EA019305B1 - Способ получения плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма из крови, в частности периферической, и применение полученных клеток в области медицины - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма из крови, в частности из периферической крови, состоящему из этапа наращивания стволовых клеток крови сразу же после того, как они взяты, путем обработки клеток МКСФ в концентрации, составляющей 8-15 нМ, и дополнительного этапа очистки стволовых клеток после наращивания.

Description

Настоящее изобретение относится к способу наращивания стволовых клеток из крови, в частности, но не только, периферической крови взрослых млекопитающих, и к его соответственному применению в области медицины, в частности в ветеринарии для лечения повреждений, хронических и/или острых воспалительных патологий, неврологических и нейродегенеративных патологий. Здесь и далее в описании изобретения, и как известно из литературных источников, под словом наращивание понимается процесс увеличения количества клеток либо путем клеточного деления, либо, как в конкретно описанном и заявленном в формуле изобретения случае путем дедифференцировки, т.е. процесса, посредством которого присутствующие в крови клетки трансформируются в стволовые клетки после подходящей обработки ίη νίίτο, как будет показано далее в этом документе.

В последние годы использование стволовых клеток в терапии получило большую поддержку вследствие успеха при лечении различных патологий, которые ранее считались неизлечимыми. Однако методики получения стволовых клеток, известные в настоящее время, являются трудоемкими и дорогостоящими.

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) являются не только предметом исследования, но также служат для создания лекарств и трансплантантов (Аадега А. 1. с1 а1., 2002; ΟπΓΠΐΙι Ь. О. с1 а1., 2002).

Существуют две обширные категории стволовых клеток, эмбриональные и взрослого организма: первые получают от эмбрионов, точнее говоря, из 8-дневных бластоцист, в то время как стволовые клетки взрослого организма, напротив, могут быть получены, главным образом, из костного мозга, жировой или мышечной ткани и из периферической крови.

Определение стволовой клетки постоянно эволюционирует, и в настоящее время не существует общего мнения или стандартного способа их выделения или идентификации. Для всех этих клеток эмбриональных (ЭС) и взрослого организма, как гемопоэтических (ГСК), так и мезенхимных (МСК) (Киетапа М. еί а1., 2003), идентифицированы различные генетические маркеры, из которых некоторые являются общими для многих типов клеток (Сопбошшек М. еί а1., 2006; Капд А. 1. еί а1., 2006; 2йао Υ. еί а1., 2003; ВаЬтоуЦсй М. еί а1., 1976).

В частности, Ζΐιηο Υ. еί а1. в статье А йишап рег1рЬега1 Ыооб шопосуЮ-бепуеб шЬхе! ас15 а§ р1штроίеηί Цеш се11з и в АО 2004/043990 раскрывает способ получения стволовых клеток из моноцитов, который включает в себя следующие этапы: выделение моноцитов из периферической крови, взаимодействие их с митогенным фактором и затем культивирование моноцитов из периферической крови в условиях, подходящих для наращивания клеток.

Этот способ, для которого требуется, во-первых, этап выделения моноцитов и, во-вторых, этап наращивания клеток в питательной среде, занимает очень много времени для получения существенного количества стволовых клеток, порядка 15-20 дней, и не позволяет получить стволовые клетки тотипотентного типа, т.е. неспециализированные, подходящие для прямого внесения пациенту в течение очень короткого времени после первого взятия крови.

В многочисленных научных работах описывается способность стволовых клеток восстанавливать различные типы повреждений, регенерируя ткани, которые повреждены механически или в результате различных патологий, устраняя в корне причины возникновения патологии, а не просто воздействуя на ее последствия.

В настоящее время научные исследования в основном направлены на использование стволовых клеток, полученных из эмбриональных тканей, фетусов или из пуповины, но в связи с этим возникают различные юридические и этические вопросы. Но самое главное, на сегодняшний момент, использование этих клеток имеет различные противопоказания, такие как риск инфекций, риск отторжения при трансплантации и, у лошадей, риск возникновения тератом.

Для того, чтобы избежать этих проблем, было решено использовать в терапии ίη νί\Ό аутологичные стволовые клетки, выделенные предпочтительно из костного мозга, жировой ткани или периферической крови.

Эти способы, в которых используются в качестве исходного материала стволовые клетки взрослого организма, включают этап дифференцировки ίη νίΙΐΌ (или ех νί\Ό) стволовых клеток в желаемые клеточные линии под действием специфических индуцирующих дифференцировку факторов, и последующий этап трансплантации ίη νί\Ό полученной дифференцированной клеточной линии. Ограничение этих способов связано с тем, что поскольку дифференцированные клетки в течение индуцированной стадии ίη νίίΐΌ дифференцировки утрачивают факторы, отвечающие за распознавание клеток как своих, вводимые пациенту вновь, не распознаются как свои и возникает наблюдаемая реакция отторжения.

При получении стволовых клеток из периферической крови человека их очистка проводится с помощью процесса, называемого аферезом или лейкоцитоферезом. На практике, клетки выделяют из крови, собирают и затем вносят пациенту сразу же после химио- или радиотерапии. При аферезе, который длится от 6 до 8 ч, забирают кровь из вены руки или шеи, или грудной клетки и пропускают через аппарат, который удаляет стволовые клетки. Кровь, очищенная таким образом, возвращается пациенту, в то время как собранные клетки сохраняют путем замораживания в жидком азоте (Со^отше^ М. еί а1., 2006; Вайд А. 1. еί а1., 2006). Такая методика не только болезненна, но также чрезвычайно тяжела для пациента. Кроме того, эта методика непригодна к использованию у животных как маленьких, так и

- 1 019305 больших размеров; а главное, не обеспечивает достоверного определения и/или очистки циркулирующих стволовых клеток.

В настоящее время, в ветеринарии, стволовые клетки успешно применяют главным образом для восстановления сухожилий и поврежденных связок.

Основными методиками очистки являются:

использование ростовых или тромбоцитарных факторов (ТОР-В, УБОР), но экономическая стоимость их получения чрезмерно высока (Нои М. с1 а1., 2006);

выделение стволовых клеток из костного мозга. Эта методика позволяет очистить и затем использовать для лечения только 15% клеток, содержащихся в экстрагированном материале;

выделение стволовых клеток из жировой ткани. В этой методике, для которой требуется предварительное хирургическое удаление существенного количества ткани животного-донора, нельзя применять внутривенное введение;

ЮР-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), известный как Тепйо1горЫи (Р|сй1сг 1. с1 а1., 2006);

ИВМ (внеклеточный матрикс мочевого пузыря) является производным из свиньи, содержащим цитокины (но не клетки с ядром), которое вызывает заживление раны, но не восстановление всей зоны повреждения (Ζΐιηηβ Υ. 8. с! а1., 2005).

В свете всего вышеуказанного очевидно, что необходимы способы наращивания и очистки стволовых клеток взрослого организма из легко доступных источников, которые также должны позволять получать такие стволовые клетки, подходящие для использования в качестве лекарственного средства в медико-ветеринарной области, которые, будучи введенными млекопитающему, не вызывали бы реакции отторжения и которые было бы просто сохранять.

Существует также явная необходимость получать стволовые клетки плюрипотентного и тотипотентного типов, то есть неспециализированные, которые напрямую можно было бы вносить пациенту и которые имели намного меньшее время получения, чем в существующих на сегодняшний день способах.

Авторы настоящего изобретения усовершенствовали способ наращивания и выделения ίη νίίτο стволовых клеток из периферической крови, который позволяет получать такие стволовые клетки, которые, будучи введенными взрослому млекопитающему, не дают таких побочных эффектов, как реакция отторжения, инфекция и тератомы; способны дифференцироваться ίη νίνο и вести себя как плюрипотентные стволовые клетки.

Авторы показали, что размножаемые таким образом клетки, будучи введенными локально или внутривенно, приобретают ίη νίνο (а не ίη νίίτο, как в известных способах существующего уровня техники и с помощью подходящих ростовых факторов и/или химических стимулов (Ои1ай Я. с! а1., 2003; Ка1х Я. Ь. с! а1., 2002; Окахак! Т. с! а1, 2005)) все морфологические и химические характеристики макрофагов, лимфоцитов, гепатоцитов, эпителиальных, эндотелиальных и нервных клеток, в соответствии с необходимостью и типом патологии животного, подвергаемого лечению. Настоящий способ даже менее агрессивен, чем другие используемые до сих пор способы сбора стволовых клеток; безболезненный (если сравнивать с афарезом); экономичный и технически наиболее подходящий для использования у всех видов животных (маленьких и больших).

И, наконец, возможность простого получения этих клеток и сохранения их в течение длительного времени замороженными в жидком азоте, делает клетки, полученные этим способом в соответствии с настоящим изобретением, подходящими для аутологичных трансплантаций в лечении многих патологий человека и животных (различных повреждений, болезней обмена веществ, острых и хронических неврологических и воспалительных патологий) или для улучшения тех качеств некоторых животных, например, таких как лошади, которые необходимы для участия в соревнованиях.

Поэтому настоящее изобретение в особенности относится к способу наращивания стволовых клеток взрослого организма крови, в частности, но не только, из периферической крови, состоящему из следующих этапов.

Первый этап состоит из двух подэтапов:

a) первый подэтап наращивания стволовых клеток крови, в частности, но не только периферической крови, путем обработки ίη νίίτο клеток МКСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор) в концентрации, составляющей 8-15 нМ, предпочтительно 10 нМ, сразу же после того, как они взяты; этап наращивания может иметь различную продолжительность в зависимости от условий, в которых проводится обработка ίη νίίτο. Авторы подтвердили экспериментально, что продолжительность обработки ίη νίίτο клеток МКСФ, длящейся от 24 до 96 ч, а предпочтительно от 48 до 72 ч, привела к стабилизации роста клеток с идентификацией одновременного присутствия маркеров СЭ90. СЭ34 и смешанного СЭ90/СЭ34. Такие условия считали оптимальными.

Под сразу же подразумевают кратчайший возможный промежуток времени между тем, как клетки были взяты, и началом обработки ίη νίίτο, в любом случае - не более 10 мин, предпочтительно не более 5 мин.

b) после первого подэтапа следует второй подэтап очистки, осуществляемый предпочтительно путем фракционирования в градиенте фиколла.

Этап очистки в основном направлен на разрушение эритроцитов и культивирование макрофагов и

- 2 019305 моноцитов на чашках.

Поэтому, в противоположность существующему уровню техники, настоящее изобретение относится прежде всего к этапу наращивания клеток путем их взаимодействия с МКСФ и возможным антикоагулирующим веществом, например, в подходящей пробирке; этот этап наращивания проводится сразу же после того, как клетки были взяты из крови пациента, без выделения конкретных их частей и использования какой-либо питательной среды.

Следующий после очистки этап состоит из:

с) дальнейшего наращивания стволовых клеток крови, в частности, но не только, периферической крови, очищенных на этапе Ь) путем обработки ίη νίίτο клеток МКСФ в концентрации, составляющей 3555 нМ, предпочтительно 50 нМ, более предпочтительно 45 нМ.

Продолжительность этого этапа также может меняться от 24 до 96 ч, предпочтительно от 48 до 72 ч.

Было обнаружено, что при использовании МКСФ в концентрации более, чем 55 нМ (т.е. 70 нМ) уже по прошествии 24 ч клетки утрачивали фенотип плюрипотентных стволовых клеток (см. фиг. 12). В частности, этап а) предварительного наращивания в суспензии с МКСФ сразу же после забора крови позволяет повысить процент стволовых клеток относительно популяции моноцитов и макрофагов (см. фиг. 13). Следующий этап позволяет получить плюрипотентные стволовые клетки, которые напрямую подвергаются дифференцировке ίη νινο, не вызывая реакции отторжения или инфекции.

Изобретение также относится к применению стволовых клеток взрослого организма, полученных в соответствии с описанным выше способом наращивания, в получении лекарственного средства для лечения повреждений. Подвергаемые лечению повреждения принадлежат к следующей группе: повреждения кожи, повреждения сухожилий, связок, костей, слизистых оболочек у млекопитающих или переломы.

Настоящее изобретение также относится к применению стволовых клеток взрослого организма, полученных в соответствии с описанным выше способом, в получении лекарственного средства для лечения неврологических и нейродегенеративных патологий, выбранных из группы, состоящей из болезни Кушинга, тряски головы, синдрома Вобблера, затруднения дыхания, парезов конечностей; острых и хронических воспалительных патологий, таких как ламиниты, периоститы, гастриты, артрозы, воспаления, вызванные вирусными, бактериальными, паразитарными и грибковыми агентами; дилатации и заворота желудка у млекопитающих.

Изобретение также относится к применению стволовых клеток, полученных способом в соответствии с настоящим изобретением для лечения бесплодия кобыл, преждевременного полового созревания жеребят и для улучшения тех качеств млекопитающих, которые необходимы для участия в соревнованиях. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей полученные в соответствии с описанным выше способом наращивания стволовые клетки взрослого организма в качестве действующего начала, а также фармакологически приемлемые адъюванты и/или наполнители.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом примера осуществления стволовые клетки взрослого организма, применяемые в качестве действующего начала и полученные согласно установленному выше способу, концентрация которых в композиции составляет 90-250х10³ клеток/мл, предпочтительно 150х10³ клеток/мл, вместе с фармакологически приемлемыми адъювантами и/или наполнителями, считается композицией, готовой для внутривенного введения.

В соответствии с альтернативным вариантом примера осуществления стволовые клетки взрослого организма, применяемые в качестве действующего начала и полученные согласно установленному выше способу, концентрация которых в композиции составляет 4-40х10³ клеток/мл, вместе с фармакологически приемлемыми адъювантами и/или наполнителями, считается композицией, готовой для местного применения (также важной и для наружных ран).

Упоминаемые выше фармацевтические композиции могут также включать в качестве действующего начала антибиотик в концентрации, составляющей 5-15 нМ, предпочтительно 10 нМ, в соответствии с особенно предпочтительным вариантом примера осуществления настоящего изобретения. Предпочтительным антибиотиком является гентамицин или амикацин.

Изобретение также относится к применению установленной выше фармацевтической композиции (т.е. подходящей для местного применения, с антибиотиком или без него) в качестве лекарственного средства для лечения повреждений, выбранных из группы, состоящей из повреждений кожи, повреждений сухожилий, связок, костей и слизистых оболочек у млекопитающих.

С другой стороны, изобретение относится к применению установленной выше фармацевтической композиции (т.е. подходящей для местного применения, с антибиотиком или без него) в качестве лекарственного средства для лечения переломов у млекопитающих.

Настоящее изобретение также относится к применению установленной выше фармацевтической композиции (т.е. подходящей для внутривенного введения) в качестве лекарственного средства для лечения неврологических и нейродегенеративных патологий, выбранных из группы, которая включает болезнь Кушинга, тряску головы, синдром Вобблера, затруднения дыхания, парезы конечностей у млекопитающих.

В соответствии с другим вариантом примера осуществления настоящее изобретение относится к

- 3 019305 применению установленной выше фармацевтической композиции (т.е. подходящей для внутривенного введения) в качестве лекарственного средства для лечения острых и хронических воспалительных патологий, выбранных из ламинитов, периоститов, гастритов, артрозов, воспалений, вызванных вирусными, бактериальными, паразитарными и грибковыми агентами у млекопитающих.

Изобретение также относится к применению установленной выше фармацевтической композиции (т.е. подходящей для внутривенного введения) в качестве лекарственного средства для лечения синдрома дилатации и заворота желудка у млекопитающих. Фармакологическая композиция в соответствии с настоящим изобретением также применима при патологии желчного пузыря, сердечно-сосудистых заболеваниях, стрессе и последующей депрессии; в животноводстве - при бесплодии кобыл, преждевременном половом созревании жеребят, а также для улучшения тех качеств животных, которые необходимы для участия в соревнованиях.

В предпочтительном варианте примера осуществления настоящего изобретения медицинские применения предпочтительно используются в ветеринарии, а подвергаемых лечению млекопитающих выбирают из лошади, собаки, кошки или человека.

Далее настоящее изобретение будет описано в неограничивающих примерах, в их предпочтительных вариантах осуществления, с частичными ссылками на прилагаемые чертежи, где на фиг. 1 представлено инфицированное бактериями семейства ΟοκΙπάία повреждение размером 20 см между плюсной и первой фалангой и разрыв сухожилия разгибателя у кобылы;

на фиг. 2 - та же кобыла, что и на фиг. 1, через три месяца после местного применения стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением;

на фиг. 3 - кобыла после шести месяцев применения;

на фиг. 4 - ультразвуковая сканограмма повреждения 80% поверхности сухожилия сгибателя лошади;

на фиг. 5 - ультразвуковая сканограмма повреждения приблизительно через три с половиной месяца после местного применения стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением;

на фиг. 6 - ультразвуковая сканограмма повреждения лошади приблизительно через три с половиной месяца после местного применения стволовых клеток;

на фиг. 7 - ультразвуковая сканограмма повреждения приблизительно через четыре месяца местного применения; отмечается практически полное восстановление сухожилия и отсутствие рубцовой ткани;

на фиг. 8 - ультразвуковая сканограмма повреждения сухожилия меньшей величины (менее 1 см в диаметре) у кобылы;

на фиг. 9 - ультразвуковая сканограмма повреждения той же кобылы, что и на фиг. 7, через месяц местного лечения;

на фиг. 10 - 17-летняя оперированная по поводу колик лошадь с общей слабостью перед применением стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением;

на фиг. 11 - выступление 17-летней лошади через год после внутривенного применения стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением;

на фиг. 12 - увеличение количества выделенных из периферической крови культивируемых клеток, обработанных различными количествами МКСФ: 15 нМ (ломаная линия с крестами), 25 нМ (ломаная линия с треугольниками, расположенными вершиной вниз), 35 нМ (ломаная линия с треугольниками, расположенными вершиной вверх), 50 нМ (ломаная линия с черными кругами), 60 нМ (ломаная линия с белыми квадратами), 70 нМ (ломаная линия с белыми кругами); эти результаты являются усредненными, подсчитанными для трех образцов периферической крови;

на фиг. 13 представлено увеличение количества выделенных из периферической крови культивируемых клеток; предварительно обработанных МКСФ (ломаная линия с черными точками), без обработки МКСФ (ломаная линия с крестами); эти результаты являются усредненными, подсчитанными для трех образцов периферической крови.

Пример 1. Наращивание и очистка стволовых клеток взрослого организма из периферической крови и их медицинские применения

Выделенные из периферической крови клетки после наращивания их в соответствии с настоящим изобретением действуют ίη νίνο как плюрипотентные клетки (ПСК) и способны устранять в течение нескольких месяцев повреждения или патологии, неизлечимые классическими методиками и/или лекарственными средствами, или излечимые, но медленно.

Материалы и методы Сбор образцов

Каждый образец, состоящий приблизительно из 5-7 мл периферической крови, был взят из нижних конечностей лошадей и собак и сразу же помещен в пробирки, содержащие, например, гепарин (150 Ед.) и МХФ (10 нМ).

Однако гепарин может быть заменен другим подходящим антикоагулирующим веществом.

Очистка

Образцы крови (5-7 мл) разбавляли в соотношении 1:5 в РВ8 (фосфатно-солевой буфер), содержащем ИН₄С1 (200 мМ), чтобы вызвать лизис эритроцитов, центрифугировали при 10000 д, дважды промы- 4 019305 вали РВ8 и снова центрифугировали при 200 д. Полученные клетки, содержащие ядра, инкубировали в течение 7-12 ч при 37°С, предпочтительно в течение 10-12 ч, и очищали путем фракционирования в градиенте фиколла, затем выделяли и промывали три раза средой ВРМ1 1640 (ЫГе Тсе1то1од1С5. Сгапб Шайб, Уотк). Очищенные клетки, которые содержали приблизительно 95% моноцитов (как было определено с помощью цитофлюорометрического анализа на проточном цитометре РЛС8еаи - ВееЮп Ωίοίοηδοη) инкубировали в течение дополнительных 24 ч с МХФ в концентрации 50 нг/мл, 45 нМ и затем или продолжали инкубирование до получения необходимого количества клеток для местного применения или центрифугировали при 10000 д и ресуспендировали в РВ8 до концентрации приблизительно 90 х 10³ клеток/мл для внутривенного применения.

Клеточные культуры

Клетки инкубировали в течение 8-12 ч, предпочтительно в течение 10-12 ч при 37°С (в атмосфере 8% СО₂) на чашках размером 15 см в количестве приблизительно 2-3х10⁵ клеток на чашку; потом промывали клетки питательной средой для удаления неприкрепившихся клеток и затем инкубировали дополнительные 48 ч в 10 мл среды РРМ1, с добавлением 10%-ного раствора РВ8, пенициллина (100 Ед./мл), стрептомицина (100 мг/мл), Ь-глутамина (2 мМ) и МХФ (макрофагальный хемотаксический фактор; 50 нг/мл). Некоторые из этих клеток, выделенные вместе со стволовыми клетками, при инкубировании с МХФ выглядели вытянутыми и напоминали фибробласты (Ζΐιαο Υ. с1 а1., 2003). Все используемые вещества, кроме тех, которые были отмечены иначе, получали от 8|дта-Л1бпе11. Далее получали суспензию клеток с помощью пипетирования после инкубирования клеток в течение 5-8 мин в растворе 2% лидокаина (81дта) в РВ8, как уже было ранее описано (ВаЬшоуйей М. с1 а1., 1976). Прикрепившиеся клетки дважды промывали РВ8 и центрифугировали в течение 5 мин при 2000 д, добавляли гентамицин (10 нМ) и разбавляли до конечной концентрации 5-7 х10⁶, предпочтительно 6х10⁶ клеток/мл (кроме тех случаев, где была отмечена более высокая концентрация).

В предварительных экспериментах часть клеток тестировали на присутствие маркера ί.Ό34, одного из главных маркеров гемопоэтических стволовых клеток, с помощью методики, уже описанной Вапба11 с1 а1., 1998.

Иммунное окрашивание

Для цитофенотипирования клетки промывали РВ8 и затем фиксировали на слайдах 4%-ным раствором формальдегида в РВ8 в течение 20 мин при 20°С.

Для идентификации внутриклеточных белков клетки пермеабилизировали инкубированием с 0,5% Тритон Х-100 в течение 5 мин при 20°С и затем инкубировали в течение 1 ч с первичными антителами, растворенными в РВ8, содержащем 1% В8Л (чтобы блокировать сайты неспецифического связывания антител). После трех последовательных отмывок слайды инкубировали в течение 45 мин с вторичными антителами, коньюгированными с наиболее подходящим флуорохромом: Т1ТС или изотиоцианат тетраметилродамина В (ТВ1ТС) или Су5.

Все вторичные антитела были получены в лаборатории баеккои 1ттцпоВе8еатсй, используя осла в качестве организма-хозяина. Иммуноцитохимия проводилась в насыщенной влагой атмосфере при температуре 4°С. После трех отмывок слайды заключали в дека1о1-РВ8. Затем получали флуоресцентное изображение с помощью флуоресцентного микроскопа, используя в качестве внутреннего стандарта иммунофлуоресценцию против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (поликлональное антитело овцы, произведенное Сойех Вюейет, 8ап Ьеапбто, СА). Для калибровки уровня фоновой флуоресценции и использования в качестве негативных контролей, слайды инкубировали с неспецифичными антителами того же изотипа, что и в образцах.

Полученные изображения представляли собой изображения клеток, видимые через фазовоконтрастный микроскоп, наложенные на флюоресцентное изображение окрашенных красителем №1е Веб липидов и на изображение окрашенных ЭАР1 (4',6-диамидин-2-фенилиндол) ядер. Масштабная шкала имела размер 40 мкм. Интенсивность относительной флуоресценции измеряли путем количественного отношения данных изображения микроскопии между клетками, обработанными МКСФ и макрофагами.

Описанный выше способ использовали для идентификации всех исследуемых маркеров (СО90, СО34, С1290/СЧ 234).

Результаты

Местное применение

Клетки применяли непосредственно на поверхности наружных ран. В случае повреждений сухожилий, связок и переломов, напротив, клетки вносили прямо в место повреждения в конечной концентрации 5-10х10⁶ клеток/мл в зависимости от тяжести повреждения, кроме тех случаев, в которых было указано другое. Если клетки невозможно было поместить точно в место повреждения, использовали следующий способ:

при повреждении коллатеральных связок инъекцию делали между второй и третьей фалангой;

при повреждении ладьевидного сустава инъекцию делали в карпальный канал;

при повреждении крестцово-подвздошного сустава и в случаях синдрома Вобблера инъекцию делали между пятым и шестым или между шестым и седьмым шейными позвонками.

- 5 019305

Повреждения кожи

Случай, в котором у кобылы рана между плюсной и первой фалангой диаметром 20 см, осложненная клостридиальной инфекцией, привела к разрушению нижележащих тканей, включая сухожилие разгибателя (фиг. 1). Первое применение было сделано через год после травмы и двух хирургических операций по удалению келоидов, и было повторно проведено еще 3 раза с интервалом в 15 дней, используя 10-400х10⁶ клеток, ресуспендированных в физиологическом растворе в присутствии гентамицина. Через 100 дней рана была полностью излечена (фиг. 2), и через 6 месяцев в 70% рубцовой зоны вновь появились волосы (фиг. 3).

Сухожилия

У трех подвергаемых лечению лошадей было поражено 80% поверхности сухожилия сгибателя. Уже после 3-х месяцев лечения клетками в количестве приблизительно 300х10⁶ на ультразвуковом исследовании не обнаруживалось гипоэхогенных зон, наоборот, толщина сухожилия (которая возросла после разрыва и воспалительных процессов) была заметно уменьшена приблизительно на 80%, как показано на ультразвуковых сканограммах на фиг. 4-7.

У других лошадей с меньшими повреждениями сухожилий (1 см в диаметре) уже через 1 месяц после лечения повреждений больше не обнаруживали (фиг. 8 и 9).

Связки

Среди подвергаемых лечению повреждений было смещение поддерживающей связки под скакательный сустав с возникшей в результате этого хромотой: менее чем через три месяца после местного внесения клеток лошадь вернулась к работе вновь, без хромоты, и через год рецидива не наблюдали.

У других подвергаемых лечению лошадей, с повреждениями между ветвями и центральным телом передней и задней поддерживающих связок все случаи завершились полным выздоровлением.

Переломы

При лечении переломов был один случай, когда у собаки с переломом бедренной кости, даже через 4 месяца после хирургической операции все еще не сформировалась костная мозоль. После местного применения 10х10⁶ клеток произошло полное выздоровление в течение 30 дней.

Слизистые оболочки

В области восстановления повреждений слизистых оболочек подвергали лечению различные виды хронических язв. Наиболее интересный случай был у выезженной лошади с несколькими язвами во рту, которая уже перенесла две пластические хирургические операции. Уже после 3 дней местного применения 4х10⁵ клеток у лошади прекратилось кровотечение. Через 15 дней повреждения были полностью вылечены.

В заключение стоит отметить, что при местном применении выделенных клеток, модифицированных с помощью данного способа для восстановления повреждений сухожилий, связкой, суставов и костей, более чем в 80% случаев, повреждения были полностью устранены в течение нескольких недель или, самое большее, четырех месяцев. В остальных 20% случаев все равно наблюдали значительные улучшения. Способы, обычно используемые в настоящее время в ветеринарии для лечения подобных случаев, дают положительные результаты не более чем в 60% случаев приблизительно после 6-15 месяцев лечения, а улучшения наступают лишь в 5%.

Внутривенное применение

Клетки вводили внутривенно (1 доза = 150х 10³ клеток) при следующих патологиях:

Болезнь Кушинга, которая является патологией, возникающей вследствие гипертрофии средней доли гипофиза и сокращения выработки дофамина гипоталамусом, очень схожа с болезнью Паркинсона у человека.

У пораженного пони, подвергаемого лечению, помимо классических симптомов болезни наблюдалось снижение иммунитета и гемолиз. После трех введений клеток с интервалом в 5 дней в количестве 150х 10³ клеток на введение были отмечены улучшения. После 4 циклов лечения с интервалом в 40 дней, симптомы окончательно исчезали. Данные результаты повторились у четырех лошадей, подвергаемых лечению таким же образом.

Тряска головы, которая является неврологической патологией центральной нервной системы с вторичным осложнением со стороны тройничного нерва, что приводит к непрекращающейся тряске головы и светобоязни. У подвергаемой лечению лошади эти симптомы наблюдали в течение шести месяцев. Лечение включало цикл введений в течение 5 недель 150х10³ клеток с интервалом в одну неделю. Уже на третью неделю симптомы исчезали. При лечении двух других лошадей по этой же методике, были получены такие же результаты.

Три случая синдрома Вобблера, который является врожденной неврологической деформацией шейного отдела позвоночника. При лечении заболевания путем введения трех доз (внутривенно или местно) с интервалом в неделю, после окончания лечения наступала полная ремиссия.

Внутривенное применение нарощенных и очищенных стволовых клеток с использованием описанного способа показало, как эти клетки способны устранять патологии ίη νίνο, воздействуя на нервную ткань и давая первые результаты уже после недели лечения.

- 6 019305

Восстановление сосудов

У лошади, пораженной ламинитом (разрушение периферической сосудистой сети ног, приводящей к чрезвычайно болезненной хромоте, которая ограничивает движение), боль практически исчезала через 12-24 ч после введения дозы в сосуды пальцев. Такие же результаты были получены в двух других случаях поражения лошадей той же патологией.

Клетки вводили внутривенно и в следующих основных случаях:

Лошадь с переломом ладьевидной кости. Вновь начала участвовать в соревнованиях после одновременного введения стволовых клеток в периферические сосуды, сумку ладьевидной мышцы и суставную поверхность между сухожилием глубокого сгибателя и ладьевидной костью;

Лошадь, страдающая от периостита.

После введения двух внутривенных доз стала меньше хромать;

17-летняя лошадь, которую оперировали по поводу колик и после этого выгнали на пастбище, поскольку она не могла больше продолжать участвовать в соревнованиях из-за постоянного состояния общей слабости. После 4 циклов лечения введением 3 доз каждые 5 дней лошадь начала снова участвовать в соревнованиях, и участвуя в них, показывала результаты лучшие, чем раньше (фиг. 10 и 11);

20-летняя лошадь, с подозрением на ишемию головного мозга и с возникшей в результате этого потерей координации трех конечностей, которая после фармакологического лечения, основанного на использовании производных кортизона, все еще продолжала держаться неуверенно и имела неустойчивый шаг. После введения двух доз с интервалом в одну неделю животное вновь вернулось к нормальной активности, уже не проявляя каких-либо симптомов заболевания;

23-летняя кобыла, у которой в 21 год была беременность, которой после окончания периода лактации ввели внутривенно две дозы. После введения кобыла вновь начала участвовать в соревнованиях в полном объеме (считается, что лошадь слишком стара для участия в соревнованиях в 20 лет);

Лошадь с переломом таза.

После введения двух доз клеток вновь начала участвовать в международных соревнованиях;

15-летняя лошадь с затруднением дыхания и очень нервным характером. После введения двух доз демонстрировала отсутствие малейших признаков затруднения дыхания и вновь начала участвовать в соревнованиях международного уровня;

Две лошади с крайней степенью хромоты, возникшей более двух лет назад после растяжения коллатеральных связок между первой и второй фалангами. Эта патология считается необратимой в 75% случаев. После введения трех доз через три месяца оба подвергаемых лечению животных вернулись к участию в соревнованиях в обычных условиях;

13-летняя лошадь, оперированная по поводу колик в 7 лет и кастрированная в 12. Несмотря на лечение антибиотиками и противовоспалительными средствами, после второй операции у животного было нераспространившееся бактериальное осложнение.

Кроме того, животное страдало от хронического гастрита, подтвержденного путем гастроскопии. После введения 4 доз с интервалом в одну неделю животному снова была проведена гастроскопия, которая показала, что слизистая оболочка желудка полностью восстановлена. Такие же результаты были получены для 10 других скаковых лошадей;

Лошадь с пансистолическим шумом в сердце и многочисленными шумами, нетипичными при аускультации сердца, и с положительной реакцией крови на активную форму вируса герпеса 1-го типа, который вызывает неврологические проблемы и нарушение координации. В этом случае были введены три внутривенные дозы с интервалом в 5 дней, после которых четвертую дозу вводили на уровне позвоночного столба. Уже через два месяца лошадь снова начала двигаться, практически полностью восстановив координацию;

19-летняя лошадь, практически полностью отстраненная от участия в соревнованиях вследствие общего ухудшения физического состояния. После двукратного введения 200х10³ клеток с интервалом в неделю и повтора лечения, через три месяца вновь была одной из лучших в своей категории (в соревнованиях по преодолению препятствий, высота прыжка 1,35-1,40 м).

Такие же результаты были получены при применении аналогичного лечения у очень старых собак. Подвергали лечению следующие патологии у собак: две собаки с заворотом желудка. Первая - это 6летний датский дог, которому была проведена хирургическая операция, и из-за развившегося через неделю рецидива - другая. После первого введения 150х 10³ клеток, собака снова начала есть и после двух доз с интервалом в одну неделю собака вернулась к своей нормальной активности. Вторая собака - это 10летняя, страдающая от артроза сука датского дога, у которой диагностирован диабет, перенесла гистерэктомию и овариэктомию. Через четыре месяца после операции у собаки произошел заворот желудка, и ей была проведена очередная хирургическая операция, которая, однако, не принесла значительного улучшения. На этом этапе собаке ввели две дозы с интервалом в одну неделю и провели еще четыре цикла лечения в последующие четыре месяца. В настоящее время через восемь месяцев после последнего цикла у собаки не только восстановился нормальный уровень глюкозы в крови, но и выросла ее способность ходить приблизительно на 80%; 13-летняя собака смешанной породы, кобель, с параличом задних

- 7 019305 конечностей и страдающая недержанием мочи и кала; до того момента лечили лишь кортизоном, без ощутимых результатов. Через пятнадцать дней после того, как лечение кортизоном было приостановлено, у собаки взяли клетки и провели цикл лечения из двух доз с интервалом в неделю. Через шесть дней после последнего введения, собака не только вновь приобрела подвижность ног, но и нормально мочилась и испражнялась.

Вследствие того, что в настоящее время не существует методики ίη νίνο, обеспечивающей наращивание плюрипотентных стволовых клеток, результаты, полученные данным способом в соответствии с настоящим изобретением, делают эту методику чрезвычайно широкоприменимой. Кроме того, отсутствие какого-либо отторжения или инфекции после введения во всех описанных выше историях болезни, делает эту методику подходящей для процедур аутотрансплантации.

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма из крови, в частности из периферической крови, включающий обработку образца крови ίη νίίτο макрофагальным колониестимулирующим фактором (МКСФ) в концентрации, составляющей 8-15 нМ, где указанная обработка МКСФ ίη νίίτο длится от 24 до 96 ч и начинается не позднее чем через 10 мин после того, как был взят образец, предпочтительно не позднее чем через 5 мин.
2. 2. Способ по п.1, в котором указанная обработка МКСФ ίη νίίτο длится от 48 до 72 ч.
3. 3. Способ по п.1, в котором концентрация МКСФ предпочтительно равна 10 нМ.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, который включает дополнительный этап очистки полученных стволовых клеток.
5. 5. Способ по п.4, который дополнительно включает наращивание очищенных стволовых клеток крови путем их обработки ίη νίίτο с помощью МКСФ в концентрации, составляющей приблизительно 3555 нМ в течение 24-72 ч.
6. 6. Способ по п.5, в котором концентрация МКСФ предпочтительно равна 50 нМ, наиболее предпочтительно 45 нМ.
7. 7. Способ по п.5, в котором стволовые клетки очищают фракционированием в градиенте фиколла.
8. 8. Способ по любому из пп.1 и 5, в котором указанная обработка МКСФ длится 24-48 ч, предпочтительно 45-48 ч.
9. 9. Применение плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма, полученных в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в получении лекарственного средства для лечения повреждений, выбранных из группы, состоящей из повреждений кожи, повреждений сухожилий, связок, костей, слизистых оболочек у млекопитающих или переломов.
10. 10. Применение плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма, полученных в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в получении лекарственного средства для лечения неврологических и нейродегенеративных патологий, выбранных из группы, состоящей из болезни Кушинга, тряски головы, синдрома Вобблера, затруднения дыхания, парезов конечностей у млекопитающих.
11. 11. Применение плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма, полученных в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в получении лекарственного средства для лечения острых и хронических воспалительных патологий, выбранных из ламинитов, периоститов, гастритов, артрозов, воспалений, вызванных вирусными, бактериальными, паразитарными и грибковыми агентами у млекопитающих.
12. 12. Применение плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма, полученных в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в получении лекарственного средства для лечения синдрома дилатации и заворота желудка у млекопитающих.
13. 13. Применение плюрипотентных стволовых клеток взрослого организма, полученных в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в получении лекарственного средства для лечения бесплодия кобыл, преждевременного полового созревания жеребят и для улучшения тех качеств млекопитающих, которые необходимы для участия в соревнованиях.
14. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая плюрипотентные стволовые клетки взрослого организма, полученные в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в качестве действующего начала, вместе с фармакологически приемлемыми адъювантами и/или эксципиентами.
15. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая плюрипотентные стволовые клетки взрослого организма, полученные в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в концентрации, составляющей 90-250х10³ клеток/мл, предпочтительно 100-120х10³ клеток/мл, в качестве действующего начала, вместе с фармакологически приемлемыми адъювантами и/или эксципиентами, причем эта композиция приготовлена в виде препарата для внутривенного введения.
16. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая плюрипотентные стволовые клетки взрослого организма, полученные в соответствии со способом по любому из пп.1-8, в концентрации, составляющей 440х10⁶ клеток/мл, предпочтительно 7х10⁶ клеток/мл, в качестве действующего начала, вместе с фармакологически приемлемыми адъювантами и/или эксципиентами, причем эта композиция приготовлена в

    - 8 019305 виде препарата для местного применения.
17. 17. Композиция по п.16, дополнительно содержащая антибиотик, в качестве действующего начала, в концентрации, составляющей 5-15 нМ, предпочтительно 10 нМ.
18. 18. Композиция по п.17, где антибиотик является гентамицином.
19. 19. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.14 и 16-18 в качестве лекарственного средства для лечения повреждений, выбранных из группы, состоящей из повреждений кожи, повреждений сухожилий, связок, костей, слизистых оболочек у млекопитающих.
20. 20. Применение фармацевтической композиции, как определено по любому из пп.14 и 16-18, в качестве лекарственного средства для лечения переломов у млекопитающих.
21. 21. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.14 или 15 в качестве лекарственного средства для лечения неврологических и нейродегенеративных патологий, выбранных из группы, состоящей из болезни Кушинга, тряски головы, синдрома Вобблера, затруднения дыхания, парезов конечностей у млекопитающих.
22. 22. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.14 или 15 в качестве лекарственного средства для лечения острых и хронических воспалительных патологий, выбранных из ламинитов, периоститов, гастритов, артрозов, воспалений, вызванных вирусными, бактериальными, паразитарными и грибковыми агентами у млекопитающих.
23. 23. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.14 или 15 в качестве лекарственного средства для лечения синдрома дилатации и заворота желудка у млекопитающих.
24. 24. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.14 или 15 для лечения бесплодия кобыл, преждевременного полового созревания жеребят.
25. 25. Применение по любому из пп.19-23, согласно которому указанная композиция содержит стволовые клетки в концентрации, равной 150х 10³ клеток/мл.
26. 26. Применение по любому из пп.9-13, 19-23 или 25, в котором указанные млекопитающие выбраны из человека, лошадей, кошек и собак.