CN103501822A - 使用胎盘干细胞治疗脊髓损伤和外伤性脑损伤 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗患有中枢神经系统损伤（例如脊髓损伤或外伤性脑损伤）的个体的方法，其中使用在此描述的胎盘干细胞和胎盘多效干细胞和这些胎盘细胞群。

Description

使用胎盘干细胞治疗脊髓损伤和外伤性脑损伤
本申请要求提交于2010年12月17日的美国临时申请号61/424,559的权益，其公开内容在此整体引入作为参考。
1.技术领域
在此提供了使用人胎盘干细胞治疗患有外伤性脊髓损伤(SCI)或外伤性脑损伤(TBI)的个体的方法。
2.背景技术
中枢神经系统(CNS)损伤代表了一类医学上很重要的问题。约300,000在美国生活的人患有脊髓损伤(SCI)，且每年诊断新增10,000-14,000的SCI病例。SCI通常来自脊柱创伤，例如，由错位的骨骼或骨盘压迫脊髓导致。SCI可能在没有明显椎骨骨折情况下发生，例如，由脊髓血液损失导致，而脊柱骨折可能在没有SCI的情况下发生。
外伤性脑损伤(TBI)是导致全球青壮年残疾和死亡的主要原因之一。其在军队的情况下为，例如，由诸如直接撞击、诸如子弹和弹片等穿透性物体以及由爆炸导致的冲击波等导致的脑损伤。
3.发明概述
在此提供了治疗、控制和/或减轻CNS损伤相关紊乱和/或病况的方法。在一个实施方式中，在此提供了治疗患有外伤性CNS损伤、或与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况的个体的方法，包括对个体给予治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基，其中治疗有效量是足以对所述外伤性CNS损伤、或与所述CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况的一种或多种症状产生可检测的改善或足以减轻其发展的量。在此还提供了胎盘干细胞在制备用于治疗、控制和/或减轻例如SCI或TBI的CNS损伤的一种或多种症状的药物中的应用。
在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基在损伤的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、15、16、17、18、19、20，25、30，35、40、45、50天或更多天内，或CNS损伤后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年内被给予个体。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基在CNS损伤的21天、14天或7天内，或在CNS损伤的48小时、24小时、12小时或3小时内被给予个体。
在一个具体的实施方式中，CNS损伤是SCI。在一些实施方式中，SCI来自直接创伤。在一些实施方式中，SCI来自骨折片、血肿或盘材料的压迫。在一些实施方式中，SCI发生于颈椎、胸椎、腰椎、或骶椎的一种或多种。在一些实施方式中，SCI是针对颈髓、胸髓、腰骶椎、椎体、枕骨的一种或多种，或一种或多种马尾神经。
在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况是由SCI导致的脊髓休克。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况是由SCI导致的神经源性休克。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况是由SCI导致的自主反射障碍。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况是由SCI导致的水肿。在一些实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况选自由下述组成的组：中髓综合症、脊髓半切综合症、前髓综合症、脊髓圆锥综合症和马尾综合症。
在一些实施方式中，给药的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基的治疗有效量是足以对一种或多种的以下SCI症状产生可检测的改善或减轻其发展的量：在脊髓的颈段、胸段、腰段或骶段的运动功能、感觉功能、或运动和感觉功能的缺失或损伤。在一些实施方式中，SCI的一种或多种症状包括臂部、躯干、腿部或盆腔内器官的运动机能、感觉功能、或运动和感觉功能的缺失或损伤。在一些实施方式中，SCI的一种或多种症状包括在皮节C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4或L5的一种或多种中的麻木。
在此提供的治疗SCI的一些实施方式中，该方法进一步包括对所述个体给予第二治疗剂。在一些实施方式中，第二治疗剂是皮质类固醇、神经保护剂、免疫调节或免疫抑制剂、或抗凝剂。
在此提供的治疗方法的另一个具体的实施方式中，与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况是TBI。在一些实施方式中，TBI是大脑额叶、顶叶、枕叶、颞叶、脑干、或小脑的损伤。在一些实施方式中，TBI为轻度TBI。在一些实施方式中，TBI是中度至重度TBI。
在一些实施方式中，给药的治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基是足以对一种或多种的以下轻度TBI症状产生可检测的改善或减轻其发展的量：头痛、记忆力问题、注意力缺陷、情绪波动和挫折、疲劳、视力障碍、记忆力减退、注意力/专注度不佳、睡眠障碍、头晕/失去平衡、烦躁不安、情绪障碍、感觉抑郁、抽搐、恶心、嗅觉损失、声光敏感、情绪变化、迷失或糊涂、或思维缓慢。
在一些实施方式中，给予的治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基是足以对一种或多种的以下中度至重度TBI症状产生可检测的改善或减轻其发展的量：注意困难、专注度困难、注意力不集中、记忆困难、处理速度缓慢、混乱、持续言语、冲动、语言处理困难、言语困难、不理解口语（感觉性失语）、说话和被理解困难（表达性失语）、口齿不清、说话过快或过慢、阅读问题、写作问题、对触摸、温度、运动、肢体位置和细微区分的解释困难、将感官印象整合或构架至心理学有意义的数据的困难、部分或完全丧失视力、眼部肌肉衰弱和双视（复视）、视力模糊、判断距离困难、眼球不自主运动（眼球震颤）、不耐光（畏光）、听力下降或损失、耳鸣、对声音敏感性增加、嗅觉损失或减退（嗅觉缺失症）、味觉损失或减退、癫痫、癫痫相关的抽搐、身体瘫痪/痉挛、慢性疼痛、肠和/或膀胱失去控制、睡眠障碍、耐久力损失、食欲改变、体温失调、月经困难、社会情感困难、依赖行为、情感能力丧失、缺乏动力、烦躁不安、易怒、抑郁、去抑制、或缺乏认识。
在此提供的治疗TBI的一些实施方式中，该方法进一步包括对所述个体给予第二治疗剂。在一些实施方式中，第二治疗剂是抗癫痫药、抗抑郁药、金刚烷胺、哌醋甲酯、溴隐亭、卡马西平或阿米替林。
在治疗诸如SCI或TBI等CNS损伤的一些实施方式中，如在此提供的，治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基通过选自下述的路径给予个体：静脉内、动脉内、腹膜内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内、大脑内、脑室内、囊内、骨内输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬脑膜外、腰椎穿刺、小脑延髓池或皮下给药。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基直接在损伤部位给予个体。
在一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞是CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞表达CD200且不表达HLA-G；或表达CD73、CD105和CD200；或表达CD200和OCT-4；或表达CD73和CD105且不表达HLA-G；或表达CD73和CD105且当含有所述干细胞的胎盘细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；或表达OCT-4且当含有所述干细胞的胎盘细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体。在某些实施方式中，胎盘干细胞抑制免疫细胞的活性，例如，抑制T细胞增殖。
在某些实施方式中，在此提供了一种的方法抑制个体中对诸如SCI或TBI等CNS损伤的促炎性应答的方法，包括用胎盘干细胞接触CNS损伤相关的或作为CNS损伤一部分的T细胞(例如，CD4+T淋巴细胞或白细胞)，例如，用在此描述的胎盘干细胞接触。在一个具体的实施方式中，炎性应答是Th1应答或Th17应答。在一个具体的实施方式中，所述接触可检测地减少Th1细胞成熟。在本方法的一个具体的实施方式中，所述接触可检测地减少由所述T细胞产生的一种或多种的白介素-1β(IL-1β)、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和/或干扰素-γ(IFNγ)。在本方法的另一个具体的实施方式中，所述接触增强或上调调节性T细胞(Treg)表型。在另一个具体的实施方式中，所述接触下调树突细胞(DC)和/或巨噬细胞表达促进Th1和/或Th17免疫应答的标志物(例如，CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)。在一个具体的实施方式中，所述T细胞还接触IL-10，例如，外源性IL-10或不由所述T细胞产生的IL-10，例如，重组IL-10。在另一个实施方式中，在此提供了一种减少产生来自巨噬细胞的促炎性细胞因子的方法，包括用有效量的胎盘干细胞接触巨噬细胞。在另一个实施方式中，在此提供了一种上调耐受原细胞和/或细胞因子的方法，例如，来自巨噬细胞的，包括用有效量的胎盘干细胞接触免疫系统细胞。在一个具体的实施方式中，所述接触导致活化巨噬细胞生成较之不与所述胎盘干细胞接触的活化巨噬细胞而言可检测的更多IL-10。在另一个实施方式中，在此提供了一种上调或增加抗炎性T细胞数量的方法，包括用有效量的胎盘干细胞接触免疫系统细胞。
在一个实施方式中，在此提供了一种抑制个体中CNS损伤相关的Th1应答的方法，包括对个体给予有效量的胎盘干细胞，其中所述有效量是在个体中导致所述CNS损伤相关的Th1应答可检测地减少的量。在另一个实施方式中，在此提供了一种抑制个体中CNS损伤相关的Th17应答的方法，包括对个体给予有效量的胎盘干细胞，其中所述有效量是在个体中导致Th17应答可检测地减少的量。在这些方法的具体的实施方式中，所述给药在所述个体中可检测地降低由T细胞或抗原呈现细胞(例如，DC、巨噬细胞或单核细胞)生产的一种或多种的淋巴毒素-1α(LT-1α)、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα和/或IFNγ。在本方法的另一个具体的实施方式中，所述接触加强或上调调节性T细胞(Treg)。在另一个实施方式中，所述接触在个体中调节(例如，减少)由树突细胞(DC)和/或巨噬细胞生产的所述促进Th1或Th17应答的标志物(例如，CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)。在另一个具体的实施方式中，该方法另外包括对所述个体给药IL-10。
在另一方面，在此提供了如在此描述的被遗传修饰以表达一种或多种抗炎性细胞因子的胎盘干细胞。在一个具体的实施方式中，所述抗炎性细胞因子包括IL-10。
3.1定义
如本文所使用的，当涉及说明的数值时，术语“约”表示所说明的数值正或负10%内的值。
如本文所使用的，当涉及在此描述的胎盘干细胞时，术语“数量”表示特定数量的胎盘细胞，例如，以一种或多种剂量被给药的若干胎盘干细胞，其足以在降低CNS损伤的一种或多种症状的严重程度或减缓其发展方面产生可检测的改善。
如本文所使用的，术语“来源的”表示从中分离的或用其它方式纯化的。例如，胎盘来源的贴壁细胞分离自胎盘。术语“来源的”涵盖了由直接从诸如胎盘的组织中分离的细胞所培养的细胞，以及培养或扩增自初级分离物的细胞。
在此使用的“免疫定位”表示在例如流式细胞术、荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等中对诸如细胞标志物的化合物进行检测，其中使用免疫蛋白，例如，抗体或其片段。
如本文所使用的，术语“SH2”是指结合标志物CD105上的表位的抗体。因此，称为SH2+的细胞是CD105+。
如本文所使用的，术语“SH3”和“SH4”是指结合标志物CD73上所存在的表位的抗体。因此，称为SH3+和/或SH4+的细胞是CD73+。
如本文所使用的，如果在例如干细胞的收集和/或培养期间从干细胞中除去了至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%的与其天然相联系的其他细胞，那么干细胞是“分离的”。“分离的”细胞群表示基本上与从中分离细胞群体的组织（例如，胎盘）中的其他细胞分离的细胞群体。在一些实施方式中，如果在例如干细胞群的收集和/或培养期间从干细胞群中除去了至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%的与其天然相联系的其他细胞，那么干细胞群是“分离的”。
如本文所使用的，术语“胎盘干细胞”是指来源于（例如分离自）哺乳动物胎盘的干细胞或祖细胞，而不考虑形态、细胞表面标志物或初代培养后的传代数，其附着于组织培养基材（例如，塑料组织培养皿、纤连蛋白涂覆的组织培养板）。如本文所使用的，术语“胎盘干细胞”不是滋养层、细胞滋养层、胚胎生殖细胞或胚胎干细胞，如本领域技术人员所理解的那些细胞。如果细胞保持至少一种干细胞的性质，例如：与一种或多种类型的干细胞有关的标志物或基因表达谱；在培养中复制至少10-40次的能力；多潜能性，例如能够体外、体内或体内外分化成一种或多种的三个胚层细胞的能力；缺失成体（即，分化的）细胞特性；等等，那么认为该细胞是“干细胞”。术语“胎盘干细胞”和“胎盘来源的干细胞”可交换使用。除非在本文中另作说明，否则术语“胎盘”包括脐带。在某些实施方式中，本文所公开的胎盘干细胞是体外多效(即，细胞在分化条件下体外分化)、体内多效(即，细胞在体内分化)、或两者兼有。
如本文所使用的，当标志物是可检测的时，干细胞对特定标志物是“阳性的”。例如，由于CD73在胎盘干细胞上是以比背景（与（例如）抗体同型对照相比或给定分析的实验阴性对照相比）更大的量可检测的，因此胎盘干细胞对于（例如）CD73是阳性的。当由细胞所提供或表达时标志物可用于将该细胞与至少一种其他细胞类型进行区分或可用于选择或分离该细胞时，该细胞对于标志物也是阳性的。
在此使用的“免疫调节”和“免疫调节的”表示导致或有能力导致可检测的免疫应答变化，以及导致可检测的免疫应答变化的能力。
在此使用的“免疫抑制”和“免疫抑制的”表示导致或有能力导致可检测的免疫应答减少，以及导致可检测的免疫应答减少的能力。
4.附图简述
图1显示了胎盘来源的贴壁细胞对选定的血管生成蛋白的分泌。
图2显示了胎盘来源的贴壁细胞条件培养基对人内皮细胞(HUVEC)管形成的血管生成效果。
图3显示了胎盘来源的贴壁细胞条件培养基对人内皮细胞迁移的血管生成效果。
图4显示了胎盘来源的贴壁细胞条件培养基对人内皮细胞增殖的效果。
图5显示了HUVEC和胎盘来源的贴壁细胞的管形成。
图6显示了胎盘来源的贴壁细胞在低氧和常氧条件下的VEGF和IL-8的分泌。
图7显示了鸡绒毛膜尿囊血管生成模型中PDAC对血管生成的正面效果。bFGF：碱性成纤维细胞生长因子(阳性对照)。MDAMB231：血管生成性乳腺癌细胞系(阳性对照)。Y轴：血管形成度。
图8显示了鸡绒毛膜尿囊血管生成模型中PDAC条件培养基(上清)对血管生成的正面效果。bFGF：碱性成纤维细胞生长因子(阳性对照)。MDAMB231：血管生成性乳腺癌细胞系(阳性对照)。Y轴：血管形成度。
图9：在星形胶质细胞培养物或星形胶质细胞和PDAC共培养物中存在的过氧化氢产生的活性氧。RFU ROS活性：活性氧的相对荧光单位。
5.发明详述
5.1治疗CNS损伤的方法
在此提供了用于治疗患有诸如SCI或TBI的CNS损伤或与CNS损伤相关的疾病、紊乱或病况的个体的方法，包括对患有CNS损伤的个体给予一种或多种剂量的胎盘干细胞。用于治疗该个体的方法和用于该干细胞单独或与其它治疗剂组合给药的方法如下详述。
5.1.1治疗脊髓损伤(SCI)
在此提供了治疗患有或正在经历SCI症状或其相关疾病、紊乱或病况的个体的方法，包括对个体给予治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基，其中治疗有效量是足以对所述SCI的一种或多种症状产生可检测的改善或足以减轻其发展的量。在此使用的“一种或多种症状”包括客观检测参数，例如炎症程度、免疫应答、与治疗过程有关的损伤部位内部的基因表达、损伤部位瘢痕的质量和程度、患者运动和感觉功能改进等，以及主观检测参数，例如患者的健康、患者对运动和感觉功能改进的感觉、SCI相关的疼痛或不适减轻的感觉，等等。
SCI是一种对脊髓的破坏，导致其正常运动、感觉或自主神经功能暂时或永久性改变。SCI包括被称为四肢瘫痪(前身为四肢麻痹(quadriplegia))和截瘫的两种情况。从而，在此提供的SCI治疗方法的一些实施方式中，患有或正在经历SCI症状或其相关疾病、紊乱或病况的个体是四肢瘫痪或截瘫的。
四肢瘫痪指颈部脊髓损伤，其特征为由于椎管内神经元伤害导致的脊髓颈段运动和/或感觉功能的损伤或缺失。四肢瘫痪导致臂部、躯干、腿部和盆腔内器官的功能损伤。其不包括臂丛神经损害或椎管外周围神经损伤。
截瘫指椎管内神经元伤害继发性胸段、腰段或骶段（而非颈段）脊髓运动和/或感觉功能的损伤或缺失。患有截瘫，手臂功能仍然存在，但是根据损伤程度不同，躯干、腿部和盆腔内器官可能涉及（损伤）。该术语适用于马尾和椎体髓损伤，但不适用于腰骶丛损伤或椎管外周围神经损伤。
SCI的一般诱因包括但不限于，机动车事故、跌落、暴力、运动损伤、血管病变、椎关节强硬、医源性损伤（特别是脊髓注射和硬脑膜外导管放置）、骨质疏松和发育障碍继发性椎骨骨折。
在某些实施方式中，SCI可能来自于，例如，钝力外伤、压迫、错位等。在某些实施方式中，脊髓被完全切断。在某些其它实施方式中，脊髓受到伤害，例如，部分切断但不完全切断。在其它实施方式中，脊髓受到来自脊柱骨性结构受伤、一种或多种椎骨相对于其它椎骨发生错位、炎症或邻近组织肿胀等等的压迫。
在一个实施方式中，SCI发生于一种或多种的颈椎。在另一个实施方式中，SCI发生于一种或多种的胸椎。在另一个实施方式中，SCI发生于一种或多种的腰椎。在另一个实施方式中，SCI发生于一种或多种的骶椎。在某些实施方式中，SCI发生于椎骨C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7；或位于椎骨T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11或T12；或位于椎骨L1、L2、L3、L4或L5。在其它某些实施方式中，SCI是针对在C1和C2之间、在C2和C3之间、在C3和C4之间、在C4和C5之间、在C5和C6之间、在C6和C7之间、在C7和T1之间、在T1和T2之间、在T2和T3之间、在T3和T4之间、在T4和T5之间、在T5和T6之间、在T6和T7之间、在T7和T8之间、在T8和T9之间、在T9和T10之间、在T10和T11之间、在T11和T12之间、在T12和L1之间、在L1和L2之间、在L2和L3之间、在L3和L4之间、或在L4和L5之间退出(exiting)脊柱的脊髓根。在某些实施方式中，损伤是针对颈髓。在其它实施方式中，损伤是针对胸髓。在其它实施方式中SCI是针对腰骶部脊髓。在其它某些实施方式中，SCI是针对椎体。在其它某些实施方式中，CNS损伤是针对马尾中的一种或多种神经。在另一个实施方式中，SCI发生于枕骨。
在某些实施方式中，SCI的症状是一种或多种皮节(即，由给定脊髓平面神经支配的一片皮肤)的麻木。在具体的实施方式中，SCI的症状是在一种或多种的皮节C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4或L5的麻木。
脊髓休克是一种在损伤平面下的脊索功能暂时性生理（而非解剖）反射抑制状态，伴有相应的感觉运动功能损失。其中在初期由于儿茶酚胺的释放导致血压升高，继而发生低血压。可观察到包括肠和/或膀胱的迟缓性瘫痪，且有时发生持续性异常勃起。这些症状倾向于持续几小时至几天，直至在损伤平面下的反射弧开始再次发挥功能（例如，球海绵体肌反射，肌牵张反射[MSR]）。因此，在该方法具体的实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对由SCI造成的脊髓休克的一种或多种症状产生可检测的改善的量，包括但不限于，一些或全部感觉运动功能损失、高血压、低血压、(例如，肠和/或膀胱的)迟缓性瘫痪和异常勃起。
神经源性休克表现为低血压、心动过缓和体温过低三项。休克一般更倾向于发生在T6之上，随着来自T1-L2的交感传出和非对抗性迷走紧张，导致血管阻力降低并伴随着血管扩张。神经源性休克不同于脊髓休克和低血容量性休克，其倾向于与心动过速有关。从而，在治疗SCI方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对由SCI造成的一种或多种神经源性休克症状得到可检测的改善的量，包括但不限于，低血压，心动过缓，体温过低，血管阻力降低和血管扩张。
自主反射障碍(AD)是发生在患有内脏交感传出之上(T5-T6)的SCI患者中的大规模不平衡反射交感神经冲动释放的综合症。AD发生于其中反射返回的脊髓休克阶段之后。患有主要内脏传出之上损伤的个体可能发展成AD。在损伤之下，完整的周围感觉神经传递脉冲，其在脊髓丘脑和后柱中升高以刺激位于中侧脊髓灰质的交感神经元。在SCI之上来自脑血管舒缩中枢的受抑传出被增强，但其不能穿过下方SCI的阻隔。这一大的交感传出导致各种神经递质的释放（去甲肾上腺素、多巴胺-b-羟化酶、多巴胺），产生立毛、皮肤苍白和严重的动脉血管收缩。其结果是在损伤平面之上突然的血压升高和血管舒张。患者通常会患有由疼痛敏感的脑血管舒张导致的头痛。从而，在SCI治疗方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对由SCI造成的自主反射障碍的一种或多种症状产生可检测的改善的量，包括但不限于，在损伤平面之上的立毛、皮肤苍白和严重的动脉血管收缩、血压升高和血管舒张。
在SCI治疗方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对由SCI造成的水肿的一种或多种症状产生可检测的改善的量。在本方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对由直接创伤导致的SCI的一种或多种症状产生可检测的改善的量。在本方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对受椎骨碎片压迫导致的一种或多种SCI症状产生可检测的改善的量。在本方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对受椎骨盘材料压迫导致的一种或多种SCI症状产生可检测的改善的量。
在此提供的治疗SCI的方法还提供针对患有或正在经历涉及其它SCI种类的症状或疾病、紊乱或病况的个体的治疗，包括但不限于，中髓综合症、脊髓半切综合症、前髓综合症、脊髓圆锥综合症和马尾综合症。
中髓综合症通常与颈部损伤相关，并导致上肢发生比下肢更严重的虚弱，且保留骶骨感知。从而，在SCI治疗方法的具体实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对中髓综合症的一种或多种症状产生可检测的改善的量，包括但不限于，上肢发生比下肢更严重的虚弱，且保留骶骨感知。
脊髓半切综合症，通常与脊索半切损伤相关，导致相对严重的同侧本体感觉和运动损失，以及对侧痛觉和温度敏感性损失。从而，在SCI治疗方法的具体实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对脊髓半切综合症的一种或多种症状产生可检测的改善的量，包括但不限于，同侧本体感觉和运动损失，以及对侧痛觉和温度感觉损失。
前髓综合症通常与导致运动功能不定损失及痛觉和温度敏感性损失的损伤相关；本体感受被保留。从而，在SCI治疗方法的具体实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对前髓综合症的一种或多种症状产生可检测的改善的量，包括但不限于，运动功能的不定损失及痛觉和温度敏感性损失。
脊髓圆锥综合症与导致反射消失性膀胱、肠和下肢的骶索和腰神经根损伤有关，而骶段偶尔可能表现出保留的反射(例如，球海绵体肌和排尿反射)。从而，在SCI治疗方法的具体实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对脊髓圆锥综合症的一种或多种症状产生可检测的改善的量，包括但不限于，反射消失性膀胱、肠和下肢。
马尾综合症是由于椎管腰骶神经根损伤，导致反射消失性膀胱、肠和下肢。从而，在SCI治疗方法的具体实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对马尾综合症的一种或多种症状产生可检测的改善的量，包括但不限于，反射消失性膀胱、肠和下肢。
在某些实施方式中，用于检测对SCI的一种或多种症状、病症或综合症是否产生改善、减轻严重程度或减轻其发展的特定技术对于在此提供的SCI治疗方法而言并不重要。在某些实施方式中，根据本领域从业者的判断对针对SCI一种或多种症状、病症或综合症发展的改善和减缓做出评价。在某些实施方式中，根据本领域从业者的判断以及主体的主观经验对针对SCI一种或多种症状、病症或综合症发展的改善和减缓做出评价。
在一些实施方式中，根据脊髓损伤的神经和功能分类国际标准来检测对所述SCI一种或多种症状的改善或发展减轻。脊髓损伤的神经和功能分类国际标准由美国脊髓损伤协会(ASIA)公布，是一个基于神经功能的系统性运动和感知检查来描述SCI水平和程度的得到广泛接受的系统。参见International Standards For Neurological Classification Of Spinal Cord Injury,J Spinal Cord Med.26Suppl1:S50-6(2003)，其公开内容全文引入作为参考。
在特定的实施方式中，根据ASIA病损分级（修订的Frankel分级）对所述SCI一种或多种症状的改善或发展减轻进行检测，使用以下分类：
A—完全性损害：在骶段S4-S5.4无任何感觉或运动功能保留。“完全”指在最下方的骶段无无任何感觉或运动功能保留。
B—不完全性损害：在神经平面以下并贯穿骶段（S4—S5）存在感觉功能，但无运动功能。“不完全”指损伤平面以下保留感觉或运动功能，包括最下方的骶段。
C—不完全性损害：在神经平面以下存在运动功能，并且神经平面以下大部分关键肌的肌力小于3级。
D—不完全性损害：在神经平面以下存在运动功能，并且神经平面以下大部分关键肌的肌力大于或等于3级。
E—正常：感觉和运动功能正常。
从而，在此提供的SCI治疗方法的一个具体实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致根据ASIA病损分级(AIS)的损伤降低级别的量。在一些实施方式中，该降低为1、2、3、4或5级的损伤级别降低，其中一级对应一个单独的分类改善，例如，从损伤类别D降低到类别E。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据AIS足以使个体从ASIA A变为ASIA B、ASIA C、ASIA D或ASIA E的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据AIS足以使个体从ASIA B变为ASIA C、ASIA D或ASIA E的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据AIS足以使个体从ASIAC变为ASIA D或ASIA E的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据AIS足以使个体从ASIA D变为ASIA E的量。
在一些实施方式中，根据测量患者肌力对所述SCI一种或多种症状的改善或发展减轻进行检测。在一些实施方式中，肌力可以使用以下医学研究委员会(MRC)的0-5个级别进行分级：
5–正常力量
4+-对抗阻力的次最大运动
4-对抗阻力的中度运动
4–-对抗阻力的轻度运动
3–对抗重力但不对抗阻力的运动
2–消除重力下的运动
1–颤动运动
0–无运动
对SCI患者的以下关键肌进行测试并标明对应的损伤水平：
C5-肘屈肌（二头肌，肱肌）
C6-腕伸肌（桡侧伸腕长肌和短肌）
C7-肘伸肌（三头肌）
C8-中指手指屈肌（指深屈肌）
T1-小手指外展肌（小指展肌）
L2-髋部屈肌（髂腰肌）
L3-膝伸肌（四头肌）
L4-踝背屈肌（胫骨前肌）
L5-趾长伸肌（拇长伸肌）
S1-踝跖屈肌（腓肠肌，比目鱼肌）
从而，在此提供的SCI治疗方法的一个具体实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据MRC分级足以导致对肌肉力量提升1、2、3、4或5分的量。例如，在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由SCI导致的无运动的肌肉具有颤动运动、消除重力下的运动、对抗重力但不对抗阻力的运动、对抗阻力的轻度运动、对抗阻力的中度运动、对抗阻力的次最大运动、或正常力量的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由SCI导致的只有颤动运动的肌肉具有消除重力下的运动、对抗重力但不对抗阻力的运动、对抗阻力的轻度运动、对抗阻力的中度运动、对抗阻力的次最大运动、或正常力量的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由SCI导致的只有消除重力下的运动的肌肉具有对抗重力但不对抗阻力的运动、对抗阻力的轻度运动、对抗阻力的中度运动、对抗阻力的次最大运动、或正常力量的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由SCI导致的只有对抗重力但不对抗阻力的运动的肌肉具有对抗阻力的轻度运动、对抗阻力的中度运动、对抗阻力的次最大运动、或正常力量的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由SCI导致的只有对抗阻力的轻度运动的肌肉具有对抗阻力的中度运动、对抗阻力的次最大运动、或正常力量的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由SCI导致的只有对抗阻力的中度运动的肌肉具有对抗阻力的次最大运动或正常力量的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由SCI导致的只有对抗阻力的次最大运动的肌肉具有或正常力量的量。
在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的二头肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的肱肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的桡侧伸腕长肌或短肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的三头肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的指深屈肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的小指展肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的髂腰肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的四头肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的胫骨前肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的拇长伸肌力量提升1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对主体的腓肠肌或比目鱼肌力量提升1、2、3、4或5分的量。
在一些实施方式中，根据感官检查对所述SCI一种或多种症状的改善或发展减轻进行检测。感官检查可以在以下水平进行：
C2-枕骨隆突
C3-锁骨上窝
C4-肩锁关节顶部
C5-肘窝侧部
C6-拇指
C7-中指
C8-小指
T1-肘窝内侧
T2-腋窝顶点
T3-第三肋间（IS）
T4-乳头线第四IS
T5-第五IS（T4和T6中间）
T6-在剑突水平的第六IS
T7-第七IS（T6和T8中间）
T8-第八IS（T6和T10中间）
T9-第九IS（中间T8和T10）
T10–第10IS或脐
T11-第11IS（T10和T12中间）
T12-腹股沟韧带中点
L1–T12和L2之间一半的距离
L2-股前中部
L3-股骨内侧髁
L4-内踝
L5-足背第三跖趾关节
S1-脚后跟外侧
S2-中线腘窝
S3-坐骨结节
S4-5-肛周区域（作为1级）
感觉评分使用轻触和针刺，如下：
0–无感觉
1-受伤或感觉过敏
2–完整
如果患者无法区分针尖和钝端的区别，则给出零分。从而，在此提供的治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对应于一种或多种的C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4、L5、S1、S2、S3、S4和S5的感觉评分增加1分或2分的量。
在一些实施方式中，根据监控患者日常生活功能对所述SCI一种或多种症状的改善或发展减轻进行检测。在此提供的SCI治疗方法的一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以影响患者日常生活活动力的功能改善的量。在一些实施方式中，使用功能独立性评定(FIM)评价患者的功能改善。FIM专注于六个领域的功能：自我照顾、括约肌控制、移动性、行走、交流和社会认知。在每个领域内衡量两种或更多具体的活动/项目，共18个项目。例如，自我照顾领域包含六个活动项目（进食、梳洗、沐浴、穿上衣、穿下衣和如厕）按照功能的独立性对18项目各自评分，使用7分的等级：
独立（不需他人帮助）
7=完全独立：活动通常能完全地完成，不需修改、辅助设备或用品，并在合理的时间内完成
6=有条件的独立：活动需要辅助设备和/或比正常长的时间和/或没有安全地进行
依赖（需要他人监护或肢体协助）
5=监护或布置(setup)：不需要肢体协助，但是需要提示、劝告或布置。
4=最少接触的帮助：患者所需的帮助只限于接触，自己能付出75%或以上活动需要的努力。
3=中度帮助：患者所需的帮助只限于接触，自己能付出50±75%活动需要的努力。
2=最大帮助：患者付出25±50%活动需要的努力。
1=完全帮助：患者付出0±25%活动需要的努力。
从而，根据FIM的总分（全部项目之和）能够估计出残疾安全问题的成本以及依赖他人和技术设备的成本。领域分值和项目分值分布能精确指明受到SCI影响而导致的最大的日常生活的具体问题。在此提供的SCI治疗方法的一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据FIM分级足以导致患者功能提高1、2、3、4、5或6分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由于SCI的原因需要完全帮助的主体只需要中度帮助、只需要最少接触的帮助、只需要监护或布置，或能够有条件的独立或完全独立的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由于SCI的原因需要中度帮助的主体只需要最少接触的帮助、只需要监护或布置，或能够有条件的独立或完全独立的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由于SCI的原因需要最少接触的帮助的主体只需要监护或布置，或能够有条件的独立或完全独立的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由于SCI的原因需要监护或布置的主体能够有条件的独立或完全独立的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以使得由于SCI的原因只能有条件独立的主体能够完全独立的量。
患有或正在经历SCI症状的个体可以采用多个胎盘干细胞以及可选的一种或多种治疗剂在损伤过程的任意时刻进行治疗。例如，个体可以在损伤之后立即治疗，或在损伤之后的1、2、3、4、5、6天内，或在损伤之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50天或更多天内，或在损伤之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年内进行治疗。个体可以在损伤的临床过程中治疗一次或多次。在治疗方法的一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在SCI一种或多种症状发展的21天内给予所述个体。在治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在SCI一种或多种症状发展的14天内给予所述个体。在治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在SCI一种或多种症状发展的7天内给予所述个体。在治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在SCI一种或多种症状发展的48小时内给予所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在SCI一种或多种症状发展的24小时内给予所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在SCI一种或多种症状发展的12小时内给予所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在SCI一种或多种症状发展的3小时内给予所述个体。
在本发明某些实施方式中，个体是动物，优选的哺乳动物，更加优选的非人灵长类。在某些实施方式中，个体是人患者。个体可以是男性或女性。在某些实施方式中，主体是非人动物，例如，举例而言，牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。
用于治疗SCI的胎盘干细胞可以是任意在此公开的胎盘干细胞(参见第5.5节)。在一个具体的实施方式中，胎盘干细胞表达CD200且不表达HLA-G；表达CD73、CD105和CD200；表达CD200和OCT-4；表达CD73和CD105且不表达HLA-G；表达CD73和CD105且当胎盘干细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘干细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；或表达OCT-4和(c)当胎盘干细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘干细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；或前述的任意组合。在一个具体的实施方式中，胎盘干细胞是CD10+、CD105+、CD200+、CD34–胎盘干细胞。在另一个具体的实施方式中，胎盘干细胞是CD117-。
在一个实施方式中，对个体给予约3亿剂量的胎盘干细胞。然而，剂量可以根据个体的物理特性（如重量）发生变化，其可能的剂量为100万-100亿每剂，优选的1000万-10亿每剂，或1亿-5亿胎盘干细胞每剂。在一些实施方式中，给药方式可以是任何医学上可接受的活细胞给药方式，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内(例如，在存在眼部病变的位置)、大脑内、脑室内(例如，在存在神经或脑部病变的位置)、囊内、骨内输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬脑膜外、或皮下给药。在具体的实施方式中，给药是通过快速浓注或直接输液至SCI位置，例如，通过腰椎穿刺。
在一个实施方式中，胎盘干细胞来自细胞库，例如，胎盘干细胞库。在一个实施方式中，一剂胎盘干细胞包含于一个血袋或类似的袋子，其适合快速浓注或导管给药。
胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基可以单剂量给药，也可以多剂量给药。如果胎盘干细胞多剂量给药，那么该剂量可以是为缓解一种或多种急性SCI症状而设计的治疗方案的一部分，或可以是为减轻SCI严重程度而设计的长期治疗方案的一部分。
在此提供的用于治疗SCI的方法进一步包括通过给予治疗有效量的胎盘干细胞并联用SCI疗程中的一种或多种疗法或处理治疗SCI。该一种或多种额外的疗法可以在胎盘干细胞的给药前、同时或之后。在一些实施方式中，该一种或多种额外的疗法包括应用治疗性脊椎牵引。治疗性脊椎牵引使用手动或机械产生的力来拉伸和运动脊椎，其基于沿着脊柱纵向轴施加作用力（通常为重力）来进行。如果颈部或颈段骨折，牵引可以拉直脊柱并使其减压。
在其它实施方式中，该一种或多种额外的疗法包括手术固定脊柱，例如，通过插入棒和螺钉来适当地对齐脊柱或连接临近椎骨以强化椎骨、促进骨再生并减少未来进一步的SCI发生的可能性。在其它实施方式中，该一种或多种额外的疗法包括修复术(例如，重复随意运动训练，力量训练等等)，其能够促进新的局部CNS连接的形成。在其它实施方式中，该一种或多种额外的疗法包括对特定神经或肌肉进行功能电刺激(FES)，例如，对膈神经FES以帮助呼吸；对骶骨根FES以促进膀胱和肠功能；对四肢肌肉FES以改善臂或手部功能以及站立或行走。
在此还提供了用于治疗患有或正在经历SCI症状的个体的方法，包括对个体给予多个胎盘干细胞，其足以导致所述SCI的一种或多种症状、病症或综合症产生可检测的改善，或减轻其一种或多种症状、病症或综合症的发展；以及一种或多种治疗剂。在一个实施方式中，治疗剂为皮质类固醇。在其它实施方式中，治疗剂为抗凝剂，例如肝素。在其它实施方式中，治疗剂为神经保护剂。在一些实施方式中神经保护剂是甲泼尼龙琥珀酸钠(MPSS)、GM-1(Sygen)、加环利定(GK-11)、促甲状腺激素释放激素、单四环素(米诺环素)、锂或红细胞生成素(EPO)。
在其它实施方式中，治疗剂是肌苷、咯利普兰、ATI-355(NOGO)、软骨素酶、氨吡啶(4-氨基吡啶)、加巴喷丁、或Rho拮抗剂(例如，
Figure GDA0000408263340000171
)。在另一个实施方式中，治疗剂是免疫调节或免疫抑制试剂，例如，环孢菌素A、FTY506(他克莫司)或FTY720。在其它实施方式中，治疗剂是与胎盘干细胞共同给药的第二细胞群。在一些实施方式中，第二细胞群是自体巨噬细胞、骨髓基质细胞、鼻嗅鞘细胞、胚胎嗅皮质细胞、或许旺细胞的群体。
5.1.2外伤性脑损伤(TBI)的治疗
在此还提供了治疗患有或正在经历TBI症状的个体的方法，包括对个体给予治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基，其中治疗有效量是足以对所述TBI的一种或多种症状产生可检测的改善或足以减轻其发展的量。在此使用的“一种或多种症状”包括客观检测参数，例如炎症程度、免疫应答、与治疗过程有关的损伤部位内部的基因表达、损伤部位瘢痕的质量和程度、患者运动和感觉功能改进等，以及主观检测参数，例如患者的健康、患者对运动、感觉和认知功能的改进、TBI相关的疼痛或不适减轻的感觉，等等。
TBI是一种由外部机械力作用于头盖骨和颅内容物的非退化性、非先天性脑损伤，可能导致暂时或永久性的认知、身体和心理社会功能损伤以及相关的意识减少或变态。TBI可能临床表现为从脑震荡到昏迷以及死亡。
在TBI治疗方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对初级TBI（即，外伤瞬间发生的TBI）的一种或多种症状产生可检测的改善的量。在一些实施方式中，初级TBI是局部损伤，例如，头盖骨骨折、撕裂伤、挫伤或贯通伤。在一些实施方式中，初级TBI是弥漫性的，例如，弥漫性轴索损伤。
在TBI治疗方法的一些实施方式中，胎盘干细胞的治疗有效量是足以导致对由初级TBI造成的次级损伤（其在外伤之后立即发生，并产生可能持续一段时间的影响）的一种或多种症状产生可检测的改善的量。TBI的次级类型可归因于来自初级损伤效果的进一步细胞伤害。在大脑的初次外伤后，次级损伤可能发展几小时或几天。
在此提供的用于TBI治疗的方法还包括对大脑特定区域TBI损伤的治疗。在一些实施方式中，在此提供的TBI治疗方法可用于治疗对大脑额叶(位于前额)、顶叶(靠近脑后顶部)、枕叶(位于最后、在头的背部)、颞叶(位于脑侧耳上部位)、脑干(位于脑内深处)和小脑(位于颅底)的损伤。
在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对大脑额叶损伤的一种或多种症状产生改善的量，包括但不限于，身体各部位简单运动的损失（麻痹）、无法计划完成多步骤任务所需的一系列复杂动作（如煮咖啡（定序））、与他人互动中的自发性损失、思想失去弹性、坚持一个单一的想法（持续言语）、无法专注于任务（注意力）、情绪变化（情绪不稳定）、社会行为变化、人格变化、难以解决问题、或不能表达语言（布洛卡失语症）。
在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对顶叶损伤的一种或多种症状产生改善的量，包括但不限于，一次无法专注于多个对象、无法命名对象（命名障碍）、无法确定用于写作的词语（失写症）、阅读问题（失读症）、难以描绘对象、难以区分左右、难以进行数学计算（计算障碍）、导致自我照顾困难的缺乏对某些身体部位和/或周围空间的认识（失用症）、视觉注意力无法集中、或眼睛和手协调困难。
在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对枕叶损伤的一种或多种症状产生改善的量，包括但不限于，视力缺陷（视野削减）、环境中定位对象困难、难以识别颜色（颜色失认）、产生幻觉、视觉错误（不准确地看到物体）、词盲（无法识别单词）、难以认识描绘的对象、无法识别对象的运动（运动失认症）、或读写困难。
在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对颞叶损伤的一种或多种症状产生改善的量，包括但不限于，难以认识面孔（面容失认症）、难以理解所说的话（韦尼克失语症）、主体看到和听到内容的选择性注意干扰、鉴定和语言表达对象困难、短期记忆丧失、长期记忆干扰、对性行为的兴趣增加和减少、无力分类对象（分类）、持久性说话（右叶损伤指标）、或增加的攻击行为。
在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对脑干损伤的一种或多种症状产生改善的量，包括但不限于，呼吸肺活量下降（对讲话重要）、吞咽食物和水困难（吞咽困难）、难以组织/感知环境、平衡和运动问题、头晕和恶心（眩晕）、或睡眠困难（失眠、睡眠呼吸暂停）。
在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致对颅底损伤的一种或多种症状产生改善的量，包括但不限于，丧失协调精细动作的能力、丧失行走能力、无法伸手和抓住对象、震颤、头晕（眩晕）、口齿不清（断续言语）、或无法做出快速运动。
在此提供的用于TBI治疗的方法还包括对轻度至重度TBI损伤的治疗。如果意识丧失和/或混乱和定向障碍短于30分钟，则TBI可以归类为轻度。从而，在一些实施方式中，本发明提供了对患有TBI的个体给药有效剂量的胎盘干细胞(例如，PDACS)，其中所述有效剂量是例如足以使得轻度TBI的一种或多种症状产生可检测的改善、或降低其严重程度或减轻其发展的胎盘细胞的量，包括但不限于，认知问题例如头痛、记忆力问题、注意力缺陷、情绪波动和挫折、疲劳、视力障碍、记忆力减退、注意力/专注度不佳、睡眠障碍、头晕/失去平衡、烦躁不安、情绪障碍、感觉抑郁、抽搐、恶心、嗅觉和对声光的敏感度损失、情绪变化、迷失或糊涂、或思维缓慢。
在具体的实施方式中，有效剂量是足以使得脑震荡的一种或多种症状产生可检测的改善、或降低其严重程度或减轻其发展的胎盘细胞的量，包括但不限于，混乱或感觉茫然、动作笨拙、言语不清、恶心或呕吐、头痛、平衡问题或头晕、视力模糊、光敏感、噪音敏感、呆滞、耳鸣、行为或性格改变、精力难以集中、记忆丧失。在一些实施方式中，脑震荡是1级(轻度)脑震荡，其特征为意识不丧失和脑震荡症状持续少于几分钟。在一些实施方式中，脑震荡是2级(中度)脑震荡，其特征为意识不丧失和脑震荡症状持续长于15分钟。在一些实施方式中，脑震荡是3级(重度)脑震荡，其特征为至少几秒的意识丧失。
在一些实施方式中，本发明提供了对患有TBI的个体给予有效剂量的胎盘干细胞(例如，PDAC)，其中所述有效剂量是足以对所述中度至重度TBI的一种或多种症状产生可检测的改善、或降低其严重程度或足以减轻其发展的量，包括但不限于，认知缺陷，例如，注意力、专注力、注意力不集中、记忆、加工速度、持续言语、冲动、语言处理、讲话和语言、不理解口语单词（接受性失语）、说话和被理解困难（表现性失语）、口齿不清、说话非常快或非常慢、阅读问题、书写问题等方面的困难；感觉缺陷，例如触碰、温度、移动、四肢位置或细微区别的解释困难；知觉缺陷，例如难以将感觉印象整合或模式化为心理学有意义的数据；视觉缺陷，包括部分或完全丧失视觉、眼部肌肉衰弱和双视（复视）、视力模糊、判断距离困难、眼球不自主运动（眼球震颤）、不耐光（畏光）；听力缺陷，包括听力下降或损失、耳鸣、对声音敏感性增加；嗅觉障碍，包括嗅觉损失或减退（嗅觉缺失症）；味觉损失或减退；癫痫，包括癫痫相关的抽搐，该癫痫可以为几种类型，且可以涉及对意识、感觉知觉或运动的破坏；身体变化，包括身体瘫痪/痉挛；慢性疼痛、肠和/或膀胱失去控制、睡眠障碍、耐久力损失、食欲改变、体温失调、月经困难；社会情感困难，包括依赖行为、情感能力丧失、缺乏动力、烦躁不安、易怒、抑郁、去抑制、或否认/缺乏认识。
在一个实施方式中，本发明提供了对患有TBI的个体给予有效剂量的胎盘干细胞(例如，PDAC)，其中所述有效剂量是足以对上述TBI的一种或多种症状产生可检测的改善、或降低其严重程度或足以减轻其发展的量。在某些实施方式中，用于检测对TBI的一种或多种症状、病症或综合症是否产生改善、减轻严重程度或减轻其发展的特定技术对于在此提供的TBI治疗方法而言并不重要。在某些实施方式中，根据本领域从业者的判断对针对TBI一种或多种症状、病症或综合症发展的改善和减缓做出评价。在某些实施方式中，根据本领域从业者的判断以及主体的主观经验对针对TBI一种或多种症状、病症或综合症发展的改善和减缓做出评价。
在一些实施方式中，对TBI一种或多种症状、病症或综合症的改善和其发展的减缓是根据格拉斯哥昏迷评分(GCS)进行测定的。GCS定义了损伤48小时内TBI的严重程度，如下：
睁眼反应
自然睁眼=4
呼唤会睁眼=3
有刺激或痛楚会睁眼=2
无应答=1
运动应答
依指令动作=6
施以刺激时，可定位出疼痛位置=5
对疼痛刺激有反应，肢体会回缩=4
对疼痛刺激有反应，肢体弯曲呈“去皮质强直”姿势=3
对疼痛刺激有反应，肢体伸直呈“去脑强直”姿势=2
无应答=1
语言应答
能确定人物、地点和日期=5
能交流但无判断力=4
说话不适当=3
发出不可理解的声音=2
无应答=1
TBI严重程度根据GCS分值(48h内)如下：
植物人TBI=少于3(其特征为睡眠觉醒周期；觉醒但与环境无交互；对疼痛无局部应答)
重度TBI=3-8(其特征为昏迷：无意识状态；无意义应答，无自发性活动)
中度TBI=9-12(其特征为意识丧失多于30分钟；可能或不能解决的身体或认知障碍；患者可以从康复训练受益)
轻度TBI=13-15(其特征为精神状态的短暂变化（混乱、迷失方向或丧失记忆）或意识丧失少于30分钟)
从而，在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是足以导致患者的GCS分值提高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更高分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据GCS足以导致睁眼反应的分值提高1、2或3分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据GCS足以导致运动应答的分值提高1、2、3、4或5分的量。在一些实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据GCS足以导致语言应答的分值提高1、2、3或4分的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将外伤性损伤的严重程度从植物人TBI水平降低到重度、中度或轻度TBI水平的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将外伤性损伤的严重程度从重度TBI水平降低到中度或轻度TBI水平的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将外伤性损伤的严重程度从中度TBI水平降低到轻度TBI水平的量。
在一些实施方式中，对TBI一种或多种症状的改善和其发展的减缓是根据Ranchos Los Amigos评分进行测定的。该Ranchos Los Amigos评分根据以下分级测量了意识、认识、行为和与环境互动的水平：
水平I：无应答
水平II：一般应答
水平III：局部应答
水平IV：混乱-躁动
水平V：混乱-不适当
水平VI：混乱-适当
水平VII：自动-适当
水平VIII：有目的-适当
从而，在此提供的TBI治疗方法的一个具体的实施方式中，胎盘干细胞(例如，PDAC)的治疗有效量是根据Rancho Los Amigos评分足以导致患者的评分增加1、2、3、4、5、6或7分的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将主体的意识、认识、行为和与环境互动的水平从无应答提高至一般应答、局部应答、混乱躁动、混乱不适当应答、混乱适当应答、自动适当应答或有目的适当应答的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将主体的意识、认识、行为和与环境互动的水平从一般应答提高至局部应答、混乱躁动、混乱不适当应答、混乱适当应答、自动适当应答或有目的适当应答的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将主体的意识、认识、行为和与环境互动的水平从局部应答提高至混乱躁动、混乱不适当应答、混乱适当应答、自动适当应答或有目的适当应答的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将主体的意识、认识、行为和与环境互动的水平从混乱躁动提高至混乱不适当应答、混乱适当应答、自动适当应答或有目的适当应答的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将主体的意识、认识、行为和与环境互动的水平从混乱不适当应答提高至混乱适当应答、自动适当应答或有目的适当应答的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将主体的意识、认识、行为和与环境互动的水平从混乱适当应答提高至自动适当应答或有目的适当应答的量。在一些实施方式中，治疗有效量的胎盘干细胞(例如，PDAC)是足以将主体的意识、认识、行为和与环境互动的水平从自动适当应答提高至有目的适当应答的量。
患有或正在经历TBI症状的个体可以在损伤过程的任意时刻采用多个胎盘干细胞以及可选的一种或多种治疗剂进行治疗。例如，个体可以在损伤之后立即治疗，或在损伤之后的1、2、3、4、5、6天内，或在损伤之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30，35、40、45、50天或更多天内进行治疗。个体可以在损伤的临床过程中治疗一次或多次。在治疗方法的一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在TBI的一种或多种症状发展的21天内给予所述个体。在治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在TBI的一种或多种症状发展的14天内给予所述个体。在治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在TBI的一种或多种症状发展的7天内给予所述个体。在治疗方法的另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在TBI的一种或多种症状发展的48小时内给予所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在TBI的一种或多种症状发展的24小时内给予所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在TBI的一种或多种症状发展的12小时内给予所述个体。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞在TBI的一种或多种症状发展的3小时内给予所述个体。
在本发明某些实施方式中，个体是动物，优选的哺乳动物，更加优选的非人灵长类。在某些实施方式中，个体是人患者。个体可以是男性或女性。在某些实施方式中，主体是非人动物，例如，举例而言，牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。
可用于治疗TBI的胎盘干细胞可以是在此公开的任意胎盘干细胞(参见第5.5节)。在一个具体的实施方式中，胎盘干细胞表达CD200且不表达HLA-G；表达CD73、CD105和CD200；表达CD200和OCT-4；表达CD73和CD105且不表达HLA-G；表达CD73和CD105且当胎盘干细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘干细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；或表达OCT-4和(c)当胎盘干细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘干细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；或前述的任意组合。在一个具体的实施方式中，胎盘干细胞是CD10+、CD105+、CD200+、CD34-胎盘干细胞。在另一个具体的实施方式中，胎盘干细胞是CD117–。
在一个实施方式中，对个体给予约2-8亿剂量的胎盘干细胞。然而，剂量可以根据个体的物理特性（如重量）发生变化，其可能的剂量为100万-100亿每剂，优选的1000万-10亿每剂，或1亿-5亿胎盘干细胞每剂。优选通过静脉内给药，但是给药方式可以是任何医学上可接受的活细胞给药方式，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内(例如，在存在眼部病变的位置)、大脑内、脑室内(例如，在存在神经或脑部病变的位置)、囊内、骨内输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬脑膜外、或皮下给药。在具体的实施方式中，给药是通过快速浓注或直接输液至TBI位置，例如，通过小脑延髓池。
胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基可以单剂量给药，也可以多剂量给药。如果胎盘干细胞多剂量给药，那么该剂量可以是为缓解一种或多种急性TBI症状而设计的治疗方案的一部分，或可以是为减轻TBI严重程度而设计的长期治疗方案的一部分。
在此提供的用于治疗SCI的方法进一步包括通过给予治疗有效量的胎盘干细胞并联用TBI疗程中的一种或多种疗法或处理治疗TBI。该一种或多种额外的疗法可以在胎盘干细胞的给药前、同时或之后。在一些实施方式中，该一种或多种额外的疗法包括外科手术。在一些实施方式中，可以在颅内植入螺钉或ICP(颅内压)监控设备来监控大脑空腔内的压力。在一些实施方式中，如果头骨空腔存在出血，其可以手术移除或排出，且可以在胎盘干细胞的给药前、同时或之后进行血管或组织的手术修补。在重症情况下，如果存在严重肿胀和损伤的脑组织，那么可以在胎盘干细胞的给药前、同时或之后对其一部分手术去除，来为活的脑组织提供空间。在一些实施方式中，该一种或多种额外的疗法包括应用机械通风，其支持呼吸并帮助头部稳定降压。
在此还提供了用于治疗患有或正在经历TBI症状的个体的方法，包括对个体给予足以导致所述TBI一种或多种症状可检测的改善、或足以减轻其发展多个胎盘干细胞，和一种或多种治疗剂。例如，胎盘干细胞可以与药物联合使用，以使患者镇静并使其进入药物引起的昏迷，从而使扰动和二次损伤最小化。在一些实施方式中，如果个体患有癫痫，可以在治疗早期和之后使用防癫痫药。在一些实施方式中，在患者恢复功能时可以使用控制痉挛的药物。另外，可以使用药物改善注意力和集中度(例如，金刚烷胺和哌醋甲酯、溴隐亭和抗抑郁药)，或控制攻击行为(例如，卡马西平和阿米替林)。
5.2胎盘干细胞在抑制由CNS损伤导致的或与之有关的炎性应答中的用途
在另一方面，在此提供了治疗患有CNS损伤的个体的方法，包括抑制由CNS损伤导致的或与之有关的炎性应答。在此提供了通过将免疫细胞与多个胎盘干细胞进行接触来调控（例如抑制）免疫细胞活性（例如增殖）的方法。
胎盘干细胞介导的免疫调节（例如，免疫抑制）能够，例如，有利于CNS损伤，其中炎症在CNS损伤早期和慢性期之一或之二中起作用。因此，在各实施方式中，在此提供了一种抑制由CNS损伤（例如，SCI或TBI）导致的或与之有关的免疫应答的方法。
在一个实施方式中，在此提供了一种抑制由CNS损伤（例如，SCI或TBI）导致的或与之有关的免疫应答的方法，包括用多个胎盘干细胞接触多个免疫细胞，接触时间足以使所述胎盘干细胞可检测地抑制免疫应答，其中所述胎盘干细胞在MLR分析或回归分析中可检测地抑制T细胞增殖。
胎盘干细胞是，例如，在此其它位置描述的胎盘干细胞(参见第5.5节)。用于免疫抑制的胎盘干细胞可来自于或获得自单一胎盘或多个胎盘。用于免疫抑制的胎盘干细胞还可来自单一物种，例如接受者的物种或其功能被减弱或抑制的免疫细胞的物种，或者可来自多个物种。
在本方法的上下文中，“免疫细胞”指免疫系统的任何细胞，特别是T细胞和自然杀伤(NK)细胞。从而，在本方法各实施方式中，胎盘干细胞接触多个免疫细胞，其中多个免疫细胞为，或含有，多个T细胞(例如，多个CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)和/或自然杀伤细胞。在本方法的上下文中，“免疫应答”可以是免疫细胞对通常由免疫细胞感知的刺激的任意应答，例如，对抗原存在的应答。在各实施方式中，免疫应答可以是T细胞(例如，CD3+T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)响应CNS损伤（如SCI或TBI）的增殖。免疫应答也可是自然杀伤(NK)细胞的任意活性，或树突细胞的成熟化等等。免疫应答也可是一类或多类免疫细胞活性的局部、组织或器官特异性的，或系统性的效果，例如，免疫应答可以是炎症和炎症相关伤疤组织的形成等等。
在上下文中的“接触”包括在一个容器中(例如，培养皿，烧瓶，小瓶等)或体内（例如，在同一个体中(例如，哺乳动物，例如，人)）一起加入胎盘干细胞和免疫细胞。在一个优选的实施方式中，接触足够的时间和足够剂量的胎盘干细胞和免疫细胞，使得能够检测到免疫细胞的免疫功能发生变化。更加优选的，在各实施方式中，所述接触与不存在胎盘干细胞的免疫功能相比足以抑制至少50%、60%、70%、80%、90%或95%的免疫功能(例如，在抗原应答中的T细胞增殖)。在体内环境中该抑制可以在体外分析中进行检测(参见下文)；即，在体外分析中的抑制程度可以被外推至在个体中的抑制程度，用于受试者体内特定数量的胎盘干细胞和一些免疫细胞。
在某些实施方式中，在此提供了使用胎盘干细胞调控免疫应答或多个一种或多种类型的免疫细胞活性的体外方法。胎盘干细胞与多个免疫细胞的接触可以包括在同一物理空间内组合胎盘干细胞和免疫细胞，从而至少一部分的多个胎盘干细胞与至少一部分多个免疫细胞相互作用；将胎盘干细胞和免疫细胞维持在使用共同培养基的分离的物理空间；或可以包括用来自一个或一种胎盘干细胞或免疫细胞培养物的培养基接触另一种细胞（例如，从胎盘干细胞培养中获得培养基并将分离的免疫细胞重悬于该培养基）。在一个具体的实施例中，该接触在MLR分析中进行。在另一个具体的实施例中，该接触在回归分析中进行。在另一个具体的实施例中，该接触在小珠T淋巴细胞反应(BTR)分析中进行。
接触可以在检测特定的多个胎盘干细胞在何种程度上是免疫调节的，例如，免疫抑制的实验中进行。这一实验可以是例如，MLR或回归分析。MLR和回归分析的流程是本领域熟知的。参见，例如，Schwarz,“The MixedLymphocyte Reaction:An In Vitro Test for Tolerance,”J.Exp.Med.127(5):879-890(1968);Lacerda等人,“Human Epstein-Barr Virus(EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and InduceSelective Regressions of Autologous EBV induced B Lymphoproliferations inXenografted C.B-17Scid/Scid Mice,”J.Exp.Med.183:1215-1228(1996)。在一个优选的实施方式中，MLR中多个胎盘干细胞接触多个免疫细胞(例如，淋巴细胞，例如，CD3+、CD4+和/或CD8+T淋巴细胞)。
MLR可用于检测多个胎盘干细胞的免疫抑制能力。例如，可以在MLR中检测多个胎盘干细胞，包括组合的CD4+或CD8+T细胞、树突细胞(DC)和胎盘干细胞，其比例为约10:1:2，其中T细胞用例如分入子细胞的CFSE的染料染色，且其中允许T细胞增殖约6天。如果与存在DC但不存在胎盘干细胞时的T细胞增殖相比，在胎盘干细胞存在下6天的T细胞增殖被可检测的减少，那么该多个胎盘干细胞是免疫抑制的。在这样一个MLR中，胎盘干细胞是解冻的或来自培养。将约20,000胎盘干细胞重悬于100μl的培养基中(RPMI1640，1mM HEPES缓冲液，抗生素和5%混合人血清)并使其接触孔底2小时。CD4+和/或CD8+T细胞分离自完整外周血单核细胞Miltenyi磁珠。细胞用CFSE染色，每孔加入总量为100,000的T细胞(单独的CD4+T细胞、单独的CD8+T细胞、或等量的CD4+和CD8+T细胞)。孔中的体积达到200μl，进行MLR。
因此，在一个实施方式中，在此提供了一种抑制免疫应答的方法，包括用多个免疫细胞接触多个胎盘干细胞，接触时间足以使得在MLR分析或回归分析中所述胎盘干细胞可检测地抑制T细胞增殖。在一个实施方式中，MLR中使用的所述胎盘干细胞代表来自更大的胎盘干细胞群的一个胎盘干细胞样品或等分部分。
来自不同胎盘或同一胎盘不同组织的胎盘干细胞群可能在其调控免疫细胞活性方面各不相同，例如可能具有不同的抑制T细胞活性或增殖或NK细胞活性的能力。因此需要在使用前测定特定的胎盘干细胞群的免疫抑制能力。该能力可通过例如在MLR或回归分析中测定胎盘干细胞群的一个样品来测定。在一个实施方式中，对样品进行MLR并在分析中测定由于胎盘干细胞导致的免疫抑制程度。然后可以将该免疫抑制程度归功于取样的胎盘干细胞群。从而，MLR可被用作一种测定特定胎盘干细胞群抑制免疫功能的绝对和相对能力的方法。MLR的参数可以改变以提供更多的数据或最好地测定胎盘干细胞样品免疫抑制的能力。例如，由于胎盘干细胞的免疫抑制大致与分析中存在的胎盘干细胞数量同比增加，因此，在一个实施方式中，MLR可以使用两倍或更多数量的胎盘干细胞，例如，每个反应使用1x103、3x103、1x104和/或3x104的胎盘干细胞。胎盘干细胞相对于T细胞的数量也可以在分析中改变。例如，在分析中胎盘干细胞和T细胞可以任意比例存在，例如约10:1至约1:10、优选的约1:5，当然也可以使用相对更大的胎盘干细胞或T细胞数量。
回归分析或BTR分析可以按照类似方式使用。
在此提供了使用胎盘干细胞调控免疫应答或多个一种或多种类型的免疫细胞体内活性的方法，例如，由CNS损伤（例如，SCI或TBI）导致的或与之有关的。胎盘干细胞和免疫细胞可以在例如作为多个胎盘干细胞接受者的个体中接触。如果在个体中进行接触，在一个实施方式中，接触是在外源性胎盘干细胞(即，不来自个体的胎盘干细胞)和多个个体内源性的免疫细胞之间进行。在具体的实施方式中，在个体中的免疫细胞是CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或NK细胞。
胎盘干细胞可以按照已知或期望的免疫细胞（例如T细胞）数量的比例被给药至个体，比例为约10:1至约1:10、优选的约1:5。然而，多个胎盘干细胞可被给予个体，其比例为，以非限制性的实施例，约10,000:1、约1,000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100，约1:1,000或约1:10,000。一般，约1x105至约1x108胎盘干细胞每受试者公斤，优选的约1x106至约1x107胎盘干细胞每受试者公斤可被给药来影响免疫抑制。在各实施方式中，多个胎盘干细胞被给予个体或主体，包括至少、约、或不多于1x105、3x105、1x106、3x106、1x107、3x107、1x108、3x108、1x109、3x109胎盘干细胞，或更多。
胎盘干细胞也可与一种或多种第二类型的干细胞一起给药，例如来自骨髓的间质干细胞。该第二干细胞可与胎盘干细胞一起被给予个体，其比例为，例如，约1:10至约10:1。
为了利于使得体内的胎盘干细胞和免疫细胞接触或接近，胎盘干细胞可通过足以将胎盘干细胞和免疫细胞彼此接触的任意途径被给药至个体。例如，胎盘干细胞可通过下述方式被给药至个体，例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、眼内、胃肠外、囊内，或直接进入器官，例如，胰脏。为了体内给药，胎盘干细胞可制剂为药物组合物，如以下第5.9.1.2节所述。
免疫抑制的方法可以额外包括一种或多种免疫抑制试剂的加入，特别是在体内环境中。在一个实施方式中，在个体体内多个胎盘干细胞接触多个免疫细胞，并对个体给予含有免疫抑制试剂的组合物。免疫抑制试剂是本领域熟知的，包括例如，抗T细胞受体抗体(单克隆或多克隆，或抗体片段或其衍生物)，抗IL-2受体抗体(例如，巴利昔单抗
Figure GDA0000408263340000281
或达珠单抗，抗T细胞受体抗体(例如，Muromonab-CD3)、硫唑嘌呤、皮质类固醇、环孢菌素、他克莫司、麦考酚酯吗乙、西罗莫司、钙神经素抑制剂等等。在一个具体的实施方式中，免疫抑制剂是巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α或MIP-1β中和抗体。优选的，抗MIP-1α或MIP-1β抗体以足以导致所述个体MIP-1α和/或MIP-1β可检测的减少的量被给药。
胎盘干细胞除了抑制T细胞增殖外，还对免疫系统细胞具有其他抗炎性效果，其可能有利于治疗CNS损伤，例如SCI或TBI。例如，当胎盘干细胞在例如体外或体内给予个体时，能降低由Th1和/或Th17T细胞亚群介导的免疫应答。在另一方面，在此提供了一种抑制促炎性应答的方法，例如，Th1应答或Th17应答，无论其是体内或体外，其包括用胎盘干细胞（例如，在此描述的胎盘干细胞）接触T细胞(例如，CD4+T淋巴细胞或白细胞)。在一个具体的实施方式中，所述接触可检测地降低Th1细胞成熟。在本方法的一个具体的实施方式中，所述接触可检测地降低所述T细胞或抗原生成细胞所产生的一种或多种的淋巴毒素-1α(LT-1α)、白介素1β(IL-1β)、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、肿瘤坏死因子-α(TNFα)和/或干扰素γ(IFNγ)。在本方法的另一个具体的实施方式中，所述接触加强或上调调节性T细胞(Treg)表型，和/或减少树突细胞(DC)和/或巨噬细胞中促进Th1和/或Th17应答的大分子表达(例如，CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)。在一个具体的实施方式中，所述T细胞还接触IL-10，例如，不由所述T细胞产生的外源性IL-10或IL-10，例如，重组IL-10。在另一个实施方式中，在此提供了一种减少产生来自巨噬细胞的促炎性细胞因子的方法，包括用有效量的胎盘干细胞接触巨噬细胞。在另一个实施方式中，在此提供了一种增加耐受原细胞数量、促进免疫细胞耐受原功能和/或上调（例如，来自巨噬细胞的）耐受原细胞因子的方法，包括用有效量的胎盘干细胞接触免疫系统细胞。在一个具体的实施方式中，较之未接触所述胎盘干细胞的活化巨噬细胞而言，所述接触导致活化巨噬细胞生产可检测的更多的IL-10。在另一个实施方式中，在此提供了一种上调或增加抗炎性T细胞数量的方法，包括用有效量的胎盘干细胞接触免疫系统细胞。
在一个实施方式中，在此提供了一种抑制患有或正在经历CNS损伤症状（例如，SCI或TBI）的个体中Th1应答的方法，包括对个体给予有效量的胎盘干细胞，其中所述有效量是导致在个体中的Th1应答产生可检测的降低的量。在另一个实施方式中，在此提供了一种抑制患有或正在经历CNS损伤症状（例如，SCI或TBI）的个体中Th17应答的方法，包括对个体给予有效量的胎盘干细胞，其中所述有效量是在个体中的Th17应答产生可检测的减少的量。在这些方法具体的实施方式中，所述给药可检测地降低所述个体中的T细胞或抗原呈递细胞生产一种或多种的IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα和/或IFNγ。在本方法的另一个具体的实施方式中，所述接触加强或上调调节性T细胞(Treg)表型，或调节所述个体的树突细胞(DC)和/或巨噬细胞中促进Th1或Th17应答的标志物的产生。在另一个具体的实施方式中，该方法另外包括对所述个体给药IL-10。
在另一方面，在此提供了如在此描述的被遗传改造为表达一种或多种抗炎性细胞因子的胎盘干细胞。在一个具体的实施方式中，所述抗炎性细胞因子包括IL-10。
5.3血管生成和治疗CNS损伤
在另一方面，在此提供了患有个体脑内或脑周围血流阻断(disruption)的个体的治疗方法，例如，患有由CNS损伤（例如，SCI或TBI）导致的个体大脑或CNS内部或周围的血流阻断引起的症状或神经性缺乏，其包括对所述个体给药治疗有效量的分离的胎盘干细胞(例如，PDAC)。在某些实施方式中，血流阻断导致个体大脑或CNS缺氧损伤或低氧损伤。在某些实施方式中，PDAC是血管生成的。在某些实施方式中，PDAC能够支持内皮细胞和内皮细胞群和上皮细胞和上皮细胞群在体内外的生长。
如本文所使用的，在提及在此描述的胎盘来源的贴壁细胞时，术语“血管生成的”表示细胞能够形成管或管样芽，或细胞能促进另一个细胞群（例如，内皮细胞）中的血管生成(例如，管或管样结构的形成)。
如本文所使用的，术语“血管生成”指血管形成的过程，包括但不限于内皮细胞活化、迁移、增殖、基质重塑和细胞稳定化。
在某些实施方式中，PDAC和该细胞群可被用于促进呈现外伤性组织损失的个体血管生成，或防止由CNS损伤例如SCI或TBI造成的伤疤形成。
在某些实施方式中，个体得益于以下治疗，例如得益于细胞支持其他细胞生长的能力，包括寡突细胞和神经元；得益于组织向内生长或组织血管生成；以及得益于有益细胞因素、趋化因子、细胞因子等的存在，但是细胞并不整合或在体内繁殖。在另一个实施方式中，患者得益于用细胞进行治疗处理，但是细胞并不在患者体内存活延长的时间。在一个实施方式中，细胞数量、活力或生化活性逐渐减少，在其它实施方式中，细胞减少前可以存在一个活性阶段，例如生长、分裂或生化活性。在其它实施方式中，衰老的、无法生存的或甚至死亡的细胞能够具有有益的治疗效果。
PDAC或含有该细胞的治疗组合物对有需求的个体的给药可以通过例如移植、植入(例如，细胞自身或作为基质细胞组合一部分的细胞)、注射（例如，直接注射至CNS损伤部位）、输液、经导管递送或任意本领域已知的提供细胞治疗的其它方式来实现。
为此，在此进一步提供了PDAC群，其接触一种或多种能刺激干细胞或祖细胞沿着生成血管的、形成血管的或血管源性的方向分化的因子，例如在其存在下培育或培养。所述因子包括但不限于因子，例如生长因子、趋化因子、细胞因子、细胞产物、脱甲基试剂和其它因子，其目前已知或之后被判断为能够刺激例如干细胞等沿着生成血管的、形成血管的或血管源性的方向或谱系分化。
在某些实施方式中，PDAC可以通过在包括至少一种的脱甲基试剂、BMP(骨形态生成蛋白)、FGF(成纤维细胞生长因子)、Wnt因子蛋白、Hedgehog蛋白、和/或抗Wnt因子的存在下培养，从而沿着生成血管的、形成血管的或血管源性的方向或谱系体外分化。
PDAC可以治疗组合物的形式对个体给药，其中含有细胞和另一治疗剂，例如，胰岛素样生长因子（IGF）、血小板来源的生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、白细胞介素18（IL-8）、抗血栓形成剂（例如肝素、肝素衍生物、尿激酶、或PPack（D-苯丙氨酰脯氨酰精氨酰氯甲酮）、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂、和/或血小板抑制剂）、抗凋亡剂（如促红细胞生成素（EPO）、促红细胞生成素衍生物或其类似物或它们的盐、血小板生成素（TPO）、IGF-I、IGF-II、肝细胞生长因子（HGF）、或胱天蛋白酶抑制剂）、抗炎剂（例如p38MAP激酶抑制剂、他汀药物、IL-6抑制剂、IL-1抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、英利昔单抗、西罗莫司和/或非类固醇抗炎化合物（例如乙酰水杨酸、布洛芬、替泊沙林、托美丁、或舒洛芬））、免疫抑制或免疫调节剂（例如钙神经素抑制剂，如环孢素、他克莫司、mTOR抑制剂如西罗莫司、依维莫司；抗增殖剂如硫唑嘌呤和/或霉酚酸酯、皮质类固醇，如强的松龙或氢化可的松；抗体，如抗-IL-2Rα受体的单克隆抗体、巴利昔单抗、赛尼哌、多克隆抗-T细胞抗体如抗胸腺细胞球蛋白（ATG）、抗淋巴细胞球蛋白（ALG）、和/或单克隆抗T细胞抗体OKT3，或美国专利第7,468,276号和美国专利申请公开第2007/0275362号中所描述的贴壁胎盘干细胞，其中每一个均全文引入作为参考）、和/或抗氧化剂（例如普罗布考、维生素A、C和/或E、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、或抗氧化剂衍生物、模拟物或任何前述的盐）。在某些实施例中，含有PDAC的治疗组合物进一步包括一种或多种其他类型的细胞，例如，成体细胞（例如，成纤维细胞或内胚层细胞）、干细胞和/或祖细胞。该治疗剂和/或一种或多种其他类型的细胞可被分别或组合给予有需要的个体，或给予两种或更多该化合物或试剂。
5.4第二治疗组合物和第二治疗
在上述任意治疗方法中，所述方法可以包括第二治疗组合物的给药或第二疗法。对上述治疗特定疾病的特定的第二治疗组合物或第二疗法的描述不是排他性的。例如，在此讨论的任何疾病、紊乱或病况均可以采用任意在此描述的抗炎性化合物或免疫抑制化合物进行治疗。在胎盘干细胞与第二治疗剂或第二类干细胞一起给药的实施方式中，胎盘干细胞和第二治疗剂和/或第二类干细胞可同时给药或不同时给药，例如，给药可以在彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、或50分钟内，或彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或22小时内，或彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天内进行。
在一个具体的实施方式中，与不适当、有害的或危害性的免疫应答有关的或由其造成的疾病、紊乱或病况的治疗包括给药第二类干细胞，或第二类干细胞群。在一个具体的实施方式中，所述第二类干细胞是间质干细胞，例如，骨髓来源的间质干细胞。在其它实施方式中，第二类干细胞是多效干细胞、多能干细胞、祖细胞、造血干细胞例如CD34+造血干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞或胚胎生殖干细胞。第二类干细胞，例如，间质干细胞，可以任何比例与胎盘干细胞一起给药，例如，比例为约100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、1:75或1:100。间质干细胞可商业获得或从一个初始来源获得，例如骨髓、骨髓穿刺液、脂肪组织等。
在另一个具体的实施方式中，所述第二疗法包括免疫调节化合物，其中免疫调节化合物是3-(4-氨基-1-氧-1,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧(3-哌啶))-异吲哚啉-1,3-二酮；或α-(3-氨基苯二甲酰亚氨基)戊二酰亚胺。在一个更具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是具有下述结构的化合物：
Figure GDA0000408263340000321
其中X和Y之一为C=O，另一为C=O或CH2，R2是氢或低级烷基，或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、笼形物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体混合物。在另一个更具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是具有下述结构的化合物：
Figure GDA0000408263340000322
其中X和Y之一为C=O，另一为CH2或C=O；
R1是H、(C1–C8)烷基、(C3–C7)环烷基、(C2–C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基–(C1-C6)异环烷基、(C0-C4)烷基–(C2-C5)异芳基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基–N(R6)2、(C1-C8)烷基–OR5、(C1-C8)烷基–C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3’、C(S)NR3R3’或(C1-C8)烷基–O(CO)R5；
R2是H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、或(C2-C8)炔基；
R3和R3’独立的为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基–(C1-C6)异环烷基、(C0-C4)烷基–(C2-C5)异芳基、(C0-C8)烷基–N(R6)2、(C1-C8)烷基–OR5、(C1-C8)烷基–C(O)OR5、(C1-C8)烷基–O(CO)R5、或C(O)OR5；
R4是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基–OR5、苄基、芳基、(C0-C4)烷基–(C1-C6)异环烷基、或(C0-C4)烷基–(C2-C5)异芳基；
R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、或(C2-C5)异芳基；
每次出现的R6独立的为H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C2-C5)异芳基、或(C0-C8)烷基–C(O)O–R5或R6基团可连接形成异环烷基基团；
n是0或1；且
*表示手性碳中心；
或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、笼形物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体混合物。在另一个更具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是具有下述结构的化合物：
Figure GDA0000408263340000331
其中：
其中X和Y之一为C=O，另一为CH2或C=O；
R是H或CH2OCOR’；
(i)每个R1、R2、R3、或R4，彼此独立的为卤素、1-4碳原子的烷基、或1-4碳原子的烷氧基或(ii)R1、R2、R3、或R4之一是硝基或-NHR5，且剩余的R1、R2、R3、或R4是氢；
R5是氢或1-8碳的烷基
R6氢、1-8碳原子的烷基、苯并基、氯或氟；
R’是R7-CHR10-N(R8R9)；
R7是间苯撑或对苯撑或-(CnH2n)-，其中n的值为0-4；
每个R8和R9彼此独立的是氢或1-8碳原子的烷基，或R8和R9一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、或-CH2CH2X1CH2CH2–，其中X1是-O-、-S-、或-NH-；
R10是氢、1-8碳原子的烷基、或苯基；且
*表示手性碳中心；
或其药学可接受的盐、水合物、溶剂化物、笼形物、对映异构体、非对映异构体、外消旋物或立体异构体混合物。
上述治疗剂的任意组合都可给药。治疗剂可以与胎盘干细胞任意组合在治疗同时或作为独立的疗程给药。
胎盘干细胞可以药物组合物的形式被给药至患有CNS损伤（例如SCI或TBI）的个体，例如，适于静脉内、肌肉内或腹膜内注射的药物组合物。胎盘干细胞可以单剂量给药，也可以多剂量给药。如果胎盘干细胞多剂量给药，那么该剂量可以是为缓解一种或多种CNS损伤（例如SCI或TBI）而设计的治疗方案的一部分，或可以是为预防或减轻慢性损伤严重程度而设计的长期治疗方案的一部分。在胎盘干细胞与第二治疗剂或第二类干细胞一起给药的实施方式中，胎盘干细胞和第二治疗剂和/或第二类干细胞可同时给药或不同时给药，例如，给药可以在彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、或50分钟内，或彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、或22小时内，或彼此的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天内进行。
5.5胎盘干细胞和胎盘干细胞群
在此提供的方法使用胎盘干细胞，即，从胎盘或其部分获得的干细胞，其(1)贴壁在组织培养基材上；(2)具有分化为非胎盘细胞类型的能力；且(3)有足够的数量则具有可检测地抑制免疫功能的能力，例如，在MLR分析或回归分析中抑制CD4+和/或CD8+T细胞的增殖。胎盘干细胞不来自血液，例如，胎盘血或脐带血。在此提供的方法和组合物中使用的胎盘干细胞具有抑制个体免疫系统的能力，或为了其能力而被选中。
胎盘干细胞在来源上可以是胎儿的或母体的（即，可以分别具有胎儿或母体的基因型）。胎盘干细胞或包含胎盘干细胞的细胞群体可以包含在来源上仅是胎儿的或母体的胎盘干细胞，或者可以包含胎儿和母体来源的胎盘干细胞的混合群体。可以通过以下所讨论的形态学、标志物和培养特征来鉴别和选择胎盘干细胞和包含胎盘干细胞的细胞群体。
5.5.1物理和形态特征
当在原代培养或在细胞培养中培养时，本文所述的胎盘干细胞贴壁到组织培养基材上，例如，组织培养容器表面（例如，组织培养塑料制品）。培养中的胎盘干细胞呈现出一般成纤维样星形外观，其中多个胞质突从中央细胞体中伸出。然而，由于所述胎盘干细胞显示出比成纤维细胞数目更多的该类胞质突，因此该细胞在形态学上是与相同条件下培养的成纤维细胞可区分的。形态学上，胎盘干细胞还是与造血干细胞可区分的，造血干细胞在培养时一般呈现出更圆的或卵石形态。
5.5.2细胞表面、分子和遗传标志物
在本方法（例如，治疗CNS损伤的方法）中使用的分离的胎盘干细胞，例如，分离的多效胎盘干细胞或分离的胎盘干细胞和该分离的胎盘干细胞的群，是组织培养贴壁人胎盘干细胞，其具有多能细胞或干细胞的特征并且表达可以用于鉴别和/或分离所述细胞或包含所述干细胞的细胞群体的多种标志物。在某些实施方式中，PDAC是生成血管的，例如，体外或体内。在此描述的分离的胎盘干细胞和胎盘细胞群(即，两种或更多分离的胎盘干细胞)包括直接从胎盘或其部分(例如，绒毛膜、胎盘胚等)获得的细胞和含有胎盘细胞的细胞群体。分离的胎盘干细胞群体还包括培养中的（也就是说，两种或更多种）分离的胎盘干细胞的群体和容器（例如，袋）中的群体。本文所述的分离的胎盘干细胞不是骨髓来源的间充质细胞、脂肪源间质干细胞或得自脐带血、胎盘血或周围血液的间充质细胞。在（例如）美国专利No.7311904；7311905和7468276中；以及在美国专利申请公开No.2007/0275362中说明了在本文所述的方法和组合物中有用的胎盘干细胞，以上专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，分离的胎盘细胞是分离的胎盘干细胞。在其它某些实施方式中，分离的胎盘细胞是分离的胎盘多效细胞。在一个实施方式中，分离的胎盘细胞，例如PDAC，是可通过流式细胞术检测的CD34–、CD10+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞具有分化为神经表型细胞、成骨表型细胞和/或软骨形成表型细胞的潜能。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是CD200+。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是CD45–或CD90+。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是可通过流式细胞术检测的CD45–和CD90+。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘细胞另外是可通过流式细胞术检测的CD90+或CD45–。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘细胞另外是可通过流式细胞术检测的CD90+和CD45–，即，细胞为CD34–、CD10+、CD45–、CD90+、CD105+和CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述CD34–、CD10+、CD45–、CD90+、CD105+、CD200+细胞另外是CD80–和CD86–。
在某些实施方式中，所述胎盘细胞是CD34–、CD10+、CD105+和CD200+，和一种或多种可通过流式细胞术检测的CD38–、CD45–、CD80-、CD86–、CD133–、HLA-DR,DP,DQ–、SSEA3–、SSEA4–、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、CD105+、HLA-A,B,C+、PDL1+、ABC-p+、和/或OCT-4+。在其它实施方式中，上述任意CD34–、CD10+、CD105+细胞另外是一种或多种的CD29+、CD38–、CD44+、CD54+、SH3+或SH4+。在另一个具体的实施方式中，细胞另外是CD44+。在上述任意的分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞的另一个具体的实施方式中，细胞另外是一种或多种的CD117–、CD133–、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、或程序性死亡配体-1(PDL1)+、或其任意组合。
在另一个实施方式中，CD34–、CD10+、CD105+细胞另外是一种或多种的CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD62E–、CD62L–、CD62P-、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘素低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–、或程序性死亡配体-1(PDL1)+、或其任意组合。在另一个实施方式中，CD34–、CD10+、CD105+细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘素低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–和程序性死亡配体-1(PDL1)+。
在另一个具体的实施方式中，本文所述的任何分离的胎盘干细胞是ABC-p+，如通过流式细胞术可检测的，或OCT-4+（POU5F1+），如通过RT-PCR可确定的，其中ABC-p是胎盘特异性ABC转运蛋白（也称为乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和耐米托蒽醌蛋白（MXR）），并且OCT-4是八聚体-4蛋白（POU5F1）。在另一个具体的实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是SSEA3–或SSEA4–，如通过流式细胞术可确定的，其中SSEA3是阶段特异性胚胎抗原3，而SSEA4是阶段特异性胚胎抗原4。在另一个具体的实施方式中，本文所述的任何胎盘干细胞另外是SSEA3–和SSEA4–。
在另一个具体的实施方式中，在此描述的任一胎盘细胞另外是一种或多种的MHC-I+(例如，HLA-A,B,C+)、MHC-II–(例如，HLA-DP,DQ,DR–)或HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，在此描述的任一胎盘细胞另外是一种或多种的MHC-I+(例如，HLA-A,B,C+)、MHC-II–(例如，HLA-DP,DQ,DR–)和HLA-G–。
本文还提供了在本文所公开的方法和组合物中有用的包含分离的胎盘干细胞（例如，富含分离的胎盘干细胞）的细胞群体。优选的细胞群体包含所述分离的胎盘干细胞，其中所述细胞群含有，例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%分离的CD10+、CD105+和CD34–胎盘细胞；即，所述细胞群中至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的细胞是分离的CD10+、CD105+和CD34–胎盘细胞。在一个具体的实施方式中，所述分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘干细胞另外是CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD34-、CD10+、CD105+、CD200+胎盘干细胞另外是CD90+或CD45–，如通过流式细胞术可检测的。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘细胞另外是CD90+和CD45–，如可通过流式细胞术检测的。在另一个具体的实施方式中，任意上述分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞另外是一种或多种的CD29+、CD38–、CD44+、CD54+、SH3+或SH4+。在另一个具体的实施方式中，分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞或分离的CD34–、CD10+、CD105+、CD200+胎盘细胞，另外是CD44+。在含有分离的CD34–、CD10+、CD105+胎盘细胞的任意上述细胞群的一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞另外是一种或多种的CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD62E-、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘素低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133-、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–、或程序性死亡配体-1(PDL1)+、或其任意组合。在另一个具体的实施方式中，CD34–、CD10+、CD105+细胞另外是CD13+、CD29+、CD33+、CD38–、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–、CD62L–、CD62P–、SH3+(CD73+)、SH4+(CD73+)、CD80–、CD86–、CD90+、SH2+(CD105+)、CD106/VCAM+、CD117–、CD144/VE-钙粘素低、CD184/CXCR4–、CD200+、CD133–、OCT-4+、SSEA3–、SSEA4–、ABC-p+、KDR–(VEGFR2–)、HLA-A,B,C+、HLA-DP,DQ,DR–、HLA-G–和程序性死亡配体-1(PDL1)+。
在某些实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘干细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–、SSEA4–、OCT-4+和ABC-p+中的一种或多种或者全部，其中所述分离的胎盘细胞是通过胎盘组织的物理和/或酶促破环获得的。在一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+和ABC-p+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34–、其中所述分离的胎盘细胞具有至少一种下述特征：CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34–、CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34–和SH2+或SH3+之一。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34–、SH2+和SH3+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–和SH2+或SH3+之一。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34–和SH2+或SH3+之一，且是至少一种的CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SSEA3–、或SSEA4–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34–、CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SSEA3–和SSEA4–和SH2+或SH3+之一。
在另一个实施方式中，在本方法和在此公开的组合物中有用的分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、CD34–、CD45–、SSEA3–、或SSEA4–。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–和SSEA4–、CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、OCT-4+、CD34–或CD45–。
在另一个实施方式中，在本方法和在此公开的组合物中有用的分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+和SH4+；其中所述分离的胎盘细胞另外是一种或多种的OCT-4+、SSEA3–或SSEA4–。
在某些实施方式中，在本方法中有用的分离的胎盘细胞和在此公开的组合物是CD200+或HLA-G–。在一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD200+和HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞另外是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞另外是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞另外是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘细胞是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+或HLA-G–胎盘细胞在允许胚胎样小体形成的条件下有利于在含有分离的胎盘细胞的胎盘细胞群中形成胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是从非干细胞或多能细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞是从不表现出这些标志物组合的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）CD200+、HLA-G-胎盘干细胞的细胞群体。在具体的实施方式中，所述群体是胎盘细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD200+、HLA-G-胎盘干细胞。优选的，所述细胞群中至少约70%的细胞是分离的CD200+、HLA-G–胎盘细胞。更加优选的，至少约90%、95%、或99%的所述细胞是分离的CD200+、HLA-G–胎盘细胞。在所述细胞群体的具体实施方式中，所述分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞还是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞还是CD34-、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞还是CD34–、CD38–或CD45–、CD73+和CD105+。在另一个实施方式中，当在允许胚胎样小体形成的条件下培养时所述细胞群产生一种或多种胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体是从非干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、HLA-G–胎盘干细胞是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。
在另一个实施方式中，在本方法和在此描述的组合物中有用的分离的胎盘细胞是CD73+、CD105+和CD200+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD34–、CD38–、CD45–和HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，分离的CD73+、CD105+和CD200+胎盘细胞在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在含有分离的胎盘细胞的胎盘细胞群中形成胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞是从非分离的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘细胞的细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约70%的所述细胞是分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约90%、95%或99%的细胞是分离的CD73+、CD105+、CD200+胎盘干细胞。在所述群体的具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞是HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞另外是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞另外是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞另外是CD34–、CD38–、CD45-和HLA-G-。在另一个具体的实施方式中，当在允许胚胎样小体形成的条件下培养时所述细胞群产生一种或多种胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘细胞群体是从非干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞群体是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。
在其它某些实施方式中，分离的胎盘细胞是一种或多种的CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4–、OCT-4+、HLA-G–或ABC-p+。在一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3-、SSEA4–和OCT-4+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD45–、CD54+、SH2+、SH3+和SH4+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD45-、CD54+、SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34–、CD38–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、HLA-G–、SH2+、SH3+、SH4+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+和ABC-p+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是SH2+、SH3+、SH4+和OCT-4+。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–。在一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+、CD34–、SSEA3–和SSEA4–胎盘细胞另外是CD10+、CD29+、CD34–、CD44+、CD45–、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+和SH4+。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是OCT-4+和CD34–和SH3+或SH4+之一。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是CD34–和CD10+、CD29+、CD44+、CD54+、CD90+、或OCT-4+之一。
在另一个实施方式中，在本方法和在此描述的组合物中有用的分离的胎盘细胞是CD200+和OCT-4+。在一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞是HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+、CD105+和HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞当在允许胚胎样小体形成的条件下培养细胞群时有利于含有分离的细胞的胎盘细胞群产生一种或多种胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是从非干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘细胞是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）CD200+、OCT-4+胎盘干细胞的细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞。在另一种实施方式中，至少约70%的所述细胞是所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约80%、90%、95%或99%的细胞是所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞。在所述分离的群体的具体实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞另外是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞另外是HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞另外是CD34-、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞另外是CD34–、CD38–、CD45-、CD73+、CD105+和HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，当在允许胚胎样小体形成的条件下培养时，细胞群产生一种或多种胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体是从非分离的CD200+、OCT-4+胎盘干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的所述分离的胎盘干细胞是CD73+、CD105+和HLA-G–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+和HLA-G–胎盘干细胞另外是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞另外是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞另外是OCT-4+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞另外是CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞另外是CD34–、CD38–、CD45–、OCT-4+和CD200+。在另一个具体的实施方式中，当在允许胚胎样小体形成的条件下培养细胞群时，分离的CD73+、CD105+，HLA-G–胎盘细胞有利于在含有所述细胞的胎盘细胞群中形成胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞是从非分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘干细胞是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）分离的CD73+、CD105+和HLA-G–胎盘细胞的细胞群体。在多种实施方式中，所述细胞群体中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约70%的细胞是分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞。在另一种实施方式中，所述细胞群体中至少约90%、95%或99%的细胞是分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞。在上述群体的具体实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞另外是CD34-、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞另外是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞另外是OCT-4+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞另外是CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞另外是CD34-、CD38-、CD45-、OCT-4+和CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体是从非CD73+、CD105+、HLA-G–胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。
在另一个实施方式中，在本方法和在此描述的组合物中有用的分离的胎盘细胞是CD73+和CD105+，且当在允许胚胎样小体形成的条件下培养细胞群时，有利于在含有所述CD73+、CD105+细胞的分离的胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是OCT-4+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是OCT-4+、CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞被分离自非所述细胞的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞被分离自不显示这些特性的的胎盘细胞。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）分离的CD73+、CD105+胎盘细胞，且当在允许胚胎样小体形成的条件下培养细胞群时，有利于在含有所述细胞的分离的胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体。在各实施方式中，所述细胞群体中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞群体中至少约70%的细胞是分离的CD73+、CD105+胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞群体中至少约90%、95%或99%的细胞是分离的CD73+、CD105+胎盘细胞。在上述群体的一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是OCT-4+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–、CD45–、OCT-4+和CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群分离自并非所述分离的CD73+、CD105+胎盘细胞的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群分离自不显示这些标记的胎盘细胞。
在另一个实施方式中，在本方法和在此描述的组合物中有用的分离的胎盘细胞是OCT-4+，且当在允许胚胎样小体形成的条件下培养细胞群时，有利于在含有所述细胞的分离的胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体。在一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–，或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD73+、CD105+、CD200+、CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞被分离自并非OCT-4+胎盘细胞的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞被分离自不显示这些特性的的胎盘细胞。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）分离的OCT-4+胎盘细胞，且有利于在含有的分离的胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体所述细胞当在允许胚胎样小体形成的条件下培养细胞群时。在各实施方式中，所述细胞群体中至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%的细胞是所述分离的OCT-4+胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞群体中至少约70%的细胞是分离的OCT-4+胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞群中至少约80%、90%、95%或99%的细胞是所述分离的OCT-4+胎盘细胞。在上述群体的一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–或CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD73+和CD105+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD200+。在另一个具体的实施方式中，所述分离的OCT-4+胎盘细胞另外是CD73+、CD105+、CD200+、CD34–、CD38–和CD45–。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群分离自非所述细胞的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群分离自不显示这些标记的胎盘细胞。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是分离的HLA-A,B,C+、CD45-、CD133–和CD34–胎盘细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述分离的细胞群体中至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是分离的HLA-A,B,C+、CD45–、CD133–和CD34-胎盘细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从非HLA-A,B,C+、CD45–、CD133–和CD34–胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在本文所述的任何胎盘干细胞的另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞群体基本不含母体成分；例如，所述分离的胎盘细胞群体中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞在来源上是非母体的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45–、CD117–和CD133–胎盘细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含所述分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是所述分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45–、CD117–和CD133–胎盘细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从非所述分离的胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的CD10+、CD13+、CD33+、CD45–、CD117-和CD133–胎盘细胞在来源上是非母体的，即具有胎儿基因型。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞群体中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是分离的CD10+、CD33–、CD44+、CD45–和CD117–胎盘细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）所述分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是分离的CD10+、CD33–、CD44+、CD45–和CD117–胎盘细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从非所述胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是分离的CD10+、CD13–、CD33–、CD45–和CD117–胎盘细胞。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体是包含（例如，富含）分离的CD10+、CD13–、CD33–、CD45–和CD117–胎盘细胞的细胞群体，其中所述群体中至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的细胞是CD10+、CD13–、CD33–、CD45–和CD117–胎盘细胞。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从非所述胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从不表现出这些特征的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是HLA A,B,C+、CD45–、CD34–和CD133–，并且另外是CD10+、CD13+、CD38+、CD44+、CD90+、CD105+、CD200+和/或HLA-G–，和/或对CD117是阴性的。在另一种实施方式中，在本文所述的方法中有用的细胞群体是包含所述分离的胎盘细胞的细胞群体，其中所述群体中至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或约99%的细胞是作为HLA A,B,C–、CD45–、CD34–、CD133–的分离的胎盘细胞，并且另外对CD10、CD13、CD38、CD44、CD90、CD105、CD200是阳性的，和/或对CD117和/或HLA-G是阴性的。在具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从非所述胎盘细胞的胎盘细胞中分离出来的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群体是从不表现出这些标志物的胎盘细胞中分离出来的。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是CD200+和CD10+，如通过抗体结合可确定的，以及CD117–，如通过抗体结合和RT-PCR两者可确定的。在另一个实施方式中，在本方法和在此描述的组合物中有用的分离的胎盘细胞是分离的胎盘细胞，例如，胎盘干细胞或胎盘多效细胞，其是CD10+、CD29–、CD54+、CD200+、HLA-G–、MHC I类+和β-2微球蛋白+。在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是胎盘细胞，其中至少一种细胞标志物的表达比间质干细胞（例如，骨髓来源的间质干细胞）高至少两倍。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是非母体的。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体中至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、90%、85%、90%、95%、98%或99%的所述细胞在来源上是非母体的。
在另一个实施方式中，在本方法和在此描述的组合物中有用的分离的胎盘细胞是分离的胎盘细胞，例如，胎盘干细胞或胎盘多效细胞，其为一种或多种的CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–、CD62L–、CD62P-、CD80–、CD86–、CD103–、CD104–、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-钙粘素低、CD184/CXCR4–、β2-微球蛋白低、MHC-I低、MHC-II–、HLA-G低、和/或PDL1低。在一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞至少为CD29+和CD54+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞至少为CD44+和CD106+。在另一个具体的实施方式中，分离的胎盘细胞至少为CD29+。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体包含分离的胎盘细胞，其中所述细胞群体中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是分离的胎盘细胞，所述分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62E–、CD62L-、CD62P–、CD80–、CD86–、CD103–、CD104–、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-钙粘素dim、CD184/CXCR4–、β2-微球蛋白dim、HLA-Idim、HLA-II-、HLA-Gdim和/或PDL1dim中的一种或多种。在另一个具体的实施方式中，所述细胞群体中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的细胞是CD10+、CD29+、CD44+、CD45–、CD54/ICAM+、CD62-E-、CD62-L-、CD62-P–、CD80–、CD86–、CD103–、CD104–、CD105+、CD106/VCAM+、CD144/VE-钙粘素dim、CD184/CXCR4–、β2-微球蛋白dim、MHC-Idim、MHC-II-、HLA-Gdim和PDL1dim。在某些实施方式中，当受到干扰素γ(IFN-γ)诱导时，胎盘细胞表达HLA-II标志物。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞是CD10+、CD29+、CD34-、CD38-、CD44+、CD45-、CD54+、CD90+、SH2+、SH3+、SH4+、SSEA3–、SSEA4–、OCT-4+和ABC-p+中的一种或多种或者全部，其中ABC-p是胎盘特异的ABC转运蛋白（也称为乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和耐米托蒽醌蛋白（MXR）），其中所述分离的胎盘干细胞是通过已排出脐带血并灌注以除去残余血液的哺乳动物（例如，人）胎盘的灌注获得的。
在任何上述特征的另一个具体的实施方式中，细胞标志物（例如，分化或免疫原性标志物簇）的表达是通过流式细胞术可确定的；在另一个具体的实施方式中，所述标志物的表达是通过RT-PCR可确定的。
基因谱确认分离的胎盘干细胞以及分离的胎干细胞的群与其他细胞（例如，间质干细胞，例如，骨髓来源的间质干细胞）是可区分的。根据一种或多种基因的表达，本文所述的分离的胎盘干细胞可以不同于（例如）间质干细胞，与骨髓来源的间质干细胞相比，在分离的胎盘干细胞或在某些分离的脐带干细胞中所述基因的表达显著更高。具体地，根据一种或多种基因的表达，在本文提供的治疗方法中有用的分离的胎盘干细胞可以不同于间质干细胞（例如，骨髓来源的间质干细胞），当细胞在相同条件下生长时，在所述分离的胎盘干细胞中所述基因的表达显著高于（即至少两倍高于）相等数目的骨髓来源的间质干细胞中的表达，其中所述一种或多种基因为ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、Cllorf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN、ZC3H12A或任何上述基因的组合。参见（例如）美国专利申请公开No.2007/0275362，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在某些具体的实施方式中，通过（例如）RT-PCR或微阵列分析（例如，使用U133-A微阵列（Affymetrix））确定了所述一种或多种基因的所述表达。在另一个具体的实施方式中，当在包含DMEM-LG（例如，得自Gibco）；2%胎牛血清（例如，得自Hyclone Labs）；1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）；1×亚油酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）；10-9M地塞米松（例如，得自Sigma）；10-4M抗坏血酸2-磷酸酯（例如，得自Sigma）；10ng/mL表皮生长因子（例如，得自R&D Systems）；10ng/mL血小板源性生长因子（PDGF-BB）（例如，得自R&D Systems）的培养基中培养多次群体倍增（例如，约3至约35次之间任何次数的群体倍增）时，所述分离的胎盘干细胞表达所述一个或多个基因。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞特异的基因是CD200。
这些基因的具体序列可见于GenBank，例如，从2008年3月起的登录号no.NM_001615（ACTG2）、BC065545（ADARB1）、NM_181847（AMIGO2）、AY358590（ARTS-1）、BC074884（B4GALT6）、BC008396（BCHE）、BC020196（Cllorf9）、BC031103（CD200）、NM_001845（COL4A1）、NM_001846（COL4A2）、BC052289（CPA4）、BC094758（DMD）、AF293359（DSC3）、NM_001943（DSG2）、AF338241（ELOVL2）、AY336105（F2RL1）、NM_018215（FLJ10781）、AY416799（GATA6）、BC075798（GPR126）、NM_016235（GPRC5B）、AF340038（ICAM1）、BC000844（IER3）、BC066339（IGFBP7）、BC013142（IL1A）、BT019749（IL6）、BC007461（IL18）、（BC072017）KRT18、BC075839（KRT8）、BC060825（LIPG）、BC065240（LRAP）、BC010444（MATN2）、BC011908（MEST）、BC068455（NFE2L3）、NM_014840（NUAK1）、AB006755（PCDH7）、NM_014476（PDLIM3）、BC126199（PKP-2）、BC090862（RTN1）、BC002538（SERPINB9）、BC023312（ST3GAL6）、BC001201（ST6GALNAC5）、BC126160或BC065328（SLC12A8）、BC025697（TCF21）、BC096235（TGFB2）、BC005046（VTN）和BC005001（ZC3H12A）。
在某些具体的实施方式中，当细胞在相同条件下生长时，所述分离的胎盘干细胞以比相同数目的骨髓来源的间质干细胞可检测的更高的水平表达ACTG2、ADARB1、AMIGO2、ARTS-1、B4GALT6、BCHE、Cllorf9、CD200、COL4A1、COL4A2、CPA4、DMD、DSC3、DSG2、ELOVL2、F2RL1、FLJ10781、GATA6、GPR126、GPRC5B、HLA-G、ICAM1、IER3、IGFBP7、IL1A、IL6、IL18、KRT18、KRT8、LIPG、LRAP、MATN2、MEST、NFE2L3、NUAK1、PCDH7、PDLIM3、PKP2、RTN1、SERPINB9、ST3GAL6、ST6GALNAC5、SLC12A8、TCF21、TGFB2、VTN和ZC3H12A中的每一个。
在具体的实施方式中，所述胎盘干细胞以比相同数目的骨髓来源的间质干细胞（BM-MSC）更高的水平（例如，可检测地更高的水平）表达CD200和ARTS1（1型氨肽酶调节子肿瘤坏死因子）；CD200和NUAK1、ARTS-1和LRAP（白血球源性精氨酸氨肽酶）；IL6（白介素-6）和TGFB2（转化生长因子β2）；IL6和KRT18（角蛋白18）；IER3（即刻早期反应蛋白3）、MEST（中胚层特异性转录本同源物）和TGFB2；CD200和IER3；CD200和IL6；CD200和KRT18；CD200和LRAP；CD200和MEST；CD200和NFE2L3（核因子（红细胞源2）样蛋白3）；或CD200和TGFB2，其中在培养中所述骨髓来源的间质干细胞经历了与所述分离的胎盘干细胞所经历的传代次数相等的传代次数。在其他具体的实施方式中，所述胎盘干细胞以比相同数目的骨髓来源的间质干细胞BM-MSC更高的水平（例如，可检测地更高的水平）表达ARTS-1、CD200、IL6和LRAP；ARTS-1、IL6、TGFB2、IER3、KRT18和MEST；CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2；ARTS-1、CD200、IER3、IL6、KRT18、LRAP、MEST、NFE2L3和TGFB2；或IER3、MEST和TGFB2，其中在培养中所述骨髓来源的间质干细胞经历了与所述分离的胎盘干细胞所经历的传代次数相等的传代次数。
可以通过标准技术评价上述提及的基因的表达。例如，可以通过常规方法分别选择并构建基于所述基因序列的探针。可以在（例如）包含一种或多种基因的探针的微阵列（例如，Affymetrix
Figure GDA0000408263340000491
人基因组U133A2.0阵列或Affymetrix
Figure GDA0000408263340000492
人基因组U133Plus2.0（Santa Clara,California））上评价基因的表达。由于可以使用众所周知的标准技术容易地产生对修改的序列特异的探针，因此即使特定GenBank登录号的序列被修改，但仍可以评价这些基因的表达。
这些基因的表达水平可用于确认分离的胎盘细胞群体的身份，鉴别细胞群体（由于包含至少多个分离的胎盘干细胞）等。身份确认的分离的胎盘细胞群体可以是无性系的（例如，分离的胎盘干细胞群体是从单个分离的胎盘干细胞扩增的），或者是干细胞的混合群体（例如，包含从多个分离的胎盘干细胞扩增的分离的胎盘干细胞的细胞群体），或者是包含如本文所述的分离的胎盘干细胞和至少一种其他类型细胞的细胞群体。
这些基因的表达水平可用于选择分离的胎盘干细胞群体。例如，如果在来自胎盘干细胞群体的样品中以上所列的一种或多种基因的表达显著高于相等的间质干细胞（例如，骨髓来源的间质干细胞）群体中的表达，则可以选择胎盘干细胞群体（例如，无性系扩增的胎盘干细胞）。选择的群体可以来自身份未明的多个细胞群等的多个分离的胎盘细胞的群。
可以根据与（例如）间质干细胞对照中所述一种或多种基因的表达水平（例如，相等数目的骨髓来源的间质干细胞中所述一种或多种基因的表达水平）相比的一种或多种这些基因的表达水平选择分离的胎盘细胞。在一种实施方式中，将包含相等数目的间质干细胞的样品中所述一种或多种基因的表达水平用作对照。在另一种实施方式中，在一定条件下测试的分离的胎盘细胞的对照是表示在所述条件下间质干细胞中所述一种或多种基因的表达水平的数值。
本文所述的分离的胎盘干细胞在原代培养中或者在包含（例如）DMEM-LG（Gibco）、2%胎牛血清（FCS）（Hyclone Laboratories）、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、1×亚麻酸-牛血清白蛋白（LA-BSA）、10-9M地塞米松（Sigma）、10-4M抗坏血酸2-磷酸酯（Sigma）、10ng/ml表皮生长因子（EGF）（R&D Systems）、10ng/ml血小板源性生长因子（PDGF-BB）（R&D Systems）和100U青霉素/1000U链霉素的培养基中增殖期间显示出上述特征（例如，细胞表面标志物和/或基因表达谱的组合）。
在本文所公开的任何胎盘细胞的某些实施方式中，所述细胞是人细胞。在本文所公开的任何胎盘干细胞的某些实施方式中，所述细胞标志物特征或基因表达特征是人标志物或人基因。
在所述分离的胎盘细胞或包含所述分离的胎盘细胞的细胞群体的另一个具体的实施方式中，所述细胞或群体已扩增（例如）传代了至少，约或者不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或者增殖了至少，约或者不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次群体倍增。在所述分离的胎盘干细胞或包含所述分离的胎盘细胞的细胞群体的另一个具体的实施方式中，所述细胞或群体是原代分离物。在分离的胎盘细胞或包含本文所公开的分离的胎盘细胞的细胞群体的另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘细胞在来源上是胎儿的（即，具有胎儿的基因型）。
在某些实施方式中，所述分离的胎盘细胞在生长培养基（即，配制以促进增殖的培养基）中培养期间（例如，在生长培养基中增殖期间）不分化。在另一个具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞不需要饲养层来增殖。在另一个具体的实施方式中，仅由于饲养细胞层的缺少，所述分离的胎盘干细胞在不存在饲养层的情况下培养时不分化。
在另一种实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞是分离的胎盘细胞，其中多个所述分离的胎盘干细胞对醛脱氢酶（ALDH）是阳性的，如通过醛脱氢酶活性测定所评价的。这些测定在本领域中是已知的（参见，例如，Bostian和Betts,Biochem.J.,173,787,(1978)）。在具体的实施方式中，所述ALDH测定使用
Figure GDA0000408263340000501
（Aldagen,Inc.,Ashland,Oregon）作为醛脱氢酶活性的标志物。在具体的实施方式中，所述多个是所述细胞群体中约3%至约25%之间的细胞。在另一种实施方式中，所述分离的胎盘细胞群体显示出比具有大致相同的细胞数目并且在相同条件下培养的骨髓来源的间质干细胞群体高至少三倍或至少五倍的ALDH活性。
在包含本文所述的分离的胎盘细胞的任何细胞群体的某些实施方式中，所述细胞群体中的胎盘干细胞基本不含具有母体基因型的细胞；例如，所述群体中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的胎盘干细胞具有胎儿基因型。在包含本文所述的分离的胎盘干细胞的任何细胞群体的某些其他实施方式中，包含所述胎盘干细胞的细胞群体基本不含具有母体基因型的细胞；例如，所述群体中至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的细胞具有胎儿基因型。
在任何上述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞的细胞群体的具体实施方式中，所述群体中全部细胞或至少约95%或约99%的细胞的染色体组型是正常的。在任何上述胎盘干细胞的另一个具体的实施方式中，所述胎盘干细胞或所述细胞群体中的细胞在来源上是非母体的。
在此公开的胎盘细胞的任意实施方式的一个具体的实施方式中，胎盘细胞是遗传稳定的，表现出正常的双倍体染色体数和正常染色体组型。
可以将具有任何上述标志物组合的分离的胎盘细胞的不同群体以任何比例混合。可以将上述分离的胎盘细胞的任何两种或更多种群体混合以形成分离的胎盘干细胞群体。例如，分离的胎盘细胞群体可以包含由如上所述的标志物组合之一所定义的第一分离的胎盘细胞群体和由如上所述的标志物组合中另一种所定义的第二分离的胎盘细胞群体，其中所述第一和第二群体以约1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或约99:1的比值混合。以类似的方式，可以将任何三种、四种、五种或更多种上述分离的胎盘干细胞群体混合。
可以通过（例如）使用或不使用酶促消化（参见5.3.3节）或灌注（参见5.3.4节）的胎盘组织破坏来获得在本文所述的方法和组合物中有用的分离的胎盘细胞。例如，可以根据以下方法产生从中可以分离胎盘细胞的分离的胎盘细胞群体，所述方法包括灌注已排出脐带血并灌注以除去残余血液的哺乳动物胎盘；用灌注溶液灌注所述胎盘；和收集所述灌注溶液，其中灌注后的所述灌注溶液包含含有分离的胎盘干细胞的胎盘细胞群体；和从所述细胞群体分离多个所述分离的胎盘细胞。在具体的实施方式中，将灌注溶液通过脐静脉和脐动脉并在其从胎盘流出后收集。在另一个具体的实施方式中，将灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或者通过脐动脉并从脐静脉收集。
在多种实施方式中，包含在得自胎盘灌注的细胞群体内的所述分离的胎盘干细胞是所述胎盘细胞群体的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或至少99.5%。在另一个具体的实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘干细胞包含胎儿细胞和母细胞。在另一个具体的实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘干细胞是至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或至少99.5%的胎儿细胞。
在另一个具体的实施方式中，本文提供了包含通过灌注收集的如本文所述的分离的胎盘干细胞群体的组合物，其中所述组合物包含用于收集所述分离的胎盘干细胞的灌注溶液的至少一部分。
可以通过使用一种或多种组织破坏酶的胎盘组织消化以获得包含所述胎盘细胞的胎盘细胞群体并且将胎盘干细胞与其余的所述胎盘细胞分离或基本分离来分离本文所述的胎盘细胞。可以将全部或部分胎盘消化以获得本文所述的分离的胎盘细胞。在具体的实施方式中，例如，所述胎盘组织可以是整个胎盘(例如，包括脐带)、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合、或前述任意组合。在其他具体的实施方式中，所述组织破坏酶是胰蛋白酶或胶原酶。在多种实施方式中，包含在得自胎盘消化的细胞群体内的所述分离的胎盘细胞是所述胎盘细胞群体的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或至少99.5%。
上述分离的胎盘细胞群和分离的胎盘细胞群一般可以包含约，至少或不超过1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011个或更多个分离的胎盘细胞。在本文所述的治疗方法中有用的分离的胎盘细胞群体包含至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的分离的活胎盘干细胞，例如，如通过（例如）台盼蓝排阻法可确定的。
对于上述任意胎盘细胞或胎盘细胞群，细胞或胎盘干细胞群为，或者可以含有已经传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、或20次或更多，或增殖了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20，22、24、26、28、30，32、34、36、38或40次群体倍增或更多的细胞。
在任何上述胎盘细胞或胎盘细胞的细胞群体的具体实施方式中，所述群体中细胞或至少约95%或约99%的细胞的染色体组型是正常的。在任何上述胎盘细胞或细胞群的另一个具体的实施方式中，所述细胞或所述细胞群体中的细胞在来源上是非母体的。
可以将具有任何上述标志物组合的分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞群以任何比例混合。可以将上述胎盘细胞群的任何两种或更多种分离或富集以形成胎盘细胞群体。例如，包含由如上所述的标志物组合之一所定义的第一分离的胎盘细胞群体可以和由如上所述的标志物组合中另一种所定义的第二分离的胎盘细胞群体进行组合，其中所述第一和第二群体以约1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或约99:1的比值混合。以类似的方式，可以将任何三种、四种、五种或更多种上述胎盘细胞或胎盘细胞群混合。
在上述胎盘细胞的一个具体的实施方式中，胎盘细胞组成型地分泌IL-6、IL-8和单核细胞化学吸引蛋白(MCP-1)。
上述免疫抑制的多个胎盘细胞可以含有约，至少，或不多于，1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011或更多胎盘细胞。
在某些实施方式中，在此提供的在本方法中有用的胎盘细胞(例如，PDAC)在暴露于1-100ng/mL的VEGF4-21天后不表达通过免疫定位可检测的CD34。在一个具体的实施方式中，所述胎盘贴壁细胞贴壁至组织培养塑料制品。在另一个具体的实施方式中，当在血管生成因子（例如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)）存在的条件下在例如MATRIGELTM的基质上培养时，所述细胞群诱导内皮细胞形成芽或管样结构。
在另一方面，在此提供的PDAC，例如PDAC的细胞群或其中至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%的细胞是PDAC的细胞群，将一种或多种或全部的VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、卵泡抑素、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、或galectin-1分泌至例如细胞生长所在的培养基中。在另一个实施方式中，在低氧条件下(例如，少于约5%O2)，PDAC表达较之常氧条件(例如，约20%或约21%O2)而言增加水平的CD202b、IL-8和/或VEGF。
在另一个实施方式中，在此描述的任何PDAC或含有PDAC的细胞群可以导致内皮细胞形成芽或管样结构，所述内皮细胞接触所述胎盘来源的贴壁细胞。在一个具体的实施方式中，PDAC与人内皮细胞共培养，当例如在胞外基质蛋白（例如胶原I和IV型）和/或血管生成因子（例如血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)）存在的条件下在基质中或基质上（例如胎盘胶原或MATRIGELTM）培养至少4天后，人内皮细胞形成芽或管样结构或支持内皮细胞芽的形成。在另一个实施方式中，在此描述的含有胎盘来源的贴壁细胞的任意细胞群分泌血管生成因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、或白介素8(IL-8)，并从而能够诱导人内皮细胞在胞外基质蛋白（例如胶原I和IV型）存在下在基质中或基质上（例如胎盘胶原或MATRIGELTM）培养时形成芽或管样结构。
在另一个实施方式中，上述含有胎盘来源的贴壁细胞(PDAC)的任意细胞群分泌血管生成因子。在具体的实施方式中，细胞群分泌血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或白介素8(IL-8)。在其他具体实施方式中，含有PDAC的细胞群分泌一种或多种血管生成因子并从而诱导人内皮细胞在体外创伤愈合分析中迁移。在其他具体实施方式中，含有胎盘来源的贴壁细胞的细胞群诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或肌肉细胞的成熟化、分化或增殖。
5.5.3选择和生产胎盘细胞群
在某些实施方式中，胎盘细胞群可被选择，其中该细胞群是免疫抑制的。在一个实施方式中，例如，在此提供了一种从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制的胎盘细胞的方法，包括选择胎盘细胞群，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述细胞是CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘细胞，且其中所述胎盘细胞在MLR分析中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD45–和CD90+的干细胞。
在另一个实施方式中，在此提供了一种从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制的胎盘细胞的方法，包括选择胎盘细胞群，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述细胞是CD200+，HLA-G–胎盘细胞，且其中所述胎盘细胞在MLR分析中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的干细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–或CD45–的干细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+和CD105+的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择还包括选择多个胎盘细胞，其在允许胚胎样小体形成的条件下培养时形成一种或多种胚胎样小体。
在另一个实施方式中，在此提供了一种从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制的胎盘细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述细胞是CD73+、CD105+、CD200+胎盘细胞，且其中所述胎盘细胞在MLR分析中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是HLA-G–的干细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–或CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–和CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–、CD45–和HLA-G–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择另外包括选择胎盘细胞群，其在允许胚胎样小体形成的条件下培养时产生一种或多种胚胎样小体。
在另一个实施方式中，在此还提供了一种从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制的胎盘细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述细胞是CD200+、OCT-4+胎盘细胞，且其中所述胎盘细胞在MLR分析中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是HLA-G–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–和CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–、CD45–、CD73+、CD105+和HLA-G–的胎盘细胞。
在另一个实施方式中，在此提供了一种从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制的胎盘细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述细胞是CD73+、CD105+和HLA-G–胎盘细胞，且其中所述胎盘细胞在MLR分析中可检测地抑制T细胞增殖。在一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–或CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–和CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD200+的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–、CD45–、OCT-4+和CD200+的胎盘细胞。
在另一个实施方式中，在此还提供了一种从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制的胎盘细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述细胞是CD73+、CD105+胎盘细胞，且其中所述多个细胞在允许形成胚胎样小体的条件下形成一种或多种胚胎样小体。在一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–或CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–和CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是OCT-4+的胎盘细胞。在一个更具体的实施方式中，所述选择包括选择还是OCT-4+、CD34–、CD38–和CD45–的胎盘细胞。
在另一个实施方式中，在此提供了一种从多个胎盘细胞中选择多个免疫抑制的胎盘细胞的方法，包括选择多个胎盘细胞，其中至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的所述分离的胎盘细胞是OCT4+干细胞，且其中所述多个细胞在允许形成胚胎样小体的条件下形成一种或多种胚胎样小体。在一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73+和CD105+的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD34–、CD38–，或CD45–的胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD200+的胎盘细胞。在一个更具体的实施方式中，所述选择包括选择还是CD73+、CD105+、CD200+、CD34–、CD38–和CD45–的胎盘细胞。
免疫抑制的胎盘细胞群或多个胎盘细胞可以根据在此提供的方法进行生产。例如，在此提供了生产细胞群的方法，包括选择上述任意的多个胎盘细胞和从其他细胞（例如，其他胎盘细胞）中分离多个胎盘细胞。在一个具体的实施方式中，在此提供了一种生产细胞群的方法，包括选择胎盘细胞，其中所述胎盘细胞(a)附着到基质上，(b)表达CD200且不表达HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4、或表达CD73、CD105和不表达HLA-G，或表达CD73和CD105且在允许胚胎样小体形成的条件下培养含有所述干细胞的胎盘细胞群时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体，或表达OCT-4且在允许胚胎样小体形成的条件下培养含有所述干细胞的胎盘细胞群时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；且(c)在MLR或回归分析中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；和从其他细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。
在一个更具体的实施方式中，免疫抑制的胎盘细胞群可以通过以下方法生产，包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达CD200且不表达HLA-G和(c)在MLR分析中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；和从其他细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。在另一个具体的实施方式中，该方法包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达CD73、CD105和CD200和(c)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；和从其他细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。在另一个具体的实施方式中，在此提供了一种生产细胞群的方法，包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达CD200和OCT-4和(c)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；和从其他细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。在另一个具体的实施方式中，在此提供了一种生产细胞群的方法，包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达CD73和CD105，(c)在允许胚胎样小体形成的条件下培养时形成胚胎样小体和(d)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；和从其他细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。在另一个具体的实施方式中，该方法包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达CD73和CD105，不表达HLA-G和(c)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；和从其他细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。一种生产细胞群的方法，包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达OCT-4，(c)在允许胚胎样小体形成的条件下培养时形成胚胎样小体和(d)在MLR中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖；和从其他细胞中分离所述胎盘细胞以形成细胞群。
在免疫抑制的胎盘细胞群的生产方法的一个具体的实施方式中，所述T细胞和所述胎盘细胞在所述MLR中的比例为约5:1。该方法中使用的胎盘细胞可来自于整个胎盘，或主要来自于羊膜，或羊膜和绒毛膜。在另一个具体的实施方式中，胎盘细胞在所述MLR中与不存在所述胎盘细胞的MLR中的T细胞增殖相比，至少50%、至少75%、至少90%、或至少95%地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖。该方法可以另外包括具有免疫调节能力的胎盘细胞群的选择和/或生产，例如，对其他免疫细胞活性的抑制，例如，自然杀伤(NK)细胞的活性抑制。
5.5.4培养中的生长
本文所述的胎盘细胞，例如，胎盘干细胞(PDAC)的生长部分取决于选择用于生长的特定培养基（对于任意哺乳动物细胞而言）。在最适条件下，胎盘细胞通常在约3-5天中数目加倍。在培养期间，在培养中本文所述的分离的胎盘干细胞贴壁到基材上，例如，组织培养容器（例如，塑料组织培养皿、纤连蛋白涂覆的塑料制品等）的表面上，并且形成单层。
在合适条件下培养时，在此提供的含有胎盘细胞的分离的胎盘细胞群形成胚胎样小体，即，生长于贴壁干细胞层顶部的立体细胞簇。胚胎样小体中的细胞表达与非常早期的干细胞有关的标记物，例如，OCT-4、Nanog、SSEA3和SSEA4。胚胎样小体中的细胞一般不像在此描述的胎盘细胞那样贴壁到培养基材上，而是在培养中保持附着于贴壁细胞上。胚胎样小体细胞依赖贴壁胎盘细胞存活，因为在不存在贴壁干细胞时胚胎样小体不能形成。因此，贴壁胎盘细胞有利于一种或多种胚胎样小体在含有该贴壁胎盘细胞的胎盘细胞群中的生长。不希望受限于理论，胚胎样小体的细胞被认为是生长在贴壁胎盘细胞上，如同胚胎干细胞生长在饲养层细胞上一样。间质干细胞，例如，骨髓来源的间质干细胞，在培养中不发展成胚胎样小体。
5.5.5分化
在此提供的在CNS损伤例如（SCI或TBI）治疗方法中有用的胎盘细胞在某些实施方式中可分化为不同的定向细胞谱系。例如，在某些实施方式中，胎盘细胞可分化为脂肪形成的、软骨形成的、神经原的或成骨性细胞谱系。分化可通过例如本领域公知的任何方法进行，例如，骨髓来源的间质干细胞分化为类似细胞谱系，或通过本文其它位置描述的方法进行。将胎盘细胞分化为特定细胞谱系的具体方法公开于，例如，美国专利号7,311,905和美国专利申请公开号2007/0275362，其公开内容全文引入作为参考。
在此提供的胎盘细胞可以表现出体外、体内、或体内外分化为特定细胞谱系的能力。在一个具体的实施方式中，在此提供的胎盘细胞可在体外导致或促进分化的条件下分化为特定细胞谱系，但不能发生可检测的体内分化，例如，在NOD-SCID小鼠模型中。
5.6获得胎盘细胞的方法
5.6.1干细胞收集组合物
胎盘细胞可以根据在此提供的方法进行收集和分离。一般，干细胞是使用生理学可用的溶液（例如，细胞收集组合物）从哺乳动物胎盘获得的。在相关的美国专利申请公开No.2007/0190042（发明名称为“ImprovedComposition for Collecting and Preserving Placental cells and Methods of Usingthe Composition”，申请日2005年12月29日）中详细说明了干细胞收集组合物。
干细胞收集组合物可以包括适合于细胞（例如，本文所述的分离的胎盘干细胞）收集和/或培养的任何生理学可用的溶液，例如，盐溶液（例如，磷酸盐缓冲盐水、克氏液、改良的克氏液、伊格尔氏溶液、0.9%NaCl等）、培养基（例如，DMEM、H.DMEM等）等。
干细胞收集组合物可以包含趋于维持胎盘细胞的一种或多种成分，即在从收集到培养期间防止胎盘细胞死亡或延缓胎盘细胞死亡、减少细胞群体中死亡的胎盘细胞的数目等。这些成分可以是（例如）细胞凋亡抑制剂（例如，半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂或JNK抑制剂）；血管扩张剂（例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠尿肽（ANP）、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼屈嗪、三磷腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等）；坏死抑制剂（例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐或氯硝西泮）；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳（例如，全氟辛基溴化物、全氟癸基溴化物等）。
干细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶等。这些酶包括（但不限于）胶原酶（例如，胶原酶I、II、III或IV、得自溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum）的胶原酶等）；分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性酶、胰蛋白酶、释放酶、玻璃酸酶等。
干细胞收集组合物可以包含杀菌或细菌抑制有效量的抗生素。在某些非限制性实施方式中，所述抗生素是大环内酯（例如，妥布霉素）、头孢菌素（例如，头孢氨苄、环己烯胺头孢菌素、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄）、克拉霉素、红霉素、青霉素（例如、青霉素V）或喹诺酮（例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星）、四环素、链霉素等。在具体的实施方式中，所述抗生素对革兰氏（+）和/或革兰氏（-）细菌是有活性的，例如，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。
干细胞收集组合物还可以包含一种或多种下列化合物：腺苷（约1mM至约50mM）；D-葡萄糖（约20mM至约100mM）；镁离子（约1mM至约50mM）；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一种实施方式中，其以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在（例如，合成或天然存在的胶体，如葡聚糖的多糖或聚乙二醇，其以约25g/l至约100g/l或者约40g/l至约60g/l存在）；抗氧化剂（例如，丁基羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，其以约25mM至约100mM存在）；还原剂（例如，以约0.1mM至约5mM存在的N-乙酰半胱氨酸）；防止钙进入细胞的试剂（例如，以约2mM至约25mM存在的维拉帕米）；硝酸甘油（例如，约0.05g/L至约0.2g/L）；抗凝剂，在一种实施方式中，其以足以帮助防止残余血液凝结的量存在（例如，以约1,000单位/升至约100,000单位/升的浓度存在的肝素或水蛭素）；或含有阿米洛利的化合物（例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，其以约1.0M至约5M存在）。
5.6.2胎盘的收集和处理
一般地，在分娩后胎盘娩出后不久回收人胎盘。在优选的实施方式中，在知情同意后并且在获得患者的完整病历并且该病历与胎盘有关后从患者回收胎盘。优选地，病历在产后连续。该病历可用于配合由此收获的胎盘或干细胞的后续使用。例如，根据病历，人胎盘干细胞可用于与胎盘有关的婴儿或者婴儿的父母、兄弟或其他亲属的个人化医学。
在胎盘细胞的回收之前除去脐带血和胎盘血。在某些实施方式中，产后回收胎盘中的脐带血。可以对胎盘进行常规脐带血回收过程。通常，借助于重力使用针或插管对胎盘抽血（参见，例如，Anderson，美国专利No.5372581；Hessel等人，美国专利No.5415665）。通常将针或插管置于脐静脉中，并且可以轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘中排出脐带血。可以通过商业进行这种脐带血回收，例如，LifeBank Inc.、Cedar Knolls,N.J.、ViaCord、Cord Blood Registry和Cryocell。优选地，将胎盘重力放血而无需其他操作从而使脐带血回收期间的组织破环程度最小。
通常，将胎盘从分娩或生产房间输送到另一个位置（例如，实验室）以用于通过（例如）灌注或组织解离的脐带血回收和胎盘干细胞收集。优选地，将胎盘在无菌、隔热的输送装置（将胎盘温度维持在20-28℃之间）中输送，例如，通过将近端脐带夹紧的胎盘置于无菌自封塑料袋中，然后置于保温容器中。在另一种实施方式中，在基本如未决美国专利No.7147626（申请日2005年9月19日）中所述的脐带血收集试剂盒中输送胎盘，该专利的公开内容作为参考并入本文。优选地，在分娩后的4至24小时将胎盘输送到实验室。在某些实施方式中，在脐带血回收之前将近端脐带夹紧，优选地，在胎盘中插入的4-5cm（厘米）内。在其他实施方式中，在脐带血回收后但在胎盘的其他处理前将近端脐带夹紧。
在干细胞收集前，可以将胎盘储存在无菌条件下和室温或5℃至25℃的温度下。在灌注胎盘以除去任何残留脐带血之前，可以将胎盘储存多于48小时，优选的4至24小时的一段时间。在一种实施方式中，在娩出后约0小时至约2小时收获胎盘。优选地，将胎盘在5℃至25℃的温度下储存在抗凝剂溶液中。适合的抗凝剂溶液在本领域中是熟知的。例如，可以使用肝素或华法令钠溶液。在优选的实施方式中，所述抗凝剂溶液包括肝素溶液（例如，1:1000溶液中的1%（w/w））。优选地，在收集胎盘干细胞之前将放血的胎盘储存不超过36小时。
一旦一般地如上所述收集并制备，则可以采用任何本领域已知的方式（例如，可以灌注或破坏，例如，用一种或多种组织破坏酶消化）处理哺乳动物胎盘或其部分以获得干细胞。
5.6.3胎盘组织的物理破环和酶促消化
在一种实施方式中，通过对器官进行例如酶促消化的物理破环来从哺乳动物胎盘中收集干细胞，例如，使用5.3.1节描述的干细胞收集组合物。例如，可以（例如）将胎盘或其部分挤压、剪切、剁碎、切块、切碎、浸软等，其中与例如缓冲液、培养基或干细胞收集组合物接触，随后使用一种或多种酶消化组织。然后，可以培养组织以获得胎盘细胞群体。胎盘或其部分也可以被物理破环和使用一种或多种酶进行消化，然后将得到的材料进入或混合入缓冲液、培养基或干细胞收集组合物。可以使用任何物理破环方法，但前提条件是所述破环方法在所述器官中留下多个，更优选地大多数，并且更优选地至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的活细胞，如通过（例如）台盼蓝排阻法可确定的。
在物理破环和/或酶促消化以及干细胞回收之前，可以将胎盘切成部分。例如，可以从羊膜、绒毛膜、胎盘绒毛叶或其任意组合或脐带或其任意组合中获得胎盘细胞。优选的，胎盘细胞获得自含有羊膜和绒毛膜、或羊膜-绒毛膜和脐带的胎盘组织。在一个实施方式中，干细胞获得自约1:1重量比的羊膜-绒毛膜和脐带。一般，可以通过小块胎盘组织（例如，体积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米的胎盘组织块）的破环获得胎盘细胞。
优选的干细胞收集组合物包含一种或多种组织破坏酶。酶促消化优选的使用酶的组合，例如，基质金属蛋白酶和中性蛋白酶的组合，例如胶原酶和分散酶的组合。在一个实施方式中，胎盘组织的酶促消化使用基质金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘多糖酶的组合用于透明质酸的消化，例如胶原酶、分散酶和玻璃酸酶的组合或释放酶(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.)和玻璃酸酶的组合。其它可以用于破坏胎盘组织的酶包括木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、分散酶或弹性酶。可以通过血清中的α2微球蛋白抑制丝氨酸蛋白酶，因此用于消化的媒介通常是不含血清的。通常在酶消化程序中使用EDTA和脱氧核糖核酸酶以提高细胞回收的效率。优选地，稀释消化物以避免将细胞限制在粘稠的消化液内。
可以使用组织消化酶的任意组合。组织消化酶的一般浓度包括，例如胶原酶I和胶原酶IV为50-200U/mL，分散酶为1-10U/mL，以及弹性蛋白酶10-100U/mL。蛋白酶可以组合使用，即在相同消化反应中使用两种或更多种蛋白酶，或者可以顺序使用以释放胎盘细胞。例如，在一种实施方式中，首先用适量的2mg/ml胶原酶I将胎盘或其部分消化30分钟，然后以约0.25%的浓度使用胰蛋白酶在37℃消化10分钟。优选地，在使用其他酶之后，连续使用丝氨酸蛋白酶。
在另一种实施方式中，还可以通过将螯合剂（例如，乙二醇双(2-氨基乙醚)-N,N,N'N'-四乙酸（EGTA）或乙二胺四乙酸（EDTA））加入至包含干细胞的干细胞收集组合物中，或者加入到其中在胎盘干细胞的分离之前用干细胞收集组合物破坏和/或消化组织的溶液中来破坏组织。
将理解当整个胎盘或胎盘的一部分包含胎儿和母体细胞两者时（例如，当胎盘的一部分包含绒毛膜或绒毛叶时），所收集的胎盘细胞可以包含来源于胎儿和母体来源两者的胎盘干细胞的混合。当胎盘的一部分不包含或包含数目可忽略的母体细胞（例如，羊膜）时，由此胎盘细胞将几乎只包含胎儿胎盘干细胞。
5.6.4胎盘灌注
还可以（例如）部分通过哺乳动物胎盘的灌注分离胎盘细胞，例如，胎盘干细胞(PDAC)。例如，在Hariri的美国专利申请No.2002/0123141和相关的美国临时申请No.60/754,969（发明名称为“Improved Composition forCollecting and Preserving Placental cells and Methods of Using theComposition”，申请日2005年12月29日）中公开了灌注哺乳动物胎盘以获得胎盘干细胞的方法。
可以通过使用（例如）干细胞收集组合物作为灌注溶液（例如）通过胎盘脉管系统灌注来收集胎盘干细胞。在一种实施方式中，通过将灌注溶液穿过脐动脉和脐静脉之一或两者来灌注哺乳动物胎盘。可以使用（例如）重力流动至胎盘来完成通过胎盘的灌注溶液的流动。优选地，使用泵（例如，蠕动泵）迫使灌注溶液通过胎盘。可以（例如）用连接到无菌连接装置（如，无菌管）的插管（例如，
Figure GDA0000408263340000621
或塑料插管）插入脐静脉。将无菌连接装置连接到灌注歧管。
在为灌注做准备时，优选地以使脐动脉和脐静脉位于胎盘最高点的方式定向（例如，悬挂）胎盘。可以通过将灌注液体（例如，在此提供的干细胞收集组合物）穿过胎盘脉管系统或穿过胎盘脉管系统和周围组织来灌注胎盘。在一种实施方式中，例如，同时将脐动脉和脐静脉连接至（例如）通过挠性连接器连接至灌注溶液储罐的吸移管。将灌注溶液通过至脐静脉和动脉。灌注溶液从血管壁流出和/或穿过血管壁至胎盘的周围组织，并且从连接至妊娠期间的母体子宫的胎盘表面收集至适合的开放容器中。还可以将灌注溶液引入通过脐带开口并允许从与母体子宫壁连接的胎盘壁中的开口中流出或渗出。在另一个实施方式中，将灌注液体穿过脐静脉并从脐动脉收集或者将灌注液体穿过脐动脉并从脐静脉收集。
在一种实施方式中，在灌注期间将近端脐带夹紧，并且更优选地，在胎盘中脐带插入的4-5cm（厘米）内夹紧近端脐带。
一般地，放血过程中来自哺乳动物胎盘的第一次收集的灌注液被脐带血和/或胎盘血的残留红细胞染色。随着灌注的进行，灌注液变得更无色并且残留的脐带血细胞被清洗出胎盘。一般地，30ml至100ml（毫升）的灌注液满足了初始对胎盘的放血，但是根据观察结果可以使用更多或更少的灌注液。
可以根据要收集的细胞数目、胎盘的尺寸、对单个胎盘进行收集的次数等改变用于分离胎盘干细胞的灌注液的量。在多个实施方式中，灌注液的量可以为50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL或者750mL到2000mL。通常，在放血后用700-800mL的灌注液灌注胎盘。
可以在几小时或几天的过程中对胎盘灌注多次。当将胎盘灌注多次时，可以将其在无菌条件下在容器或其他适合的器皿中维持或培养，并用干细胞收集组合物或标准灌注溶液（例如，生理盐溶液，如加入或未加入抗凝剂（例如，肝素、华法令钠、香豆素、双香豆素）和/或加入或未加入抗微生物剂（例如，β-巯基乙醇（0.1mM）；抗生素，如链霉素（例如，40-100μg/ml）、青霉素（例如，40U/ml）、两性霉素B（例如，0.5μg/ml））的磷酸盐缓冲盐水（“PBS”））灌注。在一种实施方式中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌注液，从而在灌注液的灌注和收集之前将该胎盘维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者2或3或更多天。可以将灌注的胎盘维持额外的一次或多次，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个小时，并用（例如）700-800mL灌注液灌注第二次。可以将胎盘灌注1、2、3、4、5或更多次，例如，每1、2、3、4、5或6小时一次。在优选的实施方式中，重复胎盘的灌注和灌注溶液（例如，干细胞收集组合物）的收集直至回收的有核细胞的数目低于100个细胞/毫升。可以在不同的时间点分别进一步处理灌注液以回收时间依赖的细胞（例如，干细胞）群体。还可以将来自不同时间点的灌注液混合。
不希望受限于任何理论，在对胎盘放血和足够时间的灌注后，胎盘细胞被认为迁移至放血的和灌注的胎盘微循环中，在此它们被收集起来，优选的通过灌注冲洗进入收集容器中。灌注分离的胎盘不仅帮助去除残余的脐带血，还给胎盘提供合适的营养物，包括氧气。可以使用与去除残余的脐带血所使用的相似的溶液培养和灌注胎盘，优选的，不添加抗凝剂。
与不采用所述溶液灌注和不用其它方式(例如，通过组织破坏，例如，酶促消化)处理哺乳动物胎盘所获得的干细胞数相比，在此描述的灌注能收集到明显更多的胎盘细胞。在上下文中，“明显更多的”表示至少多10%。较之从培养胎盘或其部分中可获得的胎盘细胞数而言，灌注产生明显更多的胎盘细胞。
可以通过用包含一种或多种蛋白酶或其他组织破坏酶的溶液灌注来将胎盘干细胞与胎盘分离。在具体的实施方式中，使胎盘或其部分（例如，羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或胎盘绒毛叶、脐带或任何上述部分的组合）恢复至25-37℃，并在200mL培养基中与一种或多种组织破坏酶培育30分钟。收集来自灌注液的细胞，使其恢复至4℃，并用包含5mM EDTA、2mM二硫苏糖醇和2mMβ-巯基乙醇的冷抑制剂混合物清洗。几分钟后，用冷的（例如，4℃)干细胞收集组合物清洗胎盘干细胞。
将理解使用盘法（pan method，即，其中在灌注液从胎盘母体侧流出后收集灌注液）的灌注导致产生了胎儿和母体细胞的混合。因此，通过该方法收集的细胞可以包含胎儿和母体来源的胎盘细胞的混合群体。相反，仅通过胎盘脉管系统的灌注（其中灌注液通过一个或两个胎盘血管并仅通过剩余的血管收集）导致收集了几乎只有胎儿来源的胎盘细胞群体。
5.6.5胎盘干细胞的分离、分选和鉴别
开始，可以通过Ficoll梯度离心从其他细胞纯化（即，分离）无论是通过灌注还是通过酶促消化获得的胎盘细胞。这种离心作用可以按照对于离心速度等的任何标准规程进行。在一种实施方式中，例如，通过在室温下以5000×g离心15分钟从灌注液回收了收集自胎盘的细胞，该离心作用将细胞与（例如）污染碎片和血小板分离。在另一种实施方式中，将胎盘灌注液浓缩至约200ml，轻轻地在聚蔗糖上方成层，并在22℃以约1100×g离心20分钟，并且收集细胞的低密度中间层以用于其他处理。
可以将细胞颗粒在新鲜的干细胞收集组合物中或者在适合于干细胞维持的培养基（例如，含有2U/ml肝素和2mM EDTA的IMDM无血清培养基（GibcoBRL,NY））中再悬浮。可以（例如）根据生产商推荐的程序使用Lymphoprep（Nycomed Pharma,Oslo,Norway）分离总单核细胞部份。
在此使用的“分离的”胎盘细胞，例如，胎盘干细胞(PDAC)表示去除至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的细胞，在完整的哺乳动物胎盘中所述细胞与干细胞通常是关联的。当来自器官的干细胞存在于其中含有少于50%的在完整的哺乳动物胎盘中与干细胞通常是关联的细胞的细胞群时，所述干细胞是“分离的”。
可以通过使用（例如）含有0.2%EDTA（Sigma,St.Louis MO）的0.05%的胰蛋白酶溶液的差异胰酶消化进一步或初始分离通过灌注或消化获得的胎盘干细胞。差异胰酶消化是可能的，因为胎盘细胞(PDAC)通常在约5分钟内从塑料表面上分开，而其他贴壁群体通常需要20-30分钟以上的培育。可以在胰酶消化和使用（例如）胰蛋白酶中和溶液（TNS,Cambrex）的胰蛋白酶中和后收获分开的胎盘干细胞。在贴壁细胞分离的一种实施方式中，将细胞等份（例如，约5-10×106个细胞）分别置于几个T-75烧瓶中，优选地纤连蛋白涂覆的T75烧瓶。在这种实施方式中，可以用可商购的间质干细胞生长培养基（MSCGM）（Cambrex）培养细胞并将其置于组织培养箱（37℃，5%的CO2）中。10至15天后，通过用PBS清洗从烧瓶中除去非贴壁细胞。然后，用MSCGM替代PBS。优选的每天检查烧瓶是否存在不同的贴壁细胞种类，且特别的，检查成纤维样细胞簇的鉴别和扩张。
可以（例如）通过使用标准细胞检测技术（如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学（例如，用组织特异或细胞标志物特异的抗体染色）、荧光激活细胞分选（FACS）、磁性激活细胞分选（MACS））测量形态和细胞表面标志物的变化，通过使用光学或共聚焦显微镜检查法检查细胞形态和/或通过使用本领域中熟知的技术（如PCR和基因表达谱）测量基因表达的变化来监测从哺乳动物胎盘收集的细胞的数目和类型。这些技术也可以用于鉴别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞。例如，使用抗CD34抗体，使用上述技术可以确定细胞是否包含可检测数量的CD34；如果是，则该细胞是CD34+。同样，如果细胞产生通过RT-PCR可检测的足够的OCT-4或者产生比成体细胞显著更多的OCT-4，则该细胞是OCT-4+。抗细胞表面标志物（例如，CD标志物，如CD34）的抗体和干细胞特异基因（如OCT-4）的序列在本领域中是熟知的。
可以使用（例如）荧光激活细胞分选仪（FACS）分选胎盘干细胞，特别是已通过聚蔗糖分离、差异贴壁或两者组合分离的细胞。荧光激活细胞分选（FACS）是根据颗粒的荧光性能分离包括细胞在内的颗粒的熟知方法（Kamarch,1987,Methods Enzymol,151:150-165）。在个体粒子中的荧光基团激光激发产生允许从混合物中电磁分离正负颗粒的微小电荷。在一种实施方式中，用不同的荧光标记物标记细胞表面标志物特异的抗体或配体。通过细胞分选仪处理细胞，从而允许根据它们与所使用的抗体结合的能力分离细胞。可以将FACS分选的颗粒直接沉积到96孔板或384孔板的各个孔中以有利于分离和克隆。
在一个分选方案中，根据标志物CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD105、OCT-4和/或HLA-G的表达分选胎盘干细胞。这可以与根据它们在培养中的贴壁性能选择这些细胞的程序结合完成。例如，可以在根据标志物表达的分选之前或之后完成组织培养贴壁选择。在一种实施方式中，例如，首选根据它们的CD34表达分选细胞；CD34–细胞被保留，而CD200+HLA-G+细胞被与所有其他CD34–细胞分离。在另一种实施方式中，根据它们的CD200和/或HLA-G表达分选来自胎盘的细胞；例如，将显示出上述任一标志物的细胞分离用于其他用途。在具体的实施方式中，可以根据它们的CD73和/或CD105表达，或者通过抗体SH2、SH3或SH4识别的表位，或者CD34、CD38或CD45表达的缺少进一步分选表达（例如）CD200和/或HLA-G的细胞。例如，在另一种实施方式中，通过CD200，HLA-G、CD73、CD105、CD34、CD38和CD45的表达或表达缺少来分选胎盘细胞，并且将作为CD200+，HLA-G-、CD73+、CD105+、CD34-、CD38–和CD45–的胎盘细胞与其他胎盘细胞分离以用于其他用途。
在另一种实施方式中，可以使用磁珠分离细胞。可以使用磁性激活细胞分选（MACS）技术对细胞进行分选，该技术是基于它们结合磁珠（0.5-100μm直径）的能力分离颗粒的方法。可以对磁性微球体进行多种有用的修饰，其包括特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体的共价加成。然后，将珠与细胞混合以使其结合。然后，将细胞通过磁场以分离出具有特异性细胞表面标志物的细胞。在一种实施方式中，然后可以将这些细胞分离并与和抗其他细胞表面标志物的抗体结合的磁珠再混合。将这些细胞再次通过磁场，从而分离出与两种抗体结合的细胞。然后，可以将这些细胞稀释至单独的盘中，如用于无性系分离的微量滴定盘。
还可以根据细胞形态和生长特征来鉴别和/或分选胎盘细胞。例如，可以将培养中的胎盘细胞鉴别为具有（例如）成纤维样外观和/或根据（例如）成纤维样外观进行选择。还可以将胎盘细胞鉴定为具有形成胚胎样小体的能力和/或根据它们形成胚胎样小体的能力进行选择。在一种实施方式中，例如，将处于成纤维样形状，表达CD73和CD105并且在培养中产生一个或多个胚胎样小体的胎盘干细胞与其他胎盘细胞分离。在另一种实施方式中，将在培养中产生一个或多个胚胎样小体的OCT-4+胎盘细胞与其他胎盘细胞分离。
在另一个实施方式中，胎盘细胞可通过集落生成单位分析进行鉴定和表征。集落生成单位分析是本领域公知的，例如Mesen CultTM培养基(StemCell Technologies,Inc.,Vancouver British Columbia)
可以使用本领域中已知的标准技术对胎盘细胞测定活力、增殖潜能和寿命，所述标准技术如台盼蓝排阻测定、荧光素二乙酸酯吸收测定、碘化丙啶吸收测定（以评价活力）；和胸苷吸收测定、MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物）细胞增殖测定（以评价增殖）。可以通过本领域中熟知的方法确定寿命，如通过确定扩大培养中群体倍增的最大次数。
还可以使用本领域中已知的其他技术将胎盘细胞与其他胎盘细胞分离，所述技术例如所需细胞的选择性生长（阳性选择）、不希望的细胞的选择性破坏（阴性选择）；基于混合群体中差异细胞可凝集性的分离，如（例如）使用大豆凝集素；冻融程序；过滤；常规和区带离心；离心淘选（逆流离心作用）；单位重力分离；逆流分配；电泳等。
5.7胎盘细胞的培养
5.7.1培养基
可以将分离的胎盘细胞或胎盘细胞群或从中生长出胎盘干细胞的胎盘组织用于起始或接种胎盘干细胞的培养。一般将细胞转移至未用胞外基质或配体涂覆或用其涂覆的无菌组织培养容器中，所述胞外基质或配体如层粘连蛋白、胶原（例如，天然或变性）、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白和胞外膜蛋白（例如，MATRIGEL（BD Discovery Labware,Bedford,Mass.））。
可以在本领域中认为是对干细胞培养可用的任何培养基中和任何条件下培养分离的胎盘细胞。优选地，所述培养基包含血清。胎盘细胞可以在（例如）含有ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）、LA+BSA（亚油酸-牛血清白蛋白）、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF、IGF-1和青霉素/链霉素的DMEM-LG（达尔伯克氏改良基础培养基，低葡萄糖）/MCDB201（小鸡成纤维细胞基础培养基）；包含10%胎牛血清（FBS）的DMEM-HG（高葡萄糖）；包含15%FBS的DMEM-HG；包含10%FBS、10%马血清和氢化可的松的IMDM（伊思考夫改良达尔伯克氏培养基)；包含10%FBS、EGF和肝素的M199；包含10%FBS、GlutaMAXTM和庆大霉素的α-MEM（最低必需培养基）；包含10%FBS、GlutaMAXTM和庆大霉素的DMEM等。优选的培养基是含有2%FBS、ITS、LA+BSA、葡萄糖、L-抗坏血酸、PDGF、EGF和青霉素/链霉素的DMEM-LG/MCDB-201。
可用于培养胎盘细胞的其他培养基包括DMEM（高或低葡萄糖）、伊格尔基础培养基、汉姆氏F10培养基（F10）、汉姆氏F-12培养基（F12）、伊思考夫改良的达尔伯克氏培养基、间质干细胞生长培养基（MSCGM）、莱博维茨L-15培养基（Liebovitz's L-15medium）、MCDB、DMEM/F12、RPMI1640、高级DMEM（Gibco）、DMEM/MCDB201（Sigma）和CELL-GRO FREE。
所述培养基可以单独或组合补充一种或多种成分，其包括（例如）血清（例如，胎牛血清（FBS），优选地约2-15%（v/v）；马（马）血清（ES）；人血清（HS））；β-巯基乙醇（BME），优选地约0.001%（v/v）；一种或多种生长因子，例如，血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、白血病抑制因子（LIF）、血管内皮生长因子（VEGF）和促红细胞生成素（EPO）；氨基酸，其包括L-缬氨酸；和控制微生物污染的一种或多种抗生素和/或抗霉菌剂，如（例如）单独或组合的青霉素、链霉素硫酸盐、两性霉素B、庆大霉素和制霉菌素。
5.7.2胎盘干细胞的扩增和增殖
一旦胎盘细胞或细胞群已分离（例如，与至少50%的干细胞在体内与之正常相连的胎盘细胞分离），则所述细胞或细胞群体可以体外增殖和扩增。例如，可以在组织培养容器（例如，盘、烧瓶、多孔板等）中将分离的胎盘干细胞培养足以使所述细胞增殖至70-90%汇合（即，直至所述细胞以及它们的子代占据组织培养容器的培养表面积的70-90%）的一段时间。
可以将胎盘细胞以允许细胞生长的密度接种到培养容器中。例如，可以将细胞以低密度（例如，约1000至约5000个细胞/平方厘米）至高密度（例如，约50,000个细胞/平方厘米或以上）接种。在优选的实施方式中，在空气中存在约0至约5体积%的CO2的情况下培养细胞。在一些优选的实施方式中，将细胞在空气中约2至约25%的O2的情况下培养，优选地，在空气中约5至约20%的O2的情况下培养。优选地，将细胞在约25℃至约40C培养，优选地，在37℃培养。优选地，将细胞在培育箱中培养。培养基可以是静止的或搅拌的，例如，使用生物反应器。在某些实施方式中，胎盘干细胞在低氧胁迫（例如，加入谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、维生素E、N-乙酰半胱氨酸等）条件下生长。
一旦获得70%至90%的汇合，则细胞可以传代。例如，可以使用本领域中公知的技术对细胞进行酶促处理（例如，胰蛋白酶化）以将它们从组织培养表面上分离。通过吸取除去细胞并对细胞计数后，将约20,000-100,000干细胞，优选的约50,000干细胞传代至含有新鲜培养基的新培养容器中。通常，新的培养基与从中除去胎盘细胞的培养基的类型相同。在此提供的胎盘细胞可以传代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次，及其组合。
5.7.3胎盘细胞群
在某些实施方式中，在本文所述的治疗方法使用胎盘细胞群体。胎盘细胞群体可以直接从一个或多个胎盘中分离；即，所述细胞群体可以是包含分离的胎盘细胞的胎盘细胞群体，其中所述胎盘细胞得自或包含在灌注液内，或者得自或包含在胎盘组织消化物（即，通过胎盘或其部分的酶促消化获得的细胞收集物）内。还可以培养并扩增本文所述的分离的胎盘细胞以产生胎盘细胞群体。还可以培养并扩增包含胎盘细胞(例如，PDAC)的胎盘细胞群体以产生胎盘干细胞群体，例如，含有PDAC或PDAC群的胎盘细胞群。
在此描述的胎盘细胞群含有胎盘细胞，例如，如在此描述的胎盘细胞(例如，PDAC)。在多个实施方式中，分离的胎盘细胞群体中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的细胞是所述胎盘细胞。也就是说，胎盘干细胞群体可以包含（例如）多至1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的非干细胞。
在此提供了通过（例如）选择表达特定标志物和/或特定培养或形态特征的胎盘干细胞而无论其来源于酶促消化或灌注来产生分离的胎盘细胞群的方法。在一个实施方式中，例如，细胞群可以通过以下方法生产，包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上和(b)表达CD200且不表达HLA-G；且从其他细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一个实施方式中，生产细胞群的方法包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上和(b)表达CD73、CD105和CD200；且从其他细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一个实施方式中，生产细胞群的方法包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上和(b)表达CD200和OCT-4；且从其他细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一个实施方式中，生产细胞群的方法包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达CD73和CD105和(c)当含有所述干细胞的胎盘细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；且从其他细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一个实施方式中，生产细胞群的方法包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上和(b)表达CD73和CD105和不表达HLA-G；且从其他细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在另一个实施方式中，生产细胞群的方法包括选择胎盘细胞，其(a)附着到基质上，(b)表达OCT-4和(c)当含有所述干细胞的胎盘细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；且从其他细胞中分离所述细胞以形成细胞群。在任何上述实施方式中，该方法可以另外包含选择性表达ABC-p（胎盘特异性ABC转运蛋白；参见，例如Allikmets等人，Cancer Res.58(23):5337-9(1998)）的胎盘干细胞。所述方法还可以包括选择表现出对（例如）间质干细胞特异的至少一种特性，例如，CD29的表达、CD44的表达、CD90的表达或上述组合的表达）的细胞。
在上述实施方式中，所述基材可以是在其上可以完成细胞（例如，胎盘干细胞）的培养和/或选择的任何表面。通常，所述基材是塑料制品，例如，组织培养盘或塑料多孔板。可以用生物分子（例如，层粘连蛋白或纤连蛋白）涂覆组织培养塑料制品。
可以通过细胞选择领域中已知的任何方式为胎盘细胞群选择细胞，例如，胎盘干细胞。例如，可以在（例如）流式细胞术或FACS中使用抗一种或多种细胞表面标志物的抗体选择细胞。可以使用与磁珠结合的抗体完成选择。对某些干细胞相关标志物特异的抗体在本领域中是已知的。例如，抗OCT-4（Abcam,Cambridge,MA）、CD200（Abcam）、HLA-G（Abcam）、CD73（BD Biosciences Pharmingen,San Diego,CA）、CD105（Abcam;BioDesign International,Saco,ME）等的抗体。抗其他标志物的抗体也是可商购的，例如，购自（例如）StemCell Technologies或BioDesign International的CD34、CD38和CD45。
分离的胎盘细胞群体可以包含非干细胞的胎盘细胞或非胎盘细胞的细胞。
分离的胎盘细胞群体可以与一个或多个非干细胞或非胎盘细胞群体混合。例如，可以将胎盘细胞群体与血液（例如，胎盘血或脐带血）、血液来源的干细胞（例如，来源于胎盘血或脐带血的干细胞）、血液来源的有核细胞群体、骨髓来源的间充质细胞、骨来源的干细胞群体、粗骨髓、成体（体细胞）干细胞、包含在组织内的干细胞群体、培养的干细胞、完全分化的细胞（例如，软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌细胞、心肌细胞等）的群体等混合。在具体的实施方式中，在本文所述的方法和组合物中有用的细胞群体包含胎盘细胞和分离的脐带干细胞。通过比较每个群体中总有核细胞的数目，可以将胎盘细胞群体中的细胞与另一类型的多个细胞以约100000000:1、50000000:1、20000000:1、10000000:1、5000000:1、2000000:1、1000000:1、500000:1、200000:1、100000:1、50000:1、20000:1、10000:1、5000:1、2000:1、1000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1；1:2；1:5；1:10；1:100；1:200；1:500；1:1000；1:2000；1:5000；1:10000；1:20000；1:50000；1:100000；1:500000；1:1000000；1:2000000；1:5000000；1:10000000；1:20000000；1:50000000；或约1:100000000的比值混合，其中对比每个细胞群中的有核细胞总数。也可以将分离的胎盘细胞群体中的细胞与多种细胞类型的多个细胞混合。
在一种实施方式中，将胎盘细胞群体与多个造血干细胞混合。这些造血干细胞可以（例如）包含在未处理的胎盘、脐带血或周围血液中；来自胎盘血、脐带血或周围血液的所有有核细胞中；来自胎盘血、脐带血或周围血液的分离的CD34+细胞群体中；未处理的骨髓中；来自骨髓的所有有核细胞中；来自骨髓的分离的CD34+细胞群体中等。
5.8胎盘干细胞的保存
可以保存胎盘细胞（例如，如上所述的胎盘细胞），即可以将它们置于使其长期保存的条件或抑制通过（例如）细胞凋亡或坏死的细胞死亡的条件下。
可以使用（例如）包含细胞凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物来保存胎盘干细胞，如相关美国临时申请No.60/754,969（发明名称“Improved Composition for Collecting and Preserving Placental cells andMethods of Using the Composition”，申请日2005年12月25日）所述。在一种实施方式中，在此提供了一种保存胎盘干细胞群体的方法，包括将所述细胞群体与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的干细胞收集组合物接触，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触细胞凋亡抑制剂的细胞群体相比足以降低或防止细胞群体中细胞凋亡的量和时间存在。在具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂。在另一种具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂是JNK抑制剂。在另一种具体的实施方式中，所述JNK抑制剂不调节所述细胞的分化或增殖。在另一种实施方式中，所述干细胞收集组合物包含处于分离的相的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述干细胞收集组合物包含处于乳液中的所述细胞凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一种实施方式中，所述干细胞收集组合物另外包含乳化剂，例如，卵磷脂。在另一种实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触时处于约0℃至约25℃之间。在另一种具体的实施方式中，所述细胞凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与干细胞接触时处于约2℃至10℃之间，或者约2℃至约5℃之间。在另一种具体的实施方式中，在所述干细胞群体的输送期间进行所述接触。在另一种具体的实施方式中，在所述干细胞群体的冻融期间进行所述接触。
在另一个实施方式中，可以通过（例如）包括将所述干细胞群体与细胞凋亡抑制剂和器官保存化合物接触的方法来保存胎盘细胞群体，其中所述细胞凋亡抑制剂以与未接触细胞凋亡抑制剂的干细胞群体相比足以降低或防止所述干细胞群体中细胞凋亡的量和时间存在。在具体的实施方式中，所述器官保存化合物是UW溶液（如美国专利No.4,798,824中所述；也称为ViaSpan；参见Southard等人，Transplantation49(2):251-257(1990)）或在Stern等人，美国专利No.5,552,267中所述的溶液。在另一种实施方式中，所述器官保存化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或它们的组合。在另一种实施方式中，所述干细胞收集组合物另外包含处于两相或作为乳液的携氧全氟化碳。
在所述方法的另一种实施方式中，在灌注期间将胎盘细胞与包含细胞凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或它们的组合的干细胞收集组合物接触。在另一种实施方式中，在组织破环处理（例如，酶促消化）期间接触所述干细胞。在另一种实施方式中，在通过灌注收集后或在通过组织破环（例如，酶促消化）收集后，将胎盘干细胞与所述细胞收集化合物接触。
通常，在胎盘干细胞收集、富集和分离期间，优选地减少或消除由于缺氧和机械应力所造成的细胞胁迫。因此，在所述方法的另一种实施方式中，在收集、富集或分离期间将细胞或细胞（例如，胎盘干细胞）群体在所述保存期间在缺氧条件下暴露6小时以下，其中缺氧条件是低于正常血氧浓度的氧浓度。在另一种具体的实施方式中，在所述保存期间将所述细胞群体在所述缺氧条件下暴露两小时以下。在另一种具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间将所述细胞群体在所述缺氧条件下暴露1小时以下或30分钟以下或不暴露于缺氧条件。在另一个具体的实施方式中，在收集、富集或分离期间未将所述细胞群体不暴露于切应力。
在此描述的胎盘细胞可以在（例如）小容器（例如，安瓿）中的冷冻保存培养基中冷冻保存。适合的冷冻保存培养基包括（但不限于）包含（例如）生长培养基或细胞冷冻培养基（例如，可商购的细胞冷冻培养基，例如，C2695、C2639或C6039（Sigma））的培养基。冷冻保存培养基优选地包含约10%（v/v）浓度的DMSO（二甲亚砜）。冷冻保存培养基可以包含其他试剂，例如，勃脉力、含有或不含甘油的甲基纤维素。优选地，在冷冻保存期间将胎盘细胞以约1℃/min冷却。优选的冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃，优选的约-125℃至约-140℃。在融化使用前，可以将冷冻保存的细胞转移至液氮。在一些实施方式中，例如，一旦安瓿达到约-90℃，则将它们转移至液氮储存区。还可以使用速率控制的冰箱进行冷冻保存。优选地，在约25℃至约40℃的温度下，优选地在约37℃的温度下融化冷冻保存的细胞。
5.9胎盘细胞的使用
5.9.1包含胎盘细胞的组合物
在此提供的免疫抑制方法可以使用含有胎盘细胞或来自其中的生物分子的组合物。同样的，可以将胎盘干细胞与用于研究和治疗的任何生理学可用或医学可用的化合物、组合物或装置混合。
5.9.1.1冷冻保存的胎盘细胞
可以将在此描述的免疫抑制的胎盘细胞和细胞群保存（例如，冷冻保存）以备以后使用。用于细胞（如干细胞）冷冻保存的方法在本领域中是公知的。可以将胎盘细胞群体制备成易于施用至个体的形式。例如，在此描述的胎盘细胞或其细胞群可以包含在适合于医学使用的容器内。这种容器可以是（例如）无菌塑料袋、烧瓶、罐或从中可以容易地分配分离的胎盘细胞群体的其他容器。例如，所述容器可以是血袋或者是适合于液体静脉内施用至受者的其他可医用的塑料袋。优选地，所述容器是允许组合的细胞群冷冻保存的容器。
冷冻保存的免疫抑制的胎盘细胞群可以包含来源于单个供体或多个供体的分离的胎盘细胞。所述胎盘细胞群体可以是与预定受体完全HLA匹配的或者是部分或完全HLA不匹配的。
因此，在一个实施方式中，在此提供了一种存在于容器中的含有免疫抑制的胎盘细胞群的组合物。在具体的实施方式中，将干细胞群冷冻保存。在另一种具体的实施方式中，所述容器是袋、烧瓶或罐。在更具体的实施方式中，所述袋是无菌塑料袋。在更具体的实施方式中，所述袋适合于，允许或有利于所述胎盘细胞群的静脉内给药。所述袋可以包含互相连接以允许在施用之前或期间所述胎盘细胞和一种或多种其他溶液（例如，药物）混合的多个腔或隔室。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含有利于胎盘干细胞冷冻保存的一种或多种化合物。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘细胞包含在生理学可用的水溶液内。在另一种具体的实施方式中，所述生理学可用的水溶液是0.9%NaCl溶液。在另一种具体的实施方式中，所述分离的胎盘干细胞包含与所述胎盘干细胞受体HLA匹配的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述混合的细胞群体包含与所述胎盘干细胞受体至少部分HLA不匹配的胎盘干细胞。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘细胞来源于多个供体。
5.9.1.2药物组合物
可以将免疫抑制的胎盘细胞群体或包含胎盘细胞的细胞群体配制到用于体内使用的药物组合物中。这些药物组合物包含药物可用载体（例如，盐溶液或用于体内施用的其他可用的生理学可用溶液）中的胎盘细胞群体或含有胎盘细胞的细胞群体。在此提供的药物组合物可以包含本文其他处所述的任何胎盘细胞群或胎盘细胞种类。所述药物组合物可以包含胎儿、母体、或胎儿和母体两者的胎盘细胞。本文所提供的药物组合物还可以包含获自单个个体或胎盘或者获自多个个体或胎盘的胎盘细胞。
本文所提供的药物组合物可以包含任意数目的免疫抑制的胎盘细胞。例如，在多种实施方式中，单一单位剂量的胎盘细胞可以包含约，至少或不超过1x105、5x105、1x106、5x106、1x107、5x107、1x108、5x108、1x109、5x109、1x1010、5x1010、1x1011或更多胎盘细胞。
本文所提供的药物组合物包含含有50%或以上的活细胞的细胞群体（也就是说，所述群体中至少50%的细胞是功能性的或活的）。优选地，在所述群体中至少60%的细胞是有活力的。更优选地，在所述药物组合物中的所述群体中至少70%、80%、90%、95%或99%的细胞是有活力的。
本文所提供的药物组合物可以包含（例如）有利于移植的一种或多种化合物（例如，抗T细胞受体抗体、免疫抑制剂等）；稳定剂，如白蛋白、葡聚糖40、明胶、羟乙基淀粉等。
5.9.1.3胎盘细胞条件培养基
在此提供的胎盘细胞可用于生产免疫抑制的条件培养基，即，含有一种或多种由干细胞分泌或排出的对多个一种或多种类型的免疫细胞具有可检测的免疫抑制的生物分子的培养基。在各实施方式中，条件培养基含有其中胎盘细胞已生长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天的培养基。在其它实施方式中，条件培养基含有其中胎盘细胞生长至至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%汇合，或高达100%汇合的培养基。该条件培养基可用于支持分离的胎盘细胞群或另一种干细胞的培养。在另一个实施方式中，条件培养基含有其中胎盘细胞已经分化为成体细胞的培养基。在另一个实施方式中，条件培养基含有其中培养胎盘细胞和非胎盘细胞的培养基。
从而，在一个实施方式中，在此提供了含有来自胎盘细胞培养物的培养基的组合物，其中所述胎盘细胞(a)附着到基质上；(b)表达CD200且不表达HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73和CD105和不表达HLA-G，或表达CD73和CD105且在允许胚胎样小体形成的条件下培养含有胎盘细胞的胎盘细胞群时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体，或表达OCT-4且在允许胚胎样小体形成的条件下培养含有胎盘细胞的胎盘细胞群时有利于在胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体；且(c)在MLR分析中可检测地抑制CD4+或CD8+T细胞增殖，其中所述胎盘细胞培养物在所述培养基中已经培养了24小时或更多。在一个具体的实施方式中，组合物进一步含有多个所述胎盘细胞。在另一个具体的实施方式中，组合物含有多个非胎盘细胞。在一个更具体的实施方式中，所述非胎盘细胞含有CD34+细胞，例如，造血祖细胞，例如外周血造血祖细胞，脐带血造血祖细胞，或胎盘血造血祖细胞。非胎盘细胞还可以含有其它干细胞，例如间质干细胞，例如，骨髓来源的间质干细胞。非胎盘细胞也可以是一种或多种的成体细胞或细胞系。在另一个具体的实施方式中，组合物含有抗增殖试剂，例如，抗MIP-1α或抗MIP-1β抗体。
5.9.1.4包含胎盘细胞的基质
本文还提供了包含含有免疫抑制的胎盘细胞，例如，免疫抑制的胎盘干细胞群(例如，PDAC)的基质、水凝胶、支架等的组合物。
可以将本文所述的胎盘细胞接种到天然基质上，例如，胎盘生物材料，如羊膜材料。这种羊膜材料可以是（例如）直接从哺乳动物胎盘上切下的羊膜；固定或热处理的羊膜、基本干燥（即，<20%的H2O）的羊膜、绒毛膜、基本干燥的绒毛膜、基本干燥的羊膜和绒毛膜等。在Hariri的美国专利申请公开No.2004/0048796中描述了可以在其上接种胎盘细胞的优选的胎盘生物材料。
可以将本文所述的胎盘细胞悬浮在适合于（例如）注射的水凝胶溶液中。适合于这些组合物的水凝胶包括自组装肽，如RAD16。在一种实施方式中，可以使包含细胞的水凝胶溶液在（例如）模具中硬化以形成具有分散于其中的细胞的移植用基质。还可以培养该基质中的胎盘细胞从而使细胞在植入前通过有丝分裂扩增。水凝胶是（例如）通过共价键、离子键或氢键交联以产生捕获水分子以形成凝胶的立体开放网格结构的（天然或合成）有机聚合物。水凝胶形成材料包括多糖（如海藻酸盐及其盐）、肽、聚膦嗪和聚丙烯酸酯，它们通过阴离子交联或者是嵌段聚合物（如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物），其分别是通过温度或pH交联的。在一些实施方式中，所述水凝胶或基质是生物可降解的。
在一些实施方式中，所述制剂包括原位可聚合凝胶（参见，例如，美国专利申请公开2002/0022676；Anseth等人，J.Control Release,78(1-3):199-209(2002)；Wang等人，Biomaterials,24(22):3969-80(2003)）。
在一些实施方式中，具有带电侧基的聚合物或其一价离子盐在水溶液（如水、缓冲盐溶液或酒精水溶液）中至少是部分可溶的。具有可以与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(醋酸乙烯酯)和磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。还可以使用具有通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧基、磺酸基、卤化（优选地，氟化）醇基、酚OH基和酸OH基。
可以将胎盘细胞或其共培养接种到立体框架或支架上并植入体内。可以将该框架与任何一种或多种生长因子、细胞、药物或刺激组织形成或以其他方式增强或改进本文其它位置描述的治疗方法的实践的其他组分结合植入。
在此描述的治疗方法中可以使用的支架的实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。可以使用由乙醇酸和乳酸（例如，PGA/PLA）的合成可吸收共聚物（VICRYL,Ethicon,Inc.,Somerville,N.J.）组成的纤维来形成非纺织垫。还可以将通过如冷冻干燥或冻干法（参见，例如，美国专利No.6,355,699）的工艺所形成的由（例如）聚(ε-己内酯)/聚(羟基乙酸)（PCL/PGA）共聚物组成的泡沫用作支架。
在另一个实施方式中，支架为，或含有毫微纤维支架，例如，电纺毫微纤维支架。在一个更具体的实施方式中，所述毫微纤维支架含有聚(L-乳酸)(PLLA)，I型胶原，1,1-二氟乙烯和三氟乙烯共聚物(PVDF-TrFE)，聚(-己内酯)，聚(L-丙交酯-共-ε-己内酯)[P(LLA-CL)](例如，75:25)，和/或聚(3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸)(PHBV)和I型胶原共聚物。在另一个更具体的实施方式中，所述支架促进胎盘细胞分化为软骨细胞。生产毫微纤维支架（例如，电纺毫微纤维支架）的方法是本领域已知的。参见，例如，Xu等，Tissue Engineering10(7):1160-1168(2004)；Xu等，Biomaterials25:877-886(20040；Meng等，J.Biomaterials Sci.,Polymer Edition18(1):81-94(2007)。
还可以将本文所提供的胎盘细胞(例如，免疫抑制的胎盘细胞)接种到生理学可用的陶瓷材料上或与之接触，所述陶瓷材料包括（但不限于）磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸三钙、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙和磷酸四钙、羟基磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸镁钙、生物活性玻璃（如
Figure GDA0000408263340000761
及其混合物。目前可商购的多孔生物相容性陶瓷材料包括（CanMedica Corp.,Canada）、
Figure GDA0000408263340000763
（Merck Biomaterial France,France）、
Figure GDA0000408263340000764
（Mathys,AG,Bettlach,Switzerland）和矿化胶原骨移植产品，如HEALOSTM（DePuy,Inc.,Raynham,MA）和
Figure GDA0000408263340000765
RHAKOSSTM和
Figure GDA0000408263340000766
（Orthovita,Malvern,Pa.）。所述框架可以是天然和/或合成材料的混合物、共混物或复合材料。
在另一种实施方式中，可以将胎盘细胞接种到毡制物上或者与毡制物接触，所述毡制物可以由（例如）生物可吸收材料（如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物）或者透明质酸制成的复丝组成。
在另一种实施方式中，可以将本文所提供的胎盘细胞接种到可以是复合结构的泡沫支架上。可以将这些泡沫支架塑模成有用的形状，如体内待修复、置换或扩张的具体结构的一部分。在一些实施方式中，在免疫抑制的胎盘细胞接种之前用（例如）0.1M乙酸处理所述框架，然后在聚赖氨酸、PBS和/或胶原中培育以提高细胞附着。可以（如）通过血浆涂覆基质或一种或多种蛋白（例如，胶原、弹性纤维、网状纤维）、糖蛋白、糖胺聚糖（例如，硫酸肝素、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等）、细胞基质和/或其他材料（如，但不限于，明胶、海藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物树胶等）的加入来修饰基质的外表面以改善细胞的附着或生长和组织的分化。
在一些实施方式中，所述支架包含使其为非血栓形成性的材料或用该材料处理。这些处理和材料还可以促进并保持内皮的生长、迁移和胞外基质的沉积。这些材料和处理的实例包括（但不限于）天然材料，如基底膜蛋白（如层粘连蛋白和IV型胶原蛋白）；合成材料，如EPTFE和嵌段聚氨酯脲硅酮（polyurethaneurea silicones），如PURSPANTM（The PolymerTechnology Group,Inc.,Berkeley,Calif.）。所述支架还可以包含抗血栓形成试剂，如肝素；还可以在用胎盘细胞接种之前处理所述支架以改变表面电荷（例如，用血浆涂覆）。
5.9.2遗传修饰的胎盘细胞
在另一方面，在此提供了遗传修饰以（例如）产生目标核酸或蛋白质的胎盘细胞。可以（例如）使用基于病毒的载体（包括但不限于非整合复制型载体（例如乳头瘤病毒载体、SV40载体、腺病毒载体）、整合病毒载体（例如反转录病毒载体、腺病毒相关病毒载体）或复制缺陷型病毒载体）进行遗传修饰。将DNA转入细胞的其它方法包括使用脂质体、电穿孔、微粒枪、直接DNA注射等。
可以用DNA转化或转染干细胞，所述DNA通过一种或多种合适的表达控制元件进行控制或与其可操作地连接，例如，启动子或增强子序列、转录终止子、多腺苷酸位点、内核糖体进入位点。优选的，该DNA包含可选择标记。在引入外源DNA后，工程化的干细胞可以（例如）生长在富集培养基中，然后转移到选择培养基。在一个实施方式中，用于工程化胎盘细胞的DNA包含编码目标蛋白的核酸序列，例如细胞因子、生长因子、分化剂或治疗性蛋白质。
用于工程化干细胞的DNA可以含有本领域已知的任何启动子以驱动哺乳动物细胞（例如，人细胞）中的核酸序列的表达。例如，启动子包括但不限于，CMV启动子/增强子、SV40启动子、乳头瘤病毒启动子、Epstein-Barr病毒启动子、弹性蛋白基因启动子等等。在一个具体的实施方式中，启动子是可调节的，从而核酸序列只有在需要时才表达。启动子可以是诱导型(例如，与金属硫蛋白和热休克蛋白相关的那些启动子)或组成型的。
在另一个具体的实施方式中，启动子是组织特异性的或表现出组织特异性。该启动子的实例包括但不限于：髓磷脂碱蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell48:703)(少突胶质细胞)；弹性蛋白酶I基因控制区(Swit等，1984，Cell38:639；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399；MacDonald，1987，Hepatology7:425)(胰脏腺泡细胞)；胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature315:115)(胰腺β细胞)；肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani，1985，Nature314:283)(骨骼肌)。
胎盘细胞可被工程化“敲除”或“敲低（knock down）”对一种或多种基因的表达。细胞本身的基因表达可以通过（例如）同源重组完全失活基因抑制表达进行减弱。在一个实施方式中，例如，编码蛋白重要区域的外显子或5'至该区域的外显子通过正选择标记（例如，neo）被打断，阻止从靶基因产生正常mRNA并导致基因失活。还可以通过在基因的一部分产生缺失或缺失整个基因来失活基因。通过使用具有两个在基因组中距离很远的靶基因同源区域的构建体，插入该两个区域中的序列可以被缺失(Mombaerts等，1991、Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.88:3084)。也可以使用抑制靶基因表达的反义、DNA酶、小干扰RNA和核酶分子来降低靶基因在干细胞中的活性水平。例如，抑制主要组织相容性基因复合物(HLA)表达的反义RNA分子被证明在免疫应答方面具有多种功能。可以使用三螺旋分子降低靶基因活性水平。参见，例如，L.G.Davis等编，1994，BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY，第二版，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，其在此引入作为参考。
在一个具体的实施方式中，可以使用含有编码目标多肽的核苷酸序列的核酸分子遗传修饰胎盘细胞，其中目标多肽的表达由外源性因子控制，例如多肽、小分子有机物等。该多肽可以是治疗性多肽。在一个更具体的实施方式中，目标多肽是IL-12或白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)。在另一个更具体的实施方式中，目标多肽是白介素1受体拮抗剂和二氢叶酸还原酶(DHFR)的融合蛋白，外源性因子是抗叶酸素，例如氨甲喋呤。该构建体可用于接触氨甲喋呤时表达IL-1Ra或IL-1Ra和DHFR融合蛋白的胎盘细胞的工程化。该构建体可用于例如治疗风湿性关节炎。在该实施方式中，IL-1Ra和DHFR的融合蛋白在暴露于抗叶酸素例如氨甲喋呤时被翻译性上调。因此，在另一个具体的实施方式中，用于工程化胎盘细胞的核酸可以包含编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列，其中所述第一第二多肽被表达为融合蛋白，其在外源性因子存在时被翻译性上调。多肽可暂时性或长期性表达（例如经过几周或几月）。
该核酸分子还可以包含编码允许工程化干细胞正选择的多肽的核苷酸序列，或允许干细胞视觉化。在另一个更具体的实施方式中，核苷酸序列编码例如在合适的视觉条件下呈现荧光的多肽，例如，荧光素酶(Luc)。在一个更具体的实施方式中，该核酸分子可以含有IL-1Ra-DHFR-IRES-Luc，其中IRES是内核糖体进入位点。
5.9.3永生化胎盘细胞系
可以通过转染含有生长促进基因（即，编码在适当情况下促进转染细胞生长从而使生长促进蛋白的产生和/或活性是通过外部因素可调控的蛋白的基因）的任何合适的载体使得哺乳动物胎盘细胞有条件地永生化。在优选的实施方式中，所述生长促进基因是致癌基因，如（但不限于）V-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤大T抗原、E1a腺病毒或人乳头状瘤病毒的E7蛋白。
可以通过将生长促进基因置于外部可调控启动子（例如，可以通过（例如）改变转染细胞的温度或与所述细胞接触的培养基的组成来控制其活性的启动子）的控制之下来实现生长促进蛋白的外部调控。在一种实施方式中，可以使用四环素（tet）控制的基因表达系统（参见Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551,1992；Hoshimaru等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1518-1523,1996）。在不存在tet的情况下，该载体内的tet控制的反式激活因子（tTA）强烈激活从phCMV*-1（融合至tet操纵子序列的来自人巨细胞病毒的最小启动子）的转录。tTA是大肠杆菌（Escherichia coli）的转座子-10源tet耐受操纵子的抑制因子（tetR）和单纯疱疹病毒VP16的酸性域的融合蛋白。低、无毒浓度的tet（例如，0.01-1.0μg/mL）几乎完全消除了tTA的反式激活。
在一种实施方式中，所述载体还含有编码可选择标志物（例如，赋予抗药性的蛋白）的基因。细菌新霉素抗性基因（neoR）是可以在本发明方法中使用的一个这种标志物。可以通过本领域技术人员已知的方式选择具有neoR的细胞，如向生长培养基中加入（例如）100-200μg/mL的G418。
可以通过本领域技术人员已知的任何多种方式来实现转染，其包括（但不限于）反转录病毒感染。一般地，可以通过与从载体的生产细胞系收集的条件培养基和含有N2添加剂的DMEM/F12的混合物培育来转染细胞培养。例如，可以在（例如）体外五天后通过在一体积条件培养基和两体积含有N2添加剂的DMEM/F12中培育约20小时来感染如上所述制备的胎盘细胞培养。然后，可以如上所述选择具有可选择标志物的转染细胞。
转染后，将细胞传代至允许增殖（例如，允许至少30%的细胞在24小时的周期内倍增）的表面上。优选地，所述基材是由用聚鸟氨酸（10μg/mL）和/或层粘连蛋白（10μg/mL）涂覆的组织培养塑料制品组成的聚鸟氨酸/层粘连蛋白基材、聚赖氨酸/层粘连蛋白基材或用纤连蛋白处理的表面。然后，每3-4天用可以或可以不补充一种或多种增殖增强因子的生长培养基饲养培养物。当培养小于50%汇合时，可以将增殖增强因子加入至生长培养基。
当80%-95%汇合时，可以使用标准技术（如通过胰酶消化）使条件永生化胎盘干细胞系传代。在一些实施方式中，直至约第二十次传代，维持选择（例如，通过对含有新霉素抗性基因的细胞加入G418）是有益的。还可以将细胞在液氮中冷冻以用于长期储存。
可以从如上所述制备的条件永生化人胎盘干细胞系分离无性细胞系。一般地，可以使用标准技术（如通过限度稀释或使用克隆环）分离这些无性细胞系并扩增。一般地，可以如上所述饲养无性细胞系并使其传代。
一般地，可以通过在有利于分化的培养条件下抑制生长促进蛋白的产生和/或活性来诱导条件永生化人胎盘干细胞系（其可以但不需要是无性系的）分化。例如，如果编码生长促进蛋白的基因受外界可调控启动子的控制，则可以改变条件（例如，温度或培养基组成）以抑制所述生长促进基因的转录。对于以上所讨论的四环素控制基因表达系统，可以通过四环素的加入来抑制生长促进基因的转录从而实现分化。一般地，4-5天的1μg/mL的四环素足以引起分化。为了促进进一步分化，可以在生长培养基中包含其他试剂。
5.9.4分析
胎盘细胞可用于分析以测定培养条件、环境因素、分子（例如生物分子、无机小分子等）等相对于不暴露在这些条件下的胎盘细胞而言对干细胞增殖、扩张和/或分化的影响。
在一个实施方式中，可以分析胎盘细胞接触一种分子时的增殖、扩张或分化。在一个实施方式中，例如，在此提供了一种调节多个胎盘细胞增殖的化合物的鉴定方法，包括在允许增殖的条件下用所述化合物接触所述多个干细胞，其中如果与不接触所述化合物的多个干细胞相比，所述化合物导致多个胎盘细胞增殖可检测的改变，那么所述化合物即鉴定为调节胎盘细胞增殖的化合物。在一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定为增殖抑制剂。在另一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定为增殖增强剂。
在另一个实施方式中，可以鉴定调节多个胎盘细胞扩张的化合物，包括在允许扩张的条件下用所述化合物接触所述多个干细胞，其中如果与不接触所述化合物的多个干细胞相比，所述化合物导致多个胎盘细胞扩张可检测的改变，那么所述化合物即鉴定为调节胎盘细胞扩张的化合物。在一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定为扩张抑制剂。在另一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定为扩张增强剂。
在另一个实施方式中，可以鉴定调节多个胎盘细胞分化的化合物，包括在允许分化的条件下用所述化合物接触所述多个干细胞，其中如果与不接触所述化合物的多个干细胞相比，所述化合物导致多个胎盘细胞分化可检测的改变，那么所述化合物即鉴定为调节胎盘细胞分化的化合物。在一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定为分化抑制剂。在另一个具体的实施方式中，所述化合物被鉴定为分化增强剂。
5.9.5胎盘细胞库
来自产后胎盘的干细胞可以以多种不同的方式进行培养，产生一系列的多种细胞，例如一系列的个体可给药剂量的胎盘细胞。该多种细胞可以从例如来自胎盘灌注物或酶促消化胎盘组织的干细胞中获得。从多个胎盘中获得的一系列的多种胎盘细胞可以安置在一个胎盘细胞库中进行例如长期保存。一般，从胎盘材料初始培养中获得贴壁干细胞，形成种子培养，其在控制的条件下扩增基本相同的代数形成细胞群。多种细胞优选的来自单一胎盘组织，但也可以来自多个胎盘组织。
在一个实施方式中，干细胞群如下获得。首先破碎胎盘组织，例如，通过切碎、用合适的酶（例如，胶原酶）消化(参见上述5.3.3节)。胎盘组织优选的含有，例如，来自单一胎盘的完整的羊膜、完整的绒毛膜、或两者，但也可以只含有羊膜或绒毛膜的一部分。培养消化的组织（例如）约1-3周，优选的约2周。在去除非贴壁细胞后，通过例如胰酶消化来收集形成的高密度集落。将这些细胞收集并重悬于合适体积的培养基中，然后用于接种扩增培养物。扩增培养物可以是单独的细胞培养装置的任意排列，例如，NUNCTM的细胞工厂（Cell Factory）。可以将细胞次分至任意程度来按照例如1x103、2x103、3x103、4x103、50103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、或10x104干细胞/cm2接种扩增培养物。优选的，使用约1x103至约1x104细胞/cm2接种各扩增培养物。扩增培养物的数量可以较大或较小，取决于获得干细胞的特定胎盘。
扩增培养物进行生长，直至培养中的细胞密度达到某个值，例如，约1x105细胞/cm2。此时可以收集细胞或冷冻保藏，或者传代到新的扩增培养物，如上所述。在使用前，细胞可传代例如2、3、4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。优选的在扩增培养中保持纪录累计的群体倍增数。来自培养的细胞可以扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20，22、24、26、28、30，32、34、36、38或40个群体倍增，或高达60次倍增。然而，优选的，在将细胞群分成个体剂量前，群体倍增数为约15至约30。细胞可以在扩增过程中连续培养，或在扩增中的一个或多个点进行冷冻。
用于个体剂量的细胞可以被冷冻，例如，冷冻保藏以待他用。个体剂量可以包括，例如约1百万至约5千万细胞每ml，且可以含有约106至约1010细胞总量。
因此，在一个实施方式中，胎盘干细胞库可以通过以下方法制备，包括：从人产后胎盘扩增初级培养胎盘干细胞用于第一次多个群体倍增；冷冻保藏所述胎盘干细胞形成原始细胞库；从原始细胞库扩增多个胎盘干细胞用于第二次多个群体倍增；冷冻保藏所述胎盘干细胞形成工作细胞库；从工作细胞库扩增多个胎盘干细胞用于第三次多个群体倍增；并以个体剂量冷冻保藏所述胎盘干细胞，其中所述个体剂量共同形成胎盘干细胞库。可选的，来自所述第三次多个群体倍增的多个胎盘细胞可以扩增第四次的多个群体倍增并以个体剂量冷冻保藏，其中所述个体剂量共同形成胎盘干细胞库。
在一个实施方式中，细胞用勃脉力（10%人血清白蛋白(HSA)，10%DMSO）稀释至约2百万/ml。
在一个优选的实施方式中，对从中获得胎盘的供体（例如母亲）检测至少一个病原体。如果母亲对检测的病原体呈阳性，那么丢弃整个胎盘细胞。该测试可以在胎盘细胞群生产的任意时间进行，包括确定0代细胞前后，或在扩增培养中。所检测的病原体可以包括（不限于）甲、乙、丙、丁、戊型肝炎，人免疫缺陷病毒(I型和II型)，巨细胞病毒，疱疹病毒等。
6.实施例
6.1实施例1：使用胎盘细胞进行免疫调节
胎盘细胞，例如胎盘干细胞(PDAC)具有免疫调节效果，包括对T细胞增殖的抑制和自然杀伤细胞。以下实验表明了胎盘细胞(CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞)具有调控T细胞应答刺激的能力。
6.1.1PDAC通过IFN-γ诱导的可溶性机理介导抑制T细胞 增殖
为了查明PDAC是否抑制T细胞增殖以及该抑制的机理是细胞对细胞接触还是可溶性因子介导，在允许细胞对细胞接触的共培养物中，或在T细胞:PDAC比例为10:1的侵袭小室系统中建立了BTR(由抗CD3、抗CD28包被的免疫磁珠刺激的T细胞)和PDAC或用500或100units/mL的IFN-γ预处理24小时的PDAC的共培养。
在存在或不存在20,000个PDAC的96孔板的孔中，通过以磁珠:T淋巴细胞为1:3的比例将100,000个T-淋巴细胞和抗CD3和抗CD28包被的免疫磁珠(Invitrogen)混合，进行磁珠T-淋巴细胞反应(BTR)。混合的细胞培养物在37℃，5%CO2和90%相对湿度下培育6天。在第6天回收全部细胞，用抗CD4-PE和抗CD8APC(R&D systems，Minneapolis，MN)染色。
在细胞接触和侵袭小室条件下都观察到PDAC对BTR的抑制，表明抑制至少部分是由一种可溶性因子介导的。IFN-γ预处理PDAC强烈增加了PDAC介导的BTR抑制。为了进一步确定PDAC通过IFN-γ诱导机制对T细胞增殖的抑制，将2、8、16或32μg/ml的抗IFN-γ中和抗体引入PDAC和AbTR(可溶性抗CD3和抗CD28刺激的PBMC)的共培养物。抗IFN-γ抗体以剂量依赖的方式（ED50为～2μg/ml）从PDAC介导的抑制中挽救了T细胞增殖。从而，PDAC对激活的T细胞增殖的免疫抑制是由IFN-γ介导的。
6.1.2PDAC诱导T REG 细胞
本实施例显示胎盘细胞(PDAC)具有诱T细胞分化为Treg细胞(也称为抑制子T细胞)的能力，后者能够下调其它T细胞的活性。
初始(Naive)CD4+T细胞可根据局部细胞因子环境被诱导分化为Th1、Th2、Th17和调控(Treg)表型。Treg细胞控制对自抗原的免疫耐受性。对Th17或Th1表型应答的偏移以及远离Treg表型可能是一些自身免疫病和/或移植物抗宿主病(GVHD)的发生和/或发展的原因。
诱导的Treg细胞具有FoxP3+(叉头盒P3+)表型。由此，考察了PDAC对Treg细胞中FoxP3表达的影响。将单独的外周血细胞(PBMC)、比例为1:1000的PBMCs+PDAC、或存在白介素2(IL-2；300IU/mL)和IL-15(125IU/mL)的PBMC培养4天。然后对PBMC的样品针对CD25和FoxP3进行免疫染色。使用抗CD4抗体包被的小珠分离各条件下的来自PBMC的CD4+T细胞。37℃下用10μg/mL丝裂霉素C处理分离的T细胞2小时，检测其对新鲜分离的T细胞的影响，比例为1:1、1:10和1:100。与PDAC共培养的PBMC表现出更高百分比的呈现FoxP3+表型的CD4+细胞，表明更高数量的Treg细胞。
结论：与PBMC共培养的PDAC诱导T细胞分化为具有Treg表型的细胞，且该细胞具有抑制T细胞增殖的能力。
6.1.3PDAC介导的T细胞增殖抑制是通过吲哚胺2,3-双加 氧酶(IDO)进行的
本实施例显示PDAC的T细胞免疫抑制是由吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)活性介导的。
当与T细胞共培养时，如上建立的PDAC抑制T细胞增殖。为了考察PDAC介导的T细胞增殖抑制的活动机理，在体外T细胞增殖分析(BTR)中使用药理学抑制剂或中和抗体来封闭前列腺素E2(PGE2)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、转化生长因子β(TGF-β)、白介素10(IL-10)和IDO的活性。封闭PGE2、iNOS，TGF-β和IL-10活性后没有观察到T细胞增殖的恢复。然而，通过对T细胞增殖分析以剂量依赖的方式添加16、64、128和256μM的IDO抑制剂1MT(1-甲基色氨酸)获得了T细胞增殖的恢复。
色氨酸对T细胞增殖是必须的。为了确定PDAC介导的体外T细胞增殖抑制是IDO介导的，将16、64、128和256μM的1MT和过量的L-色氨酸(L-Trp)引入T细胞增殖分析。256μM的1MT和256μM的L-Trp以剂量依赖的方式基本上从PDAC介导的抑制中挽救了T细胞增殖。
在另一实验中，将IDO小干扰RNA(siRNA)或对照siRNA转染进PDAC，以降低IDO的表达。在BTR分析中，感染有IDO的siRNA而不是对照siRNA的PDAC基本上取消了对T细胞增殖的抑制。这些结果确认了PDAC的T细胞增殖抑制是由IDO介导的。
6.1.4L-系统对PDAC介导的免疫抑制是必需的
L-系统转运蛋白是一种异二聚体膜转运蛋白，其优选转运中性氨基酸(缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸)和芳香族氨基酸(色氨酸，酪氨酸)。由于L-系统转运蛋白跨质膜转运IDO底物色氨酸，推测L-系统对PDAC介导的免疫抑制是必需的。将L-系统(LAT1)轻链SiRNA转染到PDAC中，并在增殖分析中将PDAC与T细胞共培养。LAT1特异性siRNA，而非对照siRNA，在PDAC存在下恢复了T细胞增殖。该结果表明L-系统对PDAC介导的免疫抑制是必需的。
6.1.5PDAC对细胞分化和细胞因子分泌的影响
本实施例显示胎盘干细胞(PDAC)使得T细胞的分化偏离了Th1和Th17亚群，并朝向Treg亚群。
通过在包括PDAC的PMLR中测定细胞因子的分泌，研究了PDAC影响T细胞区域偏离的能力。与MLR中单独的T细胞或单独培养的T细胞相比，MLR中与PDAC共培养的T细胞的IFN-γ（一种Th1亚群标记物）的生产降低(≈50%)。该结果与PMLR中的T细胞增殖抑制一致。在一个单独的实验中，PMLR中PDAC的存在还减少了Th17细胞(IL-17-表达细胞)的百分比，从T细胞的10.44%到4.68%，并提高了Treg细胞的百分比，从8.34%到12.65%。
为了考察PDAC介导的Th1偏移抑制活动的分子机制，通过标准技术将IDO的siRNA瞬间转染PDAC。对BTR反应(参见上文)发生了Th1偏移，但补充有另外的Th1偏移细胞因子混合物，包含IL-2(200IU/mL)、IL-12(2ng/mL)和抗IL-4(0.4μg/ml)。IDO siRNA转染完全地挽救了PDAC介导的Th1偏移抑制。作为确证，过量的IDO抑制剂1MT和色氨酸同样完全地挽救了被PDAC抑制的Th1偏移。
为了确定PDAC对Th1偏移的抑制是否由可溶性因子介导，在PDAC培养的第1、2和3天收集来自PDAC和用IL-1β处理的PDAC的条件培养基，并在T细胞正常分化为Th17亚群的条件下将其加入T细胞培养物。对于Th17极化(偏移)，使用5x105分选的CD14+单核细胞、50ng/mL抗CD3抗体(BD BioScienences)和100ng/mL LPS(Sigma Aldrich)对5x105的总T-淋巴细胞刺激6天，其中存在或不存在50,000PDAC。通过IL-17的ICCS染色在CD4阳性群上分析Th17细胞群。
PDAC条件培养基抑制Th17偏移，加入IL-1β处理增强了该抑制效果。从而，PDAC介导的Th17偏移抑制由可溶性因子介导，且IL-1β处理增强了该抑制效果。
PDAC介导的诱导IL-10生产T细胞表型与初始培养的T细胞Th1/Th2谱系提交的偏移无关。为了定义观察到的响应PDAC共培养的T细胞细胞因子分泌的影响的调控模式，通过从PDAC/BTR共培养物分选的CD4和CD8T细胞的FACS对IL-10和TNF mRNA进行了定量PCR(qPCR)分析。在与PDAC共培养的T细胞中观察到很强的IL-10mRNA可复制的转录诱导。
观察到的IL-10转录调节表明在响应PDAC与T细胞共培养中存在改变的效应物T细胞分化模式，可以通过初始T细胞的Th1谱系分化和/或Th2谱系分化诱导的特异性抑制进行解释。为了证明该可能性，监控了在选定的初始CD4T细胞中PDAC对Th1/Th2分化模式的作用，所述细胞培养于非极化和Th1-或Th2-极化条件下。使用分别作为Th1和Th2谱系提交的特异性转录标记物的T-bet(转录因子)和GATA-3mRNA的相对表达水平来定量从含有或不含PDAC的BTR培养物中分离的T细胞的分化。在任何中性或谱系特异性培养条件下，都没有观察到PDAC共培养对Th1或Th2转录因子的影响。因此，与PDAC对调节性T细胞发展的不同分子途径的作用一致，PDAC对IL-10生产表型的转录诱导不是由Th1/Th2提交的偏移介导的。
6.1.6PDAC对巨噬细胞/单核细胞细胞因子谱的作用
从PBMC中获得的含有约50%CD14+细胞的贴壁细胞群被分离。通过用抗CD14包被的MACS磁珠正向筛选得到第二CD14+细胞群。为了考察PDAC对巨噬细胞和单核细胞细胞因子分泌谱的作用，用LPS处理巨噬细胞/单核细胞12小时，然后与PDAC共培养另外的48小时。收集上清并通过25-倍Luminex分析对细胞因子和生长因子进行分析。当与PBMC贴壁群体共培养时，PDAC抑制脂多糖(LPS)处理的PBMC贴壁细胞对IL-1β、IL-8、RANTES和TNF-α的生产，并增强?其对白介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)的生产。观察到巨噬细胞和PDAC的共培养产生TNF-α抑制和IL-10诱导中的PDAC细胞剂量依赖型应答。IL-10应答的数量级更随巨噬细胞供体的不同而变化。
6.1.7胎盘干细胞对树突细胞成熟和功能的作用
为了研究树突细胞(DC)成熟和功能的PDAC介导的调控，使用单独的LPS或LPS+IFN-γ组合处理单核细胞来源的不成熟DC，以驱动DC的成熟过程，其中存在或不存在PDAC。通过DC成熟标志物CD83、CD86和HLA-DR的FACS染色来分析DC的成熟。通过IL-12胞内染色和由细胞计数磁珠分析(BD Pharmingen)检测的可溶性细胞因子的生产进行DC功能评估。根据DC上CD86、HLA DR和CD83表达的下调，发现PDAC强烈抑制LPS-和LPS+IFN-γ诱导的DC成熟。
另外，PDAC约50%地显著抑制LPS+IFN-γ刺激的生产IL-12的DC群。类似的，PDAC抑制TNF-α生产。不像前述PDAC增加了T细胞IL-10表达的结果，PDAC没有提高树突细胞的IL-10生产。
6.1.8PDAC抑制由LPS诱导并由可溶性因子介导的单核 细胞的IL-23生产
为了考察是否PDAC调节IL-23的生产，用10ng/ml的LPS刺激1百万的人PBMC24小时，其中存在或不存在200-100,000细胞/孔的PDAC。ELISA测定IL-23。PDAC以剂量依赖性方式强烈抑制PBMC的IL-23生产。对于超过20,000的PDAC细胞观察到基本上完全抑制(>90%)。在最低的PDAC细胞剂量，200细胞/孔下得到约50%的IL-23生产抑制。
相反，PDAC不抑制LPS-激活的单核细胞来源的树突细胞的IL-23生产。为了测定在何种PBMC细胞中IL-23生产受到调节，从人PBMC中分离CD14单核细胞和DC的CD11c级分。存在或不存在PDAC下的培养中每个级分用10ng/ml LPS处理24小时。观察到PDAC特异性下调单核细胞而非DC的LPS-激活的IL-23生产。
为了理解PDAC介导的下调PBMC IL-23生产的作用机理，从PDAC、PDAC+IFN-γ(100U/ml)和PDAC+IL-1β(10ng/ml)的培养物收集条件培养基。将不同浓度的条件培养基加至LPS处理的PBMC过夜培养物。观察到PDAC条件培养基以剂量依赖的方式强烈抑制LPS-激活的PBMC的IL-23生产。进一步的，与单独的PDAC条件化的培养基相比，IL-1β处理的PDAC的条件培养基表现出更强的以剂量依赖的方式的抑制。相反，IFN-γ处理的PDAC不抑制LPS-激活的PBMC的IL-23生产。该结果表明PDAC介导的对LPS激活的PBMC的IL-23生产的抑制由一种未鉴别的可溶性因子所介导。
6.1.9在Th17偏移培养中PDAC抑制IL-21生产
IL-21是一种维持Th17群所必需的重要的细胞因子。为了考察PDAC是否能够调控调控IL-21生产，将PDAC引入Th17偏移培养。根据生产商的说明使用eBioscience的ELISA试剂盒(#88-7216)检测从Th-17偏移培养中获得的上清液中的可溶性IL-21。观察到与不含PDAC的Th17偏移培养相比，在PDAC-Th17共培养中PDAC强烈抑制IL-21生产。该结果表明PDAC能够抑制IL-21生产。
6.2实施例2：使用胎盘来源的贴壁细胞生成血管
6.2.1PDAC的血管生成因子分泌
本实施例显示了胎盘细胞(CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞，还称为PDAC)的血管生成因子分泌。
6.2.1.1用于评价胎盘来源的贴壁细胞的血管生成能力的分泌 组蛋白谱
多重磁珠分析：在生长培养基中以相等的细胞数对第6代胎盘来源的贴壁细胞进行铺板，48小时后收集条件培养基。使用基于磁珠的多重分析(multiplex assays)(Bio-Plex ProTM，Bio-Rad，CA)进行细胞条件培养基中的多重血管生成细胞因子/生长因子的同时定性分析，所述分析允许检测不同基质（包括血清、血浆和细胞/组织培养上清）中血管生成的生物标志物。这些96孔板形式的、基于磁珠的分析的原则与俘获性夹心免疫分析类似。将直接抗目标血管生成靶位的抗体共价结合到内部染色的磁珠上。偶联的磁珠允许与含有血管生成目标的样品发生反应。在一系列洗涤去除未结合蛋白后，在反应物中加入不同表位特异性的生物素化检测抗体。结果在血管生成目标周围形成了夹心抗体。然后添加链霉亲和素-PE以结合磁珠表面的生物素化检测抗体。简而言之，根据生产商的说明进行多重分析，评价了条件培养基中各自的生成血管的生长因子数目。
ELISA：在细胞条件培养基中进行单独的生成血管的细胞因子/生长因子的定量分析，其中使用来自R&D Systems(Minneapolis,MN)的可商购的试剂盒。简而言之，根据生产商的说明进行ELISA分析，评价了条件培养基中各自的生成血管的生长因子数目。
PDAC的各种血管生成蛋白的分泌水平见图1。
表1生成血管标志物的多重和ELISA结果
Figure GDA0000408263340000881
在独立的实验中，确定PDAC还分泌血管生成素-1、血管生成素-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮细胞粘附分子)、层粘连蛋白、纤连蛋白、MMP1、MMP7、MMP9和MMP10。
6.2.2PDAC的功能特征
本实施例显示胎盘细胞(CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞，还称为PDAC)与血管生成和分化能力有关的不同特征。
6.2.2.1HUVEC管腔形成评价PDAC的血管生成能力
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在第3代或更少的代时被次培养于EGM-2培养基(Cambrex，East Rutherford，NJ)中3天，并在汇合度为大约70％-80％时进行收获。将HUVEC用基本培养基/抗生素(DMEM/F12(Gibco))洗涤一次并以期望的浓度重悬于相同培养基。在HUVEC制备的1小时之内使用。将人胎盘胶原蛋白(HPC)用10mM HCl(pH2.25)配成浓度为1.5mg/mL，用缓冲液中和至pH7.2并置于冰上直至使用。将HPC与HUVEC悬液混合至细胞终浓度为4000细胞/μl。得到的HUVEC/HPC悬液马上移液至96-孔板中，3μl每孔(板周围需要预先填充无菌PBS以防止蒸发，每个条件下n＝5)。将HUVEC液滴在不添加培养基的情况下培育于37℃和5％CO275-90分钟以允许胶原蛋白聚合。在“干燥”培育完成后，轻柔地在各孔中填充200μl条件化的PDAC培养基(n＝2细胞系)或对照培养基(例如，DMEM/F12作为阴性对照，EGM-2作为阳性对照)并在37℃和5％CO2下培育20小时。通过将第6代PDAC在生长培养基中培育4-6小时制备条件培养基；在贴壁和扩散后，将培养基替换为DMEM/F12培养24小时。培育后，将培养基从孔中移除，而不干扰HUVEC液滴，并将孔用PBS洗涤一次。然后使HUVEC液滴固定10秒并使用Diff-Quik细胞染色试剂盒染色1分钟，然后用无菌水洗涤3次。风干染色的液滴，使用Zeiss SteReo Discovery V8显微镜获取各孔的图像。然后使用计算机软件包“ImageJ”和/或MatLab分析图像。将图像从彩色转为8-bit灰度图像，并设置临界值转化为黑白图像。然后使用粒子分析特征来对图像进行分析，后者提供像素密度数据，包括计数(个体粒子的数量)、总面积、(个体粒子的)平均大小和面积分数，其等价于分析中的内皮管腔形成数。
条件培养基对于内皮细胞具有血管生成效果，如诱导管腔形成所示(参见图2)。
6.2.2.2HUVEC迁移分析
本实验显示胎盘来源的贴壁细胞的血管生成能力。HUVEC在纤维粘连蛋白(FN)包被的12-孔板上生长至单层汇合，并用1mL塑料移液管头“划伤”单层以横跨孔内形成细胞系。通过用PDAC生长3天获得的无血清的条件培养基(EBM2；Cambrex)培育“受伤的”细胞来检测HUVEC迁移。不含细胞的EBM2培养基用作对照。15小时后，使用倒置显微镜记录细胞记录(n＝3)至非细胞区的细胞迁移。然后使用计算机软件包“ImageJ”和/或MatLab分析图像。将图像从彩色转为8-bit灰度图像，并设置临界值转化为黑白图像。然后使用粒子分析特征来对图像进行分析，后者提供像素密度数据，包括计数(个体粒子的数量)、总面积、(个体粒子的)平均大小和面积分数，其等价于分析中的内皮迁移数。将细胞迁移的程度相对于初始记录的受伤细胞系的大小进行计分，并将结果归一化为1×106细胞。
胎盘来源的贴壁细胞分泌的营养因子对于内皮细胞具有血管生成效果，如诱导细胞迁移所示(图3)。
在一个单独的实验中，HUVEC在24-孔板底部培养进行EGM2中的过夜建立，然后进行EBM中的半天饥饿。同时，解冻培养基培养的PDAC并将其在侵袭小室(8μM)中培养过夜。在EC饥饿后，将无血清的条件培养基DMEM以及侵袭小室转移到EC进行过夜增殖。每个实验包括4个平行，使用Promega细胞滴度Glo分析评价24小时后的增殖情况。EBM-2培养基用作阴性对照，EGM-2用作阳性对照。误差线表示分析平行重复(n＝3)的标准误差。
PDAC分泌的营养因子导致HUVEC细胞数的增加，其是HUVEC增殖的指标。参见图4。
6.2.2.3HUVEC管腔形成评价胎盘来源的贴壁细胞的血管生成 能力
PDAC或者生长于不添加VEGF的生长培养基，或者生长于添加VEGF的EGM2-MV，以评价PDAC的一般血管生成能力，以及VEGF对细胞分化潜力的影响。HUVEC作为管腔形成的对照细胞生长于EGM2-MV。细胞培养于各自培养基4-7天，直至达到70-80％汇合。将冷的(4℃)MATRIGELTM溶液(50μL；BDBiosciences)分散至12-孔板的孔中，将板在37℃培育60min使溶液凝胶化。对PDAC和HUVEC细胞进行胰蛋白酶化，重悬于适当培养基中(含有或不含VEGF)，并将100μL的稀释的细胞(1-3x104细胞)加至各个含有MATRIGELTM的孔中。在聚合的MATRIGELTM上的细胞，在0.5-100ng VEGF存在或不存在下，被置于37℃5％CO2培养箱4-24小时。在培育后使用标准光学显微镜评价细胞的管腔形成迹象。
PDAC在缺少VEGF的条件下表现出最小的管腔形成，但会在受到VEGF刺激的情况下诱导/分化至形成管样结构。参见图5。
6.2.2.4使用缺氧响应评价胎盘来源的贴壁细胞的血管生成能 力
为评价内皮细胞和/或内皮祖细胞的血管生成功能，可以针对在缺氧和常氧条件下细胞分泌血管生成生长因子的能力进行评估。在缺氧条件下培养通常由内皮细胞或内皮祖细胞诱导产生增加的血管生成生长因子分泌，其可以在条件培养基中进行检测。将胎盘来源的贴壁细胞按照与其标准培养基中相等的数量接种并生长至大约70-80％汇合度。然后，将细胞转向无血清的培养基(EBM-2)并在常氧(21％O2)或缺氧(1％O2)条件下培育24小时。收集条件培养基并使用商业可获得的R&D SYSTEMS的ELISA试剂盒对血管生成生长因子的分泌进行分析。根据生产商的使用说明进行ELISA分析，在条件培养基中各血管生成生长因子(VEGF和IL-8)的数量被归一化为1×106细胞。
胎盘来源的贴壁细胞在低氧条件表现出增加的各血管生成生长因子分泌。参见图6。
6.2.2.5PDAC条件培养基的HUVEC响应
PDAC在含有60％DMEM-LG(Gibco)；40％MCBD-201(Sigma)；2％FBS(Hyclone Labs)，1×胰岛素-转铁因子-硒补充剂(ITS)；10ng/mL亚油酸-牛血清白蛋白(LA-BSA)；ln-地塞米松(Sigma)；100μM抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)；10ng/mL表皮生长因子(R&D SYSTEMS)；以及10ng/mL血小板衍生的生长因子(PDGF-BB)(R&D SYSTEMS)的生长培养基中培养48小时，然后在无血清培养基中另外培养48小时。收集来自PDAC培养物的条件培养基并用于刺激血清饥饿的HUVEC5、15和30分钟。然后裂解HUVEC并用BDTM CBA(Cytometric Bead Assay)Cell Signaling Flex试剂盒(BD Biosciences)染色磷蛋白，后者已知在血管生成途径信号中起作用。PDAC被发现为HUVEC中的AKT-1(其抑制凋亡过程)、AKT-2(其为胰岛素信号途径的重要信号蛋白)、和ERK1/2细胞增殖途径的强激活剂。这些结果进一步显示PDAC的血管生成能力。
6.2.3PDAC诱导血管生成
本实施例显示如实施例2所示的PDAC在使用鸡绒毛膜尿囊膜(CAM)的体内分析中的促血管生成。
进行了两组单独的CAM分析。在第一组CAM分析中，评价了来自不同PDAC制备的完整的细胞沉淀。在第二组CAM分析中，评价了来自不同PDAC制备的上清液。成纤维细胞生长因子(bFGF)被用作阳性对照，MDA-MB-231人乳腺癌细胞作为参比，载体和培养基对照作为阴性对照。本研究的终点是测定全部处理组和对照组的血管密度。
6.2.3.1使用PDAC进行CAM分析
使用了按照上述方法制备和冷冻保藏的PDAC。将PDAC解冻用于施用并测定了用于CAM施用的细胞的数量。
研究设计：本研究包括5个组，每组10个胚胎。本研究的设计描述于表2。
表2：研究组，鸡绒毛膜尿囊膜血管生成分析。
Figure GDA0000408263340000921
CAM分析流程：在37℃的标准鸡蛋培养箱中将新鲜受精卵培育3天。在第3天，在无菌条件下将蛋打破，将胚胎置于20个100mm塑料板中，在胚胎培养箱中37℃培养，底架上储水。使用一个小泵持续将空气通入储存水中，从而培养箱湿度维持恒定。在第6天，在各CAM放置一个无菌的“O”型硅胶环，然后在无菌状态下将PDAC以密度为7.69×105细胞/40μL培养基/MATRIGELTM混合物(1∶1)转移至各“O”型环。表2A和2B表示所使用的细胞数量和添加至各细胞制备物用于施用的培养基数量。载体对照胚胎中加入40μL的载体(PBS/MATRIGELTM，1∶1)，阳性对照中加入在40μL的DMEM培养基/MATRIGELTM混合物(1∶1)中的100ng/mlbFGF，以及培养基对照中只加入40μL的DMEM培养基。在各施用完成后将胚胎返回各培养箱。在第8天，将胚胎从培养箱中移出并置于室温下，使用放大100×的图像捕捉系统测定各“O”型环的血管密度。
通过使用正实数0-5、或指数血管1-32的评分系统检测生成血管的密度，显示CAM处理位置处的血管数量。较高的分值表示较高的血管密度，0表示没有血管生成。对于各施用位置的抑制百分比使用该位置记录的分值/每个个体实验中对照样品获得的平均分值进行计算。对于给定化合物的各施用的抑制百分比通过合并来自8-10胚胎施用的所有结果进行计算。
表3：为了归一化最终施用的细胞悬液而添加至各细胞制备物的培养基的量
Figure GDA0000408263340000922
使用的PDAC处于第6代。
结果
血管密度评分值的结果见图7。该结果清楚地显示分别用PDAC细胞悬液、或100ng/mL的bFGF、或MDAMB231乳腺癌细胞悬液处理的鸡绒毛膜尿囊膜的血管密度分值在统计学上显著高于载体对照组的CAM(P＜0.001，T检验)。用于培养PDAC细胞（阴性对照）的培养基对血管密度没有任何效果。此外，PDAC制备物诱导的血管密度显示了一些变化，但是这些变化在统计学上并不显著。
6.2.3.2使用PDAC上清进行CAM分析
来自MDA-MB-231细胞和PDAC的上清液样品被用于第二次CAM分析，如上所述。bFGF和MDA-MB-231上清被用作阳性对照，培养基和载体用作阴性对照。
研究设计：本研究包括5个组，每组10个胚胎。本研究的设计描述于表4。
表4：研究设计-使用细胞上清进行CAM分析
Figure GDA0000408263340000931
PDAC上清来自第6代细胞。
CAM分析流程：分析流程与上述6.3.1节相同。唯一的区别是来自各干细胞制备物或来自MDA-MB-231细胞的上清液被用作测试材料。对于剂量，各上清液与MATRIGELTM(以1∶1体积比)进行混合并对各胚胎施用40μL的混合物。
结果：血管密度分值(参见图8)显示各干细胞制备物上清液的血管形成诱导各不相同。来自PDAC的上清液样品表现出对于血管诱导的显著影响，分别为P＜0.01、P＜0.001和P＜0.02(T检验)。如同预料的那样，阳性对照bFGF同样显示出对于血管形成的强诱导，如上述CAM分析编号1(P＜0.001，T检验)所示。然而，MDA-MB-231人乳腺癌细胞上清液相对于载体对照组而言没有显示出对于血管形成的显著诱导。如前所示，培养基本身没有任何效果。
6.3实施例3：PDAC表现出神经保护效果
本实施例使用氧气-葡萄糖剥夺(OGD)损伤分析和活性氧分析，显示PDAC在低氧和低葡萄糖条件下具有神经保护效果。另外，PDAC表达神经保护部分，包括神经营养因子BDNF、GDNF、NT-3、NT-4/5和抗氧化酶血红素氧合酶-1、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶-1和醛氧化酶-1，且这些部分的一些表达和分泌在缺氧损伤后升高。从而，这些结果显示PDAC可用于治疗CNS损伤，例如，SCI或TBI，一般其特征为神经功能损失或由坏死、凋亡、脱髓鞘和其他功能损失导致的退化。
将人神经元(ScienCell，目录号1520)根据生产商的建议进行培养。简要地，培养容器在37℃下无菌蒸馏水中用聚-L-赖氨酸(2μg/mL)进行包被1小时。将容器用双蒸水洗涤3次。将神经元培养基(ScienCell)加至容器中并在培养箱中平衡至37℃。解冻神经元，并直接加至容器中，不必离心。在随后的培养中，初始培养后的当天更换培养基，之后每隔一天更换。神经元一般在第4天可以进行损伤分析。
通过首先水浴加热培养基，在一定程度上降低液体培养基中的氧气溶解度，来配制OGD培养基(Dulbecco的修饰的Eagle培养基-无葡萄糖)。使用0.5μm漫射石在培养基中通入100％氮气30分钟以去除溶解氧。加入HEPES缓冲液至终浓度为1mM。喷射结束时将培养基直接加至神经元。取培养基的小样品使用下沉型氧气传感器确认氧气水平。氧气水平一般被降至0.9％至约5.0％氧气。
通过将箱子在充气前置于37℃培养箱中至少4小时(优选过夜)制备缺氧箱。去除培养容器中的培养基并替换为脱气的培养基，将培养容器置于缺氧箱中。通过系统在缺氧箱中以20-25Lpm的速率通入95％N2/5％CO2气体至少5分钟。将系统在培养箱中37℃下培育4小时，且1小时后再次对箱子进行脱气。
在该损伤流程的最后，对OGD培养基进行吸气并将温热的培养基加至神经元。24-28小时后，将PDAC和神经元以相等的100,000细胞每孔的数量接种至6-孔板，其悬浮于神经元培养基，后者被加至神经元并共培养6天。
对于各条件下的6孔板的随机区域拍摄显微照片。对具有典型神经元形态的细胞进行了鉴定，并记录神经突长度。神经突的平均长度与神经元健康成正相关，其在神经元和PDAC的共培养物中更长，表明PDAC保护细胞不受损伤。
活性氧分析
在使用过氧化氢作为活性氧发生器的分析中测定了PDAC吸收活性氧和保护细胞不受其影响的能力。
分析描述：将目标细胞(星形细胞，ScienCell Research Laboratories)接种到96-孔黑孔板，该板使用6000/cm2聚-L-赖氨酸进行预包被。将星形细胞在生长培养基中37℃和5％二氧化碳下贴壁过夜。第二天，去除培养基并将细胞与细胞渗透性染料DCFH-DA(二氯荧光素二脂)一起培育，后者为荧光探针。用Dulbecco磷酸缓冲液盐或Hank缓冲盐溶液洗涤去除过量染料。然后通过添加1000μM过氧化氢30-60分钟用活性氧损伤细胞。然后去除含过氧化氢的培养基并替换为无血清的、无葡萄糖的生长培养基。PDAC被加至6000/cm2，并将细胞再培养24小时。然后用标准荧光读板仪在480Ex和530Em下读取细胞。培养基的活性氧含量与细胞溶质中的DCFH-DA水平成正比。活性氧含量通过与预测定的DCF标准曲线比较进行测定。所有实验中N＝24。
为了进行分析，在使用前制备1×DCFH-DA，其中将20×DCFH-DA储存液在不含胎牛血清的细胞培养基中稀释至1×，并搅拌均匀。根据需要在DMEM或DPBS中进行制备过氧化氢(H2O2)稀释液。如下制备标准曲线：通过用细胞培养基稀释1mM标准DCF，按照浓度范围0μM-10μM的1∶10进行系列稀释，转移100μL的标准DCF至适于荧光检测的96孔板，并添加100μL的细胞裂解缓冲液。在480Ex和530Em下读取荧光。
结果：PDAC显著降低了星形细胞共培养中的活性氧浓度。参见图9。神经保护部分的表达和分泌
为了评价神经保护部分在正常（常氧）和损伤/疾病相关（低氧）状况下的基因表达，将PDAC以6000细胞/cm2接种于6孔组织培养皿，在培养基中生长24小时。然后，去除生长培养基，用PBS洗涤细胞。然后在细胞中加入无血清DMEM培养基，将培养物在37℃、5%CO2、21%O2、90%湿度下培育3小时。为了评价低氧条件下的PDAC基因表达，在细胞中加入平衡至1%O2的无血清培养基培养，将培养物在37℃、5%CO2、1%O2、90%湿度的缺氧箱中培育3小时。在所述条件下培育后，按生产商的说明使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从细胞中提取总RNA。使用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术进行基因转录的定量。按生产商的说明使用固相夹心ELISA免疫分析系统(R&D SYSTEMS，Minneapolis，WN)检测BDNF，GDNF，NT-3、NT-4/5在上清中的分泌。通过吸光度关联或报告显色物(四甲基联苯胺)采用各自的标准在450nM比色测定蛋白浓度。
为了评价神经保护部分的分泌，将PDAC以6000细胞/cm2接种于6孔组织培养皿，在PDAC培养基中生长24小时。然后，去除生长培养基，用PBS洗涤细胞。然后在细胞中加入无血清DMEM培养基，将培养物在37℃、5%CO2、21%O2、90%湿度下的标准组织培养箱中另外培育3小时，以评价PDAC在常氧条件下的营养因子分泌。为了评价低氧条件下的PDAC分泌，在细胞中加入平衡至1%O2的无血清培养基培养，将培养物在37℃、5%CO2、1%O2、90%湿度的缺氧箱中培育3小时。
在培育阶段结束后，从组织培养容器中收集细胞条件培养基，-80℃下冷冻并继而进行如上分析。
结果：将常氧条件下PDAC表达的抗氧化酶转录物的表达水平与人星形胶质细胞进行了对比。检测到的Ct值表明PDAC对抗氧化酶过氧化氢酶(CAT)、血红素氧合酶-1(HMOX-1)、醛氧化酶-1(AOX-1)和超氧化物歧化酶-1(SOD-1)的表达较高，说明与培养的星形胶质细胞相比具有更好的ROS中和。此外，将常氧条件下PDAC表达的神经营养因子的表达水平与人星形胶质细胞对照进行了对比。检测到的Ct值显示了PDAC中已知的神经营养因子脑源神经营养因子(BDNF)、神经胶质来源的神经营养因子(GDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)的表达，说明PDAC可以通过一些因子表现出神经保护功能。为了评价这些目标基因在损伤/疾病相关条件下的诱导性，在评价基因表达前，在低氧条件下培养PDAC3小时。低氧条件下培养后，PDAC对BDNF、GDNF、NT-3和NT-4/5的表达分别提高了2.5倍、5倍、30倍和15倍。这些结果表明在疾病相关环境下PDAC可以通过调控神经保护因子进行合适的应答，进一步支持了PDAC具有神经保护功能的假说。
为了确定增加的转录是否产生增加的蛋白表达，对条件化的上清液评价了神经营养因子的存在。在条件培养基中3个小时的培养后证实了BDNF、GDNF、NT-3和NT-4神经营养因子的大量存在，在缺氧损伤后3小时分别增加78%和100%的BDNF和NT-3的分泌证实了观察到的基因表达水平的调控。这些结果支持了PDAC能通过表达抗氧化酶和神经营养因子在治疗上调节多种急性CNS相关病变（例如，低氧驱动的ROS过量积累和神经元细胞损伤）的理论。
6.4实施例4：在大鼠SCI模型中使用PDAC治疗SCI
本实施例提供了一种示例性的模型和用于评价CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞（还称为PDAC）对SCI的作用的方法，特别的，用于评价移植到大鼠未受伤和受伤的脊髓中的PDAC的免疫排斥、迁移和分化。本模型提供了对PDAC单独给药或与第二治疗选项（与甲基强的松龙、锂、和/或环孢菌素A联合给药）组合给药的效果评价。PDAC对功能的影响（存在或不存在环孢菌素）在损伤12周后与不进行细胞移植的大鼠对照相比进行评价，所述功能包括运动活性的恢复（BBB分值）、皮质脊髓束和血清素激活轴突和脊髓白质区的再生。在损伤后立刻、2周和6周将细胞移植入脊髓，来刺激SCI的急性、亚急性和慢性阶段中的细胞移植。评价了损伤0、1、2、3、4和6周后的PDAC的存活、迁移和分化。另外，可以利用基因芯片、RT-PCR和ELISA方法评价PDAC给药后神经原性生长因子，例如，神经营养蛋白的表达。
实验设计
PDAC的体内存留。在0、1、2、3、4和6周将PDAC注射入大鼠脊髓椎节T9上边缘和T10下边缘的中央灰质区，所述大鼠施加或不施加25mm重锤打击(n=4/组)。6周后，用60mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠，用甲醛灌注，将脊髓水平分段用荧光解剖显微镜检查。通过荧光检测了PDAC在离注射位点不同距离的分布，将节段免疫组织学染色用于β-3-微管蛋白（神经元）、GFAP（星形胶质细胞）、巢蛋白（祖细胞）标志物。
治疗。PDAC给药的大鼠用甲基强的松龙(MP，在移植时30mg/kg大剂量)、锂(Li，100mg/kg/天，6周)和环孢菌素(CsA，10mg/kg/天)处理，评价了损伤和移植6周后移植的PDAC的数量、分布和特征。评价了单独的PDAC、单独的MP、单独的Li、单独的CsA、或MP+Li的效果。为了定量细胞，检测了脊髓中人DNA和绿色荧光蛋白(GFP)的量。通过对编码组成型GFP表达组件的质粒载体的基于Amaxa的电穿孔获得了PDAC中的短期-中期GFP表达。通过使用编码组成型GFP表达的慢病毒载体获得了长期表达。
基因/蛋白表达。使用RT/PCR和ELISA检测未处理或用单独的PDAC、PDAC+MP、PDAC+MP和Li、以及PDAC+MP、Li和CsA处理的动物中的LIF，BDNF，GDNF，NT3、NGFA和GFP的mRNA和蛋白水平。
恢复/再生。损伤后2周和6周移植PDAC（加入或不加入CsA），动物保持12周。评价运动恢复(BBB)，并进行组织学研究。
规程
麻醉。对77±1天大的Sprague-Dawley大鼠施行椎板切除术。用腹膜内戊巴比妥(雌性45mg/kg，雄性65mg/kg)麻醉大鼠。5分钟内未深度麻醉的大鼠被排除出实验。为了在损伤1周和4周后延迟的细胞脊髓移植，由头锥(5%诱导5分钟，然后维持1%)自发呼吸异氟烷麻醉大鼠。
脊髓损伤。在给大鼠剃毛并用碘伏准备手术侧后，制造一个中线背部切口露出T8-11脊柱，并进行T9-10椎板切除术露出下方的T13脊髓。钳住TS和T11背突将大鼠悬空。麻醉诱导1小时后，在T13脊髓上25mm落下一个10克重的棒子。在硬脑膜上放置一块聚乳酸和聚己内酯薄片(100)以防止粘连，并将一块自体皮下脂肪置于椎板切除术位置来延迟伤疤形成。椎板切除术上下方用丝线进行肌肉中线缝合。用不锈钢夹封闭皮肤。一周后去除夹子。
细胞移植。用26口径的结核菌素注射器切割硬脑膜，在脊髓中注射200,000细胞的1-微升悬液。为了延迟移植，用异氟烷麻醉后重新打开椎板切除术位点，制造小型硬脑膜切割，使用微量移液管注射两滴200,000细胞的1-微升悬液至脊髓喙部和尾部至撞击位置。
术后护理。将大鼠置于电热垫上直至苏醒。对表现出苍白病(来自足部颜色)的大鼠进行经口腔导管抽吸以清除分泌物并刺激呼吸。如果存在更多的呼吸道阻塞事件，可选的给药0.04mg/kg IM的阿托品或0.5mg/kg IM的吡咯糖以减少术中分泌加强。对有脱水迹象的大鼠（例如，后背皮肤收缩且在1秒后没有平复）进行5-10ml皮下盐水注射(雌性5ml，雄性10ml)。所有大鼠每天皮下注射50mg/kg的头孢唑啉，共7天，以减少尿路和窗口感染。
术后止痛。脊髓损伤的大鼠一般没有疼痛迹象，因为损伤导致在损伤部位和其下方的麻醉。然而，对于只接受椎板切除术的动物，即，没有脊髓损伤并显示术后疼痛，以2mg/kg体重的最高剂量对手术部位给予局部麻醉药布比卡因(麻卡因)。监控每只动物的疼痛迹象，根据需要进行额外的止痛。
长期护理。每天检查大鼠，每周评估运动分值(BBB)。首先，每天两次检查动物，且如果触诊表明其膀胱中有>1ml的尿则手动挤出。在最初的7天后，对浑浊尿和血尿（表示膀胱感染）的大鼠给予2.5mg/kg/天的拜有利(一种氟喹诺酮抗生素)，共7-10天。如果其不能清除感染，则对大鼠实行安乐死。其次，将大鼠置于无菌白纸层(Alpha Dry)上，其保持大鼠干燥并显示血尿的存在。挑出有血尿的大鼠单独护理以避免传递感染。第三，如果大鼠有疼痛的迹象（出声，对碰触敏感）或自食己肉（噬咬损伤部位下方皮节，表现为掉毛或皮肤穿透），那么给大鼠每天口服对乙酰氨基酚(64mg/kg/天口服“Baby Tylenol”)直至其皮肤损伤完全治愈。如果未发现疼痛有可治疗的原因，则对大鼠实行安乐死。第一周每天给动物称重，之后每周称重。
安乐死。所有动物用戊巴比妥(100mg/kg雌性-雄性剂量)深度麻醉，并断头处死用于分子研究或用多聚甲醛溶液灌注用于固定和组织学研究。
6.5实施例5：在大鼠TBI模型中使用PDAC治疗TBI
本实施例提供了一种示例性的模型和用于评价CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞（还称为PDAC）对TBI的作用的方法。不希望受限于任何特定理论或作用机制，TBI被认为导致脾块的减小，后者与导致血脑屏障穿透性增加的循环免疫细胞增加有关。从而，本方法提供了对PDAC的以下能力的评价：调控免疫应答；与脾细胞共存以促进脾细胞增殖和分泌抗炎性细胞因子例如IL-4和IL-10；保存脾块；以及维持诱导TBI之后的血脑屏障完整性。
体内方法
控制性皮质撞击损伤。使用控制性皮质撞击(CCI)装置（例如，eCCIModel6.3；VCU，Richmond，VA）按照Lighthall J.，Neurotrauma5，1–15(1988))中的描述进行单侧脑损伤，其公开内容全文引入作为参考。重225–250g的雄性大鼠用4%异氟烷和O2麻醉，将每只大鼠的头部固定在立体稳定框架内。头部固定在一个水平面上。使用中线切割暴露，在右侧颅顶施行7–8mm颅骨切除术。颅骨切除术的中央置于前囱和人字缝尖中点、中线侧～3mm处，覆盖颞顶皮质。动物受到用6mm直径撞击器尖部与垂直面呈10°角度以5.8m/s的撞击速度和150ms的停留时间(中度–重度损伤)形成3.1mm深的变形的单次撞击，使得撞击与皮质表面正交。对顶骨联合皮质撞击。通过麻醉动物、制造中线切割和从颅骨分开皮肤、结缔组织和腱膜来进行假损伤。然后封闭切口。
PDAC的制备和静脉注射。注射前将PDAC解冻、洗涤并重悬于磷酸缓冲盐(PBS)载体中，浓度2x106细胞/mL。对细胞计数并通过台盼蓝排除法检测活力。马上要静脉注射前，轻柔地滴定PDAC8–10次以确保产生均匀的细胞混合物。在CCI损伤2小时和24小时后以两个不同的剂量注射PDAC(CCI+2x106PDAC/kg和CCI+10x106PDAC/kg)。因此，每只处理动物接收2个单独剂量的指定PDAC浓度。CCI损伤对照动物在与细胞处理动物相同的指定时间接收单独的PBS载体注射。
大鼠脾切除术。对于脾切除术后对大鼠完成的所有试验，将雄性Sprague Dawley大鼠如上麻醉并置于仰卧位。在腹部左上象限制造一个小的3cm切口，然后进行脾切除和脾门连接。在去除脾后连续缝合封闭切口。脾切除术后动物恢复和适应72小时。然后所有试验在原始脾切除术72小时后完成。
伊文思蓝血脑屏障(BBB)渗透分析。CCI损伤72小时后，将大鼠如上麻醉，在右侧颈内静脉直接插管注入1mL(4cm3/kg)的3%伊文思蓝染料PBS液。将大鼠恢复60分钟以允许灌注染料。此后，右心房穿刺处死动物并灌注4%多聚甲醛。然后，切除动物头部提取大脑。将小脑从剩余的皮质组织中切除。沿中线将脑分开，检测每个半球(损伤同侧和损伤对侧)进行归一化。然后，每个半球在5mL甲醛中50℃培育过夜，以允许染料提取。离心后，将100μL的每个样品上清转移到96孔板(三个平行)，在620nm检测吸光度。所有值都按半球重量归一化。
皮质免疫组织化学。进一步通过紧密连接封闭蛋白免疫染色和荧光显微镜观察(DAPI蓝用于胞核，FITC绿用于闭合蛋白)来检查BBB完整性。CCI损伤72小时后，对4组(未损伤、单独CCI损伤、CCI损伤+2x106PDAC/kg和CCI损伤+10x106PDAC/kg)保留完整脾脏的大鼠和进行脾切除术的大鼠进行断头后快速处死。提取大脑，分离两个半球(损伤同侧和损伤对侧)。然后快速将组织样品置于预冷的2-甲基丁烷用于闪冻。将样品转移至干冰并储存在-80℃直至将组织切块。然后将组织样品置于最佳切割温度化合物，例如，Sakura Finetek，Torrance，CA，并穿过直接损伤区域制造20μm冰冻切片。通过用紧密连接封闭蛋白(例如，1:150稀释，Invitrogen，Carlsbad，CA)抗体和合适的异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的第二抗体(例如，1:200稀释，Invitrogen，Carlsbad，CA)染色对血管构筑的直接损伤进行评价。在所有的抗体染色后，用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)(例如，Invitrogen，Carlsbad，CA)对组织块进行复染色用于核染色和荧光显微镜观察。
脾免疫组织化学。为了体内追踪PDAC，例如，为了检测PDAC是否绕开肺微血管并到达脾，对4组(未损伤、单独CCI损伤、CCI损伤+2x106PDAC/kg和CCI损伤+10x106PDAC/kg)大鼠进行假损伤或CCI损伤。然后，CCI损伤2和24h后对该两个处理组注射量子点(例如，QDOT，Qtracker细胞标记试剂盒525和800，Invitrogen，Inc.，Carlsbad，CA)标记（根据生产商建议的流程）的PDAC。第二QDOT标记的PDAC灌输后6小时，处死动物并去除脾脏。然后将脾脏置于荧光扫描仪上(例如，OdysseyImaging System，Licor Inc.，Lincoln，NE)以定位QDOT标记的PDAC。扫描完成后，快速将组织样品置于预冷的2-甲基丁烷用于闪冻。将样品转移至干冰并储存在-80℃直至使用。然后将组织样品置于最佳切割温度化合物（例如，Sakura Finetek，Torrance，CA），并穿过脾脏制造10μm冰冻切片。用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)(例如，Invitrogen，Carlsbad，CA)对组织块进行染色用于核染色，并用荧光显微镜观察QDOT标记的PDAC和脾细胞。另外，根据生产商建议的流程进行苏木精和曙红染色，以评价脾脏构筑。
脾细胞分离/脾块检测。损伤72小时后，对动物进行脾切除术并检测脾块。此时将动物麻醉。然后，使用安全刀片将脾脏颗粒化，用基础培养基(10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI液)洗涤，压碎并用100μm滤器过滤。将来自滤器的流出物样品轻轻滴定8-10次，用40μm滤器过滤除去任何残留的结缔组织。1000g离心样品3min。然后去除上清液，将样品重悬于3mL的红血细胞裂解缓冲液(Qiagen Sciences，Valencia，CA)并在冰上培育5min。然后，用基础培养基洗涤样品两次，并按前述设定进行离心。对脾细胞进行计数并通过台盼蓝排除法进行活力检测。
体内脾细胞增殖分析。使用例如Click-iTTM EdU流式细胞分析试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据生产商建议的流程对处死时的活性增殖脾细胞百分比(S阶段)进行了检测。简而言之，在72h收集脾细胞，加入20mM的EdU并培育2h。然后洗涤细胞并用4%多聚甲醛进行固定。使用Triton-X100通透细胞，随后加入由生产商提供的抗EdU抗体“混合物”。最后，洗涤细胞并加入核糖核酸酶和CellCycle488-Red染色分析DNA含量。
体内脾细胞凋亡分析。使用例如Annexin V染色(BD Biosciences，SanJose，CA)根据生产商建议的流程对处死时的凋亡脾细胞百分比进行了检测。简而言之，在分离后将脾细胞用冷PBS洗涤两次。然后用5μL的AnnexinV和7-氨基-放线菌素(7-AAD)培育1x106细胞15min。然后使用流式细胞术检测凋亡细胞百分比。使用例如RNEasy柱(Qiagen，Valencia，CA)根据生产商的说明从脾细胞中分离定量PCR RNA。大鼠参比RNA(Stratagene，La Jolla，CA)用作阳性对照。用M-MLV逆转录酶和随机引物(Promega，Madison，WI)合成cDNA。对照反应中不使用逆转录酶以控制基因组DNA污染。使用例如9600仿真的ABI7500进行qPCR。
体外方法
脾细胞培养。密度为7.5x105细胞/mL的培养的脾细胞在用2μg伴刀豆球蛋白A刺激的生长培养基(10%FBS、1%添加维生素的RPMI、1%丙酮酸钠、0.09%2-巯基乙醇和1%青霉素/链霉素的RPMI液)中扩增72h。
脾细胞表征。用流式细胞术分析分离的脾细胞测定单核细胞、嗜中性粒细胞和T细胞群。单核细胞和嗜中性粒细胞分别使用CD200和CD11b/CD18抗体进行检测。脾细胞T细胞群使用CD3、CD4和CD8抗体进行标记。所有的染色根据生产商建议的流程进行。
体外增殖分析。使用例如Click-iTTM EdU流式细胞分析试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据生产商建议的流程对在刺激的生长培养基中培养后活性增殖CD4+脾细胞的百分比(S阶段)进行了检测。简而言之，脾细胞在如上所述的用2μg伴刀豆球蛋白A刺激的生长培养基中培养72h，密度为7.5x105细胞/mL。加入20mM的EdU并培育1h。然后用4%的牛血清DMEM(4%FBS)洗涤细胞并加入CD4-PE以筛选（gate）目标T细胞群。培育30分钟后，洗涤细胞并用4%多聚甲醛进行固定。使用Triton-X100通透细胞，随后加入由生产商提供的抗EdU抗体“混合物”。最后，洗涤细胞并加入核糖核酸酶和CellCycle488-Red染色分析DNA含量。
脾细胞细胞因子体外生产。在刺激的生长培养基中培养后，使用例如BD流式细胞小球微阵列弹性集(BD Biosciences，San Jose，CA)根据生产商建议的流程进行流式细胞术定量抗炎性细胞因子IL-4和IL-10的生产。
6.6实施例6：PDAC在组织重塑中的用途
本实施例描述了PDAC是如何得以用于调控纤维化并从而进行组织重塑的。
使用ELISA和多重分析对PDAC条件培养基和正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)条件培养基进行了比较，以评价两种细胞的分泌谱。检测到PDAC分泌的卵泡抑素比NHDF多60%-65%。还检测到PDAC分泌的肝细胞生长因子(HGF)比NHDF多75%-95%。另外，检测到PDAC能分泌基质金属蛋白酶(MMP)1、MMP2、MMP7和MMP10。
PDAC相对NHDF而言分泌高水平的卵泡抑素和HGF以及PDAC还分泌MMP1、MMP2、MMP7和MMP10的检测结果表明，PDAC可能具有体内组织重塑的能力，例如调节纤维化，从而其可以用于在此描述的方法中。
6.7实施例7：使用PDAC进行治疗的方法
6.7.1使用PDAC治疗SCI
个体患有脊髓损伤(SCI)并正在经历感觉和/或运动功能丧失。对个体静脉内给予2.5x108-1x1010的CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞(PDAC)的0.9%NaCl溶液。在随后的两周到一个月内监控个体以评价一种或多种症状的减少。另外在随后的一年内对个体进行监控，并根据需要以相同的剂量给予PDAC，例如，如果症状重现或变得更严重。
6.7.2使用PDAC治疗SCI
个体患有脊髓损伤(SCI)并正在经历感觉和/或运动功能丧失。对个体脊髓损伤部位给予1x106-1x107的CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞(PDAC)的0.9%NaCl溶液。在随后的两周到一个月内监控个体以评价一种或多种症状的减少。另外在随后的一年内对个体进行监控，并根据需要以相同的剂量给予PDAC，例如，如果症状重现或变得更严重。
6.7.3使用PDAC治疗TBI
个体患有外伤性脑损伤(TBI)并正在经历记忆丧失、注意力/专注度差和/或眩晕/失去平衡。对个体静脉内给予2.5x108-1x1010的CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞(PDAC)的0.9%NaCl溶液。在随后的两周到一个月内监控个体以评价一种或多种症状的减少。另外在随后的一年内对个体进行监控，并根据需要以相同的剂量给予PDAC，例如，如果症状重现或变得更严重。
6.7.4使用PDAC治疗TBI
个体患有外伤性脑损伤(TBI)并正在经历记忆丧失、注意力/专注度差和/或眩晕/失去平衡。对个体颅内给予1x106-1x107的CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞(PDAC)的0.9%NaCl溶液。在随后的两周到一个月内监控个体以评价一种或多种症状的减少。另外在随后的一年内对个体进行监控，并根据需要以相同的剂量给予PDAC，例如，如果症状重现或变得更严重。
等同性：
本文的组合物和方法不受限于本文所述的具体实施方式的范围。的确，除所述那些以外，通过上述说明和附图对所描述的组合物和方法的多种改变将对本领域技术人员是显而易见的。这些改变旨在处于所附权利要求的范围内。
在本文中引用了多个出版物、专利和专利申请，以上出版物、专利和专利申请的公开内容以其全部内容并入本文作为参考。

Claims (30)

1.一种治疗患有与脊髓损伤或外伤性脑损伤相关的疾病、紊乱或病况或存在发病风险的个体的方法，包括对个体给予治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基，其中治疗有效量是足以在所述疾病、紊乱或病况的一种或多种症状中产生可检测到的改善的量。
2.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞是CD10+、CD34–、CD105+、CD200+胎盘干细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述胎盘干细胞表达CD200且不表达HLA-G，或表达CD73、CD105和CD200，或表达CD200和OCT-4，或表达CD73和CD105且不表达HLA-G，或表达CD73和CD105且当含有所述干细胞的胎盘细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体，或表达OCT-4且当含有所述干细胞的胎盘细胞群在允许胚胎样小体形成的条件下培养时有利于在所述胎盘细胞群中形成一种或多种胚胎样小体。
4.权利要求2的方法，其中个体患有与脊髓损伤相关的疾病、紊乱或病况或存在发病风险。
5.权利要求4的方法，其中脊髓损伤来自于直接创伤。
6.权利要求4的方法，其中脊髓损伤来自于骨折片、血肿或盘材料的压迫。
7.权利要求4的方法，其中脊髓损伤来自于由于脊髓动脉伤害或撞击的局部缺血。
8.权利要求2的方法，其中所述疾病、紊乱或病况是由脊髓损伤导致的脊髓休克。
9.权利要求2的方法，其中所述疾病、紊乱或病况是由脊髓损伤导致的神经源性休克。
10.权利要求2的方法，其中所述疾病、紊乱或病况是由脊髓损伤导致的自主反射障碍。
11.权利要求2的方法，其中所述疾病、紊乱或病况是由脊髓损伤导致的水肿。
12.权利要求2的方法，其中所述疾病、紊乱或病况是选自由下述组成的组：中髓综合症、脊髓半切综合症、前髓综合症、脊髓圆锥综合症和马尾综合症。
13.权利要求4的方法，其中脊髓损伤位于颈椎、胸椎、腰椎、或骶椎的一种或多种。
14.权利要求4的方法，其中脊髓损伤是对于颈髓、胸髓、腰骶椎、椎体、枕骨的一种或多种，或一种或多种的马尾神经。
15.权利要求4的方法，其中所述一种或多种症状包括脊髓的颈段、胸段、腰段或骶段的运动功能、感觉功能、或运动和感觉功能的缺失或损伤。
16.权利要求4的方法，其中所述一种或多种症状包括臂部、躯干、腿部或盆腔内器官的运动机能、感觉功能、或运动和感觉功能的缺失或损伤。
17.权利要求4的方法，其中所述一种或多种症状包括在皮节C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4或L5的一种或多种处的麻木。
18.权利要求4的方法，其中治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基在脊髓损伤的14天内被给予个体。
19.权利要求4的方法，包括对所述个体给予第二治疗剂。
20.权利要求9的方法，其中所述第二治疗剂是皮质类固醇、神经保护剂、免疫调节或免疫抑制剂或抗凝剂。
21.权利要求2的方法，其中个体患有与外伤性脑损伤相关的疾病、紊乱或病况或存在发病风险。
22.权利要求21的方法，其中外伤性脑损伤是大脑额叶、顶叶、枕叶、颞叶、脑干、或小脑的损伤。
23.权利要求21的方法，其中外伤性脑损伤是轻度外伤性脑损伤。
24.权利要求21的方法，其中外伤性脑损伤是中度至重度外伤性脑损伤。
25.权利要求21的方法，其中所述症状是下述一种或多种：头痛、思考困难、记忆力问题、注意力缺陷、情绪波动和挫折、疲劳、视力障碍、记忆力减退、注意力/专注度不佳、睡眠障碍、头晕/失去平衡、烦躁不安、情绪障碍、感觉抑郁、抽搐、恶心、嗅觉损失、对声光敏感、情绪变化、迷失或糊涂或思维缓慢。
26.权利要求21的方法，其中所述症状是下述一种或多种：注意困难、专注度困难、注意力不集中、记忆困难、处理速度缓慢、混乱、持续言语、冲动、语言处理困难、言语困难、不理解口语（感觉性失语）、说话和被理解困难（表达性失语）、口齿不清、说话过快或过慢、阅读问题、写作问题、对触摸、温度、运动、肢体位置和细微区分的解释困难、将感官印象整合或构架至心理学有意义的数据的困难、部分或完全丧失视力、眼部肌肉衰弱和双视（复视）、视力模糊、判断距离困难、眼球不自主运动（眼球震颤）、不耐光（畏光）、听力下降或损失、耳鸣、对声音敏感性增加、嗅觉损失或减退（嗅觉缺失症）、味觉损失或减退、癫痫、癫痫相关的抽搐、身体瘫痪/痉挛、慢性疼痛、肠和/或膀胱失去控制、睡眠障碍、耐久力损失、食欲改变、体温失调、月经困难、社会情感困难、依赖行为、情感能力丧失、缺乏动力、烦躁不安、易怒、抑郁、去抑制、或缺乏认识。
27.权利要求21的方法，包括对所述个体给予第二治疗剂。
28.权利要求9的方法，其中所述第二治疗剂是抗癫痫药、抗抑郁药、金刚烷胺、哌醋甲酯、溴隐亭、卡马西平或阿米替林。
29.权利要求1的方法，其中治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基通过选自以下的路径给予个体：静脉内、动脉内、腹膜内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内、滑膜内、眼内、玻璃体内、大脑内、脑室内、囊内、骨内输液、膀胱内、透皮、脑池内、硬脑膜外或皮下给药。
30.权利要求1的方法，其中治疗有效量的胎盘干细胞或胎盘干细胞条件培养基直接在损伤部位给予个体。
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