ES2853935T3

ES2853935T3 - Proteínas modificadas de sustancia inhibidora muleriana (MIS) y usos de las mismas para el tratamiento de enfermedades

Info

Publication number: ES2853935T3
Application number: ES14779351T
Authority: ES
Inventors: Patricia K Donahoe; Demetrios Vavvas; David Pepin; Mien Van Hoang
Original assignee: General Hospital Corp; Massachusetts Eye and Ear Infirmary
Current assignee: General Hospital Corp; Massachusetts Eye and Ear
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2021-09-20
Anticipated expiration: 2034-03-12
Also published as: US20220041677A1; BR112015022181A8; DK2968470T3; KR20160029731A; US11084860B2; AU2014248768A1; MX2015011846A; JP2022180637A; JP2016518325A; CN105473154A; EP2968470A1; WO2014164981A1; JP2020074789A; PL2968470T3; US20160039898A1; HK1222331A1; BR112015022181A2; EP2968470B1; CA2904978A1; EP2968470A4

Abstract

Proteína recombinante de sustancia inhibidora muleriana (MIS) que comprende una combinación de una secuencia líder distinta de MIS en lugar de la secuencia líder de MIS de los aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1, y una modificación de residuo del aminoácido 450 de SEQ ID NO 1: para aumentar la escisión en comparación con la ausencia de dicha modificación, en la que el residuo de aminoácido 450 de SEQ ID NO: 1 se cambia de Q a R, en la que la proteína recombinante de MIS ha aumentado la escisión y ha aumentado el rendimiento de la producción in vitro en comparación con la proteína de MIS de tipo natural correspondiente a los residuos de aminoácido de SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia líder distinta de MIS se selecciona del grupo que consiste en: una secuencia líder de albúmina, un péptido señal de inmunoglobulina fusionado a un propéptido activador de plasminógeno de tipo tisular (IgSP-tPA), un péptido señal de inmunoglobulina murina (IgSP), una secuencia señal de MPIF-1 (MKVSVAALSCLMLVTALGSQA; SEQ ID NO: 15); una secuencia señal de estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA; SEQ ID NO:16); una secuencia señal de invertasa (MLLQAFLFLLAGFAAKISA; SEQ ID NO:17); una secuencia señal del factor alfa de apareamiento de la levadura (secuencia líder de toxina mortal de K. lactis); una secuencia señal híbrida (MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR; SEQ ID NO:18); una secuencia señal híbrida de HSA/MFa-1 (MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR; SEQ ID NO:19); una secuencia líder de fusión mortal de K. lactis/MFa- 1 (MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR; SEQ ID NO:20); una secuencia señal de inmunoglobulina Ig (MGWSCIILFLVATATGVHS; SEQ ID NO:21); una secuencia señal de precursor de fibulina B (MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA; SEQ ID NO:22); una secuencia señal del precursor de la clusterina (MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG; SEQ ID NO: 23); y la secuencia señal de la proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG; SEQ ID NO:24) o fragmentos funcionales de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas modificadas de sustancia inhibidora muleriana (MIS) y usos de las mismas para el tratamiento de enfermedades

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de MIS humana recombinante modificada que tiene escisión mejorada y bioactividad aumentada y potencia aumentada en comparación con una proteína de MIS humana de tipo natural. En algunos aspectos, la proteína de MIS humana recombinante comprende al menos uno de los siguientes: un sitio de escisión Kex modificado para escisión aumentada, una etiqueta FLAG y una secuencia líder distinta de MIS en lugar de la secuencia líder de MIS normal. Otros aspectos de la invención se refieren a métodos y usos que comprenden una proteína de MIS humana recombinante para el tratamiento de cánceres, tales como los que expresa el receptor de tipo II de MIS (MISRII) o para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por un exceso de andrógenos.

Antecedentes de la invención

La sustancia inhibidora muleriana (MIS) también conocida como hormona antimuleriana (AMH), es un miembro de glicoproteína homodimérica unida por disulfuro de 140 kDa de la gran familia de glicoproteínas multigénicas del factor de crecimiento transformante p (TGFp). Todas las proteínas de esta familia de genes se producen como precursores diméricos y se someten a un procesamiento postraduccional para su activación, que requiere escisión y disociación para liberar fragmentos C-terminales bioactivos. De manera similar, el homodímero de MIS unido por disulfuro de 140 kilodalton (kDa) se escinde de manera proteolítica para generar sus fragmentos C-terminales activos.

El gen humano MIS se encuentra en el cromosoma 19 y su expresión es sexualmente dimórfica. En los hombres, la expresión de MIS comienza a las 9 semanas de gestación en los testículos fetales y continúa en niveles altos hasta la pubertad, cuando los niveles de expresión caen drásticamente. En las mujeres, se produce MIS solo después del nacimiento en las células de la granulosa desde la prepubertad hasta la menopausia a niveles similares a los de los hombres adultos, después de lo cual cesa la expresión. En los fetos masculinos, MIS provoca la regresión de los conductos de Müller, los precursores de las trompas de Falopio, el útero, el cuello uterino y el tercio superior de la vagina.

El MIS ejerce su efecto biológico después de unirse a un heterodímero de los receptores de serina treonina cinasa que abarcan la transmembrana únicos de tipo I y tipo II, lo que conduce a la fosforilación cruzada del dominio cinasa de la caja GS del receptor de tipo I por el receptor de tipo II. Posteriormente, SMAD 1, 5 y 8 (pero predominantemente SMAD 8) se activan y, junto con SMAD 4, regulan la transcripción génica. Solo se ha identificado un receptor de tipo II del gen MIS (MISRII) en ratones, ratas y conejos, donde en seres humanos su gen se localiza en el cromosoma 12. Es una proteína de 65 kDa que se ha detectado en estructuras mulerianas embrionarias y adultas, tejido mamario, tejido prostático, gónadas, motoneuronas y cerebro. En el feto, las células mesoepiteliales que expresan MISRII en el epitelio celómico que cubre la cresta urogenital migran hacia las células mesenquimatosas que rodean el epitelio del conducto de Müller y se vuelven parte de ellas. La expresión también se detecta en las gónadas, así como en el epitelio celómico ovárico. Se han identificado receptores de MIS de tipo I en mamíferos, siendo los candidatos más probables la cinasa similar al receptor de activina (ALK) 2 y 3, dependiendo de la especie animal y el tejido examinado.

Además de su papel bien establecido en la regresión de los conductos de Müller, MIS inhibe la proliferación de diversas líneas celulares de cáncer humano in vitro e in vivo. Las líneas celulares que muestran inhibición se derivaron de cánceres de ovario, cuello uterino, endometrio, próstata y mama. No se ha observado toxicidad in vivo incluso cuando se mantienen altas concentraciones de MIS de manera sistémica en roedores o en pacientes humanos con tumores que secretan MIS durante periodos de tiempo prolongados. Estos hallazgos de expresión del receptor relativamente restringida, actividad antiproliferativa contra células cancerosas que expresan MIS RI y RII, y su aparente no toxicidad, en conjunto, hacen que MIS sea un reactivo ideal para su uso en combinación con fármacos quimioterápicos existentes para el tratamiento de cáncer de ovario, que se sabe que se vuelven resistentes a estos agentes convencionales.

MIS actúa a través de las células del receptor de tipo II de MIS para actuar como un potente supresor de tumores de la iniciación del cáncer de ovario (Teixeira et al, no publicado). MIS también puede seleccionar como diana, como un acontecimiento mediado por receptor, a la población madre/progenitora de la línea celular de cáncer de ovario (Meirelles et al, 2012; Wei et al, 2010). Por ejemplo, MIS puede usarse para el tratamiento de cánceres que expresan MISRII. MISRII se expresa en la mayoría de los cánceres epiteliales de ovario (Masiakos et al. 1999; Bakkum-Gamez et al. 2008; Song et al. 2009).

MIS también inhibe el crecimiento de una variedad de cánceres in vitro e in vivo, sin toxicidad evidente después de una terapia prolongada in vivo (Pieretti-Vanmarcke et al. 2006b). El cáncer epitelial de ovario recapitula la histología original de los conductos embrionarios de Müller y sus diversos subtipos (Scully 1977); por ejemplo, el cistadenocarcinoma seroso se parece a las trompas de Falopio embrionarias, el carcinoma de endometrio, al endometrio, y el carcinoma mucinoso, al cuello uterino. Además, MIS actúa de manera sinérgica o aditiva con los fármacos contra el cáncer usados comúnmente para controlar el crecimiento tumoral (Pieretti-Vanmarcke et al.

2006a).

Se ha informado previamente de que los agentes quimioterápicos seleccionan células madre de cáncer de ovario, que son normalmente multirresistentes y/o resistentes a los quimioterápicos. En particular, existe un creciente organismo de investigación que informa que los cánceres de ovario y las líneas celulares son heterogéneas, con poblaciones de células madre de cáncer de ovario que son resistentes a los fármacos quimioterápicos pero que siguen respondiendo al MIS. El MIS se dirige particularmente a las células de poblaciones secundarias de cáncer de ovario y a una población de células CD44+, CD24+, EpCam+ y negativas para E-cadherina características de madre/progenitora que responden mal a los agentes quimioterápicos actualmente en uso clínico para el cáncer de ovario (Wei et al, 2010). En particular, se ha demostrado que MIS inhibe las células de cáncer de ovario tanto in vitro como in vivo y puede dirigirse específicamente e inhibir el crecimiento de una población de células progenitoras de cáncer de ovario enriquecida por los marcadores de superficie celular de CD44+, CD24+, Ep-CAM+ y E-cadherina. Para adaptarse a las pruebas clínicas de MIS en pacientes con cáncer de ovario, la producción de MIS humana recombinante debe optimizarse para aumentar el rendimiento y la pureza.

Sin embargo, la preparación que resulta de la purificación de MIS nativa o de tipo natural es compleja y el rendimiento es bajo. Además, la escisión necesaria para producir el fragmento activo de MIS también es ineficaz. La proteína de MIS humana se produce a partir de una preproproteína, que comprende una secuencia líder. La secuencia líder (aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1) se separa por escisión y la preproteína restante (a menudo denominada “MIS holohumana”) debe escindirse de manera postraduccional para dar como resultado un dominio N-terminal y C-terminal. Estos dominios N-terminales y C-terminales unidos covalentemente forman un monómero, y dos monómeros idénticos (que comprenden los dominios N- y C-terminales) se forman juntos para generar un homodímero. La MIS holohumana se escinde para dar sus dominios N- y C-terminales muy probablemente por medio de furina o una prohormona convertasa relacionada PC5, expresada en las gónadas. La escisión se produce principalmente en un sitio similar a kex caracterizado por R'4 XXR'1 con una serina en el sitio 1, lo que hace que el sitio de escisión de MIS sea monobásico. El dominio C-terminal purificado es el resto biológicamente activo y se requiere la escisión para la actividad biológica. Un sitio de escisión secundario, cuyo significado se desconoce, se observa con menos frecuencia en los residuos 229-230 (que corresponde a los residuos de aminoácidos 254-255 de la SEQ ID NO: 1). Los mutantes no escindibles de MIS no son biológicamente activos y las mutaciones en el gen humano que truncan el dominio carboxilo-terminal conducen a un síndrome persistente del conducto de Müller. El papel del dominio amino-terminal in vivo puede ser para ayudar en el plegamiento de proteínas y facilitar la administración del péptido C-terminal a su receptor. En un estudio (Cate, Pepinsky, et al.) se demostró que la adición del péptido N-terminal mejora la actividad biológica del resto C-terminal in vitro, pero el mecanismo no estaba claro. La escisión de MIS recombinante expresada por células CHO es incompleta, por lo que se requiere la escisión con una serina proteasa exógena tal como la plasmina para mejorar la bioactividad.

Papakostas et al. (Protein Expression and Purification, Academic Press, San Diego, CA, vol. 70, n.° 1 (marzo de 2010).)) describe una proteína recombinante de MIS que comprende dos monómeros, cada uno de los cuales comprende (i) un dominio N-terminal (aminoácidos 26-451 de SEQ ID 1) en el que el aminoácido 450 se cambia de Q a R y (ii) un dominio C-terminal (aminoácidos 452-560 de SEQ ID 1) en el que el aminoácido 452 se cambia de S a R, y adicionalmente una etiqueta, y la expresión de la proteína recombinante de MIS en células huésped.

Por consiguiente, existe la necesidad de un método más eficaz para producir altas concentraciones de proteína de MIS humana para su uso como agente biológico terapéutico.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona una proteína recombinante de sustancia inhibidora muleriana (MIS) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína recombinante de MIS de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido según las reivindicaciones 6 a 7.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector según la reivindicación 8 ó 9.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped según la reivindicación 10.

En otro aspecto, la invención proporciona la proteína recombinante de MIS de la invención para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con cáncer, según las reivindicaciones 11 y 12.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de producción de una proteína recombinante de MIS, que comprende la escisión de una secuencia señal de cualquiera de las proteínas recombinantes de MIS de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1B son dibujos esquemáticos que muestran el diseño de nuevos constructos de MIS recombinantes con la secuencia líder de albúmina. La figura 1A muestra que la secuencia líder de MIS (25 aminoácidos) y albúmina (24 aminoácidos) tienen una identidad del 20% y 5 aminoácidos conservados. La figura 1B es un dibujo esquemático que muestra el diseño de constructos de RF (sitio de escisión modificado más etiqueta Flag), LRF (secuencia líder más sitio de escisión modificado más etiqueta Flag) y LR (secuencia líder más sitio de escisión modificado) que incluyen la colocación de la etiqueta flag (F), el sitio de escisión modificado (R) y la secuencia líder de albúmina (L). La figura 2 muestra la producción y escisión de MIS en clones de CHOK1 transfectados de manera estable con constructos de LR-MIS y LRF-MIS humanos recombinantes. Inmunotransferencia de tipo Western de geles SDS reducidos al 4% del sobrenadante del medio después de 72 h en cultivo usando un anticuerpo policlonal de cabra anti-MIS dirigido al extremo c-terminal de MIS (1:200). Los medios RF-MIS, CHO93 y B9 purificados se muestran como controles positivos.

Las figuras 3A-3B muestran MIS recombinante purificada analizada por inmunotransferencia de tipo Western de geles SDS reducidos para estimar la cantidad de escisión. La figura 3A muestra RF-MIS, LRF-MIS y WT-MIS recombinantes purificadas que se comparan usando un anticuerpo contra el extremo N-terminal que puede reconocer el monómero holo MIS, el extremo N-terminal escindido y los productos de escisión críptica que contienen parte del extremo N-terminal. La figura 3B muestra la detección de RF-MIS, LRF-MIS y WT-MIS recombinantes purificadas usando un anticuerpo contra el extremo C-terminal que puede reconocer el monómero holo MIS, el extremo C-terminal escindido y los productos de escisión críptica que contienen parte del extremo C-terminal.

Las figuras 4A-4B muestran la comparación de 5 ug/ml (35 uM) de MIS recombinante WT, RF y LRF en un bioensayo de regresión de conductos de Müller. Los productos de MIS humana recombinante se incubaron durante 72 h con crestas urogenitales de ratas fetales. La figura 4A muestra secciones representativas tanto de la cresta tratada como de la cresta de control contralateral sin tratar que se comparan para determinar la regresión del conducto de Müller. La figura 4B es un histograma que muestra la distribución de frecuencias de esas puntuaciones en la figura 4A. (LRF-MIS N = 6, RF-MIS N = 39). W, conducto de Wolff; M, conducto de Müller.

Las figuras 5A-5B muestran el aminoácido de la proteína de MIS de tipo natural (SEQ ID NO: 1) con los residuos de aminoácido correspondientes usando la nomenclatura convencional de marcaje de aminoácidos (en la que el primer aminoácido numerado comienza después de la secuencia líder). La figura 5A muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína de MIS de tipo natural de SEQ ID NO: 1, mostrando la secuencia líder (en negrita) y los sitios de escisión primario y secundario resaltados. La correspondiente numeración de aminoácidos usando la numeración convencional se muestra entre paréntesis. La figura 5B muestra una tabla que indica las características de los residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 1 que se corresponden con los residuos de aminoácido usando la nomenclatura normal de MIS (en la que el primer aminoácido numerado comienza después de la secuencia líder). La figura 5B da a conocer “RAQR/S” como SEQ ID NO: 26.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de MIS humana recombinante modificada que tiene al menos una de las siguientes características; escisión mejorada, bioactividad aumentada, potencia aumentada y puede producirse un alto rendimiento en comparación con la proteína de MIS humana de tipo natural, en la que la proteína de MIS humana recombinante comprende una combinación de los siguientes: un sitio de escisión Kex modificado para escisión aumentada y una secuencia líder distinta de MIS en lugar de la secuencia líder de MIS normal, para mejorar el rendimiento de la proteína bioactiva. En algunas realizaciones, esta MIS modificada es con o sin un marcador interno, o etiqueta, para facilitar su purificación.

Por consiguiente, en el presente documento los inventores han cambiado mediante ingeniería la secuencia humana nativa para aumentar la escisión endógena y, por tanto, la potencia de MIS. Los inventores también han insertado, opcionalmente, una etiqueta para facilitar su purificación.

Los inventores también han modificado de manera adicional la proteína de MIS humana recombinante para comprender una secuencia líder distinta de MIS en vez de la secuencia líder de MIS de 25 aminoácidos de los aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la secuencia líder comprende una secuencia líder de albúmina, tal como una secuencia de albúmina sérica humana (HSA) o un fragmento funcional o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la secuencia líder comprende 24 aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o un fragmento funcional de la misma, y reemplaza los residuos de los aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1. Esta adición, sorprendentemente, ha aumentado adicionalmente la escisión de la proteína recombinante de MIS. Esta combinación ha conducido a un mayor rendimiento de un producto que es más homogéneo, con potencia aumentada debido a la escisión aumentada. Esta combinación de cambios produce una variante de MIS humana recombinante que puede satisfacer una necesidad previamente insatisfecha para tener una de MIS bioactiva que se marca para su uso en el receptor y otros sitios de unión que serán muy importantes tanto para la selección de pacientes para tratamiento como para abordar las cuestiones del mecanismo de acción molecular con respecto a la interacción de MIS en diversos tejidos que portan receptores Además, el ligando marcado será esencial para determinar si existe otro receptor u otras proteínas de unión en diversos tejidos. En el presente documento, los inventores demuestran la producción de una MIS marcada con epítopo de manera interna que conserva la bioactividad completa en el ensayo de regresión del conducto de Müller. En una realización, la etiqueta es una etiqueta “FLAG” debido a la disponibilidad de reactivos de alta calidad usados para su detección y purificación.

Tal como se analiza en el presente documento, la presente invención proporciona un método para tratar una variedad de estados administrando una cantidad eficaz de una proteína de MIS humana recombinante y fragmentos funcionales y derivados de la misma tal como se da a conocer en el presente documento a un sujeto que lo necesita. Los estados que pueden tratarse con los compuestos de esta invención, o una composición farmacéutica que contenga los mismos, incluyen cualquier estado que se trate o reduzca los síntomas mediante la administración de MIS humana o la activación de la señalización de MIS o la activación de MISRII y, por tanto, se beneficie de la administración de una proteína de MIS humana recombinante y fragmentos funcionales y derivados de la misma. Las condiciones representativas a este respecto incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, cánceres que expresan receptores de MIS, por ejemplo cáncer que expresa MISRII, por ejemplo, pero sin limitarse a cáncer de ovario, cuello uterino y endometrio. Otros estados que pueden tratarse con MIS o la activación de la señalización de MIS reduce los síntomas son enfermedades proliferativas tales como el cáncer o estadios androgénicos anómalamente altos tales como la enfermedad de ovario poliquístico, pubertad precoz y otros trastornos hiperandrogénicos, tales como la testotoxicosis o cualquier tumor dependiente de andrógenos tal como el cáncer de próstata.

Definiciones:

Por conveniencia, aquí se recopilan determinados términos empleados en toda la solicitud (incluyendo la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas). A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.

El término “sustancia inhibidora muleriana” y “MIS” se usan de manera intercambiable en el presente documento y también se conoce como hormona antimuleriana o AMH, se refiere a compuestos y materiales que son estructuralmente similares a MIS. Por “MIS” o “sustancia inhibidora muleriana” se entiende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 96%, o al menos aproximadamente el 97%, o al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% idéntica a los residuos de aminoácido 26-560 de SEQ ID NO: 1. La presente invención está destinada a incluir formas mutantes de MIS humana recombinante que tienen sustancialmente la misma o mayor actividad biológica que la MIS de tipo natural. Los ejemplos de tales moléculas de MIS mutantes que portan una deleción, inserción o alteración en la secuencia de aminoácidos de MIS de tipo natural (por ejemplo, residuos de aminoácido 26-560 de SEQ ID NO: 1). Otras formas de sustancias incluidas son, por ejemplo, sales, derivados funcionales y formas agliconas de MIS de tipo natural y MIS humana recombinante. Además, la proteína de MIS recombinante humana puede obtenerse usando tecnología de ADN recombinante o mediante síntesis química de la proteína de MIS. Solo con fines de referencia, el ácido nucleico de MIS humana de tipo natural corresponde al n.° de RefSeq: NM_000479.

El término “receptor de tipo II de la sustancia inhibidora muleriana” o “MISRII” se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse al receptor de tipo II para MIS. El término MISRII pretende abarcar todos los receptores de MIS sustancialmente homólogos a MISRII y derivados funcionales de MISRII. MISRII también se conoce por el alias de AMHR2, y con fines de referencia, la secuencia de ácido nucleico de MISRII humano corresponde a NM_020547 y el n.° de GenBank: AF172932.

El término “de tipo natural” se refiere a la secuencia de polinucleótido que se produce de manera natural que codifica para una proteína, o una porción de la misma, o una secuencia de proteína, o porción de la misma, respectivamente, como existe normalmente in vivo. Por consiguiente, tal como se da a conocer en el presente documento, la secuencia de aminoácidos de tipo natural para la preproproteína de MIS humana corresponde a SEQ ID NO: 1, en la que los residuos de aminoácido 1-25 corresponden a la secuencia líder. La proproteína de MIS comprende residuos de aminoácido 26-560 de SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, que carece de la secuencia líder 1-25), que luego se procesa de manera postraduccional mediante escisión tal como se ha comentado en el presente documento para formar un homodímero de MIS bioactivo.

El término “polipéptido de MIS soluble” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido de MIS que no comprende al menos parte de, o todos, los aminoácidos que le permiten unirse de manera funcionales a la membrana.

Por un “polinucleótido que codifica para MIS” se entiende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 96%, o al menos aproximadamente el 97%, o al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácido 26-560 de SEQ ID NO: 1.

El término “mutante” se refiere a cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular un cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia de polinucleótidos de tipo natural o cualquier cambio en una secuencia de proteína de tipo natural. El término “variante” se usa de manera intercambiable con “mutante”. Aunque a menudo se supone que un cambio en el material genético da como resultado un cambio en la función de la proteína, los términos “mutante” y “variante” se refieren a un cambio en la secuencia de una proteína de tipo natural independientemente de si ese cambio altera la función de la proteína (por ejemplo, aumenta, disminuye, confiere una nueva función), o si ese cambio no tiene efecto sobre la función de la proteína (por ejemplo, la mutación o variación es silenciosa). El término mutación se usa de manera intercambiable en el presente documento con polimorfismo en esta solicitud.

El término “agente” o “compuesto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una entidad química o producto biológico, o una combinación de entidades químicas o productos biológicos, administrados a un sujeto para tratar o prevenir o controlar una enfermedad o estado. La entidad química o producto biológico es preferiblemente, pero no necesariamente, un compuesto de bajo peso molecular, pero también puede ser un compuesto más grande, o cualquier molécula orgánica o inorgánica, incluyendo ácidos nucleicos modificados y no modificados tales como ácidos nucleicos antisentido, ARNi, como ARNip o ARNhc, péptidos, peptidomiméticos, receptores, ligandos y anticuerpos, aptámeros, polipéptidos, análogos de ácidos nucleicos o variantes de los mismos. Por ejemplo, un oligómero de ácidos nucleicos, aminoácidos o hidratos de carbono que incluye, sin limitación, proteínas, oligonucleótidos, ribozimas, ADNzimas, glicoproteínas, ARNip, lipoproteínas, aptámeros y modificaciones y combinaciones de los mismos.

El término “ácido nucleico” es bien conocido en la técnica. Un “ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento se referirá generalmente a una molécula (es decir, una cadena) de ADN, ARN o un derivado o análogo del mismo, que comprende una nucleobase. Una nucleobase incluye, por ejemplo, una base de purina o pirimidina que se produce de manera natural que se encuentra en el ADN (por ejemplo, una adenina “A”, una guanina “G”, una timina “T” o una citosina “C”) o ARN (por ejemplo, una A, una G, un uracilo “U” o una C). El término “ácido nucleico” abarca los términos “oligonucleótido” y “polinucleótido”, cada uno como un subgénero del término “ácido nucleico”. El término “oligonucleótido” se refiere a una molécula de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 100 nucleobases de longitud. El término “polinucleótido” se refiere a al menos una molécula de más de aproximadamente 100 nucleobases de longitud. El término “ácido nucleico” también se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (ARN). El término también debe entenderse que incluye, como equivalentes, análogos de o bien ARN o bien ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos y, según sea aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos monocatenarios (sentido o antisentido) y bicatenarios. Los términos “secuencia de polinucleótido” y “secuencia de nucleótidos” también se usan de manera intercambiable en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “gen” se refiere a un ácido nucleico que comprende un marco de lectura abierto que codifica para un polipéptido, que incluye secuencias de exón y (opcionalmente) intrón. Un “gen” se refiere a la secuencia codificante de un producto génico, así como a las regiones no codificantes del producto génico, incluyendo las regiones 5'UTR y 3'UTR, los intrones y el promotor del producto génico. Estas definiciones se refieren generalmente a una molécula de cadena sencilla, pero en realizaciones específicas también abarcarán una cadena adicional que es parcial, sustancial o totalmente complementaria a la molécula de cadena sencilla. Por tanto, un ácido nucleico puede abarcar una molécula de doble cadena o una molécula de doble cadena que comprende una o más cadenas complementarias o “complementos” de una secuencia particular que comprende una molécula. Tal como se usa en el presente documento, un ácido nucleico monocatenario puede indicarse con el prefijo “mc”, un ácido nucleico bicatenario con el prefijo “bc” y un ácido nucleico triple hebra con el prefijo “tc”. El término “gen” se refiere al segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica, incluye regiones que preceden y siguen a la región codificante así como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones). Un “promotor” es una región de una secuencia de ácido nucleico en la que se controlan el inicio y la velocidad de transcripción. Puede contener elementos a los que pueden unirse proteínas y moléculas reguladoras, tal como la ARN polimerasa y otros factores de transcripción, para iniciar la transcripción específica de una secuencia de ácido nucleico. El término “potenciador” se refiere a una secuencia reguladora que actúa en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico. Un potenciador puede funcionar en cualquier orientación y puede estar en el sentido de 5' o en el sentido de 3' del promotor.

Tal como se usa en el presente documento, el término “producto(s) génico(s)” se usa para referirse a incluir ARN transcrito de un gen (por ejemplo, ARNm), o un polipéptido codificado por un gen o traducido a partir de ARN.

Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan de manera intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácido y no se limitan a una longitud mínima. Los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares también se componen de aminoácidos dispuestos de manera lineal unidos por enlaces peptídicos, y se incluyen si se producen de manera biológica, recombinante o sintética y si se componen de aminoácidos que se producen de manera natural o de manear no natural dentro de esta definición. Tanto las proteínas de longitud completa como fragmentos de las mismas están abarcados en la definición. Los términos también incluyen modificaciones cotraduccionales (por ejemplo, escisión de la secuencia líder de los aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1) y postraduccionales del polipéptido, tal como, por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, acetilación, fosforilación, escisión proteolítica (por ejemplo, escisión por furinas o metaloproteasas y prohormonas convertasas (PC)) y similares. Además, para los fines de la presente invención, un “polipéptido” abarca una proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservativa tal como sería conocido por una persona en la técnica), a la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, tal como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como por mutaciones de huéspedes que producen las proteínas, o errores debidos a la amplificación por PCR u otros métodos de ADN recombinante. Los polipéptidos o proteínas se componen de aminoácidos dispuestos de manera lineal unidos por enlaces peptídicos, pero a diferencia de los péptidos, tienen una conformación bien definida. Las proteínas, a diferencia de los péptidos, consisten generalmente en cadenas de 50 o más aminoácidos. Para los fines de la presente invención, el término “péptido” tal como se usa en el presente documento normalmente se refiere a una secuencia de aminoácidos compuesta por una cadena simple de D- o L-aminoácidos o una mezcla de D- y L-aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Generalmente, los péptidos contienen al menos dos residuos de aminoácido y tienen menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud.

La incorporación de aminoácidos no naturales, incluyendo aminoácidos no nativos sintéticos, aminoácidos sustituidos o uno o más D-aminoácidos en los péptidos (u otros componentes de la composición, con excepción de las secuencias de reconocimiento de proteasas) es deseable en determinadas situaciones. Los péptidos que contienen D-aminoácidos presentan una mayor estabilidad in vitro o in vivo en comparación con las formas que contienen L-aminoácidos. Por tanto, la construcción de péptidos que incorporan D-aminoácidos puede ser particularmente útil cuando se desea o se requiere una mayor estabilidad in vivo o intracelular. Más específicamente, los D-péptidos son resistentes a las peptidasas y proteasas endógenas, proporcionando así una mejor administración oral transepitelial y transdérmica de fármacos unidos y conjugados, una biodisponibilidad mejorada de los complejos de membrana permanente (véase a continuación para un análisis adicional) y vidas útiles intravasculares e intersticiales prolongadas cuando tales propiedades sean deseables. El uso de péptidos de isómeros D también puede mejorar la administración transdérmica y transepitelial oral de fármacos unidos y otras moléculas de carga. Además, los D-péptidos no pueden procesarse de manera eficaz para la presentación restringida del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II a las células T cooperadoras y, por tanto, es menos probable que induzcan respuestas inmunitarias humorales en todo el organismo. Por tanto, los conjugados de péptidos pueden construirse usando, por ejemplo, formas de isómeros D de secuencias de péptidos que penetran en las células, formas de isómeros L de sitios de escisión y formas de isómeros D de péptidos terapéuticos. En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante se compone de residuos de D- o L-aminoácidos, ya que el uso de residuos de L-aminoácidos que se producen de manera natural tiene la ventaja de que cualquier producto de degradación debería ser relativamente no tóxico para la célula o el organismo.

En aún una realización adicional, una proteína de MIS humana recombinante o fragmentos o derivados de la misma pueden ser péptidos retroinversos. Un “péptido retroinverso” se refiere a un péptido con una inversión de la dirección del enlace peptídico en al menos una posición, es decir, una inversión de los extremos terminales amino y carboxilo con respecto a la cadena lateral del aminoácido. Por tanto, un análogo retroinverso ha invertido los extremos terminales y la dirección invertida de los enlaces peptídicos mientras mantiene aproximadamente la topología de las cadenas laterales como en la secuencia del péptido nativo. El péptido retroinverso puede contener L-aminoácidos o D-aminoácidos, o una mezcla de L-aminoácidos y D-aminoácidos, siendo hasta todos los aminoácidos el isómero D. Los análogos de péptidos retroinversos parciales son polipéptidos en los que solo una parte de la secuencia se invierte y se reemplaza con residuos de aminoácido enantioméricos. Dado que la porción retroinvertida de un análogo de este tipo tiene extremos terminales amino y carboxilo invertidos, los residuos de aminoácidos que flanquean la porción retroinvertida se reemplazan por diaminometanos y malonatos geminales a-sustituidos análogos de cadena lateral, respectivamente. Se ha descubierto que las formas retroinversas de péptidos que penetran en las células funcionan tan eficazmente en la translocación a través de una membrana como las formas naturales. La síntesis de análogos de péptidos retroinversos se describe en Bonelli F. et al., Int J Pept Protein Res.

24(6):553-6 (1984); Verdini, A y Viscomi, G. C., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:697-701 (1985); y la patente estadounidense n.° 6.261.569. Se han descrito procedimientos para la síntesis en fase sólida de análogos de péptidos retroinversos parciales (documento EP 97994-B).

El término “fragmento” de un péptido, polipéptido o molécula tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier subconjunto de polipéptido contiguo de la molécula. El término “fragmento de proteína” tal como se usa en el presente documento incluye secuencias de aminoácidos tanto sintéticas como que se producen de manera natural derivables de la secuencia de aminoácidos que se producen de manera natural de MIS (SEQ ID NO:1). Se dice que la proteína es “derivable a partir de la secuencia de aminoácidos que se produce de manera natural de una proteína de MIS humana recombinante” si puede obtenerse fragmentando la proteína de MIS humana recombinante, o si puede sintetizarse basándose en el conocimiento de la secuencia de la secuencia de aminoácidos que se produce de manera natural o del material genético (ADN o ARN) que codifica para esta secuencia. Por consiguiente, se entiende que un “fragmento” de una molécula se refiere a cualquier subconjunto de polipéptidos de la molécula. En algunas realizaciones, un fragmento funcional de MIS humana recombinante comprende al menos el dominio C-terminal y al menos el dominio N-terminal. En algunas realizaciones, un fragmento funcional comprende una porción del dominio C-terminal y/o una porción (por ejemplo, fragmento) del dominio N-terminal de la proteína de MIS humana recombinante. Los fragmentos de una proteína de MIS humana recombinante que tienen la actividad al menos o mayor que la proteína de MIS de tipo natural de SEQ ID NO: 1 tal como se da a conocer en el presente documento y que son solubles también se abarcan para su uso en la presente invención.

Los fragmentos de una proteína de MIS humana recombinante, por ejemplo, fragmentos funcionales de SEQ ID NO: 2 ó 3 útiles en los métodos tal como se dan a conocer en el presente documento tienen al menos el 30% de la actividad como la de un polipéptido de SEQ ID NO: 2 ó 3 in vivo, por ejemplo, para provocar la regresión del conducto de Müller en un bioensayo de la regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento en los ejemplos. Dicho de otra manera, un fragmento funcional de una proteína de MIS humana recombinante es un fragmento de cualquiera de SEQ ID NO: 2 ó 3 que, solo o como una proteína de fusión puede dar como resultado al menos el 30% de la misma actividad en comparación con SEQ ID NO: 2 ó 3 para unirse y activar MISRII, o provocar la regresión del conducto de Müller en un bioensayo de la regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento (véase la figura 4). Los fragmentos tal como se usan en el presente documento pueden ser solubles (es decir, no unidos a la membrana). Un “fragmento” puede ser al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300 ácidos nucleicos o aminoácidos, y todos los número enteros entre ellos. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen truncamientos C-terminales, truncamientos N-terminales o truncamientos tanto C- como N-terminales (por ejemplo, deleciones de, por ejemplo, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100 o más aminoácidos delecionados del extremo N-terminal, el extremo C-terminal, o ambos). Un experto habitual en la técnica puede crear tales fragmentos mediante un análisis de deleción simple. Un fragmento de este tipo de SEQ ID NO:2 ó 3 puede ser, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 aminoácidos o más de 10 aminoácidos, tales como 15, 30, 50, 100 o más de 100 aminoácidos delecionados desde el extremo N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID NO: 2 ó 3, respectivamente. Los expertos habituales en la técnica pueden identificar fácilmente el fragmento de péptido mínimo de SEQ ID NO: 2 ó 3 útil en los métodos y las composiciones tal como se dan a conocer en el presente documento, o proteínas de fusión tal como se dan a conocer en el presente documento, delecionando de manera secuencial aminoácidos N- y/o C-terminales de SEQ ID NO: 2 ó 3, o delecionando de manera secuencial aminoácidos N- y/o C-terminales de la proteína de MIS humana recombinante y evaluando la función del fragmento de péptido resultante, solo o cuando se escinde. Pueden crearse fragmentos funcionales con múltiples fragmentos más pequeños. Estos pueden unirse mediante ligadores peptídicos en puente. Pueden seleccionarse fácilmente ligadores para mantener la conformación de tipo natural. Un experto habitual en la técnica puede evaluar fácilmente la función de la proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento para activar MISRII o en el bioensayo de la regresión del conducto de Müller, tal como se da a conocer en el presente documento en comparación con una proteína de MIS humana recombinante correspondiente a SEQ ID NO: 2 ó 3. Usando un ensayo in vivo de este tipo, si el fragmento de la proteína de MIS humana recombinante tiene al menos el 30% de la actividad biológica de la proteína de MIS humana recombinante correspondiente a SEQ ID NO:2 ó 3 tal como se da a conocer en el presente documento, entonces el fragmento se considera un fragmento válido de la proteína de MIS humana recombinante y puede usarse en las composiciones y los métodos tal como se da a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, un fragmento de SEQ ID NO: 2 ó 3 puede ser de menos de 200, o menos de 150 o menos de 100, o menos de 50, o menos de 20 aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 3. En algunas realizaciones, un fragmento de SEQ ID NO: 2 ó 3 tiene menos de 100 péptidos de longitud. Sin embargo, tal como se indicó anteriormente, el fragmento debe ser de al menos 6 aminoácidos, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 500 ácidos nucleicos o aminoácidos, o cualquier número entero entre los mismos.

El término “derivado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a péptidos que se han modificado químicamente, por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante técnicas tales como ubiquitinación, marcaje, pegilación (derivatización con polietilenglicol) o adición de otras moléculas. Una molécula también es un “derivado” de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, la absorción, la semivida biológica, etc. de la molécula. Los restos pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseable de la molécula, etc. Los restos pueden mediar tales efectos se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (1990).

El término “funcional” cuando se usa junto con “derivado” o “variante” o “fragmento” se refiere a un polipéptido que posee una actividad biológica (o bien funcional o bien estructural) que es sustancialmente similar a la actividad biológica del que es un derivado funcional, variante o fragmento funcional del mismo. El término derivado funcional se entiende que incluye los fragmentos, análogos o derivados químicos de una molécula. Por “sustancialmente similar” en este contexto se entiende que la actividad biológica, por ejemplo, la activación de MISRII es al 25% o al menos el 35%, o al menos el 50% tan activa como un polipéptido de referencia, por ejemplo, un polipéptido de MIS o proteína de MIS humana recombinante de tipo natural correspondiente, y preferiblemente al menos el 60% tan activa, el 70% tan activa, el 80% tan activa, el 90% tan activa, el 95% tan activa, el 100% tan activa o incluso mayor (es decir, la variante o derivado tiene mayor actividad que el tipo natural), por ejemplo, el 110% tan activa, el 120% tan activa, o más. Dicho de otra manera, un fragmento funcional “sustancialmente similar” de una proteína de MIS humana recombinante en este contexto significa que se conserva al menos el 25%, al menos el 35%, al menos el 50% de la actividad biológica relevante o deseada de una proteína de MIS humana recombinante correspondiente. En el caso de un fragmento funcional o péptido de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 3), un fragmento funcional de SEQ ID NO: 2 ó 3 podría ser una proteína o un péptido que comprende una porción de SEQ ID NO: 2 ó 3 que conserva una actividad para activar MISRII, o en el bioensayo de la regresión del conducto de Müller, tal como se da a conocer en el presente documento en los ejemplos; preferiblemente el fragmento de SEQ ID NO: 2 ó 3 que conserva al menos el 25%, al menos el 35%, al menos el 50% al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% o incluso mayor (es decir, la variante o derivado tiene mayor actividad que la MIS de tipo natural de SEQ ID NO: 1 o de una proteína de MIS humana recombinante de SEQ ID NO 2 ó 3), por ejemplo, al menos el 110%, al menos el 120%, o más actividad en comparación con la SEQ ID NO: 2 ó 3 de longitud completa para activar MISRII o provocar la regresión del conducto de Müller en el bioensayo de la regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento. Como otro ejemplo, en el caso de un fragmento de MIS (por ejemplo, aminoácidos 26-560 de SEQ ID NO: 1) podría ser una proteína o un péptido que comprende una porción de aminoácidos 26-560 de SEQ ID NO: 1 que conserva una actividad para la regresión del conducto de Müller, preferiblemente el fragmento de aminoácidos 26-560 de SEQ ID NO: 1 conserva al menos el 25%, al menos el 35%, al menos el 50% al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% o incluso mayor (es decir, la variante o derivado tiene mayor actividad que el de tipo natural), por ejemplo, al menos el 110%, al menos el 120%, o más actividad en comparación con los aminoácidos 26-560 de longitud completa de SEQ ID NO: 1 para provocar la regresión del conducto de Müller en un bioensayo de regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento en los ejemplos. Como un ejemplo alternativo ejemplo, un fragmento de una secuencia líder de HSA de SEQ ID NO: 6 podría ser una proteína o un péptido que comprende una porción de SEQ ID NO: 6 que retuvo al menos el 25%, al menos el 35%, al menos el 50% al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100% o incluso mayor (es decir, la variante o derivado tiene mayor actividad que la secuencia de HSA de tipo natural), por ejemplo, al menos el 110%, al menos el 120%, o más actividad en comparación con la secuencia de HSA de longitud completa de SEQ ID NO: 6, tal como se determina mediante un ensayo, por ejemplo tal como se da a conocer en la patente estadounidense 5.759.802.

El término “derivado funcional” y “mimético” o “variante biológicamente activa” o “fragmento biológicamente activo” se usan de manera intercambiable y se refiere a un compuesto que posee una actividad biológica (o bien funcional o bien estructural) que es sustancialmente similar a una actividad biológica de la entidad o molécula que es un derivado funcional de (por ejemplo, la proteína de MIS humana recombinante). El término derivado funcional pretende incluir los fragmentos, variantes, análogos o derivados químicos de una molécula.

El término “derivados funcionales” pretende incluir los “fragmentos”, “variantes”, “análogos” o “derivados químicos” de una molécula. Se dice que una molécula es “sustancialmente similar” a otra molécula si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar. Por tanto, siempre que dos moléculas posean una actividad similar, se consideran variantes ya que ese término se usa en el presente documento incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en la otra, o si la secuencia de residuos de aminoácido no es idéntica. Un “análogo” de una proteína de MIS humana recombinante se refiere a una molécula sustancialmente similar en función a la molécula completa o a un fragmento de la misma. Tal como se usa en el presente documento, se dice que una molécula es un “derivado químico” de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, la absorción, la semivida biológica, etc. de la molécula. Los restos pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseable de la molécula, etc. Los restos pueden mediar tales efectos se da a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (1990).

Una “variante” de una proteína de MIS humana recombinante pretende hacer referencia a una molécula sustancialmente similar en estructura y función a la molécula completa o a un fragmento de la misma. Por consiguiente, el término “variante” tal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido o ácido nucleico que difiere del polipéptido o ácido nucleico que se produce de manera natural en una o más deleciones, adiciones, sustituciones o modificaciones de la cadena lateral de aminoácidos o ácidos nucleicos, pero aún conserva una o más funciones o actividades biológicas específicas de la molécula que se produce de manera natural. Las sustituciones de aminoácidos incluyen alteraciones en las que un aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido diferente que se produce de manera natural o no convencional. Tales sustituciones pueden clasificarse como “conservativas”, en cuyo caso un residuo de aminoácido contenido en un polipéptido se reemplaza con otro aminoácido de carácter similar que se produce de manera natural en relación con la polaridad, la funcionalidad de la cadena lateral o el tamaño. Las sustituciones abarcadas por la presente invención también pueden ser “no conservativas”, en las que un residuo de aminoácido que está presente en un péptido se sustituye por un aminoácido que tiene propiedades diferentes, tales como un aminoácido que se produce de manera natural de un grupo diferente (por ejemplo, sustituyendo un aminoácido cargado o hidrófobo con alanina), o alternativamente, en el que un aminoácido que se produce de manera natural se sustituye por un aminoácido no convencional. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son conservativas. También se abarca dentro del término variante cuando se usa con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que puede variar en estructura primaria, secundaria o terciaria, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de tipo natural). Se pretende que una “variante” de una proteína de MIS humana recombinante se refiera a una molécula sustancialmente similar en estructura y función, es decir, en la que la función es la capacidad para activar MISRII.

Por ejemplo, una variante de una proteína de MIS humana recombinante puede contener una mutación o modificación que difiere de un aminoácido de referencia en SEQ ID NO: 2 ó 3. En algunas realizaciones, una variante de ^sE^qID NO: 2 ó 3 es un fragmento de SEQ ID NO: 2 ó 3 tal como se da a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, una variante puede ser una isoforma diferente de SEQ ID NO: 2 ó 3 o puede comprender diferentes aminoácidos isoméricos. Las variantes pueden ser polinucleótidos o polipéptidos sintéticos, recombinantes o químicamente modificados que se producen de manera natural, aislados o generados usando métodos bien conocidos en la técnica. Las variantes pueden incluir cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos, tal como se describe a continuación. Los cambios de polinucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las variantes también pueden incluir inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, incluyendo inserciones y sustituciones de aminoácidos y otras moléculas) que no se producen normalmente en la secuencia peptídica que es la base de la variante, por ejemplo, pero sin limitarse a la inserción de ornitina. que no se produce normalmente en las proteínas humanas.

El término “sustitución conservativa”, cuando describe un polipéptido, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos del polipéptido que no altera sustancialmente la actividad del polipéptido. Por ejemplo, una sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente que tiene propiedades químicas similares. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen el reemplazo de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato o una treonina por una serina. Las “sustituciones conservativas de aminoácidos” resultan del reemplazo de un aminoácido por otro que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato o una treonina por una serina. Por tanto, una “sustitución conservativa” de una secuencia de aminoácidos particular se refiere a la sustitución de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad polipeptídica o la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácidos, básicos, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.) de manera que la sustitución de incluso aminoácidos críticos no reduce la actividad del péptido (es decir, la capacidad del péptido para reducir las células T-reg y/o disminuir las citocinas inflamatorias tal como se da a conocer en el presente documento). Las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W). (Véase también Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984).) En algunas realizaciones, las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos también pueden considerarse “sustituciones conservativas” si el cambio no reduce la actividad de la proteína de MIS. (es decir, la capacidad de una proteína o variante de MIS humana recombinante para producir la regresión del conducto de Müller in vivo, que puede determinarse usando el bioensayo de regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento). Las inserciones o deleciones están normalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La elección de los aminoácidos conservativos puede seleccionarse basándose en la ubicación del aminoácido que va a sustituirse en el péptido, por ejemplo, si el aminoácido está en el exterior del péptido y se expone a disolventes, o en el interior y no se expone a disolventes.

En realizaciones alternativas, puede seleccionarse el aminoácido que sustituirá a un aminoácido existente basándose en la ubicación del aminoácido existente, es decir, su exposición a disolventes (es decir, si el aminoácido se expone a disolventes o está presente en la superficie exterior del péptido o polipéptido en comparación con los aminoácidos ubicados internamente no expuestos a disolventes). La selección de tales sustituciones conservativas de aminoácidos es bien conocida en la técnica, por ejemplo, tal como se da a conocer en Dordo et al., J. Mol Biol, 1999, 217, 721-739 y Taylor et al, J. Theor. Biol. 119 (1986); 205-218 y S. French y B. Robson, J. Mol. Evol. 19 (1983)171. Por consiguiente, pueden seleccionarse sustituciones de aminoácidos conservativas adecuadas para aminoácidos en el exterior de una proteína o péptido (es decir, aminoácidos expuestos a un disolvente), por ejemplo, pero sin limitarse a, pueden usarse las siguientes sustituciones: sustitución de Y por F, T por S o K, P por A, E por D o Q, N por D o G, R por K, G por N o A, T por S o K, D por N o E, I por L o V, F por Y, S por T o A, R por K, G por N o A, K por R, A por S, K o P.

En realizaciones alternativas, también pueden seleccionarse sustituciones conservativas de aminoácidos abarcadas adecuadas para aminoácidos en el interior de una proteína o péptido, por ejemplo, pueden usarse sustituciones conservativas adecuadas para aminoácidos en el interior de una proteína o péptido (es decir, los aminoácidos no se exponen a un disolvente), por ejemplo, pero sin limitarse a, pueden usarse las siguientes sustituciones conservativas: en las que Y se sustituye por F, T por A o S, I por L o V, W por Y, M por L, N por D, G por A, T por A o S, D por N, I por L o V, F por Y o L, S por A o T y A por S, G, T o V. En algunas realizaciones, Las sustituciones de aminoácidos no conservativas también se abarcan dentro del término de variantes. Una variante de una proteína de MIS humana recombinante, por ejemplo una variante de SEQ ID NO: 2 ó 3, se refiere a cualquier molécula sustancialmente similar en estructura y función a la molécula completa de SEQ ID NO: 2 ó 3, o a un fragmento de la misma.

Los términos “homología”, “identidad” y “similitud” se refieren al grado de similitud de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico alineadas de manera óptima. La homología y la identidad pueden determinarse cada una comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Por ejemplo, se basa en el uso de un software de homología convencional en la posición predeterminada, tal como BLAST, versión 2.2.14. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por residuos de aminoácidos similares (por ejemplo, similares en naturaleza estérica y/o electrónica tal como, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas), entonces las moléculas pueden denominarse homólogas (similares) en esa posición. La expresión como porcentaje de homología/similitud o identidad se refiere a una función del número de aminoácidos similares o idénticos en posiciones compartidas por las secuencias comparadas, respectivamente. Una secuencia que es “no relacionada” o “no homóloga” comparte menos del 40% de identidad, aunque preferiblemente menos del 25% de identidad con las secuencias tal como se dan a conocer en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “identidad de secuencia” significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (es decir, en una base nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) en la ventana de comparación. El término “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que se produce la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T. C, G, U o I) o residuo en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos “identidad sustancial” tal como se usan en el presente documento denotan una característica de una secuencia de polinucleótidos o aminoácidos, en la que el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85%, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos del 90% al 95%, más habitualmente una identidad de secuencia de al menos el 99% en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente en una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en la que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. El término “similitud”, cuando se usa para describir un polipéptido, se determina comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “homólogo” u “homólogos” se usan de manera intercambiable, y cuando se usan para describir un polinucleótido o polipéptido, indican que dos polinucleótidos o polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan de manera óptima, por ejemplo usando BLAST, versión 2.2.14 con parámetros predeterminados para una alineación (véase en el presente documento) son idénticos, con inserciones o deleciones de nucleótidos o inserciones o deleciones de aminoácidos apropiadas, en al menos el 70% de los nucleótidos, habitualmente de aproximadamente el 75% al 99%, y más preferiblemente al menos aproximadamente del 98 al 99% de los nucleótidos. El término “homólogo” u “homólogo” tal como se usan en el presente documento también se refiere a homología con respecto a la estructura y/o la función. Con respecto a la homología de secuencia, las secuencias son homólogas si son al menos el 50%, al menos el 60 al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% idénticas, al menos el 97% idénticas o al menos el 99% idénticas. La determinación de homólogos de los genes o péptidos de la presente invención puede ser comprobada fácilmente por un experto en la técnica.

El término “sustancialmente homóloga” se refiere a secuencias que son al menos el 90%, al menos el 95% idénticas, al menos el 96%, idénticas al menos el 97% idénticas, al menos el 98% idénticas o al menos el 99% idénticas. Las secuencias homólogas pueden ser el mismo gen funcional en diferentes especies. La determinación de homólogos de los genes o péptidos de la presente invención puede ser comprobada fácilmente por un experto en la técnica.

Se dice que una molécula es “sustancialmente similar” a otra molécula si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar, por ejemplo si ambas moléculas pueden activar MISRII. Por tanto, siempre que dos moléculas poseen una actividad similar, (es decir una variante de una proteína de MIS humana recombinante que puede activar MISRII similar a la de la proteína de MIS que corresponde a SEQ ID NO: 1, o proteína de MIS humana recombinante que corresponde a SEQ ID NO: 2 ó 3) se consideran variantes y se abarcan para su uso tal como se da a conocer en el presente documento, incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en la otra, o si la secuencia de residuos de aminoácido no es idéntica. Por tanto, siempre que dos moléculas posean una actividad biológica similar, se consideran variantes ya que ese término se usa en el presente documento incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en la otra, o si la secuencia de residuos de aminoácido no es idéntica. En particular, el término “sustancialmente similar”, cuando se usa para definir una proteína de MIS humana recombinante que comprende una variante funcional de proteína de MIS humana recombinante en comparación con la proteína de MIS humana recombinante codificada por SEQ ID NO:2 ó 3, significa que una secuencia objetivo particular, por ejemplo, una secuencia de variante o derivado de proteína de MIS humana recombinante, varía de la secuencia de la MIS natural (o de tipo natural) de SEQ ID NO: 1 o proteína de MIS humana recombinante (es decir, codificada por SEQ ID NO: 2 ó 3), en una o más sustituciones, deleciones, o adiciones, aunque el efecto neto de las cuales es conservar al menos algo de la actividad biológica encontrada en la proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento. Como tal, las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos que tienen menores grados de similitud pero una actividad biológica comparable a la proteína de MIS humana recombinante se consideran que son equivalentes. Al determinar las secuencias de polinucleótido, se considera que todas las secuencias de polinucleótidos objeto pueden codificar para secuencias de aminoácidos sustancialmente similares son sustancialmente similares a una secuencia de polinucleótidos de referencia, independientemente de las diferencias en la secuencia de codones. Una secuencia de nucleótidos es “sustancialmente similar” a una secuencia de ácido nucleico específica de SEQ ID NO: 4 ó 5 tal como se da a conocer en el presente documento si: (a) la secuencia de nucleótidos se hibrida con las regiones codificantes del ácido nucleico de MIS natural, o (b) la secuencia de nucleótidos puede hibridar con la secuencia de nucleótidos de una proteína de MIS humana recombinante codificada por SEQ ID NO: 4 o 5 en condiciones moderadamente rigurosas y tiene una actividad biológica similar a la proteína de MIS humana recombinante; o (c) las secuencias de nucleótidos que son degenerativas como resultado del código genético de las secuencias de nucleótidos definidas en (a) o (b). Las proteínas sustancialmente similares serán normalmente más de aproximadamente un 80% similares a la secuencia correspondiente de la proteína nativa.

El término “similitud sustancial” en el contexto de las secuencias de polipéptido, indica que el polipéptido comprende una secuencia con una identidad de secuencia de al menos 60% con una secuencia de referencia, o el 70%, o el 80%, o el 85% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia, o lo más preferiblemente el 90% de identidad sobre una ventana de comparación de aproximadamente 10-20 residuos de aminoácidos. En el contexto de las secuencias de aminoácidos, la “similitud sustancial” incluye además sustituciones conservativas de aminoácidos. Por tanto, un polipéptido es sustancialmente similar a un segundo polipéptido, por ejemplo, en el que los dos péptidos difieren en una o más sustituciones conservativas.

En una realización, el término “homólogo humano” de un transcrito de gen se refiere a una secuencia de ADN que tiene al menos aproximadamente el 55% de homología con la secuencia de nucleótidos de longitud completa de la secuencia de un gen de proteína de MIS humana recombinante codificada por el genoma de seres humanos o un animal, por ejemplo, un ratón o un animal transgénico. En una realización, el término “homólogo humano” de una proteína identificada como asociada con una proteína de MIS humana recombinante se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene el 40% de homología con la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína identificada como asociada con una proteína de MIS humana recombinante codificada por el genoma del animal transgénico de la presente invención, más preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente el 60% de homología, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente el 70% de homología, incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente el 75% de homología, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80% de homología, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de homología, todavía más preferiblemente, al menos aproximadamente el 90% de homología, y más preferiblemente, al menos aproximadamente el 95% de homología. Tal como se comentó anteriormente, la homología es de al menos aproximadamente del 50% al 100% y todos los intervalos entre los mismos (es decir, el 55%, el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, etc.). La determinación de los homólogos humanos de los genes de la presente invención puede ser determinada fácilmente por el experto en la técnica.

El término “sustitución conservativa”, cuando describe un polipéptido, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos del polipéptido que no altera sustancialmente la actividad del polipéptido. Por tanto, una “sustitución conservativa” de una secuencia de aminoácidos particular se refiere a la sustitución de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad polipeptídica o la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácidos, básicos, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.) de modo que la sustitución de incluso aminoácidos críticos no altere sustancialmente la actividad. Las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), serina (S), treonina (T); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); y 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W). (Véase también Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984).) Además, las sustituciones, deleciones o adiciones individuales que alteran, añaden o delecionan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada también son “sustituciones conservativas”.

Tal como se usa en el presente documento, el término “no conservativa” se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente que tiene diferentes propiedades químicas. Las sustituciones no conservativas incluyen, pero no se limitan a, el reemplazo del ácido aspártico (D) por glicina (G); asparagina (N) reemplazada por lisina (K); o alanina (A) reemplazada por arginina (R).

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados.

La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970) mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspección visual. (Véase, en general Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4a ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1999)).

Un ejemplo de algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas por pares para mostrar el porcentaje de identidad de secuencia. También traza un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle (J. Mol. Evol.

25:351-60 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (Comput. Appl. Biosci. 5:151-53 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple comienza con la alineación por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento se alinea luego con la siguiente secuencia más relacionada o agrupamiento de secuencias alineadas. Dos agrupamientos de secuencias se alinean mediante una simple extensión de la alineación por pares de dos secuencias individuales. La alineación final se logra mediante una serie de alineaciones progresivas por pares. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para las regiones de comparación de secuencias y designando los parámetros del programa. Por ejemplo, una secuencia de referencia puede compararse con otras secuencias de prueba para determinar la relación de porcentaje de identidad de secuencia usando los siguientes parámetros: valor de hueco predeterminado (3,00), valor de longitud de hueco predeterminado (0,10) y huecos finales ponderados.

Otro ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe por Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). (Véase también Zhang et al., Nucleic Acid Res. 26:3986-90 (1998); Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997). El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través de la página web de Internet del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntuación de palabras de vecindad (Altschul et al. (1990), citado anteriormente). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa está en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9 (1992) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0,1, más normalmente menos de aproximadamente 0,01 y más normalmente menos de aproximadamente 0,001.

El término “inserciones” o “deleciones” se encuentra normalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse de manera experimental produciendo el péptido de manera sintética mientras se hacen inserciones, deleciones o sustituciones de manera sistemática de nucleótidos en la secuencia usando técnicas de ADN recombinante.

El término “sustitución” cuando se refiere a un péptido, se refiere a un cambio en un aminoácido por una entidad diferente, por ejemplo, otro aminoácido o resto de aminoácido. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.

Un “análogo” de una molécula tal como una proteína de MIS humana recombinante, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 ó 3 se refiere a una molécula similar en función a la molécula completa o a un fragmento de la misma. El término “análogo” también pretende incluir variantes alélicas, de especies e inducidas. Los análogos difieren normalmente de los péptidos que se producen de manera natural en una o unas pocas posiciones, a menudo en virtud de sustituciones conservativas. Los análogos presentan normalmente una identidad de secuencia de al menos el 80 o el 90% con péptidos naturales. Algunos análogos también incluyen aminoácidos no naturales o modificaciones de aminoácidos N o C terminales. Los ejemplos de aminoácidos no naturales son, por ejemplo, pero sin limitarse a; aminoácidos acedisustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, g-N,N,N-trimetilisina, g-N-acetilisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina. Los fragmentos y análogos pueden cribarse para determinar su eficacia profiláctica o terapéutica en modelos animales transgénicos tal como se describe a continuación.

Por “unido covalentemente” se entiende unido directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un ligador) mediante un enlace químico covalente.

El término “proteína de fusión” tal como se usa en el presente documento se refiere a una proteína recombinante de dos o más proteínas. Las proteínas de fusión pueden producirse, por ejemplo, mediante una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que se une al ácido nucleico que codifica para otra proteína de modo que constituyan un único marco de lectura abierto que pueda traducirse en las células en un único polipéptido que alberga todos los proteínas previstas. El orden de disposición de las proteínas puede variar. Como ejemplo no limitativo, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión de MIS humana recombinante se deriva de la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento derivado funcional o una variante de la misma, fusionado en marco a un extremo, ya sea el extremo 5' o el 3' de un gen que codifica para un primer componente de fusión, tal como un fragmento Fc de IgG1. De esta manera, en la expresión del gen, la proteína de MIS humana recombinante o el fragmento derivado funcional o una variante de la misma se expresa de manera funcional y se fusiona con el extremo N-terminal o C-terminal del Fc de IgG1 En determinadas realizaciones, la modificación de la sonda polipeptídica es tal que la funcionalidad de la proteína de MIS humana recombinante o un fragmento derivado funcional o una variante de la misma permanece sustancialmente inalterada en términos de su actividad biológica por fusión con el primer componente de fusión, tal como Fc de IgG1.

Por “se une específicamente” o “unión específica” se entiende un compuesto o anticuerpo que reconoce y se une a un polipéptido deseado pero que no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que incluye de manera natural un polipéptido de la invención.

Por “sustancialmente puro” se entiende un ácido nucleico, polipéptido u otra molécula que se ha separado de los componentes que lo acompañan de manera natural. Normalmente, un polipéptido es sustancialmente puro cuando es al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o incluso al menos aproximadamente el 99%, en peso, libre de proteínas y moléculas orgánicas que se producen de manera natural con las que se asocia de manera natural. Por ejemplo, puede obtenerse un polipéptido sustancialmente puro mediante extracción de una fuente natural, por expresión de un ácido nucleico recombinante en una célula que no expresa normalmente esa proteína, o mediante síntesis química.

Por “estabilidad proteolítica mejorada” se entiende una reducción en la tasa o extensión de la proteólisis de una secuencia peptídica en al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% en comparación con una secuencia de control en las mismas condiciones (por ejemplo, in vivo o en un sistema in vitro tal como en una célula o lisado celular). Un péptido con estabilidad proteolítica mejorada puede contener cualquier modificación, por ejemplo, inserciones, deleciones, o mutaciones puntuales que reducen o eliminan un sitio objeto para la escisión proteolítica en un sitio particular. Los sitios de escisión proteolítica pueden identificarse basándose en secuencias diana conocidas o usando un software informático (por ejemplo, el software descrito por Gasteiger et al., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. En John M. Walquer, ed. The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005)). Alternativamente, los sitios proteolíticos pueden determinarse de manera experimental, por ejemplo, mediante inmunotransferencia de tipo Western para la proteína tras la expresión o incubación en un sistema celular o lisado celular, seguido por secuenciación de los fragmentos identificados para determinar sitios de escisión.

El término “recombinante” tal como se usa en el presente documento para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, viral, semisintético y/o sintético, que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con todo o con un porción del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza. El término recombinante, tal como se usa con respecto a una proteína o polipéptido, significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. El término recombinante tal como se usa con respecto a una célula huésped significa una célula huésped en la que se ha introducido un polinucleótido recombinante. Recombinante también se usa en el presente documento para referirse, con referencia a material (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector) que el material ha sido modificado mediante la introducción de un material heterólogo (por ejemplo, una célula, un ácido nucleico, una proteína o un vector).

Los términos “sujeto” e “individuo” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a un animal, por ejemplo, un ser humano, al que se le proporciona tratamiento, incluyendo el tratamiento profiláctico, con la composición farmacéutica según la presente invención. El término “sujeto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a animales humanos y no humanos. El término “animales no humanos” y “mamíferos no humanos” se usan de manera intercambiable en el presente documento e incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como primates no humanos (en particular primates superiores), ovejas, perros, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobaya, cabra, cerdo, gato, conejos, vacas y no mamíferos tales como pollos, anfibios, reptiles, etc. En una realización, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal de experimentación o un sustituto de animal como modelo de enfermedad. El término no denota una edad o sexo particular. Por tanto, pretende cubrirse a sujetos adultos y recién nacidos, así como a fetos, ya sean varones o mujeres. Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, vacas, cabras y ratones. Además, se pretende que el término sujeto incluya especies transgénicas. El término sujeto también abarca un mamífero, por ejemplo, un ser humano, al que se proporciona un tratamiento, tal como un tratamiento terapéutico y/o un tratamiento profiláctico con una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento.

El término “tejido” pretende incluir células intactas, sangre, preparaciones de sangre tales como plasma y suero, huesos, articulaciones, músculos, músculos lisos y órganos.

El término “enfermedad” o “trastorno” se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a cualquier alteración en el estado del cuerpo o de algunos de los órganos, interrumpiendo o perturbando el desempeño de las funciones y/o provocando síntomas tales como malestar, disfunción, angustia, o incluso la muerte de la persona afectada o de quienes estén en contacto con una persona. Una enfermedad o un trastorno también puede estar relacionado con moquillo, molestia, afección, enfermedad, trastorno, falta de salud, malestar, enfermedad leve, indisposición, afección.

El término “neoplasia maligna” y “cáncer” se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a enfermedades que se caracterizan por un crecimiento anómalo incontrolado de células. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente circulatorio y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. El término también pretende incluir cualquier enfermedad de un órgano o tejido en mamíferos caracterizada por una multiplicación mal controlada o incontrolada de células normales o anómalas en ese tejido y su efecto en el cuerpo como un todo. Las enfermedades cancerosas dentro del alcance de la definición comprenden neoplasias benignas, displasias, hiperplasias así como neoplasias que muestran crecimiento metastásico o cualquier otra transformación como, por ejemplo, leucoplasias que a menudo preceden a un brote de cáncer.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tumor” se refiere a una masa de células transformadas que se caracterizan, al menos en parte, por contener vasculatura angiogénica. Las células transformadas se caracterizan por una multiplicación celular neoplásica incontrolada que es rápida y continúa incluso después de que hayan cesado los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. El término “tumor” se usa ampliamente para incluir las células parenquimatosas tumorales así como el estroma de soporte, incluyendo los vasos sanguíneos angiogénicos que infiltran la masa de células parenquimatosas tumorales. Aunque un tumor generalmente es un tumor maligno, es decir, un cáncer que tiene la capacidad de provocar metástasis (es decir, un tumor metastásico), un tumor también puede ser no maligno (es decir, un tumor no metastásico). Los tumores son características del cáncer, una enfermedad neoplásica cuyo curso natural es mortal. Las células cancerosas presentan propiedades de invasión y metástasis y son altamente anaplásicas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “metástasis” o “tumor metastásico” se refiere a un tumor secundario que crece por separado en otra parte del cuerpo desde el tumor primario y ha surgido de células transportadas desprendidas, en el que el tumor primario es un tumor sólido. El tumor primario, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tumor que se originó en la ubicación u órgano en el que está presente y no provocó metástasis en esa ubicación desde otra ubicación. Tal como se usa en el presente documento, un “tumor maligno” es uno que tiene las propiedades de invasión y metástasis y que muestra un alto grado de anaplasia. La anaplasia es la reversión de las células a una forma inmadura o menos diferenciada y se produce en la mayoría de los tumores malignos.

El término “cáncer resistente a la terapia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un cáncer presente en un sujeto que es resistente o refractario a al menos dos agentes anticancerígenos diferentes tales como agentes de quimioterapia, lo que significa que normalmente un sujeto ha sido tratado con al menos dos agentes anticancerígenos diferentes que no proporcionaron un tratamiento eficaz tal como se define ese término en el presente documento.

El término “sensibilizar” o “sensibiliza” usados de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a hacer que la célula sea sensible o susceptible a otros agentes secundarios, por ejemplo, otros profármacos u otros efectos ambientales tales como la radiación, etc.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “tratar” o “tratamiento” o “que trata” se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o ralentizar el desarrollo de la enfermedad, tal como ralentizar el desarrollo de un tumor, la propagación del cáncer o la reducción de al menos un efecto o síntoma de un estado, enfermedad o trastorno asociado con una proliferación inapropiada o una masa celular, por ejemplo, cáncer. El tratamiento es generalmente “eficaz” si uno o más síntomas o marcadores clínicos se reducen tal como se define ese término en el presente documento. De manera alternativa, el tratamiento es “eficaz” si se reduce o detiene la progresión de una enfermedad. Es decir, “tratamiento” incluye no solo la mejora de los síntomas o marcadores, sino también una disminución medible de uno o más síntomas o marcadores medibles de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, cáncer) y/o el cese de al menos la ralentización del progreso o empeoramiento de los síntomas que se esperarían en ausencia de tratamiento. La disminución medible incluye cualquier disminución estadísticamente significativa en un marcador o síntoma medible. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o más síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejoría o alivio del estado de enfermedad y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. “Tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya han sido diagnosticados con cáncer, así como aquellos que pueden desarrollar tumores secundarios debido a metástasis. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser un tratamiento profiláctico.

El término “cantidad eficaz” tal como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento, para aliviar al menos uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno, y se refiere a una cantidad suficiente de composición farmacológica para proporcionar el efecto deseado. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” tal como se usa en el presente documento, por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento significa una cantidad suficiente de la composición para tratar un trastorno, en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Por tanto, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de la composición tal como se da a conocer en el presente documento que es suficiente para efectuar una reducción terapéutica o profilácticamente significativa en un síntoma o marcador clínico asociado con un cáncer o un estado mediado por cáncer.

Una reducción terapéutica o profilácticamente significativa de un síntoma es, por ejemplo, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 100%, al menos aproximadamente el 125%, al menos aproximadamente el 150% o más en un parámetro medido en comparación con un control o un sujeto no tratado. Los parámetros medidos o medibles incluyen marcadores clínicamente detectables de la enfermedad, por ejemplo, niveles elevados o deprimidos de un marcador biológico, así como parámetros relacionados con una escala clínicamente aceptada de síntomas o marcadores para una enfermedad o trastorno. Sin embargo, se entenderá que el médico responsable decidirá el uso diario total de las composiciones y formulaciones tal como se dan a conocer en el presente documento dentro del alcance del juicio médico razonable. La cantidad exacta requerida variará dependiendo de factores tales como el tipo de enfermedad que va a tratarse.

Con referencia al tratamiento de un sujeto con un cáncer con una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad que es segura y suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo y crecimiento adicional de un tumor o la diseminación de metástasis en pacientes con cáncer. Por tanto, la cantidad puede curar o hacer que el cáncer entre en remisión, ralentizar el curso de la progresión del cáncer, ralentizar o inhibir el crecimiento tumoral, ralentizar o inhibir la metástasis tumoral, ralentizar o inhibir el establecimiento de tumores secundarios en los sitios metastásicos o inhibir la formación de nuevas metástasis tumorales. La cantidad eficaz para el tratamiento del cáncer depende del tumor que va a tratarse, la gravedad del tumor, el nivel de resistencia al fármaco del tumor, la especie que va a tratarse, la edad y el estado general del sujeto, el modo de administración, etc. Por tanto, no es posible especificar la “cantidad eficaz” exacta. Sin embargo, para cualquier caso dado, una “cantidad eficaz” apropiada puede ser determinada por un experto en la técnica usando solo experimentación de rutina. La eficacia del tratamiento puede ser juzgada por un médico con experiencia habitual, por ejemplo, la eficacia puede evaluarse en modelos animales de cáncer y tumor, por ejemplo, el tratamiento de un roedor con cáncer, y cualquier tratamiento o administración de las composiciones o formulaciones que conduzca a una disminución de al menos un síntoma del cáncer, por ejemplo, una reducción en el tamaño del tumor o una ralentización o el cese de la tasa de crecimiento del tumor indica un tratamiento eficaz. En realizaciones en las que las composiciones se usan para el tratamiento del cáncer, la eficacia de la composición puede juzgarse usando un modelo animal de experimentación de cáncer, por ejemplo, ratones o ratas de tipo natural, o preferiblemente, trasplante de células tumorales. Cuando se usan un modelo animal de experimentación, la eficacia del tratamiento se evidencia cuando se produce una reducción de un síntoma del cáncer, por ejemplo, una reducción del tamaño del tumor o una ralentización o el cese de la tasa de crecimiento del tumor antes en el tratamiento, frente a los animales no tratados. Por “antes” se entiende que una disminución, por ejemplo, en el tamaño del tumor, ocurre al menos un 5% antes, pero más preferiblemente, por ejemplo, un día antes, dos días antes, 3 días antes o más.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratar” cuando se usa en referencia a un tratamiento de cáncer se usa para referirse a la reducción de un síntoma y/o un marcador bioquímico de cáncer, por ejemplo, una reducción significativa en al menos un marcador bioquímico de cáncer se consideraría un tratamiento eficaz. Los ejemplos de tales marcadores bioquímicos de cáncer incluyen CD44, telomerasa, TGF-a, TGF-p, erbB-2, erbB-3, MUC1, MUC2, CK20, PSA, CA125 y FOBT. Una reducción en la tasa de proliferación de las células cancerosas en al menos aproximadamente un 10% también se consideraría un tratamiento eficaz mediante los métodos dados a conocer en el presente documento. Como ejemplos alternativos, una reducción de un síntoma de cáncer, por ejemplo, una ralentización de la tasa de crecimiento del cáncer en al menos aproximadamente el 10% o un cese del aumento del tamaño del tumor, o una reducción del tamaño de un tumor en al menos aproximadamente el 10% o una reducción en la diseminación del tumor (es decir, metástasis tumoral) en al menos aproximadamente el 10% también se consideraría como tratamientos eficaces mediante los métodos dados a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones, se prefiere, pero no se requiere, que el agente terapéutico realmente destruya el tumor.

El término “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad de una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma que es eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado, por ejemplo, para prevenir la aparición de cáncer en un sujeto que tiene riesgo de desarrollar cáncer. Normalmente, dado que una dosis profiláctica de una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma se administra a un sujeto antes o en un estadio más temprana de un cáncer, o a un sujeto que tiene una predisposición genética de padecer cáncer, por ejemplo, pero de ninguna manera una limitación, a un sujeto que tiene una mutación en un gen que aumenta la probabilidad de que el sujeto padezca cáncer de ovario. En algunas realizaciones, una cantidad profilácticamente eficaz es menor que la cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma es también una en la que cualquier efecto beneficioso supera los efectos tóxicos o perjudiciales del compuesto.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “prevenir”, “que previene” y “prevención” se refieren a evitar o retrasar la manifestación de uno o más síntomas o marcadores medibles de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, de una enfermedad autoinmunitaria. Un retraso en la manifestación de un síntoma o marcador es un retraso en relación con el tiempo en el que tal síntoma o marcador se manifiesta en un sujeto de control o no tratado con una probabilidad o susceptibilidad similar de desarrollar la enfermedad o trastorno. Los términos “prevenir”, “que previene” y “prevención” incluyen no solo evitar o prevenir un síntoma o marcador de la enfermedad, sino también una gravedad o grado reducido de uno cualquiera de los síntomas o marcadores de la enfermedad, en relación con aquellos síntomas o marcadores en un individuo de control o no tratado con una probabilidad o susceptibilidad similar de desarrollar la enfermedad o trastorno, o en relación con los síntomas o marcadores que pueden surgir en basándose en las mediciones históricas o estadísticas de poblaciones afectadas por la enfermedad o trastorno. Por “gravedad reducida” se entiende una reducción de al menos un 10% en la gravedad o grado de un síntoma o marcador de enfermedad medible, en relación con un control o referencia, por ejemplo, al menos el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 99% o incluso el 100% (es decir, sin síntomas o marcadores medibles).

Tal como se usan en el presente documento, los términos “administrar” e “introducir” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a la colocación de los agentes de reguladores metabólicos de la presente invención en un sujeto mediante un método o vía que da como resultado la ubicación al menos parcial de una proteína de MIS humana recombinante en un sitio deseado. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto. En algunas realizaciones, para el tratamiento de un cáncer, la proteína de MIS humana recombinante puede colocarse directamente en, o cerca del sitio del tumor, o administrarse de manera alternativa por vía sistémica.

Una “composición” o “composición farmacéutica” se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a una composición que contiene habitualmente un excipiente, tal como un portador farmacéuticamente aceptable que es convencional en la técnica y que es adecuado para la administración a células. Las células pueden formar parte de un sujeto, por ejemplo, con fines terapéuticos, de diagnóstico o profilácticos. Las células también pueden cultivarse, por ejemplo, células como parte de un ensayo para seleccionar posibles composiciones farmacéuticas, y las células pueden ser parte de un animal transgénico con fines de investigación. La composición también puede ser un cultivo celular, en el que un polipéptido o polinucleótido que codifica para un regulador metabólico de la presente invención está presente en las células y/o en el medio de cultivo. Además, las composiciones para administración tópica (por ejemplo, mucosa oral, mucosa respiratoria) y/u oral pueden formar disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, colutorios o polvos, tal como se conocen en la técnica y se describen en el presente documento. Las composiciones también pueden incluir estabilizantes y conservantes. Para ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes, University of the Sciences in Philadelphia (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons, 21a ed.

Las expresiones “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” tal como se usan en el presente documento significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e intraesternal. Las expresiones “administración sistémica”, “administrado por vía sistémica”, “administración periférica” y “administrado por vía periférica” tal como se usan en el presente documento significan la administración de una proteína de MIS humana recombinante de manera que entre al sistema del animal y, por tanto, esté sometida al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico razonable, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

La expresión “portador farmacéuticamente aceptable” tal como se usa en el presente documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una cara, un diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante líquido o sólido, implicado en el mantenimiento de la actividad o el porte o transporte de los agentes en cuestión desde un órgano o parte del cuerpo hasta otro órgano o parte del cuerpo. Además de ser “farmacéuticamente aceptable” tal como se define el término en el presente documento, cada portador también debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulación. La formulación farmacéutica contiene un compuesto de la invención en combinación con uno o más componentes farmacéuticamente aceptables. El portador puede estar en forma de diluyente sólido, semisólido o líquido, crema o cápsula. Estas preparaciones farmacéuticas son un objeto adicional de la invención. Habitualmente, la cantidad de compuestos activos es de entre el 0,1 y el 95% en peso de la preparación, preferiblemente entre el 0,2 y el 20% en peso en preparaciones para uso parenteral y preferiblemente entre el 1 y el 50% en peso en preparaciones para administración oral. Para el uso clínico de los métodos de la presente invención, la composición de administración dirigida de la invención se formula para dar composiciones farmacéuticas o formulaciones farmacéuticas para administración parenteral, por ejemplo, intravenosa; mucosa, por ejemplo, intranasales; enteral, por ejemplo, oral; tópica, por ejemplo, transdérmica; ocular, por ejemplo, mediante escarificación de la córnea u otro modo de administración. La composición farmacéutica contiene un compuesto de la invención en combinación con uno o más componentes farmacéuticamente aceptables. El portador puede estar en forma de diluyente sólido, semisólido o líquido, crema o cápsula.

El término “oncogén”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para, o polipéptido, de una versión mutada y/o sobreexpresada de un gen normal que de manera dominante puede liberar a la célula de las restricciones normales del crecimiento y, por tanto, solo o en concierto con otros cambios, contribuyen a la tumorigenicidad de las células. Los ejemplos de oncogenes incluyen; gp40 (v-fms); p21 (ras); p55 (v-myc); p65 (gag-jun); pp60 (v-src);, v-abl; v-erb; v-erba; v-fos, etc. Un protooncogén se refiere a la expresión normal de un ácido nucleico que expresa el equivalente celular normal de un oncogén, normalmente, estos genes son habitualmente un gen implicado en la señalización o regulación del crecimiento celular.

El término “regeneración” significa el recrecimiento de una población celular, órgano o tejido, y en algunas realizaciones después de una enfermedad o traumatismo.

El término “vectores” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido; un plásmido es una especie del género abarcado por “vector”. El término “vector” se refiere normalmente a una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación y otras entidades necesarias para la replicación y/o el mantenimiento en una célula huésped. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes y/o secuencias de ácidos nucleicos a los que están unidos operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión de utilidad se encuentran a menudo en forma de “plásmidos” que se refieren a bucles circulares de ADN bicatenario que, en su forma de vector, no están unidos al cromosoma, y comprenden normalmente entidades para la expresión estable o transitoria del ADN codificado. Pueden usarse otros vectores de expresión en los métodos tal como se dan a conocer en el presente documento, por ejemplo, pero no se limitan a, plásmidos, episomas, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, bacteriófagos o vectores virales, y tales vectores pueden integrarse en el genoma del huésped o replicarse de manera autónoma en la célula particular. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. También pueden usarse otras formas de vectores de expresión conocidas por los expertos en la técnica que cumplen funciones equivalentes, por ejemplo, vectores extracromosómicos autorreplicantes o vectores que se integran en un genoma huésped. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”. Los vectores de expresión pueden dar como resultado una expresión estable o transitoria del ADN. Un vector de expresión a modo de ejemplo para su uso en la presente invención es pcDNA3.1.

El término “vectores virales” se refiere al uso como virus, o vectores asociados a virus como portadores del constructo de ácido nucleico en la célula. Los constructos pueden integrarse y empaquetarse en genomas virales defectuosos no replicantes como adenovirus, virus adenoasociado (AAV) o virus del herpes simple (HSV) u otros, incluyendo vectores retrovirales y lentivirales, para la infección o transducción en células. El vector puede incorporarse o no al genoma de las células. Los constructos pueden incluir secuencias virales para transfección, si se desea. Alternativamente, el constructo puede incorporarse en vectores capaces de replicación episómica, por ejemplo, vectores EPV y EBV.

Tal como se usa en el presente documento, un “promotor” o “región promotora” o “elemento promotor” usado de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a un segmento de una secuencia de ácido nucleico, normalmente pero sin limitarse a ADN o ARN o análogos de los mismos, que controla la transcripción de la secuencia de ácido nucleico a la que está unida operativamente. La región promotora incluye secuencias específicas que son suficientes para el reconocimiento, la unión y el inicio de la transcripción de la ARN polimerasa. Esta porción de la región promotora se denomina promotor. Además, la región promotora incluye secuencias que modulan esta actividad de reconocimiento, unión e iniciación de la transcripción de la ARN polimerasa. Estas secuencias pueden actuar en cis o puede responder a factores que actúan en trans. Los promotores, dependiendo de la naturaleza de la regulación, pueden ser constitutivos o regulados.

El término “secuencias reguladoras” se usa de manera intercambiable con “elementos reguladores” en el presente documento, se refiere a un elemento de un segmento de ácido nucleico, normalmente pero sin limitarse a ADN o ARN o análogos de los mismos, que modula la transcripción de la secuencia de ácido nucleico a la que está unidos operativamente y, por tanto, actúan como moduladores transcripcionales. Las secuencias reguladoras modulan la expresión del gen y/o la secuencia de ácido nucleico a la que están unidas operativamente. La secuencia reguladora comprende a menudo “elementos reguladores” que son secuencias de ácido nucleico que son dominios de unión de transcripción y son reconocidas por los dominios de unión a ácido nucleico de proteínas transcripcionales y/o factores de transcripción, represores o potenciadores, etc. Las secuencias reguladoras típicas incluyen, pero no se limitan a, promotores transcripcionales, promotores inducibles y elementos transcripcionales, una secuencia operativa opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica para sitios de unión ribosómica de ARNm adecuados y secuencias para controlar la terminación de la transcripción y/o traducción. Las secuencias reguladoras pueden ser una única secuencia reguladora o múltiples secuencias reguladoras, o secuencias reguladoras modificadas o fragmentos de las mismas. Las secuencias reguladoras modificadas son secuencias reguladoras en las que la secuencia de ácido nucleico ha sido cambiada o modificada por algún medio, por ejemplo, pero sin limitarse a, mutación, metilación, etc.

El término “unido operativamente” tal como se usa en el presente documento se refiere a la relación funcional de las secuencias de ácido nucleico con secuencias reguladoras de nucleótidos, tales como promotores, potenciadores, sitios de parada transcripcionales y traduccionales y otras secuencias señal. Por ejemplo, el enlace operativo de secuencias de ácido nucleico, normalmente ADN, a una secuencia reguladora o región promotora se refiere a la relación física y funcional entre el ADN y la secuencia reguladora o promotor de tal manera que la transcripción de tal ADN se inicia a partir de la secuencia reguladora o promotor, mediante una ARN polimerasa que reconoce, une y transcribe específicamente el ADN. Para optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro, puede ser necesario modificar la secuencia reguladora para la expresión del ácido nucleico o del ADN en el tipo celular para el que se expresa. La conveniencia o necesidad de tal modificación puede determinarse de manera empírica. No es necesario que los potenciadores estén ubicados muy cerca de las secuencias codificantes cuya transcripción potencian. Además, puede decirse que un gen transcrito a partir de un promotor regulado en trans por un factor transcrito por un segundo promotor está unido operativamente al segundo promotor. En tal caso, se dice que la transcripción del primer gen está unida operativamente al primer promotor y también se dice que está unida operativamente al segundo promotor.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra biológica” también se refiere a una célula o población de células o una cantidad de tejido o líquido de un sujeto. Más a menudo, la muestra se ha extraído de un sujeto, pero el término “muestra biológica” también puede referirse a células o tejido analizado in vivo, es decir sin extraerlo del sujeto. A menudo, una “muestra biológica” contendrá células de un sujeto, pero el término también puede referirse a un material biológico no celular, tal como fracciones no celulares de sangre, saliva u orina, que pueden usarse para medir los niveles de fosforilación de proteínas. En algunas realizaciones, una “muestra biológica” o “muestra de tejido” se refiere a una muestra de tejido o líquido aislado de un individuo, incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, biopsia tumoral, orina, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de los pezones, líquido linfático, las secciones externas de la piel, aparato respiratorio, tracto intestinal y aparato genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células (incluyendo pero no limitado a glóbulos sanguíneos), tumores, órganos, y también muestras de constituyente de cultivo celular in vitro. En algunas realizaciones, una muestra biológica es de una resección, biopsia broncoscópica o biopsia con aguja gruesa de un tumor primario, secundario o metastásico, o un bloque celular del líquido pleural. Además, también son útiles las muestras biológicas aspiradas con aguja fina. En algunas realizaciones, una muestra biológica son células ascíticas primarias. Las muestras pueden ser recién obtenidas, congeladas, fijadas u opcionalmente embebidas en parafina, congeladas o sometidas a otros métodos de conservación de tejidos, incluyendo por ejemplo métodos para conservar el estado de fosforilación de polipéptidos en la muestra biológica. Una muestra biológica también puede significar una muestra de tejido o fluido biológico que comprende proteína o células. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a, tejido aislado de sujetos o animales. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como muestras de biopsia y autopsia, secciones congeladas tomadas con fines histológicos, sangre, plasma, suero, esputo, heces, lágrimas, mucosidad, cabello y piel. Las muestras biológicas también incluyen explantes y cultivos celulares primarios y/o transformados derivados de tejidos de pacientes. Puede proporcionarse una muestra biológica extrayendo una muestra de células del sujeto, pero también puede lograrse usando células previamente aisladas (por ejemplo, aisladas por otra persona, en otro momento y/o para otro fin), o realizando los métodos de la invención in vivo. También pueden usarse tejidos de archivo, tales como los que tienen antecedentes de tratamiento o resultados. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, biopsias de tejido, raspados (por ejemplo, raspados bucales), sangre total, plasma, suero, orina, saliva, cultivo celular o líquido cefalorraquídeo. Las muestras biológicas también incluyen biopsias de tejidos, cultivo celular. La muestra biológica puede obtenerse extrayendo una muestra de células de un sujeto, pero también puede lograrse usando células previamente aisladas (por ejemplo, aisladas por otra persona), o realizando los métodos de la invención in vivo. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a, sangre completa, células cultivadas, preparaciones de células primarias, esputo, líquido amniótico, muestras de tejido o biopsia con aguja fina, líquido peritoneal y líquido pleural, entre otros. En algunas realizaciones, se toma una muestra biológica de un paciente humano, y en realizaciones alternativas, la muestra biológica se toma de cualquier mamífero, tal como roedores, modelos animales de enfermedades, animales comerciales, animales de compañía, perros, gatos, ovejas, ganado vacuno y cerdos, etc. La muestra biológica puede pretratarse según sea necesario para su almacenamiento o conservación, mediante dilución en una disolución tampón adecuada o concentrada, si se desea. Puede usarse cualquiera de una serie de disoluciones tampón acuosas convencionales, empleando uno de una variedad de tampones, tales como fosfato, Tris o similares, a pH fisiológico. En determinadas circunstancias, la muestra biológica puede almacenarse para su uso antes de su uso en el ensayo tal como se describe en el presente documento. Tal almacenamiento puede ser a 4°C o congelado, por ejemplo a -20°C o -80°C, siempre que se usen agentes de crioconservación adecuados para mantener la viabilidad celular una vez que las células se descongelan.

El término “reducido” o “reducir” o “disminuir” o “menor” tal como se usa en el presente documento significa generalmente una disminución en una cantidad estadísticamente significativa con respecto a una referencia. Sin embargo, para evitar dudas, “reducido” significa una disminución estadísticamente significativa de al menos el 10% en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo, una disminución de al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, o al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, al menos el 90% o más, hasta e incluyendo una disminución del 100% (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia), o cualquier disminución entre el 10 y el 100% en comparación con un nivel de referencia, tal como se define ese término en el presente documento. El término “disminución” o “inhibición” usado en el contexto del nivel de expresión o actividad de un gen se refiere a una reducción en el nivel o actividad de proteína o ácido nucleico en una célula, un extracto celular o un sobrenadante celular. Por ejemplo, una disminución de este tipo puede deberse a una reducción de la estabilidad, transcripción o traducción del ARN, aumento de la degradación de proteínas o interferencia del ARN. Preferiblemente, esta disminución es de al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, o incluso al menos aproximadamente el 90% del nivel de expresión o actividad en condiciones de control.

El término “bajo” tal como se usa en el presente documento significa generalmente más bajo en una cantidad estadísticamente significativa; para evitar dudas, “bajo” significa un valor estadísticamente significativo al menos el 10% más bajo que un nivel de referencia, por ejemplo, un valor al menos el 20% más bajo que un nivel de referencia, al menos el 30% más bajo que un nivel de referencia, al menos el 40% más bajo que un nivel de referencia, al menos el 50% más bajo que un nivel de referencia, al menos el 60% más bajo que un nivel de referencia, al menos el 70% más bajo que un nivel de referencia, al menos el 80% más bajo que un nivel de referencia, al menos el 90% más bajo que un nivel de referencia, hasta e incluso el 100% más bajo que un nivel de referencia (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia).

Los términos “aumentado” o “aumento” tal como se usan en el presente documento significan generalmente un aumento en una cantidad estáticamente significativa; para evitar dudas, “aumentado” significa un aumento estadísticamente significativo de al menos el 10% en comparación con un nivel de referencia, incluyendo un aumento de al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 100% o más, incluyendo, por ejemplo, un aumento de al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces o mayor en comparación con un nivel de referencia, tal como se define ese término en el presente documento. El término “aumento”, tal como se usa en el contexto de la expresión o actividad de un gen o proteína, significa un cambio positivo en el nivel o actividad de proteína o ácido nucleico en una célula, un extracto celular o un sobrenadante celular. Por ejemplo, un aumento de este tipo puede deberse a una mayor estabilidad, transcripción o traducción del ARN, o una disminución de la degradación de proteínas. Preferiblemente, este aumento es de al menos el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 100%, al menos aproximadamente el 200%, o incluso aproximadamente el 500% o más sobre el nivel de expresión o actividad en condiciones de control.

El término “alto” tal como se usa en el presente documento significa generalmente más alto en una cantidad estadísticamente significativa con respecto a una referencia; para evitar dudas, “alto” significa un valor estadísticamente significativo al menos el 10% más alto que un nivel de referencia, por ejemplo, al menos el 20% más alto, al menos el 30% más alto, al menos el 40% más alto, al menos el 50% más alto, al menos el 60% más alto, al menos el 70% más alto, al menos el 80% más alto, al menos el 90% más alto, al menos el 100% más alto, al menos 2 veces más alto, al menos 3 veces más alto, al menos 4 veces más alto , al menos 5 veces más alto, al menos 10 veces más alto o más, en comparación con un nivel de referencia.

Los artículos “un/uno” y “una” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Aparte de los ejemplos operativos, o cuando se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de componentes o condiciones de reacción usados en el presente documento deben entenderse modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. El término “aproximadamente” cuando se usa en relación con porcentajes puede significar ±1%. La presente invención se explica adicionalmente con más detalle mediante los siguientes ejemplos, pero el alcance de la invención no debe limitarse a los mismos.

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en el presente documento y, como tal, puede variar. La terminología usada en el presente documento tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones. Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones.

Sustancia inhibidora muleriana (MIS)

Sin pretender imponer ninguna teoría, la sustancia inhibidora de muleriana (MIS) es un miembro de la familia de glicoproteínas multigénicas TGFp. Todas las proteínas de esta familia de genes se producen como precursores diméricos y se someten a un procesamiento postraduccional para su activación, lo que requiere la escisión y disociación para liberar fragmentos C-terminales bioactivos. MIS es un dímero de 140 kDa que consta de monómeros idénticos unidos por disulfuro de 70 kDa, cada uno se compone de un dominio N-terminal de 57 kDa y un carboxilo-terminal de 12,5 kDa (C-terminal). Por tanto, MIS comprende 2 monómeros idénticos (y por tanto se denomina “homodímero”), comprendiendo cada monómero dos dominios, el dominio N-terminal y el C-terminal, que se mantienen en asociación no covalente. El dominio C-terminal purificado es el resto biológicamente activo y se requiere la escisión para la actividad. El dominio N-terminal puede ayudar con el plegamiento de proteínas in vivo y facilitar el suministro del péptido C-terminal a su receptor, por ejemplo, MISRI y MISRII. Un mutante no escindible de MIS es biológicamente inactivo.

El dominio activo carboxilo-terminal comparte homología de aminoácidos con otros miembros de la familia TGFb, como TGF-B 1, 2 y 3, inhibina, activina y proteínas morfogenéticas óseas, así como un miembro de los factores de crecimiento y diferenciación (GDF). La estructura del dominio carboxilo-terminal de MIS está respaldada por siete cisteínas implicadas en puentes disulfuro intra e intermoleculares que conducen a su estabilidad estructural, como lo revela la homología con la estructura tridimensional de TGFb usando modelización molecular (Lorenzo, Donahoe, et al., datos no publicados).

Como otros miembros de la familia TGFb, la plasmina puede escindir MIS, lo que genera sus dominios amino y carboxilo-terminales. Este proceso proteolítico es necesario para su actividad fisiológica y se produce en un sitio en una posición similar al sitio de escisión dibásico encontrado en la secuencia de TGFb. Los productos resultantes están estrechamente asociados en un complejo no covalente que se disocia a pH bajo; por tanto, se requieren protocolos técnicamente complejos y que requieren mucho tiempo con tratamiento con plasmina y cromatografía de exclusión molecular para mejorar o completar la separación del extremo carboxilo terminal del extremo aminoterminal.

MIS contiene dos sitios de escisión principales que son sensibles a la plasmina; el sitio monobásico primario que está ubicado en la posición de aminoácido 426-427 de MIS de tipo natural humana (correspondiente al aminoácido 451-452 de SEQ ID NO:1 en el presente documento). La escisión en este sitio, que libera el dominio carboxiloterminal activo de MIS, se asemeja a un sitio de escisión de furina consenso. Un sitio de escisión secundario (denominado “R/S”), identificado por secuenciación amino-terminal de fragmentos de MIS, se encuentra en los residuos 229-230 en el dominio amino-terminal de MIS de tipo natural (correspondiente a los aminoácidos 254-255 de SEQ ID NO: 1). Este sitio contiene un R/S, pero por lo demás no sigue el consenso Arg-X-(Arg/Lys)-Arg para la escisión de furina. La separación del terminal carboxilo purificado de la MIS amino-terminal después de la digestión con plasmina exógena usado previamente por cromatografía de exclusión molecular en condiciones ácidas. Esta técnica requiere un cuidado extremo para controlar la digestión de MIS, ya que las incubaciones prolongadas de MIS en plasmina produjeron el dominio carboxilo-terminal de MIS más otros fragmentos de 22 y 34 kDa, debido a la escisión tanto en los sitios primarios como secundarios, son extremadamente difíciles de separar entre sí por exclusión molecular. Dado que todos los fragmentos generados después de la digestión con plasmina están glicosilados, excepto el dominio carboxilo-terminal, la afinidad por lectina de germen de trigo puede usarse como una alternativa a la separación por cromatografía de exclusión para purificar el dominio carboxilo-terminal de MIS. Después de la escisión de la plasmina, los fragmentos resultantes pueden cargarse en una columna de lectina de germen de trigo a pH 3,5 para disociar los dominios amino y carboxilo-terminales, tal como se da a conocer en Lorenzo et al., J. Chromatography, (2001), 776; 89-98.

Por consiguiente, para superar varios problemas con respecto a evitar la producción de fragmentos de MIS, por ejemplo, el dominio carboxilo-terminal de MIS más fragmentos de 22 y 34 kDa debido a la escisión tanto en el sitio primario como en el secundario, los inventores han modificado el sitio de escisión primario en la posición de aminoácido 426-427 de MIS de tipo natural humana (correspondiente al aminoácido 451-452 de SEQ ID NO: 1 en el presente documento). Para ayudar a la purificación del dominio C-terminal sin la necesidad de métodos complicados usando columnas de cromatografía de afinidad o de exclusión de lectina de germen de trigo, el dominio más flexible del extremo C-terminal, los inventores han incluido una etiqueta en el extremo N-terminal del dominio C-terminal.

Además, la proteína de MIS de tipo natural se produce como una prohormona que comprende una secuencia líder N-terminal, que corresponde a los residuos de aminoácido 1-25 de SEQ ID NO: 1. El procesamiento de la proteína de MIS de la hormona madura puede implicar la escisión proteolítica y retirada de la secuencia líder (por ejemplo, aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1), la escisión de la proteína de MIS en el sitio primario para generar los dominios N-terminal y C-terminal, y la formación de estos dominios en un monómero, que está unido por enlaces disulfuro entre cadenas e intracadena a un monómero idéntico para formar la proteína de MIS homodimérica bioactiva.

Secuencias líder

Sin desear estar ligado a la teoría, las secuencias líder mejoran la expresión y/o secreción de un polipéptido de interés en una célula huésped y son útiles para la producción recombinante de proteínas. Generalmente, como método eficaz para secretar una proteína deseada mediante un procedimiento de ingeniería genética, se conoce un método en el que una proteína fusionada que comprende la proteína deseada (por ejemplo, MIS) y un prepropéptido (péptido señal propéptido) se expresa en una célula huésped y luego se escinde de manera intracelular (procesado) por las enzimas del huésped y luego, se secreta de manera extracelular. Sin embargo, según este proceso, la proteína fusionada debe ser escindida dos veces por las enzimas del huésped para ser una proteína madura, lo que da como resultado un menor rendimiento de la proteína madura y la contaminación de la proteína madura con proteína fusionada residual.

Por consiguiente, las proteínas secretadas se expresan inicialmente dentro de la célula en una forma precursora que contiene una secuencia líder que asegura la entrada en la ruta secretora. Tales secuencias líder, también denominadas péptidos señal, dirigen el producto expresado a través de la membrana del retículo endoplásmico (ER). Los péptidos señal se escinden generalmente mediante peptidasas señal durante la translocación al ER. Una vez que entra en la ruta secretora, la proteína se transporta al aparato de Golgi. Desde el aparato de Golgi, la proteína puede seguir diferentes rutas que conducen a compartimentos como la vacuola celular o la membrana celular, o puede ser enrutada fuera de la célula para ser secretada al medio externo (Pfeffer y Rothman (1987) Ann. Rev. Biochem. 56:829-852).

Para la producción industrial de una proteína secretada, la proteína que va a producirse debe secretarse de manera eficaz desde la célula huésped o el organismo huésped. El péptido señal puede ser, por ejemplo, el péptido señal nativo de la proteína que va a producirse, un péptido señal heterólogo o un híbrido de péptido señal nativo y heterólogo. Sin embargo, se encuentran varios problemas con el uso de péptidos señal conocidos actualmente. Un problema que se encuentra a menudo cuando se produce una proteína humana a partir de una célula u organismo huésped no humano es que el péptido señal nativo no asegura una translocación y/o escisión eficaz del péptido señal. Esto conduce a bajas tasas de secreción de proteínas y/o secreción de proteínas maduras que presentan extensiones N-terminales debido a una escisión incorrecta del péptido señal. Por tanto, la elección del péptido señal es de gran importancia para la producción industrial de una proteína.

Además de las secuencias líder que dirigen la secreción de la proteína, una forma precursora puede comprender secuencias líder complementarias que se escinden durante la maduración. Estos péptidos líderes complementarios, denominados propéptidos, siguen habitualmente al péptido señal. Prácticamente todas las hormonas peptídicas, numerosas proteínas bioactivas (por ejemplo, factores de crecimiento, receptores y moléculas de adhesión celular, incluyendo la MIS) y muchas toxinas bacterianas y glicoproteínas de la envuelta viral comprenden un propéptido que se escinde de manera postraduccional para generar la proteína madura y biológicamente activa (Seidah y Chretien

(1999) Brain Res. 848:45-62).

Los péptidos se escinden además mediante enzimas denominadas proproteína convertasas. Las proproteína convertasas de mamífero incluyen, por ejemplo, las subtilisina convertasas PCSK1, PCSK2 y furina. La furina se expresa de manera ubicua y se localiza en la red trans-Golgi. La furina activa de manera proteolítica un gran número de sustratos de proproteínas en los compartimentos de la ruta secretora. (Thomas (2002) Nat Rev Mol Cell Biol.

3:753-766). Más específicamente, la furina se ubica en la red trans-Golgi, una estructura de Golgi tardía que es responsable de clasificar las proteínas de la ruta secretora hasta sus destinos finales, incluyendo la superficie celular, los endosomas, los lisosomas y los gránulos secretores. El sitio en el que se escinde la furina se ha estudiado ampliamente. El sitio de escisión está posicionado después de la arginina carboxilo-terminal de la secuencia consenso R-X-L/R-R, en la que X puede representar cualquier aminoácido (Nakayama (1997) Biochem. J 327:625-635). La eficiencia de escisión aumenta cuando X es una lisina, una valina, una isoleucina o una alanina (Watanabe et al. (1992) J Biol. Chem. 267:8270-8274).

En algunas realizaciones, la proteína de MIS humana recombinante comprende una secuencia líder modificada en lugar de la secuencia líder de tipo natural de la proteína de MIS de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la secuencia líder nativa de los residuos de aminoácido 1-25 de SEQ ID NO: 1 se reemplaza con una secuencia líder distinta MIS, por ejemplo, pero sin limitarse a una secuencia líder de albúmina o un fragmento funcional de la misma.

En algunas realizaciones, la secuencia líder distinta de MIS es una secuencia de albúmina sérica humana (HSA), por ejemplo, una secuencia líder correspondiente a SEQ ID NO:6, que está codificada por ácidos nucleicos correspondientes a SEQ ID NO: 7.

En algunas realizaciones, una secuencia de HSA es un fragmento funcional de SEQ ID NO: 6, por ejemplo, o al menos 23, o al menos 22, o al menos 21, o al menos 20, o al menos 19, o al menos 18, o al menos 17, o al menos

16, o al menos 15, o al menos 14, o al menos 13, o al menos 12, o al menos 11, o al menos 10, o menos de 10 aminoácidos consecutivos o no consecutivos de SEQ ID NO:6. Las versiones modificadas de la secuencia líder de

HSA también se abarcan para su uso en la presente invención y se dan a conocer en la patente estadounidense 5.759.802. En algunas realizaciones, un fragmento funcional de la secuencia líder de HSA es MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO:13) o variaciones de la misma, que se dan a conocer en la patente EP EP2277889. Las variantes de la región pre-pro de la secuencia señal de HSA (por ejemplo, MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR, SEQ ID NO: 6) incluye fragmentos, tales como la región pre de la secuencia señal de HSA (por ejemplo, MKWVTFISLLFLFSSAYS, S^eQ ID NO:13) o variantes de la misma, tal como, por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYS, (SEQ ID NO:14)

En algunas realizaciones, la secuencia líder es una secuencia líder al menos aproximadamente el 60%, o al me aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 96%, o al menos aproximadamente el 97%, o al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99% idéntica a los residuos de aminoácido de SEQ ID

NO: 6.

La secuencia líder de HSA tal como se usa en el presente documento dio como resultado un rendimiento aumentado esperado (tanto mayor concentración como mayor producción) de la proteína de MIS humana recombinante (véanse las figuras 2 y 3). Sin embargo, la presencia de la secuencia líder de HSA también dio como resultado un aumento sorprendente e inesperado en la escisión del sitio de escisión primario (correspondiente a la escisión en 451/452 de

SEQ ID NO: 1 (o 426/427 de la nomenclatura de aminoácidos convencional de la proteína de MIS humana de tipo natural) (véanse las figuras 2 y 3). Este rendimiento aumentado y escisión aumentada fue sorprendente porque con un rendimiento aumentado (y por tanto más proteína producida por la célula), uno esperaría una escisión disminuida a medida que se satura y se sobreextiende la actividad de las enzimas de escisión disponibles, sin embargo, este no fue el caso, de hecho se produjo exactamente lo contrario cuando con una producción de proteínas aumentada hubo una escisión aumentada desde el sitio de escisión primario.

Se abarcan otras secuencias líder para su uso en una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento, por ejemplo, para reemplazar los aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1. Tales secuencias líder son bien conocidas en la técnica e incluyen las secuencias líder que comprenden un péptido señal de inmunoglobulina fusionado a un propéptido activador de plasminógeno de tipo tisular (IgSP-tPA), tal como se da a conocer en el documento US 2007/0141666. Se usan muchos otros péptidos señal para la producción de proteínas secretadas. Uno de ellos es un péptido señal de inmunoglobulina murina (IgSP, número de registro EMBL M13331).

IgSP se identificó por primera vez en 1983 por Loh et al. (Cell 33:85-93). Se sabe que IgSP proporciona una buena expresión en células de mamíferos. Por ejemplo la patente EP n.° 0382762 da a conocer un método para producir peroxidasa de rábano picante mediante la construcción de un polipéptido de fusión entre IgSP y peroxidasa de

rábano picante.

Otras secuencias líder incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, la secuencia señal de MPIF-1 (por ejemplo, aminoácidos 1-21 del número de registro de GenBank AAB51134) MKVSVAALSCLMLVTALGSQA (SEQ ID NO: 15); la secuencia señal de estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID NO:16); la secuencia señal de invertasa (por ejemplo, MLLQAFLFLLAGFAAKISA, SEQ ID NO:17); la secuencia señal del factor alfa de apareamiento de la levadura (por ejemplo, secuencia líder de toxina mortal de K. lactis); una secuencia señal híbrida (por ejemplo, MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR, SEQ ID NO:18); una secuencia señal híbrida de HSA/MFa-1 (también conocida como HSA/kex2) (por ejemplo, MKWVSFISLLFLfSsAYSRSLDKR, SEQ ID NO:19); una secuencia líder de fusión mortal de K. lactis/MFa-1 (por ejemplo, MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR, SEQ ID NO:20); la secuencia señal de inmunoglobulina Ig (por ejemplo, MgWs CIILFLVATATGVHS, SEQ ID NO:21); la secuencia señal del precursor de fibulina B (por ejemplo, MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA, SEQ ID NO:22); la secuencia señal del precursor de la clusterina (por ejemplo, MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG, SEQ ID NO: 23); y la secuencia señal de la proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (por ejemplo, MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG, SEQ ID NO:24).

Cuando sea deseable producir MIS recombinante en un sistema bacteriano, las secuencias líder pueden incluir secuencias líder bacterianas tal como se da a conocer en la solicitud estadounidense 2011/0020868. Se han descrito otras varias señales secreción para su uso en la expresión de polipéptidos o proteínas recombinantes. véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.914.254; patente estadounidense n.° 4.963.495; patente europea n.° 0 177 343; patente estadounidense n.° 5.082.783; publicación de PCT n.° WO 89/10971; patente estadounidense n.° 6.156.552; patentes estadounidenses n.os 6.495.357; 6.509,181; 6.524.827; 6.528.298; 6.558.939; 6.608.018; 6.617.143; patentes estadounidenses n.os 5.595.898; 5.698.435; y 6.204.023; patente estadounidense n.° 6.258.560; publicación de PCT n.os WO 01/21662, WO 02/068660 y publicación de solicitud estadounidense 2003/0044906; patente estadounidense n.° 5.641.671; y patente europea n.° EP 0121352.

Sitios de escisión modificados

Tal como se analiza en el presente documento, la preparación de una proteína de MIS para uso preclínico es compleja e ineficaz. La proteína de MIS humana se produce a partir de una preproproteína, que comprende una secuencia líder. La secuencia líder (aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1) se escinde y la proteína restante (a menudo denominada “MIS holohumana”), y corresponde a los residuos de aminoácidos 26-560 de SEQ ID NO:1, adicionalmente debe escindirse de manera postraduccional para dar como resultado un dominio N-terminal y uno C-terminal. Estos dominios N-terminales y C-terminales forman un monómero, y dos monómeros idénticos (que comprenden los dominios N- y C-terminales) se forman juntos para generar un homodímero. La MIS holohumana se escinde en sus dominios N- y C-terminales muy probablemente por medio de furina o una prohormona convertasa relacionada PC5, expresada en las gónadas. La escisión se produce principalmente en un sitio similar a kex caracterizado por R'4 XXR'1 con una serina en el sitio 1, lo que hace que el sitio de escisión de MIS sea monobásico, pero más de consenso furina/hex. El dominio C-terminal purificado es el resto biológicamente activo y se requiere la escisión para la actividad biológica. Un sitio de escisión secundario, cuyo significado se desconoce, se observa con menos frecuencia en los residuos 229-230 (que corresponden a los aminoácidos 254-255 de SEQ ID NO: 1). Los mutantes no escindibles de MIS no son biológicamente activos y las mutaciones en el gen humano que truncan el dominio carboxilo-terminal conducen a un síndrome persistente del conducto de Müller. La escisión de la proteína de MIS expresada de manera recombinante por las células CHO es incompleta e ineficaz, por tanto se requiere la escisión con una serina proteasa exógena tal como la plasmina para mejorar la bioactividad.

En el presente documento, los inventores han modificado el sitio similar a kex caracterizado por R’4 XXR’1 con un R en el sitio -2, lo que hace que el sitio de escisión de MIS monobásico se parezca más a un sitio de reconocimiento de consenso Kex/furina. En particular, en una realización, la MIS humano recombinante se produce a partir de una proproteína en la que el residuo de aminoácido en la posición 450 de SEQ ID NO: 1 se ha cambiado de una Q (glutamina o Gln) a una R (arginina o Arg). Esta mutación puede denominarse Q450R de SEQ ID NO:1. Esto corresponde a un cambio en el residuo de aminoácido 425 (Q425R) de MIS que se numera con la numeración de proteínas convencional, en la que el primer aminoácido numerado comienza después de la secuencia líder.

Este cambio en la secuencia de aminoácidos de Q450R de SEQ ID NO:1 permite la producción de una preparación escindida altamente purificada de proteína de MIS humana que tiene bioactividad completa.

En realizaciones alternativas, el sitio de escisión primario en la proteína de MIS, por ejemplo, el sitio monobásico que está ubicado en la posición de aminoácido 426-427 de MIS de natural humana (correspondiente al aminoácido 451 452 de SEQ ID NO:1 en el presente documento) puede modificarse a un sitio de reconocimiento de aminoácidos que es reconocido por una enzima de escisión diferente. Por ejemplo, el sitio de escisión primario en la proteína de MIS, por ejemplo, el sitio monobásico que está ubicado en la posición de aminoácidos 426-427 puede modificarse a una secuencia de aminoácidos que es reconocida por una proteasa o peptidasa, tal como las prohormonas convertasas (PC) u otros agentes de escisión expresados por una célula y encontrados en el tejido circundante, o producidos por un microbio que puede establecer una infección en un mamífero. Los péptidos escindibles por enzimas pueden contener uno o más aminoácidos además de la secuencia de reconocimiento de aminoácidos, pero no es necesario que lo hagan; pueden añadirse aminoácidos adicionales al extremo amino-terminal, al extremo carboxilo-terminal, o tanto al extremo amino como al extremo carboxilo-terminal de la secuencia de reconocimiento. Los medios para añadir aminoácidos a una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, en un sintetizador de péptidos automatizado, así como los medios para detectar la escisión de un péptido, por ejemplo, mediante análisis cromatográfico para determinar los productos de aminoácidos de dicha escisión, son bien conocidos por los expertos habituales en la técnicas que recibieron las enseñanzas de esta invención.

Las proteínas convertasas de prohormonas constituyen una familia de serina proteasas estructuralmente relacionadas con las subtilisinas bacterianas y con la kexina de levadura. Actualmente se conocen varios miembros eucariotas de esta familia. Las prohormonas convertasas (PC) escinden los polipéptidos precursores en residuos básicos específicos, con mayor frecuencia después de residuos básicos emparejados seleccionados, para generar péptidos y proteínas bioactivos. Muchos miembros de la familia de proteínas de la insulina (por ejemplo, insulina, Igf-1) son sustratos de las PC.

Etiquetas para mejorar la purificación

En algunas realizaciones, una proteína de MIS recombinante comprende al menos un marcador interno o “etiqueta”. En algunas realizaciones, la etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta c-myc, polihistidina o FLAG. En algunas realizaciones, la etiqueta es una etiqueta FLAG, por ejemplo, una etiqueta FLAG de SEQ ID NO:8. Una etiqueta FLAG puede estar codificada por el ácido nucleico de ^sE^qID NO 9.

En algunas realizaciones, la etiqueta en la proteína de MIS humana recombinante es interna en el extremo carboxilo-terminal inmediatamente en el sentido de 3' del sitio de escisión. Como es la parte más flexible del extremo C-terminal y no participa en la unión al receptor y en la obtención de especificidad, ya que son las “yemas de los dedos” del extremo C-terminal (Papakostas et al, 2010, Lorenzo et al, 2002). En algunas realizaciones, es más probable que el marcaje en este sitio conserve la actividad biológica. En algunas realizaciones, una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta FLAG está ubicada después del sitio de escisión primario, por ejemplo, después del aminoácido 450 de SEQ ID NO: 1 (correspondiente al residuo de aminoácido 425 de la nomenclatura de proteínas convencional). En algunas realizaciones, una etiqueta está ubicada entre los residuos de aminoácidos 452 y 453 de SEQ ID NO: 1 (que se corresponde con los residuos de aminoácidos 427 y 428 en la nomenclatura de aminoácidos normal de la proteína de MIS).

En realizaciones alternativas, la etiqueta o el marcador está ubicado en cualquier posición entre la secuencia 450 y 560 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la etiqueta se inserta 2 residuos de aminoácidos después del aminoácido modificado en la posición 450 de SEQ ID NO: 1. Sin embargo, se prefiere una posición de la etiqueta en el extremo N-terminal del dominio C-terminal de MIS, ya que su ubicación en el extremo C-terminal del dominio C-terminal hace que el dominio C-terminal sea totalmente inactivo, reduciendo significativamente la bioactividad de la proteína de MIS.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS recombinante comprende más de una etiqueta, por ejemplo, al menos 2 o al menos 3, o al menos 4 o más de 4 etiquetas. En algunas realizaciones, las etiquetas son secuenciales (por ejemplo, una tras otra) y en algunas realizaciones, están dispersas (por ejemplo, intermitentes) en la proteína de MIS humana recombinante. Preferiblemente, las etiquetas no interfieren ni afectan sustancialmente la bioactividad de la función de la proteína de MIS recombinante en la unión y activación de MISRII. En algunas realizaciones, en las que la proteína de MIS recombinante comprende más de una etiqueta, las etiquetas son la misma etiqueta. En realizaciones alternativas, en las que la proteína de MIS recombinante comprende más de una etiqueta, las etiquetas son etiquetas diferentes, por ejemplo, una proteína de MIS recombinante puede comprender una etiqueta FLAG y una etiqueta de histidina. El pequeño tamaño de la etiqueta Flag permite que esté contenida en el dominio N-terminal flexible y de no unión del extremo C-terminal. Por consiguiente, en algunas realizaciones, puede usarse cualquier etiqueta conocida por un experto habitual en la técnica en lugar de la etiqueta Flag, por ejemplo, una etiqueta de entre aproximadamente 5 y 10 aminoácidos, o entre aproximadamente 10 y 15 aminoácidos, o una etiqueta entre aproximadamente 15 y 20 aminoácidos, o una etiqueta entre 20 y 30 aminoácidos, o una etiqueta entre aproximadamente 30 y 50 aminoácidos. En algunas realizaciones, no se recomienda una etiqueta de más de 50 aminoácidos de longitud, ya que la etiqueta puede obstaculizar de manera estérica el extremo N-terminal flexible del dominio C-terminal y así inhibir la bioactividad de la proteína de MIS recombinante.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante marcada con una etiqueta, por ejemplo, marcada con FLAG, tal como la proteína de MIS humana recombinante LRF tal como se da a conocer en el presente documento (véase la figura 1) puede eluirse en una única etapa para producir una preparación escindida de manera eficaz altamente purificada con bioactividad completa. Cuando se cambie de escala, esta purificación de proteína de MIS humana recombinante será adecuada para aplicaciones clínicas; además, será útil para diversos ensayos de unión tanto en entornos clínicos como experimentales. El marcaje interno de MIS durante la traducción ha demostrado ser más eficaz que el marcaje después de la purificación de la proteína, ya que la yodación o biotinilación redujo en gran medida la bioactividad de MIS. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que el constructo de la proteína de MIS humana recombinante LRF es más bioactivo que la MIS de tipo natural. La inserción de la secuencia de la etiqueta FLAG tiene otras varias ventajas distintas. En primer lugar, su dominio de aminoácidos único no está presente en ningún otro gen (a excepción de la fosfatasa cerebral de ratón), lo que hace que el anticuerpo anti-FLAG sea muy específico. En segundo lugar, la elución de la proteína con el péptido FLAG 3x es específica para FLAG MIS y no para otras proteínas que se unen de forma no específica a las perlas de agarosa.

Sorprendentemente, una MIS humana recombinante optimizada por escisión etiquetada con FLAG (por ejemplo, una MIS humana recombinante RF o RARR/S (SEQ ID NO: 27) FLAG MIS) fue bioactiva mientras que una MIS humana recombinante optimizada sin escisión etiquetada con FLAG (por ejemplo, RAQR/R (SEQ ID NO: 28) FLAG MIS) no lo era cuando se comparó con MIS humana nativa o con el RAQR/R sin etiquetar previamente preparado (SEQ ID NO: 28) MIS. Ya que es probable que la presencia de la etiqueta FLAG ácida tan cerca del sitio de escisión pueda alterar el grado de escisión, provocando así una pérdida de actividad. Por tanto, los inventores no anticiparon una escisión mejorada con la adición de la etiqueta Flag. Además, la preparación de holo RAQR/R FLAG MIS (“RAQR/R” dada a conocer como SEQ ID NO: 28) en células CHO (o ^hE^k) no es bioactiva, ya que no se produce ningún procesamiento endógeno con el sitio de escisión de RAQR/R (SEQ ID NO: 28) en contraste con lo informado por Kurian (Cancer Res., 1995, 1;343-349) cuando el constructo carecía de la etiqueta FLAG. Por otro lado, la retención de la serina en la posición 428 y la conversión del sitio monobásico en dibásico (correspondiente a Q>R en la posición de aminoácidos 425 usando la nomenclatura de proteínas convencional), o Q>R en la posición 450 de SEQ ID NO: 1) hace que la escisión endógena sea más eficaz y muy específica. Además, una etiqueta como FLAG MIS es una herramienta poderosa para estudios de unión y puede usarse para inmunoprecipitar el MISRII endógeno sin reticulación. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante marcada, por ejemplo, una MIS con un FLAG interno, es útil en un método eficaz para producir una forma de MIS marcada de manera internamente muy pura y biológicamente activa, que puede usarse para cambiar de escala para uso preclínico y clínico, para el estudio de proteínas de unión a MIS y para el seguimiento en estudios farmacocinéticos.

Variantes de una proteína de MIS humana recombinante.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer puede tener una modificación en la secuencia de la proteína de MIS central, por ejemplo, residuos de aminoácidos 26-560 de SEQ ID NO: 1 (incluyendo una modificación del residuo de aminoácido 450 de Q a R de SEQ ID NO: 1) y/o la inserción de una etiqueta al comienzo del dominio C-terminal). Se considera que tales variantes son homólogas a la proteína de MIS de tipo natural.

Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido” se refiere a un polímero de aminoácidos y su equivalente y no se refiere a una longitud específica del producto; por tanto, los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de un polipéptido. Un derivado es un polipéptido que tiene sustituciones de aminoácidos conservativas, en comparación con otra secuencia. Los derivados incluyen además otras modificaciones de proteínas, incluyendo, por ejemplo, modificaciones tales como glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante es al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95% similar a la proteína de MIS humana recombinante homóloga. Tal como se usa en el presente documento, “similitud” o “porcentaje de similitud” en el contexto de dos o secuencias de polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o sustituciones conservativas de los mismos, que son los mismo, cuando se compara y alinea para una máxima correspondencia, según se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante inspección visual. A modo de ejemplo, una primera secuencia de aminoácidos puede considerarse similar a una segunda secuencia de aminoácidos cuando la primera secuencia de aminoácidos es al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 75%, el 80%, el 90% o incluso el 95% idéntica, o sustituida de manera conservativa, a la segunda secuencia de aminoácidos cuando se compara con un número igual de aminoácidos que el número contenido en la primera secuencia, o cuando se compara con una alineación de polipéptidos que ha sido alineada por un programa informático de similitud conocido en la técnica, tal como se comenta a continuación.

Los homólogos y derivados funcionales y fragmentos funcionales de MIS de SEQ ID NO: 1 también se abarcan para su uso en la presente invención y también pueden identificarse, por ejemplo, mediante la expresión de MIS a partir de una biblioteca de expresión. (Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual, 3a ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press); Ausubel et al., citado anteriormente). Una secuencia génica endógena mutada puede denominarse transgén heterólogo; por ejemplo, un transgén que codifica para una mutación en MIS que no se conoce en genomas que se producen de manera natural es un transgén heterólogo con respecto a una especie murina y no murina, por ejemplo, humana. Una proteína de MIS, tal como, por ejemplo, las dadas a conocer en las publicaciones de patentes estadounidenses n.os 5.427.780, 5.359.033 y 5.661.126.

La variación en la estructura primaria de la secuencia de la proteína de MIS humana central (por ejemplo, residuos de aminoácidos 26-560 de s Eq ID NO: 1 (incluyendo una modificación del residuo de aminoácido 450 de Q a R de SEQ ID NO: 1) y/o la inserción de una etiqueta al comienzo del dominio N-terminal del dominio C-terminal), o un fragmento funcional, o un homólogo se abarcan para su uso en la presente invención, por ejemplo, pueden incluir deleciones, adiciones y sustituciones. Las sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas. Las diferencias entre una proteína de MIS humana recombinante y una variante conservan generalmente las propiedades deseadas, mitigan o eliminan propiedades no deseadas y añaden propiedades deseadas o nuevas. Por ejemplo, las variantes de una proteína de MIS humana recombinante pueden tener una actividad superior en comparación con la proteína de MIS de tipo natural.

Los expertos apreciarán que la secuencia de la proteína de MIS humana central (por ejemplo, residuos de aminoácidos 26-560 de S^eQ ID NO: 1) de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento puede manipularse fácilmente para alterar la secuencia de aminoácidos. de una proteína. Un gen que codifica para la proteína de MIS o un fragmento funcional, homólogo o una variante de la misma, puede manipularse mediante una variedad de técnicas bien conocidas para la mutagénesis in vitro, entre otras, para producir variantes de la proteína humana que se producen de manera natural o un fragmento de la misma, denominadas en el presente documento variantes o muteínas, puede usarse según la invención.

Otras modificaciones a una proteína de MIS humana recombinante

La proteína de MIS humana recombinante útil en la presente invención también puede modificarse en sus extremos amino-terminales, por ejemplo, para aumentar su hidrofilicidad. El aumento de la hidrofobicidad potencia la exposición de los péptidos en las superficies de los portadores basados en lípidos en los que se han incorporado los conjugados péptido-lípido parentales. Los grupos polares adecuados para la unión a péptidos para aumentar su hidrofilicidad son bien conocidos e incluyen, por ejemplo y sin limitación: grupos acetilo (“Ac”), 3-ciclohexilalanilo (“Cha”), acetil-serina (“Ac Ser”), acetil-seril-serina (“Ac-Ser-Ser-”), succinil (“Suc”), succinil-serina (“Suc-Ser”), succinil-seril-serina (“Suc-Ser-Ser”), metoxisuccinilo (“MeO-Suc”), metoxisuccinil-serina (“MeO-Suc-Ser”), metoxisuccinil-seril-serina (“MeO-Suc-Ser-Ser”) y seril-serina (“Ser-Ser-”), polietilenglicol (“PEG”), poliacrilamida, poliacrilomorfolina, polivinilpirrolidina, un grupo polihidroxilo y azúcares carboxílicos, por ejemplo, grupos ácido lactobiónico, N-acetilneuramínico y siálico. Los grupos carboxilo de estos azúcares estarían unidos al extremo N-terminal del péptido mediante un enlace amida. Actualmente, la modificación N-terminal preferida es una modificación de metoxisuccinilo.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante puede fusionarse con uno o más componentes de fusión. En determinadas realizaciones, uno de los componentes de fusión es la proteína Fc (por ejemplo, Fc de ratón o Fc humana). La proteína de fusión puede incluir además un segundo componente de fusión, tal como una etiqueta de purificación o detección, por ejemplo, proteínas que pueden detectarse directa o indirectamente tales como proteína verde fluorescente, hemaglutinina o fosfatasa alcalina), dominios de unión a ADN (por ejemplo, GAL4 o LexA), dominios de activación génica (por ejemplo, GAL4 o VP16), etiquetas de purificación o péptidos señal de secreción (por ejemplo, secuencia señal de preprotripsina).

En una realización, una proteína de fusión de proteína de MIS humana recombinante útil en los métodos y composiciones tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender una proteína Fc humana o un fragmento funcional de la misma. Por consiguiente, en una realización, una proteína de fusión de proteína de MIS humana recombinante útil en los métodos y composiciones tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender una molécula de Fc humana como primer componente de fusión, en la que el fragmento Fc puede ser la SEQ ID NO: 10 o variantes funcionales o derivados de la misma, en la que ^sE^qID NO: 10 es la siguiente:

LELVPRGSGDPIEGRGGGGGDPKSCDKPHTCPLCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP

EVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWL

N GKEYKCKV SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SRDELTKN Q VSLT CLVKGF YPS

DIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTQKSLSLSPGK

Pueden usarse variaciones y modificaciones de una proteína de MIS humana recombinante y vectores para aumentar o disminuir la expresión de la proteína de MIS humana recombinante, y para proporcionar medios para el direccionamiento. Por ejemplo, una proteína de MIS humana recombinante puede unirse con una molécula de direccionamiento molecular para seleccionar como diana células cancerosas o células de ovario, para hacer que la proteína de MIS humana recombinante sea específica para cánceres o tejido específico para el ovario, respectivamente.

En una realización, una proteína de MIS humana recombinante se fusiona con un segundo componente de fusión, tal como una molécula portadora para mejorar su biodisponibilidad. Tales portadores se conocen en la técnica e incluyen poli(alquil)glicol tal como polietilenglicol (PEG). La fusión con albúmina sérica también puede aumentar la semivida en suero de polipéptidos terapéuticos.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante también puede fusionarse con un segundo componente de fusión, por ejemplo, con un polipéptido que dirige el producto a una ubicación deseada, o, por ejemplo, una etiqueta que facilita su purificación, si así se desea. En algunas realizaciones, las etiquetas y los componentes de fusión pueden diseñarse para que puedan escindirse, si así se desea. Otra modificación contemplada específicamente es la unión, por ejemplo, unión covalente, a un polímero. En un aspecto, polímeros tales como el polietilenglicol (PEG) o el metoxipolietilenglicol (mPEG) pueden aumentar la semivida in vivo de las proteínas con las que están conjugadas. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de pegilación de agentes polipeptídicos, al igual que las consideraciones de, por ejemplo, el tamaño del polímero de PEG a utilizar.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional de la misma se modifica para lograr semividas circulantes adecuadas, que afectan a la dosificación, la administración del fármaco y la eficacia. Se han emprendido muchos enfoques con el objetivo de aumentar la semivida de los agentes bioterapéuticos. Las proteínas pequeñas por debajo de 60 kD son eliminadas rápidamente por el riñón y, por tanto, no alcanzan su objetivo. Esto significa que se necesitan dosis altas para alcanzar la eficacia. Las modificaciones a una proteína de MIS humana recombinante y los fragmentos abarcados en los métodos de la presente invención para aumentar la semivida de las proteínas en circulación incluyen: pegilación; conjugación o fusión genética con proteínas, por ejemplo, transferrina (documento WO06096515A2), albúmina, hormona del crecimiento (documento US2003104578AA); conjugación con celulosa (Levy y Shoseyov, 2002); conjugación o fusión con fragmentos Fc; enfoques de glicosilación y mutagénesis (Carter, 2006).

En el caso de la pegilación, el polietilenglicol (PEG) se conjuga con una proteína de MIS humana recombinante o fragmento, que puede ser, por ejemplo, una proteína, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en plasma. Los primeros estudios sobre el efecto de la pegilación de anticuerpos se realizaron en la década de 1980. La conjugación puede realizarse de forma enzimática o química y está bien establecida en la técnica (Chapman, 2002; Veronese y Pasut, 2005). Con la pegilación puede aumentarse el tamaño total, lo que reduce la posibilidad de filtración renal. La pegilación protege además de la degradación proteolítica y ralentiza el aclaramiento de la sangre. Además, se ha informado de que la pegilación puede reducir la inmunogenicidad y aumentar la solubilidad. La farmacocinética mejorada por la adición de PEG se debe a varios mecanismos diferentes: aumento del tamaño de la molécula, protección contra la proteólisis, antigenicidad reducida y enmascaramiento de secuencias específicas de los receptores celulares. En el caso de los fragmentos de anticuerpos (Fab), se ha logrado un aumento de 20 veces en la semivida en plasma mediante pegilación (Chapman, 2002).

Hasta la fecha, existen varios fármacos pegilados aprobados, por ejemplo, PEG-interferón alfa2b (PEG-INTRON) comercializado en 2000 y alfa2a (Pegasys) comercializado en 2002. Un fragmento de anticuerpo pegilado contra TNF alfa, denominado Cimzia o certolizumab pegol, se presentó a la aprobación de la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Crohn en 2007 y ha sido aprobada el 22 de abril de 2008. Una limitación de la pegilación es la dificultad para sintetizar especies monodispersas largas, especialmente cuando se necesitan cadenas de PEG superiores a 1000 kD. Para muchas aplicaciones, se usa PEG polidisperso con una longitud de cadena superior a 10000 kD, lo que da como resultado una población de conjugados que tienen cadenas de PEG de diferente longitud, que necesitan un análisis exhaustivo para garantizar lotes equivalentes entre producciones. La diferente longitud de las cadenas de PEG puede dar como resultado diferentes actividades biológicas y, por tanto, diferentes farmacocinéticas. Otra limitación de la pegilación es una disminución en la afinidad o actividad, tal como se ha observado con el interferón alfa Pegasys, que tiene solo el 7% de la actividad antiviral de la proteína nativa, pero tiene una farmacocinética mejorada debido a la semivida en plasma mejorada.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento de la misma se conjuga con una proteína de vida larga, por ejemplo, albúmina, que es de 67 kD y tiene una semivida en plasma de 19 días en seres humanos (Dennis et al., 2002). La albúmina es la proteína más abundante en el plasma y está implicada en la regulación del pH plasmático, pero también sirve como portador de sustancias en el plasma. En el caso de CD4, se ha logrado un aumento de la semivida en plasma después de fusionarla con albúmina sérica humana (Yeh et al., 1992). Otros ejemplos de proteínas de fusión son la insulina, la hormona del crecimiento humana, la transferrina y las citocinas (Ali et al., 1999; Duttaroy et al., 2005; Melder et al., 2005; Osborn et al., 2002a; Osborn et al., 2002b ; Sung et al., 2003) y véanse los documentos (US2003104578A1, WO06096515A2 y WO07047504A2.

También se ha estudiado ampliamente el efecto de la glicosilación sobre la semivida en plasma y la actividad de las proteínas. En el caso del activador de plasminógeno tisular (tPA), la adición de nuevos sitios de glicosilación disminuyó el aclaramiento plasmático y mejoró la potencia (Keyt et al., 1994). La glicoingeniería se ha aplicado con éxito a varias proteínas recombinantes e inmunoglobulinas (Elliott et al., 2003; Raju y Scallon, 2007; Sinclair y Elliott, 2005; Umana et al., 1999). Además, la glicosilación influye en la estabilidad de las inmunoglobulinas (Mimura et al., 2000; Raju y Scallon, 2006).

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante o fragmentos de la misma pueden fusionarse con el fragmento Fc de una IgG (Ashkenazi y Chamow, 1997). El enfoque de fusión de Fc se ha utilizado, por ejemplo, en la tecnología Trap desarrollada por Regeneron (por ejemplo, ⁱL1 trap y VEGF trap). El uso de albúmina para extender la semivida de los péptidos se ha descrito en el documento US2004001827A1. También se han informado efectos positivos de la albúmina para los fragmentos Fab y la proteína de fusión scFv-HSA (Smith et al., 2001). Se ha demostrado que la semivida prolongada en suero de la albúmina se debe a un proceso de reciclaje mediado por el FcRn (Anderson et al., 2006; Chaudhury et al., 2003; Smith et al., 2001).

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante se conjuga con una proteína Fc biotinilada, tal como se da a conocer en la solicitud estadounidense 2010/0209424.

Tal como se usa en el presente documento, el término “conjugar” o “conjugación” se refiere a la unión de dos o más entidades para formar una entidad. Por ejemplo, los métodos de la presente invención proporcionan la conjugación de una proteína de MIS humana recombinante (es decir, SEQ ID NO: 2 ó 3 o fragmentos o derivados o variantes de la misma) unida con otra entidad, por ejemplo, un resto tal como un primer componente de fusión que hace que la proteína de MIS humana recombinante sea estable, tal como la partícula portadora de Ig, por ejemplo, Fc de IgG1. La unión puede ser por medio de ligadores, modificación química, ligadores peptídicos, ligadores químicos, enlaces covalentes o no covalentes, o fusión de proteínas o mediante cualquier medio conocido por un experto en la técnica. La unión puede ser permanente o reversible. En algunas realizaciones, pueden incluirse varios ligadores para aprovechar las propiedades deseadas de cada ligador y cada proteína en el conjugado. Se contempla el uso de ligadores flexibles y ligadores que aumentan la solubilidad de los conjugados solos o con otros ligadores tal como se da a conocer en el presente documento. Los ligadores peptídicos pueden unirse expresando ADN que codifica para el ligador a una o más proteínas en el conjugado. Los ligadores pueden ser ligadores escindibles con ácido, fotoescindibles y sensibles al calor. Los métodos para la conjugación son bien conocidos por los expertos en la técnica y están abarcados para su uso en la presente invención.

Según la presente invención, una proteína de MIS humana recombinante (es decir SEQ ID NO: 2 ó 3 o fragmentos, derivados o variantes de la misma), pueden unirse al primer componente de fusión a través de cualquier medio adecuado, tal como se conoce en la técnica, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.625.014, 5.057.301 y 5.514.363. Por ejemplo, una proteína de MIS humana recombinante puede conjugarse covalentemente al Fc de IgG1 o bien directamente o bien a través de uno o más ligadores. En una realización, una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento se conjuga directamente con el primer componente de fusión (por ejemplo Fc), y en una realización alternativa, una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento puede conjugarse con un primer componente de fusión (tal como Fc de IgG1) a través de un ligador, por ejemplo, un ligador que potencia el transporte.

Se conocen en la técnica una gran variedad de métodos para la conjugación de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento con un primer componente de fusión (por ejemplo, Fc). Tales métodos se describen, por ejemplo, en Hermanson (1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press), en los documentos U.S. 6.180.084 y U.S. 6.264.914 e incluyen, por ejemplo, métodos usados para unir haptenos a proteínas portadoras tal como se usa habitualmente en inmunología aplicada (véase Harlow y Lane, 1988, “Antibodies: A laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se reconoce que, en algunos casos, una proteína de MIS humana recombinante puede perder eficacia o funcionalidad tras la conjugación dependiendo, por ejemplo, del procedimiento de conjugación o del grupo químico utilizado en el mismo. Sin embargo, dada la gran variedad de métodos de conjugación, el experto en la técnica puede encontrar un método de conjugación que no afecte o afecte menos a la eficacia o funcionalidad de las entidades, tal como una proteína de MIS humana recombinante que va a conjugarse.

Los métodos adecuados para la conjugación de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento con un primer componente de fusión (por ejemplo, Fc) incluyen, por ejemplo, conjugación de carbodimida (Bauminger y Wilchek, 1980, Meth. Enzymol. 70: 151-159). Alternativamente, puede acoplarse un resto a un agente de direccionamiento tal como se describe en Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7269-7273 (1996), y Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1794-1799 (1998). Otro método para conjugar que puede usarse es, por ejemplo, oxidación con peryodato de sodio seguido por alquilación reductora de reactantes apropiados y reticulación con glutaraldehído.

Puede usarse una variedad de ligadores diferentes para conjugar una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento con un primer componente de fusión (por ejemplo, Fc), por ejemplo, pero sin limitarse a, ácido aminocaproico, peroxidasa de rábano picante (HRP) o un agente reticulante heterobiofuncional, por ejemplo, agente reticulante reactivo con carbonilo y reactivo con sulfhidrilo. Los reactivos de reticulación heterobiofuncionales contienen generalmente dos grupos reactivos que pueden acoplarse a dos dianas de función diferentes en proteínas y otras macromoléculas en un proceso de dos o tres etapas, lo que puede limitar el grado de polimerización asociado a menudo con el uso de agentes reticulantes homobiofuncionales. Estos protocolos de etapas múltiples pueden ofrecer un gran control del tamaño del conjugado y la razón molar de los componentes.

El término “ligador” se refiere a cualquier medio para unir dos o más entidades, por ejemplo, una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento con un primer componente de fusión (por ejemplo, Fc). Un ligador puede ser un ligador covalente o un ligador no covalente. Los ejemplos de ligadores covalentes incluyen enlaces covalentes o un resto ligador unido covalentemente a una o más de las proteínas que van a unirse. El ligador también puede ser un enlace no covalente, por ejemplo, un enlace organometálico a través de un centro metálico tal como un átomo de platino. Para los enlaces covalentes, pueden usarse diversas funcionalidades, tales como grupos amida, incluyendo derivados del ácido carbónico, éteres, ésteres, que incluyen ésteres orgánicos e inorgánicos, amino, uretano, urea y similares. Para proporcionar la unión, la molécula efectora y/o la sonda pueden modificarse mediante oxidación, hidroxilación, sustitución, reducción, etc. para proporcionar un sitio para el acoplamiento. Se apreciará que se prefieren las modificaciones que no disminuyen significativamente la función de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o el primer componente de fusión (por ejemplo, Fc).

Direccionamiento. En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante, o un fragmento funcional, o un homólogo para su uso en los métodos y composiciones tal como se dan a conocer en el presente documento, pueden seleccionar como diana células cancerosas o de ovario mediante un ligando de direccionamiento. Un ligando de direccionamiento es una molécula, por ejemplo, una molécula pequeña, proteína o fragmento de la misma que se une específicamente con alta afinidad a una diana, por ejemplo, un marcador de superficie celular en una célula preseleccionada, tal como una proteína de superficie tal como un receptor que está presente en mayor grado en la diana celular preseleccionada que en cualquier otro tejido corporal. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante para su uso en las composiciones y métodos tal como se dan a conocer en el presente documento puede fusionarse con un Fc y/u opcionalmente también con una molécula de direccionamiento. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica para un ligando de direccionamiento puede fusionarse con un nucleótido que codifica para una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento u homólogo o una variante de la misma. Otro ejemplo de ligando de direccionamiento es un grupo de dominios de cadherina de una cadherina humana. Un componente de ligando de direccionamiento unido a una proteína de MIS humana recombinante puede incluir un ligando que se produce de manera natural o recombinante o modificado por ingeniería, o un fragmento del mismo, que puede unirse a la célula diana preseleccionada.

Los ejemplos adicionales de ligandos de direccionamiento también incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y porciones de los mismos que se unen específicamente a una proteína de superficie celular preseleccionada con alta afinidad. Por “alta afinidad” se entiende una constante de disociación en equilibrio de al menos molar, tal como se determina mediante métodos de ensayo conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis BiaCore. En una realización, el ligando de direccionamiento también puede comprender uno o más dominios de unión a inmunoglobulina aislados de anticuerpos generados contra una proteína de superficie específica de tejido seleccionada o receptor específico de tejido diana. El término “inmunoglobulina o anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido de mamífero, incluyendo humano, que comprende una región de entramado de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une y reconoce específicamente un antígeno, que, en el caso de la presente invención, es una proteína de superficie específica de tejido, un receptor específico de tejido diana o una porción de los mismos. Si el polipéptido de fusión de direccionamiento pretendido se usará como agente terapéutico en mamíferos, las regiones de unión a inmunoglobulinas deberían derivarse de las inmunoglobulinas de mamíferos correspondientes. Si el polipéptido de fusión de direccionamiento está destinado a un uso no terapéutico, tal como para diagnóstico y ELISA, las regiones de unión a inmunoglobulina pueden derivarse de mamíferos humanos o no humanos, tales como ratones. Los genes o fragmentos de genes de inmunoglobulina humana incluyen las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, lgG, lgM, IgA, lgD e IgE, respectivamente. Dentro de cada clase de lgG, hay diferentes isotipos (por ejemplo, lgG1, lgG2, etc.). Normalmente, la región de unión a antígeno de un anticuerpo será la más crítica para determinar la especificidad y afinidad de unión.

Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) a modo de ejemplo de IgG humana comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena ligera (aproximadamente 25 kD) y una cadena pesada (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100-110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos “cadena ligera variable” (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. Por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo así el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región bisagra. Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en cuanto a la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo o bien químicamente o bien usando metodología de ADN recombinante. Por tanto, los términos inmunoglobulina o anticuerpo, tal como se usan en el presente documento, también incluyen fragmentos de anticuerpos producidos por la modificación de anticuerpos completos, o aquellos sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena sencilla) (scFv)) o aquellos identificados usando bibliotecas de presentación de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554). Además, los polipéptidos de fusión de la invención incluyen las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de las inmunoglobulinas, así como proteínas de superficie específicas de tejido y porciones de unión a receptor diana de las mismas. Los métodos para producir tales regiones variables se describen en Reiter et al. (1999) J. Mol. Biol. 290:685-698.

Los métodos para preparar anticuerpos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY). Los genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de interés pueden clonarse a partir de una célula, por ejemplo, los genes que codifican para un anticuerpo monoclonal pueden clonarse a partir de un hibridoma y usarse para producir un anticuerpo monoclonal recombinante. También pueden prepararse bibliotecas de genes que codifican para cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas o células plasmáticas. Las combinaciones aleatorias de los productos génicos de cadena pesada y ligera generan una gran conjunto de anticuerpos con diferente especificidad antigénica. Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla o anticuerpos recombinantes (patente estadounidense n.° 4.946.778; patente estadounidense n.° 4.816.567) puede adaptarse para producir anticuerpos usados en los polipéptidos de fusión y métodos de la presente invención. Además, pueden usarse ratones transgénicos u otros organismos tales como otros mamíferos para expresar anticuerpos humanos o humanizados. Alternativamente, la tecnología de presentación de fagos puede usarse para identificar anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, tales como dominios variables y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados.

El cribado y la selección de inmunoglobulinas preferidas (por ejemplo, anticuerpos) pueden realizarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica: el cribado inicial para detectar la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para un receptor diana o específico de tejido puede realizarse mediante el uso de métodos basados en ELISA o presentación de fagos, por ejemplo. Preferiblemente, se realiza un cribado secundario para identificar y seleccionar un anticuerpo monoclonal deseado para su uso en la construcción de los polipéptidos de fusión específicos de tejido de la invención. El cribado secundario puede realizarse con cualquier método adecuado conocido en la técnica. Un método, denominado “Perfilado asistido por modificación de biosensor" (“BiaMAP”) (solicitud de patente estadounidense 2004/101920), permite la identificación rápida de clones de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales con las características deseadas. Más específicamente, los anticuerpos monoclonales se clasifican en distintos grupos relacionados con el epítopo basándose en la evaluación de las interacciones anticuerpo: antígeno.

Producción de proteínas de MIS humanas recombinantes

Las proteínas de MIS de humanas recombinantes tal como se da a conocer en el presente documento, y los fragmentos funcionales y derivados de las mismas pueden obtenerse mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, los polipéptidos pueden producirse usando tecnología de ácido nucleico recombinante convencional tal como ADN o ^aRⁿ, preferiblemente ADN. En numerosos tratados y manuales de referencia puede encontrarse orientación e información sobre métodos y materiales para la producción de polipéptidos usando tecnología de ADN recombinante. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al. (eds.), 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.; Innis et al. (eds.), 1990 PCR Protocols, Academic Press.

Alternativamente, las proteínas de MIS humanas recombinantes o fragmentos funcionales de las mismas pueden obtenerse directamente mediante síntesis química, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos comercial según las instrucciones del suministrador. Los métodos y materiales para la síntesis química de polipéptidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Merrifield, 1963, “Solid Phase Synthesis”, J. Am. Chem. Soc. 83:2149 -2154.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante, o un fragmento funcional o derivado o una variante de la misma puede expresarse en la célula después de la introducción de un ADN que codifica para la proteína, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para proteínas de MIS humanas recombinantes u homólogos o derivados funcionales de las mismas, por ejemplo, en un vector de expresión convencional tal como se da a conocer en el presente documento o mediante un catéter o mediante células transformadas con el ácido nucleico ex vivo y trasplantado al sujeto.

Ensayos para determinar la actividad de la proteína de MIS humana recombinante

En una realización, puede usarse un sistema de ensayo de cultivo de órganos para someter a ensayo la bioactividad de una proteína de MIS recombinante humana tal como se da a conocer en el presente documento. El sistema de ensayo usado lo describieron Donahoe et al., J. Surg. Res., 23, 141-148, 1977 que es el ensayo de cultivo de órganos de regresión de Müller. Se diseccionó la cresta urogenital del embrión de rata hembra de 14 días y se transfirió a una placa de cultivo de órganos (Falcon, 3010). Se colocaron las muestras en rejillas de acero inoxidable recubiertas con una capa fina de agar al 2% y se incubaron durante 72 horas a 37°C en el 5% de CO²y el 95% de aire sobre 2 ml de medio de cultivo [CMRL 1066 que contenía suero bovino fetal al 10%, penicilina al 1% (10000 unidades/ml)] o una mezcla 1:1 de medio de cultivo y el sobrenadante o la fracción de gradiente que va a analizarse. A continuación, el tejido incubado se recubrió con una mezcla de agar al 2% y albúmina a 44°C, se fijó en formaldehído tamponado, se deshidrató en etanol, limpiado en xileno y embebido en parafina. Se tiñeron secciones en serie de ocho micrómetros con hematoxilina y eosina para su visualización mediante microscopía óptica. A las secciones del extremo cefálico del conducto de Müller se les asignó un número codificado y se clasificaron para determinar la regresión (Donahoe et al., Biol. Reprod., 15, 329-334, 1976) en una escala de 0 a V. Se leyeron cinco portaobjetos con de seis a ocho secciones por portaobjetos para cada ensayo. El grado de actividad se enumeró como el número entero más cercano a la media. Un grupo de prueba para los procedimientos de fraccionamiento representa al menos 10 ensayos. Si la media estaba a mitad de camino entre dos números, entonces se enumeraban ambos números. El grado 0 se refiere a la ausencia de regresión. El conducto de Müller, que está revestido por células epiteliales columnares cuyos núcleos tienen una orientación basilar, tiene una luz ampliamente permeable. El grado I es una regresión mínima. El conducto es un poco más pequeño y el mesénquima circundante se condensa alrededor del conducto tal como se observa en las secciones de plástico o existe un área despejada alrededor del conducto tal como se observa en las secciones de parafina. El grado II se refiere a una regresión leve. El conducto es más pequeño y la condensación mesenquimatosa o el área despejada alrededor del conducto es más pronunciada. Los núcleos de las células epiteliales más cortas pierden su orientación basilar. El grado III es una regresión moderada. El conducto es muy pequeño y desorganizado. La punta de la cresta urogenital se desarrolla poco distal al conducto de Wolff. El grado IV es una regresión severa. El conducto es reemplazado por una espiral de células. El grado V se refiere a la regresión completa. No pueden detectarse restos del conducto. En cada experimento se incluyeron controles de tejido positivos, usando testículo fetal, y controles de tejido negativos, en los que se incubaron los conductos de Müller solos o con músculo. Los conductos de Müller expuestos a extractos de tejido no testicular, a fracciones testiculares inactivas o solución salina sirvieron como controles bioquímicos. Se dializaron alícuotas de todas las fracciones frente a agua destilada y se liofilizaron, y se midió el contenido de proteínas.

Administración de proteína de MIS humana recombinante

Los métodos conocidos en la técnica para la administración terapéutica de una proteína de MIS humana recombinante y/o ácidos nucleicos que codifican para la misma pueden usarse para tratar una enfermedad o trastorno, tal como el cáncer en un sujeto, por ejemplo, transfección celular, terapia génica, administración directa con un vehículo de administración o un portador farmacéuticamente aceptable, administración indirecta proporcionando células recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de fusión de direccionamiento de la invención.

En algunas realizaciones, la proteína de MIS humana recombinante se escinde in vitro para formar un halodímero bioactivo de MIS, que comprende dos monómeros idénticos, que consiste cada uno en el dominio N-terminal y el dominio C-terminal, y luego se administra a un sujeto.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar una proteína de MIS humana recombinante (antes o después de que se haya escindido para dar su forma bioactiva) a un sujeto, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que pueden expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptores (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, etc. Los métodos de introducción pueden ser enterales o parenterales e incluyen, pero no se limitan a, intradérmicos, intramusculares, intraperitoneales, intravenosos, subcutáneos, pulmonares, intranasales, intraoculares, epidurales y vías orales. Puede administrarse una proteína de MIS humana recombinante por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de mucosas epiteliales o mucocutáneas (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros compuestos biológicos. agentes activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de MIS humana recombinante, antes o después de la escisión en su forma bioactiva, en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; La inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, como un depósito de Ommaya. También puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante.

Métodos para tratar enfermedades proliferativas y cáncer

Un aspecto de la presente invención proporciona métodos para tratar cánceres, por ejemplo, cánceres que expresan MISRII en un sujeto. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere generalmente a un método de tratamiento de una enfermedad proliferativa o trastorno en un sujeto, en el que la enfermedad proliferativa o trastorno se asocia con células que expresan un receptor de MIS, por ejemplo, células que expresan MISRII. En algunas realizaciones, la enfermedad proliferativa o trastorno es cáncer, en la que el cáncer o células cancerosas expresan al menos un receptor de MIS, por ejemplo, cáncer o células cancerosas que expresan MISRII. El método de la presente invención comprende la administración de una cantidad eficaz de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento funcional o derivado de la misma a un sujeto con un trastorno proliferativo, en el que las células asociadas con el trastorno proliferativo expresan al menos un receptor de MIS, por ejemplo las células expresan MISRII. Por ejemplo, una cantidad eficaz de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento funcional se administra a un sujeto con un cáncer que expresa al menos un receptor de MIS, por ejemplo que expresa MISRII. Por tanto, usando los métodos de la presente invención, puede intervenirse en la enfermedad proliferativa, por ejemplo, cáncer, mejorar los síntomas, y en algunos casos curar la enfermedad. En algunas realizaciones, la proteína de MIS humana recombinante que puede usarse para tratar enfermedades proliferativas y cáncer comprende los residuos de la secuencia de aminoácidos 25-559 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento funcional de la misma.

Los ejemplos de tales enfermedades en las que la proliferación de células que expresan al menos un receptor de MIS, por ejemplo, que expresan MISRII es la causa de la enfermedad, son cánceres, por ejemplo cáncer de cuello uterino y cáncer de ovario. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa al menos un receptor de MIS, por ejemplo, MISRII es una célula cancerosa. En algunas realizaciones, una célula cancerosa de este tipo que expresa al menos un receptor de MIS, por ejemplo que expresa MISRII es, por ejemplo, pero no se limita a, una célula de cáncer de ovario, célula de carcinoma epidérmico de vulva, célula de carcinoma de cuello uterino, célula de edenocarcinoma endometrial, adenocarcinoma de ovario.

En realizaciones alternativas, el cáncer que expresa al menos un receptor de MIS, por ejemplo, cánceres que expresan MISRII son, por ejemplo, pero no se limitan a; cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer del sistema nervioso, cáncer de hueso, cáncer de médula ósea, cáncer de cerebro, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer gastrointestinal, cáncer genitourinario, cáncer de estómago, linfomas, melanoma, glioma, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de encía, cáncer de riñón, cáncer de retina, cáncer de hígado, cáncer de nasofaringe, cáncer de ovario, cánceres de la boca, cáncer de vejiga, neoplasias hemáticas, linfoma folicular, cáncer de cuello uterino, mieloma múltiple, osteosarcomas, cáncer de tiroides, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de lengua o cáncer de útero.

En realizaciones alternativas, la presente invención se refiere al uso de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento funcional o derivado o una variante de la misma para el tratamiento de cualquier trastorno en el que la administración de la proteína de MIS o un ácido nucleico que codifica para la proteína de MIS o la activación de MISRII es todo o parte del régimen terapéutico.

En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer que responde a MIS, por ejemplo, pero sin limitarse a, cáncer de ovario y cáncer de cuello uterino. En algunas realizaciones, el cáncer expresa MISRII, por ejemplo, pero sin limitarse а, cáncer de ovario y cáncer de cuello uterino. En algunas realizaciones, el trastorno es un trastorno asociado con un exceso de estados de andrógenos, por ejemplo, tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° б. 673.352. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención se usan en el tratamiento de cáncer de próstata, enfermedad de ovario poliquístico, hipertrofia prostática benigna y pubertad precoz.

En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer resistente a quimioterápicos o multirresistente, por ejemplo, en el que el cáncer es un cáncer resistente a paclitaxel, cisplatino, rapamicina, pirazoloantrona o doxorrubicina.

En una realización relacionada, el tejido que va a tratarse es un tejido tumoral que expresa al menos un receptor de MIS, por ejemplo, que expresa MISRII de un sujeto, por ejemplo, el tejido tumoral es, pero no se limita a, un tumor sólido, una metástasis, un cáncer de piel, un cáncer de mama, un cáncer de ovario, un cáncer de cuello uterino, un hemangioma o angiofibroma y cánceres similares. Los tejidos tumorales sólidos típicos tratables mediante la composición farmacéutica de la invención incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a tumores de pulmón, páncreas, mama, colon, laringe, ovario y tejidos similares. En alguna realización, el tejido tumoral sólido tratable mediante los presentes métodos incluye tiroides, y el tipo de cáncer es cáncer medular de tiroides.

En una realización relacionada, la invención contempla la práctica del método de administración de una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento funcional junto con otras terapias tales como quimioterapia convencional dirigida contra tumores sólidos y para controlar el establecimiento de metástasis. Por ejemplo, un agente quimioterápico usado en quimioterapia incluye, pero no se limita a, paclitaxel, cisplatino, doxorrubicina, rapamicina, pirazoloantrona, incluyendo pero sin limitarse a antra(1,9-cd)pirazol-6(2H)-ona (SP600125) o N1-metil-1,9-pirazoloantrona (M-SP600125) o un derivado funcional o análogo funcional de la misma. En algunas realizaciones, un agente quimioterápico es un agente radioterápico. La administración de los compuestos descritos en el presente documento se realiza normalmente antes y/o al mismo tiempo y/o después de la quimioterapia, aunque también se abarca dentro de la presente invención para inhibir la proliferación celular después de un régimen de quimioterapia en momentos en los que el tejido tumoral responderá al ataque tóxico induciendo la angiogénesis para recuperarse mediante la provisión de un suministro de sangre y nutrientes al tejido tumoral. Además, las composiciones farmacéuticas de la invención para el tratamiento de trastornos proliferativos, por ejemplo, el cáncer, pueden administrarse de manera profiláctica y/o antes del desarrollo de un tumor, si se ha identificado que el sujeto tiene riesgo de desarrollar cáncer, por ejemplo, para sujetos que son positivos para biomarcadores de células cancerosas o tumores. En la medida en que los presentes métodos se aplican a la inhibición de la proliferación celular, los métodos también pueden aplicarse a la inhibición del crecimiento de tejido tumoral, a la inhibición de la formación de metástasis tumorales y a la regresión de tumores establecidos.

En algunas realizaciones, la expresión del receptor de la sustancia inhibidora muleriana (MIS) se mide en una muestra biológica obtenida del sujeto, por ejemplo, una muestra de tejido del cáncer o tumor o una célula cancerosa o célula tumoral, por ejemplo, una muestra de tejido de biopsia.

La presencia de MISRII en las células en líquidos tales como la sangre puede ser indicativa de la presencia de cáncer. La presencia de MISRII en líquidos o sitios no cercanos a un tumor puede ser indicativa de metástasis. En algunas de tales realizaciones, los compuestos de la presente invención se administran al sujeto, y en algunas realizaciones los compuestos de la presente invención se administran al sujeto en una composición farmacéutica que comprende una o más terapias adicionales.

Los métodos de la invención dados a conocer en el presente documento proporcionan la administración parenteral y oral de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento funcional o derivado de la misma, en combinación con otras composiciones farmacéuticas a sujetos que necesitan tal tratamiento. La administración parenteral incluye, pero no se limita a, las vías intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.), subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intranasal e inhalatoria. En el método de la presente invención, una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento funcional o análogos de la misma se administran preferiblemente por vía oral. La administración i.v., i.m., s.c. e i.p. puede ser por bolo o infusión, y también puede ser mediante un dispositivo implantable de liberación lenta, incluyendo, pero sin limitarse a, bombas, formulaciones de liberación lenta y dispositivos mecánicos. La formulación, vía y método de administración y dosificación dependerán del trastorno que va a tratarse y de la historia clínica del sujeto. En general, una dosis que se administra por inyección subcutánea será mayor que la dosis equivalente terapéuticamente administrada por vía intravenosa o intramuscular. Preferiblemente, la dosis de compuestos de la presente invención se administrará a dosis de desde aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 250 mg. En algunas realizaciones, la dosis de compuestos de la presente invención será de desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 60 mg.

Los métodos de la presente invención para tratar cáncer que expresa al menos un receptor de MIS, por ejemplo, que expresa MISRII, son útiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la proliferación o cáncer, que está asociado con células que expresan al menos un receptor de MIS, por ejemplo MISRII, que comprende poner en contacto un tejido en el que se está produciendo proliferación, o existe el riesgo de que ocurra, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento funcional o derivados funcionales de la misma.

En algunas realizaciones, el sujeto tratado por los métodos de la presente invención en sus muchas realizaciones es un sujeto humano, aunque debe entenderse que los principios de la invención indican que la invención es eficaz con respecto a todos los mamíferos. En este contexto, se entiende que un mamífero incluye cualquier especie de mamífero en la que sea deseable el tratamiento de enfermedades asociadas con el cáncer o un trastorno relacionado con la proliferación, particularmente especies de mamíferos agrícolas y domésticos, así como animales transgénicos.

Usos

En otra realización, la presente invención proporciona un método para tratar una variedad de estados administrando una cantidad eficaz de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales de la misma de la invención a un sujeto que lo necesita. Los estados que pueden tratarse con los compuestos de esta invención, o una composición farmacéutica que contenga los mismos, incluyen cualquier estado que se trate o reduzca los síntomas mediante la administración de MIS o la activación de la señalización de MIS o la activación de MISRII y, por tanto, se beneficien de la administración de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales de la misma. Los estados representativos a este respecto incluyen, por ejemplo, pero no se limita a, cánceres que expresan receptores de MIS, por ejemplo cáncer que expresan MISRII, por ejemplo, pero sin limitarse a cáncer de ovario, cuello uterino y endometrio. Otros estados que pueden tratarse con MIS o la activación de la señalización de MIS que reduce los síntomas son, por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedades proliferativas tales como el cáncer, tratamiento del cáncer de próstata, enfermedad de ovario poliquístico, hipertrofia prostática benigna y pubertad precoz y otros trastornos de hiperandrogenismo tales como testotoxicosis.

Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales de la misma para el tratamiento de cualquier trastorno en el que la administración de la proteína de MIS o un ácido nucleico que codifica para la proteína de MIS o un derivado funcional de MIS o la activación de MISRII es todo, o parte, del régimen terapéutico. En algunas realizaciones, la proteína de MIS humana recombinante que puede usarse comprende los residuos de aminoácido 25-559 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento funcional de la misma.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención se refieren al uso de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales de la misma con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, agentes de quimioterapia, en los que los agentes de quimioterapia, por ejemplo, paclitaxel o MIS pueden usarse en una dosis menos lo que da como resultado la disminución de los efectos secundarios.

Usos de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma para el tratamiento de exceso de estados andrógenos

En otra realización, puede usarse una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma para el tratamiento de un trastorno asociado con la producción en exceso de andrógenos en un sujeto. Los inventores han demostrado previamente que la administración de proteína de MIS y/o ácido nucleico de MIS disminuye los niveles de andrógeno en un sujeto y disminuye los niveles en suero de andrógeno en un sujeto, tal como se da a conocer en la patente estadounidense 6.673.352 y la solicitud de patente estadounidense 10/683.346. Los ratones transgénicos que sobreexpresan MIS también han demostrado tener concentraciones de testosterona en suero disminuidas, y la administración de MIS da como resultado niveles disminuidos de testosterona en suero (Sriraman et al., J Androl. 2001, 22(5):750-8 y Trbovich et al., PNAS, 13 de marzo de 2001; 98(6):3393-7). También se ha demostrado que MIS suprime tanto el crecimiento estimulado por andrógenos como la supervivencia independiente de los andrógenos de las células, y MIS regula el crecimiento de la próstata al suprimir la síntesis de testosterona testicular y regula directamente la expresión génica inducida por andrógenos y el crecimiento en la próstata a nivel celular (Trann et al., Mol Endocrinol. 2006, 20(10):2382-91).

Los andrógenos estimulan o controlan el desarrollo y mantenimiento de las características masculinas en los vertebrados al unirse a los receptores de andrógenos. Los andrógenos también se conocen como hormonas androgénicas o testoides, y también son los precursores de todos los estrógenos, las hormonas sexuales femeninas. El andrógeno principal y más conocido es la testosterona.

Sin querer limitarse a la teoría, la producción excesiva de andrógenos por las glándulas suprarrenales y/o el ovario da como resultado un exceso de andrógenos y puede dar como resultado una mayor sensibilidad del tejido local a los andrógenos circulantes. El exceso de andrógenos afecta a diferentes tejidos y sistemas de órganos, provocando estados clínicos que van desde el acné hasta el hirsutismo y la virilización franca.

El hiperandrogenismo, que se refiere al exceso de producción y secreción de andrógenos y precursores, es una endrocrinopatía común y en ocasiones grave para las mujeres en edad reproductiva. El exceso de andrógenos y precursores se originan en las glándulas suprarrenales y los ovarios en diversas proporciones y se manifiestan en diferentes efectos dependiendo de la cantidad de exceso de andrógenos. Las manifestaciones clínicas van desde el hirsutismo (crecimiento excesivo del pelo de patrón masculino, a veces acompañado de acné) hasta la virilización (clitorimegalia, calvicie temporal, voz más grave o aumento de la musculatura).

El hiperandrogenismo se produce como parte de un amplio espectro de manifestaciones de la enfermedad, incluyendo el síndrome de ovario poliquístico (SOP), que es una combinación variable de hirsutismo, infertilidad, obesidad, resistencia a la insulina y ovarios poliquísticos, el síndrome de HAIR-AN (hiperandrogenismo, resistencia a la insulina y acantosis pigmentaria), hipertecosis ovárica (HAIR-AN con hiperplasia de células de teca luteinizadas en el estroma ovárico) y otras manifestaciones de altas concentraciones de andrógenos intraováricos (por ejemplo, detención de la maduración folicular, atresia, anovulación, dismenorrea, hemorragia uterina disfuncional, infertilidad), tumores que producen andrógenos (tumores virilizantes de ovario o suprarrenales).

El hirsutismo es el crecimiento excesivo de vello reconocible que se caracteriza por un aumento en el número y la longitud de los vellos terminales en las áreas sensibles a los andrógenos. Las diferencias raciales, familiares, genéticas y étnicas afectan a la aparición del hirsutismo. El hirsutismo es difícil de cuantificar. Es necesario inspeccionar todo el cuerpo y documentar cuidadosamente los hallazgos. Se debe prestar especial atención al mentón, los labios, las patillas, los senos y el esternón, la línea media entre el ombligo, el pubis y el muslo.

Ferriman y Gallwey publicaron una escala de clasificación para clasificar el hirsutismo y es comúnmente conocida por los expertos habituales en la técnica. Esta escala permite al médico medir de manera objetiva la respuesta a la terapia. Este sistema es el más usado y evalúa las áreas del cuerpo en busca de hirsutismo de ausente a grave con puntuaciones de 0 a 4, respectivamente. Las puntuaciones de 8 y más son coherentes con un diagnóstico de hirsutismo. Esta escala no mide el grosor del cabello, que es otra forma de evaluar de manera objetiva el exceso de vello. Los sistemas de puntuación son una ayuda útil para cuantificar el hirsutismo y evaluar la respuesta al tratamiento. Incluso con puntuaciones superiores a 8, el paciente proporciona la definición. Desde un punto de vista clínico, el paciente puede determinar si nota una diferencia. Las fotografías son útiles para la documentación y para seguir el progreso de la terapia.

La virilización es relativamente poco común; se produce con hiperandrogenismo extremo. La virilización se caracteriza por calvicie temporal, atrofia mamaria, desarrollo de los músculos androgénicos, hipertrofia del clítoris, amenorrea, voz más grave e hirsutismo extremo.

Las terapias médicas actuales para mujeres se dirigen contra las glándulas suprarrenales, los ovarios o el receptor de andrógenos. El tratamiento con glucocorticoides se dirige contra las glándulas suprarrenales, pero está limitado, en algunos casos, por la supresión no deseada de la síntesis de cortisol. La terapia con GnRH se dirige contra los ovarios, pero es costosa y se desconocen sus efectos a largo plazo. Además, la terapia usando anticonceptivos orales puede no ser adecuada porque la mayoría contiene progestinas con actividad androgénica.

Debido a que la producción anómala de andrógenos está implicada en las rutas de muchas enfermedades y/o trastornos para los que no existen tratamientos aceptables, existe la necesidad de encontrar moléculas pequeñas para inhibir la producción de gonadotropinas y/o andrógenos en mamíferos para su tratamiento y/o profilaxis.

Por consiguiente, en una realización, puede usarse una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma para el tratamiento de un trastorno asociado con la producción en exceso de andrógenos en un sujeto. En algunas realizaciones, la proteína de MIS humana recombinante que puede usarse comprende los residuos de aminoácidos 25-559 de SEQ I^dNO: 2 o un fragmento funcional de la misma.

El término “andrógeno” se usa en el presente documento para significar esteroides que estimulan el desarrollo de las características sexuales masculinas e incluyen los derivados esteroides del androstano que incluyen testosterona, androstenediona y análogos.

Tal como se usa en el presente documento, un estado patológico o trastorno caracterizado por “dependencia androgénica” es un estado patológico que se ve exacerbado por, o provocado por, la producción de andrógenos insuficiente, excesiva, inapropiada o no regulada. Los ejemplos de tales enfermedades en hombres incluyen, pero no se limitan a, BPH, carcinoma de próstata metastásico, cáncer de testículo, acné dependiente de andrógenos, calvicie de patrón masculino y pubertad precoz en niños. Los ejemplos de tales enfermedades en mujeres incluyen, pero no se limitan a, hiperandrogenismo, hirsutismo, virilización, SOP, síndrome de HAIR-AN, hipertecosis ovárica, detención de la maduración folicular, atresia, anovulación, dismenorrea, hemorragia uterina disfuncional, infertilidad, tumores que producen andrógenos.

Tal como se usa en el presente documento, “que inhibe andrógenos” se refiere a una cantidad eficaz de pirazoloantrona o derivados funcionales o análogos de la misma tal como se define en el presente documento, tal como SP600125, que provocará una disminución en los niveles in vivo del andrógeno a niveles normales o niveles por debajo de los normales, cuando se administra a un sujeto para la profilaxis o el tratamiento de un estado patológico que se ve exacerbado por, o provocado por, la producción de andrógenos excesiva o no regulada.

En algunas realizaciones, puede usarse una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma, tal como se da a conocer en el presente documento, para tratar el cáncer de próstata. Se conoce el impacto de los andrógenos sobre el carcinoma de próstata, al igual que el tratamiento del cáncer de próstata mediante la privación de andrógenos, incluyendo el bloqueo de andrógenos y la inhibición de la síntesis de andrógenos (Huggins et al., Archs. Surg., vol. 43, págs.209-223 (1941)). J. Steroid Biochem. Molec. Biol., vol. 37, págs. 349-362 (1990)). Además, las hormonas esteroideas se usan ampliamente como anticonceptivos. Los agentes antiespermatogénicos son anticonceptivos masculinos que inhiben la espermatogénesis, el proceso que conduce a los espermatozoides maduros. Los fármacos que interfieren en este proceso incluyen andrógenos y antiandrógenos. Dado que los efectos antiandrogénicos de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma tal como se da a conocer en el presente documento son reversibles, la proteína de MIS humana recombinante también puede usarse como un agente anticonceptivo masculino. Korolkovas, A., Essentials Of Medicinal Chemistry, segunda edición, págs. 1032 (1988).

En algunas realizaciones, pueden usarse otros agentes en combinación con las composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma tal como se da a conocer en el presente documento para el tratamiento del exceso de andrógenos en un sujeto. En algunas realizaciones, los agentes funcionan para reducir los niveles de andrógenos libres en suero y bloquear la acción de los andrógenos periféricos. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a, la supresión de andrógenos ováricos mediante la administración de estrógenos y/o progestinas (es decir, píldora anticonceptiva) o agonista de GnRH y terapia suplementaria con estrógenos; supresión de andrógenos suprarrenales mediante la administración de glucocorticoides (tal como dexametasona, prednisolona), antiandrógenos (tal como espironolactona, flutamida, acetato de ciproterona), inhibidor de la 5a-reductasa (tal como finasterida), bromocriptina y fármacos sensibilizantes a la insulina (como metformina, tiazolidinedionas).

Los sujetos susceptibles de tratamiento con una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma mediante los métodos dados a conocer en el presente documento son sujetos que se han identificado con una enfermedad o trastorno asociado con exceso de niveles de andrógenos, tales como, por ejemplo, trastornos tales como, pero sin limitarse a HPB, carcinoma de próstata, hipertrofia prostática benigna, cáncer de testículo, acné dependiente de andrógenos, calvicie de patrón masculino, pubertad precoz, hiperandrogenismo, hirsutismo, virilización, SOP, síndrome de HIAR-AN, hipertecosis ovárica, detención de la maduración folicular, atresia, anovulación, dismenorrea, hemorragia uterina disfuncional, infertilidad y tumores que producen andrógenos.

En algunas realizaciones, los sujetos susceptibles de tratamiento con una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma mediante los métodos dados a conocer en el presente documento son sujetos con hiperplasia suprarrenal congénita (HSC), que puede identificarse comúnmente por un experto habitual en la técnica. La HSC es más típicamente un trastorno autosómico recesivo en el que falta la enzima 21 hidrolasa o es funcionalmente defectuosa. Alternativamente, los sujetos con HSC pueden tener una pérdida y/o reducción en la función de la enzima 11a-hidroxilasa y/o una enzima 3a-hidroxi-esteroidea deshidrogenasa. Cuando estas enzimas faltan o funcionan a niveles bajos, el cuerpo no puede producir cantidades adecuadas de las hormonas esteroideas suprarrenales cortisol y aldosterona. Se producen niveles elevados de ACTH que estimulan la hiperplasia suprarrenal y la hipersecreción de precursores de andrógenos para la síntesis de cortisol y aldosterona. La HSC puede aparecer en el útero o desarrollarse después del nacimiento. El pseudohermafroditismo puede estar presente al nacer.

La deficiencia de 21-hidroxilasa es el trastorno autosómico recesivo más común (más común que la fibrosis quística) y se manifiesta con niveles elevados de 17-hidroxiprogesterona. La deficiencia de 11a-hidroxilasa se caracteriza por niveles elevados de 11-desoxi-cortisol (compuesto S) y da como resultado niveles elevados de desoxicorticosterona (DOC), un mineralocorticoide. La hipertensión y la hipopotasemia pueden ser una característica destacada de la deficiencia de 11a-hidroxilasa. Otra forma de hSc , la deficiencia de 3a-hidroxi-esteroidea deshidrogenasa, da como resultado niveles elevados de pregnenolona, 17-hidroxi-pregnenolona y DHEA. Este estado es letal si no se detecta porque no se sintetizan corticosteroides.

Un defecto parcial en las enzimas anteriores que se manifiesta después de la pubertad da como resultado niveles elevados de esteroides suprarrenales a través del mismo mecanismo. Las elevaciones no son tan marcadas como lo están con el estado congénito y este estado se conoce como HSC no clásica (inicio en la madurez o inicio tardío). Por consiguiente, en algunas realizaciones, los sujetos susceptibles de tratamiento con una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma mediante los métodos dados a conocer en el presente documento son sujetos con HSC no clásica (inicio en la madurez o inicio tardío).

En algunas realizaciones, los sujetos susceptibles de tratamiento con una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma mediante los métodos dados a conocer en el presente documento son sujetos femeninos con niveles de testosterona de aproximadamente 2,0 ng/ml o superiores (200 ng/dl, 8,92 nmol/l) o al menos aproximadamente 2,5 veces el límite superior del intervalo de referencia. En algunas realizaciones, tales sujetos tienen tumores de células de Sertoli-Leydig, tumores de células del hilio y tumores de células lipoides (resto suprarrenal) que son los más comunes. Los tumores de células de Sertoli-Leydig alcanzan un tamaño palpable en el momento del diagnóstico clínico, mientras que los tumores de células hiliares y lipoides son difíciles de detectar por cualquier medio debido a su pequeño tamaño.

En algunas realizaciones, los sujetos susceptibles de tratamiento con una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o análogos de la misma mediante los métodos dados a conocer en el presente documento son sujetos con tumores de las glándulas suprarrenales (adenomas, carcinomas), que secretan niveles elevados de andrógenos. En tales realizaciones, los sujetos susceptibles de tratamiento mediante los métodos dados a conocer en el presente documento pueden identificarse por tener un nivel de DHEAS de aproximadamente o superior a 7 pg/ml (18 pmol/l).

Otros sujetos que son susceptibles a los métodos de tratamiento de estados androgénicos en exceso tal como se dan a conocer en el presente documento incluyen, por ejemplo, HSC clásica y no clásica (de inicio tardío), síndrome de Cushing, donde los sujetos con síndrome de Cushing secretan andrógenos elevados, hiperandrogénicos, resistencia a la insulina y síndrome de acantosis pigmentaria (HAIR-AN). En algunas realizaciones, otros sujetos susceptibles de los métodos de tratamiento de estados androgénicos en exceso tal como se dan a conocer en el presente documento incluyen, por ejemplo, sujetos con trastornos androgénicos leves, tales como, pero sin limitarse a, SOP ovulatorio (sujetos hiperandrogénicos ovulatorios con ovario poliquístico en la ecografía), hiperandrogenismo idiopático (un sujeto hiperandrogénico ovulatorio pero con ovarios normales en la ecografía); hirsutismo idiopático (sujetos con fenotipo androgénico con andrógenos normales).

Los niveles de testosterona de referencia y los niveles de DHEAS son comúnmente conocidos por los expertos habituales en la técnica y se dan a conocer en Guay et al, International Journal of Impotence Research (2004) 16, 112-120. En resumen, los niveles normales de andrógenos en mujeres entre las edades de 20 y 49 años oscilan entre; DHEAS; aproximadamente 195,6-140,4 ug/dl; testosterona en suero aproximadamente 51,5-33,7 ng/dl y testosterona libre 1,51-1,03 pg/ml. Por consiguiente, los sujetos susceptibles de tratamiento con pirazoloantrona o derivados funcionales o análogos de los mismos mediante los métodos dados a conocer en el presente documento tienen al menos aproximadamente el 20%, o al menos aproximadamente el 30% o al menos aproximadamente el 40% o al menos aproximadamente el 50%, o al menos aproximadamente el 60% o al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 100% o más de aumento de DHEAS o testosterona en suero, o niveles de testosterona libre en comparación con el valor de intervalo más alto del valor normal para DHEAS (195,6 pg/dl), testosterona en suero (51,5 ng/dl), testosterona libre (1,51 pg/ml). En algunas realizaciones, los sujetos susceptibles del tratamiento de pirazoloantrona o derivados funcionales o análogos de los mismos mediante los métodos tal como se dan a conocer en el presente documento tienen al menos aproximadamente 2 veces, o al menos aproximadamente 3 veces, o al menos aproximadamente 4 veces , o al menos aproximadamente 5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces o más de aumento en DHEAS o testosterona en suero, o niveles de testosterona libre en comparación con el valor de intervalo más alto del valor normal para DHEAS (195,6 pg/dl), testosterona en suero (51,5 ng/dl), testosterona libre (1,51 pg/ml).

Un experto habitual en la técnica puede medir DHEAS usando un kit de Diagnostic Products Corporation de Los Ángeles, California, EE.UU. La reactividad cruzada se ha determinado previamente como del 100% para DHEAS y el 0,121% con androstenediona, el 15% con 9-hidroxiandrostenediona, el 0,046% con sulfato de estrona 3, el 0,55% con sulfato de androsterona, el 0,5% con DHEA y despreciable para todos los demás esteroides sometidos a prueba. Un experto habitual en la técnica puede medir la testosterona libre usando los kits Coat a Count de Diagnostic Products Corporation, Los Ángeles, California, EE.UU. Se ha determinado previamente que la reactividad cruzada es del 0,41% para la dihidrotestosterona, el 0,01% para la androstenediona, el 0,10% para la metiltestosterona y el 0,01% para todos los demás esteroides sometidos a prueba. Un experto habitual en la técnica puede medir los niveles de testosterona en suero total usando el kit de testosterona en suero Immunochem de ICN Biomedicals Inc., División de Diagnóstico de Costa Mesa, California, EE.UU.

Un experto habitual en la técnica puede realizar los ensayos para determinar la pregnenolona y la 17-hidroxipregnenolona en suero del kit de Quest Laboratory en Tarzana, California, EE.UU. El índice de andrógenos libres (FAI) puede calcularse usando la siguiente fórmula: (Testosterona total ng/dl x 0,0347)/(SHBG nmol/l) x100 = FAI.

Administración de composiciones farmacéuticas

Una proteína de MIS humana recombinante o un derivado o un fragmento funcional de la misma puede administrarse por cualquier vía conocida en la técnica o descrita en el presente documento, por ejemplo, oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa o intramuscular), intraperitoneal, rectal, cutánea, nasal, vaginal, por inhalación, piel (parche) u ocular. La proteína de MIS humana recombinante o el derivado o la proteína del fragmento funcional pueden administrarse en cualquier dosis o pauta posológica.

Con respecto a los métodos terapéuticos de la invención, no se pretende que la administración de una proteína de MIS humana recombinante o polinucleótido que codifica para una proteína de MIS humana recombinante de este tipo o fragmento funcional de la misma se limite a un modo particular de administración, dosificación o frecuencia de dosificación; la presente invención contempla todos los modos de administración, incluyendo intramuscular, intravenoso, intraperitoneal, intravesicular, intraarticular, intralesional, subcutáneo o cualquier otra vía suficiente para proporcionar una dosis adecuada para tratar una enfermedad autoinmunitaria o trastorno relacionado con el sistema inmunitario tal como se da a conocer en el presente documento. Puede administrarse al paciente una cantidad eficaz, por ejemplo, una dosis terapéuticamente eficaz de una proteína de MIS humana recombinante en una dosis única o en dosis múltiples. Cuando se administran múltiples dosis, las dosis pueden separarse entre sí por, por ejemplo, una hora, tres horas, seis horas, ocho horas, un día, dos días, una semana, dos semanas o un mes. Por ejemplo, una composición que comprende un agente de proteína de MIS humana recombinante puede administrarse durante, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 o más semanas. Debe entenderse que, para cualquier sujeto particular, las pautas posológicas específicas deben ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. Por ejemplo, la dosificación del agente terapéutico puede aumentarse si la dosis más baja no proporciona suficiente actividad terapéutica.

Si bien el médico responsable decidirá finalmente la cantidad apropiada y la pauta posológica, pueden proporcionarse cantidades eficaces de una proteína de MIS humana recombinante o derivado o fragmento funcional de la misma en una dosis de 0,0001, 0,01, 0,01 0,1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500 ó 1000 mg/kg. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas de dosis-respuesta derivadas de bioensayos o sistemas de prueba con modelos animales in vitro. En algunas realizaciones, las dosis de una proteína de MIS humana recombinante son de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (peso corporal del paciente), aunque también pueden administrarse dosis más bajas y más altas.

En algunas realizaciones, los intervalos de referencia para las dosis de MIS humana recombinante se estiman a partir de grupos de referencia en los Estados Unidos y se describen en Antimullerian Hormone (AMH), Serum from Mayo Medical Laboratories. Obtenido en abril de 2012. En algunas realizaciones, a los sujetos femeninos se les pueden administrar las siguientes dosis de MIS humana recombinante: mujeres menores de 24 meses: menos de 5 ng/ml; mujeres de 24 meses a 12 años: menos de 10 ng/ml; mujeres de 13 a 45 años: 1 a 10 ng/ml; mujeres mayores de 45 años: menos de 1 ng/ml. En algunas realizaciones, a los sujetos masculinos se les pueden administrar las siguientes dosis de MIS humana recombinante; hombres menores de 24 meses: 15 a 500 ng/ml; hombres entre 24 meses y 12 años: 7 a 240 ng/ml; hombres mayores de 12 años: 0,7 a 20 ng/ml. Se observa que las mediciones de MIS pueden ser menos precisas si la persona que se mide tiene deficiencia de vitamina D.

Además, como se ha demostrado la aditividad, sinergia o competencia con MIS y rapamicina, AzadC, doxorrubicina, cisplatino y paclitaxel, la MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento puede administrarse en combinación con terapias dirigidas selectivas, por ejemplo, para lograr una mayor actividad contra el cáncer de ovario que el uso de MIS humana recombinante o el agente quimioterápico usado solo.

Las dosificaciones para un paciente o sujeto particular pueden ser determinadas por un experto habitual en la técnica usando consideraciones convencionales (por ejemplo, mediante un protocolo farmacológico convencional apropiado). Un médico puede, por ejemplo, prescribir una dosis relativamente baja al principio, aumentando posteriormente la dosis hasta que se obtenga una respuesta adecuada. La dosis administrada a un paciente es suficiente para producir una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente a lo largo del tiempo o, por ejemplo, para reducir los síntomas u otra actividad apropiada, dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia de la formulación particular y la actividad, estabilidad o semivida en suero de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o fragmentos funcionales de la misma tal como se da a conocer en el presente documento, y el estado del paciente, la enfermedad autoinmunitaria que va a tratarse, así como el peso corporal o el área superficial del paciente que va a tratarse. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que acompañe a la administración de un vector, formulación particular o similar en un sujeto particular. Las composiciones terapéuticas que comprenden una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o fragmentos funcionales de la misma se someten a prueba de manera opcional en uno o más modelos animales in vitro y/o in vivo de enfermedad, tal como un bioensayo de regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento en los ejemplos, y conocido por los expertos habituales en la técnica, para confirmar la eficacia, el metabolismo tisular y estimar las dosificaciones, según métodos bien conocidos en la técnica . En particular, las dosificaciones pueden determinarse inicialmente por actividad, estabilidad u otras medidas adecuadas de tratamiento frente a no tratamiento (por ejemplo, comparación de células o modelos animales tratados frente a no tratados), en un ensayo relevante. Las formulaciones se administran a una tasa determinada por la DL50 de la formulación relevante y/o la observación de cualquier efecto secundario de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o fragmentos funcionales de la misma a diversas concentraciones, por ejemplo, según se aplique a la masa y salud general del paciente. La administración puede realizarse mediante dosis únicas o divididas.

Al determinar la cantidad eficaz de una proteína de MIS humana recombinante o derivados funcionales o fragmentos funcionales de la misma para administrar en el tratamiento o profilaxis de una enfermedad, el médico evalúa los niveles en plasma circulantes, las toxicidades de la formulación y la progresión de la enfermedad. El nivel de dosificación seleccionado también dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o el éster, la sal o amida del mismo, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que va a emplearse, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular empleado, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historia clínica previa del paciente que va a tratarse, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento puede administrarse en una dosis según las buenas prácticas médicas, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual, el sitio y método de administración, la programación de la administración, la edad del paciente, sexo, peso corporal y otros factores conocidos por los médicos.

Las pautas posológicas de una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse de manera proporcional según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación.

Además, los niveles de dosificación reales de una proteína de MIS humana recombinante en una composición farmacéutica pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un sujeto, composición y modo de administración en particular, sin ser tóxico para el sujeto. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede ser una “cantidad terapéuticamente eficaz” y/o una “cantidad profilácticamente eficaz”. En general, una dosis diaria adecuada de una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer será la cantidad de una proteína de MIS humana recombinante que es la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico, tal como una reducción de un síntoma de un trastorno proliferativo o cáncer tal como se da a conocer en el presente documento. Una dosis eficaz de este tipo dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente.

Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados durante el día, opcionalmente, en formas de dosificación unitarias.

El nivel de dosificación administrado a un sujeto puede ser constante durante un periodo de tiempo deseado, por ejemplo, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año o al menos 5 años. Alternativamente, el nivel de dosificación administrado a un sujeto puede variar dependiendo de la progresión del estado que va a tratarse.

Cabe señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad del cáncer que va a aliviarse. Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, las pautas posológicas específicas deben ajustarse a lo largo del tiempo según la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son a modo de ejemplo únicamente y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.

La eficacia y toxicidad del compuesto puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, DE50 (la dosis es eficaz en el 50% de la población) y DL50 (la dosis es letal para el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la razón DL50/DE50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan grandes índices terapéuticos. Un modelo de experimentación apropiado que puede usarse incluye la determinación de la dosis. Puede usarse el bioensayo de regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento en los ejemplos, o un modelo de cáncer in vivo que es comúnmente conocido por los expertos habituales en la técnica. Los modelos de cáncer in vivo se comentan en Frese et al., “Maximizing mouse cancer models” Nat Rev Cancer. Septiembre de 2007; 7(9):645-58 y Santos et al., Genetically modified mouse models in cancer studies. Clin Transl Oncol. Diciembre de 2008; 10(12):794-803 y “Cancer stem células in mouse models of cancer”, 6° Simposio anual de MDI de células madre, MDI Biological Lab, Salisbury Cove, ME, 10-11 de agosto de 2007”.

Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente o bien en ensayos de cultivo celular o bien en modelos animales, habitualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se usa para lograr un intervalo de concentración y una vía de administración deseables. Entonces, tal información puede usarse para determinar las dosis útiles y las vías de administración en otros sujetos. Generalmente, la cantidad terapéuticamente eficaz depende del efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de MIS humana recombinante puede evaluarse en un modelo de ratón de cáncer, o usando el bioensayo de regresión del conducto de Müller tal como se da a conocer en el presente documento en los ejemplos y la figura 4.

Un médico o veterinario con experiencia normal en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar de manera gradual la dosis hasta lograr el efecto deseado. También se observa que los seres humanos son tratados generalmente más tiempo que los ratones u otros animales de experimentación ejemplificados en el presente documento, tratamiento que tiene una duración proporcional a la duración del proceso de la enfermedad y la eficacia del fármaco. Las dosis pueden ser dosis únicas o dosis múltiples durante un periodo de varios días, pero se prefieren dosis únicas.

En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante (por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos que codifican para una proteína de MIS humana recombinante o fragmentos de la misma) puede administrarse a seres humanos y otros animales para terapia por cualquier vía de administración adecuada, incluyendo por vía oral, nasal, como por, por ejemplo, un pulverizador, por vía rectal, intravaginal, parenteral, intracisternal y tópica, como mediante polvos, pomadas o gotas, incluyendo por vía bucal y sublingual.

Después de la formulación con un portador farmacéuticamente aceptable apropiado en una dosificación deseada, puede administrarse a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma puede administrarse a un sujeto usando cualquier medio adecuado. En general, los medios de administración adecuados incluyen, pero no se limitan a, las vías tópica, oral, parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea o intramuscular), rectal, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, ocular o nasal.

En una realización específica, puede ser deseable administrar la composición farmacéutica que comprende una proteína de MIS humana recombinante localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas, fibras o sustitutos comerciales de la piel. En algunas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento puede aplicarse al músculo usando cremas tópicas, parches, inyecciones intramusculares y similares. En algunas realizaciones, puede administrarse una proteína de MIS humana recombinante a un sujeto por vía oral (por ejemplo, en cápsulas, suspensiones o comprimidos) o mediante administración parenteral. Los métodos convencionales para la administración oral incluyen administrar una proteína de MIS humana recombinante en cualquiera de los siguientes; pueden usarse comprimidos, suspensiones, disoluciones, emulsiones, cápsulas, polvos, jarabes y similares. Se prefieren las técnicas conocidas que administran una proteína de MIS humana recombinante por vía oral o intravenosa y conservan la actividad biológica. La administración parenteral puede incluir, por ejemplo, administración intramuscular, intravenosa, intraarticular, intraarterial, intratecal, subcutánea o intraperitoneal. Una proteína de MIS humana recombinante también puede administrarse por vía oral, transdérmica, tópica, por inhalación (por ejemplo, intrabronquial, intranasal, inhalación oral o gotas intranasales) o por vía rectal. La administración puede ser local o sistémica según se indique. Los agentes, por ejemplo, agentes de ácido nucleico que codifican para una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional de la misma, también pueden administrarse usando un vector, por ejemplo, un vector viral mediante métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Cuando se administra una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento por vía parenteral, se formulará generalmente en una forma de dosis unitaria inyectable (por ejemplo, disolución, suspensión, emulsión). Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la reconstitución en disoluciones o dispersiones inyectables estériles. El portador puede ser un medio disolvente o dispersante que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

El término forma de “dosificación unitaria”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que van a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas de una proteína de MIS humana recombinante o fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento y el efecto terapéutico o profiláctico particular que va a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de elaboración de una proteína de MIS humana recombinante con un agente activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Las composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento pueden suspenderse en vehículos acuosos e introducirse a través de agujas hipodérmicas convencionales o usando bombas de infusión.

Composiciones farmacéuticas

En algunas realizaciones, una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede formularse en cualquier medio adecuado, por ejemplo, como una disolución inyectable estéril, por ejemplo, que puede prepararse incorporando la proteína de MIS humana recombinante en la cantidad requerida del disolvente apropiado con varios de los otros componentes, según se desee.

Una formulación farmacológica de una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede administrarse al paciente en una formulación inyectable que contenga cualquier portador compatible, tal como diversos vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes; o los compuestos utilizados en la presente invención pueden administrarse por vía parenteral al paciente en forma de implantes subcutáneos de liberación lenta o sistemas de administración dirigidos tales como anticuerpos monoclonales, administración vectorizada, agentes iontoforéticos, matrices poliméricas, liposomas y microesferas. Los ejemplos de sistemas de administración útiles en la presente invención incluyen los presentados en las patentes estadounidenses n.os: 5.225.182; 5.169.383; 5.167.616; 4.959.217; 4.925.678; 4.487.603; 4.486.194; 4.447.233; 4.447.224; 4.439.196 y 4.475.196. Otros de tales implantes, sistemas de administración y módulos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Los vehículos no acuosos tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de girasol o aceite de cacahuete y ésteres, tales como miristato de isopropilo, también pueden usarse como sistemas disolventes para composiciones de compuestos. De manera adicional, pueden añadirse diversos aditivos que mejoran la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol y ácido sórbico. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse aproximadamente mediante el uso de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Según la presente invención, sin embargo, cualquier vehículo, diluyente o aditivo usado tendría que ser compatible con los compuestos.

En otra realización, una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender formulaciones basadas en lípidos. Cualquiera de los sistemas de administración de fármacos basados en lípidos conocidos puede usarse en la práctica de la invención. Por ejemplo, pueden usarse liposomas multivesiculares, liposomas multilaminares y liposomas unilaminares siempre que pueda establecerse una tasa de liberación sostenida del compuesto activo encapsulado. Los métodos para elaborar sistemas de liberación de fármacos liposiculares multivesiculares de liberación controlada se describen en las publicaciones de solicitud de PCT n.os: WO 9703652, WO 9513796 y WO 9423697.

La composición de la vesícula de membrana sintética es habitualmente una combinación de fosfolípidos, habitualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de vesículas de membrana sintética incluyen fosfatidilgliceroles, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, fosfatidiletanolaminas, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos, con realizaciones preferibles que incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina, diestearoolfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol y dioleoilfosfatidilglicerol.

En la preparación de vesículas basadas en lípidos que contienen una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma, deberían considerarse variables tales como la eficiencia de la encapsulación del compuesto activo, la labialidad del compuesto activo, la homogeneidad y el tamaño de la población resultante de vesículas, la razón compuesto activo con respecto a lípido, la permeabilidad, la inestabilidad de la preparación y la aceptabilidad farmacéutica de la formulación.

En otra realización, una proteína de MIS humana recombinante puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533). En aún otra realización, una proteína de MIS humana recombinante puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer (1990) citado anteriormente). En otra realización, puede usarse materiales poliméricos (véase Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105). En otra realización en la que el agente activo de la invención es un ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, construyéndola como pate de un vector de expresión de ácidos nucleicos apropiado y administrándola de manera que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retroviral (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un cañón de genes; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o administrándola junto con un péptido de tipo homeocaja que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede introducirse de manera intracelular e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión, mediante recombinación homóloga.

Antes de la introducción, una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede esterilizarse mediante cualquiera de las numerosas técnicas disponibles en la técnica, tal como con radiación gamma o esterilización por haz de electrones.

En otra realización de la invención, una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento, puede administrarse y/o formularse junto (por ejemplo, en combinación) con cualquier otro agente terapéutico. Para el fin de la administración, una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento se formula preferiblemente como una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un compuesto de esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que el compuesto está presente en la composición en una cantidad que es eficaz para tratar el estado de interés. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las concentraciones y dosificaciones apropiadas.

Los portadores farmacéuticamente aceptables son familiares para los expertos en la técnica. Para las composiciones formuladas como disoluciones líquidas, los portadores aceptables incluyen solución salina y agua estéril y pueden incluir opcionalmente antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y otros aditivos comunes. Las composiciones también pueden formularse como píldoras, cápsulas, gránulos o comprimidos que contienen, además de un compuesto de esta invención, diluyentes, agentes dispersantes y tensioactivos, aglutinantes y lubricantes. Un experto en esta técnica puede formular además los compuestos de esta invención de una manera apropiada y según las prácticas aceptadas, tales como las dadas a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania. 1990.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en cualquier forma. Estas formas incluyen, pero no se limitan a, disoluciones, suspensiones, dispersiones, pomadas (incluyendo pomadas orales), cremas, pastas, geles, polvos (incluyendo polvos dentales), pastas dentales, pastillas para chupar, bálsamos, chicles, pulverizadores bucales, pastillas, sobres, colutorios, aerosoles, comprimidos, cápsulas, parches transdérmicos, que comprenden una o más resolvinas y/o proteínas o sus análogos de la invención.

Las formulaciones de una composición que comprenden una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma, tal como se da a conocer en el presente documento, pueden prepararse mediante varios medios conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las formulaciones pueden prepararse para la administración como una formulación en aerosol, por ejemplo, combinando (i) una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento en una cantidad suficiente para proporcionar una pluralidad de dosis terapéuticamente eficaces; (ii) la adición de agua en una cantidad eficaz para estabilizar cada una de las formulaciones; (iii) el propelente en una cantidad suficiente para impulsar una pluralidad de dosis desde un bote de aerosol; y (iv) cualquier componente opcional adicional, por ejemplo, etanol como codisolvente; y dispersando los componentes. Los componentes pueden dispersarse usando una mezcladora o un homogeneizador convencional, mediante agitación o mediante energía ultrasónica. La formulación a granel puede transferirse a viales de aerosol individuales más pequeños usando métodos de transferencia de válvula a válvula, llenado a presión o usando métodos convencionales de llenado en frío. No se requiere que un estabilizador usado en una formulación de aerosol en suspensión sea soluble en el propelente. Aquellos que no son suficientemente solubles pueden recubrirse sobre las partículas de fármaco en una cantidad apropiada y las partículas recubiertas pueden incorporarse luego en una formulación tal como se describió anteriormente.

En determinadas realizaciones, una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento puede administrarse a un sujeto como una composición farmacéutica con un portador farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, estas composiciones farmacéuticas comprenden además opcionalmente uno o más agentes terapéuticos adicionales. En determinadas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos adicionales son enfermedades autoinmunitarias o fármacos, tales como inmunosupresores y similares. En algunas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un cortiosteroide. En algunas realizaciones, se selecciona un agente terapéutico adicional del grupo que consiste en prednisona, metilprednisolona, Kenalog, Medrol oral, Medrol (Pak) oral, Depo-Medrol iny., prednisolona oral, Solu-Medrol iny., hidrocortisona oral, Cortef oral, Solu-Medrol i.v., cortisona oral, Celestone Soluspan iny., Orapred ODT oral, Orapred oral, Prelone oral, acetato de metilprednisolona iny., Prednisone Intensol oral, acetato de betametasona y fosfato de sodio iny., Veripred, Celestone oral, suc. sódico de metilprednisolona i.v., suc. sódico de metilprednisolona iny., Millipred oral, Solu-Medrol (PF) iny., Solu-Cortef iny., Aristospan intraarticular iny., succinato sod. de hidrocortisona iny., fosfato sódicod de prednisolona oral, suc. sódico de metilprednisolona (PF) i.v., Solu-Medrol (PF) i.v., hexacetónido de triamcinolona iny., A-Hydrocort iny., A-Methapred iny., Millipred DP oral, Flo-Pred oral, Aristospan intralesional iny., betametasona oral, suc. sódico de metilprednisolona (PF) iny., suc. sódico de hidrocortisona (PF) iny., Solu-Cortef (PF) iny., acetato de prednisolona oral, dexametasona en NaCl al 0,9% i.v., Rayos, levotiroxina. Por supuesto, tales agentes terapéuticos que son conocidos por los expertos habituales en la técnica pueden sustituirse fácilmente ya que esta lista no debe considerarse exhaustiva o limitativa.

También pueden estar presentes en las composiciones agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Las formulaciones de la presente invención incluyen las adecuadas para administración intravenosa, oral, nasal, tópica, transdérmica, bucal, sublingual, rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una única forma de dosificación será generalmente la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. Generalmente, de un cien por ciento, esta cantidad oscilará entre aproximadamente el 1 por ciento y aproximadamente el noventa y nueve por ciento de principio activo, preferiblemente entre aproximadamente el 5 por ciento y aproximadamente el 70 por ciento, más preferiblemente entre aproximadamente el 10 por ciento y aproximadamente el 30 por ciento.

Las formulaciones de la invención adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar (usando una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos o como una disolución o suspensión en líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) y/o como colutorios y similares, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como principio activo. Un compuesto de la presente invención también puede administrarse en forma de bolo, electuario o pasta.

En las formas de dosificación sólidas de la invención para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), el principio activo se mezcla con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; humectantes, como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio; agentes retardadores de la disolución, tal como parafina; aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; absorbentes, como caolín y arcilla bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de tamponamiento. También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Un comprimido puede prepararse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes accesorios. Los comprimidos fabricados por compresión pueden prepararse usando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo, almidón glicolato de sodio o carboximetilcelulosa de sodio reticulada), agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte.

Los comprimidos y otras formas de dosificación sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden marcarse o prepararse opcionalmente con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de la formulación farmacéutica. También pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del principio activo en los mismos usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado, otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas. Pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que conserva bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en agua estéril o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición que liberen el/los principio(s) activo(s) solamente, o preferentemente, en una determinada parte del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. Los ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente.

Las formas de dosificación líquidas para la administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables.

Además del principio activo, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión como, por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, ésteres de polioxietilen sorbitol y sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

En algunos casos, una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede estar en una formulación adecuada para administración rectal o vaginal, por ejemplo, como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes o portadores no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorios o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a temperatura corporal y, por tanto, libera el compuesto activo. Los portadores y formulaciones adecuados para tal administración se conocen en la técnica.

Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de una proteína de MIS humana recombinante de esta invención, por ejemplo, para administración muscular, incluyen polvos, pulverizadores, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalatorios. Una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede mezclarse en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propelente que pueda ser necesario.

Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc o mezclas de los mismos. Los polvos y pulverizadores pueden contener, además de un compuesto de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizadores pueden contener además propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano.

Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar una administración controlada de una proteína de MIS humana recombinante de la presente invención al cuerpo. Tales formas de dosificación pueden elaborarse disolviendo o dispersando el compuesto en el medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de dicho flujo puede controlarse proporcionando una membrana que controla la velocidad o dispersando el compuesto activo en una matriz polimérica o gel.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención adecuadas para la administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido o agentes de suspensión o espesantes.

Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tal como oleato de etilo. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede asegurarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco, es deseable ralentizar la absorción del fármaco por inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga mala solubilidad en agua. La tasa de absorción del fármaco depende entonces de su tasa de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el fármaco en un vehículo oleoso.

Las formas de depósito inyectables se elaboran formando matrices microencapsuladas de los compuestos objeto en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la razón de fármaco con respecto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal.

En determinadas realizaciones, una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma puede aislarse y/o purificarse o purificarse sustancialmente mediante uno o más métodos de purificación descritos en el presente documento o conocidos por los expertos en la técnica. Generalmente, las purezas son al menos del 90%, en particular el 95% y, a menudo, superiores al 99%. En determinadas realizaciones, el compuesto que se produce de manera natural se excluye de la descripción general del género más amplio.

En algunas realizaciones, la composición comprende al menos una proteína de MIS humana recombinante en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones de tampón fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

En determinadas realizaciones, una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede contener uno o más grupos funcionales ácidos y, por tanto, puede formar sales farmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término “sales, ésteres, amidas y profármacos farmacéuticamente aceptables”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a las sales de carboxilato, sales de adición de aminoácidos, ésteres, amidas y profármacos de los compuestos de la presente invención que se encuentran dentro del alcance del juicio médico razonable adecuados para su uso en contacto con los tejidos de pacientes sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica indebidas y similares, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable y eficaz para el uso previsto de los compuestos de la invención. El término “sales” se refiere a las sales de adición de ácidos orgánicos e inorgánicos relativamente no tóxicos de los compuestos de la presente invención.

Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y aislando la sal así formada. Estos pueden incluir cationes basados en metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes no tóxicos de amonio, amonio cuaternario y amina, incluyendo, pero sin limitarse a, amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. (Véase, por ejemplo, Berge S. M. et al., “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci., 1977; 66:1-19).

El término “ésteres farmacéuticamente aceptables” se refiere a los productos esterificados, relativamente no tóxicos, de los compuestos de la presente invención. Estos ésteres pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos, o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de ácido libre o hidroxilo con un agente de esterificación adecuado. Los ácidos carboxílicos pueden convertirse en ésteres mediante el tratamiento con un alcohol en presencia de un catalizador. El término pretende además incluir grupos hidrocarbonados inferiores capaces de solvatarse en condiciones fisiológicas, por ejemplo, ésteres de alquilo, ésteres de metilo, etilo y propilo.

Tal como se usa en el presente documento, “sales o profármacos farmacéuticamente aceptables” son sales o profármacos que, dentro del alcance del juicio médico razonable, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de pacientes sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas, proporcionales con una relación beneficio/riesgo razonable y eficaces para el uso previsto. Estos compuestos incluyen las formas zwitteriónicas, cuando es posible, de los compuestos r de la invención.

El término “sales” se refiere a las sales de adición de ácidos orgánicos e inorgánicos relativamente no tóxicos de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos o haciendo reaccionar por separado el compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y aislando la sal así formada. Estos pueden incluir cationes basados en metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, así como cationes no tóxicos de amonio, amonio cuaternario y amina, incluyendo, pero sin limitarse a, amonio, tetrametilanunonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares (véase, por ejemplo, Berge S. M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66, 1,).

El término “profármaco” se refiere a compuestos o agentes que se transforman rápidamente in vivo para producir la proteína de MIS humana recombinante activa, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico de MIS activo biológicamente activo o funcional (por ejemplo, ARNm, ADN, ARNmod) que codifica para una proteína de MIS funcionalmente activa. En algunas realizaciones, un profármaco de proteína de MIS humana recombinante puede activarse mediante hidrólisis en sangre, por ejemplo, mediante la escisión de una secuencia líder, y/o escisión en el sitio de escisión primario para dar como resultado los dominios N-terminal y C-terminal para la producción de una proteína de MIS bioactiva, similar a cómo se activa la insulina a partir de su proproteína para dar una proteína de insulina activa. Se proporciona un análisis detallado en T. Higachi y V. Stella, “Prodrugs as Novel Delivery Systems”, vol. 14 de la serie de simposios de la A.C.S., y en Bioreversible Carriers in: Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association y Pergamon Press, 1987. Tal como se usa en el presente documento, un profármaco es un compuesto que, administración in vivo, se metaboliza o se convierte de otro modo en la forma biológica, farmacéutica o terapéuticamente activa del compuesto. El profármaco puede diseñarse para alterar la estabilidad metabólica o las características de transporte de una proteína de MIS humana recombinante, para enmascarar efectos secundarios o toxicidad, o para alterar otras características o propiedades de la proteína de MIS humana recombinante.

En virtud del conocimiento de los procesos farmacodinámicos y el metabolismo de fármacos o el procesamiento de proteínas postraduccionales de MIS in vivo, una vez que se identifica un compuesto farmacéuticamente activo, los expertos en la técnica farmacéutica pueden diseñar generalmente un profármaco de proteína de MIS humana recombinante que puede activarse in vivo para aumentar los niveles de una proteína de MIS bioactiva en el sujeto (véase, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, N.Y., páginas 388-392). Los procedimientos convencionales para la selección y preparación de profármacos adecuados se describen, por ejemplo, en “Designo of Prodrugs, ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985. Los ejemplos adecuados de profármacos incluyen ésteres de metilo, etilo y glicerol del ácido correspondiente.

Tal como se comenta en el presente documento, en algunas realizaciones una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional o una variante de la misma tal como se da a conocer en el presente documento puede conjugarse con o unirse covalentemente a un agente de direccionamiento para aumentar su especificidad de tejido y dirigirse a una célula, por ejemplo, células musculares. Los agentes de direccionamiento pueden incluir, por ejemplo, sin limitación, anticuerpos, citocinas y ligandos de receptor, tal como se comenta en la sección titulada “direccionamiento”. En algunas realizaciones, el agente de direccionamiento se sobreexpresa en las células que van a dirigirse, por ejemplo, las células musculares en comparación con las células no musculares.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos habituales en la técnica.

Terapia génica

En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional de la misma tal como se da a conocer en el presente documento, puede administrarse de manera adecuada como un vector, por ejemplo, un vector viral.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante puede usarse de manera eficaz en el tratamiento mediante terapia génica. Véase, en general, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.399.346,. El principio general es introducir el polinucleótido en una célula diana en un paciente, y donde se transcribe a la proteína.

La entrada en la célula puede facilitarse mediante técnicas adecuadas conocidas en la técnica, tales como proporcionar el polinucleótido en forma de un vector adecuado o encapsular el polinucleótido en un liposoma.

Un modo deseado de terapia génica es proporcionar el polinucleótido de tal manera que se replique dentro de la célula, mejorando y prolongando el efecto deseado. Por tanto, el polinucleótido está unido operativamente a un promotor adecuado, tal como el promotor natural del gen correspondiente, un promotor heterólogo que es intrínsecamente activo en células hepáticas, neuronales, óseas, musculares, cutáneas, articulares o de cartílago, o un promotor heterólogo. que puede inducirse por un agente adecuado.

Los vectores de expresión compatibles con células eucariotas, preferiblemente los compatibles con células de vertebrados, pueden usarse para producir constructos recombinantes para la expresión de una proteína de MIS humana recombinante o un derivado funcional o variante funcional o fragmento funcional de la misma tal como se da a conocer en el presente documento. Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la técnica y están disponibles en varias fuentes comerciales. Normalmente, tales vectores se proporcionan que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Estos vectores pueden ser vectores virales tales como adenovirus, virus adenoasociados, poxvirus tales como un orthopox (vaccinia y vaccinia atenuado), avipox, lentivirus, virus de leucemia murina de Moloney, etc.

Alternativamente, en algunas realizaciones, puede usarse un vector de expresión plasmídico. Los vectores de expresión plasmídicos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3.1, vectores pET (Novagen®), vectores pGEX (GE Life Sciences) y vectores pMAL (New England labs. Inc.) para la expresión de proteínas en la célula huésped de E. coli tales como BL21, ^bL21(DE3) y AD494(DE3)pLysS, Rosetta (DE3) y Origami(DE3) ((Novagen®); los vectores pcDNA3.1 (Invitrogen™ Inc.) basados en el promotor CMV fuerte y pCIneo (Promega) para la expresión en líneas celulares de mamíferos como CHO, COS, HEK-293, Jurkat y MCF-7; vectores de vectores adenovirales incompetentes para la replicación pAdeno X, pAd5F35, pLP-Adeno-X-CMV (Clontech®), pAd/CMV/V5-DEST, vector pAd-DEST (Invitrogen™ Inc.) para la transferencia y expresión de genes mediadas por adenovirus en células de mamíferos; vectores de retrovirus pLNCX2, pLXSN y pLAPSN para su uso con el sistema Retro-X™ de Clontech para la transferencia y expresión de genes mediadas por retrovirus en células de mamíferos; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ y pLenti6.2/V5-GW/lacZ (INVITROGEN™ Inc.) para la transferencia y expresión de genes mediadas por lentivirus en células de mamíferos; vectores de expresión de virus asociados a adenovirus tales como pAAV-MCS y pAAV-IRES-hrGFP para la transferencia y expresión de genes mediadas por virus adenoasociado en células de mamífero; baculovirus BACpak6 (Clontech®) y pFastBac™ HT (Invitrogen™ Inc.) para la expresión en líneas celulares de insectos Spodopera frugiperda 9 (Sf9) y Sf11; pMT/BiP/V5-His (Invitrogen™ Inc.) para la expresión en células de Drosophila Schneider S2; vectores de expresión de Pichia pPICZa, pPICZ, pFLDa y pFLD (Invitrogen™ Inc.) para expresión en Pichia pastoris y vectores pMETa y pMET para expresión en P. methanolica; vectores pYES2/GS y pYD1 (Invitrogen™ Inc.) para la expresión en levadura Saccharomyces cerevisiae. Los avances recientes en la expresión a gran escala de proteínas heterólogas en Chlamydomonas reinhardtii son descritos por Griesbeck C. et. al. 2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33 y Fuhrmann M. 2004, Methods Mol Med. 94:191-5. Se insertan secuencias codificantes heterólogas foráneas en el genoma del núcleo, el cloroplasto y la mitocondria mediante recombinación homóloga. El vector de expresión de cloroplasto p64 que porta el marcador seleccionable de cloroplasto más versátil aminoglucósido adenil transferasa (aadA), que confiere resistencia a espectinomicina o estreptomicina, puede usarse para expresar proteína foránea en el cloroplasto. El método de cañón de genes biolístico se usa para introducir el vector en las algas. Tras su entrada en los cloroplastos, el ADN foráneo se libera de las partículas del cañón de genes y se integra en el genoma del cloroplasto a través de la recombinación homóloga.

Los sistemas de vectores virales que pueden utilizarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus; (c) vectores de virus adenoasociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores SV 40; (f) vectores del virus del polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores de poxvirus tales como un orthopox, por ejemplo, vectores del virus vaccinia o avipox, por ejemplo, viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de un cooperador o sin intestino. En una realización preferida, el vector es un adenovirus. Los virus de replicación defectuosa también pueden ser ventajosos.

El vector puede incorporarse o no al genoma de las células. Los constructos pueden incluir secuencias virales para transfección, si se desea. Alternativamente, el constructo puede incorporarse en vectores capaces de replicación episómica, por ejemplo, vectores EPV y EBV.

Los constructos para la expresión de un ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento, por ejemplo, ADN, ARNmod o aARN, pueden unirse generalmente operativamente a elementos reguladores, por ejemplo, promotores, potenciadores, etc., para asegurar la expresión del constructo en células diana. Otros detalles específicos para vectores y constructos se describen con más detalle a continuación.

Las secuencias reguladoras típicas incluyen, pero no se limitan a, promotores transcripcionales, promotores inducibles y elementos transcripcionales, una secuencia operativa opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica para sitios de unión ribosomal de ARNm adecuados y secuencias para controlar la terminación de la transcripción y/o traducción. En el término “elementos reguladores” se incluyen secuencias de ácidos nucleicos tales como señales de iniciación, potenciadores y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias codificantes de proteínas con las que están unidas operativamente. En algunos ejemplos, la transcripción de un gen recombinante está bajo el control de una secuencia promotora (u otra secuencia reguladora de la transcripción) que controla la expresión del gen recombinante en un tipo celular en el que se pretende la expresión. También se entenderá que el gen recombinante puede estar bajo el control de secuencias reguladoras de la transcripción que son iguales o diferentes de aquellas secuencias que controlan la transcripción de la forma que se produce de manera natural de una proteína. En algunos casos, la secuencia promotora es reconocida por la maquinaria de síntesis de la célula, o la maquinaria de síntesis introducida, necesaria para iniciar la transcripción de un gen específico.

Las secuencias reguladoras pueden ser una única secuencia reguladora o múltiples secuencias reguladoras, o secuencias reguladoras modificadas o fragmentos de las mismas. Las secuencias reguladoras modificadas son secuencias reguladoras en las que la secuencia de ácido nucleico ha sido cambiada o modificada por algún medio, por ejemplo, pero sin limitarse a, mutación, metilación, etc. Las secuencias reguladoras útiles en los métodos tal como se dan a conocer en el presente documento son elementos promotores que son suficientes para producir expresión génica dependiente de promotor controlable para específico de tipo celular, específico de tejido o inducible por señales o agentes externos (por ejemplo, potenciadores o represores); tales elementos pueden estar ubicados en las regiones 5' o 3' del gen nativo, o dentro de un intrón.

Tal como se usa en el presente documento, el término “promotor específico de tejido” significa una secuencia de ácido nucleico que sirve como promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada unida operativamente al promotor, y que afecta selectivamente la expresión de la secuencia de ácido nucleico seleccionada en células específicas de un tejido, tal como las células de origen ovárico.

El término “promotor constitutivamente activo” se refiere a un promotor de un gen que se expresa en todo momento dentro de una célula dada. Los promotores a modo de ejemplo para su uso en células de mamífero incluyen citomegalovirus (CMV), y para su uso en células procarióticas incluyen los promotores de bacteriófagos T7 y T3, y similares. El término “promotor inducible” se refiere a un promotor de un gen que puede expresarse en respuesta a una señal dada, por ejemplo, adición o reducción de un agente. Los ejemplos no limitativos de un promotor inducible son los promotores “tet-on” y “tet-off”, o promotores que se regulan en un tipo de tejido específico.

En una realización específica, pueden usarse vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, ADN, ARNmod o aARN que codifican para una proteína de MIS humana recombinante o un fragmento funcional de la misma tal como se da a conocer en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (véase Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma viral y la integración en el ADN de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para una proteína de MIS humana recombinante se clonan en uno o más vectores, lo que facilita la administración del gen a un paciente. Pueden encontrarse más detalles sobre los vectores retrovirales en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdr1 a las células madre hematopoyéticas para hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993).); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)).

La producción de un vector retroviral recombinante que porta un gen de interés se logra normalmente en dos etapas. En primer lugar, la secuencia que codifica para una proteína de MIS humana recombinante o un derivado funcional o variante funcional o fragmento funcional de la misma, sola o fusionada con -Fc, puede insertarse en un vector retroviral que contiene las secuencias necesarias para la expresión eficaz de los reguladores metabólicos (incluyendo los elementos promotores y/o potenciadores que pueden proporcionarse por las repeticiones terminales largas virales (LTR) o por un promotor/potenciador interno y señales de corte y empalme relevantes), secuencias requeridas para el empaquetamiento eficiente del ARN viral en viriones infecciosos (por ejemplo, una señal de empaquetamiento (Psi), un sitio de unión a cebador de ARNt (-PBS), una secuencia reguladora 3' requerida para la transcripción inversa (+PBS)) y una LTR viral). Las LTR contienen secuencias requeridas para la asociación de ARN genómico viral, funciones de transcriptasa inversa e integrasa, y secuencias implicadas en el direccionamiento de la expresión del ARN genómico que se empaquetará en partículas virales.

Después de la construcción del vector retroviral recombinante, el ADN del vector se introduce en una línea celular de empaquetamiento. Las líneas celulares de empaquetamiento proporcionan proteínas virales requeridas en trans para el empaquetamiento de ARN genómico viral en partículas virales que tienen la gama de huéspedes deseada (por ejemplo, Las proteínas de núcleo (gag), polimerasa (pol) y envuelta (env) codificadas por virus). La gama de huéspedes está controlada, en parte, por el tipo de producto génico de la envuelta expresado en la superficie de la partícula viral. Las líneas celulares de empaquetamiento pueden expresar productos génicos de la envuelta ecotróficos, anfotrópicos o xenotrópicos. Alternativamente, la línea celular de empaquetamiento puede carecer de secuencias que codifiquen para una proteína de la envuelta viral (env). En este caso, la línea celular de empaquetamiento puede empaquetar el genoma viral en partículas que carecen de una proteína asociada a la membrana (por ejemplo, una proteína env). Para producir partículas virales que contienen una proteína asociada a la membrana que permite la entrada del virus en una célula, la línea celular de empaquetamiento que contiene las secuencias retrovirales puede transfectarse con secuencias que codifican para una proteína asociada a la membrana (por ejemplo, la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV)). La célula de empaquetamiento transfectada puede entonces producir partículas virales que contienen la proteína asociada a la membrana expresada por la línea celular de empaquetamiento transfectada; se dice que estas partículas virales que contienen ARN genómico viral derivado de un virus encapsidado por las proteínas de la envuelta de otro virus son partículas de virus pseudotipadas.

Los adenovirus son otros vectores virales que pueden usarse en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para administrar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de manera natural el epitelio respiratorio donde provocan una enfermedad leve. Otros dianas para los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y el músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de poder infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de los macacos de la India. Otro vector viral preferido es un poxvirus, tal como el virus vaccinia, por ejemplo, una vacuna atenuada, tal como el virus modificado de Ankara (MVA) o NYVAC, un avipox, tal como la viruela aviar o la viruela del canario. Otros casos del uso de adenovirus en terapia génica pueden encontrarse en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91: 225-234 (1993); publicación de PCT WO94/12649; y Wang et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). En otra realización, se usan vectores lentivirales, tales como los vectores basados en VIH descritos en las patentes estadounidenses n.os 6.143.520; 5.665.557; y 5.981.276. En algunas realizaciones, se usa un vector viral tal como un vector de virus adenoasociado (AAV). Los ejemplos de vectores de AAV se dan a conocer en Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); la patente estadounidense n.° 5.436.146; Gao et al., Gene Therapy 2005, 5, 285-297; Vandenberghe et al., Gene Therapy 2009, 16, 311-319; Gao et al., PNAS 2002, 99, 11854-11859; Gao et al., PNAS 2003, 100, 6081-6086; Gao et al., J. of Virology 2004, 78, 6381-6388; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a edición) ed. por M. Green y J. Sambrook. En algunas realizaciones, el vector AAV es AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh. 10, AAV2.5. Cabe señalar que la selección de un tipo particular de vectores AAV puede depender del tejido diana.

En algunas realizaciones, cuando una proteína de MIS humana recombinante codificada por un vector viral se expresa de manera endógena en un sujeto, el nivel de expresión de la proteína de MIS humana recombinante dada a conocer en el presente documento puede ser constante durante un periodo de tiempo deseado, por ejemplo, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año o al menos 5 años. En algunas realizaciones, la expresión de la proteína de MIS humana de recombinación dada a conocer en el presente documento puede mantenerse en o por encima de un nivel de dosificación terapéuticamente eficaz durante un periodo de tiempo deseado.

Otro enfoque de la terapia génica implica la transferencia de un gen a las células en cultivo de tejidos mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Habitualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Luego, las células se colocan bajo selección para aislar aquellas células que han captado y están expresando el gen transferido. Luego, esas células se administran a un paciente.

La patente estadounidense n.° 5.676.954 informa sobre la inyección de material genético, complejado con portadores de liposomas catiónicos, en ratones. Las patentes estadounidenses n.os 4.897.355, 4.946.787, 5.049.386, 5.459.127, 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, y la publicación internacional n.°: WO 94/9469 proporciona lípidos catiónicos para su uso en la transfección de ADN en células y mamíferos. Las patentes estadounidenses n.os 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, y la publicación internacional n.°: WO 94/9469 proporciona métodos para proporcionar complejos lipídicos catiónicos de ADN a mamíferos. Tales complejos lipídicos catiónicos o nanopartículas también pueden usarse para administrar la proteína.

Puede introducirse un gen o secuencia de ácido nucleico en una célula diana mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, un constructo de proteína de MIS humana recombinante puede introducirse en una célula por transfección (por ejemplo, transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE-dextrano), lipofección, electroporación, microinyección (por ejemplo, por inyección directa de ADN desnudo), biolística, infección con un vector viral que contiene un transgén relacionado con el músculo, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, transferencia nuclear y similares. Un ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante puede introducirse en las células mediante electroporación (véase, por ejemplo, Wong y Neumann, Biochem. Biophys. Res. Comun. 107:584-87 (1982)) y biolística (por ejemplo, un cañón de genes; Johnston y Tang, Methods Cell Biol. 43 Parte A: 353-65 (1994); Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-82 (1993)).

En determinadas realizaciones, puede introducirse un gen o secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante en células diana mediante transfección o lipofección. Los agentes adecuados para transfección o lipofección incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, lipofectina, lipfectamina, DIMRIE C, Superfect y Effectin (Qiagen), unifectina, maxifectina, DOTMA, DOGS (Transfectam; dioctadecilamidoglicilespermina), DOPE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamoniopropano), DDAB (dioctadecilamoniobromuro de dimetilo), DHDEAB (amoniobromuro de N,N-di-nhexadecil-N,N-dihidroxietilo), HDEAB (amoniobromuro de N-n-hexadecil-N,N-dihidroxietilo), polibreno, poli(etilenimina) (PEI) y similares. (Véase, por ejemplo, Banerjee et al., Med. Chem. 42: 4292-99 (1999); Godbey y col., Gene Ther. 6:1380-88 (1999); Kichler et al., Gene Ther. 5:855-60 (1998); Birchaa et al., J. Pharm. 183:195-207 (1999)).

Los métodos conocidos en la técnica para la administración terapéutica de agentes tales como proteínas y/o ácidos nucleicos pueden usarse para la administración de un polipéptido o ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante a un sujeto, por ejemplo, transfección celular, terapia génica, tratamiento directo. administración con un vehículo de administración o portador farmacéuticamente aceptable, administración indirecta proporcionando células recombinantes que comprenden un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de fusión de direccionamiento de la invención.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar directamente polipéptidos terapéuticos tales como una proteína de MIS humana recombinante y/o un ácido nucleico que codifica para una proteína de MIS humana recombinante tal como se da a conocer en el presente documento, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto y la endocitosis mediada por receptores (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción pueden ser enterales o parenterales e incluyen, pero sin limitarse a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, pulmonar, intranasal, intraocular, epidural y oral. Los agentes pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, por absorción a través de mucosas epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo el implante de una forma porosa, material no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialasticas, fibras o sustitutos comerciales de la piel.

En otra realización, el agente activo puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249:1527-1533). En aún otra realización, el agente activo puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer (1990) citado anteriormente). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos (véase Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105).

Por tanto, se conoce en la técnica una amplia variedad de vectores y constructos de transferencia génica/terapia génica. Estos vectores se adaptan fácilmente para su uso en los métodos de la presente invención. Mediante la manipulación apropiada usando técnicas de ADN recombinante/biología molecular para insertar una proteína de MIS humana recombinante unida operativamente que codifica para un segmento de ácido nucleico en el vector de expresión/administración seleccionado, pueden generarse muchos vectores equivalentes para la práctica de los métodos descritos en el presente documento.

Los expertos apreciarán que los genes clonados pueden manipularse fácilmente para alterar la secuencia de aminoácidos de una proteína. El gen clonado para la proteína de MIS humana recombinante puede manipularse mediante una variedad de técnicas bien conocidas para mutagénesis in vitro, entre otras, para producir variantes de la proteína humana que se produce de manera natural, denominadas en el presente documento muteínas o variantes o mutantes de una proteína de MIS humana recombinante, que pueden usarse según los métodos y composiciones descritos en el presente documento.

La variación en la estructura primaria de las muteínas de una proteína de MIS humana recombinante útil en la invención, por ejemplo, puede incluir deleciones, adiciones y sustituciones. Las sustituciones pueden ser conservativas o no conservativas. Las diferencias entre la proteína natural y la muteína conservan generalmente las propiedades deseadas, mitigan o eliminan propiedades no deseadas y añaden propiedades deseadas o nuevas. Remington's Pharmaceutical sciences Ed. Alemania, Merk Publishing, Easton, PA, 1995 da a conocer diversos portadores usados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y: ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles; tal propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes de tamponamiento tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; agua; solución salina isotónica; solución de Ringer, disoluciones de tampón alcohol etílico y fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos como laurilsulfato de sodio y sulfato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, también pueden estar presentes conservantes y antioxidantes en la composición, según el juicio del formulador.

Kits

En el presente documento se describen un kit o envases farmacéuticos que comprenden una proteína de MIS humana recombinante o una variante funcional o un fragmento funcional o proteína de fusión de la misma para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativos, por ejemplo, cáncer o enfermedad por exceso de andrógenos tal como se da a conocer en el presente documento. El kit descrito en el presente documento puede comprender una composición de proteína de MIS humana recombinante en forma de, por ejemplo, comprimidos, cápsulas o polvos liofilizados, y puede incluir opcionalmente instrucciones para usar una proteína de MIS humana recombinante para el tratamiento de cáncer o enfermedad asociada con dependencia de andrógenos. Puede proporcionarse una composición que comprende una proteína de MIS humana recombinante o una variante funcional o un fragmento funcional o proteína de fusión de la misma en los kits o envases en un frasco u otra forma apropiada (por ejemplo, un envase tipo blíster). Opcionalmente, los kits o envases farmacéuticos descritos en el presente documento también pueden incluir otros agentes farmacéuticamente activos (véase, por ejemplo, los agentes enumerados anteriormente, tal como otros agentes usados para el tratamiento de enfermedades y trastornos autoinmunitarios) y/o materiales usados en la administración del/de los fármaco(s), tales como diluyentes, agujas, jeringas, aplicadores y similares.

Diversas realizaciones de la divulgación también podrían incluir permutaciones de los diversos elementos enumerados en las reivindicaciones como si cada reivindicación dependiente fuera una reivindicación dependiente múltiple que incorpora las limitaciones de cada una de las reivindicaciones dependientes anteriores así como las reivindicaciones independientes. Tales permutaciones están expresamente dentro del alcance de esta divulgación. Cada una de las solicitudes y patentes citadas en este texto, así como cada documento o referencia citada en cada una de las solicitudes y patentes (incluso durante la tramitación de cada patente expedida; “documentos de solicitud citados”), y cada uno de los PCT y solicitudes o patentes extranjeras correspondientes y/o que reivindiquen la prioridad de cualquiera de estas solicitudes y patentes, y cada uno de los documentos citados o referenciados en cada uno de los documentos de solicitud citados, podrán emplearse en la práctica de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Constructos y clonación de plásmidos.

WT-MIS: vector pBG311 con secuencia genómica de MIS. El vector se construyó tal como se describió previamente (Cate et al, 1986). En resumen, la secuencia genómica de MIS humana se subclonó en un vector de expresión pBG311 de chMIS33 que se aisló de una biblioteca de cósmidos humanos usando una sonda de ADNc bovino (Cate et al. 1986).

RF-MIS: vectores pcDNA 3.1 y pAA V-IRES-NEO que contienen ADNc de MIS con secuencia líder de MIS nativa, sitio de escisión modificado y etiqueta flag. La secuencia codificante de MIS, presente en un vector pcDNA3.1 que contiene una secuencia de ADNc de MIS humana de longitud completa marcada con FLAG descrita previamente (Papakostas et al, 2010) se subclonó en un vector de expresión pAAV-IRES-Neo en un sitio ECORV. Esta secuencia codificante contiene un epítopo de FLAG insertado después de un sitio de escisión modificado en la posición 428 (RARR/S) (SEQ ID NO: 27) (Papakostas et al, 2010).

LR-MIS: vector pcDNA 3.1 que contiene ADNc de MIS con secuencia líder de albúmina sérica humana y sitio de escisión modificado. El vector pcDNA3.1 que contiene una secuencia de ADNc de MIS humana de longitud completa que contiene un sitio de escisión modificado, tal como se describió previamente (Papakostas et al, 2010) se usó para incorporar la secuencia líder de albúmina. El líder de albúmina se clonó en el lugar del líder de MIS usando un cebador directo que contiene un sitio EcoRV: CGAGATAC ATGAAGTGGGT GAGCTTCATCAGC CTGCTGTTCCTGTTCAGCAGC GCTTA CTCCCGCGGTGTGTTCCGGCGCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTG (SEQ ID NO: 11) (con el ácido nucleico que codifica para la secuencia líder resaltada en negrita) y un cebador inverso en la posición 451-432 de MIS GCTCCTGGAACCTCAGCGAG (SEQ ID NO: 12).

LRF-MIS: vector pcDNA 3.1 que contiene ADNc de MIS con secuencia líder de albúmina sérica humana, sitio de escisión modificado y etiqueta Flag. El vector pcDNA3.1 que contiene una secuencia de ADNc de MIS humana de longitud completa que contiene un sitio de escisión modificado y una etiqueta flag, tal como se describió previamente (Papakostas et al, 2010) se usó para incorporar la secuencia líder de albúmina tal como se describió anteriormente. Transfecciones y clonación:

MIS de tipo natural (WT-MIS). El constructo WT-MIS (pBG311) junto con pSV2DHFR se transfectó previamente en células DHFR-CHO y se seleccionó el clon B9 como el de mayor expresión tal como se describió previamente (Cate et al, 1986).

RARR/S-Flag MIS (RF-MIS) (“RARR/S" dada a conocer como SEQ ID NO: 27): El constructo RF-MIS (en pAAV-IRES-NEO) se transfectó en células CHO-S usando Fugene 6 (Roche) según el protocolo del fabricante y el clon de expresión estable CHO93 se seleccionó con una selección de Geneticin (550 ug/ml) como el de mayor expresión determinado mediante inmunotransferencia de tipo Western.

LR-MIS. El constructo LR-MIS (en pcDNA3.1) se transfectó en células CHO-K1 usando Lipofectamine 2000 (invitrogen), según el protocolo del fabricante. Los clones se seleccionaron en 800 ug/ml de Geneticin, y se eligieron los de mayor expresión determinados mediante inmunotransferencia de tipo Western (LR8, 11 y 22) para estudios adicionales.

LRF-MIS. El constructo LRF-MIS (en pcDNA3.1) se transfectó en células CHO-K1 usando Lipofectamine 2000 (invitrogen), según el protocolo del fabricante. Los clones se seleccionaron en 800 ug/ml de Geneticin (G418), y se eligieron los de mayor expresión determinados mediante inmunotransferencia de tipo Western (LRF8, 18 y 22) para estudios adicionales.

Medios y condiciones de cultivo:

Clon B9. B9 se hace crecer en frascos de rodillos (1700 cm2) con 250 ml de alfa MEM complementado con suero de ternero fetal femenino al 5% (FFCS) (Biologos), metotrexato 0,24 pM, glutamina 2 nM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ug/ml (Invitrogen) mantenidos confluentes durante varios meses en el 5% de CO², a 37°C, mientras que los medios se recogen cada 3-4 días. Los medios son evaluados mediante inmunotransferencia de tipo Western y MIS ELISA para monitorizar y medir la producción.

Clon CHO93. CHO93 se hace crecer en frascos de rodillos (1700 cm2) con 250 ml de DMEM:F12 complementado con FFCS al 10%, 550 ug/ml de Geneticin, glutamina 2 nM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ug/ml (Invitrogen) se mantuvo confluente durante varios meses en el 5% de CO², a 37°C mientras se recoge el medio cada 3-4 días. Los medios son evaluados mediante inmunotransferencia de tipo Western y MIS ELISA para monitorizar y medir la producción.

Clones LR8, 11, 22 y LRF8, 18, 22. Ambos clones LR y LRF se hacen crecer en frascos de rodillos (1700 cm2) con 250 ml de DMEM complementado con FFCS al 10%, 800 ug/ml de Geneticin, glutamina 2 nM, penicilina 100 U/ml y 100 ug/ml de estreptomicina (Invitrogen) mantenidos confluentes durante varios meses en el 5% de CO², a 37°C mientras se recoge el medio cada 7 días. Los medios son evaluados mediante inmunotransferencia de tipo Western y MIS ELISA para monitorizar y medir la producción.

Purificación de MIS.

Purificación usando perlas anti-Flag de inmunoafinidad. RF-MIS y LRF-MIS, que contienen una etiqueta flag, se aíslan de medios que contienen suero recogidos de frascos de rodillos de clones que se expresan de manera estable de CHO (CHO93, LRF8, LRF18, LRF22) tal como se describió anteriormente. Se centrifugan los medios recogidos para descartar las células muertas y se recoge el sobrenadante en recipientes de 500 ml y se almacena a -20°C hasta la purificación. Para la purificación, se descongela el medio a 4°C durante la noche y luego se incuba con perlas de agarosa anti-FLAG (SIGMA, 500 pl perlas empaquetadas/500 ml de medio), mezclando con rotación durante la noche a 4°C. Posteriormente, se precipitan las perlas a 13000 rpm, durante 10 segundos y se lavan extensamente (7X) con solución salina tamponada con Tris 1x fría (TBS) (SIGMA). Se mantienen todos los reactivos en hielo. Se eluyen RF-MIS y LRF-MIS con 50 pg de péptido 3X FLAG (SIGMA)/500 pl de perlas en IX TBS a 25°C durante 45 minutos con rotación. Se centrifugan las perlas a 13000 rpm durante 10 segundos a temperatura ambiente y se recoge el sobrenadante que contiene el FLAG MIS, se divide en alícuotas y se almacena en tubos Eppendorf de baja unión a proteínas (VWR) a -80°C para uso posterior.

Purificación usando una columna de inmunoafinidad anti-MIS 6E11.

Se produjo la columna de anticuerpo monoclonal 6E11 contra MIS tal como se describió previamente (Ragin et al, 1992). En resumen, se construyó una columna de inmunoafinidad de 5 ml usando aproximadamente 50 mg de proteína A-Sepharose (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) - anticuerpo monoclonal anti-rhMIS humano de ratón purificado, tal como se describió previamente. [Ragin 1992, Hudson 1990], unido covalentemente a 5 ml de resina de agarosa Affigel-10 empaquetada (Biorad Laboratories, Richmont, CA) según las instrucciones del fabricante (aproximadamente el 80% de eficacia de acoplamiento). Se bloqueó la columna con etonalamina y se equilibró con 50 ml de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazintanosulfónico (Hepes) 20 mM, pH 7,4 y se cargaron 200 ml de medio acondicionado concentrado (10X, libre de suero) a 1 vol. de columna/h a 4°C. Después de cargar, se lavó la columna con 10 volúmenes de columna de Hepes 20 mM, pH 7,4. Una etapa de preelución empleó 1 volumen de columna que contenía NaCl 0,5 M en Hepes 20 mM, pH 7,4. La elución de rhMIS unido se logró usando ácido acético 1 M en Hepes 20 mM, pH 3,0. La mayoría de rhMIS se eluyó en una fracción de 2-5 ml, después de la fracción de volumen inicial de 2 ml. Se neutralizó inmediatamente la rhMIS eluida con NaOH a un pH entre 7,0 y 7,4. Se dializaron las fracciones eluidas con ácido durante la noche frente a Hepes 0,02 M, pH 7,4. Se analizó la rhMIS resultante para determinar la proteína total mediante el método de Bradford (Bradford, 1976) y las concentraciones de rhMIS mediante un inmunoensayo ligado a enzimas (Hudson 1990) y se examinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (Weber 1969), análisis de inmunotransferencia de tipo Western (Towbin 1979), en bioensayos de regresión del conducto de Müller in vitro y ensayos antiproliferativos de tumores (Chin 1991).

Electroforesis e inmunotransferencia de tipo Western

Se redujeron las muestras con ditiotreitol 100 mM en tampón de Laemmli 1x (Tris 0,0625 mM pH 6,8, disolución madre de SDS al 2% (p/v), glicerol al 10% (v/v), azul de bromofenol al 0,002% (p/v)) y se desnaturalizaron por calor en un dispositivo Thermoblock a 70°C durante 10 min. Se procesaron las muestras en un “mini” gel Tris-Bis NuPage Novex al 4-12% (Invitrogen) a 130 V con tampón de transferencia IX MES (Invitrogen). Se tiñeron los geles con tinción de Coomassie (azul brillante R-250 al 0,3%, metanol al 45%, ácido acético al 10% en H²O) durante 15 min a temperatura ambiente con agitación. Posteriormente, se agitaron durante la noche a temperatura ambiente en disolución decolorante (metanol al 20%, ácido acético al 10% en H²O) con agitación.

Para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western, se transfirieron los geles a membranas de PVDF (Millipore), previamente equilibradas en tampón de transferencia 1x NuPage (Invitrogen) que contenía metanol al 12% (v/v), a 25 V durante 45 min y a 35 V durante otros 45 min. Se bloquearon las membranas con 1x PBS, Tween-20 al 0,1% que contenía leche en polvo desnatada al 5% durante 30 minutos a temperatura ambiente y se sondaron con anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2 de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (SIGMA) (1:1000), anticuerpo contra el extremo c-terminal anti-MIS de cabra C20 (Santa Cruz) (1:200) o anticuerpo anti-MIS contra el extremo n-terminal de MIS de conejo MGH4 (personalizado) (1:1000). Se lavaron los carriles dos veces durante 5 min cada uno a temperatura ambiente con 1x PBS, Tween-20 al 0,1% y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado si fuera necesario y se lavaron tres veces (5 min). Se visualizaron las bandas de proteínas con el sistema de detección del kit ECL (Perkin-Elmer) sobre una película Kodak Biomax MR.

Animales y cultivos de órganos:

Se realizó el bioensayo de cultivo de órganos convencional para la sustancia inhibidora muleriana (MIS) tal como se describió anteriormente (Donahoe, 1977). En resumen, se disecaron las crestas urogenitales de hembras de ratas preñadas programadas en E14.5 (Harlan) y se cultivaron en rejillas de acero inoxidable recubiertas de agar montadas sobre medio enriquecido de Cambridge Medical Research Laboratories (CMRL) 1066 (Life Technologies) complementado con FFCS al 10% (para evitar un efecto de MIS bovina en suero masculino), penicilina/estreptomicina al 1%, L-glutamina al 1%, Fungizone al 1% (Invitrogen) y testosterona 1 nM (Sigma). Después de la incubación durante 72 horas en el 5% de CO²humidificado a 37°C, se fijaron las muestras en tampón Zamboni (disolución de formaldehído al 15% y ácido pícrico al 5%), se incrustaron en parafina y se tiñeron secciones de 8 um del extremo cefálico con hematoxilina y eosina. A continuación, dos observadores experimentados puntuaron las secciones de 0 (sin regresión) a 5 (regresión completa). Los cultivos se llevaron a cabo con RF-MIS, LRF-MIS o WT-MIS purificados a una concentración final de 5 |ig/ml, y a dosis más bajas de 3, 2 y 1 |ig/ml.

EJEMPLO 1

La purificación de la proteína de sustancia inhibidora muleriana (MIS) para determinar la eficacia preclínica (Pieretti-Vanmarcke et al. 2006), se ha realizado predominantemente a partir de medios acondicionados de células CHO transfectadas con un clon genómico (Cate et al. 1986). A continuación, se purificó el medio por inmunoafinidad (Ragin et al. 1992) usando un anticuerpo monoclonal de ratón (Hudson et al. 1990) o se purificó mediante cromatografía en serie (Lorenzo et al. 2002). Se detectó la actividad biológica en un ensayo de regresión del conducto de Müller en cultivo de órganos embrionarios (Donahoe et al. 1977) y se detectó la inmunoactividad mediante un ELISA (Hudson et al. 1990) usando anticuerpos monoclonales y policlonales producidos contra MIS humana. Las células CHO transfectadas se adaptaron posteriormente a condiciones libres de suero y cultivo en suspensión (MacLaughlin/Stafford/Dean, Donahoe no publicado), se seleccionaron de manera clonal, se modificaron a escala y se purificaron tal como anteriormente. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western confirmó una escisión del 25-30% para producir la fracción bioactiva del extremo C-terminal homodimerizado que se mantuvo en asociación no covalente con el extremo N-terminal homodimerizado, con escisión en el sitio de escisión primaria similar a Kex en los residuos de aminoácidos 426-427 y escisión secundaria en las posiciones de aminoácidos 229 230. Las bandas en geles electroforéticos reducidos a 70, 55, 34, 24 y 12,5 kDa eran todos fragmentos MIS, tal como se determinó por la secuenciación de aminoácidos (Ragin et al. 1992; Lorenzo et al. 2002), y representativas de los productos de escisión de Kex y dibásicos predichos.

Para optimizar la escisión y el sitio de escisión primario en la posición del aminoácido 427, se mutagenizó la secuencia de reconocimiento para crear un sitio de escisión dibásico; la variante RAQR/R (SEQ ID NO: 28) era bioactiva (Kurian et al, 1994). Luego se mutagenizó la posición 425 (correspondiente al residuo de aminoácido 450 de SEQ ID NO: 1) para crear un sitio de escisión Kex más de consenso (Nachtigal & Ingraham 1996) (Hosaka et al.

1991), RARR/S (SEQ ID NO: 27), y se añadió una etiqueta Flag de 8 aminoácidos (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 8) justo en el sentido de 3' de la primera serina en el extremo C-terminal para ayudar en la detección y purificación. La expresión de esta variante resultó en una escisión mejorada y una bioactividad aumentada. En comparación, cuando la arginina C-terminal (Kurian et al 1994) fue seguida por Flag, la proteína producida por este constructo era bioinactiva (Papakostas et al 2010); por tanto, la serina pareció ser importante para la conservación de la bioactividad. Se transfectó el constructo Flag RARR/S (SEQ ID NO: 27) (Papakostas et al 2010) en células CHO y se confirmó la escisión mejorada y la conservación de la bioactividad (Papakostas et al, 2010). La modificación del sitio de escisión aumentó la escisión a más del 50-60% (Papakostas et al, 2010).

Para modificar a escala la expresión, se modificó adicionalmente el constructo con Flag MIS RARR/S (SEQ ID NO: 27) para sustituir la secuencia líder de MIS endógena por la de albúmina sérica humana (HSA). La HSA es la proteína más abundante en el plasma y el hígado la produce a una tasa muy alta para alcanzar una concentración en sangre que oscila entre 3,4 y 5,4 g/dl (Farrugia 2010). La producción y procesamiento de HSA se ajusta con precisión para permitir una maduración y secreción eficientes de la proteína. La HSA, tal como la MIS, se sintetiza como una preproproteína, que contiene una secuencia líder que se escinde posteriormente durante la maduración. Esta secuencia líder de HSA consta de solo 24 AA, no es inmunogénica en seres humanos y se elimina durante el procesamiento de proteínas. En este caso, los inventores demuestran que la sustitución de la secuencia líder de MIS por la de HSA aumenta la producción e inesperadamente, la escisión, lo que se correlaciona con el aumento de la potencia del producto de MIS humano recombinante.

EJEMPLO 2

Los esfuerzos previos para aumentar a escala la producción de MIS recombinante humana llevaron a desarrollar un nuevo constructo que presenta el ADNc de hMIS con un sitio de escisión modificado en la posición 427/428 insertado en pcDNA3.1 (Papakostas et al, 2010). Sustituyendo el RARR/S modificado (SEQ ⁱD NO: 27) por el RAQR/S endógeno (SEQ ID NO: 26) (indicado como R en los constructos), e insertando una etiqueta Flag inmediatamente en el sentido 3' del sitio de escisión (indicado como F en el constructo) (tabla 1) (figura 1), los inventores demostraron una mayor escisión del extremo C-terminal etiquetado (Papakostas et al, 2010). Además, la proteína recombinante RARR/S-Flag MIS (“RARR/S” dado a conocer como SEQ ID NO: 27) (denominada en el presente documento “RF-MIS”) retuvo la bioactividad en el ensayo de cresta urogenital fetal de rata (Papakostas et al, 2010). Para superar los bajos rendimientos de expresión, se cambió el vector de la estructura principal de RF-MIS a pAAV-IRES-Neo, y se clonó en células CHO-S y se cribó bajo una alta concentración de Geneticin. El vector de expresión resultante es policistrónico e incluye un sitio de entrada ribosómico interno (IRES) que impulsa la expresión del casete de resistencia a neomicina en el sentido de 3' de MIS, lo que permite una mejor selección de expresores altos. El clon de mayor expresión, CHO93, se aumentó a escala posteriormente para la producción usando frascos de rodillos y se purificó la RF-MIS recombinante utilizando perlas de inmunoafinidad anti-flag M2 (tabla 2). Sin embargo, aunque RF-MIS ha aumentado la escisión del extremo C-terminal activo y, lo que es más importante, menos escisión críptica interna (figura 2) (figura 3), el rendimiento y la producción del clon de ADNc CHO93 (0,16 pg/célula/día) sigue siendo mucho menor que el del clon genómico B9 (10,59 pg/célula/día) (tabla 3), aunque no está claro si esto se debe al vector de expresión, las células CHO, la naturaleza de la selección del fármaco o el tipo de mensaje producido (ADNc frente a MIS genómica).

Para mejorar la producción, el constructo original R-MIS y RF-MIS en los vectores pcDNA3.1 se modificaron sustituyendo los 24 AA de la secuencia líder de HSA (pre-pro péptido) (en el presente documento indicada como L en los constructos) por el líder de MIS de 25 AA para crear los constructos “LR” y “LRF” (tabla 1) (figura 1).

Tabla 1: lista de modificaciones a la secuencia de tipo natural de MIS y nomenclatura correspondiente.

Se ha demostrado que la fusión de la secuencia líder de HSA aumenta la producción de interleucinas recombinantes (Carter et al, 2010) y TNF-alfa (Maeda Y et al 1997), y se ha sugerido como una forma de producir proteínas que de otro modo serían difíciles de expresar y modificar a escala. Además, se sabe que la HSA también mejora la secreción de proteínas fusionadas tales como la lisozima humana en el sistema de expresión de levadura con Pichia pastoris (Xiong et al, 2008). Se seleccionaron los tres clones de mayor expresión estable en CHOK1 para un análisis adicional: LR8/11/18 y LRF8/18/22 (figura 2). Tanto la eficacia de la clonación como los niveles de expresión fueron mayores para los clones LR que para los clones LRF, lo que sugiere que la etiqueta Flag puede hacer que la expresión sea menos eficaz. De manera similar a CHO93, todos los clones LR y LRF tienen fragmentos peptídicos reducidos que resultan de la escisión críptica interna en la posición 229, en comparación con la proteína de tipo natural (WT-MIS) producida por B9. Inesperadamente, también parecen tener una mayor proporción de extremo C-terminal escindido (figuras 2 y 3). Esta escisión aumentada podría explicarse por las fuertes presiones evolutivas sobre el líder de albúmina para el procesamiento eficiente en la red trans-Golgi y el transporte a vesículas secretoras, ya que la albúmina se secreta de manera endógena a una tasa mucho mayor que la MIS (Rothschild et al. 1988). Se eligió LRF18 para la caracterización ya que es el clon de LRF de mayor expresión y puede purificarse y rastrearse usando la etiqueta Flag (tabla 2).

Tabla 2: lista de constructos y clones de líneas celulares que producen MIS y métodos de purificación correspondientes.

Cuando se cultiva durante 24 horas en matraces, la concentración de MIS, detectada por ELISA, es mayor en el medio de B9 (WT-MIS) (15 pg/ml) que en el medio de los clones (LR8: 3,04 pg/ml); LR11: 11,66 pg/ml; LR22: 6,28 pg/ml) (tabla 3). El clon de mayor producción de LR, LR11 secreta 3,24 pg/célula/día de MIS, mientras que el clon B9 de WT produce 10,58 pg/célula/día, sin embargo, las células LR11 crecen de forma mucho más compacta, por el contrario, el clon de mayor expresión de LRF, LRF18 tiene una concentración mayor (1,1 pg/ml) y una producción mayor (0,26 pg/célula/día) que RF-MIS (CHO93) con (0,67 pg/ml) y (0,15 pg/célula/día) (tabla 3). Por tanto, la adición del líder de HSA aumenta la producción del producto de MIS etiquetado con flag pero no el producto sin etiquetar. Sin embargo, como los constructos etiquetados con flag claramente no producen tanto como los no etiquetados, la etiqueta flag puede estar interfiriendo con la estabilidad o expresión de la proteína. Las tinciones de Coomassie y la inmunotransferencia de tipo Western muestran que el producto purificado a partir de LRF18 mediante purificación por inmunoafinidad anti-flag tiene menos bandas representativas de la escisión interna (Ragin 1992) que la MIS purificada a partir de WT-MIS (B9) usando purificación por afinidad anti-MIS (figura 3).

Tabla 3: rendimiento de purificación de MIS de diversos constructos.

Dado que se ha demostrado previamente que el extremo C-terminal de MIS es el resto activo (Pepinski 1988, Maclaughlin et al 1992), el aumento de la escisión debería correlacionarse con una mayor bioactividad en el ensayo de UGR de rata. En este caso, los inventores demuestran que LRF-MIS puede hacer retroceder completamente el conducto de Müller a 5 pg/ml (35 pM) y mostrar una mayor actividad que RF-MIS y WT-MIS a estas concentraciones, que solo muestran regresión parcial (figura 4). Además, LRF-MIS continúa mostrando regresión completa incluso a dosis más bajas, hasta 2 pg/ml, una dosis en la que WT-MIS ya no muestra ninguna actividad (datos no mostrados). Por consiguiente, la presencia de la secuencia líder (L) en la proteína de MIS humana recombinante LRF-MIS da como resultado una disminución dependiente de la dosis de la regresión de los conductos de Müller, en comparación con el constructo RF-MIS, lo que indica que este constructo tiene una mayor potencia y es más activo que el constructo RF-MIS.

Tomados en conjunto, los inventores demuestran en el presente documento que el producto LR da como resultado un mayor rendimiento de producción con una mayor escisión y una mayor bioactividad o potencia.

Por consiguiente, los inventores demuestran que la secuencia líder de HSA dio como resultado sorprendentemente un rendimiento aumentado (tanto mayor concentración como mayor producción) de la proteína de MIS humana recombinante (véanse las figuras 2 y 3). Además, la presencia de la secuencia líder de HSA también dio como resultado un aumento inesperado en la escisión del sitio de escisión primario (correspondiente a la escisión en 451/452 de SEQ ID NO: 1 (o 426/427 de la nomenclatura de aminoácidos convencional de la proteína de MIS humana de tipo natural) (véanse las figuras 2 y 3). Este rendimiento aumentado y escisión aumentada fueron sorprendentes porque con un rendimiento aumentado (y, por tanto, más proteína producida por la célula), uno esperaría una disminución de escisión a medida que la actividad de las enzimas de escisión disponibles se satura y se extiende demasiado, sin embargo, este no fue el caso, de hecho ocurrió exactamente lo contrario cuando con una producción aumentada de proteínas hubo un aumento de la escisión desde el sitio de escisión primaria.

Esto es particularmente inesperado ya que no se esperaba que el efecto de la secuencia líder, que no se encuentra en ningún lugar cerca del sitio de escisión del sitio de escisión primario de MIS, tuviera un efecto sobre el aumento de escisión, ya que la secuencia líder se escinde normalmente primero antes de la escisión postraducción de la proproteína de m Is .

Además, la secuencia líder también dio como resultado una menor escisión del sitio de escisión secundario (ubicado entre los residuos de aminoácidos 229/230 de la numeración de MIS de tipo natural normal o correspondiente a los residuos 254/255 de la SEQ ID NO: 1). Esto también es sorprendente, considerando que no hubo modificación en el sitio de escisión secundario.

Además, la presencia de la secuencia líder también aumentó la producción y el rendimiento incluso cuando está presente una etiqueta FLAG en la proteína de MIS humana recombinante. (La etiqueta FLAG disminuye significativamente el rendimiento tal como se muestra en la tabla 3). De nuevo, esto fue un descubrimiento sorprendente, ya que la secuencia líder no está ubicada en ninguna parte cerca de la etiqueta FLAG y no se esperaría que una modificación de este tipo de la secuencia líder aumentara el rendimiento de producción de una proteína que comprende una etiqueta FLAG.

Ejemplo 3

Se hace crecer LR11 en matraces de 5 capas con 250 ml de DMEM o en matraces de 10 capas (1700 cm2) con 500 ml de medio complementado con FFCS al 10%, 800 ug/ml de Geneticin, glutamina 2 nM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 ug/ml (Invitrogen) mantenidos confluentes durante varios meses en el 5% de CO², a 37°C. Una vez a la semana, el medio se reemplaza por un medio sin suero que omite FFCS y lo reemplaza con complementos de aminoácidos no esenciales (NEAA) e ITS (insulina, transferrina, selenio) durante 72 h. Luego se concentra el medio 10 veces usando membranas de ósmosis de flujo tangencial. Usando estos métodos, se concentran medios de 4-5 ug/ml a 25-50 ug/ml, y el rendimiento de purificación eficaz de LR-MIS se eleva a aproximadamente el 30%. Tabla 4: rendimiento de purificación de MIS de diversos constructos usando un nuevo protocolo de purificación en medio libre de suero.

Bibliografía

Cate, R.L. et al., 1986. Development of mullerian inhibiting substance as an anti-cancer drug. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology, 51 parte 1, págs. 641-647.

Donahoe, P.K., Ito, Y. & Hendren, W.H., 3a, 1977. A graded organ culture assay for the detection of Mullerian inhibiting substance. The Journal of surgical research, 23(2), págs. 141-148.

Farrugia, A., 2010. Albumin usage in clinical medicine: tradition or therapeutic? Transfusion medicine reviews, 24(1), págs. 53-63.

Hosaka, M. et al., 1991. Arg-X-Lys/Arg-Arg motif as a signal for precursor cleavage catalyzed by furin within the constitutive secretory pathway. Journal of Biological Chemistry, 266(19), págs.12127-12130. Disponible en:

[consultado el 21 de febrero de 2013].

Hudson, P.L. et al., 1990. An immunoassay to detect human mullerian inhibiting substance in males and females during normal development. The Journal of clinical endocrinology and metabolism, 70(1), págs.16-22.

Lorenzo, H.K. et al., 2002. New approaches for high-yield purification of Mullerian inhibiting substance improve its bioactivity. Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 766(1), págs.

89-98.

Nachtigal, M.W. & Ingraham, H.A., 1996. Bioactivation of Mullerian inhibiting substance during gonadal development by a kex2/subtilisin-like endoprotease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93(15), págs. 7711-7716.

Pieretti-Vanmarcke, R. et al., 2006. Recombinant human Mullerian inhibiting substance inhibits long-term growth of MIS type II receptor-directed transgenic mouse ovarian cancers in vivo. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 12(5), págs. 1593-1598.

Ragin, R.C. et al., 1992. Human mullerian inhibiting substance: enhanced purification imparts biochemical stability and restores antiproliferative effects. Protein expression and purification, 3(3), págs. 236-245.

Rothschild, M.A., Oratz, M. & Schreiber, S.S., 1988. Serum albumin. Hepatology (Baltimore, Md.), 8(2), págs. 385 401.

Papakostos, T.D. et al.,Development of an efficenty cleaved, bioactive, highly pure FLAG-tagged recombinant human Mullerian Inhibiting Substance. Protein Expression and Purification, 2010; 70;32-38.

Lista de secuencias:

SEQ ID NO: 1 MIS (560 AA) - secuencia de aminoácidos (el subrayado identifica secuencia líder de MIS nativa)

mrdlpltsla lvlsalqall qtealraeep avgtsglifr edldwppgsp qeplclvalg

gdsngssspl rvvgalsaye qaflgavqra rwgprdlatf gvcntgdrqa alpslrrlga

wlrdpggqrl vvlhleevtw eptpslrfqe pppggagppe lallvlypgp gpevtvtrag

lpgaqslcps rdtrylvlav drpagawrgs glaltlqprg edsrlstarl qallfgddhr

cftrmtpall llprsepapl pahgqldtvp fppprpsael eesppsadpf letltrlvra

lrvpparasa prlaldpdal agfpqglvnl sdpaalerll dgeeplllll rptaattgdp

aplhdptsap watalarrva aelqaaaael rslpglppat apllarllal cpggpgglgd

plrallllka lqglrvewrg rdprgpgraqr rsagataadg pcalrelsvd lraersvlip

etyqanncqg vcgwpqsdrn prygnhvvll lkmqvrgaal arppccvpta yagkllisls

eerisahhvp nmvatecgcr

SEQ ID NO: 2 LR (559 AA) la NEGRITA indica la secuencia líder de albúmina; El subrayado identifica el sitio de escisión modificado

mkwvtfisll flfssaysrg vfrr raeep avgtsglifr edldwppgsp qeplclvalg

gdsngssspl rvvgalsaye qaflgavqra rwgprdlatf gvcntgdrqa alpslrrlga

wlrdpggqrl vvlhleevtw eptpslrfqe pppggagppe lallvlypgp gpevtvtrag

lpgaqslcps rdtrylvlav drpagawrgs glaltlqprg edsrlstarl qallfgddhr

cftrmtpall llprsepapl pahgqldtvp fppprpsael eesppsadpf letltrlvra

lrvpparasa prlaldpdal agfpqglvnl sdpaalerll dgeeplllll rptaattgdp

aplhdptsap watalarrva aelqaaaael rslpglppat apllarllal cpggpgglgd

plrallllka lqglrvewrg rdprgpgraR rsagataadg pcalrelsvd lraersvlip

etyqanncqg vcgwpqsdrn prygnhvvll lkmqvrgaal arppccvpta yagkllisls

eerisahhvp nmvatecgcr

SEQ ID NO: 3 LRF (567AA) la cursiva indica la etiqueta Flag (DYKDDDDK (SEQ ID NO: 8))

mkwvtfisll flfssaysrg vfrr raeep avgtsglifr edldwppgsp qeplclvalg

gdsngssspl rvvgalsaye qaflgavqra rwgprdlatf gvcntgdrqa alpslrrlga

wlrdpggqrl vvlhleevtw eptpslrfqe pppggagppe lallvlypgp gpevtvtrag

lpgaqslcps rdtrylvlav drpagawrgs glaltlqprg edsrlstarl qallfgddhr

cftrmtpall llprsepapl pahgqldtvp fppprpsael eesppsadpf letltrlvra

lrvpparasa prlaldpdal agfpqglvnl sdpaalerll dgeeplllll rptaattgdp

aplhdptsap watalarrva aelqaaaael rslpglppat apllarllal cpggpgglgd

plrallllka lqglrvewrg rdprgpgraR rsDYKDDDDK agataadg pcalrelsvd

lraersvlip etyqanncqg vcgwpqsdrn prygnhvvll lkmqvrgaal arppccvpta

yagkllisls eerisahhvp nmvatecgcr

SEQ ID NO: 4 LR - secuencia de ácido nucleico

ATGAAGTGGGTGAGCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCTTACTCCCGCGGTGTGTTCCGC CGCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAAGACTTGGACTGGCCTCCA GGCAGCCCACAAGAGCCTCTGTGCCTGGTGGCACTGGGCGGGGACAGCAATGGCAGCAGCTCCCCCCTG CGGGTGGTGGGGGCTCTAAGCGCCTATGAGCAGGCCTTCCTGGGGGCCGTGCAGAGGGCCCGCTGGGGC CCCCGAGACCTGGCCACCTTCGGGGTCTGCAACACCGGTGACAGGCAGGCTGCCTTGCCCTCTCTACGG CGGCTGGGGGCCTGGCTGCGGGACCCTGGGGGGCAGCGCCTGGTGGTCCTACACCTGGAGGAAGTGACC TGGGAGCCAACACCCTCGCTGAGGTTCCAGGAGCCCCCGCCTGGAGGAGCTGGCCCCCCAGAGCTGGCG CTGCTGGTGCTGTACCCTGGGCCTGGCCCTGAGGTCACTGTGACGAGGGCTGGGCTGCCGGGTGCCCAG AGCCTCTGCCCCTCCCGAGACACCCGCTACCTGGTGTTAGCGGTGGACCGCCCTGCGGGGGCCTGGCGC GGCTCCGGGCTGGCCTTGACCCTGCAGCCCCGCGGAGAGGACTCCCGGCTGAGTACCGCCCGGCTGCAG GCACTGCTGTTCGGCGACGACCACCGCTGCTTCACACGGATGACCCCGGCCCTGCTCCTGCTGCCGCGG

TCCGAGCCCGCGCCGCTGCCTGCGCACGGCCAGCTGGACACCGTGCCCTTCCCGCCGCCCAGGCCATCC GCGGAACTCGAGGAGTCGCCACCCAGCGCAGACCCCTTCCTGGAGACGCTCACGCGCCTGGTGCGGGCG CTGCGGGTCCCCCCGGCCCGGGCCTCCGCGCCGCGCCTGGCCCTGGATCCGGACGCGCTGGCCGGCTTC CCGCAGGGCCTAGTCAACCTGTCGGACCCCGCGGCGCTGGAGCGCCTACTCGACGGCGAGGAGCCGCTG CTGCTGCTGCTGAGGCCCACTGCGGCCACCACCGGGGATCCTGCGCCCCTGCACGACCCCACGTCGGCG CCGTGGGCCACGGCCCTGGCGCGCCGCGTGGCTGCTGAACTGCAAGCGGCGGCTGCCGAGCTGCGAAGC CTCCCGGGTCTGCCTCCGGCCACAGCCCCGCTGCTGGCGCGCCTGCTCGCGCTCTGCCCAGGTGGCCCC GGCGGCCTCGGCGATCCCCTGCGAGCGCTGCTGCTCCTGAAGGCGCTGCAGGGCCTGCGCGTGGAGTGG CGCGGGCGGGATCCGCGCGGGCCGGGTCGGGCACGGCGCAGCGCGGGGGCCACCGCCGCCGACGGGCCG TGCGCGCTGCGCGAGCTCAGCGTAGACCTCCGCGCCGAGCGCTCCGTACTCATCCCCGAGACCTACCAG GCCAACAATTGCCAGGGCGTGTGCGGCTGGCCTCAGTCCGACCGCAACCCGCGCTACGGCAACCACGTG GTGCTGCTGCTGAAGATGCAGGCCCGTGGGGCCGCCCTGGCGCGCCCACCCTGCTGCGTGCCCACCGCC TACGCGGGCAAGCTGCTCATCAGCCTGTCGGAGGAGCGCATCAGCGCGCACCACGTGCCCAACATGGTG GCCACCGAGTGTGGCTGCCGGTGA

SEQ ID 5 LRF - secuencia de ácido nucleico

ATGAAGTGGGTGAGCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCTTACTCCCGCGGTGTGTTCCGC CGCAGAGCAGAGGAGCCAGCTGTGGGCACCAGTGGCCTCATCTTCCGAGAAGACTTGGACTGGCCTCCA GGCAGCCCACAAGAGCCTCTGTGCCTGGTGGCACTGGGCGGGGACAGCAATGGCAGCAGCTCCCCCCTG CGGGTGGTGGGGGCTCTAAGCGCCTATGAGCAGGCCTTCCTGGGGGCCGTGCAGAGGGCCCGCTGGGGC CCCCGAGACCTGGCCACCTTCGGGGTCTGCAACACCGGTGACAGGCAGGCTGCCTTGCCCTCTCTACGG CGGCTGGGGGCCTGGCTGCGGGACCCTGGGGGGCAGCGCCTGGTGGTCCTACACCTGGAGGAAGTGACC TGGGAGCCAACACCCTCGCTGAGGTTCCAGGAGCCCCCGCCTGGAGGAGCTGGCCCCCCAGAGCTGGCG CTGCTGGTGCTGTACCCTGGGCCTGGCCCTGAGGTCACTGTGACGAGGGCTGGGCTGCCGGGTGCCCAG AGCCTCTGCCCCTCCCGAGACACCCGCTACCTGGTGTTAGCGGTGGACCGCCCTGCGGGGGCCTGGCGC GGCTCCGGGCTGGCCTTGACCCTGCAGCCCCGCGGAGAGGACTCCCGGCTGAGTACCGCCCGGCTGCAG GCACTGCTGTTCGGCGACGACCACCGCTGCTTCACACGGATGACCCCGGCCCTGCTCCTGCTGCCGCGG TCCGAGCCCGCGCCGCTGCCTGCGCACGGCCAGCTGGACACCGTGCCCTTCCCGCCGCCCAGGCCATCC GCGGAACTCGAGGAGTCGCCACCCAGCGCAGACCCCTTCCTGGAGACGCTCACGCGCCTGGTGCGGGCG CTGCGGGTCCCCCCGGCCCGGGCCTCCGCGCCGCGCCTGGCCCTGGATCCGGACGCGCTGGCCGGCTTC CCGCAGGGCCTAGTCAACCTGTCGGACCCCGCGGCGCTGGAGCGCCTACTCGACGGCGAGGAGCCGCTG CTGCTGCTGCTGAGGCCCACTGCGGCCACCACCGGGGATCCTGCGCCCCTGCACGACCCCACGTCGGCG CCGTGGGCCACGGCCCTGGCGCGCCGCGTGGCTGCTGAACTGCAAGCGGCGGCTGCCGAGCTGCGAAGC CTCCCGGGTCTGCCTCCGGCCACAGCCCCGCTGCTGGCGCGCCTGCTCGCGCTCTGCCCAGGTGGCCCC GGCGGCCTCGGCGATCCCCTGCGAGCGCTGCTGCTCCTGAAGGCGCTGCAGGGCCTGCGCGTGGAGTGG CGCGGGCGGGATCCGCGCGGGCCGGGTCGGGCACGGCGCAGCgacfcacaaggafcgacgacgacaagGCG GGGGCCACCGCCGCCGACGGGCCGTGCGCGCTGCGCGAGCTCAGCGTAGACCTCCGCGCCGAGCGCTCC GTACTCATCCCCGAGACCTACCAGGCCAACAATTGCCAGGGCGTGTGCGGCTGGCCTCAGTCCGACCGC AACCCGCGCTACGGCAACCACGTGGTGCTGCTGCTGAAGATGCAGGCCCGTGGGGCCGCCCTGGCGCGC CCACCCTGCTGCGTGCCCACCGCCTACGCGGGCAAGCTGCTCATCAGCCTGTCGGAGGAGCGCATCAGC GCGCACCACGTGCCCAACATGGTGGCCACCGAGTGTGGCTGCCGGTGA

SEQ ID 6 Secuencia líder de HSA (secuencia de aminoácidos):

mkwvtfisll flfssaysrg vfrr

SEQ ID 7 - Secuencia líder de HSA (secuencia de ácido nucleico):

ATGAAGTGGGTGAGCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCTTACTCCCGCGGTGTGTTCCGC CGCAGAGCA

Claims

REIVINDICACIONES

i. Proteína recombinante de sustancia inhibidora muleriana (MIS) que comprende una combinación de una secuencia líder distinta de MIS en lugar de la secuencia líder de MIS de los aminoácidos 1-25 de SEQ ID NO: 1, y una modificación de residuo del aminoácido 450 de SEQ ID NO 1: para aumentar la escisión en comparación con la ausencia de dicha modificación, en la que el residuo de aminoácido 450 de SEQ ID NO: 1 se cambia de Q a R, en la que la proteína recombinante de MIS ha aumentado la escisión y ha aumentado el rendimiento de la producción in vitro en comparación con la proteína de MIS de tipo natural correspondiente a los residuos de aminoácido de SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia líder distinta de MIS se selecciona del grupo que consiste en: una secuencia líder de albúmina, un péptido señal de inmunoglobulina fusionado a un propéptido activador de plasminógeno de tipo tisular (IgSP-tPA), un péptido señal de inmunoglobulina murina (IgSP), una secuencia señal de MPIF-1 (MKVSVAALSCLMlVtALg SqA; SEQ ID NO: 15); una secuencia señal de estaniocalcina (MLQNSAVLLLLVISASA; SEQ ID NO:16); una secuencia señal de invertasa (MLLQAFLFLLAGFAAKISA; S^eQ ID NO:17); una secuencia señal del factor alfa de apareamiento de la levadura (secuencia líder de toxina mortal de K. lactis); una secuencia señal híbrida (MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLEKR; SEQ ID NO:18); una secuencia señal híbrida de HSA/MFa-1 (MKWVSFISLLFLFSSAYSRSLDKR; SEQ ID NO:19); una secuencia líder de fusión mortal de K. lactis/MFa-1 (MNIFYIFLFLLSFVQGSLDKR; SEQ ID NO:20); una secuencia señal de inmunoglobulina Ig (m Gw SCIILFLVATATGVHS; SEQ ID NO:21); una secuencia señal de precursor de fibulina B (MERAAPSRRVPLPLLLLGGLALLAAGVDA; SEQ ID NO:22); una secuencia señal del precursor de la clusterina (MMKTLLLFVGLLLTWESGQVLG; SEQ ID NO: 23); y la secuencia señal de la proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (MLPLCLVAALLLAAGPGPSLG; SEQ ID NO:24) o fragmentos funcionales de los mismos.
2. Proteína recombinante de MIS según la reivindicación 1, que comprende además una modificación del aminoácido 452 de SEQ ID NO: 1 de S a R para aumentar la escisión en comparación con la ausencia de una modificación de este tipo.
3. Proteína recombinante de MIS según la reivindicación 1, en la que la secuencia líder de albúmina es una secuencia líder de secuencia de albúmina humana (HSA) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
4. Proteína recombinante de MIS según la reivindicación 1 ó 2, que: comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento funcional de la misma; o que está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4.
5. Composición farmacéutica que comprende la proteína recombinante de MIS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un portador farmacéuticamente aceptable.
6. Polinucleótido que codifica para la proteína recombinante de MIS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Polinucleótido según la reivindicación 6, en el que el nucleótido tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4 o una secuencia con una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4.
8. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 7, en el que el vector es un vector viral o un vector de expresión.
9. Vector según la reivindicación 8, en el que el vector viral se selecciona del grupo que consiste en un vector adenoviral, un vector de poxvirus o un vector lentiviral.
10. Célula huésped que comprende el vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.
11. Proteína recombinante de MIS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con cáncer, que comprende administrar la proteína recombinante de MIS o un homodímero de MIS al sujeto.
12. Proteína recombinante de MIS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso según la reivindicación 11, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer del sistema nervioso, cáncer de hueso, cáncer de médula ósea, cáncer de cerebro, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de endometrio, cáncer gastrointestinal, cáncer de encía, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de nasofaringe, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de lengua, melanoma, melanoma ocular o cáncer de útero, o un cáncer que expresa la proteína del receptor II de MIS (MIS RII) o un cáncer resistente a quimioterápicos o multirresistente.
13. Método de producción de una proteína recombinante de MIS, que comprende la escisión de una secuencia señal de cualquiera de las proteínas recombinantes de MIS según las reivindicaciones 1-4.