CN101268102A - 用于治疗癌症和皮肤损伤的与糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚相连的金属蛋白酶组织抑制剂(timp) - Google Patents

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Abstract

本发明涉及糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的融合构建物及其在癌症治疗以及再生医学中的应用。通过这种方法，GPI锚定的TIMP蛋白被掺入到肿瘤细胞的表面细胞膜上，使肿瘤细胞对FAS诱导的凋亡敏感。另外，本发明的融合构建物是可用于创伤愈合的有效试剂。在一个实施方式中，TIMP蛋白与粘蛋白相连，随后是GPI，以增强其表面呈递。利用GPI连接TIMP可使融合蛋白特别适于作为抗癌剂用于癌症的治疗，尤其是个体的原发肿瘤在手术切除不完全后残余癌的治疗。

Description

用于治疗癌症和皮肤损伤的与糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚相连的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)
发明领域
本发明涉及融合构建物及其在癌症治疗和再生医学中的应用领域。更具体地说，本发明涉及包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的构建物。另外，本发明的融合构建物是可用于创伤愈合应用领域的有效再生试剂。
发明背景
癌症研究中的TIMP
癌症的治疗依然是一个困难的任务，需要采用不同的治疗方法和策略，这些方法和策略也获得了不同程度的成功。一种已知的方法是增加癌细胞对免疫介导的溶解的敏感性。肿瘤对免疫介导的溶解的敏感性与基质金属蛋白酶(MMP)的生物学活性有关，特别是与肿瘤靶细胞所表达的细胞表面MMP有关。基质金属蛋白酶(MMP)可降解细胞外基质(ECM)组分，已被用于组织重塑、肿瘤侵袭和转移中(Egeblad和Werb，2002；Itoh和Nagase，2002)。试验证明MMP的活性与穿孔素/粒酶介导的凋亡和FAS介导的凋亡都有关(综述见Egeblad和Werb，2002)。研究表明，MMP的活性在多个水平上可被调节，其中包括4个内源性抑制剂，基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1、-2、-3和-4)(Bode和Maskos，2003)。在体内，MMP和TIMP之间的平衡决定了基质发生再吸收还是沉淀(Nagase和Woessner，1999)。
内源性的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)具有不同的生理/生物学功能，其中包括肿瘤生长的缓和、转移和凋亡。试验证明，TIMP的这些不同生物活性与TIMP/MMP/细胞表面蛋白相互作用的化学计量(stochiometry)部分相关。细胞毒淋巴细胞的补充代表了抗肿瘤防御中的一种潜在途径。尽管已经鉴定出了可浸润和识别肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)，但是，有效的抗肿瘤免疫常常难以有效形成。这种无效是手术切除不完全后残存肿瘤细胞不能被完全清除的一个原因，手术切除不完全是因为疾病已处于晚期，或者是因为手术部位而无法手术。细胞毒淋巴细胞的这种功能缺陷的原因目前还不清楚。
一般来说，CTL和NK细胞的抗肿瘤效应是通过穿孔素/粒酶介导的或FAS介导的(CD95/CSD95L)凋亡途径来实现的(Kagi等，1994)。穿孔素途径是由CTL或NK识别靶细胞期间分泌的细胞毒素介导的(Kagi等，1994)。CD95或FAS死亡受体属于蛋白质的细胞死亡家族的调节子，在免疫介导的肿瘤细胞凋亡中发挥关键作用(Nagata，1999)。人FAS/CD95/Apo-1是单独的跨膜糖蛋白受体(325个氨基酸，45-48kDa)。FAS配基(FAS配基，FASL，CD95L)是膜内在蛋白，是一种II型跨膜糖蛋白。FASL是TNF家族的成员，该家族包括TNFα、淋巴毒素(LT)的α-和β-链、CD40配基和CD30配基。FAS的作用是通过FADD(FAS相关死亡结构域)/MORTI介导的，后者是一种衔接蛋白，在其C端有死亡结构域，可结合FAS的胞浆死亡结构域。研究表明，许多肿瘤可对FAS途径介导的凋亡耐受(Frost等，2003；综述见Igney和Krammer，2002)。
作为检验本发明的TIMP-GPI构建物的模型系统，肾细胞癌的细胞系被用作一个例子。肾细胞癌(RCC)是导致癌症的第七位原因。目前大约有1/3的RCC患者发生转移，在进行肾切除术后有高达50％的患者复发(Vogelzang和Stadler，1998)。RCC治疗困难，一般来说，免疫治疗如干扰素α和白细胞介素-2比化疗或放疗更有效(Vogelzang和Stadler，1998)。细胞毒淋巴细胞代表了抗肿瘤防御的一个潜在组分，其中包括RCC。
TIMP家族的一个成员TIMP-1是一种具有广泛作用的MMP抑制剂(Bode和Maskos，2003)。它是一种可溶性蛋白，仅仅通过其与表面结合蛋白的联系就可以在细胞表面检测到(Brew等，2000；Klier等，2001)。TIMP-1在肿瘤生物学中的总体作用依然存在争议(Brand，2002)。到目前为止，大家可接受的是TIMP-1在血管发生、细胞迁移和增殖中发挥作用(Brand，2002)。最近的研究表明，GPI锚定的TIMP-1蛋白可响应bFGF而明显抑制内皮细胞的迁移(Djafarzadeh R等，2004)。
癌症治疗的常规策略和方法遇到的问题还有，肿瘤一旦形成肿瘤细胞就难以被清除。原发肿瘤通常通过手术从患者体内切除。但是，在某些情况下并不是所有部位都适于手术，因此，肿瘤细胞依然留存在体内，这些细胞可形成继发性肿瘤。这是原发肿瘤手术切除不完全的后果。
因此，本发明提供了有效的抗癌剂和策略以抑制或减缓个体体内肿瘤细胞的增殖，特别是那些原发肿瘤手术切除不完全的患者。本发明的抗癌剂可用于杀伤体外细胞系内的和体内组织中的肿瘤细胞。
TIMP在再生医学中的作用
本发明还可用于再生医学领域。再生医学领域中的一个有意义的方面涉及创伤愈合过程。创伤愈合涉及对组织损伤的天然滋补反应，包括细胞事件的复杂级联，这种级联可最终导致损伤组织表面重建、拉伸强度的重建和恢复。这个过程通常可导致不同类型细胞的补充和增殖、细胞基质的建立以及免疫监视的增强。
创伤愈合以实时的、顺序的方式发展，通常可分为4期：炎症、肉芽形成、表皮细胞再生和组织重塑。创伤愈合的每一期都被特异的信号转导途径调节。研究指出，在创伤愈合过程中，生长因子和细胞因子的表达升高；特别是TNF、IL-1和IL-6的表达水平升高。在最初的炎症期，有效应蛋白IL-1、TNF-α和CSF参与，巨噬细胞和中心粒细胞补充形成纤维蛋白凝块。在肉芽形成期，成纤维细胞增殖并迁移到创伤处，分泌ECM。在这个期的后期，有效应蛋白参与，其中包括MMP、PDGF、FGF、EGF和VEGF。创伤愈合的第三期表皮细胞再生期的特征是角质化细胞增殖并迁移到创伤处，其他特征还有成肌纤维细胞增多，这种细胞负责伤口收缩。这一期参与的效应蛋白有MMP、KGF、TGF、GM-CSF、EGF和uPA及tPA，结果导致创伤表面的表皮细胞再生、焦痂剥离和屏障形成。最后，在组织重塑期，成纤维细胞产生胶原基质，导致瘢痕组织形成、成纤维细胞凋亡和角质化细胞从活化向分化转变。在创伤愈合的这个最后期已知参与的效应蛋白有TGF-b1、MMP和TIMP。
因此，负责创伤愈合最多方面的效应细胞是成纤维细胞和角质化细胞，以及在成纤维细胞(MMP-1、-2、-3和-13)和角质化细胞(MMP-1、-2、-3和-10)迁移(Singer和Clark，1999)以及瘢痕形成中发挥关键作用的MMP。每一种MMP都和ECM有不同的底物特异性，在ECM降解和更新中扮演重要角色。其中，MMP家族包括胶原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)、间质溶解素(MMP-3、MMP-10、MMP-11)、明胶酶(MMP-2、MMP-9)、基质溶解试剂(MMP-7)、金属蛋白酶(MMP-12)和一系列膜结合基质金属蛋白酶(MT-MMP)。由于MMP的功能是蛋白水解周围ECM，因此，在创伤愈合过程中这个蛋白酶的活性与ECM沉淀之间的平衡，即，损伤组织的重建，需要得到最佳维持。MMP活性的控制可由TIMP蛋白调节，大多数细胞都可产生TIMP，其作用是以1∶1的比例抑制MMP。如果ECM的蛋白水解和沉淀之间的精细平衡被打破，就会导致失调如异常的损伤愈合，例如慢性伤口、过度瘢痕形成或瘢痕瘤。
因此，有必要在创伤愈合过程中控制或影响蛋白酶活性和ECM沉淀之间的生理平衡。
在另一个实施方式中，本发明的融合构建物提供了用于治疗因MMP蛋白酶活性和ECM沉淀之间的平衡被打破而导致的疾病的有效再生试剂，如瘢痕瘤或慢性伤口，这些通常与MMP水平升高有关。另外，本发明的融合构建物提供了在创伤愈合过程中能降低、减轻或抑制瘢痕形成的有效再生试剂。
发明概述
本发明提供了用于治疗癌症的新型抗肿瘤剂和方法。
本发明的基础在于惊奇地发现GPI锚定的TIMP可在体外和体内有效地抑制或延缓癌细胞的增殖，增强细胞系中癌细胞的杀伤。已有研究将TIMP的结构和功能决定子与糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚连接，还可以任选连接上粘蛋白，以合成高效的化疗剂。这种方法利用了糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的TIMP蛋白，在其纯化和加入到癌细胞时将其掺入到细胞膜内。TIMP-GPI与粘蛋白的融合可进一步增强TIMP蛋白在表面细胞膜的呈递，使融合构建物可以更有效地促进癌细胞对免疫介导的杀伤的敏感性。
在下面的实施例中，本发明证明了TIMP在体外细胞系以及体内组织中都具有抑制肿瘤细胞生长和降低肿瘤发展的潜能。TIMP与GPI锚的连接以及加入外源的GPI锚定的TIMP可导致TIMP蛋白有效插入到癌细胞的细胞膜内。GPI锚定的TIMP-1的表面表达可在癌细胞系内诱导各种生物学效应，具有潜在的治疗价值，例如，其中包括在癌细胞内诱导FAS介导的凋亡途径。如下面的实施例所述，所观察到的癌细胞增殖的抑制作用是剂量依赖的。
GPI锚定的TIMP-1蛋白还可阻断proMMP-2和proMMP-9的分泌，明显改变细胞表面不同MMP之间的联系。最有意义的是，正常情况下对FAS-凋亡耐受的肿瘤细胞系变得对FAS/CD95-介导的杀伤敏感。GPI-TIMP处理可导致抗凋亡BCL2蛋白表达下调，促凋亡BAX蛋白相应升高。向更高浓度的促凋亡蛋白的转变可能是TIMP表面改造癌细胞对FAS介导的凋亡敏感性升高的一个原因。
利用上述方法，已经证实本发明的GPI锚定的TIMP蛋白或多肽特别适用于原发肿瘤手术切除不完全后的残余癌的治疗，如晚期乳腺癌、骨肉瘤、肾细胞癌或恶性脑肿瘤如成胶质细胞瘤。
另外，由于肿瘤细胞，其中包括肾细胞癌(RCC)，对FAS介导的杀伤天然耐受，因此，本发明提供了使肿瘤细胞对FAS介导的凋亡敏感的有效方式。
因此，在第一方面，本发明涉及包含金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)或其生物活性片段的氨基酸序列的融合构建物(TIMP-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI)，其中所述TIMP或其生物活性片段与粘蛋白结构域的氨基酸序列相连，随后是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的氨基酸序列。
在一个优选实施方式中，TIMP的3’末端直接融合于GPI连接序列，且不包含粘蛋白结构域。
术语“粘蛋白”与高度糖基化的大蛋白家族有关。有一类粘蛋白是膜结合的，这是因为这类蛋白存在疏水性的跨膜结构域，有利于蛋白固定在浆膜中，而另一类粘蛋白是在粘膜表面分泌的。粘蛋白基因编码粘蛋白单体，粘蛋白单体一般是作为杆状核粘蛋白核心来合成的，后者通过翻译后修饰来进行十分丰富的糖基化。在成熟粘蛋白上有两个截然不同的区域。一个区域包括氨基末端和羧基末端区域，这两个区域是轻度糖基化的，但是在半胱氨酸残基上糖基化很丰富，半胱氨酸残基可能参与粘蛋白单体内以及单体之间二硫键连接的建立。第二中心区域是由多个串联重复序列组成的，包含10到80个残基，其中超过一半的氨基酸残基是丝氨酸或苏氨酸。
粘蛋白通常以分子量约为1,000,000到10,000,000道尔顿的蛋白质大凝集物的形式分泌。在这些凝集物内，单体大多通过非共价相互作用彼此连接，虽然分子内二硫键在这个过程中也可能发挥作用。目前已发现至少19个人粘蛋白基因，其中包括MUC1、2、3A、3B、4、5A、5B、6-9、11-13和15-19。
本发明所使用的粘蛋白优选膜结合粘蛋白结构域，优选包含选自下组的氨基酸序列：MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11、MUC12、MUC16和MUC17，或其变体或片段(在Moniaux N等，2004中有上述粘蛋白的综述)。在另一个优选实施方式中，使用了分离自表面相关趋化因子CXCL16或CX3C趋化因子(CX3CL1)粘蛋白柄。
CX3C趋化因子是大而复杂的趋化因子基因超家族的一个成员，这个超家族主要由分泌的促炎症反应分子组成。趋化因子的典型核心结构部分通过位置保守的半胱氨酸残基之间的二硫键维持。对于大多数趋化因子肽来说，相似的结构特征是分子内4个半胱氨酸的分布，即，半胱氨酸标记基序：CXC、CC和C，其中C是半胱氨酸，X是任何氨基酸残基。通过观察分子N端附近半胱氨酸残基的组织就可以区分趋化因子肽，根据这个结果已鉴定出4个不同的趋化因子家族。CX3C趋化因子自己定义一个趋化因子家族，与其他趋化因子家族的结构区别在于CX3C趋化因子的N端半胱氨酸被3个残基隔开(即，CX3C基序)，以及CX3C趋化因子通过一个延伸的C端跨膜锚被固定在细胞膜上，其中包含粘蛋白样结构域或粘蛋白样柄。因此，本发明的融合构建物内所包含的粘蛋白和CX3C趋化因子结构域适于完成TIMP蛋白在细胞膜上的更好锚定。
本发明所使用的TIMP优选来源于哺乳动物；更优选的是人源的(在Mannello F等，2001中有4个TIMP的综述)。可用于本发明的TIMP的例子包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4，及其来源于其他生物的相应变体，如小鼠、兔、狗、猫、绵羊和牛。
本发明所使用的GPI锚优选来源于淋巴细胞功能相关抗原(LFA-3)或其一部分，其中包含可介导膜联系的GPI信号序列。
本发明还涉及核酸分子，如RNA或DNA，包括编码本发明的GPI锚定的TIMP构建物的核酸序列。
在本发明的另一方面，本发明的核酸分子位于表达质粒、载体或宿主细胞内，用于本发明核酸分子的表达。
本发明还涉及本发明的TIMP-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI融合构建物在癌症治疗中的应用，特别是手术切除原发肿瘤后的残余癌的治疗。
在本发明的另一方面，本发明的TIMP-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI融合构建物包含在药物组合物或药物中。在另一实施方式中，本发明的TIMP-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI融合构建物适合用作抗癌剂或药物。在一个优选实施方式中，本发明的抗癌药物应用到可能存在残余癌细胞高风险并且局部复发迹象升高的高危肿瘤患者以及因疾病处于晚期或者部位无法手术而导致有明显残存肿瘤的那些患者的肿瘤块切除部位旁。优选的是，融合构建物通过喷雾到创口和/或注射到无法手术的区域来给予。
本发明还涉及抑制癌细胞增殖的体外方法，该方法包括给予癌细胞有效量的TIMP-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI融合构建物的步骤。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于治疗由正常生理MMP蛋白酶活性和ECM沉淀之间的平衡被打破而造成的疾病的新型试剂和方法，这种平衡被打破可导致创伤愈合异常。在一个实施方式中，本发明提供了适用于治疗瘢痕瘤或肥厚性瘢痕以及慢性创伤的试剂和方法，这种情况通常与MMP水平升高有关。另外，本发明还提供了降低、减缓或抑制创伤愈合过程中瘢痕形成的有效试剂和方法。
定义
本文所用的术语“TIMP”是指内源性的金属蛋白酶组织抑制剂，已知TIMP参与生理/生物学功能，其中包括抑制活化的基质金属蛋白酶、调节前MMP的活化、细胞生长和调节血管形成。人“TIMP家族”包括4个成员：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。本发明所使用的一个优选成员TIMP-1是一种分泌蛋白，通过它与表面蛋白的相互作用可以在细胞表面检测到它(Bode和Maskos，2003)。
本文所用的术语“融合构建物”或“TIMP融合构建物”既指核酸分子，又指核酸分子编码的氨基酸分子。
本发明特别涉及包含核苷酸序列的核酸，其中的核苷酸序列包含由SEQID NOS：1-5、或其同源物、或其独特片段定义的序列。在本发明中，如果第一核酸分子的核苷酸序列与第二核酸分子的序列有至少约70％、优选至少约80％、更优选至少约90％的同源性，那么编码结果蛋白的核酸分子序列被认为与第二核酸分子同源。利用已知的具有默认设定的BLASTN算法(Altschul等，1990)可以很容易地确定两个核酸序列之间的同源性。作为另一个例子，另一种用于确定两个核酸序列同源性的已知试验是确定它们在正常杂交条件，优选在严格杂交条件下，是否能够杂交。
给定本文所公开的核酸序列，技术人员可以很容易地设计出在各种类型的应用中具有特定功能的核酸结构。例如，技术人员可以构建核酸扩增过程中用作引物的寡核苷酸或多聚核苷酸，如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、修复链式反应(RCR)、PCR寡核苷酸连接分析(PCR-OLA)等。在杂交试验如原位杂交中用作探针的寡核苷酸也可以构建。已知有许多方法可用于用放射性同位素、荧光素标记、酶和结合基序(如，生物素)标记这种探针，因此，本发明的探针适用于提高可检测性。
还可以设计和制备用于其他目的的寡核苷酸。例如，本发明能够设计反义寡核苷酸和三链形成寡核苷酸用于结构/功能关系的研究中。利用本发明所描述的核酸作为靶向方式可以进行同源重组。
本发明的核酸所编码的蛋白质还包括功能性同源物。如果一个蛋白与另一个蛋白具有相似的功能，那么对于这种特定功能来说，这个蛋白就被认为是另一个蛋白的功能性同源物。例如，同源物可以是蛋白的片段或蛋白的替代、添加或删除突变体。
为了本发明的目的，根据Pearson和Lipman(1988)的FASTA检索可以确定两个氨基酸序列是否是基本同源的。例如，如果第一蛋白的氨基酸序列与第二氨基酸的序列有至少约70％、优选至少80％、更优选至少95％的氨基酸序列一致性，那么第一蛋白的氨基酸序列就被认为与第二蛋白的氨基酸序列同源。
用一个等价氨基酸替代序列中的一个氨基酸的可能性是大家熟知的。已知为等价的氨基酸组包括：
(a)Ala(A)，Ser(S)，Thr(T)，Pro(P)，Gly(G)；
(b)Asn(N)，Asp(D)，Glu(E)，Gln(Q)；
(c)His(H)，Arg(R)，Lys(K)；
(d)Met(M)，Leu(L)，Ile(I)，Val(V)；以及
(e)Phe(F)，Tyr(Y)，Trp(W)。
只要本发明的核酸所编码的蛋白继续符合本文所述的功能性标准，那么就可以在氨基酸序列上造成替代、添加和/或删除。如果一个氨基酸序列与另一个序列基本相同，只是因一个或多个替代、添加和/或删除而与另一个序列有所不同，那么它就被认为是等价序列。
本发明的核酸所编码的蛋白序列中优选少于20％、更优选少于10％、更优选少于5％的氨基酸残基被替代、被添加或被删除。
本文所用的术语“MMP”是指属于MMP超家族的基质金属蛋白酶，该家族至少有26个具有代表性的细胞外基质降解金属蛋白酶，在组织发育和分化、细胞浸润、创伤愈合过程中发挥作用，以及作为免疫反应的调节剂。
本文所用的术语“GPI”是指糖基肌醇磷脂，特别是如Medof等，1996所描述的糖基磷脂酰肌醇。这些磷脂样锚具有共同结构用于膜附着，而无论蛋白的功能。GPI锚定单位由连接到肌醇磷脂上的包含磷酸乙醇胺、三个甘露糖残基和一个非乙酰化的葡萄糖胺的线性聚糖组成。GPI序列包含指导GPI锚定的信号。
本文所用的术语“粘蛋白”或“粘蛋白结构域”是指膜结合或非膜糖蛋白组分。一般来说，膜结合粘蛋白具有疏水序列或跨膜结构域，负责其在脂双层内的锚定，可选的是，膜结合粘蛋白可包含一个或几个von Willebrandt因子样结构域，这种结构域在粘蛋白单体的寡聚化以及包装到分泌载体中的过程中发挥功能。本文所用的术语“粘蛋白”或“粘蛋白结构域”还包括粘蛋白柄或粘蛋白样结构域，如通常在CXCL16趋化因子或CX3C趋化因子(CX3CL1)中发现的粘蛋白柄。
本文所用的术语“TIMP-GPI”融合构建物是指与GPI连接序列直接融合的TIMP。通过用天然GPI锚定蛋白的3’-mRNA或cDNA末端序列(即，包含指导GPI锚定的信号序列)替代内源性的TIMP 3’-mRNA或cDNA末端序列可以设计出TIMP-GPI融合构建物。
本文所用的术语“TIMP-粘蛋白-GPI”或“TIMP-muc-GPI”是指直接融合到粘蛋白上的TIMP，随后是GPI连接序列。按照构建TIMP-GPI所描述的方法设计TIMP-粘蛋白-GPI融合构建物，只是这个构建物还包含粘蛋白结构域的氨基酸序列，位于TIMP和GPI的氨基酸序列之间。依此类推，“TIMP-CX3C趋化因子-GPI”或“TIMP-frac-GPI”是指与CX3C趋化因子直接融合的TIMP，随后是GPI连接序列。
术语“RCC”是指肾癌，由于肿瘤对目前所用的化疗药物和放疗耐受而限制了可选择的治疗措施，因而肾癌被认为是侵袭性肿瘤。RCC在本发明中用作模型系统以说明GPI锚定的TIMP的抗肿瘤活性。本发明所用的模型细胞系是RCC-26和RCC-53，这两株细胞系是从I期和IV期细胞癌的患者建立的。
术语“FAS”是指可不依赖TNF-α而诱导凋亡的肿瘤坏死因子/神经生长因子受体家族的成员。在本领域中FAS的其他已知缩写是Apo1(＝凋亡诱导蛋白1)和CD95。
术语“再生”一般是指恢复因外伤或其他原因而受损的组织的完整性。这个术语包括在生理受损及其随后的组织损伤发生部位发生的创伤愈合、组织修复以及其他类型的修复活性的过程。
发明详述
TIMP家族和细胞表面的蛋白改造
金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)是已知的基质金属蛋白酶(MMP)亚家族的主要细胞抑制剂，具有不同程度的抗不同MMP成员以及不同组织表达模式和调节模式的效应。一般来说，TIMP调节可溶性的基质结合的和细胞相关的MMP的活性。虽然所有4种哺乳动物TIMP都具有很多的相似性，但是它们却具有不同的结构特征、生化特性和表达模式，这说明每一种TIMP都有其特殊的体内功能。
TIMP-1是TIMP家族中表达最广泛、被研究最多的成员。TIMP家族的其他成员包括TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4。TIMP蛋白不仅具有共同的结构特征，其中包括形成用于天然蛋白构象所必须的二硫键的一系列保守的半胱氨酸残基(Brew等，2000)，而且还具有广泛重叠的生物学活性。TIMP蛋白保守的N端区域是功能抑制活性所必须的，而不同的C端区域被认为可调节抑制的选择性和试剂与MMP结合的效率(Maskos和Bode，2003)。但是，除了作为MMP抑制剂的能力以外，TIMP家族的各个成员还具有其他生物学活性，其中包括调节增殖和凋亡以及调节血管发生和炎症反应。
研究发现，TIMP-1可抑制大多数MMP(除了MMP-2和MMP-14)，优选抑制MMP-8。TIMP-1由不同类型的细胞以可溶的形式合成和分泌，广泛分布在整个体内。它是一种高度糖基化的蛋白，分子量为28.5kDa。TIMP-1抑制MMP的活化形式，与MMP9的原型形成复合物。如MMP9一样，TIMP-1的表达对多种因子敏感。许多试剂都可以增强TIMP-1的合成，其中包括TGFβ、EGF、PDGF、FGFb、PMA、维甲酸(RA)、IL1和IL11。
TIMP-2是一种21kDa的糖蛋白，各种类型的细胞都可以表达。它与潜伏的和活化的MMP都可以形成非共价的定比化学复合物。TIMP-2优先抑制MMP-2。
TIMP-3一般与ECM结合，抑制MMP-1、-2、-3、-9和-13的活性。TIMP-3与TIMP-1具有30％的氨基酸同源性，与TIMP-2有38％的同源性。研究表明，TIMP-3可促使转化细胞从ECM上分离，加速与细胞转化相关的形态学变化。
TIMP-3在TIMP中是很独特的一个成员，因为它与ECM有较高的亲和性。研究表明，TIMP-3可促使转化细胞从ECM上脱离，加速与细胞转化相关的形态学转变。TIMP-3包含葡糖胺聚糖(GAG)结合结构域，这个结构域包含6个氨基酸(Lys30、Lys26、Lys22、Lys42、Arg20、Lys45)，被认为负责与细胞表面的连接。TIMP-3是唯一一个在正常情况下可抑制TACE(TNF-α-转化酶)的TIMP，TACE是另一种释放可溶性TNF的金属蛋白酶，负责IL-6受体的加工，因此在创伤愈合过程中发挥关键作用。
TIMP-4可抑制所有已知的MMP，优先抑制MMP-2和MMP-7。TIMP-4与TIMP1有37％的氨基酸一致性，与TIMP2和TIMP3有51％的同源性。TIMP4被分泌到细胞外，主要分布于心脑组织，以组织特异性的方式发挥与细胞外基质(ECM)稳定相关的功能。
细胞表面的蛋白改造(engineering)可能是一种高效的技术，通过这种技术无需基因转移就可以修饰细胞表面的蛋白组合物。通过用包含GPI信号结构域的GPI连接蛋白来源的mRNA衍生的cDNA序列替换目的蛋白的羧基端区域，有可能制备出编码GPI连接蛋白的融合构建物。
这种方法与更传统的基因转移方法相比有许多优势。例如，这种方法可用于难以或不可能转染的细胞(如，原代微血管内皮细胞、原代靶细胞等)。添加到细胞表面的蛋白的量是可控的，并且可以定量(通过FACS和免疫荧光分析)。另外，多个GPI锚定蛋白可先后或同时插入到同一细胞内。通过分子改造，可能表达其他表位标记以便于蛋白纯化以及监测试验过程中的试剂。试剂可直接注射到肿瘤内或肿瘤旁区域，特异性白细胞补充对肿瘤生长的效应或FAS诱导的凋亡得以确定。
用于癌症治疗的TIMP融合构建物
恶性肿瘤的预后主要取决于其临床和病理阶段。虽然在大多数情况下，大多数肿瘤(如原发肿瘤和继发肿瘤)可通过手术完全切除，但是晚期肿瘤通常不可能进行二次切除，再次切除后常常导致疾病早期复发和疾病相关死亡率升高。
特别是在乳腺癌中，肿瘤较大(＞2cm)的晚期疾病会发生远端转移和存活率降低。较大的肿瘤体积还被认为是存在残留肿瘤的关键参数，也代表了局部复发和远端转移种植的高风险。同样，脑瘤如成胶质细胞瘤(IV期星形细胞瘤)可能是另一种肿瘤监测靶标，因为通过手术完全切除几乎总是不可能的，在初次手术后的一年内局部复发的病例占总数的95％。
为了解决与残存肿瘤相关的问题，需要找到新的肿瘤治疗措施，特别是可用于治疗手术切除不完全后的残存肿瘤的措施。
作为一种解决方法，本发明提供了GPI锚定的TIMP，它可以被局部应用到切除部位边缘以吸引免疫细胞，将残存肿瘤监视集中到残存的癌细胞上。
为了此目的，用GPI锚定的TIMP蛋白，当TIMP蛋白经过纯化被添加到癌细胞内时，它可以插入到细胞的表面膜上，具有完整的功能。通过用天然GPI锚定蛋白的3’-mRNA末端序列(即，包含可指导GPI锚定的信号的序列)替换内源性的3’-mRNA末端序列，基本上所有TIMP蛋白都可表达为GPI锚定衍生物。
在本发明中，通过使细胞系与纯化的TIMP-1-GPI、TIMP-1-粘蛋白-GPI或重组人(rh)TIMP-1对照蛋白共孵育可以将纯化的GPI-TIMP蛋白插入到肿瘤细胞系的表面膜内。如下面所详细描述的，GPI锚定的TIMP-1的表面表达可在表面产生很强的TIMP-1信号。
在本文中，术语“分离的和/或纯化的”是指从其天然细胞环境中、从其与细胞其他组分的联系中体外分离DNA或多肽分子，这样就可以将其测序、复制和/或表达。例如，“分离的GPI连接序列”是编码至少一部分连接序列或其变体的包含9个以上、优选36个、更优选45个或更多连续核苷酸碱基的RNA或DNA，或其互补的RNA或DNA，其中互补的RNA或DNA可与编码连接序列的RNA或DNA分别互补或杂交，在如本领域所熟知的方法定义的严格条件下维持稳定结合。因此，RNA或DNA是“分离的”表示它不含至少一种污染核酸，正常情况下，在RNA或DNA天然来源中RNA或DNA是与污染核酸相联系的，优选基本不含任何其他哺乳动物的RNA或DNA。
在本文中，术语“重组核酸”如“重组DNA序列”是指已经从任何合适组织源中衍生或分离出的核酸，如DNA，该核酸随后在体外经过化学修饰，因此它的序列不是天然的，或者虽然与天然的序列相同，但是其所处的位置与未被外源DNA转化的基因组中的位置不同。从来源中“衍生的”DNA的一个例子是在一个给定生物体内被鉴定为有用片段，然后以基本纯化的形式被化学合成的DNA序列。从来源中“分离的”这种DNA的一个例子是通过化学方式从所述来源中取出或去除的有用DNA序列，例如，通过使用限制性内切酶，这样利用已知的遗传工程方法可以进一步操作该序列，如扩增，以用于本发明。
常规的多肽锚具有不同的跨膜序列，与特异性的胞浆延伸相连，与此不同，这些磷脂样锚利用共有结构作为通用基质进行膜粘附，而无论蛋白的功能如何。GPI锚定单位由连接到肌醇磷脂上的包含磷酸乙醇胺、三个甘露糖残基和一个非乙酰化葡萄糖胺的线性聚糖组成。它们在内质网(ER)中预制，在转移通过ER膜时添加到初级翻译产物上。GPI修饰产物随后在ER和高尔基体内糖基化，然后转运到细胞表面。
可用于本发明的优选GPI连接序列来源于分离自如下蛋白的GPI锚：例如，酶如碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、5’核苷酸酶(CO73)；粘附分子如淋巴细胞功能相关抗原(LFA-3；CD58)、神经细胞粘附分子(NCAM)；补体调节蛋白如衰变加速因子(DAF或CD55)，或其他蛋白如Fey III型受体B(Fc-y-RIII或CD16b)、Thy-1(CD90)、Qa-2、Ly-6A、反应性溶解膜抑制剂(MIRL或CD59)。为了本发明的目的，优选淋巴细胞功能相关抗原(LFA-3)。技术人员应该认识到其他已知的GPI锚也可用于实现本发明。
为了构建TIMP-GPI，利用TIMP的全长序列或其功能活性片段构建融合构建物，TIMP的功能活性片段保留了TIMP的活性。同样，GPI序列的片段也可使用，只要该片段能够使TIMP蛋白插入到癌细胞的表面细胞膜内。
下文描述了一组与TIMP融合构建物相关的实施方式，其中描述了如何制备构建物以及如何用于治疗癌症和用作再生医学领域的药物。在第一个实施方式中，TIMP分子选自TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4，优选与GPI序列融合。
在另一个优选实施方式中，GPI序列的长度为36个氨基酸。
在另一个实施方式中，TIMP分子选自TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4，该分子与粘蛋白结构域或CX3C趋化因子结构域融合，随后是GPI序列。
在另一个实施方式中，TIMP蛋白选自TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4，并与GPI序列融合，或者与粘蛋白结构域或CX3C趋化因子结构域融合，该分子是C端截短的。在一个优选实施方式中，所述TIMP分子被截短到剩下前50、50-100或50-152位N端氨基酸残基。更优选的是，TIMP分子被截短到剩下前152位N端氨基酸残基，为TIMP-1分子。术语“截短的”是指所包含的核酸碱基数或氨基酸残基数比天然TIMP核酸序列或蛋白序列的核酸碱基或氨基酸残基总数少的TIMP核酸或氨基酸序列，或者指将不需要的序列删除的核酸或氨基酸序列。
在另一个实施方式中，TIMP融合构建物由选自下组的序列定义：SEQ IDNOs：1、2、3、4和5。
所获得的构建物可在任何合适的细胞系或宿主细胞内表达以获得功能性的TIMP多肽或蛋白。为此目的，任何合适的已知载体或质粒都可用于表达本发明的GPI锚定的TIMP蛋白。如下文所详细描述的，用TIMP-GPI蛋白处理的靶癌细胞(以rhTIMP-1蛋白为对照)可被蛋白构建物识别，作为结果，细胞因FAS介导的凋亡而被杀伤。
在一个优选实施方式中，例如，用于表达本发明的融合构建物的一个载体包含人延伸试剂1α的启动子，随后是多克隆位点和内部核糖体结合位点，这些元件可使构建物进行双顺反子表达，二氢叶酸还原酶(DHFR)用作筛选标记(Mack等，P.N.A.S.USA 92：7021，1995)。TIMP蛋白的3’端(羧基端)与GPI连接序列(如，来源于淋巴细胞功能相关抗原3(LFA-3))直接融合，或者与分离自CXCL16或CX3C趋化因子(CX3CL1)的粘蛋白样结构域融合，随后是GPI信号。如上所述，这些粘蛋白结构域主要由丝氨酸/苏氨酸/甘氨酸/脯氨酸残基组成，试验表明它可以促进细胞-细胞相互作用。得到的融合构建物被转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)缺失的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内，按照文献的描述进行筛选(Mack等，P.N.A.S.USA 92：7021-7025，1995)。在一个优选实施方式中，转化子可以暴露于氨甲喋呤中，通过基因扩增提高表达率。
在另一个实施方式中，TIMP-GPI还可以融合到粘蛋白结构域上以提高TIMP-GPI蛋白的膜掺入效率。粘蛋白是膜结合的或非膜糖蛋白组分，最先在衬垫于腺上皮表面的分泌粘膜上被鉴定出来。膜结合粘蛋白具有疏水序列或跨膜结构域，负责其在脂双层中的锚定。目前，总共有21个基因被命名为MUC：MUC1-2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6-13、MUC15-20(Moniaux N等，2004)。粘蛋白的5个共有特征是：(1)分泌到粘膜层内，(2)高分子量O型糖蛋白，(3)存在独特且位于中央的大外显子所编码的串联重复排列，(4)存在包含高百分比丝氨酸和苏氨酸残基的预测肽结构域，以及(5)mRNA表达的复合模式。除了一个(MUC7)以外，分泌性粘蛋白(MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6)都拥有一个或几个von Willebrandt因子样结构域，这时一种富含半胱氨酸的肽，在粘蛋白单体寡聚化以及包装进分泌载体时发挥功能。一般来说，分泌的粘蛋白只由专门的上皮细胞分泌，被分泌到粘膜内，在人体内展示限制性的表达模式。4种分泌性粘蛋白，也被称为凝胶形成粘蛋白，具有共同的结构，与前von Willebrand因子具有很高的相似性。已知它们还包含5个D结构域，因为它们与von Willebrand因子的D结构域有同源性。
膜结合粘蛋白由MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11、MUC12、MUC16和MUC17组成。膜锚定粘蛋白包含SEA(海胆精蛋白，肠激酶和集聚蛋白)模块，但MUC4除外。MUC3A-B、MUC4、MUC11-12和MUC17包含两到三个表皮生长因子(EGF)样结构域。可用于本发明的膜结合粘蛋白的例子包括MUC1、MUC3、MUC4和MUC12。在本发明的一个优选实施方式中，使用了表面相关趋化因子CXCL16或CX3C趋化因子(CX3CL1)的粘蛋白柄。CXCL16是CXC趋化因子亚家族的一个成员。与这个亚家族的其他成员相比，CXCL16在结构上是不同的，并且有4个特殊的结构域：通过粘蛋白样柄连接到细胞表面的趋化因子结构域，该结构域依次连接上跨膜结构域和胞浆结构域。CX3C趋化因子(CX3CL1)具有与CXCL16相似的结构，CXCL16和CX3C趋化因子在细胞表面表达时都作为粘附分子发挥作用，一旦从细胞表面裂解下来，就成了趋化因子，充当化学诱导物。
优选的是，粘蛋白结构域被融合在TIMP序列的3’末端和GPI锚序列的5’末端之间，所用方法为已知的常规基因工程方法。所获得的本发明的TIMP-粘蛋白-GPI融合构建物被转染到任何合适的已知细胞系或宿主细胞内，并在其中表达。技术人员应该认识到，其他任何粘蛋白或粘蛋白结构域也都适用于本发明的目的。
在一个优选实施方式中，融合到TIMP分子上的CX3C趋化因子包含CX3CL1的100-342位氨基酸，随后是GPI序列。在一个更优选的实施方式中，TIMP分子是被截短只剩下前152位N端氨基酸的TIMP-1分子(SEQ ID NO：5)。
虽然用TIMP-1制备GPI锚定的TIMP蛋白在本发明中是优选的，但是，技术人员应该认识到其他TIMP蛋白也可用于实现本发明。可用的人TIMP的其他例子包括TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4(Mannello F等，2001)。所用的TIMP是人源的，被用于处理人癌细胞。技术人员同样应该认识到，人之外的其他生物体来源的TIMP，尤其是TIMP-1，的同源物也有相似的肿瘤细胞杀伤效应。例如，在某些实施方式中，动物如犬、猫、小鼠、兔、牛或羊以及鸟来源的TIMP-1序列也可用于构建本发明的TIMP-GPI融合构建物。然后以人体所述的相同方式将TIMP-GPI嵌合体应用到肿瘤部位。
可用GPI锚定的TIMP处理的肿瘤细胞和癌细胞包括而不限于下列癌的细胞：乳腺癌、肾癌、前列腺癌、白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、副肾癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移癌。
为了治疗残余癌，给予TIMP-GPI并局部应用到可能存在残余癌细胞高风险并且局部复发迹象升高的高危肿瘤患者以及因疾病处于晚期或者部位无法手术而导致有明显残存肿瘤的那些患者的肿瘤块切除部位旁。优选的是，融合构建物的给药浓度为0.5到5μg/ml蛋白，优选0.5到1μg，更优选的是1到2μg/ml。浓度约1μg/ml的TIMP-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI是最优选的。蛋白可通过任何可用的给药途径给药。优选的是，在手术期间进行治疗，因此，融合构建物可被喷雾到伤口处，或者被注射到无法手术的区域。为此目的，本发明的GPI锚定的TIMP融合构建物可以是药物组合物或药物的一个组分，其中还可以包含一种或多种已知的常规载体、稀释剂和赋形剂。
从下面的实施例中可以得出结论，GPI锚定的TIMP可诱导其抗肿瘤活性，即，杀伤肿瘤细胞，这种杀伤不是通过CTL和NK细胞诱导的凋亡(穿孔素/粒酶介导的溶解途径)，而是通过第二途径，该途径包括FAS/CD95介导的凋亡(进一步的描述见实施例5和6，图5和6)。另外，虽然许多肿瘤细胞对FAS介导的凋亡耐受，但是用TIMP-1-GPI而不是对照的rhTIMP-1处理可使细胞系恢复对FAS介导的凋亡的敏感性。
我们还发现TIMP-1-GPI蛋白处理可降低BCL2的表达，而升高BAX蛋白的表达。BCL2蛋白代表了参与凋亡调控的一个蛋白家族。这个家族的某些成员(如BCL2和BCL-XL)是抗凋亡的，而其他成员(如Bad和BAX)是促凋亡的。细胞对凋亡刺激信号的敏感性依赖于促凋亡和抗凋亡BCL2家族成员之间的平衡。另外，已经确定了TIMP-1-GPI处理对BCL2和BAX表达的影响，结果表明用TIMP-1-GPI处理癌细胞可增加促凋亡试剂BAX的表达，而降低抗凋亡试剂BCL2的表达。
SEQ ID NOs：1、2、3、4、5所分别编码的TIMP融合构建物也获得了相似的结果。
总之，制备微克到毫克级的重组GPI锚定的TIMP蛋白并将这些分子掺入到癌细胞表面内的方法的有效性为癌症的治疗提供了一种有效的工具。
用于再生医学中的TIMP融合构建物
另外，本发明的融合构建物还可用于再生医学中，特别是创伤愈合领域中。如上所述，融合到GPI或粘蛋白-GPI或CX3C趋化因子-GPI上的TIMP蛋白可有效掺入到细胞表面膜内，在这里它们将其功能结构域集中在那些细胞表面而不依赖蛋白-蛋白相互作用。一般来说，本发明的TIMP融合构建物相当稳定，具有放大的和新的生物活性。
如上所述，MMP和TACE在创伤愈合过程中都发挥关键作用。MMP水平升高与各种创伤愈合异常相关，尤其是慢性创口的发生。由于TIMP是MMP的天然抑制剂，因此本发明的融合构建物还可以作为有效的治疗药物用于控制创伤愈合过程，例如，用于再生医学中，并且适用于治疗以MMP水平升高为特征的疾病。
因此，本发明提供了适用于再生医学和/或治疗以MMP水平升高为特征的疾病的药物和方法。在一个优选实施方式中，本发明的融合构建物用于治疗或预防过度瘢痕形成以及异常的创伤愈合如瘢痕瘤和肥厚性瘢痕和/或慢性创口。在另一个优选实施方式中，本发明的融合构建物可用于抑制或预防瘢痕组织的形成。
典型的创伤愈合反应的特征是特异性的细胞动员到创伤部位。血小板和炎症细胞通常是首先到达损伤部位的细胞，这些分子提供了结缔组织细胞和其他愈合试剂流入的重要功能和化学信号，其中包括细胞因子。术语“创伤”是指正常生理结构和功能被打破。因此，创伤愈合过程是指最终导致生理连续性和功能恢复的复杂而连续的动态事件。
当创伤愈合时，在创伤处通常会形成瘢痕。在正常的创伤愈合过程中，简单的组织如脂肪、结缔组织和表皮再生。但是，由于皮肤是来源于两个胚层的复杂器官，因此它主要是通过纤维组织的形成来愈合的，即，瘢痕。
在正常的创伤愈合过程中，MMP蛋白水解活性受各种机制的控制，其中包括基因转录、酶的合成以及内源性TIMP抑制剂的局部分泌。在创伤修复过程中，MMP的活性和TIMP之间存在生理平衡。但是，已知基质金属蛋白酶在慢性创口中表达水平升高，这种较高的MMP浓度有损创伤愈合过程。许多类型的细胞在存在特异性生化信号如炎症试剂的情况下都可以合成MMP，其中包括巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、上皮细胞和内皮细胞。MMP能够消化细胞外基质的几乎所有组分，这会对MMP的蛋白降解活性和其他合成和沉淀组织的蛋白组分的细胞活性之间所需要的平衡造成挑战。
图8提供了组织重塑过程、纤维化以及参与调节这个过程的那些试剂的概述。一旦对特定损伤、寄生虫感染或自身免疫反应产生急性和慢性炎症反应，就会表达和分泌纤维生成因子，从而导致成纤维细胞和角质化细胞的活化。这些纤维生成因子包括TGF-β、IL-1β、IL-1α、MOB、TGF-α、IL-4、IL-13、bFGF、TNF-α和PDGF-BB等。TNF和TGF-α可能是这些细胞因子中最重要的两个，其中TNF是成纤维细胞的促有丝分裂试剂，可促使血管形成，由巨噬细胞、肥大细胞和T淋巴细胞分泌；TGF-α是角质化细胞和成纤维细胞的促有丝分裂试剂，可刺激角质化细胞的迁移，由巨噬细胞、T淋巴细胞和角质化细胞分泌。有TNF和TGF分泌的阶段标志着创伤愈合过程从炎症期进入组织重建过程，即，增殖期。
成纤维细胞一旦活化就会分泌IL-6，IL-6与TGF-β一起刺激成纤维细胞的增殖。TGF-β还可促进成纤维细胞的分化。增殖和分化过程的结果是胶原、纤连蛋白、TIMP、MMP以及其他ECM蛋白的总量增多，导致ECM合成增加以及ECM更新减少。
本发明的基础在于意外发现所公开的融合构建物，即与GPI锚、粘蛋白-GPI锚或CX3C趋化因子-GPI锚融合的TIMP蛋白或其突变体，可作为有效的试剂用于影响参与创伤愈合过程的细胞因子和其他重要酶的表达水平和/或活性。因此，本发明提供了用于调控创伤愈合过程(如，影响、抑制或防止瘢痕组织形成)以及治疗与创伤愈合过程相关的其他已知机能障碍的有效再生试剂和方法。
异常的创伤愈合
瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的特征是胶原过度积聚，从二者的物理形态中可将其彼此区分开。瘢痕瘤和肥厚性瘢痕都是皮肤外表面过度愈合的创伤。一般来说，瘢痕瘤会持续扩大，超出伤口的大小和形状之外，而肥厚性瘢痕只会在原始伤口的物理界限之内增大。肥厚性瘢痕通常在组织损伤后不久就能观察到，而瘢痕瘤可能会在损伤发生一年之后形成。但是，几乎所有的异常瘢痕形成的例子都与生理损伤相关，其中包括纹身、烧伤、感染、咬伤、疫苗接种、外伤、手术或感染。
肥厚性瘢痕和瘢痕瘤都可以描述为典型创伤愈合过程的变异。在典型的创伤中，合成代谢和分解代谢过程会在最初损伤发生后约6-8周达到平衡。在瘢痕的成熟过程中，皮肤的拉伸强度因胶原纤维的不断交联而持续升高。这时瘢痕通常是充血的，可能会增厚。但是，经过几个月的时间以后，最初的瘢痕组织会逐渐收缩形成更成熟的瘢痕，一般是平坦的、白色的和柔软的，在外观上可能是可伸缩的。此时创伤愈合过程的合成代谢期和分解代谢期之间是不平衡的，合成的胶原多于降解的胶原，因而瘢痕在各个方向上都生长。
由于目前还未找到一种简单而理想的肥厚性瘢痕和瘢痕瘤组织的治疗方法，因此这些异常瘢痕的复发率依然很高。
总之，细胞因子和特异性酶，其中包括MMP和TIMP，在创伤愈合过程中以及瘢痕组织的形成中发挥关键作用。另外，MMP和细胞因子的表达水平异常通常与异常的创伤愈合相关。
因此，本发明提供了用于调控创伤愈合过程和/或治疗通常与创伤愈合相关的机能障碍的有效再生试剂和方法。更具体地说，本发明的融合构建物可用于有效控制、改变、抑制或者甚至阻止这些不良的过程。本发明的融合构建物可制备成药用制剂，应用到损伤部位。在一个实施方式中，损伤部位是由手术、烧伤、注射、咬伤、免疫接种、外伤、手术或感染造成的。在另一个实施方式中，用于制备应用到损伤部位的药物的融合构建物选自下组：TIMP-1-GPI、TIMP-2-GPI、TIMP-3-GPI、TIMP-4-GPI、TIMP-1-muc-GPI、TIMP-2-muc-GPI、TIMP-3-muc-GPI以及TIMP-4-muc-GP或其突变体。
TIMP构建物制剂及给药模式
基于本发明的TIMP构建物的药物组合物可以常规方式利用一种或多种生理相容载体或赋形剂制备成制剂。技术和制剂一般在《雷明顿药物科学》(Remrnington′s Pharmaceutical Sciences)，宾西法尼亚州易斯通米艾德出版公司(Meade Publishing Co.，Easton，Pa)中都能找到。在用于注射时，本发明的化合物可以制备成液体溶液，优选用生理相容性缓冲液如汉克斯液或林格溶液制备。另外，化合物还可以制备成固体形式，在使用前临时溶解或重悬。冻干的形式也是合适的。
除了这些制剂以外，化合物还可以制备成缓释制剂。这些长效缓释制剂可以通过植入(例如，皮下或肌肉内)或注射给药。因此，化合物可以用合适的聚合材料或疏水材料制成制剂(如，制成溶于药用油的乳剂)，或者用作离子交换树脂或微溶衍生物如微溶盐。其他合适的转移系统包括微球，可能能够在更长的一段时间内局部和非侵袭地转移药物。这种特殊的技术利用了具有前毛细血管大小的微球，微球可通过冠状动脉导管注射到选定的任何组织部位，例如，心脏或其他器官，而不会导致炎症或缺血。注射的药物从这些微球中缓慢释放，很容易被周围组织内存在的细胞(如，损伤细胞或癌细胞)摄取。
对于局部应用来说，本发明寡聚物可以制备成本领域熟知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。包含寡聚物的洗液也可局部应用以治疗损伤或炎症，或者在总体上加速愈合过程。
在制备药物时，本发明的TIMP构建物可组合使用，这样所得到的药物就包含不止一种，优选两种，更优选三种，不同的TIMP构建物。通过这种方法，TIMP家族不同成员的放大的新生物活性可优先组合起来并靶向到细胞表面，产生协同效应。例如，TIMP-1融合构建物可抑制除MMP-2和MMP14之外的大多数MMP。因此，任何TIMP-1构建物都可以和优先抑制MMP-2的任何TIMP-2或TIMP-4构建物组合。因而通过这种组合的方式可以达到对MMP家族的更完全的抑制作用。
因此，在一个实施方式中，本发明的制剂包含TIMP-1构建物，或者TIMP-2和/或TIMP-4构建物。在一个优选实施方式中，制剂包含选自下组的TIMP-1构建物：SEQ ID NO：1所编码的截短的TIMP-1-GPI、SEQ ID NO：5所编码的截短的TIMP-1-frac-GPI、SEQ ID NO：2所编码的截短的TIMP-1-muc-GPI，以及TIMP-2和/或TIMP-4构建物。优选的是，TIMP-2由SEQ ID NO：3编码。
在另一个实施方式中，制剂包含本发明的TIMP-3构建物，优选由SEQ IDNO：4编码，该构建物与选自下组的至少一个TIMP构建物一起可抑制TACE：SEQ ID NO：1所编码的截短的TIMP-1-GPI截短的TIMP-1-frac-GPI、截短的TIMP-1-muc-GPI、TIMP-2和TIMP-4构建物。优选的是TIMP-1和TIMP-2构建物分别由SEQ ID NOs：1、2、3、5编码。
附图简述
图1.TIMP-1-GPI掺入到RCC的细胞膜内。
A.为了证明GPI-TIMP-1蛋白从新掺入到细胞膜内，将纯化的TIMP-1-GPI或对照的rhTIMP-1加入到天然RCC-26/RCC-53和A498细胞内。通过FACS分析检测细胞表面的TIMP-1。灰色柱代表同种型对照染色，实线柱代表TIMP-1抗体染色。
B.为了证明与200ng/ml或700ng/ml TIMP-1-GPI或rhTIMP-1孵育后的GPI连接，细胞用60ng/ml PLC处理，然后进行FACS分析。灰色柱代表同种型对照染色。
C.人TIMP-1ELISA用于确定PLC消化后从TIMP-1-GPI处理的RCC细胞中释放的TIMP-1蛋白的量(如图B所示)。
图2.TIMP-1-GPI抑制proMMP-2和proMMP-9从RCC-53细胞释放。
用酶谱法研究MMP-2和MMP-9蛋白从RCC-53细胞的分泌。细胞用浓度逐渐增加的TIMP-1-GPI或对照rhTIMP-1处理，48小时后取出无血清培养上清，通过明胶酶酶谱法分析。
图3.用TIMP-1-GPI处理后的MMP的表面表达。
RCC-53细胞与700ng/ml TIMP-1-GPI蛋白孵育24小时后用抗如下分子的特异性抗体进行FACS：(A)TIMP-1、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8或MMP-9，或(B)MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-16、HLA-A2(HB82)、pan HLAI类(W6/32)和ICAM-1。用PLC处理后1小时从表面裂解下的TIMP-1-GPI(见图1)作为附加的对照。灰色柱代表同种型对照染色，实线柱代表TIMP-1处理样品。
C.利用Western印迹和抗MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-12和MMP-13的单克隆抗体检测一系列MMP从RCC53的分泌。RCC-53用700ng/ml rhTIMP-1或TIMP-1-GPI处理后24小时取培养基，并与未处理的对照细胞比较。
D.评价了MMP对RCC-53侵袭通过Matragel模型基底膜的细胞表面隔绝效应。用VEGF(4ng/ml)处理的RCC-53细胞的最佳迁移设定为基线或“0”，未用VEGF信号处理的RCC-53细胞的迁移值设定为100％抑制值。RCC-53细胞用350ng/ml或700ng/ml rhTIMP-1或TIMP-1-GPI预处理。1小时后洗涤细胞，加到迁移槽内。然后测定对迁移的影响。图中所示数据为4个孔和两个试验的平均值。
图4.rhTIMP-1和TIMP-1-GPI蛋白对RCC细胞系增殖的影响。
利用MTT试验分析TIMP-1-GPI或rhTIMP-1对照蛋白水平升高对RCC-53(A)、A498(B)和RCC-26(C)增殖的影响。如图所示24小时、48小时或72小时后进行MTT分析。
图5.TIMP-1-GPI不影响RCC对穿孔素介导的凋亡的敏感性。
RCC细胞不进行处理(■)、用700ng/ml TIMP-1-GPI(◇)或rhTIMP-1蛋白(o)处理24小时，并与CTL JB4(A)或NK细胞系(B)(NKL用于RCC-53和A498，NK-92用于RCC-26)。图中显示的是具有相似结果的三个独立试验的代表性例子。
图6.TIMP-1-GPI不增强FAS的表达但是可以使细胞对FAS诱导的凋亡敏感。
A.RCC-53、RCC-26或A498细胞用700ng/ml TIMP-1-GPI或rhTIMP-1处理24小时，或者不进行处理，用抗人FAS(L-958)染色，利用流式细胞术分析FAS表面表达。单克隆抗体同种型对照染色显示为灰色柱。
三株RCC细胞系用TIMP-1-GPI或rhTIMP-1处理，随后与L-957共孵育。通过流式细胞术用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)检测活的和早期凋亡的细胞。
利用更敏感的胞浆核小体ELISA验证(B)中RCC-53细胞更低水平的凋亡。用L-957与更高水平的TIMP-1GPI而不是rhTIMP-1共孵育后可检测到凋亡的水平升高。
图7.用TIMP-1-GPI或rhTIMP-1处理后通过内部FACS染色和Western印迹分析RCC内BCL-2和BAX的表达。
RCC-53(A)、RCC-26(B)和A498(C)细胞与TIMP-1-GPI或rhTIMP-1预孵育24小时，然后再用L-957活化的FAS抗体处理16小时。抗BCL-2和抗BAX单克隆抗体通过流式细胞术分析细胞。作为平行试验，提取蛋白并通过Western印迹测定。光密度测定后以β-肌动蛋白的水平对BAX和BCL-2来源的信号进行标准化。FACS结果以直方图显示，括号内的数值对应于BCL-2或BAX的MFI或相应同种型抗体的MFI。
图8.组织重塑和纤维化概述
示意图描述了创伤愈合过程中参与ECM合成和更新之间精细平衡的试剂的复杂相互作用。
图9.在rhTIMP-1存在的情况下TIMP融合构建物对成纤维细胞产生纤连蛋白的效应
汇合的成纤维细胞在存在或缺少rhTIMP-1和TIMP-1-GPI的情况下培养。表达的和分泌的纤连蛋白用抗纤连蛋白抗体通过Western印迹进行定量(以β-肌动蛋白为对照)。rhTIMP-1(700ng/ml)不会导致纤连蛋白的明显下降；而TIMP-1-GPI(700ng/ml)可明显降低成纤维细胞分泌的纤连蛋白。
图10.TIMP融合构建物在存在TNF-α的情况下对成纤维细胞产生纤连蛋白的效应
在存在(图10A)或缺少(图10B)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/ml TIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。在TIMP-1-GPI浓度为350ng/ml时，无论培养基中是否存在TNF-α，转录的纤连蛋白RNA都明显减少。
图11.TIMP融合构建物对成纤维细胞产生IL-6的效应
利用IL-6RNA的探针通过RNA印迹评价成纤维细胞所转录的纤连蛋白RNA。因此，在存在(图11A)或缺少(图11B)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/ml TIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。在TIMP-1-GPI浓度为350ng/ml时，无论培养基中是否存在TNF-α，转录的IL-6RNA都明显减少。
图12.TIMP融合构建物对成纤维细胞产生胶原的效应
分别利用胶原1A1(图12A和B)、胶原4A2(图12C和D)和胶原16A1(图12E和F)RNA的探针通过RNA印迹评价成纤维细胞所转录的纤连蛋白RNA。因此，在存在(图12A、C、E)或缺少(图12B、D、F)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/ml TIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。在TIMP-1-GPI浓度为350ng/ml时，无论培养基中是否存在TNF-α，转录的三种胶原RNA都明显减少。
图13.TIMP融合构建物对成纤维细胞产生TGF-β的效应
利用TGF-β的探针通过RNA印迹评价成纤维细胞所转录的纤连蛋白RNA。因此，在存在(图13A)或缺少(图13B)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/ml TIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。在TIMP-1-GPI浓度为350ng/ml时，无论培养基中是否存在TNF-α以及无论培养基内的FCS含量多少，都几乎检测不到TGF-βRNA。
实施例
在下面的实施例中，更详细地描述了GPI锚定的TIMP对癌细胞的抗肿瘤效应。虽然所描述的试验都是用人TIMP-1进行的，但是本发明不应该被限制在这种类型的TIMP上。
在下面的实施例中，GPI锚被融合到TIMP-1上以使特定浓度的这个抑制蛋白聚集到三个肾细胞癌细胞系(RCC-26、RCC-53和A498)的表面而不依赖于细胞表面的蛋白-蛋白相互作用。如下文所示，外源添加的TIMP-1-GPI可有效插入到RCC细胞膜内，明显改变MMP与细胞表面的联系。TIMP-1-GPI处理可抑制RCC增殖，使正常情况下对FAS耐受的RCC细胞变得对FAS诱导的调亡敏感而不会改变细胞毒效应细胞导致的穿孔素介导的溶解。对FAS介导的调亡的敏感性升高与促调亡和抗调亡BCL-2家族蛋白之间的平衡发生改变有关。
RCC-26(Schendel等，1993)和RCC-53细胞系分别是从明确患有I期和IV期细胞癌的本地患者建立的。因此，它们代表了RCC的两个临床极端。肿瘤浸润TCL分离自两个患者的肿瘤。虽然这些天然的效应细胞在体内不能控制肿瘤的生长，RCC-26和RCC-53的表面标记染色表明MHC I类分子在细胞表面有较高表达，试验证明两个细胞系在体外都能诱导自身的和抗肿瘤特异性的CTL((Schendel等，2000)和DJS，未发表的结果)。A498最初是从一位52岁男性患者的肿瘤中分离的，是一个研究较多的RCC例子(Giard等，1973)。
实施例1
外源添加的TIMP-1-GPI掺入到RCC-53表面
按照以前描述的方法(Djafarzadeh等，2004)制备和分离GPI锚定的TIMP-1蛋白。通过细胞系与700ng/ml纯化的TIMP-1-GPI或重组人(rh)TIMP-1对照蛋白共孵育1小时来证明纯化的GPI-TIMP-1蛋白向RCC-53、RCC-26或A498RCC细胞系的表面膜内的掺入。然后用FACS检测表面相关TIMP-1蛋白(图1A)。加入对照rhTIMP-1不会导致FACS漂移的变化，而GPI锚定的TIMP-1可导致很强的TIMP-1表面信号。
为了证明外源添加的蛋白是GPI锚定的，RCC-53细胞首选与TIMP-1-GPI蛋白(200或700ng/ml)共孵育，然后用60ng/ml磷脂酶C(PLC)处理。FACS分析表明，经过PLC消化以后，TIMP-1细胞表面信号完全消失(图1B)。为了测定TIMP-1-GPI整合的效率，收集洗涤缓冲液中从膜上分离下来的TIMP-1，并用TIMP-1特异性ELISA进行定量(图1C)。结果表明从200ng/ml样品中可以回收66％的起始TIMP-1抗原，而从700ng/ml孵育的样品中回收的起始TIMP-1抗原为31％。
实施例2
TIMP-1-GPI蛋白阻断proMMP-2和proMMP-9从RCC-53释放
MMP-2和MMP-9的表达水平升高与RCC的不良预后相关(Hemmerlein等，2004)。明确处于IV期的细胞癌细胞系RCC-53可组成型地分泌proMMP-2和proMMP-9(图2)。利用明胶酶酶谱分析法检测表面TIMP-1水平升高对MMP-2和MMP-9的组成型释放的效应(Djafarzadeh等，2004；Klier等，2001)。600ng/ml或1200ng/ml的rhTIMP-1蛋白对proMMP-2或proMMP-9的分泌没有影响。与此相反，用起始浓度为10ng/ml的TIMP-1-GPI处理可以使proMMP-2和proMMP-9以浓度依赖的方式释放到培养基内。
实施例3
用TIMP-1-GPI处理可导致基质金属蛋白酶的表面表达升高
根据明胶酶酶谱分析试验的结果，TIMP-1-GPI有可能在细胞表面隔绝MMP。TIMP-1结合MMP的大多数活性形式，除了人MMP-14和MMP-16(Brew等，2000；Lang等，2004)。RCC-53与700ng/mlTIMP-1-GPI共孵育24小时后，用除MMP-14之外的MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15和MMP-16的特异性抗体进行FACS分析，结果显示每一种MMP的平均通道荧光密度(MFI)都升高。rhTIMP-1对照蛋白对FACS信号没有明显的影响(数据未列出)。其他蛋白包括MHC I类分子(pan I类和HLA-A2)和ICAM-1的表面表达不受TIMP-1-GPI处理的影响。用PLC消化TIMP-1-GPI处理的RCC531小时后MMP没有升高(图3A和3B)。MMP在细胞表面的积聚反映了图2所示的proMMP-2和proMMP-9分泌减少。为了进一步检测MMP释放的这种明显阻断，利用抗MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-12和MMP-13的单克隆抗体在对照RCC53细胞或用700ng/mlrhTIMP-1或TIMP-1-GPI处理24小时的细胞来源的培养基(无血清)上进行Western印迹试验(图3C)。对照RCC-53细胞来源的培养基内可以检测到所有MMP的存在。与rhTIMP-1共孵育不会消除MMP的分泌。与此相反，TIMP-1-GPI可完全阻断所研究每一种MMP的释放。
为了评价MMP的这种表面积聚对细胞侵袭ECM的能力，利用带ECM包被膜的改进的博伊登(Boyden)室试验检测细胞的迁移/侵袭能力。RCC-53细胞侵袭ECM的总体能力并不十分突出(数据未列出)。为了增强其侵袭能力，将水平逐渐升高的血管内皮生长因子(VEGF)加到较低的孔内，试验进行48小时。在4ng/ml VEGF时观察到最佳的侵袭反应(数据未列出)，这个反应设定为基线侵袭或0％抑制(图4D)。用350或700ng/ml rhTIMP-1或TIMP-1-GPI预处理RCC-53细胞30分钟后洗涤，加到博伊登室的上层孔。然后测定迁移/侵袭的相对升高或降低值(见材料和方法)。用rhTIMP-1处理可部分阻断细胞的侵袭，而700ng/ml的TIMP-GPI可完全阻断RCC-53细胞的侵袭(图3D)。
实施例4
GPI锚定的TIMP-1影响RCC的增殖
为了评价TIMP-1表面改造对RCC增殖的影响，进行MTT分析。试验表明，在24、48和72小时时，外源添加的TIMP-1-GPI蛋白可刺激RCC-53和A498的增殖以剂量依赖的方式降低(图4B)。RCC-26细胞的增殖十分缓慢(48+h倍增速度)，总趋势显示增殖受到抑制(图4C)。使用与TIMP-1-GPI试剂(德国西格玛公司(Sigma，Germany)，Nr.P6636)相同摩尔浓度的磷脂酰肌醇的其他对照不会导致细胞增殖的明显改变(数据未列出)。
实施例5
细胞介导的细胞毒性
研究表明，MMP的活性与靶细胞对细胞毒T细胞活化诱导的调亡(穿孔素/粒酶和FAS介导的调亡)的敏感性有关(Egeblad和Werb，2002)。利用同种异体CTL和NK细胞诱导的调亡检测TIMP-1-GPI对细胞依赖的RCC杀伤的影响。在同种异体CTL介导的试验中，RCC-53、A498和RCC-26靶细胞用700ng/ml rhTIMP-1或TIMP-1-GPI处理，然后用Cr51标记，与同种异体CD8+CTLJB4(图5A)或NK细胞系(图5B)共孵育。RCC肿瘤细胞系可被CTL和NK细胞识别和有效杀伤。用TIMP-1或TIMP-1-GPI处理不会改变三个RCC细胞系对CTL或NK细胞介导的调亡的敏感性。
实施例6
TIMP-GPI处理可使RCC对FAS介导的杀伤敏感
CTL/NK试验表明，TIMP-1-GPI处理不会影响铬释放试验中所测定的穿孔素/粒酶介导的裂解途径。这个途径通过储存的细胞毒素的分泌快速地发挥作用来启动凋亡，代表了两种主要的免疫启动的细胞死亡机制中的一种(Trapani等，2000)。第二途径包含FAS/CD95连接。然后确定TIMP-1-GPI处理对FAS介导的凋亡的效应。
首先利用非活化的抗FAS mAB(L-958)通过流式细胞术分析RCC细胞系上的FAS表达情况(H.Engelmann，未发表的结果)。未处理的细胞和用700ng/mlTIMP-1-GPI或rhTIMP-1对照蛋白处理24小时的细胞用L-958染色并进行分析。所有三株RCC细胞系都有FAS蛋白的高表达。用TIMP-1-GPI或rhTIMP-1处理不会影响FAS的细胞表面表达(图6A)。
抗FAS mAB L-957可诱导FAS表达细胞的凋亡(H.Englemann，未发表的结果)。利用L-957处理后膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)的结合以及碘化丙啶(PI)向RCC细胞内的掺入通过流式细胞术检测凋亡。如图6B所示，大部分RCC-26和RCC-53对FAS介导的凋亡耐受。未处理细胞和L-957处理细胞的荧光强度(MFI)是相似的。在用L-957处理的RCC-53细胞上观察到了MFI的轻微升高。这些结果与以前的报道一致，RCC普遍对FAS介导的凋亡耐受(Frost等，2003)。用TIMP-1-GPI(L-957+TIMP-1-GPI)而不是对照的rhTIMP-1(L-957+rhTIMP-1)处理可使细胞系对FAS介导的凋亡敏感(图6B)。试验发现，A498对活化的抗FAS mAB更敏感(在L-957处理样品中检测到膜联蛋白-MFI升高)，TIMP-1-GPI而不是rhTIMP-1处理可明显增强A498细胞的凋亡。
虽然RCC-26和A498细胞在用TIMP-1-GPI处理后FAS诱导的凋亡明显升高，但是RCC-53细胞系的敏感性并没有显著上升(MFI从62上升到93)。为了确认TIMP-1-GPI/FAS诱导的RCC-53的凋亡，根据对胞浆染色质的检测进行第二种ELISA试验。这种试验的优点包括排除了解释结果时的主观性以及与膜联蛋白V染色相比敏感性增加。染色质ELISA可检测到的最低凋亡细胞数为300个，可以从细胞表面存在的膜联蛋白V上检测处于很下游的凋亡事件。如膜联蛋白V FACS分析中所观察到的(图6B)，用L-957单独处理RCC-53可使凋亡轻微升高(图6C)。但是，用TIMP-1-GPI处理RCC-53细胞可使细胞对抗FAS诱导的凋亡以剂量依赖的方式明显升高。
这些结果证明用GPI锚定的TIMP处理癌细胞可影响FAS诱导的凋亡对癌细胞的杀伤效应。因此，GPI锚定的TIMP是一种有用的抗肿瘤剂。
实施例7
TIMP-1-GPI处理RCC可降低BCL-2的表达，增强BAX蛋白的表达
BCL-2蛋白代表了参与凋亡调控的一个蛋白家族(综述见Igney和Krammer，2002)。这个家族的某些成员(如BCL-2和BCL-XL)是抗凋亡的，而另一些成员(如Bad或BAX)是促凋亡的。细胞对凋亡刺激信号的敏感性依赖于促凋亡和抗凋亡BCL-2家族成员之间的平衡(Igney和Krammer，2002)。确定了TIMP-1-GPI处理对BCL-2和BAX表达的效应。与700ng/ml TIMP-1-GPI或rhTIMP-1对照预孵育24小时后，RCC细胞用1μg/ml L958(或对照mAB)再刺激16小时。然后利用细胞内FACS和Western印迹测定BCL-2和BAX蛋白的水平。在所有的三株细胞系中，用TIMP-1-GPI处理可增强促凋亡试剂BAX的表达，降低抗凋亡试剂BCL-2的表达。Western印迹分析也得到了相同的结果(图7A、B和C)。
实施例8
外源添加的TIMP-1-粘蛋白-GPI掺入到RCC-53表面
按照实施例1的描述制备和分离TIMP-1-粘蛋白-GPI蛋白。通过细胞系与700ng/ml纯化的TIMP-1-粘蛋白-GPI或重组人(rh)TIMP-1对照蛋白共孵育1小时来测定纯化的GPI-TIMP-1蛋白向RCC-53、RCC-26或A498RCC细胞系表面膜内的掺入。然后利用FACS检测表面相关的TIMP-1-粘蛋白-GPI。TIMP-1-粘蛋白-GPI构建物可被优先掺入到表面膜内，有效促进抗肿瘤活性。
实施例9
用于治疗个体体内的残余癌的TIMP-GPI
TIMP-1-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI试剂以1μg/ml的浓度局部应用到肿瘤手术切除后的切除结构域。不能进行手术的肿瘤成胶质细胞瘤(星形细胞癌IV期WHO)通过手术切除，在创口封闭前注入试剂。
实施例10
用于治疗个体体内的残余癌的TIMP-GPI
TIMP-1-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI试剂以1μg/ml的浓度局部应用到肿瘤手术切除后的切除结构域。晚期乳腺癌的肿瘤通过手术切除，在创口封闭前注入试剂，特别是在有局部复发的临床风险时。
实施例11
在肿瘤转移模型中评价TIMP-GPI
评价了TIMP-1-GPI对肿瘤转移的效应。利用小鼠模型，用TIMP-1-GPI或rhTIMP-1对照蛋白预处理可有效转移到肝脏内的T细胞淋巴瘤。然后将得到的肿瘤通过尾静脉注射到小鼠体内，3天和7天后确定肿瘤在肝脏内的分布。结果表明，与TIMP处理的对照细胞相比，TIMP-1-GPI处理的细胞微小转移的水平明显降低。
实施例12
基质胶侵袭试验
利用一系列基质胶试验分析TIMP-1-GPI对实施例11的肿瘤细胞系的效应。结果证明，TIMP-1-GPI对T细胞肿瘤细胞系经历rhTIMP-1相关的基质胶侵袭的能力有很大的影响。
实施例13
TIMP融合构建物对成纤维细胞产生纤连蛋白的效应
在存在或不存在rhTIMP-1和TIMP-1-GPI的情况下培养汇合的成纤维细胞。利用抗纤连蛋白抗体通过Western印迹分析定量检测表达的和分泌的纤连蛋白(β-肌动蛋白为对照)。图9描述了这个试验的结果，清楚地证明rhTIMP-1(700ng/ml)不会导致纤连蛋白表达的明显降低，而TIMP-1-GPI(700ng/ml)可使成纤维细胞所分泌的纤连蛋白明显减少。
另外，通过RNA印迹试验来分析成纤维细胞所转录的纤连蛋白RNA。在存在(图10A)或缺少(图10B)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/ml TIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。另外，培养基中包含0％、1％、5％或10％FCS。
这些结果清楚地证明，无论培养基中是否存在TNF-α，以及无论培养基中FCS的含量多少，浓度为350ng/ml的TIMP-1-GPI都可以明显降低转录的纤连蛋白RNA。
因此，TIMP-GPI融合构建物可有效抑制成纤维细胞内生长因子纤连蛋白的合成和分泌。
实施例14
TIMP融合构建物对成纤维细胞产生IL-6的效应
利用IL-6RNA的探针重复实施例13的RNA印迹试验。因此，在存在(图11A)或缺少(图11B)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/mlTIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。另外，培养基中包含0％、1％、5％或10％FCS(图11)。
这些结果清楚地证明，无论培养基中是否存在TNF-α，以及无论培养基中FCS的含量多少，浓度为350ng/ml的TIMP-1-GPI都可以明显降低转录的IL-6RNA。
因此，TIMP-GPI融合构建物可有效抑制成纤维细胞内另一种参与创伤愈合的重要细胞因子即IL-6的合成和分泌。
实施例15
TIMP融合构建物对成纤维细胞产生胶原的效应
分别利用胶原1A1(图12A和B)、胶原4A2(图12C和D)以及胶原16A1(图12E和F)的探针重复实施例13和14所进行的RNA印迹试验。因此，在存在(图12A、C、E)或缺少(图12B、D、F)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/ml TIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。另外，培养基中包含0％、1％、5％或10％FCS。
这些结果清楚地证明，无论培养基中是否存在TNF-α，以及无论培养基中FCS的含量多少，浓度为350ng/ml的TIMP-1-GPI都可以明显降低转录的所有三种胶原RNA。
因此，TIMP-GPI融合构建物可有效抑制胶原合成和分泌，胶原是ECM合成和组织重塑的抑制必须蛋白。
实施例16
TIMP融合构建物对成纤维细胞产生TGF-β的效应
利用TGF-β的探针重复实施例13-15的RNA印迹试验。因此，在存在(图13A)或缺少(图13B)10ng/ml成纤维细胞活化TNF-α的情况下分别用350ng/mlTIMP-1-GPI或700ng/ml TIMP-1-GPI、变性的TIMP-1-GPI和rhTIMP-1-GPI培养成纤维细胞。另外，培养基中包含0％、1％、5％或10％FCS。
这些结果清楚地证明，无论培养基中是否存在TNF-α，以及无论培养基中FCS的含量多少，在TIMP-1-GPI浓度为350ng/ml时几乎检测不到TGF-βRNA。
因此，如上述实施例所解释的，TIMP-GPI融合构建物可有效抑制成纤维细胞内另一种参与创伤愈合的重要细胞因子即TGF-β的合成和分泌。
实施例17
其他TIMP融合构建物的制备
根据下面提供的“材料和方法”部分所描述的制备和纯化其他TIMP融合构建物。更具体地说，构建、表达和纯化截短的TIMP-1-GPI融合构建物(SEQ IDNO：1)、截短的TIMP-1-muc-GPI融合构建物(SEQ ID NO：2)TIMP-2-GPI构建物(SEQ ID NO：3)、TIMP-3-GPI构建物以及TIMP-3-GPI的突变形式(SEQ IDNO：4)、以及截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI融合构建物(SEQ ID NO：5)。
截短的TIMP-1-GPI融合构建物(SEQ ID NO：1)包含融合到长度为36个氨基酸的GPI锚上的人TIMP-1蛋白的前152位氨基酸(即，C端126-207位氨基酸被删除)。截短的TIMP-1-muc-GPI融合构建物(SEQ ID NO：2)包含融合到人CXCR16(粘蛋白)的256-380位氨基酸上的人TIMP-1蛋白的前152位氨基酸，再与长度为36个氨基酸的GPI锚融合。得到的融合构建物包含295个氨基酸，分子量为32,111kDa。
与全长TIMP-1-GPI相比，TIMP-2-GPI(SEQ ID NO：3)和TIMP-3-GPI分别包含融合到长度为36个氨基酸的GPI锚上的人TIMP-2和TIMP-3蛋白。为了制备TIMP-3-GPI融合构建物的突变形式(SEQ ID NO：4)，通过下列6种交换突变人TIMP-3的GAG结合结构域：R43A、K45A、K49A、K53A、K65A和K68A，其中GAG结合结构域被认为负责蛋白与细胞表面的联系。截短的TIMP-1CX3C趋化因子-GPI融合构建物(SEQ ID NO：5)包含融合到人CX3CL1的100-342位氨基酸上的人TIMP-1蛋白的N端部分(1-152位氨基酸)，再与长度为36个氨基酸的GPI锚融合。
详细研究截短的TIMP-1-GPI(SEQ ID NO：1)、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI(SEQ ID NO：2)和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI(SEQ ID NO：5)构建物。
a)外源添加的截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI掺入到细胞表面
根据Djafarzadeh等，2004描述的方法制备和分离截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI。通过细胞系分别与700ng/ml纯化的截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI共孵育1小时并与缺少粘蛋白、CX3C趋化因子和GPI结构域的各自的截短TIMP-1对照TIMP-1蛋白比较来证明纯化的融合构建物向RCC-53、RCC-26或A498RCC细胞系表面膜内的掺入。然后利用FACS检测表面相关蛋白。预计加入对照TIMP-1不会导致FACS漂移的任何改变，但是，事实上截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI可分别导致很强的TIMP-1信号。
为了证明外源添加的蛋白是GPI锚定的，RCC-53细胞首先分别与截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI(200或700ng/ml)共孵育，然后用60ng/ml磷脂酶C(PLC)处理。预计FACS的分析结果可以显示，经过PLC消化后TIMP-1的细胞表面信号完全消失。为了测定锚定TIMP构建物的整合效率，收集洗涤缓冲液中从膜上分离的TIMP-1构建物，并通过TIMP-1特异性的ELISA定量检测。预计从200ng/ml样品中可以回收大部分起始TIMP-1抗原。
b)截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI阻断RCC-53释放proMMP-2和proMMP-9
MMP-2和MMP-9的表达升高一般与RCC的不良预后有关(Hemmerlein等，2004)。明确处于IV期的细胞癌细胞系RCC-53组成型地分泌proMMP-2和proMMP-9(图2)。利用明胶酶酶谱分析试验检测表面TIMP-1水平升高对MMP-2和MMP-9蛋白的组成型释放的效应(Djafarzadeh等，2004；Klier等，2001)。600或1200ng/ml的rhTIMP-1蛋白对proMMP-2或proMMP-9的分泌没有影响，与此相反，预计从10ng/ml开始，截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI就能以浓度依赖的方式减少proMMP-2和proMMP-9向培养基内释放，与实施例2所描述的TIMP-1-GPI处理相似。
c)截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI影响RCC的增殖
为了评价TIMP-1表面改造对RCC增殖的影响进行MTT试验。预计外源添加的截短的TIMP-1-GPI、截短的TIMP-1-粘蛋白-GPI和截短的TIMP-1-CX3C趋化因子-GPI蛋白在24、48和72小时时能够分别以剂量依赖的方式抑制RCC-53和A498的增殖，与实施例4的结果类似。预计RCC-26细胞的增殖将十分缓慢(48+h倍增速度)；总体趋势确实表明增殖被抑制。
实施例18
进一步评价实施例17的其他融合构建物
利用实施例17的融合构建物重复实施例1-16的试验。特别是TIMP-2融合构建物抑制大多数MMP(MMP-9除外)，优先抑制MMP-2。TIMP-3融合构建物抑制MMP-1、-2、-3、-9和13以及TACE。检测TIMP-3融合构建物的突变体(SEQ ID NO：4)的整合特性，结果还显示整合到细胞膜内的能力得到提高(这些试验是根据实施例8提供的方法进行的)。截短的TIMP-1融合构建物(SEQID NOs：1、2、5)表现出与全长TIMP-1融合构建物相似的生物学功能，这说明TIMP的N端部分是其抑制功能所必须的。试验还显示CX3C趋化因子融合构建物(SEQ ID NO：5)的膜整合能力与粘蛋白融合构建物(SEQ ID NO.：4)相似。
有关结果的讨论
根据本发明的方法利用GPI锚定蛋白进行细胞表面改造与传统的基因转移方法相比有几个优势。1)该方法可用于难以转染的细胞，例如对FAS介导的凋亡耐受的RCC细胞，以及原代培养物、骨髓祖细胞和免疫系统的细胞。2)该方法在可用细胞数量较小时或者细胞不容易扩增时也可以使用。3)无论何种类型的细胞都可以修饰细胞表面。4)最终呈递到细胞表面的蛋白量可以精确控制。5)多种GPI锚定蛋白可先后或同时掺入到同一种细胞内。
人RCC是一种侵袭性肿瘤，由于其对目前的化疗药物和放疗耐受，因此可选择的治疗措施有限。免疫治疗对某些病人有益说明RCC是免疫效应机制的靶位。在肾癌组织中常常可以看到肿瘤浸润性淋巴细胞如CD8+CTL或NK细胞，当进行体外试验时，这些细胞通常都可以识别自身的肿瘤细胞(综述见Schendel等，1997)。尽管有这些令人鼓舞的现象，但是肿瘤通常还会持续生长，说明RCC可能对细胞毒机制获得性耐受。对于有效的抗肿瘤反应的产生来说，免疫系统不仅必须识别肿瘤，而且癌细胞必须对CTL或NK细胞所利用的杀伤机制敏感。癌细胞进化出了多种机制来规避免疫防御，其中包括降低对凋亡的敏感性(综述见Dunn等，2004)。
CTL和NK细胞通过穿孔素/粒酶或FAS/FASL依赖的调亡杀伤其靶细胞(Kagi等，1994)。颗粒胞吐与FAS/FASL介导的裂解活性对体内肿瘤控制的相对重要性是有争议的。虽然许多研究指出颗粒胞吐机制占据支配地位，但是利用穿孔素敲除小鼠的其他研究(Seki等，2002)表明FAS依赖的调亡在体内是更主要的途径。大多数肿瘤细胞，其中包括RCC，对FAS介导的杀伤天然耐受(Frost等，2003)。GPI锚定的TIMP的应用代表了一种使肿瘤细胞变得对FAS介导的调亡敏感的有前景的治疗方法。
我们在本发明中证明，通过外源添加GPI-TIMP-1改造细胞可导致升高的及新的TIMP-1生物学活性。外源给予的TIMP-1-GPI可有效插入到RCC的细胞膜内，在RCC细胞系上诱导出多种生物学效应，具有潜在的治疗意义。
另外，GPI锚定的TIMP-1蛋白可明显改变RCC表达的不同MMP与细胞表面的联系。RCC细胞分泌的MMP，其中包括proMMP-2和proMMP-9，减少可以说明这一点。虽然TIMP-1可阻断MMP-2的酶活性，但是它被认为不能与酶的前体结合。数据所证明的TIMP-1-GPI处理后发生的proMMP-2分泌被阻断也说明了这种作用。数据显示在TIMP-1上连接GPI锚导致表面化学计量改变可增强TIMPI-1蛋白结合MMP的能力。
用膜型MMP也可证明TIMP-1-GPI结合的这种明显升高。虽然关于TIMP-1与MMP-15的联系知道不多，但是根据天然TIMP-1对MMP-16的亲和力很低也可以推测出TIMP-1-GPI不会与这个蛋白结合(Lang等，2004)。对MMP-16结合来说是十分关键的TIMP-1环进行突变分析发现，TIMP-1上一个很小的、明显无意义的改变也可以明显改变其抑制剂/结合特性。在这个例子中，TIMP-1所造成的细胞表面化学计量改变足以使其与MMP-16结合。细胞表面上MMP的隔绝与RCC-53细胞系经受ECM侵袭的能力下降也有关系。
如本发明所证明的，TIMP-1-GPI处理可导致RCC细胞系的增殖以剂量依赖的方式明显下降。最有意义的或许是，用本发明的TIMP-1-GPI处理后，正常情况下对FAS-调亡耐受的RCC细胞系变成对FAS/CD95介导的杀伤敏感的细胞系。但是，这个试剂不能改变对穿孔素途径的敏感性。这说明GPI锚定的TIMP是通过FAS诱导的调亡途径而不是通过穿孔素/粒酶介导的CTL/NK细胞杀伤作用来介导其抗肿瘤效应的。
FAS-调亡途径受胱冬酶活化的调节，而CTL/NK利用颗粒胞吐对细胞膜造成的损伤不依赖于胱冬酶，如铬释放试验所示(Sayers等，1998；Seki等，2002；Trapani等，2000)。导致胱冬酶活化的上游事件参与促调亡和抗调亡BCL-2家族蛋白之间的平衡。如本发明所证明的，GPI-TIMP-1处理可导致抗调亡BCL-2蛋白的表达下调以及相应的促调亡BAX蛋白的增加。这种向更高浓度的促调亡蛋白的转移可能是TIMP-1表面改造的RCC细胞对FAS介导的调亡敏感性升高的一个原因。这些结果代表了TIMP-1的一种新作用。相似的作用也见于TMP-3和其他TIMP(TIMP-2和TIMP-4)(数据未列出)。
研究表明，利用腺病毒载体在血管平滑肌细胞内过量表达TIMP-1、-2或-3可抑制细胞迁移通过模型基底膜。TIMP-1的过量表达对细胞的增殖没有影响，而TIMP-2可以剂量依赖的方式抑制细胞的增殖。TIMP-3的过量表达也可导致增殖被以剂量依赖的方式抑制，还可导致细胞通过线粒体膜去极化和细胞色素c泄漏而调亡(Baker等，1999；Baker等，1998；Smith等，1997)。TIMP-3是唯一一个能够不依赖与其他表面蛋白的联系而与细胞表面特异性结合的TIMP蛋白(Majid等，2002；Smith等，1997)。通过GPI锚将TIMP-1集中于细胞表面可产生新的生物学作用，这种作用与所报道的TIMP-3的效应类似。
研究表明，TIMP-3可使黑色素瘤细胞对抗FAS抗体、TNF-α和TRAIL诱导的调亡敏感。作用机制与FAS、TNF-RI和TRAIL-RI在TIMP-3处理的黑色素瘤细胞的表面上的总体稳定化相关(Ahonen等，2003)。受体在细胞表面的表达升高与胱冬酶-8和胱冬酶-3的活化有关(Ahonen等，2003)。
在本发明详细描述的试验中，用TIMP-1-GPI处理后FAS在RCC细胞表面的表达没有改变(图6A)。另外，无论是否用TIMP-GPI处理，RCC细胞依然对TNF-α诱导的调亡耐受(从100到10,000U/ml进行检测)(数据未列出)。随后进行的RCC细胞的FACS分析表明在RCC-53细胞上几乎检测不到TNF-RI(p55)和TNF-RII(p75)，在RCC-26和A498细胞系上也没有表达(数据未列出)。用TIMP-1-GPI处理也未改变细胞表面表达情况。因此，用TIMP-1-GPI处理后对FAS介导的调亡敏感性升高不是通过细胞表面上死亡受体蛋白的总体稳定化介导的。很清楚的是，用TIMP-1-GPI处理确实可以改变Bcl-2蛋白的平衡，激发更强的“促调亡”表达模式。
本发明的结果提供了肿瘤生物学、MMP/TIMP功能与调亡途径之间的另一种联系。直接或通过粘蛋白结构域连接到GPI上的TIMP蛋白代表了一种高效的抗肿瘤剂，它可以使正常情况下对FAS诱导的调亡耐受的肿瘤细胞变得对FAS诱导的调亡敏感。通过这个机制肿瘤细胞可被有效杀伤。
关于融合构建物，特别是TIMP-1-GPI构建物、TIMP-1-muc-GPI构建物以及SEQ ID NOs：1、2、3、4和5所列的那些构建物在再生医学领域如创伤愈合中的用途，本文中已经证明本发明的TIMP-GPI构建物可有效抑制参与组织重塑和纤维化过程的重要酶和细胞因子(纤连蛋白、胶原、IL-6、TGF-β)的合成和分泌，它们可导致ECM的合成增加。因此，如果TIMP家族的成员(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4)通过GPI锚或者粘蛋白或CX3C趋化因子和GPI锚定在细胞膜上，那么它们可通过影响ECM合成和ECM更新之间的精细平衡用于有效调节创伤愈合过程。
材料和方法
细胞系和细胞培养
RCC细胞系RCC-53和RCC-26是由D.J.S.(慕尼黑，德国)从患者样品中制备出的。RCC-53、RCC-26和A498(美国典型培养物收集中心)(Giard等，1973)用添加2mM L-谷氨酰胺(柏林BK公司(Biochrom KG，Berlin))、1mM丙酮酸钠(GIBCO BRL，德国艾根斯坦生命科技公司(Life Technologies GmbH，Eggenstein，Germany))、12％热灭活FCS(柏林BK公司，No.S01 15)的RPMI1640培养基(GIBCO BRL，德国艾根斯坦生命科技公司)培养。每三天更换一次新鲜培养基，细胞生长到汇合后拆分培养物。
细胞毒效应细胞：JB4是我们自己的实验室(E.N.)制备的HLA-A2同种异体反应性细胞毒T效应细胞，按照文献的描述每两周刺激一次进行扩增(Milani等，2005)。在刺激后的第7天或第8天用于细胞毒试验。人NK白血病细胞系NKL(Robertson等，1996)和NK-92(Gong等，1994)由C.S.Falk(德国慕尼黑分子免疫学GSF研究所(GSF-Institute of Molecular Immunology，Munich，Germany))惠赠，在含15％人灭活FCS和100U/ml重组IL-2的培养基中培养。在用于细胞毒试验前一天，培养物用新鲜培养基调整到0.3×106细胞/ml。
荧光激活细胞分类(FACS)分析
用1×PBS溶解的1.5mM EDTA(德国柏林BA公司(Biochrom A，Berlin，Germany)，No.L2113)分离细胞，在冰上与抗人：TIMP-1(IM32L)、MMP-1(IM35L-100)、MMP-3(IM36L-100)、MMP-8(IM38L)(德国默克达姆施塔特卡尔生化公司(CALBIOCHEM，Merck Darmstadt，Germany))；MMP-9(IM 61-100)、MMP-2(IM51L)(德国拜德首登昂科基因公司(ONCOGENE，Bad Soden，Germany))；MMP-7(MAB907)、MMP-12(MAB917)、MMP-14(MAB9181)(美国明尼阿波利斯R&D系统(R&D Systems，Minneapolis，USA))；MMP-13(IM44L)、MMP-15(IM48L)、MMP-16(IM50L)(德国默克达姆施塔特卡尔生化公司)的特异性抗体以及IgG lκ(德国西格玛奥尔德利希公司(SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen，Germany)，No.M9269)共孵育60分钟。ICAM-I和HLA-抗体(W6/32和HB82)以前已有描述(Johnson等，1988；Barnstable等，1978；Parham和Brodsky，1981)。抗FAS(H.Engelmann，未发表的数据)、抗TNF-RI、抗TNF-RII和同种型对照抗体按照文献的描述使用(Bigda等，1994)。细胞用1×PBS洗涤三次，与FTIC-连接的驴抗鼠mAB(丹麦格劳斯普达考公司(DAKO A/S，Glostrup，Denmark)，No.F0313)在冰上共孵育45分钟，然后用1×PBS洗涤三次并用流式细胞仪(FACSCalibur，美国加州圣何塞BD公司(Becton，Dickinson and Company，San Jose，CA，USA))和CellQuest软件分析。抗BCL-2(ALX-804-225)和抗BAX(ANC-357-040)抗体得自ALEXIS(德国哥伦堡(Grunberg，Germany))
TIMP-1-GPI蛋白的纯化
按照以前描述的方法制备和纯化TIMP-1-GPI蛋白(Djafarzadeh等，2004)。简言之，利用hTIMP-1特异性的引物从cDNA克隆人TIMP-1，不带翻译终止密码子融合到克隆自LFA-3的GPI信号序列上(Kirby等，1995；Medof等，1996)，然后亚克隆到pEF-DHFR内并稳定导入到DHFR缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，按照文献描述的方法筛选(Mack等，1995)。通过Triton X-100去污剂提取，然后利用DEAE、肝素琼脂糖和空间排阻进行色谱柱纯化从CHO细胞纯化TIMP-1-GPI融合蛋白(Djafarzadeh等，2004)。
TIMP-1 ELISA
根据厂家的说明书(MAB970，R&D系统)推荐的方法利用人TIMP-1特异性ELISA检测溶液中TIMP-1的水平。包被的抗人TIMP-1 mAB(MAB970)、生物素化的抗人TIMP-1检测mAB(BAF970)和rhTIMP-1蛋白(970-TM)购自德国R&D系统公司(R&D Systems GmbH，Wiesbaden，Germany)。
TIMP-1-GPI掺入到细胞膜内
RCC-53细胞(5-10×106细胞/ml)与200到700ng/ml纯化的Htimp-1-GPI在37℃/5％CO2中共孵育。然后用冷PBS洗涤细胞三次，利用人TIMP-1特异性单克隆抗体(如上)通过FACS进行分析。
磷脂酶C裂解GPI锚
细胞(5-10×106细胞/ml)与200或700ng TIMP-1-GPI或rhTIMP-1蛋白在无血清培养基中在37℃/5％CO2的条件下共孵育1小时。然后细胞用冷PBS洗涤三次，在无血清培养基中在37℃/5％CO2条件下用60ng/ml磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(德国西格玛奥尔德利希公司，No.661-9)处理30分钟。细胞洗涤三次，收集所有上清。
纯化
在能够确定使细胞粘附并稳定生长的标准条件下，RCC-53、A498或RCC-26细胞(30×103/100μl培养基)在96孔微滴定板中培养24小时。弃去上清后，加入50μl含TIMP-1-GPI、缓冲液或rhTIMP-1的培养基，孵育24到72小时。然后加入50μl 1mg/ml(3，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基-溴化四唑)MTT(德国西格玛奥尔德利希公司，No.M2128)。在37℃孵育3小时后，通过加入100μl异丙醇和0.04N HCl溶解甲月替结晶。然后利用GENios加TECAN ELISA计数器在550nm测定吸光度。在每种试验条件下和每个时间点，每个试验至少分析6个孔。
酶谱法
RCC-53细胞在24孔培养板内培养(5×104细胞/孔)。培养24小时后用含有rhTIMP-1或浓度不断增加的TIMP-1-GPI的无血清培养基替换原有培养基，孵育24、48和72小时。按照文献的描述(Djafarzadeh等，2004)利用10％SDS聚丙烯酰胺凝胶(荷兰格劳尼根因维曲根公司(Invitrogen，Groningen，Netherlands)，No.EC61755BOX)通过明胶酶谱法分析细胞上清。重组MMP-9酶(瑞典乌普萨拉爱美沙生物科技公司(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，No.RPN2634)用作阳性对照。
细胞外侵袭试验
利用商品化的细胞侵袭试验(加州泰美库拉凯米科国际公司(ChemiconInternational.Inc.，Temecula，CA)，No.ECM 555)评价TIMP-1-GPI和rhTIMP-1处理对细胞侵袭ECM能力的效应。首先分析RCC-53细胞侵袭ECM的能力。剥离插片底部的侵袭细胞，裂解并按照所附说明书描述的方法用CyQuant染料染色。血管内皮细胞生长因子(VEGF)的水平从2ng/ml升高到8ng/ml用于增强侵袭。在4ng/ml VEGF时观察到最佳迁移(数据未列出)。然后确定用350ng/ml和700ng/ml对照rhTIMP-1或TIMP-1-GPI处理对迁移的效应。为了定量测定TIMP试剂的潜在效应，RCC-53细胞对4ng/ml VEGF的基线迁移设定为0。对VEGF诱导的迁移100％“抑制”值设定为无VEGF时的RCC-53细胞的迁移/侵袭。rhTIMP或TIMP-1-GPI处理对RCC-53侵袭的效应计算为相对于“最大”值的百分变化率(阴性或阳性)。
调亡的膜联蛋白V检测
利用膜联蛋白-V-FLUOS染色试剂盒(德国海德尔堡BD公司(Becton，Dickinson and Company，Heidelberg，Germany)，No.556547)在单细胞水平上进行调亡细胞对坏死细胞的检测和定量。以1×106细胞/孔的浓度将RCC-53细胞接种到24孔培养板内，培养过夜使其附着。然后用1×PBS漂洗孔三次，加入1ml无血清RPMI 1640培养基，随后加入700ng/ml TIMP-1-GPI或rhTIMP-1。细胞在37℃/5％CO2孵育24小时。24小时后，加入1μl/ml抗FAS活化mAB L-957(H.Engelmann，未发表的数据)或同种型对照抗体，细胞在37℃/5％CO2再孵育16小时。细胞用PBS洗涤，离心成团，然后重悬到染色溶液(膜联-V-荧光素标记试剂和碘化丙啶溶于Hepes缓冲液中)，在室温下孵育15分钟。然后利用流式细胞仪分析细胞。时程研究表明膜联蛋白-V结合到RCC细胞内先于PI反应。
通过染色质特异性ELISA检测调亡
利用德国罗氏(Roche，Pensberg，Germany)的细胞死亡检测ELISAPlus试剂盒No.1774425)检测调亡。以4×104细胞/孔的浓度将RCC-53细胞接种到96孔培养板内，培养过夜使其附着。然后用1×PBS漂洗孔三次，每孔加入200μl无血清RPMI 1640培养基，随后加入700ng/ml TIMP-1-GPI或rhTIMP-1。细胞在37℃/5％CO2孵育24小时。与TIMP-1-GPI或rhTIMP-1共孵育24小时后，加入1μl/ml活化的抗FAS mAB L-957或同种型对照抗体，细胞在37℃/5％CO2孵育16小时。然后离心培养板，小心弃去上清。细胞团放入200ml厂家提供的裂解缓冲液中孵育30分钟，然后离心。取上清(20μl)进行ELISA，用抗DNA和抗组蛋白抗体检测胞浆核小体的存在。
Western印迹
Western印迹用于检测无血清生长培养基中的MMP。所用的抗MMP抗体在上文已有描述(FACS分析)。重组人MMPWestern印迹标准购自R&D系统(美国明尼阿波利斯)，包括MMP-1(WBC024)、MMP-2(WBC025)、MMP-3(WBC015)、MMP-8(WBC017)、MMP-12(WBC019)和MMP-13(WBC020)。Western印迹还用于检测BCL-2、BAX(参见上述对mAB的描述)和β-肌动蛋白(德国阿克瑞斯西登豪森(Acris Hiddenhausen，Germany)，No.ab8227)。利用商业化的Western印迹分析试剂盒、化学发光免疫检测系统(荷兰格劳尼根因维曲根公司)检测所有蛋白。
细胞介导的细胞毒性
靶细胞用Cr51标记1-2小时，洗涤并与效应细胞在96孔V型底培养板内共孵育，每孔的效应细胞数恒定在2000个。所有试验都采用4步滴定效应细胞双复孔测定。通过单独孵育靶细胞和直接计数标记细胞分别确定自发释放和最大释放。在37℃湿润的5％CO2空气中孵育1小时后，收获上清，转移到Lumaplate固相闪烁微板中，过夜使其干燥，在TopCount微板闪烁计数器(康涅狄格州麦瑞登派卡德公司(Packard，Meriden，CT))上计数。每一种E∶T比例即裂解百分率计算如下：
％特异性裂解＝(试验cpm-自发cpm/最大cpm-自发cpm)×100
靶细胞的自发释放总是低于总释放最大值的15％。
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序列表
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     彼得·耐尔森(Nelson，Peter)
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<150>EP 05 020 462.7
<151>2005-09-20
<160>5
<170>PatentIn 3.1版
<210>1
<211>582
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合于GPI序列的截短的人TIMP-1
<400>1
gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata   60
gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc  120
gacctcgtca tcagggccaa gttcgtgggg acaccagaag tcaaccagac caccttatac  180
cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc  240
gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg  300
tcccacaacc gcagcgagga gtttctcatt gctggaaaac tgcaggatgg actcttgcac  360
atcactacct gcagttttgt ggctccctgg aacagcctga gcttagctca gcgccggggc  420
ttcaccaaga cctacactgt tggctgtgag gaatgcacag tgtctagaac aacctgtatc  480
ccaagcagcg gtcattcaag acacagatat gcacttatac ccataccatt agcagtaatt  540
acaacatgta ttgtgctgta tatgaatgta ttatgagtcg ac                     582
<210>2
<211>900
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合于粘蛋白结构域和GPI序列的截短的人TIMP-1
<400>2
gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata   60
gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc  120
gacctcgtca tcagggccaa gttcgtgggg acaccagaag tcaaccagac caccttatac  180
cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc  240
gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg  300
tcccacaacc gcagcgagga gtttctcatt gctggaaaac tgcaggatgg actcttgcac  360
atcactacct gcagttttgt ggctccctgg aacagcctga gcttagctca gcgccggggc  420
ttcaccaaga cctacactgt tggctgtgag gaatgcacag tgtctagact tgatctcaaa  480
gaatgtggac atgcttactc ggggattgtg gcccaccaga agcatttact tcctaccagc  540
cccccaactt ctcaggcctc agagggggca tcttcagata tccacacccc tgcccagatg  600
ctcctgtcca ccttgcagtc cactcagcgc cccaccctcc cagtaggatc actgtcctcg  660
gacaaagagc tcactcgtcc caatgaaacc accattcaca ctgcgggcca cagtctggca  720
gttgggcctg aggctgggga gaaccagaag cagccggaaa aaaatgctgg tcccacagcc  780
tctagcacaa cctgtatccc aagcagcggt cattcaagac acagatatgc acttataccc  840
ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatgtatt atgagtcgac  900
<210>3
<211>599
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合于GPI序列的人TIMP-2
<400>3
gaattcatgg caaccctaga gaggatccag tatgagatca agcagataaa gatgttcaaa     60
gggcctgaga aggatataga gtttatctac acggccccct cctcggcagt gtgtggggtc    120
tcgctggacg ttggaggaaa gaaggaatat ctcattgcag gaaaggccga gggggacggc    180
aagatgcaca tcaccctctg tgacttcatc gtgccctggg acaccctgag caccacccag    240
aagaagagcc tgaaccacag gtaccagatg ggctgcgagt gcaagatcac gcgctgcccc    300
atgatcccgt gctacatctc ctccccggac gagtgcctct ggatggactg ggtcacagag    360
aagaacatca acgggcacca ggccaagttc ttcgcctgca tcaagagaag tgacggctcc    420
tgtgcgtggt accgcggcgc ggcgcccccc aagcaggagt ttctcgacat cgaggaccca    480
tctagaacaa cctgtatccc aagcagcggt cattcaagac acagatatgc acttataccc    540
ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatgtatt atagtcgac     599
<210>4
<211>758
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合于GPI序列的突变的人TIMP-3
<400>4
gaattcatga ccccttggct cgggctcatc gtgctcctgg gcagctggag cctgggggac     60
tggggcgccg aggcgtgcac atgctcgccc agccaccccc aggacgcctt ctgcaactcc    120
gacatcgtga tcgcggccgc ggtggtgggg gcgaagctgg tagcggaggg gcccttcggc    180
acgctggtct acaccatcgc gcagatggcg atgtaccgag gcttcaccaa gatgccccat    240
gtgcagtaca tccatacgga agcttccgag agtctctgtg gccttaagct ggaggtcaac    300
aagtaccagt acctgctgac aggtcgcgtc tatgatggca agatgtacac ggggctgtgc    360
aacttcgtgg agaggtggga ccagctcacc ctctcccagc gcaaggggct gaactatcgg    420
tatcacctgg gttgtaactg caagatcaag tcctgctact acctgccttg ctttgtgact    480
tccaagaacg agtgtctctg gaccgacatg ctctccaatt tcggttaccc tggctaccag    540
tccaaacact acgcctgcat ccggcagaag ggcggctact gcagctggta ccgaggatgg    600
gcccccccgg ataaaagcat catcaatgcc acagacccct ctagaacaac ctgtatccca    660
agcagcggtc attcaagaca cagatatgca cttataccca taccattagc agtaattaca    720
acatgtattg tgctgtatat gaatgtatta tagtcgac                            758
<210>5
<211>1314
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合于CX3C趋化因子结构域和GPI序列的截短的人TIMP-1
<400>5
gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata     60
gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc    120
gacctcgtca tcagggccaa gttcgtgggg acaccagaag tcaaccagac caccttatac    180
cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc    240
gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg    300
tcccacaacc gcagcgagga gtttctcatt gctggaaaac tgcaggatgg actcttgcac    360
atcactacct gcagttttgt ggctccctgg aacagcctga gcttagctca gcgccggggc    420
ttcaccaaga cctacactgt tggctgtgag gaatccacag tgtctagagg cggcaccttc    480
gagaagcaga tcggcgaggt gaagcccagg accacccctg ccgccggggg aatggacgag    540
tctgtggtcc tggagcccga agccacaggc gaaagcagta gcctggagcc gactccttct    600
tcccaggaag cacagagggc cctggggacc tccccagagc tgccgacggg cgtgactggt    660
tcctcaggga ccaggctccc cccgacgcca aaggctcagg atggagggcc tgtgggcacg    720
gagcttttcc gagtgcctcc cgtctccact gccgccacgt ggcagagttc tgctccccac    780
caacctgggc ccagcctctg ggctgaggca aagacctctg aggccccgtc cacccaggac    840
ccctccaccc aggcctccac tgcgtcctcc ccagccccag aggagaatgc tccgtctgaa    900
ggccagcgtg tgtggggtca gggacagagc cccaggccag agaactctct ggagcgggag    960
gagatgggtc ccgtgccagc gcacacggat gccttccagg actgggggcc tggcagcatg   1020
gcccacgtct ctgtggtccc tgtctcctca gaagggaccc ccagcaggga gccagtggct   1080
tcaggcagct ggacccctaa ggctgaggaa cccatccatg ccaccatgga cccccagagg   1140
ctgggcgtcc ttatcactcc tgtccctgac gcccaggctg ccacccggag gcaggctaga   1200
acaacctgta tcccaagcag cggtcattca agacacagat atgcacttat acccatacca   1260
ttagcagtaa ttacaacatg tattgtgctg tatatgaatg tattatgagt cgac         1314

Claims (30)

1. 一种包含金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)或其生物活性片段的氨基酸序列的融合构建物(TIMP-粘蛋白-GPI)，其中所述TIMP或其生物活性片段与粘蛋白结构域连接，随后是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。
2. 如权利要求1所述的融合构建物，其特征在于，所述粘蛋白结构域是膜结合的粘蛋白结构域。
3. 如权利要求2所述的融合构建物，其特征在于，所述粘蛋白结构域包含由选自下组的基因或其一部分编码的氨基酸序列：MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11、MUC12、MUC16和MUC17。
4. 如权利要求1所述的融合构建物，其特征在于，所述粘蛋白结构域包含表面相关趋化因子CXCL16或CX3C趋化因子(CX3CL1)的粘蛋白柄。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的融合构建物，其特征在于，所述TIMP选自TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3或TIMP-4。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的融合构建物，其特征在于，所述TIMP是人TIMP-1。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的融合构建物，其特征在于，所述融合构建物包含一种或多种GPI信号序列以指导GPI锚定。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的融合构建物，其特征在于，所述GPI锚来源于淋巴细胞功能相关抗原(LFA-3)或其一部分。
9. 如权利要求1-8中任一项所述的融合构建物，其特征在于，所述TIMP-粘蛋白-GPI构建物被插入到肿瘤细胞的细胞膜内。
10. 一种核酸分子，其包含编码如权利要求1-9中任一项所述融合构建物的核酸序列。
11. 一种表达质粒，其包含如权利要求10所述的核酸分子和其他表达元件。
12. 一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的表达质粒。
13. 一种载体，其包含如权利要求10所述的核酸分子。
14. 一种药物组合物，其包含如权利要求1-9中任一项所述的融合构建物或如权利要求10所述的核酸分子以及药学上可接受的载体。
15. 如权利要求1-9中任一项所述的融合构建物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
16. 如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述癌选自下组：乳腺癌、肾癌、前列腺癌、白血病、精原细胞瘤、黑色素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、副肾癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结肠直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移癌。
17. 如权利要求15或16所述的应用，其特征在于，所述癌是手术切除后的残余癌。
18. 如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述融合构建物作为抗肿瘤佐剂局部施用以治疗乳腺癌患者和成胶质细胞瘤(星形细胞瘤VI)患者体内的残余癌。
19. 如权利要求17或18所述的应用，其特征在于，所述融合构建物以0.5到5μg/ml，优选1μg/ml的浓度给药。
20. 如权利要求15-19中任一项所述的应用，其特征在于，所述融合构建物通过喷雾进入伤口和/或注射到无法手术的区域。
21. 如权利要求15-20中任一项所述的应用，其特征在于，所述融合构建物是不包含粘蛋白结构域的融合构建物(TIMP-GPI)。
22. 一种抑制癌细胞增殖的体外方法，该方法包括使癌细胞与有效量的TIMP-粘蛋白-GPI或TIMP-GPI融合构建物接触的步骤。
23. 如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述细胞系是肾细胞癌(RCC)细胞系。
24. TIMP-粘蛋白-GPI或TIMP-粘蛋白-GPI在使FAS调亡耐受肿瘤细胞系变得对FAS诱导的调亡敏感中的应用。
25. 一种治疗皮肤损伤以预防或抑制瘢痕形成的方法，该方法包括将权利要求14所述的药物组合物或包含权利要求1-9中任一项所述的融合构建物和药学上可接受的载体的药物组合物施用于皮肤损伤或瘢痕部位，其中所述融合构建物是不包含粘蛋白结构域的融合构建物(TIMP-GPI)。
26. 如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述瘢痕是肥厚性瘢痕或瘢痕瘤形成。
27. 如权利要求25和26所述的方法，其特征在于，所述药物组合物与去污剂、封闭剂或载体物质一起使用。
28. 如权利要求1-9中任一项所述的融合构建物在制备用于治疗对象的皮肤损伤以防止或抑制瘢痕形成的药物中的应用，其中，所述融合构建物是不包含粘蛋白结构域的融合构建物(TIMP-GPI)。
29. 如权利要求28所述的应用，其特征在于，所述瘢痕是肥厚性瘢痕或瘢痕瘤形成。
30. 如权利要求28和29所述的应用，其特征在于，所述药物组合物与去污剂、封闭剂或载体物质一起使用。
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