JP2022113019A - Ｐｔｘ－３、ｔｉｍｐ１、およびｂｄｎｆを発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物 - Google Patents
Ｐｔｘ－３、ｔｉｍｐ１、およびｂｄｎｆを発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】炎症性疾患、または疼痛の予防または治療のための医薬組成物を提供する。【解決手段】PTX-3、TIMP1、およびBDNFを発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む。【効果】本発明によるPTX-3、TIMP1、BDNF、および／またはHLA-A2を発現する間葉系幹細胞は、炎症反応が抑制されうるように、炎症性サイトカインであるIL-1b、IL-6、IL-8、およびTNF-αの発現を減少させ、抗炎症性サイトカインであるIL-10およびアルギナーゼ-1（ARG-1）の発現を増加させる；そして、間葉系幹細胞は、変形性関節症誘発ラットに投与された場合に、変形性関節症によって引き起こされる痛みを軽減することができる。したがって、本発明のＰPTX-3、TIMP1、およびBDNFを発現する間葉系幹細胞は、炎症性疾患、疼痛、および炎症誘発性疼痛の予防、緩和、または治療に効果的に使用することができる。【選択図】図５
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り １．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｈｉｎｄａｗｉ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ｓｃｉ／２０２０／１８０２９７６／ ２０２０年１月２３日掲載
本発明は、有効成分として間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物に関する。より具体的には、本発明は、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質の過剰発現または発現増加を示す間葉系幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物に関する。
炎症は、外部の病原体、毒素、および損傷した細胞などの有害な刺激に対する免疫応答である。このような炎症は、腫れ、痛み、または組織の剛性、機能、動きの喪失などの兆候を示す。特に、関節に炎症が発生すると、痛みが生じ、日常生活動作障害や身体の可動性が低下し、生活の質が低下する。炎症に関連する症状の治療に使用される薬剤の世界市場規模は、2020年時点で約1,061億ドルであり、これは抗がん剤の市場規模に匹敵する大きさである。このうち、関節炎治療薬は、2019年の世界輸入売上高の42.41％を占めており、2020年から2026年までの数年間で6.60％の急成長率が予想されている。
変形性関節症の初期段階では、炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α、IL-8など）が、外部刺激により滑膜および軟骨組織に分泌される。このように分泌されたサイトカインは、痛みを引き起こしながら関節組織に炎症を継続的に引き起こし、軟骨分解酵素と骨破壊因子を活性化して、関節破壊を引き起こし、最終的に関節変形を引き起こす(Piotr Wojdasiewicz et al.、Mediators Inflamm. 2014: 561459)。非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）は、そのような関節炎を治療するための薬として主に使用される。なかでも、抗TNF剤であるヒュミラ（AbbVie）は、2018年に米国で、単剤としての最高の売り上げを記録した。そのような薬物は毎日の痛みを軽減するのに役立つかもしれない；しかしながら、これらの薬は胃腸障害などの副作用があり、長期的な効果が期待できない。したがって、関節炎の炎症の発生メカニズムに影響を及ぼし、根本的な治療を可能にする治療薬を開発する必要がある。
この問題を解決するために、幹細胞治療薬のさまざまな研究開発活動が行われている。間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、および脂肪組織などのさまざまな組織から分離して培養することができ、軟骨組織に分化させることができる。したがって、これらの細胞は、関節炎の基本的な治療薬として使用される。間葉系幹細胞から分泌されるタンパク質は、その抗アポトーシス作用、免疫抑制作用、抗炎症作用などにより、さまざまな疾患の治療や組織再生に有効であることが報告されている(Mancuso et al.、Front Bioeng Biotechnol. 2019 Jan 29;7:9.、D. S. Jevotovsky et al.、Osteoarthritis Cartilage. 2018 Jun;26(6):711-729)。特に、間葉系幹細胞の抗炎症作用は、マクロファージの極性化ならびに抗炎症性サイトカインの分泌を調節し、炎症反応の発生を根本的に抑制することが報告されている(Meng Sun et al.、J Immunol Res. 2019 Jun 19;2019:7059680)。
間葉系幹細胞によって引き起こされる上記の治療効果は、ドナー、これらの細胞が由来する組織、単離方法、培養方法などによって影響を受ける可能性がある。この問題を解決するためには、治療効果のある細胞を選択することができる特性を見つける必要がある。
Piotr Wojdasiewicz et al.、Mediators Inflamm.、2014: 561459
Mancuso et al.、Front Bioeng Biotechnol.、2019 Jan 29;7:9
D. S. Jevotovsky et al.、Osteoarthritis Cartilage. 2018 Jun;26(6):711-729
Meng Sun et al.、J Immunol Res. 2019 Jun 19;2019:7059680
炎症性疾患の予防または治療に有効な間葉系幹細胞を得るための研究の結果として、本発明者らは、間葉系幹細胞が炎症性条件下で特定のタンパク質の発現の増加を示すこと、およびそのようなタンパク質を発現する間葉系幹細胞が優れた抗炎症および疼痛軽減効果を有することを確認し、それにより本発明を完成させた。
上記の問題を解決するために、本発明の1つの態様では、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質を発現する間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様では、改善された抗炎症または疼痛軽減効果を有する間葉系幹細胞を得るための方法が提供され、該方法は、間葉系幹細胞を刺激して、間葉系幹細胞が、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質の発現の増加を示すようにするステップを含む。
本発明によるPTX-3、TIMP1、およびBDNFを発現する間葉系幹細胞は、炎症性サイトカインであるIL-1b、IL-6、IL-8、およびTNF-αの発現を減少させ、抗炎症性サイトカインであるIL-10およびアルギナーゼ-1（ARG-1）の発現を増加させて、炎症反応を抑制することができる；そして、間葉系幹細胞は、変形性関節症によって誘発されたラットに投与される場合に、変形性関節症によって引き起こされる痛みを軽減することができる。したがって、本発明のPTX-3、TIMP1、およびBDNFを発現する間葉系幹細胞は、炎症性疾患、疼痛、および炎症誘発性疼痛の予防、緩和、または治療のために効果的に使用することができる。
以下、本発明についてより詳細に説明する。
本発明の1つの態様では、有効成分として、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質を発現する間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物が提供される。具体的には、医薬組成物は、有効成分として、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質の過剰発現または発現増加を示す間葉系幹細胞を含みうる。
本発明の1つの態様では、有効成分として、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質を発現する間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物が提供される。具体的には、医薬組成物は、有効成分として、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質の過剰発現または発現増加を示す間葉系幹細胞を含みうる。
PTX-3（ペントラキシン3）は、環状多量体構造を特徴とするペントラキシンスーパーファミリーのメンバーを示す。PTX-3は、一次炎症シグナルに応答して、いくつかの細胞型によって、特に、単核食細胞、樹状細胞（DC）、線維芽細胞、および内皮細胞によって急速に産生および放出される。さらに、PTX-3は、補体活性化の古典的経路を活性化し、マクロファージおよび樹状細胞による抗原認識を促進する。
いくつかの組織で発現される糖タンパク質であるTIMP1（組織阻害剤マトリックスメタロプロテイナーゼ1）は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）の作用を調節する内因性阻害剤を示す。具体的には、TIMP1は、TIMPファミリーのメンバーであり、細胞外マトリックスの分解に関与するペプチダーゼのグループであるマトリックスメタロプロテイナーゼの天然の阻害剤である。既知のマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害的役割に加えて、TIMP1は、広範囲の細胞型で細胞増殖を促進することができ、抗アポトーシス機能も有する可能性がある。
BDNF（脳由来神経栄養因子）とは、脳に分布する神経栄養因子を示す。BDNFは、ニューロンの成長を促進し、神経伝達物質の合成、代謝、および放出、ならびにニューロンの活動を調節することが知られている。
間葉系幹細胞は、PTX-3、TIMP1、またはBDNFを発現する可能性がある。さらに、間葉系幹細胞はPTX-3およびTIMP1；PTX-3およびBDNF；またはTIMP1およびBDNFを発現する可能性がある。さらに、間葉系幹細胞は、PTX-3、TIMP1、およびBDNFを発現する可能性がある。
本発明は、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質を発現するか、または発現の増加を示す間葉系幹細胞が、優れた炎症抑制または疼痛軽減能力を有するという結果に基づく。
具体的には、本発明の実施態様において、間葉系幹細胞を炎症条件下で培養することができるようにするために、2×105個の細胞のSMUP-Cellを、マウスマクロファージ細胞株であるRAW264.7細胞株を、1μg/mlのリポ多糖（LPS）での処理に付すことによって作製されたマクロファージ炎症モデルと共培養した。次に、共培養後の培地中のPTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現レベルの変化を確認した。さらに、PTX-3、TIMP1、BDNF、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されたいずれか1つを発現する間葉系幹細胞が、炎症性サイトカインである、IL-1b、IL-6、IL-8、およびTNF-αの発現を減少させること、および抗炎症性サイトカインである、IL-10およびアルギナーゼ-1（ARG-1）の発現を増加させることが確認され、その結果、炎症反応が抑制された（図1、図3、図5、図6、図8、図11、および図12）。
間葉系幹細胞は、さらにHLA-A2を発現する可能性がある。本発明の1つの実施態様では、PTX-3、TIMP1、BDNF、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つを発現する間葉系幹細胞が、HLA-A2をさらに発現することが確認された（図2）。
間葉系幹細胞は、PTX-3およびHLA-A2、TIMP1およびHLA-A2、またはBDNFおよびHLA-A2を発現する可能性がある。さらに、間葉系幹細胞は、PTX-3、TIMP1、およびHLA-A2； PTX-3、BDNF、およびHLA-A2；またはTIMP1、BDNF、およびHLA-A2を発現する可能性がある。さらに、間葉系幹細胞は、PTX-3、TIMP1、BDNF、およびHLA-A2を発現する可能性がある。
HLA-A2は、ヒト白血球抗原（HLA）-A血清型グループに属する血清型の1つであり、HLAは、ヒト主要組織適合遺伝子複合体（MHC）遺伝子によってコードされる糖タンパク質分子である。HLA-Aは、すべての有核細胞および血小板の細胞表面に発現し、細胞傷害性T細胞に抗原を認識させ、細胞傷害性T細胞がウイルス感染細胞または腫瘍細胞を認識および排除するように機能する。
間葉系幹細胞は、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなるグループから選択された1つまたは複数のタンパク質を過剰発現する可能性がある。過剰発現は、遺伝子操作によって達成することができ、具体的には、過剰発現は、PTX-3、TIMP1、BDNF、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される任意の1つをコードする遺伝子をロードしたベクターを使用する形質転換によって達成することができる。
間葉系幹細胞は、炎症性刺激を受けた場合、PTX-3、TIMP1、BDNF、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つの発現レベルの増加を示しうる。
本発明において、炎症性刺激は、インビボでの炎症性応答を模倣する炎症性環境への曝露を意味しうる。炎症性刺激には、サイトカインなどの炎症性細胞によって分泌される物質によって引き起こされる刺激、インビトロまたは動物の炎症モデルへの曝露、または炎症誘発性細胞との共培養が含まれうるが、これらに限定されない。さらに、炎症状態または炎症環境は、炎症が起こった患部でありうる。
間葉系幹細胞は、以下のステップを含む方法によって作製することができる：
(1)10μm以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する；
(2)単離された間葉系幹細胞を、酸素2％～5％の低酸素条件下でカルシウムを含む培地中で培養する；および
(3)培養間葉系幹細胞を炎症性刺激にさらす。
(1)10μm以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する；
(2)単離された間葉系幹細胞を、酸素2％～5％の低酸素条件下でカルシウムを含む培地中で培養する；および
(3)培養間葉系幹細胞を炎症性刺激にさらす。
上記の方法では、10μm以下のサイズを有する単離された間葉系幹細胞は、他のサイズを有する間葉系幹細胞よりも優れた増殖能力を有し、そのような間葉系幹細胞は、低酸素条件下でカルシウムを含む培地で培養されている場合にさらに改善された増殖能力および分化能力を示しうる。
上記の方法では、カルシウムは、1.5mM～3.8mMの濃度で培地中に含まれうる。具体的には、上記の方法において、カルシウムは、1.5mM～2.0mMの濃度で培地に含まれうる。
培養は、従来の既知の方法で実施することができる。たとえば、間葉系幹細胞は、三次元バイオリアクター（またはスピナー）を使用して培養するか、または細胞接着材料が共通の接着容器および３D担体上にコーティングされるように培養することができる。さらに、間葉系幹細胞は、3Dキャリアを使用して培養することができる。
間葉系幹細胞は、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、皮膚、臍帯、羊水、または歯に由来しうる。具体的には、間葉系幹細胞は、臍帯血に由来しうる。
医薬組成物の投与経路および投与量については、対象者の状態および副作用の有無に応じてさまざまな方法および量で投与することができ、最適な投与方法および投与量は、当業者によって適切な範囲で選択することができる。さらに、医薬組成物は、治療効果が治療される疾患に対して既知である、他の薬物または生理活性物質と組み合わせて投与されうるか、または他の薬物との組み合わせ製剤の形態で処方されうる。
医薬組成物は、細胞治療薬の一種であり、薬学的に許容される担体をさらに含みうる。担体は、医薬品の調製に一般的に使用されるものでありえ、その例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、 水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱物油が含まれる。
また、本発明の医薬組成物は、さらに、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤、およびそれらの組み合わせを含みうる。
本発明の医薬組成物の総重量に基づいて、担体は、約1重量%～約99.99重量%、好ましくは約90重量%～約99.99重量%の量で含まれてもよく、そして薬学的に許容される添加剤は、約0.1重量%～約20重量%の量で含まれうる。
医薬組成物は、従来の方法にしたがって、医薬的に許容される担体または賦形剤と共に処方されることによって単位剤形で調製されうるか、または複数回投与容器に入れられる形態で調製されうる。ここで、製剤は、溶液、懸濁液、シロップ、または乳濁液の形態でありえ、これは、油または水性媒体中にあるか、または抽出物、粉末、顆粒、またはカプセルの形態でありうる。製剤は、分散剤または安定剤をさらに含みうる。
炎症性疾患とは、炎症を伴う疾患を示す。具体的には、炎症性疾患は、骨関節炎、関節リウマチ、アトピー、喘息、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、移植片対宿主疾患（GVHD）、糖尿病性腎症、クローン病、炎症性腸疾患、移植後拒絶、気管支肺異形成症（BPD）、または慢性閉塞性肺疾患（COPD）でありうる。痛みは、炎症性の痛みでありえ、炎症性の痛みは、関節炎の痛みでありうる。
医薬組成物が投与される個体は、哺乳動物、具体的にはヒトでありうる。医薬組成物の投与経路および投与量については、対象者の状態および副作用の有無に応じてさまざまな方法および量で投与することができ、当業者は、最適な投与方法および投与量を適切な範囲で選択することができる。さらに、医薬組成物は、治療される炎症性疾患に対して治療効果が知られている他の薬物または生理活性物質と組み合わせて投与することができ、または他の薬物との組み合わせ製剤の形態で製剤化することができる。
医薬組成物を非経口投与する場合、その例として、皮下、眼、腹腔内、筋肉内、経口、直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、髄腔内、鼻腔内、静脈内、および関節内投与が挙げられる。具体的には、医薬組成物は、関節内部位、関節損傷部位、または関節が膝、指、またはつま先関節でありうる関節の内側および／または外側区画に投与されうる。「関節内」投与は、「関節内腔」投与を含みうる。
投与は、1回以上、または1～3回、具体的には3回投与することができる。反復投与の場合、投与は1～56日、7～49日、14～42日、または21～35日間隔で行うことができる。好ましくは、投与は、28日間隔で実施されうる。高用量の場合、投与は1日数回実施されうる。
間葉系幹細胞の投与量は、1×105細胞/個体から5×107細胞/個体でありうる。
本発明の別の態様では、改善された抗炎症または疼痛軽減効果を有する間葉系幹細胞を得るための方法が提供され、該方法は、間葉系幹細胞を刺激して、間葉系幹細胞が、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質の発現の増加を示すようにするステップを含む。間葉系幹細胞は、医薬組成物について上記した通りである。
刺激ステップは、間葉系幹細胞を炎症性環境に曝露するステップを含みうる。具体的には、間葉系幹細胞を炎症性環境に曝露するステップには、サイトカインなどの炎症性細胞によって分泌される物質によって引き起こされる刺激、炎症誘発性細胞との共培養、またはインビトロまたはインビボでの炎症性環境を模倣する動物の炎症モデへの曝露が含まれうるが、これらに限定されない。
炎症誘発性細胞は、リポ多糖(LPS)、マイトジェン、ケモカインまたはサイトカインでの処置によって炎症が誘発された細胞でありうる。
細胞は、体細胞、生殖細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つでありうる。体細胞は、筋細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板または粘膜細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つでありうる。生殖細胞は、精子、卵子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つでありうる。
間葉系幹細胞は、刺激ステップの前に、以下のステップを含む方法によって作製することができる：
（1）サイズが10μm以下の間葉系幹細胞を単離する；および
（2）単離された間葉系幹細胞を、カルシウムを含む培地中で、2％～5％の酸素の低酸素条件下で培養する。
（1）サイズが10μm以下の間葉系幹細胞を単離する；および
（2）単離された間葉系幹細胞を、カルシウムを含む培地中で、2％～5％の酸素の低酸素条件下で培養する。
上記の方法において、カルシウムは、1.5mM～3.8mMの濃度で培地中に含まれうる。具体的には、上記の方法において、カルシウムは、1.5mM～2.0mMの濃度で培地に含まれうる。
ステップ(1)および(2)は、医薬組成物について上記した通りである。
本発明のさらに別の態様では、炎症性疾患または疼痛を予防または治療するための方法が提供され、これは、医薬組成物を個体に投与するステップを含む。
個体は、ヒトを含む哺乳動物でありえ、そして非ヒト動物でありうる。「非ヒト動物」という用語は、任意の脊椎動物を示し、哺乳動物および非哺乳動物、たとえば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類を含みうる。
医薬組成物は、必要に応じて、当技術分野で従来から使用されている投与方法、投与経路、および投与量に従って、個人に適切に投与することができる。投与経路の例として、非経口投与が挙げられる。さらに、適切な投与量および投与回数は、当技術分野で知られている方法に従って選択することができる。実際に投与される組成物の投与量および投与回数は、予防または治療される症状の種類、投与経路、性別、健康状態、食事、個人の年齢および体重、ならびに疾患の重症度などのさまざまな要因に応じて適切に決定することができる。
発明の形態
以下、本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、以下の実施例は例示のみであり、本発明の範囲に限定されるものではない。
以下、本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、以下の実施例は例示のみであり、本発明の範囲に限定されるものではない。
製造例1. 間葉系幹細胞(SMUP-CELL)の作製
まず、間葉系幹細胞（SMUP-CELL）を作製するために、Ficoll-Plaqueを使用して同種異系臍帯血から単核細胞を単離し、次に、5×106～1×106細胞/cm2の濃度で分注した。培養は、37℃、5% CO2、および3% O2のインキュベーターで最大21日間行なった。次に、10μm以下のサイズの細胞を単離し、500～3,000細胞/cm2の濃度で分注した。培養は、低酸素（2%～5%）条件下で最大7日間、1.5～3.8mMの濃度でカルシウムを補充された5%～30%のウシ胎児血清を含むα-MEM培地（SH30265.02、Hyclone）で行った。
まず、間葉系幹細胞（SMUP-CELL）を作製するために、Ficoll-Plaqueを使用して同種異系臍帯血から単核細胞を単離し、次に、5×106～1×106細胞/cm2の濃度で分注した。培養は、37℃、5% CO2、および3% O2のインキュベーターで最大21日間行なった。次に、10μm以下のサイズの細胞を単離し、500～3,000細胞/cm2の濃度で分注した。培養は、低酸素（2%～5%）条件下で最大7日間、1.5～3.8mMの濃度でカルシウムを補充された5%～30%のウシ胎児血清を含むα-MEM培地（SH30265.02、Hyclone）で行った。
実施例1. マクロファージ炎症モデルにおける間葉系幹細胞の抗炎症作用の確認
実施例1.1. 炎症性条件下の間葉系幹細胞におけるPTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現増加の確認
マクロファージ炎症モデルは、マウスマクロファージ細胞株である1×105細胞のRAW264.7細胞株を1μg/mlのリポ多糖（LPS）で処理することにより作製した。2×105細胞のSMUP-Cellをマクロファージ炎症モデルと共培養し、分析を行った。これを、SMUP-Cellを単独で培養した場合と比較し、分析した。ここでは、基本培地としてRPMI（22400、Gibco）を用いて培養した。
実施例1.1. 炎症性条件下の間葉系幹細胞におけるPTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現増加の確認
マクロファージ炎症モデルは、マウスマクロファージ細胞株である1×105細胞のRAW264.7細胞株を1μg/mlのリポ多糖（LPS）で処理することにより作製した。2×105細胞のSMUP-Cellをマクロファージ炎症モデルと共培養し、分析を行った。これを、SMUP-Cellを単独で培養した場合と比較し、分析した。ここでは、基本培地としてRPMI（22400、Gibco）を用いて培養した。
具体的には、SMUP-Cellを単独で培養した培地、およびSMUP-Cellをマクロファージ炎症モデルと共培養した培地において、PTX-3、TIMP1、およびBDNFタンパク質の発現レベルをヒトPTX-3 ELISAキット（DPTX30B、R＆D Systems）、ヒトTIMP1 ELISAキット（DTM100、R＆D Systems）、およびヒトBDNF ELISAキット（DBD00、R＆D Systems）で分析した。ここで、SMUP-Cellを単独で培養した培地で測定した各タンパク質の発現レベルを100とした。この発現レベルについて、SMUP-Cellをマクロファージ炎症モデルと共培養した培地で測定した各タンパク質の発現レベルを換算し、比較した。
その結果、SMUP-Cellをマクロファージ炎症モデルと共培養した培地でPTX-3、TIMP1、およびBDNFタンパク質の発現レベルが増加することが確認された（図1）。
実施例1.2. 炎症性条件下の間葉系幹細胞におけるHLA-A2の発現増加の確認
2×105細胞のSMUP-Cellを、同じ培養条件（RPMI（22400、Gibco））を用いて実施例1.1で作製したマクロファージ炎症モデルと共培養し、SMUP-CellでのHLA-A2の発現を確認した。
2×105細胞のSMUP-Cellを、同じ培養条件（RPMI（22400、Gibco））を用いて実施例1.1で作製したマクロファージ炎症モデルと共培養し、SMUP-CellでのHLA-A2の発現を確認した。
具体的には、共培養したSMUP-Cellをトリプシンで処理して単細胞に分離した後、PBS溶液で2回洗浄した。次に、洗浄したSMUP-CellをPEで標識した抗HLA-A2抗体と反応させ、これを実験群とした。ネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール-PEを反応に使用した。実験群およびネガティブコントロールでは、FACSを使用してHLA-A2の発現をチェックした。ここでは、共培養したSMUP-Cellについて、2種類のドナーを使用した。
その結果、それぞれが実験群である、共培養したSMUP-Cell1とSMUP-Cell2で蛍光シグナルが測定された。このことから、HLA-A2が、それぞれがマクロファージ炎症モデルと共培養された、SMUP-Cell1およびSMUP-Cell2で発現したことが確認された（図2）。
実施例1.3. PTX-3、TIMP1、BDNF、およびHLA-A2を発現する間葉系幹細胞の抗炎症作用の確認
実施例1.2で共培養した後の培地を採取し、マウスIL-6およびマウスTNF-αのELISA分析により炎症性サイトカインの発現レベルを確認した。具体的には、マウスIL-6 ELISAキット(DY406、R&D Systems)およびマウスTNF-α ELISAキット(DY410、R&D Systems)を使用して、製造業者のプロトコルに従って分析を行った。共培養後の各培地サンプルを1～50に希釈して分析した。次に、VERSA maxマイクロプレートリーダー（Molecular Device）を用いて反応液のOD値を測定した。さらに、抗炎症性サイトカインの発現レベルを、マウスIL-10のELISA分析(DY417、R&D Systems)によってチェックした。ここで、非炎症誘発性RAW264.7細胞株を単独で培養した培地、およびマクロファージ炎症モデルを培養した培地でも、マウスIL-6、マウスTNF-α、および マウスIL-10を比較し、同様にELISA分析によって分析した。
実施例1.2で共培養した後の培地を採取し、マウスIL-6およびマウスTNF-αのELISA分析により炎症性サイトカインの発現レベルを確認した。具体的には、マウスIL-6 ELISAキット(DY406、R&D Systems)およびマウスTNF-α ELISAキット(DY410、R&D Systems)を使用して、製造業者のプロトコルに従って分析を行った。共培養後の各培地サンプルを1～50に希釈して分析した。次に、VERSA maxマイクロプレートリーダー（Molecular Device）を用いて反応液のOD値を測定した。さらに、抗炎症性サイトカインの発現レベルを、マウスIL-10のELISA分析(DY417、R&D Systems)によってチェックした。ここで、非炎症誘発性RAW264.7細胞株を単独で培養した培地、およびマクロファージ炎症モデルを培養した培地でも、マウスIL-6、マウスTNF-α、および マウスIL-10を比較し、同様にELISA分析によって分析した。
その結果、RAW264.7細胞株を単独で培養した培地と比較して、マクロファージ炎症モデルを培養した培地では、IL-6、TNF-α、およびIL-10がすべて増加することが確認された。逆に、SMUP-Cellをマクロファージ炎症モデルと共培養した培地では、IL-6とTNF-αの発現レベルが減少し、IL-10の発現レベルが増加した（図3）。
実施例2. 軟骨細胞炎症モデルにおける間葉系幹細胞の抗炎症作用の確認
実施例2.1. 炎症性条件下の間葉系幹細胞におけるPTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現増加の確認
軟骨細胞炎症モデルは、軟骨細胞株である1×105細胞のSW1353細胞株（Chon）を10ng/mlのIL-1bで処理することにより作製した。次に、1×105細胞のSMUP-Cellを、作製した軟骨細胞炎症モデルと共培養し、次に、分析を行った。ここでは、PTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現レベルを実施例1.1と同様に測定し、SMUP-Cellを単独で培養した場合と比較し、分析した。SMUP-Cellについては、3人の異なるドナーから受け取った3つの異なるタイプを使用した。それぞれの3つのタイプのSMUP-Cellについては、共培養後の培地での発現レベルのさらなる増加率をグラフで表した。「（Chon + IL-1b + SMUP-Cell）培地/SMUP-Cell単独培地×100」で数値計算を行い、計算値のみをグラフで表した。
実施例2.1. 炎症性条件下の間葉系幹細胞におけるPTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現増加の確認
軟骨細胞炎症モデルは、軟骨細胞株である1×105細胞のSW1353細胞株（Chon）を10ng/mlのIL-1bで処理することにより作製した。次に、1×105細胞のSMUP-Cellを、作製した軟骨細胞炎症モデルと共培養し、次に、分析を行った。ここでは、PTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現レベルを実施例1.1と同様に測定し、SMUP-Cellを単独で培養した場合と比較し、分析した。SMUP-Cellについては、3人の異なるドナーから受け取った3つの異なるタイプを使用した。それぞれの3つのタイプのSMUP-Cellについては、共培養後の培地での発現レベルのさらなる増加率をグラフで表した。「（Chon + IL-1b + SMUP-Cell）培地/SMUP-Cell単独培地×100」で数値計算を行い、計算値のみをグラフで表した。
その結果、軟骨細胞を単独で培養した場合、または軟骨細胞の炎症モデルを培養した場合、PTX-3、TIMP1、およびBDNFはほとんど発現されなかった。逆に、SMUP-Cellを軟骨細胞炎症モデルと共培養した場合、PTX-3、TIMP1、およびBDNFの発現レベルが増加することが確認された（図4）。
実施例2.2. PTX-3、TIMP1、およびBDNFを発現する間葉系幹細胞の抗炎症作用の確認
1×105細胞でのSMUP-Cellと、実施例2.1で作製した軟骨細胞炎症モデルとの共培養により、軟骨細胞の炎症を軽減できるかどうかを確認した。ここで、SMUP-Cellとして、3人の異なるドナーから受け取った3つの異なるタイプが使用された。実験は、以下のように分けられたグループを使用して実施された：1）軟骨細胞を単独で培養したグループ（Chon）、2）軟骨細胞の炎症モデルを培養したグループ（Chon + IL-1b）、3）3つのタイプのSMUP-Cellをそれぞれ軟骨細胞炎症モデルと共培養したグループ。
1×105細胞でのSMUP-Cellと、実施例2.1で作製した軟骨細胞炎症モデルとの共培養により、軟骨細胞の炎症を軽減できるかどうかを確認した。ここで、SMUP-Cellとして、3人の異なるドナーから受け取った3つの異なるタイプが使用された。実験は、以下のように分けられたグループを使用して実施された：1）軟骨細胞を単独で培養したグループ（Chon）、2）軟骨細胞の炎症モデルを培養したグループ（Chon + IL-1b）、3）3つのタイプのSMUP-Cellをそれぞれ軟骨細胞炎症モデルと共培養したグループ。
1)～3）の各群で培養した軟骨細胞をトリプシンで処理して単細胞に分離した後、それからmRNAを単離し、qPCRによって、炎症性サイトカインであるIL-1b、IL-8、およびIL-6の発現レベルを分析した。次に、GAPDHを使用して正規化された値との比較分析を行った。qPCRは次のように行われた。細胞を、製造元のプロトコルにしたがってTRIzol試薬（12263026、Invitrogen）で処理し、mRNAを抽出した。Transcriptor-First-Strand-cDNA合成キット(4897030001、Roche)を用いてcDNAを合成し、次に、炎症マーカーであるIL-1b、IL-8、IL-6、およびGAPDHのプライマーと混合した。次に、特定のマーカーに依存するcDNA産物を、リアルタイムPCRであるLight Cycler 480リアルタイムPCRシステム機器（Roche）を使用して測定した。ここでは、測定したcDNA産物の発現レベルをGAPDHの発現レベルに正規化し、各条件下で培養した細胞におけるマーカーの発現レベルを比較し、分析した。qPCRに使用したプライマーを表1に示す。
[表1]
[表1]
その結果、軟骨細胞を単独で培養したグループ1）と比較して、軟骨細胞炎症モデルを培養したグループ2）では、IL-1b、IL-8、およびIL-6の発現レベルが著しく増加していることが確認された。逆に、3つのタイプのSMUP-Cellのそれぞれを軟骨細胞炎症モデルと共培養したグループ3）では、IL-1b、IL-8、およびIL-6の発現レベルが低下することが確認された（図5）。
実施例3. 間葉系幹細胞から分泌されるPTX-3の抗炎症作用の確認
実施例3.1. 間葉系幹細胞におけるPTX-3遺伝子のノックダウンによって引き起こされるマクロファージ炎症モデルにおけるサイトカイン発現レベルの変化の確認
間葉系幹細胞から分泌されるPTX-3と炎症との相関関係を明らかにするために、間葉系幹細胞をPTX-3 siRNAで処理することにより得られた、PTX-3発現をノックダウンした細胞（SMUP-Cell PTX-3 C-siR）を使用した。ここでは、コントロールsiRNA（SMUP-Cell C-siR）で処理した間葉系幹細胞をネガティブコントロールとして一緒に使用した。実施例1.1のマクロファージ炎症モデルと実施例2.1の軟骨細胞炎症モデルをそれぞれSMUP-CellまたはSMUP-CellP TX-3 C-siRと共培養し、それらの抗炎症作用を比較し、分析した。
実施例3.1. 間葉系幹細胞におけるPTX-3遺伝子のノックダウンによって引き起こされるマクロファージ炎症モデルにおけるサイトカイン発現レベルの変化の確認
間葉系幹細胞から分泌されるPTX-3と炎症との相関関係を明らかにするために、間葉系幹細胞をPTX-3 siRNAで処理することにより得られた、PTX-3発現をノックダウンした細胞（SMUP-Cell PTX-3 C-siR）を使用した。ここでは、コントロールsiRNA（SMUP-Cell C-siR）で処理した間葉系幹細胞をネガティブコントロールとして一緒に使用した。実施例1.1のマクロファージ炎症モデルと実施例2.1の軟骨細胞炎症モデルをそれぞれSMUP-CellまたはSMUP-CellP TX-3 C-siRと共培養し、それらの抗炎症作用を比較し、分析した。
まず、マクロファージ炎症モデルの培養培地を用いて、炎症性サイトカインであるTNF-αと抗炎症性サイトカインであるアルギナーゼ-1（ARG-1）をELISAによって測定した。具体的には、マウスTNF-α ELISA（DY410、R＆D Systems）およびマウスアルギナーゼ1 ELISA（ab269541、Abcam）を使用して、製造元のプロトコルにしたがって分析を行った。共培養後の各培養培地サンプルを1～50に希釈し、分析した。次に、VERSA maxマイクロプレートリーダー（MolecularDevice）を用いて反応液のOD値を測定した。
その結果、マクロファージ炎症モデルを単独で培養した培地と比較して、マクロファージ炎症モデルをSMUP-CellまたはSMUP-Cell C-siRと共培養した培地では、TNF-αの発現レベルが減少し、ARG-1の発現レベルが増加した。逆に、マクロファージ炎症モデルをSMUP-Cell PTX-3 siRと共培養した培地では、TNF-αの発現レベルが増加し、ARG-1の発現レベルが減少した。このことから、PTX-3の発現が、炎症反応の調節に関与していることが確認された（図6）。
実施例3.2. 間葉系幹細胞におけるPTX-3遺伝子ノックアウト後のマクロファージ炎症モデルにおける表現型の変化の確認
LPS処置による炎症とSMUP-Cellとの共培養後のマクロファージの表現型変化（M1：炎症活性、M2：抗炎症活性）を確認するために、炎症を誘発したRAW264.7細胞株を固定し、細胞染色をマウス抗体で行った。
LPS処置による炎症とSMUP-Cellとの共培養後のマクロファージの表現型変化（M1：炎症活性、M2：抗炎症活性）を確認するために、炎症を誘発したRAW264.7細胞株を固定し、細胞染色をマウス抗体で行った。
具体的には、固定細胞を、一次抗体としてそれぞれ抗CD11b（Abcam、＃ab128797）およびマウスMMR/CD206（R＆D Systems、＃AF2535）で12～16時間冷蔵処理し、反応を進行させた。次に、Alexa Fluor 488（緑）とCy3（赤）を結合させた二次抗体でそれぞれ発色させた後、室温で30分間反応させた。続いて、未反応の試薬を洗い流した。次に、ヘキスト33342（青、Invitrogen、H3570）で処理して、核染色を行い、5分間反応させた。最終的に染色された細胞を、LSM 800共焦点顕微鏡（Zeiss）を使用して写真を撮った。
その結果、図7に示されるように、核は青色に染色され、CD11b(M1マーカー）は緑色に染色され、CD206(M2マーカー）は赤色に染色された。炎症が誘発されなかったRAW264.7細胞株では、CD11b（M1マーカー）およびCD206（M2マーカー）はほとんど染色されなかった。逆に、LPS処理により炎症を誘発されたRAW264.7細胞株では、ほとんどの細胞株でCD11bが染色されていることが確認された。一方、SMUP-CellまたはSMUP-Cell C-siRを炎症が誘発されるRAW264.7細胞株と共培養した場合、CD11bの染色度が著しく低下することが確認された。また、炎症が誘発されたRAW264.7細胞株では、CD206がほとんど染色されないのに対し、SMUP-CellまたはSMUP-CellC-siRと共培養した細胞では、CD206の染色度が上昇することが確認された。逆に、SMUP-Cell PTX-3 siRと共培養した場合、CD11bの染色度が上昇し、CD206の染色度が低下することが確認された。また、軟骨細胞の炎症モデルでも同様の傾向が確認された。
このことから、SMUP-Cellから分泌されたPTX-3がマクロファージの表現型に影響を及ぼし、炎症活性の調節に関与していることが確認された。
実施例3.3. 間葉系幹細胞におけるPTX-3遺伝子過剰発現後のマクロファージ炎症モデルにおけるサイトカイン発現レベルの変化の確認
間葉系幹細胞から分泌されるPTX-3と炎症との相関関係を明らかにするために、CRISPR/CAS9技術を使用して間葉系幹細胞でPTX-3の過剰発現（OE）を誘導することによって得られた細胞（SMUP-Cell PTX-3 OE）を使用した。ここでは、ネガティブコントロールとして、ベクターのみを導入して得られたSMUP-CellC-vecを使用した。実施例1.1のマクロファージ炎症モデルをSMUP-Cell、SMUP-Cell C-vec、SMUP-Cell PTX-3 OEとそれぞれ共培養し、それらの抗炎症作用を比較し、分析した。
間葉系幹細胞から分泌されるPTX-3と炎症との相関関係を明らかにするために、CRISPR/CAS9技術を使用して間葉系幹細胞でPTX-3の過剰発現（OE）を誘導することによって得られた細胞（SMUP-Cell PTX-3 OE）を使用した。ここでは、ネガティブコントロールとして、ベクターのみを導入して得られたSMUP-CellC-vecを使用した。実施例1.1のマクロファージ炎症モデルをSMUP-Cell、SMUP-Cell C-vec、SMUP-Cell PTX-3 OEとそれぞれ共培養し、それらの抗炎症作用を比較し、分析した。
マクロファージ炎症モデルの培養用培地を用いて、炎症性サイトカインであるIL-6をELISAによって測定した。具体的には、マウスIL-6 ELISA (DY406、R&D Systems)を使用して、製造業者のプロトコルにしたがって分析を行った。共培養後の各培地サンプルを1～50に希釈して分析した。次に、VERSA maxマイクロプレートリーダー（Molecular Device）を用いて反応液のOD値を測定した。
その結果、マクロファージ炎症モデルをSMUP-CellまたはSMUP-Cell C-vecと共培養した培地では、マクロファージ炎症モデルを単独で培養した培地と比較して、IL-6の発現レベルが同様に低下した。逆に、マクロファージ炎症モデルをSMUP-Cell PTX-3 OEと共培養した培地では、マクロファージ炎症モデルをSMUP-Cell（過剰発現前）と共培養した培地と比較して、IL-6の発現レベルが著しく低下した。このことから、PTX-3の発現が炎症反応の調節に関与していることが確認された（図13）。
実施例3.4. 間葉系幹細胞におけるPTX-3遺伝子ノックダウン後の軟骨細胞炎症モデルにおけるサイトカイン発現レベルの変化の確認
実施例2.1の軟骨細胞炎症モデルをSMUP-Cell、SMUP-Cell C-siR、またはSMUP-Cell PTX-3 siRと共培養し、次に、軟骨細胞における炎症性サイトカインの発現レベルをqPCRで確認した。qPCRは、実施例2.2と同じ方法で実施された。
実施例2.1の軟骨細胞炎症モデルをSMUP-Cell、SMUP-Cell C-siR、またはSMUP-Cell PTX-3 siRと共培養し、次に、軟骨細胞における炎症性サイトカインの発現レベルをqPCRで確認した。qPCRは、実施例2.2と同じ方法で実施された。
その結果、軟骨細胞炎症モデルをSMUP-CellまたはSMUP-Cell C-siRと共培養した培地では、軟骨細胞炎症モデルを単独で培養した培地と比較して、IL-1b、IL-6、IL-8、およびTNF-αの発現レベルが低下した。逆に、軟骨細胞炎症モデルをSMUP-Cell PTX-3と共培養した培地では、軟骨細胞炎症モデルをSMUP-CellまたはSMUP-CellC-siRと共培養した培地と比較して、IL-1b、IL-6、IL-8、およびTNF-αの発現レベルが高いことが確認された。
このことから、間葉系幹細胞におけるPTX-3の発現が軟骨細胞の炎症反応調節に関与していることが確認された。
実施例4. 間葉系幹細胞から分泌されるPTX-3の疼痛軽減効果の確認
関節炎の痛みを誘発したラットモデルを作成するために、150g～250gの雄性ラットを麻酔し、次に、膝関節内注射用注射器を使用して2mgのモノヨードアセテート（MIA）を注射した。次に、MIA注射の4日後、関節内注射用注射器を使用して、1％ヒアルロン酸（HA）を含む2.5×105細胞/25μlでの間葉系幹細胞の注射を行った。痛みの測定のために、MIA注射後0、1、4、7、14、21、および28日目に無能力試験を実施した。コントロールとして、1％のHAのみを注射したグループを使用した。さらに、ネガティブコントロールとして、PTX-3 siRNAで処理したSMUP-Cellおよび著しく低いPTX-3発現を示すヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）（CRL-1730、ATCC）を使用して、PTX-3発現の効果を確認した。
関節炎の痛みを誘発したラットモデルを作成するために、150g～250gの雄性ラットを麻酔し、次に、膝関節内注射用注射器を使用して2mgのモノヨードアセテート（MIA）を注射した。次に、MIA注射の4日後、関節内注射用注射器を使用して、1％ヒアルロン酸（HA）を含む2.5×105細胞/25μlでの間葉系幹細胞の注射を行った。痛みの測定のために、MIA注射後0、1、4、7、14、21、および28日目に無能力試験を実施した。コントロールとして、1％のHAのみを注射したグループを使用した。さらに、ネガティブコントロールとして、PTX-3 siRNAで処理したSMUP-Cellおよび著しく低いPTX-3発現を示すヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）（CRL-1730、ATCC）を使用して、PTX-3発現の効果を確認した。
ここで、間葉系幹細胞におけるPTX-3の発現レベルについて、実施例1.1のマクロファージ炎症モデルを、それぞれSMUP-Cell、SMUP-Cell C-siR、SMUP-Cell PTX-3 siR、およびHUVECと共培養した各培地に対して、HPTX-3 ELISAキットにより測定を行った。次に、SMUP-CellにおけるPTX-3の発現レベルを100％に設定した。この発現レベルを使用して変換を行い、変換された値をグラフで表して識別した。その結果、SMUP-Cellと比較して、SMUP-Cell PTX-3 siRではPTX-3の発現レベルが低下し、SMUP-Cell PTX-3 siRと比較して、HUVECではPTX-3の発現レベルが著しく低下していることが確認された（図9）。
それぞれのグループにおけるPTX-3の発現レベルの違いが疼痛軽減効果の変化を引き起こすかどうかを確認した。ここで、正常ラットでは、体重が両後肢に均等に分布していることが確認された（同側/総体重（％）=50）が、MIAまたはMIA + HAのみを投与されたコントロールでは、MIA注射後の時間の経過とともに痛みが強まり、値が減少した。このようにして、動物の痛みのモデルが作成された。次に、PTX-3の発現レベルが異なる間葉系幹細胞を関節炎の疼痛誘発ラットに注射して、それらの疼痛緩和効果を確認した。
その結果、PTX-3の発現レベルが多い、SMUP-CellおよびSMUP-Cell C-siRを注射されたグループでは、注射後から体重負荷値が増加し、細胞投与の24日以内にほぼ回復したことが確認された。逆に、SMUP-Cell PTX-3 siRを移植されたグループでは、細胞投与後も体重負荷値が回復せず、むしろ低下していることが確認された。また、HUVECを移植されたグループでは、最初は体重負荷値が回復したようにみえたが、細胞投与後10日目から値が低下し、痛みの軽減傾向は見られなかった。
このことから、間葉系幹細胞から分泌されるPTX-3が関節炎の痛みの軽減に関与していることが確認された。
実施例5. 間葉系幹細胞から分泌されるTIMP1およびその抗炎症作用の確認
間葉系幹細胞から分泌されるTIMP1と炎症の相関関係を確認するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/CAS9システムを使用して間葉系幹細胞においてTIMP1発現をノックアウトすることによって得られた細胞（SMUP-Cell TIMP1ノックアウト、KO）を使用して、テストを行った。ここでは、ネガティブコントロールとして、ベクターのみを導入して得られたSMUP-Cell C-vecを使用した。
間葉系幹細胞から分泌されるTIMP1と炎症の相関関係を確認するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/CAS9システムを使用して間葉系幹細胞においてTIMP1発現をノックアウトすることによって得られた細胞（SMUP-Cell TIMP1ノックアウト、KO）を使用して、テストを行った。ここでは、ネガティブコントロールとして、ベクターのみを導入して得られたSMUP-Cell C-vecを使用した。
実施例2の軟骨細胞炎症モデルを、各グループの間葉系幹細胞と共培養した後、軟骨細胞炎症モデルをトリプシンで処理して単細胞に分離した。そこからmRNAを抽出し、炎症性サイトカインの遺伝子発現パターンをqPCRで確認した。qPCRは実施例2.2と同様に行った。
その結果、SMUP-CellまたはSMUP-Cell c-vecと共培養した軟骨細胞炎症モデルにおいて、SMUP-CellまたはSMUP-Cell c-vecと共培養された正常な軟骨細胞と比較して、IL-1b、IL-6、IL-8、およびTNF-αの発現れべるが低下していることが確認された。逆に、軟骨細胞炎症モデルをSMUP-Cell TIMP1 KOと共培養した場合、軟骨細胞炎症モデルをSMUP-CellまたはSMUP-Cell c-vecと共培養した場合と比較して、IL-1b、IL-6、IL-8、TNF-αの発現量が高いことが確認された。このことから、間葉系幹細胞におけるTIMP1の発現が、炎症反応の調節に関与していることが確認された（図11）。
実施例6. 間葉系幹細胞から分泌されるBDNFと抗炎症との相関関係の確認
間葉系幹細胞から分泌されるBDNFと炎症との相関関係を確認するために、BDNF発現をノックダウンするために間葉系幹細胞をBDNF siRNAで処理して得られた細胞（SMUP-Cell BDNF C-siR）を使用して、テストを行った。ここでは、コントロールsiRNAで処理して得られた間葉系幹細胞（SMUP-Cell C-siR）をネガティブコントロールとして一緒に使用した。
間葉系幹細胞から分泌されるBDNFと炎症との相関関係を確認するために、BDNF発現をノックダウンするために間葉系幹細胞をBDNF siRNAで処理して得られた細胞（SMUP-Cell BDNF C-siR）を使用して、テストを行った。ここでは、コントロールsiRNAで処理して得られた間葉系幹細胞（SMUP-Cell C-siR）をネガティブコントロールとして一緒に使用した。
実施例1のマクロファージ炎症モデルを、各グループの間葉系幹細胞と共培養した。次に、各培地を用いて、炎症性サイトカインであるIL-6およびTNF-αの発現レベルを測定ELISAキットで測定した。
その結果、マクロファージ炎症モデルをSMUP-CellまたはSMUP-Cell C-siRと共培養した培地では、マクロファージ炎症モデルを単独で培養した培地と比較して、IL-6およびTNF-αの発現レベルが低下した。逆に、マクロファージ炎症モデルをSMUP-Cell PTX-3 siRと共培養した培地では、マクロファージ炎症モデルはSMUP-CellまたはSMUP-CellC-siRと共培養した培地と比較して、IL-6およびTNF-αの発現レベルが高いことが観察された。このことから、BDNFの発現が、炎症反応の調節に関与していることが確認された（図12）。
Claims (19)
- PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、炎症性疾患または疼痛の予防または治療のための医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、PTX-3を発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、BDNFを発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、TIMP1を発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、以下のステップ：
(1)10μm以下のサイズを有する間葉系幹細胞を単離する；
(2)単離された間葉系幹細胞を、酸素2％～5％の低酸素条件下でカルシウムを含む培地中で培養する；および
(3)培養間葉系幹細胞を炎症性刺激にさらす；
を含む方法によって作製される、請求項１に記載の医薬組成物。 - カルシウムが、1.5mM～3.8mMの濃度で含まれる、請求項５に記載の医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、皮膚、臍帯、羊水、または歯に由来する、請求項１に記載の医薬組成物。
- 炎症性疾患が、骨関節炎、関節リウマチ、アトピー、喘息、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、移植片対宿主疾患（GVHD）、糖尿病性腎症、クローン病、炎症性腸疾患、移植後拒絶、気管支肺異形成症（BPD）、または慢性閉塞性肺疾患（COPD）である、請求項１に記載の医薬組成物。
- 痛みが、炎症性の痛みである、請求項１に記載の医薬組成物。
- 炎症性の痛みが、関節炎の痛みである、請求項９に記載の医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、炎症性刺激を受けた場合、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質の発現レベルの増加を示す、請求項１に記載の医薬組成物。
- 改善された抗炎症または疼痛軽減効果を有する間葉系幹細胞を得るための方法であって、
間葉系幹細胞を刺激して、間葉系幹細胞が、PTX-3、TIMP1、およびBDNFからなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質の発現の増加を示すようにするステップを含む、方法。 - 刺激ステップが、間葉系幹細胞を炎症性環境に曝露するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
- 間葉系幹細胞を炎症性環境に曝露するステップが、炎症誘発性細胞との共培養を含む、請求項１３に記載の方法。
- 炎症誘発性細胞が、リポ多糖(LPS)、マイトジェン、ケモカインまたはサイトカインでの処置によって炎症が誘発された細胞である、請求項１４に記載の方法。
- 細胞が、体細胞、生殖細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項１５に記載の方法。
- 体細胞が、筋細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板または粘膜細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項１６に記載の方法。
- 間葉系幹細胞が、刺激ステップの前に、以下のステップ：
（1）サイズが10μm以下の間葉系幹細胞を単離する；および
（2）単離された間葉系幹細胞を、カルシウムを含む培地中で、2％～5％の酸素の低酸素条件下で培養する；
を含む方法によって作製される、請求項１２に記載の方法。 - カルシウムが、1.5mM～3.8mMの濃度で含まれる、請求項１８に記載の方法。
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