para minimizar la
co-sedimentación de residuos celulares con las
partículas refráctiles liberadas de la pared celular con la lisis.
La RCF específica utilizada para este fin variará dependiendo, por
ejemplo, del tipo de producto a recuperar, pero es, preferentemente,
de por lo menos, aproximadamente, 3.000 x g, más preferentemente
de, aproximadamente, 3.500-6.000 x g, y con la mayor
preferencia de, aproximadamente, 4.000-6.000 x g.
En el caso de co-expresarse el gen t,
aproximadamente 6.000 rpm proporcionan una recuperación tan buena a
partir de partículas refráctiles del caldo lisado como a partir de
células intactas.
La duración de la centrifugación dependerá de
varios factores. La tasa de sedimentación dependerá de, por
ejemplo, el tamaño, forma, y densidad de la partícula refráctil y de
la densidad y viscosidad del líquido. El tiempo de sedimentación de
los sólidos dependerá, por ejemplo, de la distancia y tasa de
sedimentación. Es razonable esperar que las centrífugas continuas
de discos funcionarán bien para la recuperación de agregados de
polipéptido heterólogo liberado o para la eliminación de residuos
celulares a gran escala, ya que estas centrífugas pueden procesar a
elevadas velocidades de fluido debido a las relativamente grandes
fuerzas centrífugas y a la distancia relativamente pequeña de
sedimentación.
El polipéptido heterólogo capturado en la etapa
inicial de recuperación puede, a continuación, purificarse
adicionalmente separándolo de proteínas contaminantes. En una
realización preferida, se aislan los agregados de polipéptido
heterólogo, seguido de una solubilización simultánea y
re-plegamiento del polipéptido, según se da a
conocer en la patente nº 5.288.931. Alternativamente, se recupera el
producto soluble mediante técnicas estándar.
Los procedimientos siguientes son
ejemplificativos de los procedimientos de purificación adecuados
para el polipéptido heterólogo soluble liberado del periplasma o
del citoplasma: fraccionamiento de inmunoafinidad o columnas de
intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase reversa;
cromatografía en sílice o en resina de intercambio catiónico, tal
como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación
con sulfato amónico; y filtración en gel utilizando, por ejemplo,
SEPHADEX^{TM} G-75.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a título
ilustrativo, pero sin limitación.
rhuMAb CD18 es un fragmento recombinante de
anticuerpo F(ab')_{2} con dos cadenas ligeras de residuo
214 y dos cadenas pesadas de residuo 241. Se une al receptor
MAC-1 (CD11b/CD18), bloqueando eficazmente la unión
de neutrófilos al endotelio. En el proceso de fermentación descrito
posteriormente, se produce rhuMab CD18 como un precursor de la
cremallera de F(ab')_{2}-leucina en
E.coli y se secreta hacia el periplasma. El procedimiento
deseado de recuperación se concentra en la fracción soluble del
producto acumulado y depende de la cremallera de
F(ab')_{2}-leucina que se libera del
periplasma para su captura inicial.
Se introdujo la co-expresión de
lisozima-T4 para debilitar el sáculo de
peptidoglicano, y se introdujo la sobre-expresión
de proteína endA para degradar el ADN genómico liberado de las
células bajo condiciones tales que las células son permeabilizadas
o lisadas.
En E.coli, el gen endA codifica una
endonucleasa normalmente secretada hacia el periplasma, que corta
el ADN en oligodesoxirribonucleótidos de una manera
endonucleolítica. Se ha sugerido que endA es expresado de manera
relativamente débil por E.coli (Wackernagel et al.,
supra). Sin embargo, la endonucleasa podría
sobre-expresarse utilizando un plásmido compatible.
Mediante la inserción de gen endA con su secuencia de señal detrás
del cassette lisozima-T4-ara en el
plásmido compatible pJJ153, ahora pJJ154, se inducirá la expresión
de ambos la lisozima-T4 y la endonucleasa al añadir
arabinosa. Si bien la lisozima-T4 está encerrada en
el citoplasma, la endonucleasa se secreta hacia el espacio
periplasmático y se mantiene alejada del ADN genómico, situado en
el citoplasma durante el proceso de fermentación. Se espera que una
degradación enzimática efectiva del ADN tras la lisis celular,
reducirá o incluso eliminará las pasadas múltiples por el
dispositivo de disrupción mecánica, una operación con frecuencia
necesaria para ambas la disrupción celular y la reducción de la
viscosidad. El éxito en esto comportaría una reducción significativa
en tiempo y costes del procedimiento de recuperación.
Construcción del plásmido pS1130: Se
construyó el plásmido pS1130 (figura 3) para dirigir la producción
de precursor de cremallera de rhuMAb CD18
F(ab')_{2}-leucina en E.coli. Está
basado en el plásmido bien caracterizado pBR322, con un cassette de
expresión de 2138 pb (figura 4; SEC ID nº:1 y nº:2) insertado en el
sitio de restricción EcoRI. El plámido codifica la resistencia a
ambos los antibióticos tetraciclina y beta-lactama.
El cassette de expresión contiene copias únicas de cada gen unidas
en tándem. La transcripción de cada gen en un solo ARNm
dicistrónico está dirigida por el promotor phoA de
E.coli (Chang et al., Gene,
44:121-125 (1986)) y finaliza en el terminador
t_{0} del fago lambda (Scholtissek y Grosse, Nuc.Acids
Res., 15:3185 (1987)). Las señales de inicio de traducción para
cada cadena las proporciona las secuencias
Shine-Dalgarno de STII (enterotoxina
termo-estable) de E.coli (Picken et
al., Infection and Immunity, 42:269-275
(1983)).
rhuMAb CD18 se creó por humanización del
anticuerpo monoclonal murina muMAb H52 (Hildreth y August,
J.Immunology, 134:3272-3280 (1985))
utilizando un procedimiento previamente descrito para otros
anticuerpos (Carter et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
89:4285-4289 (1992); Shalaby et al.,
J.Exp.Med., 175:217-225 (1992); Presta et
al., J.Immunol., 151:2623-2632 (1993)).
Brevemente, se aislaron los ADNc que codifican los dominios de
cadenas variables de muMAb H52 ligeras (V_{L}) y pesadas
(V_{H}), utilizando RT-PCR en una línea celular
de hibridoma autorizada por Hildreth (Hildreth y August, obra
anteriormente citada). Las regiones determinantes de
complementariedad (CDR) de muMAb H52 se transplantaron en un gen
marco de anticuerpo humano que codificaba huMAb
UCHT1-1 (Shalaby et al., obra anteriormente
citada) mediante mutágenesis dirigida. Se identificaron los
residuos del marco murino no CDR que pudiesen influir sobre la
afinidad del anticuerpo humanizado con su diana, CD18 humana,
utilizando modelos moleculares. Estos residuos se alteraron mediante
mutagénesis dirigida y se ensayó su influencia sobre la unión de
CD18. Aquellos residuos del marco que mejoraron significativamente
la afinidad, se incorporaron en el anticuerpo humanizado. El vector
de expresión que codificaba la versión humanizada final de muMAb
H52 en un formato Fab' se denominó pH52-10,0 y es un
derivado de pAK19 (Carter et al., Bio/Technology,
10:163-167
(1992)).
(1992)).
El plásmido pS1130 difiere de
pH52-10,0 en la región codificante de cadena pesada.
El extremo C-terminal de la cadena pesada se
extendió desde CysProPro hasta la secuencia bisagra natural
CysProProCysProAlaProLeuLeuGlyGly (SEC ID nº:3) y a continuación se
fusionó con el dominio de cremallera de leucina de 33 residuos del
factor transcripcional GCN4 de levadura. Como se ha descrito
anteriormente, los dominios de cremallera de leucina se dimerizan
para reunir dos moléculas Fab' y promover la formación de complejo
F(ab')_{2}. Los dos residuos cisteína en la región bisagra
de la cadena pesada se unen a continuación por enlace disulfuro a
aquellos de un Fab' adyacente para formar un F(ab')_{2}
unido covalentemente.
Se construyó el plásmido pS1130 en un
procedimiento multi-etapa descrito a grandes rasgos
a continuación:
En primer lugar, se introdujo un origen de
replicación fago filamentoso (f1) en pH52-10,0 para
crear el plásmido pSO858. El plásmido pSO858 se construyó ligando
el fragmento HindIII-HindIII de 1.977 pb, que
contenía el cassette de expresión Fab' del
pH52-10,0, con el fragmento
HindIII-HindIII de 4.870 pb del plásmido pSO191
(denominado phGHr (1-238) en Fuh et al.,
J.Biol.Chem., 265:3111-3115 (1990)).
En segundo lugar, se llevó a cabo la mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos sobre pSO858 para crear el plásmido
zpi1#6. Se extendió la región codificante de cadena pesada para que
incluyese los residuos bisagra de cisteína y el sitio de corte de
la pepsina (CysProProCysProAlaProLeuLeuGlyGly; SEC ID nº:3). También
se introdujo un sitio de restricción NotI. Se confirmó la secuencia
del ADN introducida mediante secuenciación de ADN.
En tercer lugar, se generó un fragmento de ADN
que codificaba el dominio cremallera de leucina de GCN4 flanqueado
por los sitios de restricción NotI y SphI (patente nº WO98/37200
publicada el 27 de agosto de 1998). Este fragmento
NotI-SphI de ADN de 107 pb se clonó posteriormente
dentro de zip1#6, el cual se había cortado de manera similar, con
el fin de crear el plásmido pS1111.
En cuarto lugar, la secuenciación de ADN del
fragmento cremallera de leucina de GCN4 reveló un error en la
secuencia codificante. Se corrigió este error mediante mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos y se confirmó mediante secuenciación
de ADN. El plásmido correcto resultante se denominó pS1117.
La etapa final en la construcción de pS1130 fue
restaurar el gen de resistencia a la tetraciclina y eliminar el
origen f1 de pS1117. Esto se consiguió ligando el fragmento
PstI-SphI de 2.884 pb de pS1117 que contenía el
cassette de expresión de la cremallera Fab' con el fragmento
PstI-SphI de 3.615 pb de
pH52-10,0.
Construcción del plásmido pJJ154: El
plásmido pJJ154 (figura 5) es un derivado de pACYC177 que es
compatible con los vectores pBR322. Para construir pJJ154, pJJ153
como se ha descrito anteriormente se digirió con MluI y el
fragmento de vector se ligó con gen endA amplificado por PCR
diseñado para codificar extremos MluI. Se filtró la orientación
correcta del plásmido mediante digestión de enzimas de restricción
con el fin de producir pJJ154.
Se muestra en la figura 5 la construcción de
pJJ153 (un derivado pACYC177 que es compatible con vectores pBR322).
Se insertó el fragmento ClaI/AlwNI de pBR322 en pBAD18 digerido con
C1aI/AlwNI (Guzman et al., obra citada anteriormente) con el
fin de producir pJJ70. A continuación, se llevó a cabo una ronda de
mutagénesis dirigida, cambiando HindIII a StuI con el fin de
obtener pJJ75. Se llevó a cabo una segunda ronda de mutagénesis
dirigida para cambiar MluI por SacII, con el fin de producir pJJ76.
A continuación, se ligaron los fragmentos XbaI/HindIII de pJJ76 y
de pBKIGF2B, y se ligaron los fragmentos XbaI/HindIII de este
producto de ligación y del plásmido lisozima-T4/tac
para producir pT4LysAra. A continuación, se ligó pACYC177, digerido
con BamHI (insertado)/ScaI, con pT4LysAra, digerido con
ClaI/HindIII (ambos extremos con inserción) con el fin de producir
pJJ153. Se muestran en la figura 5 los mapas de pACYC177, pT4LysAra
y pJJ153.
Cepas bacterianas y condiciones de
crecimiento: Se utilizó la cepa 33B8 (E.coli W3110
tonA phoA \Delta(argF-lac) 189 deoC
degP ilvG+(kanS)) como el huésped de producción para la
co-expresión de lisozima-T4 y
proteína digestora de ADN del plásmido pJJ154 y la expresión de la
cremallera de rhuMab CD18
F(ab')_{2}-leucina del plásmido pS1130. Se
co-transformaron células competentes de 33B8 con
pJJ154 y pS1130 utilizando procedimientos estándar. Se escogieron
los transformantes de placas LB que contenían 20 \mug/ml de
tetraciclina y 50 \mug/ml de canamicina (LB+Tet20+Kan50), se
purificaron, y se cultivaron en caldo LB con 20 \mug/ml de
tetraciclina y 50 \mug/ml de canamicina en un
incubador-agitador a 37ºC ó a 30ºC previamente a su
almacenamiento en DMSO a -80ºC.
Para los controles, se transformó el huésped
33B8 con pS1130 y pJJ96 (análogo a pJJ154 excepto en que no se
insertaron en el vector ácidos nucleicos que codificasen
lisozima-T4 ni producto endA) y se aisló en un medio
selectivo similar.
Proceso de fermentación de cremallera de
rhuMAb CD18 F(ab')_{2}-leucina: Se
preparó un inóculo de matraz agitado mediante la inoculación de
medio estéril con un cultivo stock recién descongelado. Se añadieron
al medio antibióticos apropiados para generar una presión selectiva
que asegurase la conservación del plásmido. En la Tabla 1 se
proporciona la composición del medio del matraz agitado de cultivo.
Se incubaron los matraces bajo agitación a, aproximadamente, 30ºC
(28ºC-32ºC) durante 14-18 horas. A
continuación, se utilizó este cultivo para inocular el recipiente
de producción fermentativa. El volumen de inóculo era de 0,1% a 10%
del volumen inicial de medio.
La producción de la cremallera
F(ab')_{2}, precursor de rhuMAb CD18 se llevó a cabo en el
medio de producción que se muestra en la Tabla 2. Se llevó a cabo
el proceso de fermentación a una temperatura aproximada de 30ºC
(28-32ºC) y a un pH aproximado de 7,0
(6,5-7,9). Se establecieron la tasas de aireación y
de agitación para proporcionar una transferencia de oxígeno
adecuada al cultivo. La producción de cremallera
F(ab')_{2}, precursor de rhuMAb CD18 se inició al agotarse
el fosfato en el medio, típicamente 36-60 horas
después de la inoculación.
\vskip1.000000\baselineskip
El momento de adición de la arabinosa estuvo
comprendido entre 50 y 65 horas después de la inoculación. Se
ensayaron los efectos de adiciones de bolus de 0,1% a 1%
(concentración final) de arabinosa sobre la inducción de la
co-expresión de lisozima-T4 y
endonucleasa endA.
Se dejó fermentar durante aproximadamente 65
horas (60 a 72 horas), después de lo cual se recolectó el caldo
para el tratamiento posterior de recuperación del producto.
Evaluación de la reducción en viscosidad del
caldo mediante sobre-expresión de endonuclease
endA: Alícuotas de caldo de cultivo recolectado de la
fermentación de cremallera de rhuMAb CD18
F(ab')_{2}-leucina con o sin
co-expresión de producto endA, añadida además de la
lisozima fágica descrita anteriormente, se sometieron a un ciclo de
congelación-descongelación. El caldo descongelado se
diluyó 1:3 en agua, o en MgCl_{2} 20 mM, previamente a su
incubación al baño maría con agua a 37ºC bajo agitación. Se
retiraron las muestras a intervalos y se midió la viscosidad del
caldo diluido utilizando un viscómetro de caída de bola.
Efecto de la sobre-expresión
de EndA, añadido además de lisozima-T4, sobre la
viscosidad del caldo: Como se muestra en la Tabla 3, el caldo
de cultivo diluido descongelado-congelado procedente
del proceso de fermentación anterior en ausencia de
sobre-expresión de endA tenía una viscosidad
superior a 800 cP al inicio de la incubación a 37ºC. Tras 60
minutos de incubación, había cambiado poco la viscosidad del caldo
de fermentación diluido con H_{2}O y
congelado-descongelado, mientras que el caldo
diluido con tampón MgCl_{2} mostró una reducción significativa en
la viscosidad del caldo. Tras extender la incubación a 37ºC durante
más de 2,5 horas, se estabilizó la viscosidad del caldo de cultivo
diluido congelado-descongelado sin sobreexpresión de
endA en adición de T4-lisozima en un valor
aproximado de 40 cP. La viscosidad del caldo de cultivo diluido
congelado-descongelado con
sobre-expresión de endA era inferior a 20 cP incluso
antes de su incubación a 37ºC.
Según se describe en el Ejemplo IA, la
sobre-expresión de endA comporta beneficios
significativos en la reducción de la viscosidad de caldo
permeabilizado o lisado. Ayuda a condicionar el caldo de
fermentación para la etapa posterior de recuperación del producto.
Mediante la co-expresión del
lisozima-T4 y gen t, además de endA, las células
pueden lisarse bioquímicamente y al mismo tiempo rendir un caldo
lisado bien preparado con viscosidad de fluido suficientemente baja
y compatible con las etapas de aislamiento del producto, tal como la
centrifugación o la EBA.
El proceso de fermentación descrito
anteriormente se utilizó para producir rhuMAb CD18 como precursor de
una cremallera de F(ab')_{2}-leucina
dirigida por el plásmido pS1130 en E.coli, con la
co-expresión de enzimas líticos y proteína
digestora de ADN dirigida por el plásmido pJJ155 en E.coli.
El producto de fragmento de anticuerpo se secretó y acumuló en el
periplasma. Los enzimas líticos se acumularon en un compartimiento
alejado de su sustrato hasta su liberación por acción del producto
del gen t. El procedimiento deseado de recuperación se concentra en
la fracción soluble de la cremallera de
F(ab')_{2}-leucina liberada del periplasma
para su captura inicial.
Construcción del plásmido pJJ155: De
manera similar a pJJ154, pJJ155 es un derivado de pACYC177 que es
compatible con vectores pBR322. Para construir pJJ155, pJJ154 según
se ha descrito anteriormente, se digirió con KpnI, y el fragmento
del vector se ligó con gen t amplificado por PCR y diseñado para
codificar extremos KpnI. Se seleccionó el plásmido con la
orientación correcta mediante digestión con enzimas de restricción
para producir pJJ155. Se muestra en la figura 7 un mapa de
pJJ155.
Cepas bacterianas y condiciones de
cultivo: La mayoría de los experimentos se llevaron a cabo con
33B8 transformado según se ha descrito anteriormente, excepto en
que se sustituyó pJJ154 por pJJ155.
Descripción del proceso de fermentación:
Ver Ejemplo IA.
El crecimiento celular de 33B8
co-transformado con pS1130 y pJJ155
(33B8/pS1130/pJJ155) no fue significativamente diferente del
crecimiento del control (33B8 transformado solamente con pS1130).
Tras la adición de 0,5% a 1% de arabinosa a las
50-65 horas para inducir la
co-expresión de los enzimas líticos y la proteína
digestora de ADN, la DO_{550} del cultivo 33B8/pS1130/pJJ155 cayó
con ritmo constante hasta un 30-40% de la densidad
celular máxima, sugiriendo lisis celular.
La Tabla 4 muestra el efecto de la
co-expresión de lisozima-T4 + endA +
gen t sobre la liberación de fragmento soluble de anticuerpo
anti-CD18 hacia el medio. Se ensayó mediante
cromatografía HPLC de intercambio iónico el sobrenadante de la
centrifugación del caldo de cultivo lisado tras incubación en
presencia de EDTA 25 mM para cuantificar el producto. Se
encontraron más de 80% de los fragmentos solubles de anticuerpo
anti-CD18 en la fracción sobrenadante en la
condición experimental en la que se inducía la
co-expresión de enzimas líticos y proteína
digestora de ADN, en comparación con menos de 10% en el control y en
la condición en la que no había gen t (pJJ154) ni disrupción
mecánica.
La endonucleasa degrada el ADN y reduce la
viscosidad del caldo. La sobre-expresión de la
endonucleasa endógena de E.coli además de la
lisozima-T4 reduce la necesidad de disrupción
celular mecánica para la rotura de ADN liberado. La liberación de
la lisozima fágica del compartimiento citoplasmático mediada por la
proteína de expresión del gen t inicia el proceso de disrupción
bioquímica, resultando en la lisis de las células y en la
liberación del contenido celular, incluyendo el polipéptido
heterólogo, ADN genómico, y proteína digestora del ADN, la cual
había quedado atrapado en el periplasma o en el citoplasma hasta
este momento. Mediante el mantenimiento del caldo lisado para la
digestión apropiada de sustratos mediante la
co-expresión de enzimas líticos y proteína
digestora de ADN, se mejoraron la viscosidad del caldo y la
liberación de producto de la matriz celular para una mejor
recuperación del producto.
Debido a las necesidades a gran escala, se
seleccionó IGF-I como el polipéptido heterólogo para
la evaluación de la recuperación de partículas refráctiles. Se
utilizó la co-expresión de enzimas líticos y
proteína digestora de ADN para mejorar la liberación de las
partículas refráctiles de IGF-I de las estructuras
de pared celular sin utilizar disrupción mecánica.
Tras la lisis celular, además de liberar
lisozima-T4 del compartimiento citoplasmático, el
ADN genómico liberado del citoplasma habría contribuido
significativamente a la viscosidad del líquido lisado del caldo. Por
lo tanto, la co-expresión de una endonucleasa de
E.coli junto con enzimas líticos fue útil en la reducción de
la viscosidad del líquido tras la lisis celular y en la mejora de la
recuperación de producto durante la centrifugación.
Construcción del plásmido pLBIGF57: Se
construyó el plásmido pLBIGF57 para la expresión de
IGF-I (figura 6) a partir de un esqueleto básico de
pBR322. Las secuencias transcripcionales y traduccionales requeridas
para la expresión del ácido nucleico que codifica
IGF-I las proporcionó el promotor phoA y la
secuencia Shine-Dalgarno trp. La secreción
de la proteína la dirigió una variante TIR de la secuencia de señal
lamB. Esta variante TIR no altera la secuencia aminoacídica
primaria de la señal lamB; sin embargo, los cambios silenciosos en
la secuencia nucleotídica resultan, en esta variante particular, en
un nivel incrementado de proteína traducida.
A continuación, se proporcionan los detalles de
la construcción de pLBIGF57. Se construyó una biblioteca de codones
de la secuencia de señal lamB para explorar las variantes de
regiones de inicio de traducción (TIR) de diferente fuerza.
Específicamente, se varió la tercera posición de los codones 3 a 7
de la secuencia de señal lamB. Este diseño conservaba la secuencia
aminoacídica de tipo salvaje y, aún de esta manera, permitía las
divergencias dentro de la secuencia nucleotídica.
Como se ha descrito anteriormente en la
exploración de la biblioteca de codones de secuencia de señal STII
(patente sudafricana nº ZA 96/1688; Simmons y Yansura, Nature
Biotechnology, 14:629-634 (1996)), el producto
del gen phoA sirvió como indicador para la selección de las
variantes TIR de lamB. La biblioteca de codones de la secuencia de
señal lamB se insertó corriente abajo del promotor phoA y del
Shine-Dalgarno trp, y corriente arriba del
gen phoA. Bajo condiciones de baja actividad transcripcional,
la cantidad de fosfatasa alcalina secretada por cada constructo a
partir de este momento era dependiente de la eficiencia de inicio
traduccional proporcionada por cada variante TIR en la biblioteca.
Utilizando este método, se seleccionaron variantes TIR de lamB que
cubrían un intervalo aproximado de actividades de factor 10.
Específicamente, la variante TIR de lamB #57 proporcionaba un TIR
aproximadamente 1,8 veces más fuerte que los codones lamB de tipo
salvaje, según el ensayo de actividad phoA.
El fragmento de vector para la construcción de
pLBIGF57 se generó mediante la digestión de pBK131Ran con XbaI y
SphI. Este vector XbaI-SphI contiene el promotor
phoA y las secuencias Shine-Dalgarno
trp. Las secuencias codificantes de IGF-I y
el terminador transcripcional t_{0} de lambda se aislaron a
partir de pBKIGF-2B (patente US nº 5.342.763)
después de la digestión con NcoI-SphI. Se aisló la
secuencia de señal lamB a partir de pLBPhoTBK#57 (variante TIR #57;
generada como se ha descrito anteriormente) seguido de la digestión
con XbaI-NcoI. A continuación, se ligaron estos
tres fragmentos para construir pLBIGF57.
Cepas bacterianas y condiciones de
cultivo: La mayoría de los experimentos se llevaron a cabo con
la cepa 43E7 (E.coli W3110 fhuA(tonA)
\Delta(argF-lac) ptr3 degP41(kanS)
\DeltaompT\Delta(nmpc-fepE) ilvG+
phoA+). Se utilizó un sistema de doble plásmido con plásmido de
producto (pLBIGF57) y pJJ155 para los enzimas líticos. Se
co-transformaron células competentes de 43E7 con
pLBIGF57 y pJJ155 utilizando el procedimiento estándar. Se
escogieron los transformantes tras cultivo en una placa LB que
contenía 50 \mug/ml de carbenicilina (LB + CARB50^{TM}) y 50
\mug/ml de canamicina, se purificaron y cultivaron en caldo LB con
50 \mug/ml de CARB50^{TM} y 50 \mug/ml de canamicina en un
agitador/incubador a 37ºC, previamente a su ensayo en el
fermentador.
Para la comparación, se utilizaron 43E7
transformadas solamente con pLBIGF57 en el caso control, llevado a
cabo bajo condiciones similares. pLBIGF57 confiere resistencia a
ambas la carbenicilina y la tetraciclina al huésped de producción y
permite que 43E7/pLBIGF57 crezca en presencia de cualquiera de los
dos antibióticos.
Proceso de fermentación: La composición
del medio de fermentación y el protocolo experimental utilizado para
la co-expresión del ácido nucleico que contenía
IGF-I, endA, lisozima-T4, y gen t en
caso de utilizarse, eran similares a los del procedimiento
IGF-I a escala pequeña, de 10 kilolitros, de elevada
tasa metabólica y alto rendimiento. Brevemente, se utilizó un
cultivo original en matraz agitado de 43E7/pLBIGF57 ó
43E7/pLBIGF57/pJJ155 para inocular el medio enriquecido de
producción. A continuación, se describe la composición del medio
(con las cantidades de cada componente utilizadas por litro de
medio inicial):
*Inicialmente, se añadió al medio una parte de
la glucosa, extracto de levadura, NZ Amina AS, y metionina,
añadiendo el resto durante la fermentación.
La fermentación fue un proceso alimentado por
lotes en el que se fijaron los parámetros de fermentación de la
manera siguiente:
- Agitación:
- Inicialmente a 800 RPM, incrementando a 1.000 RPM a 8 DO
- Aireación:
- 15,0 slpm
- Control de pH:
- 7,3
- Temperatura:
- 37ºC
- Presión de retorno:
- 0,7 barios
- Carga de glucosa:
- controlada por ordenador utilizando un algoritmo que regulaba la tasa de crecimiento a, aproximadamente, 95% del máximo en las fases tempranas de la fermentación, y que después pasaba a estabilizar la concentración de oxígeno disuelto (DO_{2}) al 30% de saturación del aire a partir de su caída hasta el 30%.
- Carga de nitrógeno complejo:
- Tasa de alimentación constante de 0,5 mL/minuto durante todo el proceso.
- Duración del proceso:
- 40 horas
El tiempo de adición de arabinosa estaba
comprendido entre las 24 y las 36 horas. Se ensayaron adiciones de
bolus entre 0,1 y 1% de arabinosa (concentración final) para definir
la fuerza de inducción necesaria para producir las cantidades de
mayor preferencia de lisozima-T4 para una mejor
recuperación de producto en la etapa de centrifugación.
Recuperación de partículas refráctiles del
caldo de cultivo: Se recolectó el caldo al final de la
fermentación al observar una caída objetivo de DO_{550}, y se
procesó poco después, o bien se almacenó por poco tiempo a 4ºC
previamente a su utilización. El protocolo de ensayo implicaba
cuatro etapas de procedimiento:
I. Adición de EDTA 1M al caldo de cultivo para
llevar la concentración final de EDTA a 25 mM. El EDTA que la los
cationes divalentes y altera la estructura de la superficie externa
de la célula. Esto hace que la capa de peptidoglicano en el
interior de las células no rotas sea accesible a la degradación por
lisozima-T4 y debilita la pared celular,
promoviendo la lisis de la célula.
II. Mantenimiento del lisado a temperatura
ambiente o incubación a 37ºC para la degradación adicional de la
pared celular. Esta etapa simula los tiempos más largos de
procesamiento asociados con el proceso a escala más grande.
III. Recuperación de partículas refráctiles y
sólidos del lisado mediante centrifugación. Se utilizó la
centrifugación a escala de laboratorio en un rotor GSA
SORVALL^{TM} a diferentes velocidades (3.000 rpm a 6.000 rpm;
equivalente a una RCF de, aproximadamente, 2.500 g a 6.000 g, a
rmax, respectivamente), para recoger los sólidos en forma de
pellet.
Una etapa adicional de lavado de los pellets con
tampón eliminaría el lisado arrastrado por los mismos, y
minimizaría la cantidad de proteínas contaminantes de E.coli
en las preparaciones de partículas refráctiles.
Se evaluó la recuperación de producto en
muestras de sobrenadante y pellet procedentes de la centrifugación
del caldo lisado resuspendido en tampón. Se analizó la cantidad de
producto presente en las muestras mediante un método de HPLC en
fase reversa. Se calculó la eficiencia de recuperación de producto
expresando la cantidad de producto, recuperado en el pellet
mediante la etapa del procedimiento, como un porcentaje del producto
total presente en la combinación de pellet y sobrenadante. Para
evaluar la calidad de las partículas refráctiles recuperadas, se
midió la cantidad de proteína total presente en el pellet y en el
sobrenadante mediante el método de Lowry (J.Biol.Chem.,
193:265 (1951)).
Se evaluó la contribución de la actividad
endonucleasa como la eficiencia de recuperación de sólidos durante
la sedimentación del caldo lisado por centrifugación. Además, se
midió la cantidad de ácidos nucleicos presentes en el pellet y en
el sobrenadante como las lecturas de DO_{260}.
La figura 8 muestra, en general, el sistema de
dos plásmidos utilizado en el presente Ejemplo para la
co-expresión de enzimas líticos y endA con
IGF-I utilizando pJJ155. La tasa inicial de
crecimiento de 43E7/pLBIGF57/pJJ155 no mostró diferencias
significativas con la del control 43E7/pLBIGF57. La densidades
celulares máximas alcanzadas en estos caldos fueron similares. Sin
embargo, en comparación con el control, se observó una pérdida
significativa de densidad óptica en los cultivos tras la inducción
para la co-expresión de enzimas líticos, indicando
lisis celular. El examen del caldo de cultivo por microscopía de
contraste de fases mostró que, en comparación con el control de no
co-expresión, había muy pocas células intactas de
E.coli y eran evidentes las partículas refráctiles liberadas
como resultado de la co-expresión de enzimas líticos
y proteína digestora de ADN. Ver las figuras
9A-9E.
Las tasas de respiración en este conjunto de
ensayos eran muy similares al control excepto por la pérdida
continua significativa de tasa de asimilación de oxígeno (OUR) con
pérdida concomitante en kla poco después de la adición de
arabinosa.
El éxito de la técnica de lisis celular
bioquímica según se describe en la presente invención es evidente a
partir de las diferencias observadas en la distribución de ácidos
nucleicos y proteína total entre fracción sólida (pellet) y líquida
(sobrenadante), como resultado de la co-expresión de
los enzimas líticos y la proteína digestora de ADN, en comparación
con el control, sin co-expresión (figuras 10A y 10B,
respectivamente). Aumentaron ambos el porcentaje de ácidos
nucleicos totales, calculado a partir de las lecturas de A260, y el
porcentaje de proteína total, según mediciones por el ensayo de
Lowry, en el sobrenadante de centrifugación del caldo lisado
bioquímicamente en comparación con el caldo de control.
Se resume la recuperación de producto bajo las
dos condiciones en la figura 11. En el caldo IGF-I
lisado bioquímicamente, el producto IGF-I fue
liberado junto con polímero ADN degradado al caldo lisado. La
eficiencia de recuperación de las pequeñas y densas partículas
refráctiles aumentó con la RCF utilizada durante la centrifugación.
A medida que aumentaba la fuerza g utilizada, aumentaba el
porcentaje del caldo lisado que se recuperaba como pellet
(expresado como % pellet) (figura 12), al igual que la cantidad de
producto IGF-I en el pellet. A aproximadamente
6.000 x g, cerca del 95% del producto había sido capturado en el
pellet.
Según se da a conocer en el presente documento,
una manipulación simple de la expresión génica durante el proceso
de fermentación resulta en una lisis celular bioquímica que podría
sustituir la disrupción mecánica convencional utilizada
tradicionalmente para la recuperación de producto a escala de
producción. La co-expresión o expresión coordinada
de lisozima-T4 y producto de gen t in vivo es
una técnica altamente efectiva para la desintegración de células,
mientras que la proteína endA sobre-expresada
degrada el ADN que se escapa, reduce la viscosidad del caldo, y
condiciona eficientemente el caldo lisado para la recuperación de
producto en la etapa inicial de captura del mismo. La lisis celular
bioquímica es aplicable a la recuperación de producto soluble así
como de producto insoluble. Es esencial la acumulación de los
enzimas co-expresados en compartimientos alejados
de sus sustratos hasta el momento deseado para la lisis celular, y
esto constituye un diseño crítico de la invención. La invención
proporciona una reducción significativa en el coste del proceso,
tiempo de procesamiento, y por lo tanto, un coste de oportunidad
respecto a otros productos que puedan compartir las mismas
facilidades de producción.
<110> GENENTECH, INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCESO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P1711R1PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6550
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 537
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (15)
1. Procedimiento para la recuperación de
polipéptido heterólogo a partir de células bacterianas, que
comprende:
- (a)
- cultivar las células, que comprenden
- \quad
- un primer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo y una secuencia de señal para la secreción del polipéptido heterólogo, estando dicho primer ácido nucleico unido a un primer promotor inducible, un segundo ácido nucleico que codifica la lisozima fágica,
- \quad
- y un tercer ácido nucleico que codifica una proteína que muestra actividad digestora de ADN bajo el control de una secuencia de señal para la secreción de la proteína digestora de ADN,
- \quad
- en el que dichos segundo y tercer ácidos nucleicos están operativamente unidos a un segundo promotor que es el mismo para ambos, y en el que ambos están unidos sobre el mismo constructo de ácido nucleico,
- \quad
- y en el que el segundo promotor es o bien
- (i)
- inducible o
- (ii)
- un promotor constitutivamente débil o un promotor con un nivel basal bajo que no requiere la adición de un inductor para funcionar como un promotor,
- \quad
- y en el que el primer promotor inducible y el segundo promotor son diferentes entre sí y, cuando el segundo promotor es un promotor inducible, responden a diferentes inductores;
- (b)
- añadir un inductor específico para la inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo a partir del primer promotor inducible,
- (c)
- únicamente cuando el cultivo se realiza mediante (a)(i) anterior, añadir un segundo inductor específico para el segundo promotor inducible tras la acumulación de aproximadamente 50% o más de la acumulación máxima del polipéptido heterólogo que se debe recuperar,
- (d)
- lisar las células, y
- (e)
- recuperar el polipéptido heterólogo acumulado del caldo lisado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido heterólogo es un polipéptido de mamífero.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el polipéptido heterólogo es el anticuerpo
anti-CD18 o un fragmento del anticuerpo
anti-CD18.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de recuperación se realiza utilizando sedimentación
o adsorción de lecho expandido.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la proteína digestora de ADN es una ADNasa eucariótica o
endA bacteriana.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las células bacterianas son células
Gram-negativas.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la lisozima de fago es la lisozima de fago T4.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de recuperación tiene lugar en presencia de un
agente que altera la pared celular exterior de las células
bacterianas.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el agente es un agente quelante o zwiterión.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que, previamente a la recuperación, se incuba el lisado celular
durante un periodo de tiempo suficiente para liberar el polipéptido
heterólogo contenido en las células.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que uno o más de los ácidos nucleicos, incluyendo el promotor
del(de los) mismo(s), está(n) integrado(s) en
el genoma de las células bacterianas.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el cultivo tiene lugar en condiciones por las que el
polipéptido heterólogo y la proteína digestora de ADN son secretados
en el periplasma de las bacterias.
\newpage
13. Bacteria que comprende
- (a)
- un polipéptido heterólogo secretado en el periplasma de la bacteria;
- (b)
- una proteína que muestra actividad digestora de ADN secretada en el periplasma de la bacteria, y
- (c)
- una lisozima de fago en el citoplasma de la bacteria.
14. Bacteria según la reivindicación 13, que es
una bacteria Gram-negativa, preferentemente E.
coli.
15. Cultivo a gran escala de bacterias, en el
que las bacterias se encuentran a una densidad celular de entre 15
g de peso seco/litro y 150 g de peso seco/litro, y en el que las
bacterias son las bacterias según la reivindicación 13 ó 14.
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