CN108938670A - 一种人脐带间充质干细胞抗类风湿性关节炎的治疗方法 - Google Patents

一种人脐带间充质干细胞抗类风湿性关节炎的治疗方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种治疗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂，包括间充质干细胞、人血白蛋白和NS。本发明通过采用间充质干细胞结合人血白蛋白和NS，能够在减轻患者疼痛的同时阻止炎症介质的释放，减轻炎症反正，从而使患者体重明显增加。同时，可不同程度增加CD4+/CD8+比值，降低血清中TNF‑α和IL‑6水平。

Description

一种人脐带间充质干细胞抗类风湿性关节炎的治疗方法
技术领域
发明涉及细胞工程领域，具体而言，涉及一种人脐带间充质干细胞抗类风湿性关节炎注射液及其制备方法。
背景技术
风湿性关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的系统性自身免疫疾病，受累关节具有对称性、持续性肿胀和疼痛特点，常伴有晨僵。类风湿性关节炎以滑膜炎为病理改变特征，可引起关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形，给患者身体和精神带来极大痛苦。临床上治疗类风湿性关节炎的传统药物包括非甾体抗炎药、糖皮质激素和免疫抑制剂，这些药物的联合应用可缓解类风湿性关节炎病情，但长期服用这些药物具有副作用，例如非甾体抗炎药可引起胃肠道反应、恶心、呕吐、上腹痛、胃粘膜糜烂出血等，免疫抑制剂可抑制机体免疫能力，增加患者感染肺炎、肺结核的风险。同时随着疾病的进展很大一部分患者对传统治疗药物不敏感，导致长期处于较高的疾病活动度。流行病学调查研究结果显示我国类风湿关节炎发病率为0.37%，估计患者人数约440万，可见积极研究类风湿性关节炎的病理生理机制及寻找新型有效治疗药物具有重要的社会意义。
风湿性关节炎是一种细胞免疫和体液免疫均紊乱的自身免疫疾病，虽然其发病原因至今还不明确，但是从细胞因子角度在分子和细胞水平上对类风湿关节炎发病机理的研究在近年来取得了实质性的进展。研究发现肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-15、白细胞介素-18、白细胞介素-6、白细胞介素-12和白细胞介素-17等在类风湿性关节炎的滑膜病变中起核心作用。全球制药巨头基于这些细胞因子为靶点已经开发成功多种生物制剂，目前获得治疗批准的药物包括以肿瘤坏死因子-α为靶点的修美乐、恩利及英夫利昔单抗等，以白细胞介素-6受体为靶点的托珠单抗及以白细胞介素-1受体为靶点的阿那白滞素等，这些新型生物制剂的出现标志着类风湿关节炎治疗已进入生物制剂时代，为类风湿性关节炎患者提供了多种治疗机会。但同时我们也注意到由于参与类风湿性关节炎的细胞因子种类繁多，目前尚未明确哪种细胞因子在类风湿性关节炎发生中占据主要作用，所以基于单一细胞因子靶点所开发的药物仍具有治疗局限性，这就提示科学家应该综合多种靶点进行类风湿性药物的研发，通过调节机体整体免疫水平从而有疗类风湿性关节炎。
现代医疗技术进步多种疾病相继得到有效治疗，使得人类预期寿命显著延长和生命质量大大提高，但同时我们也意识到现有医疗技术水平对于慢性疾病、自身免疫疾病和肿瘤等疾病的治疗仍旧无法根治，而干细胞的发现和再生医学技术的出现，有望获得治疗这些疾病的钥匙。干细胞是一类非特异性的细胞类型，具有自我复制和分化的潜能，在一定条件下可以分化成多种功能的细胞。根据干细胞所处的发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞；根据干细胞的发育潜能，可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞等。干细胞医疗技术被《科学》、《自然》等杂志评为二十一世纪生物科学领域最具发展前景的技术，是攻克各种传统医学力所不及的重大疾病的一种全新医疗技术。
间充质干细胞作为一种成体干细胞最初发现存在于骨髓中，是一种能贴附培养皿呈长梭形成纤维样细胞。除骨髓外，研究证实机体多种组织均含有间充质干细胞，例如脂肪组织、肌肉、肝脏和脐带血。由于间充质干细胞来源的多样性及异质性目前仍没有明确的生物学标志，为此国际干细胞治疗协会在2006年制定了间充质干细胞鉴定的最低标准：贴壁生长；表达CD73、CD90和CD105，不表达CD34、CD45、CD14、CD19和HLA-DR；体外可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。人脐带间充质干细胞中等表达人白细胞抗原主要组织相容复合物Ⅰ（MHCⅠ），不表达人白细胞抗原主要组织相容复合物Ⅱ（MHCⅡ）和CD40、CD80、CD86等共刺激分子，MHCⅠ的表达使得间充质干细胞可逃避自然杀伤细胞的免疫作用，缺乏共刺激分子使得T细胞对间充质干细胞无变应性反应。间充质干细胞一方面可抑制T淋巴细胞增殖和激活，另一方面通过旁分泌的可溶性蛋白因子参与细胞迁移、维持局部微环境。人胚胎干细胞来源的间充质干细胞无血清培养上清液中检测到201种分泌性因子，其中包括细胞因子、生长因子、趋化因子及造血因子等。因此，多项临床研究报道间充质干细胞能够调节免疫应答，使得免疫系统产生免疫豁免，可用于同种异体移植。
发明内容
发明提供了一种供研究的目的在于提供一种脐带来源的间充质干细胞，为类风湿性关节炎的治疗提供新的手段。
发明的另一个目的是提供了构建人脐带间充质干细胞的方法。
概括的说，本发明设计了一对针对治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂，包含人脐带间充质干细胞、人血白蛋白，目的是阻止炎性介质的释放，减轻炎症反应，从而减轻组织损伤，有利于组织病情进展。
本发明提供的治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂中，所述人脐带间充质干细胞的浓度均为1*107个／mL。
获取人脐带间充质干细胞，采用P6代间充质干细胞。
在本发明提供的治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂中，所述干细胞制剂中，添加人血白蛋白的质量分数为2%。
获取人脐带间充质干细胞，用PBS重悬后加入人血白蛋白，再加入NS至20mL。
本发明提供的治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂的制备方法中，所述干细胞制剂均为20mL包装。
实施本发明提供的治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂及其制备方法和应用，可以达到以下效果：本发明可以阻止炎症介质的释放，减轻炎症反正，从而使患者体重明显增加。同时，可不同程度增加CD4+/CD8+比值，降低血清中TNF-α和IL-6水平。
附图说明
图1为本专利研究技术路线。
图2为实验结束时各组小鼠后爪外观图。
图3为各组大鼠关节病理观察。
图4为人脐带间充质干细胞注射液对甲酰三肽趋化白细胞的影响。
图5为人脐带间充质干细胞注射液对甲酰三肽趋化白细胞的影响。
图6为人脐带间充质干细胞对Ⅱ型胶原诱导T细胞增殖的影响。
图7为各组大鼠血清中TNF-α和IL-10含量变化。
具体实施方式
用于抗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂的制备过程如下：
获取人脐带间充质干细胞；
采用P6代干细胞；
将1*107 P6代人脐带间充质干细胞添加人血白蛋白，质量分数为2%；
向获得的细胞悬液添加NS，定量到20mL；
获得本发明提供的治疗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂。
为进一步验证本发明提供的人脐带间充质干细胞制剂治疗类风湿性关节炎的效果，设置以下实验进行验证。
实验动物：SPF级DBA/1小鼠，雌雄各半，7～8周龄，体重18±3g, 购北京维通利华实验动物技术有限公司。将实验小鼠随机分笼，饲养于实验室动物房，全部自由摄食和饮水，每日更换饮水瓶一次，每隔两天更换垫料一次。
Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠模型的制备：将小鼠置于自制的固定盒子中，左手拇指和食指轻轻提起背部皮肤，右手持注射器，将针头刺入皮下，并稍向前刺入，即可注入药物。每只实验小鼠背部取4-6点进行皮下注射，总共注射200 µl胶原-完全弗氏佐剂混合乳剂，注射后将针头在皮下部位停留一会，以防液体溢出。注射成功后皮肤表面鼓起一小突起。3周后，用同样的方法将不完全弗氏佐剂与牛Ⅱ型胶原乙酸溶液等量混合并乳化，于每只小鼠尾根部取3-5点进行皮下注射，总共100 µl，进行加强免疫。正常对照组小鼠按照上述方法注射无菌生理盐水。
动物分组及给药方法：模型小鼠接受第二次免疫佐剂后随机分为模型组、甲氨蝶呤阳性对照组、干细胞低剂量组和高剂量组，同期饲养不接收任何处理小鼠作为空白组，每组12只。除空白组与模型组尾静脉注射生理盐水外，干细胞治疗组分别通过尾静脉注射数量为5x105和5x106的人脐带间充质干细胞，阳性对照组腹腔注射甲氨蝶呤1mg/kg，注射体积20 ml/kg，每周一次，连续3周。
关节炎评分标准：0分，无明显改变；1分，一个趾头明显肿胀和发红；2分，轻度的肿胀和肢体的红斑或两个趾头的肿胀；3分，三个趾头出现明显的肿胀和肢体的红斑；4分，整个关节出现肿胀和发红，甚至关节僵直，严重功能障碍。
表1:实验小鼠关节炎评分比较
表2: T淋巴细胞亚群分析
表3:大鼠血清中TNF-α和IL-6含量
结果显示，人脐带间充质干细胞注射液对甲酰三肽趋化白细胞的影响及对Ⅱ型胶原诱导T和B细胞增殖的影响；体内研究分别采用Ⅱ型胶原诱导关节炎小鼠模型和佐剂性关节炎大鼠模型评价了人脐带间充质干细胞注射液治疗作用。

Claims (6)

1.一种治疗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂，其特征在于，包括人脐带间充质干细胞制剂、人血白蛋白和NS。
2.根据权利要求1所述的治疗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞制剂的浓度为5×105个/ml，制剂规格为20mL。
3.根据权利要求2所述的治疗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂，其特征在于，所述人血白蛋白的质量分数为2%。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的治疗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
获取人脐带间充质干细胞，用基础培养基重悬间充质干细胞后加入人血白蛋白，获得干细胞混悬液，然后向干细胞混悬液中添加NS至20mL。
5.根据权利要求5所述的治疗类风湿性关节炎的人脐带间充质干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为P6代任一代的人脐带间充质干细胞。
6.根据权利要求1～3任一项所述的干细胞制剂在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
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