BRPI0622293A2

BRPI0622293A2 - uso de inibidor de tecido de metaloproteinases (timp) ligado a fixações de glicosilfosfatidilinositol (gpi) para tratamento de cáncer

Info

Publication number: BRPI0622293A2
Application number: BRPI0622293-5A
Authority: BR
Inventors: Ralf Huss; Peter Jon Nelson
Original assignee: Peter Jon Nelson
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2012-07-03
Also published as: DE602006012864D1; CA2860269C; CA2622042C; ATE439383T1; CA2622042A1; CN101268102B; JP5645362B2; US20160271234A1; IL189924A; BRPI0616093A2; AU2006299179B2; ATE460432T1; ES2331252T3; DK1937725T3; DK1764372T3; US9255139B2; RU2008108940A; CA2860269A1; RU2428479C2; HK1112923A1

Abstract

USO DE INIBIDOR DE TECIDO DE METALOPROTEINASES (TIMP) LIGADO A FIXAçõES DE GLICOSILFOSFATIDILINOSITOL (GPI) PARA TRATAMENTO DE CáNCER A presente invenção refere-se a construções de fusão de inibidores de tecido fixados por glicosilfosfatidilinositol (GPI) de metaloproteinases (TIMPs) e seu uso para o tratamento de câncer e em medicinaregenerativa. Por essa abordagem, as proteínas TIMP fixado por GPI são incorporadas na membrana de superfície de células de tumor e tornam as células de tumor sensíveis a apoptose induzida por FAS. Além disso, as construções de fusão da presente invenção são agentes eficazes úteis em aplicações de cura de ferimento. Em uma modalidade, o TIMP é ligado á mucina seguido por GPI para aumentar a apresentação superficial. O uso de GPI para ligar TIMP torna a proteína de fusão resultante particularmente útil como agente anti-câncer para o tratamento de câncer, e, em particular, qualquer câncer residual após uma ressecção cirúrgica incompleta de tumores primários em um individuo.

Description

USO DE INIBIDOR DE TECIDO DE METALOPROTEINASES (TIMP) LIGADO A FIXAÇÕES DE GLICOSILFOSFATIDILINOSITOL (GPI) PARA

TRATAMENTO DE CÂNCER

Dividido do PI 0616093-0 depositado em 20/09/2006.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de construções de fusão e seu uso para o tratamento de câncer e em medicina regenerativa. Especificamente, a invenção refere-se a construções compreendendo inibidores de tecido fixados em glicosilfosfatidilinositol (GPI) de metaloproteinases (TIMPs). Adicionalmente, as construções de fusão da presente invenção são agentes regenerativos eficazes úteis no campo de aplicações de cura de ferimento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

TIMPs em pesquisa de câncer

O tratamento de câncer permanece uma tarefa exigente e emprega diferentes abordagens terapêuticas e estratégias, oferecendo graus variáveis de sucesso. Uma abordagem conhecida é aumentar a sensibilidade de células de câncer a Iise imune-mediada. A sensibilidade de tumores à lise imune-mediada foi ligada à biologia de metaloproteinases de matriz (MMPs), e especificamente, à expressão de superfície de célula de MMPs pela célula alvo de tumor. Metaloproteinases de matriz (MMPs) degradam

componentes da matriz extracelular (ECM) e foram envolvidas na remodelagem de tecido, invasão de tumor e metástase (Egeblad & Werb, 2002; Itoh & Nagase, 2002). A atividade de MMP foi associada também à eficiência de apoptose tanto mediada por perforin/granzima como por FAS (examinado em

Egeblad & Werb, 2002). Foi mostrado que a atividade de MMP é regulada em muitos níveis incluindo quatro inibidores endógenos, o inibidor de tecido de metaloproteinases de matriz (TIMP-1, -2, -3 e -4) (Bode & Maskos, 2003) . O equilíbrio in vivo entre MMPs e TIMPs determina se ocorre a ressorção de matriz ou deposição (Nagase & Woessner, 1999).

Os inibidores de tecido endógeno de metaloproteinases (TIMPs) apresentam diversas funções fisiológica/biológica incluindo a moderação de crescimento de tumor, metástase e apoptose. Essas diversas atividades biológicas de TIMPs foram ligadas em parte à estequiometria de interações de proteína de superfície de célula/MMP/TIMP. 0 recrutamento de linfócitos citotóxicos representa uma via potencial na defesa contra tumores. Embora linfócitos T citotóxicos (CTL) e células exterminadoras naturais (NK) que infiltram e reconhecem células de tumor sejam identificadas, uma imunidade anti-tumor eficaz freqüentemente falha em se desenvolver eficientemente. Essa ineficácia é um motivo que evita a eliminação total de células de tumor residual após resseção cirúrgica incompleta, devido a um estágio avançado de doença ou inoperabilidade local. A etiologia dessa deficiência funcional em linfócitos citotóxicos atualmente não é clara.

Em geral, os efeitos anti-tumor de CTLs e células NK são mediados através das vias apoptóticas mediadas por perforin/granzima ou FAS (CD95/CSD95L) (Kagi e outros, 1994). A via de perforin é mediada por citotoxinas secretadas durante reconhecimento de NK ou CTL de células alvo (Kagi e outros, 1994). 0 CD95, ou receptor de morte de

FAS, pertence ao regulador da família de proteínas, de morte de células e é de importância central em apoptose imune mediada de células de tumor (Nagata, 1999). f-1 humano é um receptor de glicoproteína de transmembrana única (325 aminoácidos, 45-48 kDa). 0 ligando de FAS (ligando de FAS, FASL, CD95L) é uma proteína de membrana integral e é uma glicoproteína de transmembrana do tipo II. FASL é um membro da família de TNF, que inclui TN Fa, cadeias α e β de linfotoxina (LT) , ligando CD40 e ligando CD30. A ação de FAS é mediada através de FADD (domínio de morte associado a FAS)/MORTI, uma proteína adaptadora que tem um domínio de morte em sua extremidade-C e se liga ao domínio de morte citoplásmico de FAS. Verificou-se que muitos tumores são resistentes a apoptose mediada através da via FAS (Frost e outros, 2003; examinado em Igney & Krammer, 2002) .

Como um sistema de modelo para testar as construções de TIMP-GPI da presente invenção, linhagens de células de carcinoma de célula renal foram utilizadas como exemplo. Carcinoma de célula renal (RCC) é a sétima causa principal de câncer. Aproximadamente um terço de pacientes com RCC têm doença metastática em apresentação e até 50% de relapso após nefrectomia (Vogelzang & Stadler, 1998). RCC é dif ícil de tratar e terapias imunológicas como interferon— alfa e interleucin-a2 são genericamente mais eficazes do que quimioterapia ou radiação (Vogelzang & Stadler, 1998). Linfócitos citotóxicos representam um componente potencial na defesa contra tumores incluindo RCC.

Um membro da família de TIMP, TIMP-1, é um inibidor de MMP de atuação ampla (Bode & Maskos, 2003). É uma proteína solúvel que pode ser detectada na superfície da célula somente através de sua associação com proteínas ligadas superficialmente (Brew e outros, 2000; Klier e outros, 2001). O tema de relatórios conflitantes (Brand, 2002). Até a presente data, é aceito que TIMP-I desempenha um papel em angiogênese, migração de células, e proliferação (Brand, 2002). Recentemente, foi mostrado que uma proteína de TIMP-I fixada por GPI apresentou uma supressão acentuada de migração de células endoteliais em resposta a bFGF (Djafarzadeh R e outros, 2004). As estratégias convencionais e abordagens para terapia de câncer ainda sofrem do problema de que células de tumor são difíceis de se eliminar após desenvolvimento do tumor. Tumores primários são normalmente removidos a partir do paciente por cirurgia. Entretanto, em alguns casos nem todas as regiões estão disponíveis para o cirurgião, e desse modo, as células de tumor permanecem no corpo onde podem se desenvolver em tumores secundários. Isso é um resultado da ressecção cirúrgica incompleta do tumor primário.

A presente invenção provê, portanto, um agente anti-câncer eficaz e estratégia para reduzir ou aliviar a proliferação de células de tumor em um indivíduo, em particular em um paciente que foi submetido a uma ressecção cirúrgica incompleta de um tumor primário. Os agentes anti- câncer da presente invenção são úteis para exterminar células de tumor tanto em linhagens de célula in vitro como em tecidos in vivo.

O papel de TIMPs em medicina regenerativa

A presente invenção é adicionalmente útil no campo de medicina regenerativa. Uma área significativa no campo de medicina regenerativa se refere ao processo de cura de ferimento. Cura de ferimento se refere a uma resposta de restauração natural em lesão de tecido e envolve uma cascata complexa de eventos celulares que finalmente gera a recobertura, reconstituição, e recuperação da resistência à tração do tecido lesionado. Esse processo envolve genericamente o recrutamento e proliferação de diferentes tipos de células, uma elaboração da matriz celular, e um aumento em vigilância imune.

Cura de ferimento ocorre em um modo preciso, seqüencial e pode ser dividido em quatro fases gerais: inflamação, granulação, re-epitelialização e remodelagem de tecido. Cada fase do processo de cura de ferimento é regulada por vias de transdução de sinal especiais. Durante cura de ferimento, um aumento na expressão de fatores de crescimento e citocinas ocorre; em particular, aumentos nos níveis de TNF, IL-I e IL-6, foram descritos. Durante a fase de inflamação inicial, que envolve as proteínas efetoras IL-1, TNF-α e CSF, tanto macrófagos como neutrófilos são recrutados para formar um coágulo de fibrina. Durante a fase de granulação, os fibroblastos se. proliferam, migram para o ferimento, e secretam ECM. As proteínas efetoras envolvidas nessa fase mencionada por último incluem MMPs, PDGF, FGF, EGF e VEGF. A terceira face em cura de ferimento, re-epitelialização, é caracterizada pela proliferação de ceratinócitos, que migram para dentro do ferimento, e também por um aumento em miofibroblastos, que são responsáveis por contração de ferimento. 0 resultado dessa fase, que envolvem as proteínas efetoras MMPs, KGF, TGF, GM-CSF, EGF e uPA e tPA, é a re-epitelialização da superfície de ferimento, a dissecção de eschar, e a formação de uma barreira. Finalmente, durante a fase de remodelagem de tecido, fibroblastos produzem uma matriz colagenosa que leva à formação de tecido de cicatriz, apoptose de fibroblastos, e uma comutação da ativação para diferenciação dos ceratinócitos. Proteínas efetoras conhecidas envolvidas nessa fase mencionada por último de cura de ferimento incluem TGF-bl, MMPs e TIMPs.

Desse modo, as células efetoras responsáveis pela maioria dos aspectos de cura de ferimento são os fibroblastos e os ceratinócitos, e MMPs que desempenham um papel importante tanto na migração de fibroblastos (MMP-1, -2, -3 e -13) e ceratinócitos (MMP-1, -2, -3 e -10) (Singer & Clark, 1999) além da formação de cicatriz. Cada um dos MMPs tem uma especificidade de substrato diferente no ECM, e desempenha um papel importante em degradação de ECM e movimento. A família de MHP inclui, entre outras coisas, colagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18), estromelisinas (MMP-3, MMP-IO, MMP-11), gelatinases (MMP-2, MMP-9), matrilisina (MMP-7), metaloelastase (MMP-12) e uma série de metaloproteinases de matriz ligadas por membrana (MT-MMPs). Como a função de MMPs é a de romper de forma proteolítica o ECM circundante, um equilíbrio entre essa atividade de protease e deposição de ECM durante cura de ferimento, isto é, reconstrução do tecido lesionado, necessita ser mantido de forma ótima. O controle de atividade de MMP é modulado pelas proteínas de TIMP, que são produzidas pela maioria das células, e atuam para inibir os MMPs em uma razão de 1:1. Onde esse equilíbrio delicado entre a ruptura proteolítica e deposição de ECM é perturbado, distúrbios como cura anormal de ferimento podem resultar, por exemplo, ferimentos crônicos, formação excessiva de cicatriz ou formação de quelóide.

Portanto, existe necessidade de controlar ou influenciar o equilíbrio fisiológico entre atividade de protease e deposição de ECM durante o processo de cura de ferimento.

Em uma modalidade adicional, as construções de fusão da presente invenção fornecem um agente regenerativo eficaz para o tratamento de condições definidas por um equilíbrio perturbado entre atividade de protease de MMP e deposição de ECM, como por exemplo, em formação de quelóide ou ferimentos crônicos, que são comumente associados a níveis aumentados de MMP. Adicionalmente, as construções de fusão da presente invenção fornecem um agente regenerativo eficaz que pode reduzir, minimizar ou inibir a formação de cicatrizes durante o processo de cura de ferimento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção provê agentes anti-tumor novos e métodos para o tratamento de câncer.

A presente invenção se baseia na surpreendente descoberta de que TIMP fixado por GPI reduz ou alivia eficazmente a proliferação de células de câncer, e promove

o extermínio de células de câncer em linhagens de células tanto in vitro como in vivo. Os determinantes funcionais e estruturais de TIMP foram combinados com uma fixação de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e, opcionalmente com mucina, para gerar um agente de quimioterapia altamente eficaz. Essa abordagem explora proteínas de TIMP fixadas por glicosilfosfatidilinositol (GPI) a serem incorporadas em membranas superficiais quando purificadas e adicionadas a células de câncer. A fusão de TIMP-GPI com um domínio de mucina aumenta ainda mais a apresentação de proteínas de TIMP na membrana de célula superficial e torna a construção de fusão mais eficaz em tornar as células de câncer sensíveis à destruição imune mediada.

Nos exemplos a seguir, a presente invenção demonstra que TIMP tem o potencial para a inibição de crescimento de células de tumor e redução de desenvolvimento de tumor tanto em linhagens de célula in vitro como em tecidos in vivo. A ligação de TIMP a uma fixação de GPI e administração exógena de TIMP fixada por GPI resulta em uma inserção eficiente de proteína de TIMP nas membranas de célula de células de câncer. A expressão de superfície de TIMP-I fixada por GPI induziu uma variedade de efeitos biológicos em linhagens de célula de câncer com relevância terapêutica potencial como induzir a via apoptótica mediada por FAS em células de câncer. Como mostrado nos exemplos a seguir, a supressão de proliferação de células de câncer foi observada como sendo dependente de dose. A proteína de TIMP-I fixada por GPI também bloqueou a secreção de proMMP-2 e proMMP-9 e alterou dramaticamente a associação de superfície de célula de MMPs diversos. Mais significativamente, as linhagens de célula de tumor normalmente resistentes a apoptose-FAS foram tornadas sensíveis ao extermínio mediado por FAS/CD95. 0 tratamento de GPI-TIMP resulta em uma regulação descendente de proteína BCL2 anti-apoptótica e aumento correspondente em proteína BAX pró-apoptótica. Esse deslocamento em direção a uma concentração mais elevada de proteínas pró- apoptóticas pode ser um motivo para a sensibilidade aumentada de apoptose mediada por FAS de células de câncer construídas superficialmente de TIMP.

Utilizando a abordagem acima, as proteínas de TIMP fixadas por GPI ou polipeptídeos da presente invenção provaram ser particularmente úteis em aplicações terapêuticas no tratamento de câncer residual após ressecção cirúrgica incompleta do tumor primário como em câncer de mama avançado, osteosarcoma, carcinoma de célula renal ou em tumores malignos do cérebro, por exemplo, glioblastoma.

Além disso, uma vez que as células de tumor, incluindo carcinoma de célula renal (RCC), são intrinsecamente resistentes a extermínio mediado por FAS, a presente invenção provê um meio eficaz para tornar as células de tumor suscetíveis a apoptose mediada por FAS.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se portanto a uma construção de fusão (TIMP-GPI ou TIMP-mucina-GPI) compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um inibidor de tecido de metaloproteinases (TIMP) ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, onde a TIMP ou o fragmento biologicamente ativo do mesmo a uma seqüência de aminoácidos de um domínio de mucina seguido por uma seqüência de aminoácidos de uma fixação de glicosilfosfatidilinositol (GPI).

Em uma modalidade preferida, a extremidade 3' de TIMP é fundida diretamente em uma seqüência de ligação de GPI e não contém um domínio de mucina.

O termo "mucina" se refere a uma família de proteínas grandes, intensamente glicosiladas. Uma classe de mucinas é ligada por membrana devido à presença de um domínio de cobertura de membrana hidrofóbica que favorece a retenção na membrana de plasma, enquanto outra classe de mucinas é secretada em superfícies de mucosa. Genes de mucina codificam monômeros de mucina que são tipicamente sintetizados como núcleos de apomucina no formato de bastão que são modificados pós-translação por glicosilação excepcionalmente abundante. Duas regiões distintamente diferentes são encontradas em mucinas maduras. Uma região inclui as regiões terminais-carbóxi e -amino, que são levemente glicosiladas, porém ricas em resíduos de cisteína, que são provavelmente envolvidos no estabelecimento de ligações de dissulfeto dentro e entre monômeros de mucina. Δ segunda região central é formada de múltiplas repetições de tandem de seqüências de 10 a 80 resíduos, onde mais da metade dos resíduos de aminoácidos são serina ou treonina.

Mucinas são genericamente secretadas como agregados maciços de proteínas tendo massas moleculares de aproximadamente 1 a 10 milhões de Daltons. Nesses agregados, monômeros são ligados entre si principalmente por interações não covalentes, embora ligações de dissulfeto intermoleculares também possam desempenhar um papel nesse processo. Pelo menos 19 genes de mucina humanos foram distinguidos incluindo MUC1, 2, 3A, 3B, 4, 5AC, 5B, 6-9, 11-13 e 15-19. A mucina, como utilizada na presente invenção, é preferivelmente um domínio de mucina ligada por membrana e compreende preferivelmente uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em MUCl, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUCll, MUC12, MUCl6 e MUC17, ou uma variante ou porção da mesma (as mucinas acima são examinadas em Moniaux N e outros, 2004). Em outra modalidade preferida, um suporte de mucina é utilizado que é isolado a partir da quimiocina associada à superfície CXCL16 ou fractalkine (CX3CL1).

Fractalkine é um membro da superfamília de gene de quimiocina grande e completa, que consiste principalmente em moléculas pró-inflamatórias secretadas. A estrutura típica de núcleo de quimiocinas é parcialmente mantida por ligações de dissulfeto entre resíduos de cisteína conservadas de modo posicionai. Para a maioria dos peptídeos de quimiocina, uma característica estrutural familiar é a distribuição de quatro cisteínas na molécula, isto é um motivo de assinatura de cisteína: CXC, CC e C, onde C é uma cisteína e X é qualquer resíduo de aminoácido.

Quatro famílias de quimiocina diferentes foram identificadas com base na observação de que peptídeos de quimiocina podem ser distinguidos pela organização dos resíduos de cisteína localizados próximo à extremidade-N da molécula. O próprio fractalkine define uma das famílias de quimiocina, e é distinguido estruturalmente a partir de outras famílias de quimiocina visto que as cisteínas terminais-N de fractalkine são separadas por três resíduos (isto é, um motivo CX3C) bem como sendo amarrado à membrana de célula por uma fixação de transmembrana de extremidade-C estendida que inclui um domínio semelhante à mucina, ou um suporte semelhante à mucina. Desse modo, os domínios de mucina e fractalkine contidos dentro das construções de fusão da presente invenção são apropriados para obter uma fixação aperfeiçoada da proteína de TIMP na membrana de célula.

A TIMP, como utilizado na presente invenção, é preferivelmente derivada a partir de um mamífero; mais preferido é um ser humano (as quatro TIMPS são examinadas em Mannello F., e outros, 2001). Os exemplos de proteínas de TIMP que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção compreendem TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 ou TIMP-4 e suas variantes correspondentes em outros organismos como camundongo, coelho, cão, gato, carneiro e vaca.

Fixação de GPI como utilizado na presente invenção, é preferivelmente derivada do antígeno associado à função de linfócito (LFA-3) ou uma porção do mesmo, e inclui uma seqüência de sinal de GPI que media a associação de membrana.

A presente invenção também se refere a uma molécula de ácido nucléico, como RNA ou DNA, compreendendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica para a construção de TIMP fixada por GPI da invenção.

Em um aspecto adicional da presente invenção, a molécula de ácido nucléico da invenção está contida em um plasmídeo de expressão, um vetor ou uma célula hospedeira para expressão da molécula de ácido nucléico da invenção.

A presente invenção também se refere ao uso das construções de fusão de TIMP-GPI- ou TIMP-mucina-GPI da invenção para o tratamento de câncer, particularmente câncer residual após remoção cirúrgica de um tumor primário.

Em um aspecto adicional da presente invenção, as construções de fusão de TIMP-GPI ou TIMP-mucina-GPI da invenção estão contidas em uma composição farmacêutica ou medicamento. Em uma modalidade adicional, as construções de fusão de TIMP-GPI ou TIMP-mucina-GPI da invenção são apropriadamente utilizadas como drogas ou agentes anti- câncer. Em uma modalidade preferida, as drogas anti-câncer da invenção são administradas e aplicadas localmente ao lado da ressecção de massa de tumor em pacientes com tumor de alto risco com um elevado risco de células de câncer residual e incidência aumentada de um relapso local, e aqueles pacientes tendo tumor residual óbvio devido à doença em estágio avançado ou inoperabilidade local.

Preferivelmente, a construção de fusão é administrada por pulverização no ferimento e/ou injeção em regiões que não são disponíveis para cirurgia.

A presente invenção também se refere a um método in vitro para inibição de proliferação de célula de câncer compreendendo as etapas de submeter uma linhagem de células de câncer a uma quantidade eficaz de construção de fusão de TIMP-mucina-GPI ou TIMP-GPI.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê novos agentes e métodos para o tratamento de condições definidas por um equilíbrio perturbado entre atividade de protease de MMP fisiológica normal e deposição de ECM, que resultam em cura anormal de ferimento. Em uma modalidade, a presente invenção provê agentes e métodos apropriados para o tratamento de quelóide ou cicatrização hipertrófica e ferimentos crônicos comumente associados a níveis aumentados de MMP. Além disso, a presente invenção também provê agentes eficazes e métodos para reduzir, minimizar ou inibir a formação de cicatrizes durante o processo de cura de ferimento.

DEFINIÇÕES

Com o termo "TIMP", como utilizado aqui, quer se dizer um inibidor de tecido endógeno de metaloproteinases, que é conhecido como sendo envolvido em funções fisiológicas/biológicas incluindo a inibição de metaloproteinases de matriz ativas, regulação de ativação pró MMP, crescimento de células, e a modulação de angiogênese. A "família de TIMP" humana contém quatro membros, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4. Um membro preferido utilizado na presente invenção, TIMP-1, é uma proteína secretada que pode ser detectada na superfície da célula através de sua interação com proteínas de superfície (Bode & Maskos, 2003).

O termo "construção de fusão" ou "construção de fusão de TIMP", como utilizado aqui, se refere tanto a molécula de ácido nucléico como a molécula de aminoácido codificado desse modo.

A invenção se refere especificamente a ácidos nucléicos contendo uma seqüência de nucleotídeo que inclui a seqüência definida por SEQ ID NOS:1-5 ou um homólogo da mesma, ou fragmentos exclusivos da mesma. Na presente invenção, a seqüência de uma molécula de ácido nucléico que codifica a proteína resultante é considerada homóloga a uma segunda molécula de ácido nucléico se a seqüência de nucleotídeos da primeira molécula de ácido nucléico for pelo menos aproximadamente 70% homóloga, preferivelmente, pelo menos aproximadamente 80% homóloga, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% homóloga à seqüência da segunda molécula de ácido nucléico. A homologia entre duas seqüências de ácido nucléico pode ser facilmente determinada utilizando o algoritmo de BLASTN conhecido (Altshul, e outros, 1990) com ajustes default. Como exemplo adicional, outro teste conhecido para determinar a homologia de duas seqüências de ácido nucléico é se elas hibridizam sob condições de hibridização normal, preferivelmente sob condições de hibridização rigorosas. Dada a seqüência de ácido nucléico revelada aqui, a pessoa versada pode facilmente projetar estruturas de ácido nucléico tendo funções especificas em vários tipos de aplicações. Por exemplo, o técnico pode construir oligonucleotideos ou polinucleotideos para uso como iniciadores em procedimentos de amplificação de ácido nucléico, como a reação de cadeia de polimerase (PCR), reação de cadeia de ligase (LCR), Reação de Cadeia de reparo (RCR), ensaio de ligação de oligonucleotideo PCR (PCR-OLA) e similares. Oligonucleotideos úteis como sondas em estudos de hibridização, como hibridização no local, podem ser construídas. Inúmeros métodos para rotular tais sondas com radioisótopos, etiquetas fluorescentes, enzimas, e frações de ligação (por exemplo, biotina), são conhecidos, desse modo as sondas da invenção podem ser facilmente adaptadas para fácil capacidade de detecção.

Oligonucleotideos também podem ser projetados e fabricados para outras finalidades. Por exemplo, a invenção permite o desenho de oligonucleotideos anti-sentido, e oligonucleotideos de formação tripla para uso no estudo de relações de função/estrutura. A recombinação homóloga pode ser implementada por adaptação do ácido nucléico atualmente descrito para uso como um meio de alvejar.

A proteína codificada pelo ácido nucléico da presente invenção inclui ainda homólogos funcionais. Uma proteína é considerada um homólogo funcional de outra proteína para uma função específica, como descrito abaixo, se o homólogo tiver a mesma função que a outra proteína.O homólogo pode ser, por exemplo, um fragmento da proteína, ou um mutante de substituição, adição ou deleção da proteína.

A determinação de se duas seqüências de aminoácidos são substancialmente homólogas é, para fins da presente invenção, baseada em buscas FASTA de acordo com Pearson & Lipman (1988) . POr exemplo, a seqüência de aminoácidos de uma primeira proteína é considerada homóloga àquela de uma segunda proteína se a seqüência de aminoácido da primeira proteína tiver pelo menos aproximadamente 70% de identidade de seqüência de aminoácidos, preferivelmente pelo menos aproximadamente 80% de identidade, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95% de identidade, com a seqüência da segunda proteína.

A possibilidade de substituir um aminoácido em uma seqüência com um aminoácido equivalente é bem conhecida. Grupos de aminoácidos conhecidos como sendo equivalentes incluem:

(a) Ala(A), Ser(S), Thr(T), Pro(P), Gly(G);

(b) Asn(N) , Asp(D) , Glu(E) , Gln(Q) ;

(c) His(H), Arg(R), Lys(K);

(d) Met(M), Leu(L), Ile (I), Val(V); e

(e) Phe(F) , Tyr(Y), Trp(W) .

Substituições, adições e/ou deleções nas seqüências de aminoácidos podem ser feitas desde que a proteína codificada pelo ácido nucléico da invenção continue a satisfazer os critérios funcionais descritos aqui. Uma seqüência de aminoácido que é substancialmente igual à outra seqüência, porém que difere da outra seqüência por intermédio de uma ou mais substituições, adições e/ou deleções, é considerada como sendo uma seqüência equivalente.

Preferivelmente, menos de 20%, mais preferivelmente menos de 10%, e ainda mais preferivelmente menos de 5%, do número de resíduos de aminoácidos em uma seqüência são substituídos por, adicionados a, ou deletados da proteína codificada pelo ácido nucléico da invenção. Com o termo "MMP", como utilizado aqui, quer se dizer uma metaloproteinase de matriz que pertence à superfamília de MMP como representado por pelo menos 26 metaloendopeptidases de degradação de matriz extracelular que estão atuando durante desenvolvimento e diferenciação de tecido, infiltração celular, cura de ferimento, e como moderadores da resposta imune.

Com o termo "GPI", como utilizado aqui, quer se dizer glicoinositol fosfolipideos, em particular, glicosilfosfatidilinositol, como descrito em Medof e outros, 1996. Essas fixações semelhantes a fosfolipideo têm uma estrutura comum para fixação de membrana independente de função de proteína. Unidades de fixação de GPI são compostas de um glicano linear contendo um fosfoetanol amina, três resíduos de manose, e um glicosamina não acetilado ligado a um fosfolipideo de inositol. A seqüência de GPI contém os sinais que orientam fixação de GPI.

Com o termo "mucina" ou "domínio de mucina", como utilizado aqui, quer se dizer um componente de glicoproteína não de membrana ou ligado por membrana.

Normalmente, mucinas ligadas por membrana apresentam seqüências hidrofóbicas ou domínios de transmembrana responsáveis por sua fixação na bicamada de lipídeo e, opcionalmente, contêm um ou vários domínios semelhantes a fat or von Willebrandt, que funcionam na oligomerização de monômeros de mucina e no acondicionamento em vesículas secretoras. O termo "mucina" ou "domínio de mucina", como utilizado aqui, também abrange suportes de mucina ou domínios semelhantes a mucina, como os suportes de mucina tipicamente encontrados nas quimiocinas CXCLl6 ou em fractalkine (CX3CL1).

Uma construção de fusão "TIMP-GPI", como utilizado aqui, se refere a TIMP que é fundido diretamente com uma seqüência de ligação de GPI. A construção de fusão de TIMP-GPI é projetada pela substituição de seqüência extrema de cDNA ou 3'-mRNA de proteínas naturalmente fixadas por GPI (isto é, uma seqüência que contém os sinais que orientam fixação de GPI), para a seqüência extrema de cDNA ou 3'-mRNA de TIMP endógena.

Um "TIMP-mucina-GPI" ou "TIMP-muc-GPI", como utilizado aqui, se refere a uma TIMP que é diretamente fundida com um domínio de mucina seguido por uma seqüência de ligação de GPI. A construção de fusão de TIMP-mucina-GPI

é projetada, como descrito para TIMP-GPI porém incluindo a seqüência de aminoácido de um domínio de mucina entre as seqüências de aminoácido de TIMP e GPI. Por analogia, "TIMP-fractalkine-GPI" ou "TIMP-frac-GPI" se refere a um TIMP que é diretamente fundido com um domínio de fractalkine seguido por uma seqüência de ligação de GPI.

Com o termo "RCC" quer se dizer carcinoma de câncer renal que é considerado como um tumor progressivo com opções terapêuticas limitadas devido à resistência do tumor a agentes quimioterapêuticos atuais e radiação. RCC serve como um sistema modelo na presente invenção para mostrar a atividade anti-tumor de TIMP fixado por GPI. As linhagens de células de modelo utilizadas na presente invenção são as linhagens de células de RCC-26 e RCC-53 que foram estabelecidas a partir de pacientes com carcinomas de célula estágio I e estágio IV.

Com o termo "FAS" quer se dizer um membro da família de receptor de fator de crescimento de nervo/fator de necrose de tumor que induz apoptose independente de TNF-

a. Outras abreviaturas conhecidas na técnica para FAS são Apol (=proteína de indução de apoptose 1) e CD95.

O termo "regeneração" se refere genericamente à recuperação da integridade de tecido traumatizado ou de outro modo lesionado. Esse termo pode incluir os processos de cura de ferimento, reparo de tecido, e outros tipos de atividades de restauração que ocorrem no local onde um insulto fisiológico e dano resultante ao tecido ocorreu.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A família TIMP e engenharia de proteína de superfícies celulares

Inibidores de tecido de metaloproteinases (TIMPs) são conhecidos como os principais inibidores celulares da subfamília de metaloproteinase de matriz (MMP) , apresentando graus variáveis de eficácia contra membros de MMP diferentes, bem como diferentes padrões de expressão de tecido e modos de regulação. As TIMPs tipicamente modulam a atividade de matriz solúvel ligada e MMPs associadas de células. Todas as quatro TIMPs de mamíferos têm muitas similaridades amplas, porém apresenta características estruturais distintas, propriedades bioquímicas e padrões de expressão, que sugere que cada TIMP tem uma função in vivo específica.

A proteína de TIMP-I é o membro mais amplamente expresso e estudado da família TIMP. Outros membros da família TIMP incluem TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4. Proteínas TIMP não somente compartilham características estruturais comuns, incluindo uma série de resíduos de cisteína conservada que forma ligações de dissulfeto essenciais para a conformação de proteína nativa (Brew e outros, 2000), porém têm também atividades biológicas amplamente sobrepostas. A região terminal-N conservada das proteínas de TIMP é necessária para atividades inibidoras funcionais, enquanto se pensa que as regiões terminais-C divergentes modulam a seletividade de inibição e eficiência de ligação de agentes aos MMPs (Maskos & Bode, 2003). Entretanto, além de sua capacidade de atuar como inibidores de MMP, os vários membros da família de TIMP podem apresentar também atividades biológicas adicionais, incluindo a regulação de proliferação e apoptose além da modulação de repostas inflamatórias e angiogênicas.

Verificou-se que TIMP-I inibe grande parte de MMPs (exceto MMP-2 e -14), e preferencialmente inibe MMP-8. TIMP-I e produzido e secretado em forma solúvel por uma variedade de tipos de células e é amplamente distribuído por todo o corpo. É uma proteína extensamente glicosilada com uma massa molecular de 28.5 kDa. TIMP-I apresenta as formas ativas de MMPs, e complexos com a proforma de MMP9. Como MMP9, a expressão de TIMP-I é sensível a muitos fatores. A síntese aumentada de TIMP-I é causada por uma ampla variedade de reagentes que inclui: TGF beta, EGF, PDGF, FGFb, PMA, ácido alltransretinóico (RA), ILl e ILll. TIMP-2 é uma glicoproteína de 21 kDa que é expresso por uma variedade de tipos de células. Forma um complexo estequiométrico não covalente com MMPs tanto latente como ativo. TIMP-2 mostra uma preferência para inibição de MMP-2.

TIMP-3 é tipicamente ligado a ECM e inibe a atividade de MMP-1, -2, -3, -9 e 13. TIMP-3 mostra 30% de homologia de aminoácido com TIMP-I e 38% de homologia com TIMP-2. TIMP-3 foi mostrado como promovendo o desprendimento de células transformadas a partir de ECM e acelerando alterações morfológicas associadas à transformação de células.

Devido à sua ligação de afinidade elevada com ECM, TIMP-3 é exclusivo entre as TIMPs. TIMP-3 foi mostrado como promovendo o desprendimento de células transformadas a partir de ECM e acelerando alterações morfológicas associadas à transformação de células. TIMP-3 contém um domínio de ligação de glicosaminoglicano (GAG) que compreende seis aminoácidos (Lys30, Lys26, Lys22, Lys42, Arg20, Lys45) que se considere que são responsáveis para uma associação com a superfície de célula. TIMP-3 é a única TIMP que normalmente inibe TACE (enzima de conversão de TNF-α), outra metaloprotease que libera TNF solúvel e é responsável pelo processamento do receptor IL-6 para desse modo desempenhar uma parte central no processo de cura de ferimento.

TIMP-4 inibe todas as MMPs conhecidas, e preferencialmente inibe MMP-2 e -7. TIMP4 mostra 37% de identidade de aminoácido com TIMPl e 51% de homologia com TIMP2 e TIMP3. TIMP4 é secretado extracelularmente, predominantemente no tecido do coração e do cérebro e parece funcionar em um modo específico de tecido com relação a homeostase de matriz extracelular (ECM).

A engenharia de proteína de superfícies de célula é uma tecnologia potencialmente potente através da qual a composição de proteína de superfície de células pode ser manipulada sem transferência de gene. Pela substituição de seqüência de cDNA derivada de mRNA a partir de uma proteína ligada por GPI que contém o domínio de sinal de GPI para a região de terminal de carboxila de uma proteína de interesse, é possível gerar uma construção de fusão que codifica uma proteína ligada por GPI.

Essa abordagem oferece múltiplas vantagens em relação a abordagens de transferência de gene mais tradicionais. Por exemplo, o método é aplicável a células que são difíceis ou impossíveis de transfectar (por exemplo, endotélio microvascular primário, células alvo primárias, etc.). A quantidade de proteína adicionada à superfície de célula pode ser controlada e quantificada (por FACS ou imunofluorescência). Além disso, múltiplas proteínas fixadas por GPI podem ser seqüencial ou simultaneamente inseridas nas mesmas células. Através de engenharia molecular é possível expressar uma tag de epítopo adicional que auxilia a purificação de proteína bem como monitoração de reagente durante experimentos. 0 agente pode ser injetado diretamente no tumor ou área peritumorial e o efeito de recrutamento seletivo de leucócitos sobre o crescimento de tumor ou apoptose induzida por FAS determinado.

Construções de fusão de TIMP para o tratamento de câncer

O prognóstico de tumores malignos é na maior parte dependente de seu estágio clínico e patológico. Embora a maioria dos carcinomas (por exemplo, tumores primário e secundário) possa ser removida totalmente cirurgicamente na maioria dos casos, a ressecção de câncer em estágio avançado freqüentemente não é possível e associado à recorrência prematura da doença e mortalidade aumentada relacionada à doença.

Particularmente em câncer de mama, a doença em estágio avançado com tamanho estendido de tumor (> 2 cm) é associado à ocorrência de metástase distante e sobrevivência limitada. Um volume grande de tumor também é considerado como sendo um parâmetro crítico para a presença de câncer residual, que apresenta também um elevado risco para relapso local e a propagação de metástase distante. De modo semelhante, tumores de cérebro como glioblastoma (astrocitoma grau IV) é outro alvo concebível para a vigilância de tumor, porque a remoção cirúrgica total é quase sempre impossível e relapso local ocorre em 95% de todos os cases em um ano de cirurgia primária.

Para resolver o problema que é ligado a câncer residual, foi necessário identificar uma nova opção de terapia de câncer que é particularmente útil para o tratamento de câncer residual após ressecção cirúrgica incompleta.

Como solução, a presente invenção provê TIMP fixado por GPI, que pode ser aplicada localmente nas margens de ressecção para atrair células imunes e focar a vigilância de tumor residual nas células de câncer residual.

Para essa finalidade, proteínas de TIMP são fixadas por GPIs, e quando purificadas e adicionadas a células de câncer incorporam em suas membranas de superfície s são totalmente funcionais. Pela substituição de seqüências extremas de 3'-mRNA de proteínas naturalmente fixadas por GPI (isto é, uma seqüência que contém os sinais que orientam fixação por GPI) para a seqüência extrema 3'- mRNA endógena, virtualmente qualquer proteína de TIMP pode ser expressa como um derivado fixado por GPI.

Na presente invenção, a incorporação de proteína TIMP-GPI purificada nas membranas de superfície de linhagens de célula de tumor é demonstrada por incubação das linhagens de célula com TIMP-I-GPI purificado, TIMP-I- mucina-GPI ou proteína de controle (rh)TIMP-I humano recombinante. Como detalhado abaixo, expressão de superfície com TIMP-I fixado por GPI resultou em um sinal de superfície forte para TIMP-I.

Como utilizado aqui, os termos "isolado e/ou purificado" se referem a isolamento in vitro de um DNA ou molécula de polipeptídeo a partir de seu ambiente celular natural, e a partir da associação com componentes da célula, como ácido nucléico ou polipeptídeos, de modo que possa ser seqüenciado, replicado e/ou expresso. Por exemplo, "seqüência de ligação de GPI isolada" é RNA ou DNA contendo mais de 9, preferivelmente 36, e mais preferivelmente 45 ou mais, bases de nucleotídeo seqüenciais que codificam pelo menos uma porção de uma seqüência de ligação, ou uma variante do mesmo, ou um RNA ou DNA complementar ao mesmo, que é complementar ou hibridiza, respectivamente, ao RNA ou DNA codificando a seqüência de ligação e permanece estavelmente ligado sob condições rigorosas, como definido pelos métodos bem conhecidos na técnica. Desse modo, o RNA ou DNA é "isolado" em que é livre a partir de pelo menos um ácido nucléico contaminante com o qual é normalmente associado na fonte natural do RNA ou DNA e é preferivelmente substancialmente livre de qualquer outro RNA ou DNA de mamífero.

Como utilizado aqui, o termo "ácido nucléico recombinante", por exemplo, "seqüência de DNA recombinante" se refere a um ácido nucléico, por exemplo, a DNA, que foi derivado ou isolado de qualquer fonte de tecido apropriado, que pode ser subseqüentemente alterado quimicamente in vitro, de modo que sua seqüência não seja de ocorrência natural, ou corresponda a seqüências de ocorrência natural que não são posicionadas como seriam posicionadas em um genoma que não foi transformado com DNA exógeno. Um exemplo de DNA "derivado" de uma fonte, seria uma seqüência de DNA que é identificada como um fragmento útil em um organismo dado, e que é então quimicamente sintetizado em forma essencialmente pura. Um exemplo de um tal DNA "isolado" a partir de uma fonte seria uma seqüência de DNA útil que é cortada ou removida a partir da fonte por meio químico, por exemplo, pelo uso de endonucleases de restrição, de modo que pode ser adicionalmente manipulado, por exemplo, amplificado, para uso na invenção, pela metodologia conhecida de construção genética.

Ao contrário de fixações de polipeptídeo convencionais, que têm seqüências de transmembrana diferentes e conectam a extensões citoplásmicas específicas, essas fixações semelhantes a fosfolipideo utilizam uma estrutura comum como um mecanismo geral para fixação de membrana independente de função de proteína. Unidades de fixação de GPI são compostas de um glicano linear contendo um fosfoetanol amina, três resíduos de manose, e um glicosamina não acetilada ligada a um fosfolipideo de inositol. São pré-fabricados no retículo endoplásmico (ER) e são adicionados a produtos de translação primário no momento de sua translocação através da membrana ER. Os produtos modificados por GPI são então glicosilados no ER e Golgi, e subseqüentemente transportados para a superfície da célula.

Seqüências de ligação com GPI preferidas que podem ser utilizadas na presente invenção são derivadas a partir de fixações de GPI que são isoladas, por exemplo, de enzimas como fosfatase alcalina, acetil colinesterase, 5' nucleotidase (C073); moléculas de adesão como antígeno associado à função de linfócito (LFA-3; CD58); molécula de adesão de célula neural (NCAM); proteínas reguladoras de complemento como fator de aceleração de diminuição (DAF ou CD55), ou outros como o Fey receptor tipo III B (Fc-y-RIII ou CD16b), Thy-I (CD90), Qa-2, Ly-6A, inibidor de membrana de Iise reativo (MIRL ou CD59) . Para fins da presente invenção, o antígeno associado à função de linfócito (LFA- 3) é preferido. A pessoa versada reconhecerá que também qualquer outra das fixações de GPI conhecidas pode ser utilizado para a prática da presente invenção.

Para a construção de TIMP-GPI, a seqüência de comprimento total de TIMP pode ser utilizada na construção de fusão ou uma porção funcionalmente ativa da mesma, que retém a atividade de TIMP. De modo semelhante também uma porção da seqüência de GPI pode ser utilizada desde que a porção permita a incorporação da proteína de TIMP na membrana de célula de superfície de células de câncer.

A seguir, uma pluralidade de modalidades referentes a construções de fusão de TIMP são descritas, pelo que as construções foram produzidas e fornecidas para tratamento de câncer e como agentes no campo de medicina regenerativa. Em uma primeira modalidade, a molécula de TIMP é selecionada do grupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4 e é preferivelmente fundida a uma seqüência de GPI.

Em outra modalidade preferida, a seqüência de GPI tem 36 aminoácidos em comprimento.

Ainda em outra modalidade, a molécula de TIMP é selecionada do grupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4 e é fundida a um domínio de mucina ou domínio de fractalkine seguido pela seqüência de GPI.

Em uma modalidade adicional, a proteína de TIMP que é selecionada do grupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4 e fundida à seqüência de GPI, ou fundida a um domínio e mucina ou domínio de fractalkine seguido pela seqüência de GPI, é truncada no terminal-C. Em uma modalidade preferida, a molécula de TIMP é truncada nos primeiros 50, 50-100 ou 50-152 resíduos de aminoácido terminal-N. Mais preferivelmente, a molécula de TIMP é truncada nos primeiros 152 resíduos de aminoácido de terminal-N e é a molécula TIMP-1. 0 termo "truncado" se refere a uma seqüência de aminoácido ou ácido nucléico de TIMP que contém menos do que o número total de bases de ácido nucléico ou resíduos de aminoácido encontrados em uma seqüência ou proteína de ácido nucléico de TIMP nativa ou a uma seqüência de aminoácido ou ácido nucléico foi deletada de seqüências não desejadas. Ainda em uma modalidade adicional, a construção de fusão de TIMP é definida por uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 e 5.

A construção obtida pode ser então expressa em qualquer linhagem de célula apropriada ou célula hospedeira para obter o polipeptideo de TIMP funcional ou proteína. Para essa finalidade, qualquer um dos vetores conhecidos apropriados ou plasmídeos pode ser utilizado para expressar as proteínas de TIMP fixadas por GPI da presente invenção. Como descrito em mais detalhe abaixo, células de câncer alvo tratadas com proteína TIMP-GPI (e como controle com proteína rhTIMP-1) foram reconhecidas pelas construções de proteína e, como conseqüência exterminadas devido à apoptose mediada por FAS.

Em uma modalidade preferida, e como exemplo, um vetor utilizado para expressão das construções de fusão da presente invenção contém o promotor para fator de alongamento humano alfa 1 seguido por um sítio de clonagem múltiplo e um sítio de ligação ribossômica interno que permite expressão bicistrônica da construção e reductase de diidrofolato (DHFR) utilizado como um marcador de seleção (Mack, e outros, P.N.A.S. USA 92: 7021, 1995). A extremidade 3' (terminal carboxila) da proteína de TIMP é fundida diretamente a uma seqüência de ligação de GPI (por exemplo, derivada a partir de antígeno associado à função de linfócito-3 (LFA-3)) ou o domínio semelhante à mucina isolado a partir de CXCLl6 ou fractalkine (CX3CL1) seguido pelo sinal GPI. Como indicado acima, essas regiões de mucina são amplamente compostas de resíduos de serina/treonina/glicina/prolina mostrados para facilitar interações de célula-célula. As construções de fusão resultantes são transfectadas em células de ovário de hamster Chinês (CHO) com deficiência de diidrofolato reductase (DHFR) e a seleção é executada como descrito (Mack, e outros, P.N.A.S USA 92: 7021-7025, 1995). Em uma modalidade preferida, os meios de transfecção podem ser expostos a metotrexato para aumentar a taxa de expressão por amplificação de gene.

Em uma modalidade adicional, a construção de TIMP-GPI pode ser adicionalmente fundida em um domínio de mucina para aumentar a eficiência de incorporação de membrana de proteínas de TIMP-GPI. Mucinas são componentes de glicoprote ína não membrana ou ligados à membrana que foram primeiramente identificados em muco secretado revestindo as superfícies de epitélios glandulares. Mucinas ligadas por membrana apresentam seqüências hidrofóbicas ou domínios de transmembrana responsáveis por sua fixação na bicamada de lipídeo. Atualmente, um total de 21 genes recebeu a denominação MUC: MUC1-2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6-13, MUC15-20 (Moniaux N., e outros, 2004). As cinco características comuns de uma mucina são: (1) secreção na camada de muco, (2) O-glicoproteína com elevado peso molecular, (3) presença de um conjunto de repetição tandem codificado por um exon grande posicionado centralmente e exclusivo, (4) presença de um domínio de peptídeo previsto contendo uma elevada percentagem de resíduos de serina e treonina, e (5) um padrão complexo de expressão de mRNA. Com uma exceção (MUC7), as mucinas secretoras (MUC2, MUC5AC, MUC5B e MUC6) possuem um ou vários domínios semelhantes a fator von Willebrandt, peptídeos ricos em cisteína, que funcionam na oligomerização de monômeros de mucina e no acondicionamento em vesículas secretoras. Tipicamente, mucinas secretadas são expressas exclusivamente por células epiteliais especializadas, são secretadas no muco, e exibem um padrão de expressão restrito dentro do corpo humano. As quatro mucinas secretoras, também mencionadas como as mucinas de formação de gel, têm uma arquitetura comum com um elevado nível de similaridade para o fator pro-von Willebrand. São também conhecidos como abrigando cinco domínios D devido à sua homologia com os domínios D do fator von Willebrand.

As mucinas ligadas por membrana são compostas de MUCl, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC16, e MUC17. Mucinas fixadas por membrana contêm um módulo SEA (proteína de esperma de ouriço do mar, enterocinase e agrin), com a exceção de MUC4, MUC3A-B, MUC4, MUC11-12 e MUC17 contêm dois a três domínios semelhantes a fator de crescimento epidérmico (EGF). Os exemplos de mucinas ligadas por membrana que podem ser utilizados na presente invenção são MUCl, MUC3, MUC4, e MUC12. Em uma modalidade preferida da invenção, o suporte de mucina da quimiocina associada à superfície CXCLl6 ou fractalkine (CX3CL1) é utilizado. CXCLl6 é um membro da subfamília de quimiocina CXC. Ao contrário de outros membros desse subgrupo, CXCL16 é estruturalmente diferente e tem quatro domínios distintos: um domínio de quimiocina amarrado à superfície de célula através de um suporte semelhante a mucina, que por sua vez é fixado aos domínios citoplásmicos e de transmembrana. Fractalkine (CX3CL1) tem uma estrutura similar àquela de CXCLl6, e tanto CXCL16 como fractalkine atuam como moléculas de adesão quando expressas em superfície de célula, e após clivagem a partir da superfície de célula, as quimiocinas solúveis atuam como meios de quimioatração.

Preferivelmente, o domínio de mucina é fundido entre a extremidade 3' da seqüência de TIMP e a extremidade 5' da seqüência de fixação por GPI por qualquer um dos métodos de engenharia genética convencionais. A construção de fusão de TIMP-mucina-GPI obtida da invenção pode ser então transfectada e expressa em qualquer linhagem de célula conhecida ou célula hospedeira apropriada. A pessoa versada reconhecerá que quaisquer outras mucinas ou domínios de mucina são apropriados para fins da presente invenção.

Em uma modalidade preferida, fractalkine fundida à molécula de TIMP compreende aminoácidos 100-342 de CX3CL1 seguido pela seqüência de GPI. Em uma modalidade ainda mais preferida, a molécula de TIMP é a molécula de TIMP-I truncada nos primeiros 152 aminoácidos de terminal-N (SEQ ID NO:5).

Embora o uso de TIMP-I (Bode & Maskos, 2003) para a preparação de proteína de TIMP fixado por GPI seja preferido na presente invenção, a pessoa versada reconhecerá que também outras proteínas de TIMP podem ser utilizadas para a prática da presente invenção. Exemplos adicionais de TIMPs humanos que são úteis são TIMP-2, TIMP- 3 e TIMP-4 (Mannello F., e outros, 2001). As TIMPs utilizadas são derivadas a partir de fontes humanas e administradas para tratar células de câncer humano. A pessoa versada reconhecerá, de modo semelhante que também homólogos de TIMP, em particular TIMP-1, em outros organismos do que humano terá um efeito similar no extermínio de células de tumor. Por exemplo, em algumas modalidades, a seqüência de TIMP-I derivada a partir de um animal como um cão, gato, camundongo, coelho, vaca ou carneiro, e pássaro, pode ser utilizada para a construção de uma construção de fusão de TIMP-GPI da presente invenção. A quimera de TIMP-GPI será subseqüentemente aplicada ao sítio de tumor de modo similar como descrito para um indivíduo humano.

Tumores e células de câncer que podem ser tratados com a TIMP fixado por GPI incluem os cânceres a seguir porém não se limita aos mesmos: câncer de mama, câncer renal, câncer de próstata, leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer adrenal, câncer de tiróide, câncer de sangue, câncer da pele, câncer do cérebro, câncer cervical, câncer intestinal, câncer do fígado, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer gastrointestinal, câncer de linfonodo, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de orelha, nariz e garganta (ENT), câncer do útero, câncer de ovário e câncer de pulmão e as metástases dos mesmos.

Para tratamento de câncer residual, TIMP-GPI pode ser administrado e aplicado localmente ao lado da ressecção de massa de tumor em pacientes com tumor de alto risco com um elevado risco de células de câncer residual e incidência aumentada de um relapso local e naqueles pacientes com um tumor residual óbvio devido à doença em estágio avançado ou inoperabilidade local. Preferivelmente, a construção de fusão é administrada em uma concentração de 0,5 a 5 μg/ml de proteína, mais preferido em 0,5 a 1 μg, ou 1 a 2 μg/ml. Uma concentração de aproximadamente 1 μg/ml de TIMP-GPI ou TIMP-mucina-GPI é mais preferida. A proteína pode ser administrada ao indivíduo por quaisquer vias de administração aplicáveis. Prefere-se que o tratamento seja realizado durante cirurgia de tal modo que a construção de fusão seja pulverizada sobre o ferimento ou seja injetada em regiões que não são disponíveis para cirurgia. Para essa finalidade, a construção de fusão de TIMP fixada por GPI da presente invenção pode ser um constituinte de uma composição farmacêutica ou medicamento que compreende ainda um ou mais dos veículos, diluentes e excipiente convencionalmente conhecidos. Como concluído a partir dos exemplos abaixo, TIMP fixado por GPI parece induzir sua atividade anti-tumor, isto é o extermínio de células de tumor, não por apoptose induzida por célula NK e CTL (via lítica mediada por perforin/granzima), porém em vez disso pela segunda via, que envolve apoptose mediada por FAS/CD95 (para detalhes adicionais vide os exemplos 5 e 6; figuras 5 e 6) . Além disso, embora muitas células de tumor sejam resistentes a apoptose mediada por FAS, o tratamento com TIMP-1-GPI, porém não rhTIMP-1 de controle, tornou as linhagens de células sensíveis a apoptose mediada por FAS.

Verificou-se também que o tratamento com proteína TIMP-I-GPI reduz BCL2 e aumenta expressão de proteína ΒΑΧ. As proteínas BCL2 representam uma família de proteínas envolvidas no controle de apoptose. Alguns membros dessa família (como BCL2 e BCL-XL) são anti-apoptóticas, enquanto outras (como Bad ou ΒΑΧ) são pró-apoptóticas. A sensibilidade de células a estímulos apoptóticos depende do equilíbrio entre membros da família BCL2 pró- e anti- apoptóticos. Além disso, o efeito de tratamento com TIMP-I- GPI sobre a expressão de BCL2 e BAX foi determinado e mostra-se que o tratamento de células com câncer com TIMP- I-GPI aumentou a expressão de BAX pró-apoptótico, e diminuiu a expressão de BCL2 anti-apoptótico.

Resultados similares foram obtidos para as construções de fusão de TIMP codificados pela SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 e 5, respectivamente.

Em resumo, a disponibilidade da metodologia para produzir quantidades de micrograma para miligrama de proteínas de TIMP fixadas por GPI recombinante em combinação com a incorporação dessas moléculas em superfícies de células com câncer provê uma ferramenta eficaz para o tratamento de câncer. As construções de fusão de TIMP para uso em medicina regenerativa

Além disso, as construções de fusão da presente invenção são apropriadas para uso em medicina regenerativa, particularmente na área de cura de ferimento. Como descrito acima, as proteínas de TIMP que são fundidas com GPI ou com mucina-GPI ou fractalkine-GPI são eficientemente incorporadas na membrana de superfície celular, onde focam domínios funcionais naquelas superfícies de células independentemente de interações de proteína-proteína. As construções de fusão de TIMP da presente invenção são tipicamente bem estáveis e exibem bioatividades novas e amplificadas.

Como descrito acima, tanto MMPs como TACE desempenha um papel crucial no processo de cura de ferimento. Níveis aumentados de MMP são associados a vários distúrbios de cura de ferimento, entre outros a ocorrência de ferimento crônico. Como as TIMPs são inibidores naturais de MMPs, as construções de fusão da presente invenção também podem ser empregadas como agentes terapêuticos eficazes para controlar o processo de cura de ferimento, por exemplo, em medicina regenerativa e são apropriados para distúrbios de tratamento caracterizados por um aumento em níveis de MMP.

Desse modo, a presente invenção provê agentes e métodos apropriados para uso em medicina regenerativa e/ou para tratar distúrbios caracterizados por um aumento em níveis de MMP. Em uma modalidade preferida, as construções de fusão da presente invenção são utilizadas para tratar ou evitar cicatrização excessiva, e cura anormal de ferimento incluindo quelóide ou cicatrização hipertrófica e/ou ferimentos crônicos. Em uma modalidade ainda adicional, as construções de fusão da presente invenção são utilizadas para inibir ou evitar a formação de tecido de cicatriz.

Uma resposta típica de cura de ferimento é caracterizada pelo movimento de células especializadas para dentro do sítio de ferimento. Plaquetas e células inflamatórias são genericamente as primeiras células a chegarem no local de lesão e essas moléculas fornecem funções importantes e sinais químicos, incluindo citocinas que são necessárias para o influxo de células de tecido conectivo e outros fatores de cura. 0 termo "ferimento" significa uma ruptura de função e estrutura fisiológica normal. Desse modo, o processo de cura de ferimento se refere à seqüência complexa e dinâmica de eventos resultando fi nalmente na recuperação de função e continuidade fisiológica.

Quando um ferimento cura, uma cicatriz normalmente se desenvolve em seu lugar. Durante o curso de cura normal de ferimento, tecidos simples como gordura, tecido conectivo, e epitélio são regenerados. Entretanto, como a pele é um órgão mais complexo que é derivado de duas camadas germinativas, cura através da formação de um tecido predominantemente fibroso, isto é, uma cicatriz.

Em cura normal de ferimento, a atividade proteolítica de MMP é controlada por vários mecanismos incluindo transcrição de gene, produção da enzima, e por secreção local de inibidores de TIMP endógeno. Durante reparo de ferimento, um equilíbrio fisiológico existe entre as atividades das MMP's e TIMPs. Entretanto, metaloproteases de matriz são conhecidas por terem níveis elevados em ferimentos crônicos e tais concentrações elevadas de MMP são conhecidas por impedirem o processo de cura de ferimento. Múltiplos tipos de células, incluindo macrófagos, fibroblastos, neutrófilos, células epiteliais, e células endoteliais, sintetizam MMP's na presença de sinais bioquímicos específicos como citocinas inflamatórias. MMP's são capazes de digerir quase todos os componentes da matriz extracelular, que desafia o equilíbrio exigido entre as atividades de degradação de proteína de MMPs e outra atividade celular que sintetiza e deposita componentes de proteína de tecido.

A figura 8 provê uma visão geral do processo de remodelagem de tecido, fibrose e aqueles fatores envolvidos na modulação desse processo. Após uma reação inflamatória aguda e crônica a um insulto específico, uma infecção parasítica, ou uma resposta autoimune, fatores fibrogênicos são expressos e secretados desse modo levando à ativação de fibroblastos e ceratinócitos. Esses fatores fibrogênicos incluem, dentre outros, TGF-β, IL-Ιβ, IL-Ια, ΜΟΒ, TGF-a, IL-4, IL-13, bFGF, TNF-a e PDGF-BB. Talvez as duas citocinas mais importantes dessas sejam: TNF, que é mitogênica para fibroblastos e promove angiogênese e é secretada por macrófagos, mastócitos, e T linfócitos, e TGF-α, que é mitogênica para ceratinócitos e fibroblastos, estimula migração de ceratinócito e é secretada por macrófagos, T linfócitos, e ceratinócitos. 0 estágio envolvendo secreção de TGF e TNF marca a transição a partir da fase inflamatória do processo de cura de ferimento para o processo de reconstrução de tecido, isto é, a fase proliferativa.

Após ativação, fibroblastos secretam IL-6, que em combinação com TGF-β, leva a uma proliferação dos fibroblastos. TGF-β também promove diferenciação de fibroblastos. 0 resultado desses processos de proliferação e diferenciação é um aumento geral em colágeno, fibronectina, TIMPs, MMPs, bem como outras proteínas de ECM, que leva a um aumento na produção de ECM e uma diminuição em movimento de ECM.

A presente invenção se baseia na descoberta inesperada de que as construções de fusão reveladas, isto é, proteínas de TIMP ou mutantes das mesmas, fundidas em uma fixação de GPI, uma fixação de GPI-mucina ou uma fixação de GPI-fractalkine podem ser utilizadas como um agente potente para influenciar o nível de expressão e/ou atividade das citocinas e outras enzimas importantes envolvidas no processo de cura de ferimento. Desse modo, a presente invenção oferece agentes regenerativos eficazes e métodos para controlar o processo de cura de ferimento (por exemplo, para influenciar, inibir ou evitar a formação de tecido de cicatriz) e para tratar outras disfunções conhecidas associadas ao processo de cura de ferimento.

Cura anormal de ferimento

Quelóide e cicatrização hipertrófica são caracterizadas por um acúmulo de colágeno em excesso e são distinguíveis entre si por sua aparência física. As cicatrizes tanto de quelóide como hipertrófica são ferimentos que cura de forma excessiva externos à superfície da pele. Uma cicatriz de quelóide continua tipicamente a aumentar além do tamanho e formato do ferimento, enquanto uma cicatriz hipertrófica aumenta dentro dos limites físicos do ferimento original. A cicatrização hipertrófica é genericamente observável logo após a lesão de ferimento, ao passo que cicatrizes de quelóide podem se formar tão tarde quanto um ano após o momento da lesão. Entretanto, quase todas as ocorrências de cicatrização anormal são associadas a insultos fisiológicos incluindo tatuagens, queimaduras, injeções, mordidas, vacinações, trauma, cirurgia ou infecção. Cicatrizes hipertróficas e quelóides tanto podem ser descritas como variações do processo típico de cura de ferimento. Em um ferimento típico, os processos anabólico e catabólico obtêm equilíbrio aproximadamente 6-8 semanas após a lesão original. Durante maturação da cicatriz, a resistência à tração da pele melhora à medida que as fibras de colágeno são progressivamente reticuladas. Nesse ponto, a cicatriz é normalmente hiperêmica e pode ser espessada. Entretanto, o tecido inicial da cicatriz tende a baixar gradualmente durante um período de meses fornecendo cicatriz mais madura que é tipicamente plana, branca, flexível e possivelmente de aparência estirada. Quando há desequilíbrio entre as fases anabólica e catabólica do processo de cura de ferimento, mais colágeno é produzido do que é degradado, e a cicatriz pode crescer portanto em todas as direções.

Um método único, ótimo para tratar tecido de cicatriz de quelóide e hipertrófica não foi ainda desenvolvido, desse modo a taxa de recorrência dessas cicatrizes anormais é significativa.

Em resumo, citocinas e enzimas específicas, incluindo as MMPs e TIMPs, desempenham um papel crucial no processo de cura de ferimento e na formação de tecido de cicatriz. Além disso, uma expressão anormal nos níveis de MMPs e citocinas é freqüentemente associada à cura de ferimento anormal.

Desse modo, a presente invenção oferece agentes regenerativos eficazes e métodos para controlar o processo de cura de ferimento e/ou para tratar disfunções comumente associadas à cura de ferimento. Especificamente, as construções de fusão da presente invenção podem ser utilizadas para controlar, alterar, inibir ou mesmo evitar, eficazmente, esses processos indesejáveis. As construções de fusão da presente invenção podem ser formuladas como um produto farmacêutico e administradas no sitio de lesão. Em uma modalidade, o sitio de lesão é criado por cirurgia, queimadura, injeção, mordida, vacinação, trauma, cirurgia ou infecção. Em outra modalidade, a construção de fusão utilizada para a preparação do medicamento a ser aplicado ao sitio de lesão é selecionada a partir do grupo que consiste em TIMP-1-GPI, TIMP-2-GPI, TIMP-3-GPI, TIMP-4-GPI, TIMP-l-muc-GPI, TIMP-2-muc-GPI, TIMP-3-muc-GPI e TIMP-4- muc-GPI ou mutantes dos mesmos.

Formulações das construções de TIMP e modos de administração

Composições farmacêuticas baseadas nas construções de TIMP da presente invenção podem ser formuladas em um modo convencional utilizando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Técnicas e formulações podem ser genericamente encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para fins de injeção, os compostos da invenção podem ser formulados em uma solução líquida, preferivelmente em um tampão fisiologicamente compatível como uma solução de Hank ou solução de Ringer. Além disso, os compostos podem ser formulados em forma sólida e redissolvidos, ou suspensos imediatamente antes do uso. Formas liofilizadas são também apropriadas.

Além dessas formulações, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Essas formulações de depósito de longa ação podem ser administradas por implantação (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular) ou por injeção. Desse modo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos apropriados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou como uma resina de permuta de íons, ou como um derivado pouco solúvel, como um sal pouco solúvel. Outros sistemas de fornecimento apropriados incluem microesferas, que oferecem a possibilidade de um fornecimento local e não invasivo de drogas durante um período prolongado de tempo. Essa tecnologia específica utiliza microesferas tendo um tamanho pré-capilar que podem ser injetadas através de um cateter coronário em qualquer parte selecionada de um tecido, por exemplo, o coração ou outros órgãos, sem causa inflamação resultante ou isquemia. A terapêutica administrada é lentamente liberada a partir des sas microesferas e prontamente absorvida por células presentes no tecido circundante (por exemplo, células cancerosas ou lesionadas).

Para administração tópica, os oligômeros da invenção podem ser formulados em ungüentos, pomadas, géis, ou cremes genericamente conhecidos na técnica. Uma solução de lavagem contendo o oligômero pode ser utilizada localmente para tratar uma lesão ou inflamação ou para acelerar genericamente o processo de cura.

As construções de TIMP da presente invenção podem ser combinadas ao preparar um medicamento, de modo que o medicamento resultante compreenda mais de uma, preferivelmente duas, e ainda mais preferivelmente três construções de TIMP diferentes. Com essa abordagem, as bioatividades amplificadas e novas dos diferentes membros da família de TIMP podem ser preferencialmente combinadas e direcionadas à superfície de célula, o que pode levar a um efeito sinergista. Por exemplo, as construções de fusão de TIMP-I inibem a maioria das MMPs, exceto MMP-2 e MMPl4. Portanto, qualquer uma das construções de TIMP-I pode ser combinada com qualquer uma das construções de TIMP-2 ou TIMP-4 os quais ambos inibem preferencialmente MMP-2. Portanto, por meio dessa combinação, uma inibição mais completa da família de MMP pode ser obtida.

Em uma modalidade, as formulações da presente invenção compreendem, portanto, uma construção de TIMP-I ou uma construção de TIMP-2 e/ou uma de TIMP-4. Em uma modalidade preferida, a formulação compreende uma construção de TIMP-I selecionada do grupo que consiste em uma TIMP-I-GPI truncada como codificado pela SEQ ID NO: 1, uma TIMP-l-frac-GPI truncada como codificado por SEQ ID NO: 5, e uma TIMP-l-muc-GPI truncada como codificado por SEQ ID NO: 2, e uma construção TIMP-2 e/ou TIMP-4. Preferivelmente, a construção de TIMP-2 é codificada pela SEQ ID NO: 3.

Em uma modalidade adicional, a formulação compreende uma construção de TIMP-3 da presente invenção, pref erivelmente aquela codificada por SEQ ID NO: 4, que inibe TACE juntamente com pelo menos uma das construções de TIMP selecionadas do grupo que consiste em uma TIMP-I-GPI truncada como codificado por SEQ ID NO: 1, uma TIMP-l-frac- GPI truncada, uma TIMP-l-muc-GPI truncada, uma construção TIMP-2 e TIMP-4. Preferivelmente, as construções TIMP-I e TIMP-2 são codificadas por SEQ ID NOS: 1, 2, 3 e 5, respectivamente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Incorporação de TIMP-I-GPI em membranas de célula de RCCs.

A. Para demonstrar reincorporação de proteína de GPI-TIMP-I em membranas de células, TIMP-I-GPI purificado ou rhTIMP-1 de controle foi adicionado a células RCC-26, RCC-53 e A498 nativas. TIMP-I foi detectado na superfície de célula por análise de FACS. Histogramas cinzas são a coloração de controle de isotipo, histogramas de linha cheia representam coloração de anticorpo de TIMP-I. Β. Para demonstrar ligação de GPI após incubação com 200 ng/ml ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPI ou rhTIMP-1, células foram tratadas com 60 ng/ml de PLC e então submetidas à análise de FACS. Histogramas cinzas representam o controle de isotipo.

C. ELISA TIMP-I humano foi utilizado para determinar a quantidade de proteína de TIMP-I liberada a partir de células de RCC tratadas com TIMP-I-GPI (como mostrado em B) após digestão de PLC.

Figura 2. TIMP-I-GPI inibe a liberação de proMMP- 2 e proMMP-9 a partir das células RCC-53.

Zimografia foi utilizado para estudar a secreção de proteínas MMP-2 e MMP-9 a partir de RCC-53. As células foram tratadas com quantidades crescentes de TIMP-1-GPI, ou rhTIMP-1 de controle, e após 48 h o sobrenadante de cultura isento de soro foi removido e analisado por zimografia de gelatinase.

Figura 3. Expressão de superfície de MMPs após tratamento com TIMP-I-GPI.

Após incubação de células de RCC-53 com 700 ng/ml de proteína TIMP-I-GPI por 24 h FACS foi executado utilizando anticorpos específicos dirigidos contra: (A) TIMP-1, MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8 e MMP-9, ou (B) MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-16, HLA-A2 (HB82), pan HLA classe I (W6/32) e ICAM-1. Como controle adicional, o TIMP- I-GPI foi clivado a partir da superfície após uma hora por tratamento com PLC (vide a figura 1) . Histogramas cinzas são a coloração de controle de isotipo, histogramas de linha cheia representam amostras tratadas com TMP-I-GPI.

C. A secreção de uma série de MMPs a partir de RCC53 foi testada utilizando Western blot e anticorpos monoclonais dirigidos contra MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-12 e MMP-13. Meios de cultura (isentos de soro) foram tirados 24 horas após o tratamento de RCC-53 com 700 ng/ml de rhTIMP-1 ou TIMP-I-GPI e comparados com células de controle não tratadas.

D. O efeito de seqüestro de superfície de célula de MMPs em invasão de RCC-53 através de Matragel

A membrana de embasamento modelo foi avaliada. A migração ótima das células de RCC-53 para VEGF (4 ng/ml) foi definida como linha de base ou "zero" e o valor de inibição de 100% definido para o valor de migração visto para células RCC-53 não tratadas sem sinal de VEGF. As células RCC-53 foram pré-tratadas com 350 ng/ml ou 700 ng/ml de rhTIMP-1 ou TIMP-I-GPI. Após uma hora as células foram lavadas e aplicadas na câmara de migração. 0 efeito sobre a migração foi então avaliado. Os dados apresentados 15 representam uma média de quatro cavidades e dois

experimentos.

Figura 4. Efeito de proteína rhTIMP-1- e TIMP-I- GPI sobre a proliferação das linhagens de RCC

O efeito de níveis crescentes de proteína de controle rhTIMP-1 ou TIMP-I-GPI sobre a proliferação de RCC-53 (A), A498 (B) e RCC-26 (C) foi medido utilizando um ensaio de MTT. MTT foi adicionado após 24 h, 48 h ou 72 h como indicado.

Figura 5. TIMP-I-GPI não influencia suscetibilidade de RCC a apoptose mediada por perforin

Células de RCC foram deixadas sem tratamento (■), tratadas com 700 ng/ml de TIMP-I-GPI (0) ou proteína de rhTIMP-1 (o) por 24 h e incubadas com CTL JB4 (A) ou linhagens de NK (B) NKL para RCC-53 e A498, ou NK-92 para RCC-26). São mostrados exemplos representativos de três experimentos independentes com resultados similares. Figura 6. TIMP-I-GPI não aumenta a expressão de FAS porém torna as células sensíveis a apoptose induzida por FAS

A. Células RCC-53, RCC-26 ou A498 foram tratadas ou não tratadas com 700 ng/ml de TIMP-I-GPI ou rhTIMP-1 por 24 h., e foram coloridas com FAS anti-humano (L-958) e analisadas em relação à expressão de superfície de FAS por citometria de fluxo. Colorações de controle de isotipo de anti corpo itionoclonsl são mostradas como histogramas cinzas.

As três linhagens de células RCC foram tratadas com TIMP-I-GPI ou rhTIMP-1 seguido por incubação de L-957. A ligação de anexin V-fluoroisotiocianato (FITC) foi utilizada para detectar apoptose viável e prematura por citometria de fluxo.

O baixo nível de apoptose nas células RCC-53 em (B) foi verificado utilizado um ELISA de nucleossoma citoplasmático mais sensíveis. Os níveis crescentes de apoptose foram detectados após incubação de L-957 com níveis crescentes de TIMP-I-GPI porém não rhTIMP-1.

Figura 7. Expressão de BAX e BCL-2 em RCCs após tratamento com TIMP-I-GPI ou rhTIMP-1, analisada por coloração FACS interna e Western blot.

Células RCC-53 (A), RCC-26 (B) e A498 (C) foram pré-incubadas com TIMP-I-GPI ou rhTIMP-1 por 24 h., a seguir tratadas com L-957 ativando anticorpo FAS por um período adicional de 16 h. As células foram então analisadas com anticorpos monoclonais anti-BCL-2 e anti-BAX utilizando citometria de fluxo. Em paralelo proteínas foram extraídas e medidas por Western blot. Os sinais derivados a partir de BAX e BCL-2 foram normalizados para níveis de β- actina após densitometria. Os resultados de FACS são apresentados como histogramas com valores em parênteses correspondendo a MHI de BCL-2 ou BAX ou anticorpos de isotipo correspondentes.

Figura 8: visão geral de remodelagem de tecido e fibrose

Um diagrama esquemático representando a interação complexa de fatores envolvidos no equilíbrio delicado de produção de ECH e movimento durante o processo de cura de ferimento.

Figura 9: Efeito de construções de fusão de TIMP sobre produção de fibronectina de fibroblastos na presença de rhTIMP-1

Fibroblastos confluentes foram cultivados na presença ou ausência de rhTIMP-1 e TIMP-1-GPI; fibronectina expressa e secretada foi quantificada por análise de Western blot utilizando anticorpos anti fibronectina (β- actina serviu como controle). rhTIMP-1 (em 700 ng/ml) não levou a nenhuma diminuição significativa em expressão de fibronectina, enquanto TIMP-I-GPI (em 700 ng/ml) reduziu fortemente a fibronectina que foi secretada pelos fibroblastos.

Figura 10. Efeito de construções de fusão de TIMP sobre produção de fibronectina de fibroblastos na presença de TNF-a

Fibroblas tos foram cultivados na presença (figura 10A) ou ausência (figura 10B) de 10 ng/ml de fibroblasto ativando TNF-α juntamente com 350 ng/ml de TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMPI-1-GPI desnaturado e rhTIMP- I-GPI, respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-I-GPI, o RNA de fibronectina transcrito foi significativamente reduzido, independentemente de se TNF-a estava presente no meio. Figura 11. Efeito de construções de fusão de TIMP na produção de IL-6 de fibroblastos

RNA de fibronectina como transcrito por fibroblastos foi avaliado por análise Northern blot, utilizando uma sonda para IL-6 RNA. Desse modo, fibroblastos foram cultivados na presença (figura 11A) ou ausência (figura 11B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-α juntamente com 350 ng/ml de TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPI, TIMP-I-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP- I-GPI, o IL-6 RNA transcrito foi surpreendentemente reduzido, independentemente de se TNF-α estava presente no meio.

Figura 12. Efeito de construções de fusão de TIMP sobre a produção de colágeno de fibroblastos

RNA de fibronectina, como transcrito por fibroblastos, foi avaliado por análise de Northern blot, utilizando sondas para Colágeno IAl (figura 12A e Β) , Colágeno 4A2 (figura 12C e D) , e Colágeno 16A1 (figura 12E e F), respectivamente. Desse modo, fibroblastos foram cultivados na presença (figuras 12A, C, E) ou ausência (figura 12B, D, F) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF- α juntamente com 350 ng/ml de TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPI, TIMP-I-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP- I-GPI, todos os três RNAs de colágeno transcritos foram significativamente reduzidos, independentemente de se TNF-α estava presente no meio.

Figura 13. Efeito de construções de fusão de TIMP sobre a produção de TGF-β de fibroblastos

RNA de fibronectina como transcrito por fibroblastos foi avaliado por análise de Northern blot, utilizando sondas para TGF-β. Desse modo, fibroblastos foram cultivados na presença (figura 13A) ou ausência (figura 13B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-a juntamente com 350 ng/ml de TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPI, TIMP-I-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP- I-GPI, quase nenhum RNA de TGF-β pode ser detectado, independentemente de se TNF-α estava presente no meio, e independentemente do teor de FCS do meio.

EXEMPLOS

Nos exemplos a seguir, os efeitos anti-tumor da TIMP fixada por GPI em células de câncer são descritos em mais detalhe. Embora os experimentos descritos sejam realizados com TIMP-I humana, a invenção não será limitada a esse tipo de TIMP.

Nos exemplos a seguir, uma fixação por GPI foi fundida com TIMP-I para focar concentrações definidas dessa proteína inibidor na superfície de três linhagens de células de carcinoma de células renais (RCC) (RCC-26, RCC- 53 e A4 98) independentemente de interações de proteína- proteína de superfície de célula. Como mostrado a seguir, TIMP-I-GPI adicionado de forma exógena inseriu eficientemente na membrana de célula de RCC e alterou dramaticamente a associação de MMPs com a superfície de célula. O tratamento com TIMP-I-GPI inibiu a proliferação de RCC e tornou as células RCC normalmente resistentes a FAS sensíveis à apoptose induzida por FAS porém não alterou a Iise mediada por perforin por células efetoras citotóxicas. A sensibilidade aumentada de apoptose mediada por FAS correlacionou com uma alteração no equilíbrio de proteínas da família BCL-2 pró- e anti-apoptótica. As linhagens de células RCC-26 (Schendel e outros, 1993) e RCC-53 foram estabelecidas a partir de pacientes locais com carcinomas de célula clara estágio I e estágio IV, respectivamente. Desse modo, representam os dois extremos clínicos de RCC. CTL de infiltração de tumor foi isolado do tumor dos dois pacientes. Embora essas células efetoras de ocorrência natural fossem incapazes de controlar o crescimento de tumor in vivo, a coloração de marcador de superfície de RCC-26 e RCC-53 revelou boa expressão de superfície de MHC classe I, e as duas linhagens foram mostradas como induzindo CTL específico de anti-tumor e alo in vitro (Schendel e outros, 2000) e DJS, observação não publicada). A498 foi originalmente isolado a partir do tumor de um homem com 52 anos de idade e é um exemplo bem estudado de RCC (Giard e outros, 1973).

Exemplo 1

Incorporação de TIMP-I-GPI adicionado de forma exógena na superfície de RCC-53

A proteína de TIMP-I fixada por GPI foi gerada e isolada como anteriormente descrito (Djafarzadeh e outros, 2004). A incorporação de proteína de GPI-TIMP-I purificada nas membranas de superfície de linhagens de células RCC RCC-53, RCC-26 ou A498 foi demonstrada por incubação das linhagens de células com 700 ng/ml de TIMP-I-GPI ou proteína de controle (rh)TIMP-I humano recombinante por uma

h. A proteína de TIMP-I associada à superfície foi então detectada utilizando FACS (figura 1). A adição de rhTIMP-1 de controle não levou à alteração no deslocamento de FACS, entretanto, TIMP-I fixado por GPI resultou em um sinal de superfície forte para TIMP-I.

Para demonstrar que a proteína adicionada de forma exógena foi fixada por GPI, células de RCC-53 foram primeiramente incubadas com proteína de TIMP-I-GPI (200 ou 700 ng/ml) e então tratadas com 60 ng/ml de fosfolipase C (PLC) . A análise de FACS demonstrou a perda total de sinal de superfície de célula TIMP-I após digestão de PLC (figura 1B). Para medir a eficiência de integração de TIMP-1-GPI, a TIMP-I liberada da membrana foi coletada nos tampões de lavagem, e quantificada utilizando ELISA específico de TIMP-I- (figura 1C). Os resultados mostram que 66% do antígeno de TIMP-I de partida foram recuperados a partir de amostra de 200 ng/ml, enquanto 31% poderiam ser recuperados a partir da incubação de 700 ng/ml.

Exemplo 2

Proteína de TIMP-I-GPI bloqueia a liberação de proMMP-2 e proMMP-9 a partir de RCC-53

Uma expressão aumentada de MMP-2 e MMP-9 correlaciona com um prognóstico ruim de RCC (Hemmerlein e outros, 2004). A linhagem de células de carcinoma de células claras estágio IV RCC-53 secreta de forma constitutiva tanto proMMP-2 como proMMP-9 (figura 2) . 0 efeito de aumento de níveis de TIMP-I em superfície na liberação constitutiva de proteínas de MMP-2 e MMP-9 foi testado utilizando ensaios de zimografia de gelatinase (Djafarzadeh e outros, 2004; Klier e outros, 2001). A proteína rhTIMP-1 em 600 ou 1200 ng/ml não teve efeito sobre secreção de proMMP-2 ou proMMP-9. Ao contrário, iniciando em 10 ng/ml, o tratamento com TIMP-I-GPI mostrou uma diminuição dependente de concentração da liberação tanto de proMMP-2 como de proMMP-9 no meio de crescimento.

Exemplo 3

Tratamento com TIMP-I-GPI leva a aumento em expressão superficial de metaloproteinases de matriz

Com base nos resultados dos experimentos de zimografia de gelatinase, é possível que TIMP-I-GPI possa atuar para seqüestrar MMPs na superfície de célula. TIMP-I liga formas mais ativas de MMPs, as exceções sendo MMP-14 e MMP-I6 (Brew e outros, 2000; Lang e outros, 2004). Após incubação de RCC-53 com 700 ng/ml de proteína de TIMP-I-GPI por 24 h., as análises de FACS utilizando corpos específicos de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9,

MMP-12, MMP-13,MMP-14 MMP-15 e MMP16 mostraram, com a exceção de MMP-14, um aumento em intensidade média de f luorescência de canal (MFI) para cada uma das MMPs. A proteína de controle de rhTIMP-1 não teve efeito óbvio sobre o sinal de FACS (dados não mostrados). A expressão de superfície de outras proteínas incluindo MHC classe I (pan classe I e HLA-A2) e.ICAM-I não foi efetuada por tratamento com TIMP-I-GPI. Digestão do RCC53 tratado com TIMP-I-GPI com PLC após uma hora (como executado na figura 1) não mostrou aumento em MMPs (figura 3A e 3B). O acúmulo de MMPs na superfície da célula espelhou a redução em secreção de proMMP-2 e proMMP-9 mostrados na figura 2. Para testar adicionalmente esse bloqueio aparente de liberação de MMP, experimentos de Western blot foram executados utilizando anticorpos monoclonais dirigidos contra MMP-1, MMP-3, MMP- 7, MMP-8, MMP-12 e MMP-13 em meios (isentos de soro) derivados de células de RCC53 de controle ou células tratadas 24 horas com 700 ng/ml de rhTIMP-1 ou TIMP-I-GPI (figura 3C) . A presença de cada uma das MMPs foi detectada no meio a partir das células de RCC-53 de controle. A incubação com rhTIMP-1 não eliminou a secreção das MMPs. Ao contrário, TIMP-I-GPI pareceu bloquear totalmente a liberação de cada MMP estudado.

Para avaliar o efeito desse acúmulo superficial de MMPs sobre a capacidade das células invadirem ECM, a capacidade de migração/invasão das células foi testada utilizando um ensaio de câmara Boyden modificada com membranas revestidas com ECM. A capacidade geral das células de RCC-53 invadirem ECM não foi muito acentuada (dados não mostrados). Para aumentar a invasão, os níveis crescentes de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foram aplicados nas cavidades inferiores e os experimentos foram feitos por 48 h. Uma resposta de invasão ótima foi vista em 4 ng/ml de VEGF (dados não mostrados) e essa resposta foi ajustada como invasão de linha de base, ou zero % de inibição (figura 3D) . Células de RCC-53 pré- tratadas por 30 minutos com 350 ou 700 ng/ml de rhTIMP-1, ou TIMP-I-GPI foram então lavadas, e aplicadas na cavidade superior da câmara Boyden. O aumento ou diminuição relativo em migração/invasão foi então determinado (vide Materiais e Métodos). Embora o tratamento com rhTIMP-1 bloqueasse parcialmente a invasão das células, TIMP-GPI em 700 ng/ml bloqueou totalmente a invasão das células RCC-53 (figura 3D).

Exemplo 4

TIMP-I fixada por GPI efetua proliferação de RCC

Para avaliar o efeito de engenharia de superfície de TIMP-I sobre a proliferação de RCC. Ensaios de MTT foram executados. Verificou-se que a proteína de TIMP-I-GPI adicionada de forma exógena elicia uma diminuição dependente de dose na proliferação de RCC-53 e A498 em 24, 48 e 72 horas (figura 4b) . Células de RCC-26 proliferam extremamente lentamente (taxa de duplicação 48+ h) e a tendência geral sugeriu uma supressão de proliferação (figura 4C). Controles adicionais utilizando fosfatidilinositol em uma concentração molar igual ao reagente TIMP-I-GPI (Sigma, Alemanha, no. P6636) não levou a alterações significativas em proliferação das células (dados não mostrados).

Exemplo 5

Citotoxicidade mediada por células A atividade de MMP foi ligada à sensibilidade de células alvo à apoptose induzida por atividade de célula T citotóxica (apoptose mediada tanto por perforin/granzima como FAS) (Egeblad & Werb, 2002) . O efeito de TIMP-I-GPI sobre extermínio de RCC dependente de células foi testado utilizando apoptose induzida por células NK e CTL alogeneicas. Nos ensaios mediados por CTL alogeneicos, células alvo RCC-53, A498 e RCC-26 foram tratadas com 700 ng/ml de rhTIMP-1 ou TIMP-1-GPI, a seguir rotuladas com Cr51 e incubadas com CD8+ CTL JB4 alogeneicas (figura 5A) ou linhagens de células NK (figura 5B) . As linhagens de células de tumor RCC foram reconhecidas e efetivamente exterminadas por células tanto CTL como NK. O tratamento com TIMP-I ou TIMP-I-GPI não alterou a suscetibilidade das três linhagens de RCC à apoptose mediada por células CTL ou NK.

Exemplo 6

O tratamento com TIMP-GPI torna RCC sensível a extermínio mediado por FAS

Os experimentos com CTL/NK mostraram que o tratamento com TIMP-I-GPI não influenciou a via lítica mediada por perforin/granzima medida no ensaio de liberação de cromo. Essa via atua rapidamente utilizando a secreção de citotoxinas armazenadas para iniciar apoptose e representa um dos dois principais mecanismos de morte de células imunes-iniciados (Trapani e outros, 2000). A segunda via envolve ligação de FAS/CD95. 0 efeito de tratamento com TIMP-I-GPI sobre apoptose mediada por FAS foi então determinado.

A expressão de FAS sobre as linhagens de RCC foi primeiramente determinada por citometria de fluxo utilizando um mAB anti-FAS de não ativação (L-958) (H. Engelmann resultados não publicados). Células não tratadas e células tratadas com 700 ng/ml de TIMP-I-GPI ou proteína de controle de rhTIMP-1 por 24 horas foram coloridas com L- 958 e analisadas. A proteína de FAS foi fortemente expressa por todas as três linhagens de RCC. O tratamento com TIMP- I-GPI ou rhTIMP-1 não afetou a expressão superficial da célula de FAS (figura 6A).

O mAB anti-FAS L-957 pode induzir apoptose em células que expressam FAS (H. Englemann, resultados não publicados). A ligação de V-fluoroisotiocianato de anexina (FITC) e incorporação de iodeto de propídio (PI) em células de RCC após tratamento com L-957 foi utilizada para detectar apoptose por citometria de fluxo. Como demonstrado na figura 6B, RCC-26 e RCC-53 foram muito resistentes a apoptose mediada por FAS. A intensidade de fluorescência (MFI) de células tratadas com L-957 e não tratadas foi similar. Um leve aumento em MFI foi visto na RCC-53 em resposta ao tratamento com L-957. Essas observações estão em linha com relatórios anteriores que RCC é genericamente resistente a apoptose mediada por FAS (Frost e outros, 2003). O tratamento com TIMP-I-GPI (L-957+TIMP-1-GPI) , porém não rhTIMP-1 de controle (L-957+rhTIMP-l) , tornou as linhagens de células sensíveis à apoptose mediada por FAS (figura 6B) . Verificou-se que A498 é mais sensível à mAB anti-FAS de ativação (detectado por anexina-MFI aumentada em amostras tratadas com L-957). 0 tratamento com TIMP-I- GPI, porém sem rhTIMP-1, aumentou significativamente a apoptose das células A498.

Embora as células RCC-26 e A498 mostrassem um aumento dramático em apoptose induzida por FAS após tratamento com TIMP-1-GPI, a linhagem de células RCC-53 mostrou um aumento menos acentuado em sensibilidade (mudança em MFI de 62 para 93) . Para confirmar a apoptose induzida por FAS/TIMP-1-GPI de RCC-53, um segundo ensaio ELISA com base na detecção de cromatina citoplásmica foi empregado. As vantagens desse ensaio incluem a falta de subjetividade em interpretar os resultados e sua sensibilidade aumenta em relação à coloração de anexina V.

ELISA de cromatina é capaz de detectar um número tão pequeno quanto 300 células apoptóticas e mede eventos de apoptose consideravelmente a jusante a partir da presença prematura de anexina V na superfície da célula. Como foi verificado na análise FACS de anexina V (figura 6B) , o tratamento de RCC-53 com L-957 individualmente induziu um leve aumento em apoptose (figura 6C). Entretanto, o tratamento de células RCC-53 com TIMP-I-GPI aumentou dramaticamente a sensibilidade das células a apoptose induzida por anti-FAS em um modo dependente de dose.

Os resultados demonstram que tratamento de células de câncer com TIMP fixado por GPI efetua extermínio das células de câncer por apoptose induzida por FAS. Portanto, TIMP fixado por GPI é útil como agente anti- tumor.

Exemplo 7

Tratamento com TIMP-I-GPI de RCC reduz BCL-2 e aumenta expressão de proteína BAX

As proteínas BCL-2 representam uma família de proteínas envolvidas no controle de apoptose (examinado em Igney & Krammer, 2002). Alguns membros dessa família (como BCL-2 e BCL-XL) são anti-apoptóticos, enquanto outros (como Bad ou ΒΑΧ) são pró-apoptóticos. A sensibilidade de células a estímulos apoptóticos pode depender do equilíbrio entre membros de família BCL-2 pró- e anti-apoptóticos (Igney & Krammer, 2002) . O efeito de tratamento com TIMP-I-GPI sobre a expressão de BCL-2 e BAX foi então determinado. Após uma pré-incubação de 24 h com 700 ng/ml de TIM-I-GPI ou controle de rhTIMP-1, células de RCC foram estimuladas com 1 ig/ml de L-957 (ou mAB de controle) por um período adicional de 16 h. 0 nível de BCL-2 e proteína BAX foi então determinado utilizando FACS intracelular e Western blot. Em todas as três linhagens de células, o tratamento com TIMP-1GPI aumentou a expressão de BAX pró-apoptótica, e diminuiu a expressão de BCL-2 anti-apoptótica. Um padrão similar foi visto em ensaios de Western blot (figura 7A, B e C).

Exemplo 8

Incorporação de TIMP-l-mucina-GPI adicionada de forma exógena na superfície de RCC-53

A proteína TIMP-l-mucina-GPI foi gerada, e isolada como descrito no exemplo 1. A incorporação de proteína GPI-TIMP-I purificada nas membranas de superfície de linhagens de células RCC RCC-53, RCC-26 ou A498 foi demonstrada por incubação das linhagens de células com 700 ng/ml de TIMP-mucina-GPI purificado ou proteína de controle (rh)TIMP-I humano recombinante por uma hora. A proteína TIMP-l-mucina-GPI associada à superfície foi então detectada utilizando FACS. A construção de TIMP-l-mucina- GPI foi eficientemente incorporada na membrana de superfície e promove efetivamente a atividade anti-tumor.

Exemplo 9

TIMP-GPI para o tratamento de câncer residual em um indivíduo

O reagente TIMP-I-GPI ou TIMP-mucina-GPI é aplicado em 1 μg/ml localmente na área de ressecção após excisão cirúrgica de tumor. Um tumor inoperável, glioblastoma (astrocitoma grau IV WHO) é removido cirurgicamente e os reagentes são instalados antes do fechamento do ferimento.

Exemplo 10 TIMP-GPI para o tratamento de câncer residual em um indivíduo

Uma quantidade de 1 μς/πιΐ de reagente de TIMP-I- GPI ou TIMP-mucina-GPI é aplicada localmente na área de ressecção após excisão cirúrgica de tumor. Um tumor, câncer de mama em estágio avançado, é removido cirurgicamente e os reagentes são instalados antes do fechamento do ferimento, particularmente se houver um risco clínico de relapso local.

Exemplo 11

Avaliação de TIMP-GPI em modelos de metástase de tumor

O efeito de TIMP-I-GPI sobre metástase de tumor foi avaliado. Utilizando um modelo murino, um linfoma de célula T que eficientemente faz metástase no fígado foi pré-tratado com TIMP-I-GPI ou proteína de controle de rhTIMP-1. O tumor resultante foi então administrado através da veia da cauda, e a distribuição do tumor no fígado foi determinada três e sete dias após. Os resultados demonstram que células tratadas com TIMP-I-GPI mostram um nível significativamente reduzido de micrometástase em relação às células de controle tratadas com TIMP.

Exemplo 12

Ensaios de invasão Matrigel

O efeito de TIMP-I-GPI sobre as linhagens de células de tumor do Exemplo 11 foi ensaiado em uma série de experimentos Matrigel. Os resultados confirmaram que TIMP- I-GPI teve um efeito profundo sobre a capacidade das células de linhagem de tumor de células T serem submetidas à invasão de Matrigel em relação a rhTIMP-1.

Exemplo 13

Efeito de construções de fusão de TIMP sobre produção de fibroblastos, por fibronectina Fibroblastos confluentes foram cultivados na presença ou ausência de rhTIMP-1 e TIMP-I-GPI. Fibronectina expressa e secretada foi quantificada por análise Western blot utilizando anticorpos anti-fibronectina (β-actina serviu como controle). A figura 9 representa os resultados desse experimento e demonstra claramente que rhTIMP-1 (em 700 ng/ml) não levou a nenhuma diminuição significativa em expressão de fibronectina, enquanto TIMP-I-GPI (em 700 ng/ml) reduziu fortemente a fibronectina que foi secretada pelos fibroblastos.

Adicionalmente, RNA de fibronectina transcrito por fibroblastos foi avaliado por análise de Northern blot. Fibroblastos foram cultivados na presença (figura 10A) ou ausência (figura 10B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-a juntamente com 350 ng/ml de TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPI, TIMP-I-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Além disso, 0%, 1%, 5% ou 10% de FSC estavam presentes no meio de cultura.

Esses resultados demonstram claramente que em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, o RNA de fibronectina transcrito foi significativamente reduzido, independentemente de se TNF-α estava presente no meio ou não, e independentemente do teor de FCS do meio. Em 700 ng/ml de TIMP-I-GPI, RNA de fibronectina foi raramente detectável.

Desse modo, a construção de fusão de TIMP-GPI inibe eficientemente tanto a síntese como a secreção da fibronectina de fator de crescimento em fibroblastos.

Exemplo 14

Efeito de construções de fusão de TIMP sobre a produção de fibroblastos por IL-6 A análise de Northern blot do exemplo 13 foi repetida utilizando uma sonda para RNA IL-6. Desse modo, fibroblastos foram cultivados na presença (figura 11A) ou ausência (figura 11B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-α juntamente com 350 ng/ml TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPI, TIMP-I-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Além disso, 0%, 1%, 5% ou 10% de FSC estavam presentes no meio de cultura (figura 11) .

Os resultados demonstram claramente que já em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-I-GPIf o RNA de IL-6 transcrito foi surpreendentemente reduzido, independentemente de se TNF-α estava presente no meio ou não, e independentemente do teor de FCS do meio.

Desse modo, a construção de fusão de TIMP-GPI inibe eficientemente tanto a síntese como a secreção ainda de outra citocina importante envolvida na cura de ferimento, a saber IL-6, em fibroblastos.

Exemplo 15

Efeito de construções de fusão de TIMP sobre produção de colágeno por fibroblastos

A análise de Northern blot executada nos Exemplos 13 e 14 foi repetida utilizando sondas para Colágeno IAl (figura 12A e Β), colágeno 4A2 (figura 12C e D), e colágeno 16A1 (figura 12E e F), respectivamente. Desse modo, os fibroblastos foram cultivados na presença (figuras 12A, C,

E) ou ausência (figura 12B, D, F) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-α juntamente com 350 ng/ml de TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPIf TIMP-I-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Além disso, 0%, 1%, 5% ou 10% de FSC estavam presentes no meio de cultura. Os resultados demonstram claramente que já em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, todos os três RNAs de colágeno transcrito foram significativamente reduzidos, independentemente de se TNF-α estava presente no meio ou não, e independentemente do teor de FCS do meio.

Desse modo, a construção de fusão de TIMP-GPI inibe eficientemente a síntese e a secreção de colágeno, que é uma proteína essencial na produção de ECM e remodelagem de tecido.

Exemplo 16

Efeito de construções de fusão de TIMP sobre a produção de fibroblastos, por TGF-β.

A análise de Northern blot dos Exemplos 13 -15 foi repetida utilizando sondas para TGF-β. Desse modo, os fibroblastos foram cultivados na presença (figura 13A) ou ausência (figura 13B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-α juntamente com 350 ng/ml de TIMP-I-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-I-GPI, TIMP-I-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Além disso, 0%, 1%, 5% ou 10% de FSC estavam presentes no meio de cultura.

Os resultados demonstram claramente que já em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-I-GPI, quase nenhum RNA de TGF-β pode ser detectado -independentemente de se TNF-α estava presente no meio ou não, e independentemente do teor de FCS do meio.

Portanto, como ilustrado pelo exemplo acima, a construção de fusão de TIMP-GPI inibe eficientemente a síntese e a secreção ainda de outra citocina importante envolvida na cura de ferimento, a saber TGF-β, em fibroblastos.

Exemplo 17 Geração de construções de fusão de TIMP adicionais

Construções de fusão de TIMP adicionais foram geradas e purificadas de acordo com a seção "Materiais e métodos", fornecida abaixo. Especificamente, uma construção de fusão TIMP-I-GPI truncada (SEQ ID NO: 1), uma construção de fusão TIMP-l-muc-GPI truncada (SEQ ID NO: 2), uma construção TIMP-2-GPI (SEQ ID NO: 3), uma construção TIMP- 3-GPI e uma forma mudada de TIMP-3-GPI (SEQ ID NO: 4), e uma construção de fusão TIMP-l-fractalkine-GPI truncada (SEQ ID NO: 5) foram construídas, expressas e purificadas.

A construção de fusão TIMP-I-GPI truncada (SEQ ID NO: 1) compreende os 152 primeiros aminoácidos de proteína TIMP-I humana (isto é, os aminoácidos terminais-C 126-207 foram deletados) fundidos com uma fixação de GPI de 36 aminoácidos de comprimento. A construção de fusão de TIMP- 1-muc-GPI truncada (SEQ ID NO: 2) contém os 152 primeiros aminoácidos da proteína TIMP-I humana fundidos com aminoácidos 256-280 de CXCR16 humano (mucina) adicionalmente fundido com uma fixação de GPI de 36 aminoácidos em comprimento. A construção de fusão resultante contém 295 aminoácidos e tem um peso molecular de 32.111 kDa.

Por analogia ao TIMP-I-GPI de comprimento total, o TIMP-2-GPI (SEQ ID NO: 3) e TIMP-3-GPI consistem em proteína TIMP-2 e TIMP-3 humana, respectivamente, fundida com uma fixação de GPI de 36 aminoácidos em comprimento. Para produzir a forma mudada da construção de fusão de TIMP-3-GPI (SEQ ID NO: 4), o domínio de ligação de GAG do TIMP-3 humano, que se pensa ser responsável por associação da proteína com a superfície de célula, foi mudado pelas seis trocas a seguir: R43A, K45A, K49A, K53A, K65A e K68A. A construção de fusão de TIMP-l-fractalkine-GPI truncada (SEQ ID NO: 5) contém a porção terminal-N do TIMP-I humano (aminoácidos 1-152) fundido com aminoácidos 100-342 do CX3CL1 humano, adicionalmente fundido com a fixação de GPI de 36 aminoácidos de comprimento.

Exame detalhado de construções de TIMP-1-GPI truncada (SEQ ID NO: 1), TIMP-l-mucina-GPI truncada (SEQ ID NO: 2) e TIMP-1-fractalkine-GPI truncada (SEQ ID no. 5)

a) Incorporação de TIMP-I-GPI truncada adicionada de forma exógena, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-I- fractalkine-GPI truncada na superfície celular TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-1-fractalkine-GPI truncada foram geradas e isoladas de acordo com Djafarzadeh e outros, 2004. A incorporação de construções de fusão purificadas nas membranas de superfície de células de linhagens de células de RCC RCC- 53, RCC-2 6 ou A4 98 é demonstrada por incubação das linhagens de células por uma hora com 700 ng/ml de TIMP-1- GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-1- fractalkine-GPI truncada, respectivamente, e comparadas com aquela da proteína de TIMP-1 de controle, TIMP-1-truncada, respectiva que não tem domínios de mucina, fractalkine e GPI. Proteína associada à superfície foi então detectada utilizando análise FACS. Esperava-se que a adição de TIMP-1 de controle não conduzisse a nenhuma alteração no deslocamento de FACS, entretanto, a TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-1-fractalkine-GPI truncada, respectivamente, resultaram na realidade, em um sinal de superfície forte para TIMP-1.

Para demonstrar que a proteína adicionada de forma exógena foi fixada por GPI, células de RCC-53 foram primeiramente incubadas com TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1- mucina-GPI truncada e TIMP-1-fractalkine-GPI truncada, respectivamente (200 ou 700 ng/ml) e então tratadas com 60 ng/ml de fosfolipase C (PLC). Esperava-se que a análise de FACS mostrasse uma perda completa de sinal de superfície de célula TIMP-1 após digestão de PLC. Para medir a eficiência de integração das construções de TIMP fixadas, as construções de TIMP-1 liberadas da membrana foram coletadas nos tampões de lavagem, e quantificadas utilizando ELISA específico de TIMP-1. Esperava-se que a maior parte do antígeno TIMP-1 de partida fosse recuperado a partir da amostra de 200 ng/ml.

b) Proteínas de TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1- mucina-GPI truncada e TIMP-l-fractalkine-GPI truncada bloqueiam a liberação de proMMP-2 e proMMP-9 a partir de RCC-53

Uma expressão aumentada de MMP-2 e MMP-9 correlaciona-se tipicamente com um prognóstico ruim de RCC (Hemmerlein e outros, 2004). A linhagem de células de carcinoma de célula clara estágio IV RCC-53 secreta de forma constitutiva tanto proMMP-2 como proMMP-9 (figura 2).

O efeito de aumentar os níveis de TIMP-1 em superfície na liberação constitutiva de proteínas de MMP-2 e MMP-9 foi testado utilizando ensaios de zimografia de gelatinase (Dj afarzadeh e outros, 2004; Klier e outros, 2001). A proteína rhTIMP-1 em 600 ou 1200 ng/ml não teve efeito sobre a secreção de proMMP-2 ou proMMP-9. Ao contrário, iniciando em 10 ng/ml, esperava-se que o tratamento com TIMP-1-GPI truncada, TIMP-l-mucina-GPI truncada e TIMP-1- fractalkine-GPI truncada, respectivamente, mostrasse uma diminuição dependente de concentração da liberação tanto de proMMP-2 como proMMP-9 nos meios de crescimento, comparáveis com o tratamento de TIMP-1-GPI descrito no

Exemplo 2. c) Proteínas de TIMP-I-GPI truncada, TIMP-1- mucina-GPI truncada e TIMP-1-fractalkine-GPI truncada impactam a proliferação de RCC

Para avaliar o efeito de engenharia de superfície de TIMP-1 sobre a proliferação de RCC, ensaios de MTT foram realizados. Esperava-se que as proteínas TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-1-fractalkine- GPI truncada adicionadas de forma exógena, respectivamente, eliciassem uma diminuição dependente de dose em proliferação de RCC-53 e A498 em 24, 48 e 72 horas em comparação com o exemplo 4. Esperava-se que as células RCC- 26 proliferassem extremamente lentamente (48+ h taxa de duplicação); a tendência geral sugeriu realmente uma supressão de proliferação.

Exemplo 18

Avaliação adicional das construções de fusão adicionais do exemplo 17

Os experimentos dos exemplos 1-16 foram repetidos utilizando as construções de fusão do exemplo 17; resultados similares foram esperados. Em particular, as construções de fusão de TIMP-2 inibiram a maioria de MMPs (exceto MMP-9) e preferencialmente inibiram MMP-2. As construções de fusão de TIMP-3 inibiram MMP-1, -2, -3, -9 bem como TACE.O mutante da construção de fusão de TIMP-3 (SEQ ID NO: 4) foi examinada com relação a suas propriedades de integração, que mostrou adicionalmente uma capacidade aperfeiçoada de integrar-se na membrana de células (esses experimentos foram realizados de acordo com os métodos fornecidos pelo exemplo 8). As construções de fusão de TIMP-1 truncada (SEQ ID NOS: 1, 2, 5) apresentaram funções biológicas similares em comparação com as construções de fusão de TIMP-1 de comprimento total, desse modo suportando a noção de que a porção de terminal-N das TIMPs é essencial para sua função inibidora. A construção de fusão de fractalkine (SEQ ID NO: 5) mostrou ainda uma capacidade de integração de membrana comparável com aquela da construção de fusão de mucina (SEQ ID NO: 4).

Discussão dos resultados

A engenharia de superfície de célula utilizando proteínas fixadas por GPI, de acordo com a presente invenção, oferece várias vantagens em relação a abordagens de transferência de gene tradicionais. 1) 0 método é aplicável em células que são difíceis de transfectar, por exemplo, células RCC resistentes a apoptose mediadas por FAS, porém também culturas primárias, progenitores de medula óssea, e células de sistema imune. 2) 0 método pode ser utilizado quando somente um pequeno número de células está disponível ou quando células não podem ser facilmente propagadas. 3) A superfície de célula pode ser modificada independente do tipo de célula. 4) A quantidade da proteína finalmente exibida na superfície da célula pode ser controlada precisamente. 5) Múltiplas proteínas fixadas por GPI podem ser incorporadas seqüencial ou simultaneamente nas mesmas células.

RCC humano é um tumor progressivo com opções terapêuticas limitadas devido à resistência do tumor a agentes quimioterapêuticos atuais e radiação. Imunoterapias são benéficas para alguns pacientes sugerindo que RCC pode ser alvejado por mecanismos efetores imunes. Linfócitos de infiltração em tumor como células NK ou CTL CD8+ são freqüentemente vistos em tecidos de câncer renal e freqüentemente reconhecem células de tumor autólogas quando testadas in vitro (examinado em Schendel e outros, 1997).

Apesar dessas observações promissoras, os tumores continuam genericamente a crescer indicando que RCC poderia ter adquirido resistência a mecanismos citotóxicos. Para que ocorra uma resposta anti-tumor produtiva, o sistema imune não deve somente reconhecer o tumor, porém as células de câncer devem ser também suscetíveis aos mecanismos de extermínio utilizados por células CTL ou NK. Células de câncer desenvolveram vários mecanismos para evadir de defesas imunes incluindo sensibilidade reduzida a apoptose (examinado em Dunn e outros, 2004).

Células CTL e NK exterminam suas células alvo por apoptose dependente de FAS/FASL ou perforin/granzima (Kagi e outros, 1994). A importância relativa de exocitose de grânulo versus atividades líticas mediadas por FAS/FASL para controle de tumor in vivo é controversa. Embora muitos estudos apontam para uma dominância do mecanismo de exocitose de grânulo outros estudos utilizando camundongos de nocaute de perforin (Seki e outros, 2002) sugerem que apoptose dependente de FAS pode constituir uma via mais proeminente in vivo. A maioria das células de tumor, incluindo RCC, é resistente de forma intrínseca a extermínio mediado por FAS (Frost e outros, 2003) . O uso de TIMP fixada por GPI representa uma abordagem terapêutica promissora para tornar as células de tumor suscetíveis a apoptose mediada por FAS.

Mostrou-se na presente invenção que a engenharia de células por adição exógena de GPI-TIMP-I pode eliciar atividades biológicas de TIMP-I aumentadas bem como novas. TIMP-I-GPI administrado de forma exógena se torna eficientemente inserido nas membranas de células de RCCs e induziu uma variedade de efeitos biológicos nas linhagens de RCC com relevância terapêutica em potencial. Além disso, a proteína de TIMP-I fixada por GPI alterou dramaticamente a associação de superfície de célula de diversas MMPs expressas por RCC. Isso foi espalhado por uma secreção reduzida de MMPs, incluindo proMMP-2 e proMMP- 9, a partir das células de RCC. Embora TIMP-I bloqueie a atividade enzimática de MMP-2, não se pensa que o mesmo se ligue à pró-forma da enzima. Ainda assim os dados demonstrando um bloqueio de secreção proMMP-2 após tratamento com TIMP-I-GPI são sugestivos dessa ação. Parece que a adição de uma fixação de GPI a TIMP-I leva a uma estequiometria de superfície alterada, aumentou a capacidade da proteína de TIMP-I ligar MMPs.

Essa ligação aumentada aparente de TIMP-I-GPI foi também demonstrada com MMPs do tipo de membrana. Embora não muito seja sabido sobre a associação de TIMP-I com MMP-15, a ligação de proteína de TIMP-I-GPI a MMP-16 não seria prevista ocorrer com base na avidez bem deficiente de TIMP- 1 nativo para essa proteína (Lang e outros, 2004). A análise mutacional dos loops de TIMP-I críticos para a ligação de MMP-16 mostra que alterações pequenas, aparentemente insignificantes em TIMP-I podem deslocar dramaticamente suas características inibidoras/de ligação. Nesse caso, a estequiometria alterada de TIMP-I na superfície da célula parece ter sido suficiente para deslocar sua ligação para MMP-16. 0 seqüestro de MMPs na superfície da célula foi também associado a uma capacidade reduzida da linhagem de células RCC-53 ser submetida à invasão de ECM.

Como demonstrado na presente invenção, o tratamento com TIMP-I-GPI leva a uma redução dependente de dose acentuada na proliferação das linhagens de RCC. Talvez de forma mais significativa, as linhagens de RCC normalmente resistentes à apoptose-FAS foram tornadas sensíveis ao extermínio mediado por FAS/CD95 após tratamento com a proteína TIMP-GPI da invenção. Entretanto, o agente não afetou sensibilidade à via de perforin. Isso sugere que TIMP fixada por GPI media seu efeito anti-tumor pela via de apoptose induzida por FAS era vez de por extermínio mediado por perforin/granzima por células CTL/NK.

A via de apoptose de FAS é regulada por ativação de caspase, enquanto o dano de membrana celular por CTL/NK utilizando exocitose de grânulo, como medido pelo ensaio de liberação de cromo, ocorre independente de caspases (Sayers e outros, 1998; Seki e outros, 2002; Trapani, e outros, 2000) . Eventos a montante levando à ativação de caspase envolvem o equilíbrio entre proteínas de família BCL-2 pró- e anti-apoptóticas. Como demonstrado na presente invenção, o tratamento com GPI-TIMP-I resultou em uma regulagem descendente de proteína BCL-2 anti-apoptótica e um aumento correspondente em proteína BAX pró-apoptótica. Esse deslocamento em direção a uma concentração mais elevada de proteínas pró-apoptóticas pode ser um motivo para a sensibilidade aumentada de apoptose mediada por FAS de células RCC construídas superficialmente de TIMP-I. Essas observações representam uma ação nova para TIMP-I. Ações similares foram também mostradas para TIMP-3 e outras TIMPs (TIMP-2 e TIMP-4) (dados não mostrados).

Verificou-se que a superexpressão de TIMP-1, -2 ou -3 em células de músculo liso vasculares utilizando vetores adenovirais inibe sua migração através de membranas de embasamento de modelo. A superexpressão de TIMP-I não teve efeito sobre a proliferação de células, enquanto TIMP- 2 causou uma inibição dependente de dose de proliferação de células. A superexpressão de TIMP-3 também causou uma inibição de proliferação, dependente de dose, e além disso, leva à apoptose através da despolarização de membrana mitocondrial e vazamento de citocromo-c (Baker e outros, 1999; Baker e outros, 1998; Smith e outros, 1997). TIMP-3 é a única proteína de TIMP que se liga seletivamente à superfície de células independente de associação a outras proteínas de superfície (Majid e outros, 2002; Smith e outros, 1997). A focalização de TIMP-1 em superfícies de célula através de uma fixação de GPI leva a ações biológicas novas que parecem simular efeitos reportados para TIMP-3.

Mostrou-se que TIMP-3 sensibiliza células de melanoma a apoptose induzida por anticorpo anti-FAS, TNF- alfa e TRAIL. O mecanismo de ação foi ligado a uma estabilização geral de FAS, TNF-RI e TRAIL-RI na superfície das células de melanoma tratadas com TIMP-3 (Ahonen e outros, 2003). Essa expressão aumentada de superfície dos receptores foi ligada à ativação de caspase-8 e caspase-3 (Ahonen e outros, 2003).

Nos experimentos detalhados na presente invenção, as células RCC não mostraram uma alteração em expressão de superfície de FAS após tratamento com TIMP-1-GPI (figura 6A) . Além disso, as células RCC permaneceram resistentes a apoptose induzida por TNF-α (testada a partir de 100 a 10.000 unidades por ml) independente de tratamento com TIMP-GPI (dados não mostrados). A análise de FACS das células RCC mostrou subseqüentemente níveis raramente detectáveis de TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75) em RCC-53 e sem expressão nas linhagens RCC-26 ou A498 (dados não mostrados). A expressão de superfície não alterou com tratamento com TIMP-1-GPI. Desse modo, a sensibilidade aumentada a apoptose mediada por FAS após tratamento com TIMP-1-GPI não parece ser mediada através de uma estabilização geral de proteínas de receptor de morte na superfície de célula. O que é evidente é que o tratamento com TIMP-1-GPI altera o equilíbrio de proteínas Bel-2 para eliciar um perfil de expressão mais "pró-apoptótico". Os resultados da presente invenção fornecem uma ligação adicional entre biologia de tumor, função MMP/TIMP e vias de apoptose. A ligação de proteínas de TIMP a GPI diretamente ou através de domínios de mucina representa um agente anti-tumor potente para tornar as células de tumor,

que são normalmente resistentes contra apoptose induzida por FAS, sensíveis para apoptose induzida por FAS. Por esse mecanismo células de tumor serão efetivamente exterminadas.

Com relação ao uso das construções de fusão - em particular, a construção de TIMP-1-GPI, a construção de TIMP-1-muc-GPI e aquelas como exposto nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 e 5 - no campo de medicina regenerativa, por exemplo, cura de ferimento, as construções de TIMP-GPI da presente invenção foram mostradas aqui como inibindo eficientemente a produção e secreção de enzimas importantes e citocinas (fibronectina, colágeno, IL-6, TGF-ß) envolvidas nos processos de remodelagem de tecido e fibrose que levam a uma produção aumentada de ECM. Desse modo, os membros da família de TIMP (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4) se fixados na membrana de célula por intermédio de uma fixação de GPI ou uma mucina ou uma fractalkine e uma GPI, podem ser utilizados para modular eficientemente os processos de cura de ferimento pela influência do equilíbrio delicado entre a produção de ECM e movimento de ECM.

Materiais e métodos

Linhagens de célula e cultura de células As linhagens de RCC, RCC-53 e RCC-26 foram geradas por D.J.S. (Munique, Alemanha) a partir de amostras de paciente. RCC-53, RCC-26 e A4 98 (American Type Culture Coll ection) (Giard e outros, 1973) foram cultivadas em meio RPMI1640 (GIBC0 BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Alemanha) suplementadas com 2 mM L-glutamina (Biochrom KG, Berlim) , 1 mM de piruvato de sódio (GIBC0 BRL, Life Technologies GmbH, Eggnstein, Alemanha), 12% de FCS inativado por calor (Biochrom KG, Berlim, no. SOl 15). Meio fresco foi fornecido a cada terceiro dia e as culturas foram divididas quando as células estavam confluentes.

Células efetoras citotóxicas: JB4 é um clone efetor T citotóxico HLA-A2-alorreativo gerado em nossa própria instalação (E.N.) e é expandido por estimulação bi- semanal como descrito (Milani e outros, 2005). É utilizado em ensaios de citotoxicidade no dia 7 ou 8 após estimulação. As linhagens leucêmicas NK humanas, NKL (Robertson e outros, 1996) e NK-92 (Gong e outros, 1994) foram gentilmente fornecidas por C.S. Falk (GSF-Institute of Molecular Immunology, Munique, Alemanha) e cultivadas em meio contendo 15% de FCS inativado a calor e 100 U/ml de IL-2 recombinante. O dia antes do uso em ensaios de citotoxicidade, a cultura foi ajustada para 0,3 χ IO6 de células/ml em meio novo.

Análise de separação de células ativada por fluorescência (FACS)

As células foram desprendidas com 1.5 mM EDTA (Biochrom A, Berlim, Alemanha no. L2113) em 1 χ PBS e incubadas por 60 min. em gelo com anticorpos específicos para ser humano; TIMP-1 (IM32L), MMP-I (IM35L-100), MMP-3 (IM36L-100), MMP-8 (IM38L) (CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Alemanha); MMP-9 (IM 61-100), MMP-2 (IM 5IL) (ONCOGENE, Bad Soden, Alemanha); MMP-7 (MAB907), MMP-12 (MAB917), MMP-14 (MAB9181) (R&D Systems, Minneapolis, EUA); MMP-13 (IM44L), MMP-15 (IM48L), MMP-16 (IM50L) (CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Alemanha) e IgGlK (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemanha no. M9269). ICAM-I e anticorpos HLA (W6/32 e HB82) foram descritos anteriormente (Johnson e outros, 1988; Barnstable e outros, 1978; Parham & brodsky, 1981). Anti- FAS (H. Engelmann, dados não publicados), anti-TNF-RI, anti-TNF-RII e anticorpos de controle de isotipo foram utilizados como descrito (Bigda e outros, 1994). As células foram lavadas três vezes com 1 χ PBS, incubadas com mAB anti-camundongo de burro conjugado com FTIC (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca no. F0313) por 45 min. em gelo, a seguir lavadas três vezes com 1 X PBS e analisadas utilizando um citômetro de fluxo (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, EUA) e CellQuest software. Anticorpos anti-BCL-2 (ALX-804-225) e anti-BAX (ANC-357-040) foram obtidos a partir de ALEXIS (Grunberg, Alemanha).

Purificação de proteína TIMP-I-GPI

A proteína TIMP-I-GPI foi produzida e purificada como anteriormente descrito (Djafarzadeh, e outros, 2004) . Resumidamente, TIMP-I humano foi clonado a partir de cDNA utilizando iniciadores específicos de hTIMP-1, fundido sem um códon de parada de translação na seqüência de sinal GPI clonada a partir de LFA-3 (Kirby e outros, 1995; Medof e outros, 1996) e subclonado em pEF-DHFR e estavelmente introduzido nas células de ovário de hamster Chinês (CH) deficientes em DHFR e selecionado como descrito (Mack e outros, 1995) . A proteína de fusão de TIMP-I-GPI foi purificada a partir das células de CHO por extração de detergente Triton X-IOO seguido por purificação de coluna utilizando DEAE, heparina sefarose e exclusão de tamanho (Djafarzadeh e outros, 2004).

ELISA TIMP-I

Um ELISA específico de TIMP-I humano utilizando o protocolo aplicado de acordo com as orientações do fabricante (MAB970, R&D Systems) foi utilizado para monitorar níveis de TIMP-I em solução. 0 mAB TIMP-I anti- humano de revestimento (MAB970), mAB de detecção TIMP-I anti-humano biotinilado (BAF970) e proteína rhTIMP-1 (970- TM) foram adquiridos a partir de R&D Systems GmbH (Wiesbaden, Alemanha).

Incorporação de TIMP-I-GPI em membranas de

células

Células RCC-53 (5-10 χ 10^6 células/ml) foram incubadas com 200 a 700 ng/ml de hTIMP-l-GPI purificado em 37°C/5% C02. As células foram então lavadas três vezes com PBS frio e analisadas por FACS utilizando anticorpos monoclonais específicos de TIMP-I humano (vide acima).

Clivagem de fixação de GPI por fosfolipase C

Células (5-10 χ 10^6 células/ml) foram incubadas com 200 ou 700 ng de TIMP-I-GPI ou proteína rhTIMP-1 em meio isento de soro por lha 37°C por 5% CO2. As células foram lavadas três vezes com PBS frio e tratadas com 60 ng/ml de fosfolipase C específico de fosfatidilinositol (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemanha no. 661-9) em meio isento de soro por 30 min. a 37°C/5% C02. As células foram lavadas três vezes, todos os sobrenadantes foram colhidos.

Proliferação

Células RCC-53, A498 ou RCC-26 (30 χ 103/100 μl de meio) foram cultivadas em micro placas de título de 96 cavidades por 24 h sob condições padrão para fornecer células fixas de forma firma e de crescimento estável. Após descartar os sobrenadantes, 50|il de meio contendo TIPM-1- GPI, tampão, ou rhTIMP-1 foi adicionado a células e incubado por 24 h a 72 h. A seguir 50|il de uma solução de 1 mg/ml de (3,5-dimetil tiazol-2-ila]-2,5-difenil-brometo de tetrazólio) MTT (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemanha no. 2128) foi adicionado. Após 3 h de incubação a 37°C, cristais de formazan foram dissolvidos por adição de 100 μl de isopropanol e 0.04 N HCl. A absorvência foi então medida em 550 nm utilizando leitora de GENios plus TEC AN ELISA. Para cada experimento pelo menos 6 cavidades foram analisadas por condição experimental e ponto de tempo.

Zimografia

Células de RCC-53 foram cultivadas em placas de 24 cavidades (5 χ 10^4 células/cavidade).O meio foi permutado por 24 h com meio isento de soro contendo rhTIMP- 1 ou quantidades crescentes de TIMP-I-GPI e incubado por 24 h, 48 h e 72 h. Sobrenadantes de células foram analisadas por zimografia de gelatina utilizando géis de poliacrilamida-SDS a 10% (Invitrogen, Groningen, Holanda, no. EC61755BOX) como descrito (Djafarzadeh e outros, 2004).

A enzima MMP-9 recombinante (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia, no. RPN2634) foi utilizada como controle positivo.

Ensaio de invasão extracelular

O efeito de tratamento com TIMP-1-GPI vs. rhTIMP- 1 sobre a capacidade das células de invadirem ECM foi avaliado utilizando um ensaio de invasão de célula comercial (Chemicon International Inc., Temecula, CA, no. ECM 555) . Células RCC-53 foram primeiramente analisadas em relação a sua capacidade de invadir ECM. As células invadidas no fundo da inserção foram desprendidas, lisadas e detectadas por corante CyQuant como descrito no protocolo em anexo. Niveis crescentes de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) 2 ng/ml a 8 ng/ml foram utilizados para aumentar a invasão. A migração ótima foi vista em 4 ng/ml VEGF (dados não mostrados) . O efeito de tratamento com 350 ng/ml e 700 ng/ml de controle rhTIMP-1 ou TIMP-1-GPI sobre a migração foi então determinado. Para quantificar os efeitos potenciais dos agentes de TIMP, a migração de linha de base das células RC-53 para 4 ng/ml VEGF foi definida como 0. O valor para 100% de "inibição" para migração induzida por VEGF foi definido como ' a migração/invasão de células RCC-53 na ausência de VEGF. Os efeitos resultantes de tratamento com rhTIMP ou TIMP-I-GPI sobre a invasão de RCC-53 foram calculados como percentagem de alteração (negativa ou positiva) em relação ao valor "máximo".

Detecção de anexina-V, de apoptose

A detecção e quantificação de células apoptóticas vs. Necróticas no nivel de célula única foram executadas utilizando Kit de coloração anexina-V-FLUOS (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Alemanha, no. 55647). Células RCC-53 foram semeadas em 1 χ IO6 células/cavidade em placas de 24 cavidades e deixadas fixar durante a noite. As cavidades foram então enxaguadas 3 vezes com IxPBS e 1 ml de meio RPMI 1640 isento de soro foi adicionado, seguido por 700 ng/ml de TIMP-I-GPI ou rhTIMP-1. As células foram incubadas por 24 h a 37°C/5% CO2. Após 24 h., 1 | ig/ml de mAB de ativação anti-FAS L-957 (H. Engelmann, dados não publicados) ou controle de isotipo foram adicionados e as células foram adicionalmente incubadas por 16 h a 37°C/5% CO2. As células foram lavadas com PBS, formadas em pelotas e suspensas novamente em solução de coloração (reagente de rotulação de anexina-V-fluoresceina e iodeto de propidio (PI) em tampão Hepes) por 15 min. em temperatura ambiente. As células foram então analisadas por citometria de fluxo. Um estudo de curso de tempo mostrou que a ligação de anexina-V em células RCC precede a reatividade de PI.

Medição de apoptose por ELISA especifico de

cromatina

A apoptose foi medida utilizando o Kit ELISA Plus de Detecção de Morte de células a partir da Roche (Pensberg, Alemanha, no. 1774425). Células RCC-53 foram semeadas em um prato com 96 cavidades em uma concentração de 4 χ IO5 células/cavidade e deixadas fixar durante a noite. As cavidades foram enxaguadas 3 vezes com 1 χ PBS e 100 |il il de meio RPMI 1640 isento de soro foi adicionado em cada cavidade, seguido por 700 ng/ml de TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1. As células foram então incubadas por 24 h em 37°C/5% CO2. Após incubação de 24 h. com TIMP-I-GPI ou rhTIMP-1, 1 |ig/ml de mAB anti-FAS de ativação L-957 ou mAB de controle de isotipo foram adicionados e incubados por 16 h a 37 °C/5% CO2. A seguir a placa foi centrifugada e o sobrenadante foi cuidadosamente removido. A pelota de células foi colocada em 200 ml de tampão de Iise fornecido pelo fabricante por 30 min. e centrifugada. Alíquotas do sobrenadante (20 μl) foram utilizadas em um ELISA com anticorpos anti-DNA e anti-histona para detectar a presença de nucloessomas citoplásmicos.

Western blot

Western blot foi utilizado para a detecção de MMPs em meios de crescimento isentos de soro. Os anticorpos anti-MMP utilizados são descritos acima (análise de FACS). Padrões de Western blotting MMP humano recombinante foram adquiridos de R&D Systems (Minneapolis, EUA) e incluíram; MMP-I (WBCO24) , MMP-2 (WBC025), MMP-3 (WBC015), MMP-8 (WBC017), MMP-12 (WBC019) e MMP-13 (WBC020). Western blot foi também utilizado para a detecção de BCL-2, BAX (vide acima para mAbs) e β-actina (Acris Hiddenhausen, Alemanha, no. ab8227). Todas as proteínas foram detectadas utilizando um kit de análise de Western blot comercial, Sistema de Imunodetecção Qumiluminescente (Invitrogen, Groningen, Holanda).

Citotoxicidade mediada por células

Células alvo foram rotuladas com Cr51 por 1-2 h, lavadas e co-incubadas com células efetoras em um número de célula constante de 2000 células por cavidade em 96 placas de fundo V. Medições em duplicata de titulações de quatro etapas de células efetoras foram utilizadas em todos os experimentos. Liberações espontâneas e máximas foram determinadas por incubação das células alvo individualmente e por contagem diretamente de células rotuladas, respectivamente. Após 4 h de incubação a 37 0C em uma atmosfera de 5% de C02 umidificada, sobrenadantes foram colhidos, transferidos para microplacas de cintilação sólida Lumaplate, secos durante a noite e contados em um contador de cintilação de microplaca TopCount (Packard, Meriden, CT). Para cada razão E: T, a percentagem de Iise foi calculada como a seguir: % de Iise especifica = (cpm experimental - cpm espontâneo/cpm máximo - cpm espontâneo) χ 100. A liberação espontânea de células alvo foi sempre < 15% da liberação máxima total.

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<110> Hussr Ralf

Nelson, Peter

<120> Inibidor de tecido de Metaloproteinases (TIMP) ligado a fixações de glicosilfosfatidilinositol (GPI) para tratamento de câncer

<130> 109-002P

<150> EP 05 020 462-7

<151> 2005-09-20

<160> 5

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> TIMP-I humano truncado fundido com seqüência de GPI

<400> 1 gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata 60

gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc 120

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<210> 2

<211> 900

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TIMP-I humano truncado fundido com dominio de mucina e seqüência de GPI <400> 2

gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata 60

gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc 120

gacctcgtca tcagggccaà gttcgtgggg acaccagaag tcaaccagac caccttatac 180

cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc 240 gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg 300

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<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> ΤΙΜΡ-2 humano fundido com seqüência de GPI

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<210> 4

<211> 758

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

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<223> ΤΙΜΡ-3 humano mudado fundido com seqüência de GPI

<400> 4

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aacttcgtgg agaggtggga ccagctcacc ctctcccagc gcaaggggct gaactatcgg 420

tatcacctgg gttgtaactg caagatcaag tcctgctact acctgccttg ctttgtgact 480 tccaagaacg agtgtctctg gaccgacatg ctctccaatt tcggttaccc tggctaccag 540

tccaaacact acgcctgcat ccggcagaag ggcggctact gcagctggta ccgaggatgg 600

gcccccccgg ataaaagcat catcaatgcc acagacccct ctagaacaac ctgtatccca 660

agcagcggtc attcaagaca cagatatgca cttataccca taccattagc agtaattaca 720

acatgtattg tgctgtatat gaatgtatta tagtcgac 758

<210> 5

<211> 1314

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> TIMP-I humano truncado fundido com domínio de fractalcina e seqüência de GPI

<400> 5

gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata 60

gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc 120

gacctcgtca tcagggccaa gttcgtgggg acaccagaag tcaaccagac caccttatac 180

cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc 240

gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg 300

tcccacaacc gcagcgagga gtttctcatt gctggaaaac tgcaggatgg actcttgcac 360

atcactacct gcagttttgt ggctccctgg aacagcctga gcttagctca gcgccggggc 420

ttcaccaaga cctacactgt tggctgtgag gaatccacag tgtctagagg cggcaccttc 480

gagaagcaga tcggcgaggt gaagcccagg accacccctg ccgccggggg aatggacgag 540 tctgtggtcc tggagcccga agccacaggc gaaagcagta gcctggagcc gactccttct 600

tcccaggaag cacagagggc cctggggacc tccccagagc tgccgacggg cgtgactggt 660

tcctcaggga ccaggctccc cccgacgcca aaggctcagg atggagggcc tgtgggcacg 720

gagcttttcc gagtgcctcc cgtctccact gccgccacgt ggcagagttc tgctccccac 780

caacctgggc ccagcctctg ggctgaggca aagacctctg aggccccgtc cacccaggac 840

ccctccaccc aggcctccac tgcgtcctcc ccagccccag aggagaatgc tccgtctgaa 900

ggccagcgtg tgtggggtca gggacagagc cccaggccag agaactctct ggagcgggag 960

gagatgggtc ccgtgccagc gcacacggat gccttccagg actgggggcc tggcagcatg 1020

gcccacgtct ctgtggtccc tgtctcctca gaagggaccc ccagcaggga gccagtggct 1080

tcaggcagct ggacccctaa ggctgaggaa cccatccatg ccaccatgga cccccagagg 1140

ctgggcgtcc ttatcactcc tgtccctgac gcccaggctg ccacccggag gcaggctaga 1200

acaacctgta tcccaagcág cggtcattca agacacagat atgcacttat acccatacca 1260

ttagcagtaa ttacaacatg tattgtgctg tatatgaatg tattatgagt cgac 1314

Claims

1. Uso de uma construção de fusão compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um inibidor de tecido de metaloproteinases (TIMP) ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo que inibe metaloproteinases de matriz ativa, em que o TIMP ou fragmento biologicamente ativo do mesmo é ligado a uma fixação de glicosilfosfatidilinositol (GPI) caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de câncer.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o TIMP é selecionado do grupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 ou TIMP-4.

3. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o TIMP é TIMP-I humano.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a construção de fusão contém uma ou mais seqüências de sinais de GPI para orientar fixação de GPI.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a fixação de GPI é derivada do antigeno associado à função de 1 infócito (LFA-3) ou uma porção do mesmo.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a construção TIMP-GPI é inserida nas membranas celulares de células tumorais.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer de mama, câncer renal, câncer de próstata, seminomas, melanomas, teratomas, neuroblastomas, gliomas, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, câncer adrenal, câncer de tiróide, câncer de sangue, câncer da pele, câncer do cérebro, câncer cervical, câncer intestinal, câncer do fígado, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer gastrointestinal, câncer de linfonodo, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer de pâncreas, câncer de orelha, nariz e garganta (ENT), câncer do útero, câncer de ovário e câncer de pulmão e as metástases dos mesmos.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer residual após remoção cirúrgica.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracter i zado pelo fato de que a construção de fusão é administrada localmente como adjuvante anti-tumor para o tratamento de câncer residual em pacientes com câncer de mama e pacientes com glioblastoma (astrocitoma VI).

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a construção de fusão é administrada em uma concentração de -0,5 a 5 μg/ml, preferivelmente 1 μg/ml.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a construção de fusão é administrada por pulverização no ferimento e/ou injeção em regiões que não são disponíveis para cirurgia.

12. Método in vitro para inibição de proliferação de células de câncer caracterizado por compreender a etapa de submeter uma linhagem de células de câncer a uma quantidade eficaz de construção de fusão de TIMP-GPI.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a linhagem de células é uma linhagem de células de carcinoma de célula renal (RCC).

14. Uso de TIMP- GPI caracterizado por ser para tornar linhagens de célula de tumor resistentes a apoptose- FAS sensíveis à apoptose induzida por FAS.