CN1398639A - Timp－4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种TIMP－4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复药中的应用药的应用。该TIMP－4基因生物药含有如图1所示的TIMP－4基因的cDNA完整序列，和图3所示的PCINTIMP－4载体的基因，把TIMP－4基因装入哺乳类细胞特异表达载体PcI－neo亚克隆成PCINTIMP－4。由于TIMP－4基因其蛋白具有强烈的待异性抑制MMP酶的作用，达到抑制平滑肌细胞迁移并减少平滑肌细胞变成梭形细胞，起到抑制和减缓纤维结缔组织向血管腔内的增生作用；所以该TIMP－4能抑制上述血管腔内的不正常的修复过程，保证血管内皮系统获得充分的正常修复同期。这一特点保障了PTCA术后的受损血管壁，有充分时间进行正常内皮修复，预防了血管再狭窄，特别是作为制备临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术后再狭窄药的重要的应用。

Description

TIMP-4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复药中的应用

                            技术领域

本发明涉及一种T1MP-4基因生物药的用途，特别是涉及一种TIMP-4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复药中的应用，临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术(PTCA)后再狭窄药的应用。

                              背景技术

众所周知，冠心病是严重危害人类健康的疾病之一。在美国一年内死于此病的人数约为40万-60万人。在中国，冠心病的发病率也呈逐年上升趋势，其发病率由70年代万分之10-20，90年代发展到约10％，其速度上升之快，罹患人数之多，足见该病的严重性。冠心病的病理基础，是供应心脏的冠状动脉血管粥样硬化所致的管腔狭窄，从而导致单位时间内供给心肠所需的血液供应量减少，造成急性心肌梗(AMI)及心绞痛(Ad)。80年代随着科技进步，对此病的诊治水平也有很大提高，其中冠心病球囊导管扩张成型术(以下简称PTCA)就是一种被广泛采用的治疗方法。美国一年约20万人做此种手术治疗。在中国，目前每年约有2-5万人做此种手术治疗。尽管如此，其PTCA术后约30％的血管再狭窄却一直困扰着医生和病人这无疑增加了病人的风险性同时也加重了病人的经济负担。

血管狭窄形成要具备多个因素，其最重要的因言之一就是血管劈内皮完整性遭破坏后，受损的血管组织刺激血液中血小板以及白细胞等量释放活性物质，从而启动了血管壁修复系统；同时，受损的血管壁分泌大量的MMP酶促使以梭形细胞为主的纤维结缔组织增生，这一非正常的修复过程见图3。

PCTA术是通过向球囊扩张导管的球囊内加压，从而压迫狭窄血管腔内凸起的附壁物质使其缩小或去除，从而达到治疗血管狭窄所致疾病的目的。与此同时，在此手术过程中也使血管内壁受损，导致血管内皮细胞的缺失，管壁的胶原组织裸露，因而启动上述血管修复程序。一般在手术后6小时后开始的14天内，机体的平滑肌MMP在酶的作用下，迅速向受损血管壁区域呈向心移动，并逐步转变成核形细胞，使血管壁增淳，管腔变窄，使病人不得不面临再次手术。

早在1991年美国的分子生物学家率先提出了TIMPS概念；并对该家族的TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3功能进行了深入研究。以后陆续可见到有关一TIMPS与肿瘤的浸润及转移相互作用关系的论文发表。

五年前(1996年初)，本申请人首次成功克隆出TIMP-4基因(见图1)，并对TIMP-4在肿瘤生物学方面的功能作了详尽研究，参见文献1：″Molecular Cloning andCharacterization of Human Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 4″，John Greeneet al.，The Journal of Biological Chemistry，Vol.271，No.48，pp.30375-30380，1996.

本发明的目的在于克服已有技术的缺点和不足，为了减轻病人的痛苦，提高冠心病球囊导管扩张成型术成功率，防止PTCA术后血管再狭窄给病人造成再次手术治疗痛苦，从而提供一种TIMP-4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复药中的应用，特别是作为制备临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术后再狭窄药的应用。

                              发明内容

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供的一种TIMP-4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复药中的应用、作为制备临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术后再狭窄的药的应用；该药含有如图1所示的TIMP-4基因的cDNA完整序列，把TIMP-4基因装入哺乳类动物细胞特异表达载体pcI-neo亚克隆成PCINTIMP-4(见图3)，将PCINTIMP-4作为一种基因药物，它用于预防治疗心脏血管疾病，和TIMP-4基因生物药用于所有经血管介入检查治疗引起的血管内皮系统非正常修复所致的血管腔狭窄；将PCINTIMP-4以电导介入技术，转染到皮肤、肌肉，血管等组织中，肌肉或皮下注射TIMP-4基因，以及血管内局部实药的给药途径。

本发明的药采用ETS方法首先从人类乳脂指组织中克隆签定出TIMP-4蛋白(见参见文献1)，人类TIMP-4蛋白基因的完整序列含有118个碱基对，表达的TIMP-4蛋白由225个氨基酸组成(如图1所示的)。然后应用亚克隆技术，选取ECORl和Xhol内切酶，切割含有TIMP-4基因的扩增质粒后得到完整序列的TIMP-4基因，在将其装入到入哺乳类动物的特异表达载体中(如图3)；将此载体以电导介入技术经皮肤转染到哺乳类动物的肌细胞中，具体电导介入条件是电压100-150伏，单侧腿部肌肉内注射TIMP-4基因质粒300-1000μg/Kg。在肌细胞内TIMP-4基因经转录翻译后形成特定功能的特异性TIMP-4蛋白，即TIMP-4基因生物药。TIMP-4基因在进入肌肉内6小时，在血中开始出现，7天后达到最高，14天后消退。

TIMP-4蛋白的225个氨基酸分成两个功能基团，即氨基功能端和羧基功能端，氨功能端承担抑制MMP酶、抑制平滑肌移动及向梭形细胞分化的多种生物功能。羧基功能端主要参与TIMP-4蛋白自细胞膜内向细胞膜外分泌的功能。

本发明的T1MP-4基因所表达的蛋白，通过抑制MMP酶的活性，达到抑制平滑肌细胞迁移并减少平滑肌细胞变成梭形细胞。TIMP-4基因蛋白特异性限断MMP酶，降低血管平滑肌的迁移。TIMP-4基因蛋白特异性阻断MMP酶，阻断平滑肌细胞转变成梭形细胞。TIMP-4基因蛋白特异性阻断MMP酶，抑制血管平滑肌细胞的增生。

TIMP-4基因药的应用能有效防治脑动脉瘤导管治疗后的再狭窄，对临床预防治疗PTCA术后再狭窄。

TIMP-4基因有效防治在病理变化过程中有TIMP-4参与的所有疾病，如：慢性延性肝炎，大面积烧伤后的疤痕修复以及关节炎等。

本发明的优点在于：本发明涉及的TIMPS家族包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，他们所表达的蛋白是一组特异性的抑制MMP酶的生物酶，是一种公认的MMP酶阻止剂，由于T1MP-4基因是T1MPs基因家族中的重要成员，其蛋白具有强烈的待异性抑制MMP酶的作用，达到抑制平滑肌细胞迁移并减少平滑肌细胞变成梭形细胞，起到抑制和减缓纤维结缔组织向血管腔内的增生作用；所以该TIMP-4能抑制上述血管腔内的不正常的修复过程，保证血管内皮系统获得充分的正常修复同期。这一特点保障了PTCA术后的受损血管壁，有充分时间进行正常内皮修复，预防了血管再狭窄；从而本发明提供了一种TIMP-4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复药中的应用，特别是作为制备临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术后再狭窄药的重要的应用。

(二)对施行冠心病球囊导管扩张成型术后的病人，给予TIMP-4基因药物能有效防治PTCA术后的血管再狭窄，提高了PTCA手术成功率。

(三)此技术可预防所有经血管介入检查治疗后，所引起的血管内皮受损，从而导致的血管腔内皮系统的非正常修复过程。

(四)TIMP-4基因能有效防治脑动脉瘤导管治疗后的再狭窄。

(五)TIMP 4基因有效防治在病理变化过程中有TIMP-4参与的所有疾病，如：慢性延性肝炎，大面积烧伤后的疤痕修复以及关节炎等。

(六)TIMP-4基因电导从技术，将替代被广泛应用的“血管支架”技术方法。

(七)TIMP-4基因电导介入技术，是一种经济、简便、安全的基因治疗技术。

                            附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明：

图1是TIMP-4基因的cDNA完整序列

图2是TIMP-4蛋白所表达的二级结构

图3是PCINTIMP-4载体的基因示意图

图4是受损血管壁修复示意图

图5A是正常颈动脉血管，管腔通畅管壁各层薄厚均匀；

图5B是实验对照组大鼠颈动脉血管，管腔内壁大量梭形向腔内隆起，几乎将血管壁完全闭塞；

图5C是实验治疗组，颈动脉血管管腔仅见平滑肌轻度增生，血管腔约10％狭窄，即90％的管腔内内颈通畅；

图6是用Western bl ot法检测大鼠血液中TIMP-4蛋白的浓度，黑色条纹代表阳性，无黑色条纹代表阴性；黑色条纹的深浅、粗细代表浓度的差异，也就是黑色条纹越深、越款代表浓度越高；

其中图6A是实验治疗组TIMP-4蛋白血浆浓度：1号代表术前一天，2号代表术后2天，3号代表术后7天，4号代表术后10天，4号代表术后10天，5号代表术后14天，6号代表术后21天，7号代表术后28天；

其中图5B是实验对照组，全部呈阴性；

                            具体实施方式

实施例1

(一)构建哺乳类动物的特异表达载体

1.完整序列TIMP-4基因的获得：

(1)将扩增载体转化到大肠杆菌中(DH52)；

(2)在平皿中挑选鉴定阳性菌株；

(3)将阳性菌株放入LB培养基中，在37℃条件下200rpm摇荡培养约12小时；

(4)从培养的菌株中提取扩增载体；

(5)用ECOR1和Xhol内切酶切割扩增载体后，在1.2％的Agar胶中分离DNA片段；

(6)从步骤(5)的Agar胶中提取完整序列的TIMP-4基因；

2.构建完成PCINTIMP-4

(1)用ECOR1和Xhol内切酶切割pCl-neo载体(购自Promega Corporation)；(2)走胶纯化得到线形的pCl-neo载体；(3)T4 Ligase将1∶1摩尔比的线形的pCl-neo和全长TIMP-4基因连接在一起；(4)培养鉴定后得到PCINTIMP-4阳性克隆；(5)大量培养阳性菌，提取后得到所需数量的PCINTIMP-4载体(二)PCINTIMP-4在哺乳类动物体内表达成TIMP-4蛋白。

实施例2选Wester雄性大鼠20只，体重约30克左右，随机分成实验、对照两组，各10只雄性大鼠。经用苯巴比妥钠40mg/Kg腹腔注射后，仰视、平卧于动物手术台上，通过穿刺针介入颈动脉内，应用2F球束扩张导管(Arterial Embolectomy Catheter2F；Baxter Healthcare Corporation；Vascular systems Division；irvine，CA92614-5686 USA)0.2ml水柱压力，损伤颈动脉血管腔内皮，然后，撤除导管，止血。其实验组于术前7天在双测股四头肌(Thighmuscle)，使用直流电导发生仪(KROHN-HITE CORP.Model 5700-1 Avon，Massachusette USA)50-400HZ，3.5W，115/230V，将TIMP-4基因转染到哺乳类动物的肌细胞中，100-150V电压单侧肌肉内注射TIMP-4，剂量为600μg/Kg，10天后应用相同方法及同剂量的TIMP-4，再次实施一次。术后3周，处死大鼠，取材制片，经染色后，如图5所示(HE染色)，同时，本发明为测定TIMP-4血中浓度变化值，选择了TIMP-4注射前一天采集的血样，以及注射后2天、7天、10天、14天、21天、28天分别取血测定，结果如图6所示。

Claims (7)

1，TIMP-4基因作为制备临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术后再狭窄药中的应用。

2，TIMP-4基因作为制备临床预防治疗经血管介入检查治疗引起的血管内皮系统非正常修复所致的血管腔狭窄药中的应用。

3，TIMP-4基因作为制备临床防治脑动脉瘤导管治疗后的再狭窄药中的应用。

4，TIMP-4基因作为制备临床治疗大面积烧伤后的疤痕修复药中的应用。

5，按权利要求1、2、3或4所述的任一项TIMP-4基因作为制备临床治疗心血管和疤痕修复的药中的应用，其特征是：所述的药含有TIMP-4基因的cDNA完整序列，和把TIMP-4基因装入哺乳类细胞特异表达载体PcI-neo亚克隆成PCINTIMP-4。

6，按权利要求1、2、3或4所述的任一项TIMP-4基因作为制备临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术后再狭窄药的应用，其特征是：所述的给药方式是将PCINTIMP-4以电导介入技术，转染到皮肤、肌肉，血管等组织中。

7，按权利要求6所述的任一项TIMP-4基因作为制备临床预防治疗冠心病球囊导管扩张成型术后再狭窄药的应用，其特征是：所述的电导介入条件：0电压100-150伏，单侧腿部肌肉内注射TIMP-4基因质粒300-1000μg/Kg。

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