CN107961394B - 基于三元融合蛋白的抗hpv宫颈护创敷料设计 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗HPV的宫颈护创敷料设计的方法。该敷料是基于国际同行对SERPINA3和IFN‑κ功能的研究以及本实验室对这两种蛋白性质的研究而设计的融合蛋白。具体方法为运用overlap extension PCR技术，获得了以氨基酸序列GGSGG为linker的SERPINA3与IFN‑κ共价连接的融合蛋白SERPINA3‑IFN‑κ的基因片段。将目的基因克隆入原核表达载体Pet30(改造)并扩大培养，经MBP柱亲和层析，即可获得纯度达90％以上的三元融合蛋白MBP‑SERPINA3‑IFN‑κ。我们在细胞和小鼠水平上验证了该融合蛋白对HSV‑1病毒复制的抑制作用。最终证明该融合蛋白易纯化，活性高，无副作用，非常适合作为抗HPV的宫颈护创敷料。

Description

基于三元融合蛋白的抗HPV宫颈护创敷料设计

所属技术领域：

本发明属于生物工程领域，具体涉及到分子克隆，蛋白质表达纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，实时荧光定量PCR，小鼠皮肤创伤模型，病毒感染等技术。

背景技术：

HPV病毒(Human Papilloma Virus)，又称为人乳头瘤病毒，是宫颈癌的元凶。它是一种DNA病毒，人类是HPV唯一的宿主。HPV进入机体皮肤粘膜后，主要潜伏于表皮内基底细胞间，一旦时机成熟它就会致病。临床上90％以上的宫颈癌是由十几种高危型HPV病毒引起的，其中最为危险的是HPV16型和18型。根据美国的调查数据，有26.8％女性会感染一种或多种HPV病毒，而感染了高危型的则占15.2％。在中国，也有相似的感染率，且随着近年性生活态度的改变，在年轻一代中HPV的感染率有快速上升的趋势。

HPV通过密切的皮肤接触感染。80％感染者可以用1-2年的时间，通过机体的免疫能力将其清除。不能清除而持续感染者，发展为宫颈癌前病变的可能性大大增加。目前科学家已证明了经性生活传染的HPV病毒是引起宫颈癌的主要病因。近年来由于大多数患者对HPV疾病认识不足，导致其发病率及复发率持续增长，但相应的治疗手段却很不完善。目前治疗HPV的方法虽多，但普遍使用传统的治疗手段：如手术、激光、外涂药物等，其目的都只是去掉临床肉眼可见疣体，却难以解决亚临床及潜伏感染的问题，造成治标不治本致使反复发作。

目前虽然已有HPV疫苗进入临床使用，但并没有得到广泛的推广，在人群中接种率很低。而且疫苗只能针对几种亚型，难以覆盖目前感染人类的十几种HPV病毒。疫苗也没有治疗的效果，对已经感染的人群没有作用。由于目前人群，特别是年轻人群中HPV的高感染率，我们急切需要一种能够直接应用于子宫颈细胞表面，并且能够高效的抑制或清除HPV感染的敷料。

目前在人群中得到部分使用的HPV敷料，有金波抗HPV生物蛋白敷料(山西锦波生物医药股份有限公司)，瑞贝生等。二者所用的活性蛋白质从作用机制上，都是针对HPV病毒的侵染和复制过程。但是，由于HPV在体内的复制效率很低，活体组织上很难检测到活的HPV病毒。HPV感染所引起的宫颈癌和其他病症往往是由于HPV致癌基因整合，慢性感染，长期低剂量复制对宿主的影响而引起的效果，所以直接针对HPV活跃病毒的复制而进行抑制难于有好的效果。基于此，我们希望寻找能够针对宿主子宫颈细胞的损伤进行调理，并调节子宫领细胞的抗病毒免疫过程来达到预防和治疗的效果。

HPV感染后难以清除，一是由于子宫颈上皮细胞本身容易受到损伤，产生微创，给病毒传播产生了通道；二是由于子宫颈上皮细胞的局部免疫系统不活跃，容易给病毒有可乘之机。针对HPV通过微创进入，子宫颈上皮细胞局部免疫系统不活跃的两大特点，我们的两种活性蛋白，SERPINA3和IFN-κ，协同作用，会有效解决HPV不宜清除的难题。

(1)SERPINA3，是一种近来发现的胰凝乳蛋白酶抑制剂，外敷时可以帮助上皮细胞的微小创口愈合，促进局部皮肤再生。参考文献：Hoffmann et al，J.Biol.Chem.，2011，286，28889-28901。

(2)IFN-κ，干扰素kappa，新近发现的一种上皮细胞特异的I型干扰素，激活上皮细胞的抗病毒免疫，抑制病毒复制。目前发现HPV感染可以抑制IFN-κ的表达，而外源添加的IFN-κ可以抑制HPV在上皮细胞的复制。参考文献：DeCarlo et al，LaboratoryInvestigation，2010，90，1482-1491；Habiger et al，J.of Virology，2016，90，694-704。

HPV需要通过子宫颈鳞状上皮细胞的微创口进入，才能完成感染，这些微创口很容易产生(如性交，上皮细胞死亡脱落，细菌感染等)，一般不会流血，所以不会引入注意，一般也不会引起可见的炎症，所以自身的皮肤修复系统对这些微创口修复很缓慢，而SERPINA3可以有效加快这一进程，使子宫颈鳞状上皮细胞层形成完整的屏障，阻断新的HPV感染继续发生。IFN-κ可以有效激活局部的上皮细胞抗病毒免疫信号通路，抑制和杀灭HPV。对比于干扰素alpha或beta，IFN-κ限定在上皮细胞表达，通过自分泌途径激活，所以只在上皮细胞局部起作用，外敷时不进入血液循环，不会引起全身性反应，从而避免IFN alpha和beta长期使用时的副作用；另外，近期的研究发现，IFN-κ与HPV感染紧密相关，HPV感染抑制IFN-κ的表达，而外源表达的IFN-κ可以抑制HPV的激活，这些特征是IFN alpha/beta没有的。这两种活性蛋白的联合使用，同时针对HPV通过微创进入，子宫颈上皮细胞局部免疫系统不活跃的两大特点，协同作用，会有效解决HPV不宜清除的难题。

构建MBP-SERPINA3-IFN-κ是由于IFN-κ溶解度和稳定性不好，而融合蛋白能够增加其稳定性。MBP(麦芽糖结合蛋白)除了帮助增加可溶性外，还通过与细胞表面糖链的结合从而协助融合蛋白附着于细胞表面。所以，我们决定使用MBP-SERPINA3-IFN-κ三元融合蛋白来作为新型抗HPV敷料的核心成分。

发明内容：

本发明公开了一种抗HPV的宫颈护创敷料设计的方法。其特征在于我们参照国际同行对SERPINA3和IFN-κ的功能的研究以及本实验室在大肠杆菌表达系统中对SERPINA3和IFN-κ蛋白性质的研究，通过柔性linker将SERPINA3和IFN-κ共价连接，然后将其构建到含有MBP标签的载体上并进行表达，获得了溶解性和稳定性均较好的SERPINA3和IFN-κ共价连接的融合蛋白。具体为用GGSGG通过重叠延伸聚合酶链式反应(overlap extension PCR)技术将SERPINA3和IFN-κ共价连接起来。运用overlap extension PCR技术获得了融合蛋白的基因片段，将目的基因克隆入原核表达载体Pet30(本实验室改造)，经质粒小提后转入BL21(DE3)codon Plus大肠杆菌。在LB培养基中对转入目的基因的大肠杆菌进行扩大培养，当OD600＝0.7左右时用0.1mM的IPTG诱导蛋白的表达，经MBP柱亲和层析即可获得目的蛋白。经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测可以判定目的蛋白的纯度和均一性都非常好，且表达量较大。我们在角质细胞中进行了该融合蛋白的抗病毒实验，发现该蛋白能够有效抑制角质细胞中HSV-1的复制(由于HPV难以在体外培养，所以HPV相关的实验常用HSV-1代替)。最后我们在小鼠身上进行了该蛋白的促进伤口愈合实验以及抗病毒实验。我们在小鼠的背部皮肤上制造了直径6mm的创伤，滴加不同浓度的MBP-SERPINA3-IFN-κ蛋白溶液并监测伤口的恢复情况，发现该蛋白能够有效促进伤口的愈合并且效果随着蛋白溶液的浓度呈梯度变化。预先用该融合蛋白处理小鼠背部创伤12h，随后在创口上滴加HSV-1病毒进行感染并在随后两天重复此处理，在第三天取小鼠创口以及附近2mm处的皮肤提取总RNA并用实时荧光定量PCR检测HSV-1的含量，结果发现该融合蛋白能够有效抑制HSV-1的复制。

本发明同时拥有两种活性蛋白SERPINA3和IFN-κ的功效，在帮助上皮细胞的微小创口愈合的同时能够激活上皮细胞的抗病毒免疫，抑制病毒复制。并且相较于干扰素alpha或beta，IFN-κ限定在上皮细胞表达，通过自分泌途径激活，外源表达的IFN-κ可以抑制HPV的激活且外敷时不进入血液循环，从而能够避免IFN alpha和beta长期使用时的副作用。因此，三元融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ十分适合作为抗HPV的宫颈护创敷料。

附图说明

图1：融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ的设计示意图以及表达和纯化的SDS-PAGE检测结果。图1A是融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ的设计示意图，图1B是融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ表达和纯化的SDS-PAGE检测结果，其中1是细胞破碎后的上清液，2是经MBP亲和柱流穿下来的样品，3是使用Binding buffer冲洗的样品，4是使用洗脱液洗脱的蛋白样品。

图2：IFN-κ的表达能够减少病毒基因组拷贝和病毒的转录(引用自ChristinaHabiger等人，J.of Virology，2016，90，694-704)。

图3：在糖尿病小鼠的创口上施加r1-ACT(即SERPINA3)能够加速创口肉芽组织的形成和上皮化(引用自Daniel C.Hoffmann等人，J.Biol.Chem.，2011，286，28889-28901)。图3A是r1-ACT能够加速创口肉芽组织的形成，图3B是r1-ACT能够加速创口上皮化的过程。

图4：角质细胞内HSV-1含量的检测。角质细胞用MBP-SERPINA3-IFN-κ蛋白处理2h后，HSV-1刺激24h，检测病毒拷贝。

图5：小鼠皮肤创口愈合实验图片。以100ug/ml的MBP-SERPINA3-IFN-κ蛋白溶液处理创口，PBS溶液作为对照。

图6：小鼠皮肤创口愈合实验统计结果。每组五只老鼠，用直径6mm打孔器制造皮肤创口，在创口处滴加不同浓度的MBP-SERPINA3-IFN-κ蛋白溶液，以PBS溶液作为对照。

图7：小鼠皮肤创口HSV-1含量的检测。使用融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ处理小鼠创口，以PBS溶液处理为对照，随后用HSV-1病毒感染创口，三天后以β-actin作为内参使用实时荧光定量PCR检测HSV-1的含量。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细叙述。

具体实施方式：

实施例1：融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ原核表达载体的构建

以SERPINA3和IFN-κ为模板，经overlap extension PCR获得了以GGSGG为linker的融合蛋白SERPINA3-IFN-κ的DNA片段。通过使用同源重组的方法将目的基因片段克隆入经本实验室改造过的Pet30(含有MBP标签)载体上。通过改造的质粒使得融合蛋白能够带上MBP标签，从而能在很大程度上解决IFN-κ稳定性不好和溶解性差的问题。经过双酶切和测序鉴定正确后保留质粒用于后续实验。

载体构建过程中用到的引物为：

引物1：SERPINA3-UP：5’TACTTCCAATCCAATGCCCACCCTAACAGCCCA 3’

引物2：SERPINA3-LOW：5’CCCTCCACTGCCACCGGCTTGCTTGGGATT 3’

引物3：IFN-κ-UP：5’GGTGGCAGTGGAGGGCTGGACTGTAACTTA 3’

引物4：IFN-κ-LOW：5’TTATCCACTTCCAATGCTATTATTTCCTCCTGAA 3’

实施例2：融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ的表达和纯化

将构建好的质粒转入BL21(DE3)codon Plus大肠杆菌。取1ul质粒加入BL21(DE3)codon Plus感受态细胞中并混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，随后冰浴2-3min。在超净工作台中向处理后的BL21(DE3)codon Plus感受态细胞中加入400ul LB(无抗生素)液体培养基并混匀，37℃，220rpm恒温震荡培养30-60min。将培养后的BL21(DE3)codon Plus感受态细胞3800rpm离心2min，在超净工作台中吸除部分培养基，重悬菌体后涂布于LB固体培养基平板上(Kana抗性)，37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。挑取BL21(DE3)codon Plus单菌落于100ml LB(Kana抗性)液体培养基中，37℃，220rpm恒温振荡培养6-8h至OD600＝0.6-0.8，在超净工作台中将其以每份20-30ml的量分装到1000ml LB(Kana抗性)液体培养基中，37℃，220rpm恒温振荡培养3-5h至OD600＝0.6-0.8。每瓶加入100ul浓度为1M的IPTG诱导蛋白的表达，16℃，220rpm恒温振荡培养12-16h。诱导表达后的大肠杆菌于4000rpm离心20min，弃去上清，30ml Binding Buffer(20mM Tris，0.5M Nacl，2％甘油)重悬菌体。将重悬后的菌体倒入烧杯中，然后将烧杯放入冰盒中(冰盒中加入适量的水)。将冰盒放入隔音箱中进行超声破碎，5min(破两秒停四秒)，AMPL＝40％。破碎后的菌液放入离心管中，配平后进行低温高速离心，4℃，18000rpm，40min。收集上清，将上清液进行MBP柱亲和层析纯化，用Binding Buffer(20mM Tris，0.5M Nacl，2％甘油)冲洗三个柱长，洗去非特异性吸附的杂蛋白，最后用MBP Elute Buffer(20mM Tris，0.5M Nacl，10mM麦芽糖)进行洗脱，收集洗脱组分，用12％的SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色法检测分析。结果见图1B。随后把蛋白进行分装并冷冻干燥用于后续的实验。

实施例3：融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ在细胞水平上的抗病毒实验

首先将角质细胞铺于6孔板，24h以后用MBP-SERPINA3-IFN-κ蛋白处理2h并以PBS处理作为对照，随后使用HSV-1刺激24h，然后收取1×10⁶个细胞用Trizol法提取总RNA，使用试剂盒将总RNA进行反转录并使用实时荧光定量PCR检测病毒拷贝。结果见图4。

实施例4：小鼠皮肤创口愈合实验

每组五只Balb/c雄性小鼠共三组，使用剃须刀除净背部毛发，4％的水合氯醛麻醉小鼠，然后用直径6mm打孔器在背部制造皮肤创口。在创口处滴加10ul不同浓度的MBP-SERPINA3-IFN-κ蛋白溶液并以PBS溶液处理作为对照，随后每天都对创口进行上述处理并统计伤口愈合的情况。小鼠伤口愈合图片见图5。伤口愈合统计结果见图6。

实施例5：小鼠皮肤创口HSV-1含量的检测

每组三只Balb/c雄性小鼠共四组，使用剃须刀除净背部毛发，4％的水合氯醛麻醉小鼠，然后用直径6mm打孔器在背部制造皮肤创口。在创口处滴加10ul不同浓度的MBP-SERPINA3-IFN-κ蛋白溶液并以PBS溶液处理作为对照，18h以后在伤口处滴加滴度为1×10⁹/ml的HSV-1病毒10ul进行感染，随后三天每天都进行上述处理。在第三天使用断颈法处死小鼠后取小鼠创口以及周围2mm处的皮肤并在液氮中速冻。在研钵中快速将皮肤研磨成粉末(期间不断使用液氮降温防止RNA降解)。研磨后的皮肤使用Trizol法提取总RNA，使用试剂盒将总RNA进行反转录并使用实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数。结果见图7。

Claims (6)

1.一种抗HPV的宫颈护创敷料，其特征在于针对HPV难清除，易复发的难题，该抗HPV的宫颈护创敷料是基于蛋白的性质设计的带有MBP标签的融合蛋白MBP-SERPINA3-IFN-κ，该融合蛋白的制备方法为将该蛋白对应的目的基因克隆入原核表达载体Pet30，转化进BL21(DE3)codon Plus大肠杆菌，低温下扩大培养，并经MBP亲和柱亲和层析进行蛋白纯化。

2.根据权利要求1所述的抗HPV的宫颈护创敷料，其特征在于使用SERPINA3和IFN-κ两种活性蛋白。

3.根据权利要求1所述的抗HPV的宫颈护创敷料，其特征在于融合蛋白中SERPINA3在前IFN-κ在后的设计顺序。

4.根据权利要求1所述的抗HPV的宫颈护创敷料，其特征在于连接SERPINA3和IFN-κ的linker为GGSGG。

5.根据权利要求1所述的抗HPV的宫颈护创敷料，其特征在于通过对原核表达载体Pet30改造，使得融合蛋白带有MBP标签，从而使融合蛋白的溶解性更好性质更加稳定，更适合作为抗HPV的宫颈护创敷料。

6.根据权利要求1所述的抗HPV的宫颈护创敷料，其特征在于用重叠延伸PCR技术获得该融合蛋白的基因片段，将目的基因克隆入原核表达载体Pet30，转化进BL21(DE3)codonPlus大肠杆菌，低温下扩大培养后，经MBP亲和柱亲和层析获得高纯度的MBP-SERPINA3-IFN-κ融合蛋白。

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