CN110731969A - 一种间充质干细胞的制备及在制备疼痛药中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种间充质干细胞的制备及在制备疼痛药中的应用，属于生物技术和生物医药领域。间充质干细胞的新用途，用于制备疼痛药的用途。本发明所述的间充质干细胞为来源于任意组织的间充质干细胞。来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。治疗各种不同病因导致的疼痛，直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射或皮内注射。

Description

一种间充质干细胞的制备及在制备疼痛药中的应用
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及使用不同组织来源的间充质干细胞制备疼痛药的应用以及所用的细胞制剂。
背景技术
疼痛是组织损伤或潜在组织损伤所引起的不愉快感觉和情感体验，是一种主观感受。疼痛和人体呼吸、血压、脉搏、体温四大生命体征一起被列入第五大生命体征。已知，可使用一些按摩、红外等理疗的方法，或者使用抗炎、镇痛药物来改善和治疗疼痛。理疗的方法只能短暂的缓解症状，而药物镇痛不仅产生依赖，而且具有较大的副作用，以上这些方式均无法较长期的改善疼痛症状。
间充质干细胞是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。目前，间充质干细胞移植已经成功应用于包括神经系统、消化系统、免疫系统等多个系统的疾病治疗。
近年来，间充质干细胞已经作为生物制药成功应用于膝关节疾病的治疗，但治疗目的均以增强和改善膝关节活动为主，或以再生膝关节软骨细胞为目的，以专用于治单一疗疼痛为目的的没有人提出。另外，在间充质干细胞对于疼痛治疗的领域尚属于空白，没有人发现其具备抗疼痛的功能，本发明所述的治疗疼痛并不是指疼痛部位的病灶治愈而没有疼痛。
发明内容
本发明提出间充质干细胞的新用途，用于制备疼痛药的用途。
本发明所述的间充质干细胞为来源于任意组织的间充质干细胞。来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。
不同组织来源的间充质干细胞组织可以采用不同处理方法，但从原代细胞培养后的方法均相同。
本发明以脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物(优选：商品名称：Ultroser G serumsubstitute；货号：15950-017；购自美国pall公司，以下同)的基础培养基(高糖DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；
CO2培养箱培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入(如20ml)含有10wt％血清替代物的基础培养基(高糖DMEM培养基)，平置培养瓶，放置到CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；
(8)收获原代细胞
细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获
配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入细胞消化液，使每个培养瓶的细胞消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使细胞消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入基础培养基(高糖DMEM培养基)，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(9)原代细胞传代(P0传P1)
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有所述血清替代物的基础培养基(高糖DMEM培养基)，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的基础培养基(高糖DMEM培养基)定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。
种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入对应的培养基20ml。
按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为治疗疼痛的干细胞来源。所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了间充质干细胞在制备治疗疼痛药物上的新用途，所述的疼痛药物适合治疗各种不同病因导致的疼痛，具体包括：①、炎症、风湿、劳累等所有因素导致的颈、肩、腰、腿、膝关节疼痛；②、不明原因导致的神经疼痛；③、肌肉疼痛；④、各种因素导致的头痛；⑤、各种肿瘤伴随的疼痛。
本发明所述的疼痛药的用法为：直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射或皮内注射。其中该间充质干细胞注射物进一步包含一种可注射载体。
其中可注射时载体可选自透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、或者其他治疗相关的药物。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的脐带间充质干细胞的照片。
图2为本发明实施例1制得的脐带间充质干细胞的流式细胞仪鉴定照片。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1脐带间充质干细胞的制备
本发明所述的脐带间充质干细胞主要来源于人脐带间充质干细胞，但干细胞来源不仅限于脐带，可来源于人体胎盘、骨髓、牙髓、脂肪等多个人体组织来源。
其中，脐带间充质干细胞的制备过程如下：
(1)脐带间充质干细胞的培养：剪取新鲜脐带，用无菌生理盐水清洗干净后，进一步去除脐动脉和脐静脉，剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤，将华通氏胶剪碎至大小约1mm3大小后放入细胞培养皿中，加入含有10wt％血清替代物(商品名称：Ultroser G serumsubstitute；货号：15950-017；购自美国pall公司，以下同)的基础培养基(高糖DMEM培养基)至刚好覆盖组织块，置于37℃二氧化碳培养基中培养。约10-14天后可见梭型细胞从组织块中爬出，此即为脐带间充质干细胞，经过几次传代，当到3-6代的时候即可使用来制备用于疼痛治疗的细胞药物。如图1和图2所示，图1和图2分别是脐带间充质干细胞的培养图片和流式细胞仪鉴定图片。具体培养可见发明内容。
(2)脐带间充质干细胞作为疼痛治疗药物的配置：通过胰酶消化获取间充质干细胞，用0.9％的生理盐水反复清洗细胞3遍，以去除相关的培养基成份，而后计数细胞，一般用于治疗疼痛的有效细胞数量为2*106-2*107之间，具体选择细胞注射数量根据疼痛的部位、疼痛的程度不同而定，其中注射载体可选自透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、或者其他治疗相关的药物。细胞用于治疗的方式为：直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射，皮内注射。
实施例2间充质干细胞对落枕疼痛的评价实验
落枕是一种常见病，好发于青壮年，以冬春季多见。落枕的常见发病经过是入睡前并无任何症状，晨起后却感到项背部明显酸痛，颈部活动受限。一般落枕患者需要3-7天恢复正常。选取8例落枕的患者，均于落枕发生后第二天进行间充质干细胞局部皮下注射，在疼痛评价后，通过局部多点注射总量为2×106个的人脐带间充质干细胞，分别在注射后的第2、4、7天让患者填写疼痛评估量表。8例患者在注射后第2天均有疼痛改善减轻，其中5例患者疼痛全部消失。另外3例患者疼痛评分从4±2降低至1±1分，注射后第4天所有患者疼痛均消失，第7天疼痛评评价时均未再有痛感。干细胞只是对患者的疼痛症状进行缓解。
实施例3间充质干细胞对颈椎病慢性疼痛的评价实验
选取10例颈椎病慢性疼痛的患者，所有入组的患者疼痛时间均已经超过1个月，平均疼痛时间为37±22天，使用数字疼痛评估量表评价所述个体的疼痛。在疼痛评价后，通过局部多点注射总量为2×106个的人脐带间充质干细胞，分别在注射后第二天，第七天以及一月后让患者填写疼痛评估量表。10例患者在注射后第二天均有疼痛改善减轻，疼痛评分从6±2降低至4±1分，第七天后疼痛评分继续进一步减轻至2±1分，其中7位患者10天时痛感消失，剩余3位患者1个月评分时痛感消失。干细胞只是对患者的疼痛症状进行缓解，发现对颈椎病本身没有治疗作用。
实施例4间充质干细胞治疗皮肤瘢痕形成导致的疼痛。
一例55岁男性患者，因多次心室辅助装置植入，出现手术切口附近瘢痕形成不，疤痕组织周围出现严重的疼痛，影响了睡眠。由于疤痕疼痛和相关的呼吸困难，每天的各项基本生理活动均受到影响，传统的治疗方法比如止痛药物等均未能缓解疼痛。给于局部多点注射2*106人脐带间充质细胞到疤痕周围的上、下、内侧和外侧部分后，患者疼痛显著减轻。20d后，再次给予同样剂量的干细胞治疗后，患者于一周后疼痛完全消除。干细胞只是对患者的疼痛症状进行缓解，发现瘢痕本身没有治愈。
实施例5间充质干细胞治疗肝癌形成导致的疼痛。
一例62岁男性患者，因肝癌晚期伴有肝腹水出现，肝区部位出现严重的疼痛，严重影响了睡眠，每天依赖杜冷丁维系缓解，后期装置了疼痛泵缓解疼痛，随着时间延长疼痛逐渐加重。给于局部多点注射2*106人脐带间充质细胞到肝区周围后，每周注射一次，2周后患者疼痛显著减轻，配合疼痛药物后疼痛可以基本控制，提高了患者生活质量。干细胞只是对患者的疼痛症状进行缓解，发现癌症本身没有治愈作用。
以上所述间充质干细胞在疼痛领域的应用仅为本发明的较佳实施例，故不能依此限定本发明实施的范围，即根据本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞的应用，在制备疼痛药中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，所述的间充质干细胞为来源于任意组织的间充质干细胞。来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。
3.按照权利要求1所述的应用，所述的疼痛药物适合治疗各种不同病因导致的疼痛，具体包括：①、炎症、风湿、劳累等所有因素导致的颈、肩、腰、腿、膝关节疼痛；②、不明原因导致的神经疼痛；③、肌肉疼痛；④、各种因素导致的头痛；⑤、各种肿瘤伴随的疼痛。
4.按照权利要求1所述的应用，疼痛药的用法为：直接疼痛部位注射，静脉注射，肌肉注射，骨内注射，关节腔内注射，皮下注射或皮内注射。
5.按照权利要求4所述的应用，注射时载体可选自透明质酸、胶原蛋白、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白、或者其他治疗相关的药物。
6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物的基础培养基即高糖DMEM培养基，然后缓慢让它浸润整个组织块；
CO2培养箱培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入含有10wt％血清替代物的基础培养基高糖DMEM培养基，平置培养瓶，放置到CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；
(8)收获原代细胞
细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获
配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入细胞消化液，使每个培养瓶的细胞消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使细胞消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入基础培养基高糖DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(9)原代细胞传代(P0传P1)
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有所述血清替代物的基础培养基(高糖DMEM培养基)，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的基础培养基高糖DMEM培养基定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；
种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入对应的培养基20ml。
7.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为治疗疼痛的干细胞来源；所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)。
8.一种疼痛药，其特征在于，其中包括间充质干细胞；所述的间充质干细胞为来源于任意组织的间充质干细胞。来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。
9.按照权利要求8所述的疼痛药，其特征在于，间充质干细胞是作为镇痛的成分的。
10.一种疼痛药的制备方法，脐带间充质干细胞的获取方法为例，阐述间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤；
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-4mm的组织匀浆；用生理盐水洗涤组织匀浆，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有10wt％血清替代物(优选：商品名称：Ultroser G serumsubstitute；货号：15950-017；购自美国pall公司，以下同)的基础培养基(高糖DMEM培养基)，然后缓慢让它浸润整个组织块；
CO2培养箱培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入(如20ml)含有10wt％血清替代物的基础培养基(高糖DMEM培养基)，平置培养瓶，放置到CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作；
(8)收获原代细胞
细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获
配置细胞消化液：按照体积比1:4的比例混合胰酶与生理盐水，混合液即为细胞消化液；
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入细胞消化液，使每个培养瓶的细胞消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使细胞消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入基础培养基(高糖DMEM培养基)，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(9)原代细胞传代(P0传P1)
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有所述血清替代物的基础培养基(高糖DMEM培养基)，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后的细胞悬液接种到培养瓶并用含有血清替代物的基础培养基(高糖DMEM培养基)定容到一定体积，使细胞达到一定浓度；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。
种瓶：50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入对应的培养基20ml；按照上述传代方法依次传代，选取P3-P6代次的间充质干细胞为治疗疼痛的干细胞来源；所获得的间充质干细胞经过流式细胞仪鉴定纯度，符合细胞表型为：CD34/CD45/CD11b/CD19/HLADR(-)，CD90/CD105/CD73(+)。
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