JP2018500325A - 前駆細胞を用いた網膜変性の治療法 - Google Patents

前駆細胞を用いた網膜変性の治療法 Download PDF

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Abstract

分娩後由来細胞などの前駆細胞、及び前駆細胞由来の馴化培地を用いる網膜変性を治療及び低減させるための方法及び組成物が開示される。視細胞などの網膜細胞を保護して網膜細胞のアポトーシスを阻害する、前駆細胞によって分泌される栄養因子及びその他の剤も更に開示される。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１４年１２月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／０９２，６５８号、及び２０１５年１０月２日に出願された米国特許仮出願第６２／２３６，７３２号の利益を主張するものであり、これらの各内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は、眼疾患及び眼障害に対する細胞療法又は再生療法の分野に関する。具体的には、本発明は、臍帯組織由来細胞、及び胎盤組織由来細胞、並びにこれらの細胞から調製された馴化培地などの前駆細胞を用いた、眼球細胞及び眼球組織の再生又は修復のための方法及び組成物を提供する。
身体の複雑かつ繊細な器官として、眼球は多数の疾患、及び身体が正常に機能する能力に影響を及ぼすその他の有害な状態を経験し得る。これらの状態の多くが、特定の眼球細胞、及びこれらの細胞から構成される組織の損傷又は変性を伴う。一例として、視神経及び網膜の疾患及び変性的状態は、全世界における失明の主な原因である。角膜、水晶体、及び付随する眼球組織の損傷又は変性は、全世界における失明のもう一つの大きな原因を占める。
網膜は、光信号を神経信号に変換する、７層の交互になる細胞及び突起を含む。網膜視細胞及び隣接する網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、多くの障害において、遺伝変種又は環境条件（加齢を含む）のために不均衡となる機能単位を形成している。これは、アポトーシス又は二次的変性による視細胞の喪失をもたらし、更に、進行性の視力悪化、及び、一部の場合では失明をもたらす（参考として、例えば、Ｌｕｎｄ，Ｒ．Ｄ．らのＰｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１；２０：４１５〜４４９）を参照されたい）。このパターンに該当する眼球障害の２つの部類は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、及び網膜色素変性症（ＲＰ）である。
ＡＭＤは、米国の５０歳以上の人口で最も大きな視力喪失の原因であり、その有病率は年齢とともに増加する。ＡＭＤの一次的障害は、ＲＰＥの機能障害及びブルッフ膜内の変化が原因であると考えられ、とりわけ、脂質沈着、タンパク質架橋、及び養分透過性の減少によって特徴付けられる（上記のＬｕｎｄら（２００１）を参照されたい）。黄斑変性には、遺伝子構造、加齢、栄養、喫煙、及び太陽光への暴露、又はその他の酸化ストレスを含む様々な要素が寄与する場合がある。ＡＭＤの非滲出性、すなわち「乾燥」形態はＡＭＤの事例の９０％を占め、その他の１０％は滲出性新生血管形態（「湿潤型」ＡＭＤ）である。乾燥型ＡＭＤの患者においては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の段階的な消失が起こり、限局性の萎縮領域をもたらす。ＲＰＥの消失に続いて視細胞の喪失が起こるため、影響を受けた網膜領域は視覚機能をほとんど又は全く有さない。
ＡＭＤの現行の療法は、例えばレーザー療法及び薬学的インターベンションなどの処置を伴う。熱エネルギーを移送することによって、レーザービームは、黄斑下の漏孔のある血管を破壊して、視力喪失の速度を低下させる。レーザー療法の欠点は、ビームによって送達される高い熱エネルギーが、隣接する健康な組織も破壊してしまうことである。Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ第４版（Ｐｕｒｖｅｓ，Ｄら（２００８））には、「現在、乾燥型ＡＭＤに対する治療法は存在しない」と記載されている。
ＲＰＥ移植は、ヒトにおいては失敗している。例えば、Ｚａｒｂｉｎ，Ｍ（２００３）には「通常の加齢下では、ヒトのブルッフ膜の、特に黄斑下区域は、（例えば、厚さの増大、ＥＣＭ及び脂質の堆積、タンパク質の架橋、糖化最終産物の非酵素的形成を含む）様々な変化を経験する。これらの変化及びＡＭＤが原因の更なる変化は、ＥＣＭリガンド（例えば、ラミニン、フィブロネクチン、及びコラーゲンＩＶ）の生物学的利用性を低下させて、ＡＭＤを患う眼球内におけるＲＰＥ細胞の極めて低い生存率の原因となり得る。そのため、ヒトＲＰＥ細胞が、これらのＥＣＭ分子と結合するために必要なインテグリンを発現するものの、加齢した黄班下のヒトブルッフ膜上で生存するＲＰＥ細胞は、障害を生じる」と記載されている。（Ｚａｒｂｉｎ，ＭＡ，Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ，２００３；１０１：４９３〜５１４）。
網膜色素変性症は、主に遺伝性疾患であり、１００を超える突然変異が視細胞の喪失に関係していると考えられている（上述のＬｕｎｄら（２００１）を参照されたい）。突然変異の大部分は視細胞を標的にしているが、いくつかはＲＰＥ細胞に直接影響を与える。これらの突然変異は、視細胞とＲＰＥ細胞との間における分子の輸送及び光伝達としてのこうしたプロセスに、協働して影響を及ぼす。
それほど一般的ではないが、なおかつ消耗性のその他の網膜症は、視力喪失及び失明をもたらす進行性の細胞変性を更に伴い得る。これらとしては、例えば、糖尿病性網膜症、及び脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）が挙げられる。
組織の修復及び再生のための幹細胞療法の出現は、数多くの上述の細胞変性病態及びその他の眼球傷害に対する治療の可能性を提供する。幹細胞は、自己複製及び分化して多種多様な成熟細胞系統を発生させる能力を有する。こうした細胞の移植は、標的組織を再構成することによって、生理学的及び解剖学的機能を修復するための臨床的手段として用いられ得る。幹細胞技術の適用は広範にわたり、組織工学、遺伝子治療の送達、及び細胞治療（すなわち、生物学的薬剤を生成するか、又はそれらの薬剤を含む、生細胞又は細胞成分を体外から供給することによって、標的部位にそのような生物学的薬剤を送達すること）を含む。（総説は、例えば、Ｔｒｅｓｃｏ，Ｐ．Ａ．らのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０００）４２：２〜３７を参照されたい）。
近年では、分娩後由来細胞が網膜変性を改善することが示されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。英国外科医師会（ＲＣＳ）ラットは、チロシン受容体キナーゼ（Ｍｅｒｔｋ）が欠損して、外節食作用に影響を及ぼし、視細胞の細胞死をもたらすことを示す。（Ｆｅｎｇ ＷらのＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２００２，１０：２７７（１９）：１７０１６〜１７０２２）。ＲＣＳラットの網膜下腔に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を移植することで、視細胞の喪失の進行を制限して、視覚機能を維持することが判明した。（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。分娩後由来細胞を用いて、ＲＣＳモデルの視細胞のレスキューを促進して、視細胞を保存し得ることも実証されている。（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）をＲＣＳラットの眼球に網膜下注入することで、視力が向上し、網膜変性が改善された（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号（Ｌｕｎｄ ＲＤら）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００７；２５（３）：６０２〜６１１）。更に、ｈＵＴＣ由来の馴化培地（ＣＭ）を用いた治療によって、インビトロでジストロフィＲＰＥ細胞におけるＲＯＳの食作用が回復した。（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。
食細胞によるアポトーシス細胞のクリアランスは正常な生命に不可欠な構成要素であり、このプロセスの欠陥は、自己寛容性及び自己免疫性と大きな関連を有し得る（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．，２０１３，５（１）：ａ００８７４８．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ００８７４８参照）。アポトーシス細胞の認識及び除去は、マクロファージ、単核細胞、及びその他の白血球などの専門の食細胞（受容体が食作用の病原体と結合する）、及び、上皮細胞、ＲＰＥ細胞、内皮細胞などの非専門の食細胞（食作用が主な機能ではない）によって主に媒介される。現在までに、表面タンパク質のグリコシル化における変化、又は表面電荷における変化を含む、数多くの「食誘引（eat me）」シグナルが同定されている（Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．，２０１３）。ホスファチジルセリン（ＰＳ）の外在化は、アポトーシスの特徴であり、最も研究されている「食誘引」シグナルである（Ｗｕら，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２００６，１６（４）：１８９〜１９７）。「食誘引」シグナルは、直接的にか（ＰＳ受容体と同様に）、又は架橋分子及び補助受容体を介して間接的にか、のいずれかで、食細胞の貪食受容体によって認識される（Ｅｒｗｉｇら，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｄｉｆｆｅｒ．，２００８；１５：２４３〜２５０）。架橋分子の乳脂肪球−ＥＧＦ−因子８（ＭＦＧ−Ｅ８）、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、タンパク質Ｓ、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）、アポリポタンパク質Ｈ（従来はβ２−糖タンパク質、β２−ＧＰＩとしても知られる）の全てがアポトーシス細胞表面上のＰＳと結合する。続いて、ＭＦＧ−Ｅ８は、そのＲＧＤモチーフを介してαｖβ３及びαｖβ５インテグリンによって）認識され（Ｈａｎａｙａｍａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０４：１１４７〜１１５０、Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏら，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，２００４；１１：９４３〜９４５）、Ｇａｓ６はＡｘｌ、Ｔｙｒｏ３、及びＭｅｒファミリーの受容体チロシンキナーゼによって認識され（Ｓｃｏｔｔら，Ｎａｔｕｒｅ，２００１；４１１：２０７〜２１１）、アポリポタンパク質Ｈはβ２−ＧＰＩ受容体に認識される（Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら，Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ，１９９７；２７２：３１１１３〜３１１１７）。その他の架橋分子は、コレクチンファミリーのサーファクタントタンパク質Ａ及びＤのメンバーなどの、アポトーシス細胞表面の糖及び／又は脂質異常の認識に関連している（Ｖａｎｄｉｖｉｅｒら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２；１６９：３９７８〜３９８）。
続いて、分子のコレクチンファミリーは、これらのコラーゲン尾部とカルレティキュリン（ＣＲＴ）との相互作用、続いて低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質（ＬＲＰ−１／ＣＤ９１）を介する食細胞による取り込みシグナルによって認識される（Ｇａｒｄａｉら，Ｃｅｌｌ，２００３；１１５：１３〜２３）。別の例として、同定された第１の架橋分子は、細胞外マトリックス糖タンパク質であるトロンボスポンジン（ＴＳＰ）−１（Ｓａｖｉｌｌら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１９９２；９０：１５１３〜１５２２）であって、これは、アポトーシス細胞のＴＳＰ−１の結合部位と結合し、続いて、αｖβ３及びαｖβ５インテグリンを含む食細胞上の受容体複合体、並びにスカベンジャー受容体ＣＤ３６と結合するものと考えられた。アネキシンＩはＣａ２＋依存的リン脂質結合タンパク質のアネキシンファミリーに属し、原形質膜のサイトゾル表面上に優先的に配置される。アネキシンＩは、ＰＳと共局在することが示された。
ＲＰＥによるＲＯＳ食作用は、網膜の機能に不可欠である（Ｆｉｎｎｅｍａｎｎら，ＰＮＡＳ，１９９７；９４：１２９３２〜９３７）。ＲＯＳのＲＰＥ食作用に参加していることが報告された受容体としては、スカベンジャー受容体ＣＤ３６、インテグリン受容体αｖβ５、Ｍｅｒｔｋとして知られる受容体チロシンキナーゼ、及びマンノース受容体（ＭＲ）（ＣＤ２０６）が挙げられる（Ｋｅｖａｎｙら，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００９；２５：８〜１５）。Ｆｉｎｎｅｍａｎｎは、単離ＲＯＳが外在化したＰＳを有し、ＰＳを遮断又は除去することで、培養下のＲＰＥによって、これらの結合及び呑食が低下することを発見した（Ｆｉｎｎｅｍａｎｎら，ＰＮＡＳ，２０１２；１０９（２１）：８１４５〜８１４８）。しかしながら、ＲＰＥの食作用については依然として不明な点が多い。
本発明は、眼疾患及び障害に対する細胞療法又は再生療法に適用可能な組成物及び方法を提供する。具体的には、本発明は、分娩後由来細胞などの前駆細胞、及びこれらの細胞から生成された馴化培地を用いた眼球組織の再生又は修復を含む、眼疾患又は状態を治療するための方法及び組成物を特徴とする。分娩後由来細胞は、臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）、又は胎盤組織由来細胞（ＰＤＣ）である場合がある。
本発明の一態様は、前駆細胞又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を被験体に投与することを含む眼疾患の治療法であり、細胞は架橋分子を分泌する。本発明の一実施形態では、架橋分子は、馴化培地中の細胞集団によって分泌される。更なる一実施形態では、架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）−１、及びＴＳＰ−２から選択される。本発明の実施形態では、細胞は前駆細胞である。本発明の特定の実施形態では、細胞は分娩後由来細胞である。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。
実施形態では、前駆細胞の集団、例えば分娩後由来細胞は、架橋分子を分泌する。一実施形態では、例えば分娩後由来細胞などの前駆細胞の集団から調製された馴化培地は、細胞集団によって分泌された架橋分子を含有する。細胞によって分泌され、かつ馴化培地中で分泌される架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される。分娩後由来細胞は、臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）、又は胎盤組織由来細胞（ＰＤＣ）である。
一実施形態では、架橋分子は視細胞のアポトーシスを阻害する。別の一実施形態では、前駆細胞によって分泌され、かつ馴化培地中で分泌された架橋分子は、視細胞の喪失を低下させる。一実施形態では、視細胞の喪失は、視細胞断片の食作用を刺激する架橋分子によって低下する。
別の一実施形態では、上記の細胞の集団、又は上記の細胞の集団から調製された馴化培地は、桿体外節（ＲＯＳ）を改質して食作用を促進させる。更なる一実施形態では、架橋分子は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞によってＲＯＳの結合及び内在化を強化する。
別の一実施形態では、上記の細胞の集団、又は上記の細胞の集団から調製された馴化培地は、細胞集団によって分泌された受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）栄養因子を含有する。特定の一実施形態では、栄養因子はＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ及びＧＤＮＦである。実施形態では、ＲＴＫ栄養因子は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞内で食作用を媒介する。
特定の実施形態では、ＲＴＫ栄養因子は、ＲＰＥ細胞による食作用を媒介して、流出された視細胞断片（細胞によって流出された視細胞断片）を貪食する。更なる一実施形態では、ＲＴＫ栄養因子は、ＲＣＥ細胞上の受容体を活性化して、食作用を刺激する。
本発明の別の一態様は、網膜変性において視細胞の喪失を低下させるための方法を特徴とし、方法は、視細胞の喪失を低下させるのに効果的な量の前駆細胞の集団、又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を眼に投与することを含む。本発明の一実施形態では、前駆細胞は分娩後由来細胞である。特定の一実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。その他の実施形態では、分娩後由来細胞は架橋分子を分泌する。実施形態では、馴化培地は、分娩後由来細胞の集団などの細胞集団によって分泌された架橋分子を含有する。分娩後由来細胞によって分泌される架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される。
別の一実施形態では、馴化培地は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織由来の、単離された分娩後由来細胞、又は分娩後由来細胞の集団から生成される。実施形態では、分娩後由来細胞は培養下で増殖可能であり、また、神経表現型の細胞に分化する能力を有し、細胞は、増殖するためにＬ−バリンを必要とし、少なくとも約５％の酸素中で増殖することが可能である。この細胞は、（ａ）培養下で少なくとも約４０回倍加する能力、ｂ）コーティングされた又はコーティングされていない組織培養容器上での付着及び増殖（ここでコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオミチン（polyomithine）、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む）、（ｃ）組織因子、ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生、（ｄ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのうちの少なくとも１つの産生、（ｅ）フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのうちの少なくとも１つの産生の欠如、（ｆ）遺伝子の発現が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８；レチクロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫（melonoma）増殖刺激活性、α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子、α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウイルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ホモサピエンスクローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；卵巣癌においてダウンレギュレート１；及びクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のホモサピエンス遺伝子、をコード化する遺伝子のうちの少なくとも１つに関して増大すること、（ｇ）遺伝子発現が、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、低身長感受性ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）；間葉ホメオボックス２（増殖停止特異的ホメオボックス）；ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）；クリスタリン、αＢ；形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２（disheveled associated activator of morphogenesis 2）；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１の類似体；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；ｒｕｎｔ関連転写因子３；インターロイキン１１受容体、α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）；仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７；コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α１；テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）；ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５；ヘファエスチン；インテグリン、β８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ホモサピエンスｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４；インテグリン、β７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）；ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１；初期増殖応答３；ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５；仮想タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；バイグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）；ホモサピエンスｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）；仮想タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）；ニューラリン１の類似体；Ｂ細胞転座遺伝子１；仮想タンパク質ＦＬＪ２３１９１；及びＤＫＦＺｐ５８６Ｌ１５１をコード化する遺伝子の少なくとも１つに関して低減すること、並びに（ｈ）ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼ発現の欠如、の特徴のうちの１つ又は２つ以上を更に備える。一実施形態では、臍帯組織由来細胞は、ＥＬＩＳＡにより検出される、（ｉ）ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰｌｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌、（ｊ）ＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ａ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠如、の特徴を更に有する。別の一実施形態では、胎盤組織由来細胞は、（ｉ）ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌；（ｊ）ＥＬＩＳＡにより検出される、ＴＧＦ−β２、ＭＩＰｌｂ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠如、の特徴を更に有する。
特定の実施形態では、分娩後由来細胞は、細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）、細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６８）、細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７４）、細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７５）、又は細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７９）の全ての識別特徴を有する。一実施形態では、臍組織由来の分娩後由来細胞は、細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）、又は細胞型ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ１７）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６８）の全ての識別特徴を有する。別の一実施形態では、胎盤組織由来の分娩後由来細胞は、細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７４）；細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７５）；又は細胞型ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０７９）の全ての識別特徴を有する。
特定の実施形態では、分娩後由来細胞は、メタロプロテアーゼ活性、粘液溶解活性、及び中性プロテアーゼ活性を含む、１つ又は２つ以上の酵素活性の存在下で単離される。好ましくは、これらの分娩後由来細胞は、これらの細胞が培養下で継代される際に維持される、正常核型を有する。好ましい実施形態では、分娩後由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０をそれぞれ発現する。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞はＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ発現する。好ましい実施形態では、分娩後由来細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７を発現しない。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞は、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを発現しない。実施形態では、細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
実施形態では、上記の通り、細胞集団は、分娩後由来細胞の実質的に均質な集団である。特定の一実施形態では、集団は分娩後由来細胞の均質な集団である。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から誘導される。
特定の実施形態では、上記の分娩後由来細胞の集団、又は細胞集団から調製された馴化培地は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、又は他の複能性若しくは多能性の幹細胞などの、少なくとも１つのその他の細胞型と共に投与される。これらの実施形態では、その他の細胞型は、分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地と同時に、その前に、又はその後に、投与してもよい。
同様に、これら及びその他の実施形態では、上述した分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地は、眼球治療用の薬剤などの少なくとも１つのその他の薬剤、又は抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、若しくは増殖因子などの別の有益な補助剤と共に投与される。これらの実施形態では、その他の剤は、分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地と同時に、その前に、又はその後に、投与してもよい。
本明細書に記載された様々な実施形態では、分娩後由来細胞（臍又は胎盤由来細胞）の集団、又は分娩後由来細胞から生成された馴化培地は、眼球、例えば眼球の表面に、若しくは眼球の内部に、又は眼球に近接する位置（例えば、眼球の背後）に投与する。分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地は、カニューレを介して、又は患者の身体の眼球内若しくは眼球に近接した位置に移植された装置から投与してもよく、あるいは、細胞の集団又は馴化培地を備えるマトリックス又はスカフォールドを移植することによって投与してもよい。
本発明の別の一態様は、視細胞の喪失を低下させるのに効果的な量の前駆細胞の集団、又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を含む、網膜変性症において視細胞の喪失を低下させるための組成物を特徴とする。好ましくは、前駆細胞は、上記の分娩後由来細胞である。より好ましくは、分娩後由来細胞は、上述したように、血液を実質的に含まない分娩後臍帯又は胎盤から単離される。変性症は、急性、慢性、又は進行性の症状であり得る。
特定の実施形態では、上記の組成物は、星状細胞、乏突起神経膠細胞、ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、網膜上皮幹細胞、角膜上皮幹細胞、又は他の複能性若しくは多能性の幹細胞などの、少なくとも１種の他の細胞型を含む。これらの実施形態又は他の実施形態では、本組成物は、眼球変性障害を治療するための薬などの少なくとも１つの他の薬剤、又は、例えば抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、若しくは増殖因子などの別の有益な補助剤を含む。
上記の実施形態では、組成物は薬学的に許容できる担体を更に含む医薬組成物である。特定の実施形態では、医薬組成物は、眼球の表面に投与するように配合される。あるいは、これらは、眼球の内部、又は眼球に近接する位置（例えば、眼球の背後）に投与するように配合してもよい。医薬組成物は、上記の前駆細胞、又は前駆細胞から調製された馴化培地を含有するマトリックス又はスカフォールドとして配合してもよい。
本発明の更に別の一態様によれば、眼球変性症を有する患者を治療するためのキットが提供される。本キットは、薬学的に許容できる担体と、分娩後組織、好ましくは上記の分娩後由来細胞から単離された細胞などの、前駆細胞、又は前駆細胞から生成された馴化培地と、患者の治療法におけるキットの使用説明書と、を含む。本キットは、馴化培地を生成するための試薬及び説明書、又は少なくとも１つのその他の細胞型の集団、又は眼球変性症の治療に有用な１つ以上の薬剤などの、１つ又は２つ以上の追加的な構成要素を更に含み得る。
本発明のその他の態様は、網膜変性症において視細胞の喪失を低下させるための方法を含み、方法は、視細胞の喪失を低下させるのに効果的な量の前駆細胞の集団、又は前駆細胞の集団から調製された馴化培地を含む組成物を投与することを含む。本明細書で上述するように、前駆細胞が分娩後由来細胞であるか、あるいは馴化培地が分娩後由来細胞の集団から調製されることが好ましい。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まない臍帯組織又は胎盤組織から単離される。特定の一実施形態では、分娩後由来細胞、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地は、細胞集団によって分泌された架橋分子を含有する。分娩後由来細胞によって分泌されるか、又は馴化培地中で分泌される架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、網膜変性症において視細胞の喪失を低下させるための方法を提供し、方法は、視細胞の喪失を低下させるか又は防止するのに効果的な量の分娩後由来細胞、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地を眼球に投与することを含む。分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まない臍帯組織又は胎盤組織から誘導される。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞の集団は実質的に均質な集団である。特定の実施形態では、細胞の集団は均質である。
本明細書で説明する本発明の更なる態様では、分娩後由来細胞（臍又は胎盤由来細胞）の集団、又は分娩後由来細胞から生成された馴化培地は、酸化ストレス又は酸化損傷から網膜細胞を保護するか、あるいは酸化ストレス又は酸化損傷による網膜の損傷を改善する。一実施形態では、本発明は、網膜変性を低減させるための方法であり、方法は、酸化ストレス若しくは酸化損傷を低減させるか、又は防ぐのに効果的な量の分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から生成された馴化培地を眼球に投与することを含む。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まない臍帯組織又は胎盤組織から単離される。実施形態では、網膜細胞及び組織は、酸化ストレス又は酸化損傷に曝される。本明細書の実施形態では、網膜細胞及び組織は、視細胞、又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む網膜上皮である。本明細書の実施形態では、酸化ストレス又は酸化損傷は、高い酸素圧、長期間の直射日光曝露を含む直射日光曝露である。
一実施形態は、網膜変性における視細胞の喪失を低下させる方法であり、方法は、酸化ストレス若しくは酸化損傷を低減させるか、又は防ぐのに効果的な量の分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から生成された馴化培地を眼球に投与することを含む。実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まない臍帯組織又は胎盤組織から単離される。実施形態では、網膜細胞及び組織は、酸化ストレス又は酸化損傷に曝される。本明細書の実施形態では、網膜細胞及び組織は、視細胞、又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を含む網膜上皮である。本明細書の実施形態では、酸化ストレス又は酸化損傷は、高い酸素圧、長期間の直射日光曝露を含む直射日光曝露、フリーラジカルストレス、光酸化、及び光誘導損傷から選択される。
一実施形態では、本発明は、網膜変性症において視細胞の喪失を低下させるための方法であり、方法は、視細胞の喪失を低下させるか又は防止するのに効果的な量の分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から生成された馴化培地を投与することを含み、ここで細胞集団は血液を実質的に含まない分娩後組織から単離され、また、細胞集団は培養下で増殖可能であり、少なくとも神経表現型の細胞に分化する能力を有し、継代時に正常核型を維持し、かつ、
ａ）培養下で４０回集団倍加する能力、
ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の産生、並びに
ｃ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７及びＣＤ１４１の産生の欠如、を特徴とし、また、
分娩後由来細胞の集団は架橋分子を分泌し、分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地は細胞集団によって分泌された架橋分子を含有する。いくつかの実施形態では、分娩後由来細胞によって分泌された架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される。いくつかの実施形態では、細胞の集団は実質的に均質な集団である。特定の実施形態では、細胞の集団は均質である。分娩後由来細胞は、臍帯組織由来細胞、又は胎盤組織由来細胞である。一実施形態では、臍帯組織由来細胞集団は、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰｌｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１を分泌する。実施形態では、臍帯組織由来細胞集団は、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ａ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、及びＶＥＧＦの分泌を欠如する。別の一実施形態では、胎盤組織由来細胞集団は、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１を分泌する。実施形態では、胎盤組織由来細胞集団は、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＴＧＦ−β２、ＭＩＰｌｂ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦの分泌を欠如する。実施形態では、臍由来細胞、又は胎盤由来細胞は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性である。更なる実施形態では、臍由来細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
一実施形態では、本発明は、網膜変性症において視細胞の喪失を低下させるための方法であり、方法は、視細胞の喪失を低下させるのに効果的な量の分娩後由来細胞の集団、又は分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地を投与することを含み、ここで細胞集団は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、また、細胞集団は培養下で増殖可能であり、少なくとも神経表現型の細胞に分化する能力を有し、継代時に正常核型を維持し、かつ、
ａ）培養下で４０回集団倍加する能力、
ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の産生、
ｃ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７及びＣＤ１４１の産生の欠如、並びに
ｄ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコード化する遺伝子をより多く発現すること、を特徴とし、また、
分娩後由来細胞の集団が架橋分子を分泌するか、あるいは分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地が細胞集団によって分泌された架橋分子を含有する。実施形態では、分娩後由来細胞の集団によって分泌された架橋分子、又は分娩後由来細胞の集団によって分泌された馴化培地中の架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される。実施形態では、細胞集団は、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰｌｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１を分泌する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ａ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、及びＶＥＧＦの分泌を欠如する。実施形態では、細胞集団は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性である。いくつかの実施形態では、細胞の集団は実質的に均質な集団である。特定の実施形態では、細胞の集団は均質である。更に、細胞集団は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
特定の実施形態では、本発明は、網膜変性症において視細胞の喪失を低下させるための方法を提供し、方法は、視細胞の喪失を低下させるか又は防止するのに効果的な量の臍由来細胞の集団、又は臍由来細胞の集団から調製された馴化培地を投与することを含み、細胞集団は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、また、細胞集団は培養下で増殖可能であり、少なくとも神経表現型の細胞に分化する能力を有し、かつ、
ａ．培養下で４０回集団倍加する能力、
ｂ．ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の産生、並びに
ｃ．線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコード化する遺伝子をより多く発現すること、を特徴とし、また、
分娩後由来細胞の集団は架橋分子を分泌し、分娩後由来細胞の集団から調製された馴化培地は細胞集団によって分泌された架橋分子を含有する。実施形態では、分娩後由来細胞の集団中で分泌された架橋分子は架橋分子を分泌するか、あるいは、馴化培地中で分泌された架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される。実施形態では、細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７及びＣＤ１４１の産生を欠如しているか、又はこれらに関して陰性である。一実施形態では、臍帯組織由来細胞集団は、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰｌｂ、Ｉ３０９、ＭＤＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１を分泌し、ＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ａ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、及びＶＥＧＦの分泌を欠如する。実施形態では、臍由来細胞の集団は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性である。更に、細胞集団は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は実質的に均質な集団である。特定の実施形態では、細胞の集団は均質である。
本発明の別の一態様は、細胞の集団を培養することを含む馴化培地の製造方法であり、馴化培地は、細胞集団によって分泌された架橋分子を含有する。本発明の一実施形態では、架橋分子は、馴化培地中の細胞集団によって分泌される。更なる一実施形態では、架橋分子は、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）−１、及びＴＳＰ−２から選択される。本発明の実施形態では、細胞は前駆細胞である。本発明の特定の実施形態では、細胞は分娩後由来細胞である。本発明の実施形態では、分娩後由来細胞は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織又は胎盤組織から単離される。
上記の本発明の実施形態では、分娩後由来細胞の集団は、コーティング又は非コーティングの組織培養容器上での付着及び増殖（コーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオルニチン、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む）、ビメンチン及びα−平滑筋アクチンの産生、並びにＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であること、を特徴とする。
上述した本発明の実施形態では、網膜変性症、網膜症、又は網膜／黄斑疾患は、加齢性黄斑変性症である。代替的な一実施形態では、網膜変性症、網膜症、又は網膜／黄斑疾患は、萎縮型（dry）加齢性黄斑変性である。
上述した本発明の実施形態では、視細胞の喪失は、視細胞のアポトーシスを阻害することによって低下又は防止される。実施形態では、視細胞の喪失は、流出した視細胞断片の食作用を刺激することによって低下又は防止される。
血清含有ｈＵＴＣ ＣＭ１調製液中でプレインキュベートしたジストロフィＲＰＥの食作用に対する効果を示す。着色したジストロフィＲＰＥをＣＭ１調製液（血清含有）を用いてプレインキュベートした。対照のために、ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥ、及び着色したジストロフィＲＰＥを対照培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））を用いてプレインキュベートした。インキュベート時間は１６時間であった。（ｔａｎ Ｎ：ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥ、ｐｉｇ Ｄ：着色ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地、ｗ：含有）。値は、１サンプル中で計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１１又は１２／サンプル；ｎ：計数された視野数）、ｐはｐｉｇ Ｄ対照に対して＜０．０５である。 血清含有ｈＵＴＣ ＣＭ１調製液中でプレインキュベートしたジストロフィＲＰＥの食作用に対する効果を示す。ジストロフィＲＰＥをＣＭ１（血清含有）を用いてプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥを、血清含有対照培地中でプレインキュベートした。インキュベート時間は２４時間であった。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、Ｄ（１）：三重反復の１、Ｄ（２）：三重反復の２、Ｄ（３）：三重反復の３、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地、ｗ：含有）。値は、１サンプル中で計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１１、１２、又は１３／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 血清非含有ｈＵＴＣ ＣＭ１調製液中でプレインキュベートしたジストロフィＲＰＥの食作用に対する効果を示す。着色ジストロフィＲＰＥをＣＭ１（血清非含有）を用いてプレインキュベートした。対照のために、ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥ、及び着色ジストロフィＲＰＥを血清非含有対照培地中でプレインキュベートした。インキュベート時間は２４時間であった。（ｔａｎ Ｎ：ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥ、ｐｉｇ Ｄ：着色ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地、ｗｏ：非含有）。値は、１サンプル中で計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝９、１０、１１、又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはｐｉｇ Ｄ対照に対して＜０．０５である。 ｈＵＴＣ ＣＭ中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果を示す。ｈＵＴＣ ＣＭ２中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果。着色ジストロフィＲＰＥをＣＭ２を用いてプレインキュベートした。対照のために、ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥ、及び着色ジストロフィＲＰＥを対照培地中でプレインキュベートした。インキュベート時間は２４時間であった。（ｔａｎ Ｎ：ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥ、ｐｉｇ Ｄ：着色ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、１サンプル中で計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝８又は１０／サンプル、ｎ：計数された視野数）。 ｈＵＴＣ ＣＭ中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果を示す。ｈＵＴＣ ＣＭ３中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果。ジストロフィＲＰＥをＣＭ３を用いてプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥを、対照培地中でプレインキュベートした。インキュベート時間は２４時間であった。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、三重反復サンプル中で計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝５〜１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ＋ｃｏｎ Ｍ対照に対して＜０．０５である。 ｈＵＴＣ ＣＭ中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果を示す。ｈＵＴＣ ＣＭ３中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果。ジストロフィＲＰＥをＣＭ３を用いてプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥを、対照培地中でプレインキュベートした。インキュベート時間は２４時間であった。正常なＲＰＥ対照は、ＣＭ３試験１からのものであった。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、１サンプル中で計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１１又は１４／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ＋ｃｏｎ Ｍ対照に対して＜０．０５である。 ｈＵＴＣ ＣＭ中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果を示す。ｈＵＴＣ ＣＭ３中でプレインキュベートした場合の食作用に対する効果。ジストロフィＲＰＥをＣＭ３を用いてプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥを、対照培地中でプレインキュベートした。インキュベート時間は２４時間であった。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｎ１：培養由来正常ＲＰＥ、Ｎ２：Ｎ２培養由来正常ＲＰＥ、ｔａｎ Ｎ：ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、１サンプル中で計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１２又は１３／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ＋ｃｏｎ Ｍ対照に対して＜０．０５である。 インビトロでのＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用に対するｈＵＴＣの効果を示す。２４時間の間、トランスウェル中にプレーティングされたｈＵＴＣと共培養するか（図１３Ｅ）、あるいはｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートし（図１３Ｆ）、続いて食作用アッセイに供した、ＲＣＳのＲＰＥ細胞。Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィのＲＣＳのＲＰＥ、ＣＭ：馴化培地。ｈＵＴＣと共培養したか、あるいはｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートしたＲＣＳのＲＰＥ中では、食作用の増加が観察された。（図１３Ｇ）ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間インキュベートし、続いてｈＵＴＣ ＣＭの不在下で食作用アッセイのためにＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えられた視細胞ＯＳ。ＲＣＳのＲＰＥによってｈＵＴＣ ＣＭで処理されたＯＳ食作用は回復した。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。****ｐ＜０．０００１である。 インビトロでのＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用に対するｈＵＴＣの効果を示す。２４時間の間、トランスウェル中にプレーティングされたｈＵＴＣと共培養するか（図１３Ｅ）、あるいはｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートし（図１３Ｆ）、続いて食作用アッセイに供した、ＲＣＳのＲＰＥ細胞。Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィのＲＣＳのＲＰＥ、ＣＭ：馴化培地。ｈＵＴＣと共培養したか、あるいはｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートしたＲＣＳのＲＰＥ中では、食作用の増加が観察された。（図１３Ｇ）ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間インキュベートし、続いてｈＵＴＣ ＣＭの不在下で食作用アッセイのためにＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えられた視細胞ＯＳ。ＲＣＳのＲＰＥによってｈＵＴＣ ＣＭで処理されたＯＳ食作用は回復した。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。****ｐ＜０．０００１である。 インビトロでのＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用に対するｈＵＴＣの効果を示す。２４時間の間、トランスウェル中にプレーティングされたｈＵＴＣと共培養するか（図１３Ｅ）、あるいはｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートし（図１３Ｆ）、続いて食作用アッセイに供した、ＲＣＳのＲＰＥ細胞。Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィのＲＣＳのＲＰＥ、ＣＭ：馴化培地。ｈＵＴＣと共培養したか、あるいはｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートしたＲＣＳのＲＰＥ中では、食作用の増加が観察された。（図１３Ｇ）ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間インキュベートし、続いてｈＵＴＣ ＣＭの不在下で食作用アッセイのためにＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えられた視細胞ＯＳ。ＲＣＳのＲＰＥによってｈＵＴＣ ＣＭで処理されたＯＳ食作用は回復した。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。****ｐ＜０．０００１である。 ＢＤＮＦ又はＨＢ−ＥＧＦのＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ（ＭＥＭ５）中、ＢＤＮＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図５Ａ）又はＨＢ−ＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図５Ｂ）を用いて２４時間インキュベートした。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３を用いて２４時間インキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 ＢＤＮＦ又はＨＢ−ＥＧＦのＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ＋５％ＦＢＳ（ＭＥＭ５）中、ＢＤＮＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図５Ａ）又はＨＢ−ＥＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図５Ｂ）を用いて２４時間インキュベートした。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３を用いて２４時間インキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、及びＨＧＦのＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ５中で２４時間、ＰＤＧＦ−ＤＤ（図６Ａ、６Ｂ）、エフリンＡ４（図６Ｃ）、又はＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図６Ｄ、６Ｅ）を用いてインキュベートし、続いて、ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、又はＨＧＦを含有するＭＥＭ５中にＲＯＳを添加して、食作用アッセイに供した（ＲＯＳを添加した時に培地は交換しなかった）。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３を用いて２４時間インキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１、又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、及びＨＧＦのＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ５中で２４時間、ＰＤＧＦ−ＤＤ（図６Ａ、６Ｂ）、エフリンＡ４（図６Ｃ）、又はＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図６Ｄ、６Ｅ）を用いてインキュベートし、続いて、ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、又はＨＧＦを含有するＭＥＭ５中にＲＯＳを添加して、食作用アッセイに供した（ＲＯＳを添加した時に培地は交換しなかった）。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３を用いて２４時間インキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１、又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、及びＨＧＦのＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ５中で２４時間、ＰＤＧＦ−ＤＤ（図６Ａ、６Ｂ）、エフリンＡ４（図６Ｃ）、又はＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図６Ｄ、６Ｅ）を用いてインキュベートし、続いて、ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、又はＨＧＦを含有するＭＥＭ５中にＲＯＳを添加して、食作用アッセイに供した（ＲＯＳを添加した時に培地は交換しなかった）。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３を用いて２４時間インキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１、又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、及びＨＧＦのＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ５中で２４時間、ＰＤＧＦ−ＤＤ（図６Ａ、６Ｂ）、エフリンＡ４（図６Ｃ）、又はＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図６Ｄ、６Ｅ）を用いてインキュベートし、続いて、ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、又はＨＧＦを含有するＭＥＭ５中にＲＯＳを添加して、食作用アッセイに供した（ＲＯＳを添加した時に培地は交換しなかった）。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３を用いて２４時間インキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１、又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、及びＨＧＦのＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ５中で２４時間、ＰＤＧＦ−ＤＤ（図６Ａ、６Ｂ）、エフリンＡ４（図６Ｃ）、又はＨＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）（図６Ｄ、６Ｅ）を用いてインキュベートし、続いて、ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、又はＨＧＦを含有するＭＥＭ５中にＲＯＳを添加して、食作用アッセイに供した（ＲＯＳを添加した時に培地は交換しなかった）。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３を用いて２４時間インキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１、又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 エフリンＢ２のＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、エフリンＢ２（２００ｎｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートした。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３中でインキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 エフリンＢ２のＲＴＫリガンドアッセイの結果を示す。ジストロフィＲＰＥ細胞を、エフリンＢ２（２００ｎｇ／ｍＬ）を用いてインキュベートした。陽性対照として、ジストロフィＲＰＥ細胞をＣＭ３中でインキュベートした。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常ＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、ｃｏｎ：対照、Ｍ：培地、ＣＭ：馴化培地）。値は、二重反復又は三重反復サンプル中で計数されたフィールドにおける貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤであり（ｎ＝１０、１１又は１２／サンプル、ｎ：計数された視野数）、ｐはＤ対照に対して＜０．０５である。 エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６で処理したジストロフィ（dystropic）ＲＰＥ細胞を示す。（図８Ａ）正常対照と比較して、食作用に関してアッセイされたエンドセリン−１又はＴＧＦ−β１（２００ｎｇ／ｍＬで）。（図８Ｂ、８Ｃ）２００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントヒトエンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６を用いてインキュベートされ、続いて食作用に関してアッセイされたジストロフィＲＰＥ細胞。ｈＵＴＣ ＣＭ３を陽性対照として用いた。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ）。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。 エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６で処理したジストロフィ（dystropic）ＲＰＥ細胞を示す。（図８Ａ）正常対照と比較して、食作用に関してアッセイされたエンドセリン−１又はＴＧＦ−β１（２００ｎｇ／ｍＬで）。（図８Ｂ、８Ｃ）２００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントヒトエンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６を用いてインキュベートされ、続いて食作用に関してアッセイされたジストロフィＲＰＥ細胞。ｈＵＴＣ ＣＭ３を陽性対照として用いた。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ）。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。 エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６で処理したジストロフィ（dystropic）ＲＰＥ細胞を示す。（図８Ａ）正常対照と比較して、食作用に関してアッセイされたエンドセリン−１又はＴＧＦ−β１（２００ｎｇ／ｍＬで）。（図８Ｂ、８Ｃ）２００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントヒトエンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６を用いてインキュベートされ、続いて食作用に関してアッセイされたジストロフィＲＰＥ細胞。ｈＵＴＣ ＣＭ３を陽性対照として用いた。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ）。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。 様々な濃度のビトロネクチンを用いてプレインキュベートされたＲＯＳを与えられ、正常な対照と共に食作用に関してアッセイされたジストロフィＲＰＥ細胞を示す。ＲＯＳは、対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、又はＣＭ３を用いてプレインキュベートされた。同時に、ＲＯＳを、様々な濃度のヒトリコンビナントビトロネクチン（４、２、１、０．５ｕｇ／ｍＬ）をそれぞれ有するＭＥＭ２０中でプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみをＭＥＭ２０中で培養し、続いて、食作用アッセイのために、未処理のＲＯＳ（ＭＥＭ２０中で再懸濁してＲＰＥ細胞に与えた）の存在下でＭＥＭ５に交換した（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ、Ｃｏｎ Ｍ：対照培地、Ｖ：ビトロネクチン）。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。 ｈＵＴＣ中で同定されたＲＴＫリガンドの遺伝子発現レベルを示す。トータルｍＲＮＡをｈＵＴＣから抽出して、ＲＮＡ−Ｓｅｑを実施して、ｈＵＴＣ中のＲＴＫリガンドの遺伝子発現を同定して定量化した。同定されたＲＴＫリガンドを、対応するＲＴＫサブファミリーに基づいて分類し、それらのＦＰＫＭ値に従って順位付けした。１５のＲＴＫサブファミリーに対する複数のＲＴＫリガンドの遺伝子発現をｈＵＴＣ中で検出した。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを示す。（図１１Ａ〜１１Ｆ）ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のＲＴＫリガンドと比較したＲＴＫリガンドのレベル。ＢＤＮＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ａ）。ＮＴ３のレベルはＮＨＤＦ ＣＭと比較してｈＵＴＣ ＣＭ中でより高く、一方、ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった（図１１Ｂ）。ＨＧＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ ＣＭ中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのレベルは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較してより低い（それぞれ図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）。ＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦ馴化培地中で分泌されるが、ＡＲＰＥ−１９馴化培地中の分泌は微量である（図１１Ｆ）。全ての値は三重反復サンプルの平均±ＳＤであるが、ただしＮＴ３は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。（図１１Ｇ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＴＫリガンドのレベル。（示されるデータは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３））。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを示す。（図１１Ａ〜１１Ｆ）ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のＲＴＫリガンドと比較したＲＴＫリガンドのレベル。ＢＤＮＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ａ）。ＮＴ３のレベルはＮＨＤＦ ＣＭと比較してｈＵＴＣ ＣＭ中でより高く、一方、ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった（図１１Ｂ）。ＨＧＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ ＣＭ中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのレベルは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較してより低い（それぞれ図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）。ＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦ馴化培地中で分泌されるが、ＡＲＰＥ−１９馴化培地中の分泌は微量である（図１１Ｆ）。全ての値は三重反復サンプルの平均±ＳＤであるが、ただしＮＴ３は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。（図１１Ｇ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＴＫリガンドのレベル。（示されるデータは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３））。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを示す。（図１１Ａ〜１１Ｆ）ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のＲＴＫリガンドと比較したＲＴＫリガンドのレベル。ＢＤＮＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ａ）。ＮＴ３のレベルはＮＨＤＦ ＣＭと比較してｈＵＴＣ ＣＭ中でより高く、一方、ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった（図１１Ｂ）。ＨＧＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ ＣＭ中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのレベルは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較してより低い（それぞれ図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）。ＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦ馴化培地中で分泌されるが、ＡＲＰＥ−１９馴化培地中の分泌は微量である（図１１Ｆ）。全ての値は三重反復サンプルの平均±ＳＤであるが、ただしＮＴ３は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。（図１１Ｇ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＴＫリガンドのレベル。（示されるデータは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３））。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを示す。（図１１Ａ〜１１Ｆ）ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のＲＴＫリガンドと比較したＲＴＫリガンドのレベル。ＢＤＮＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ａ）。ＮＴ３のレベルはＮＨＤＦ ＣＭと比較してｈＵＴＣ ＣＭ中でより高く、一方、ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった（図１１Ｂ）。ＨＧＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ ＣＭ中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのレベルは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較してより低い（それぞれ図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）。ＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦ馴化培地中で分泌されるが、ＡＲＰＥ−１９馴化培地中の分泌は微量である（図１１Ｆ）。全ての値は三重反復サンプルの平均±ＳＤであるが、ただしＮＴ３は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。（図１１Ｇ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＴＫリガンドのレベル。（示されるデータは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３））。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを示す。（図１１Ａ〜１１Ｆ）ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のＲＴＫリガンドと比較したＲＴＫリガンドのレベル。ＢＤＮＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ａ）。ＮＴ３のレベルはＮＨＤＦ ＣＭと比較してｈＵＴＣ ＣＭ中でより高く、一方、ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった（図１１Ｂ）。ＨＧＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ ＣＭ中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのレベルは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較してより低い（それぞれ図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）。ＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦ馴化培地中で分泌されるが、ＡＲＰＥ−１９馴化培地中の分泌は微量である（図１１Ｆ）。全ての値は三重反復サンプルの平均±ＳＤであるが、ただしＮＴ３は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。（図１１Ｇ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＴＫリガンドのレベル。（示されるデータは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３））。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを示す。（図１１Ａ〜１１Ｆ）ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のＲＴＫリガンドと比較したＲＴＫリガンドのレベル。ＢＤＮＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ａ）。ＮＴ３のレベルはＮＨＤＦ ＣＭと比較してｈＵＴＣ ＣＭ中でより高く、一方、ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった（図１１Ｂ）。ＨＧＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ ＣＭ中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのレベルは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較してより低い（それぞれ図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）。ＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦ馴化培地中で分泌されるが、ＡＲＰＥ−１９馴化培地中の分泌は微量である（図１１Ｆ）。全ての値は三重反復サンプルの平均±ＳＤであるが、ただしＮＴ３は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。（図１１Ｇ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＴＫリガンドのレベル。（示されるデータは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３））。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを示す。（図１１Ａ〜１１Ｆ）ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のＲＴＫリガンドと比較したＲＴＫリガンドのレベル。ＢＤＮＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ａ）。ＮＴ３のレベルはＮＨＤＦ ＣＭと比較してｈＵＴＣ ＣＭ中でより高く、一方、ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった（図１１Ｂ）。ＨＧＦは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較して、ｈＵＴＣ ＣＭ中ではより高いレベルで分泌される（図１１Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤのレベルは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較してより低い（それぞれ図１１Ｄ、及び図１１Ｅ）。ＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦ馴化培地中で分泌されるが、ＡＲＰＥ−１９馴化培地中の分泌は微量である（図１１Ｆ）。全ての値は三重反復サンプルの平均±ＳＤであるが、ただしＮＴ３は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。（図１１Ｇ）ＥＬＩＳＡによって測定されたＲＴＫリガンドのレベル。（示されるデータは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３））。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された架橋分子のレベルを示す。（図１２Ａ〜１２Ｅ）。ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較した架橋分子のレベル。ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦ馴化培地中のＭＦＧ−Ｅ８レベルを示す。値は二重反復又は三重反復サンプルの平均±ＳＤである。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された架橋分子のレベルを示す。（図１２Ａ〜１２Ｅ）。ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較した架橋分子のレベル。ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦ馴化培地中のＧａｓ６レベルを示す。値は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された架橋分子のレベルを示す。（図１２Ａ〜１２Ｅ）。ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較した架橋分子のレベル。ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦ馴化培地中のＴＳＰ−１レベルを示す。値は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された架橋分子のレベルを示す。（図１２Ａ〜１２Ｅ）。ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較した架橋分子のレベル。ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦ馴化培地中のＴＳＰ−２レベルを示す。値は二重反復サンプルの平均±ＳＤである。 ｈＵＴＣ ＣＭ中で測定された架橋分子のレベルを示す。（図１２Ａ〜１２Ｅ）。ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地と比較した架橋分子のレベル。ＥＬＩＳＡによって測定された架橋分子のレベル。示されるデータは平均±ＳＥＭである（ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２はｎ＝２、全てのＭＦＧ−Ｅ８はｎ＝３）。 ｈＵＴＣ馴化培地（ＣＭ）を用いたジストロフィＲＰＥ細胞をプレインキュベートした場合の、食作用に対する効果を示す。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみを、その標準増殖培地ＭＥＭ２０中でプレインキュベートした（ＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）。同時に、ジストロフィＲＰＥを、更にＣＭ３を用いてプレインキュベートした。更に、ＲＯＳをｈＵＴＣ ＣＭ３を用いてプレインキュベートするために試験した。値は、１サンプルあたりで計数されたフィールド中における、貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである。１サンプルあたりｎ＝１０〜２０、 ｈＵＴＣ馴化培地（ＣＭ）を用いたジストロフィＲＰＥ細胞をプレインキュベートした場合の、食作用に対する効果を示す。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみを、その標準増殖培地ＭＥＭ２０中でプレインキュベートした（ＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）。同時に、ジストロフィＲＰＥを、更にＣＭ３を用いてプレインキュベートした。更に、ＲＯＳをｈＵＴＣ ＣＭ３を用いてプレインキュベートするために試験した。値は、１サンプルあたりで計数されたフィールド中における、貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである。生データである。 ｈＵＴＣ馴化培地（ＣＭ）を用いたジストロフィＲＰＥ細胞をプレインキュベートした場合の、食作用に対する効果を示す。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみを、その標準増殖培地ＭＥＭ２０中でプレインキュベートした（ＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ）。同時に、ジストロフィＲＰＥを、更にＣＭ３を用いてプレインキュベートした。更に、ＲＯＳをｈＵＴＣ ＣＭ３を用いてプレインキュベートするために試験した。値は、１サンプルあたりで計数されたフィールド中における、貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである。１サンプルあたりｎ＝１２であり、各サンプルは二重反復である。（ｎ：計数された視野数）。 生データである。 ＲＣＳのＲＰＥ細胞による桿体外節（ＲＯＳ）食作用に対する架橋分子及びＲＴＫリガンドの効果を示す。ＲＯＳは、対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、又はｈＵＴＣ馴化培地を用いて予備インキュベートされた。同時に、対照培地中、様々な濃度のヒトリコンビナントＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ａ）、Ｇａｓ６（図１４Ｂ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｃ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｄ）を用いて、ＲＯＳをプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみを食作用アッセイのために培養した。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｎ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられた正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｃｏｎ Ｍ：対照培地、Ｄ＋ＲＯＳ＋Ｃｏｎ：対照培地でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、ＣＭ４：ｈＵＴＣ馴化培地の第４バッチ）。Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４：ＣＭ４でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＭＦＧ−Ｅ８：ＭＦＧ−Ｅ８でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。*Ｐ＜０．００１であり、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２で予処理されたＤ＋ＲＯＳと、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭ、及びＤ＋ＲＯＳと、の比較であり、**Ｐ＜０．０００１であり、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４と、Ｄ＋ＲＯＳ、及びＤ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭと、の比較である。 ＲＣＳのＲＰＥ細胞による桿体外節（ＲＯＳ）食作用に対する架橋分子及びＲＴＫリガンドの効果を示す。ＲＯＳは、対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、又はｈＵＴＣ馴化培地を用いて予備インキュベートされた。同時に、対照培地中、様々な濃度のヒトリコンビナントＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ａ）、Ｇａｓ６（図１４Ｂ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｃ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｄ）を用いて、ＲＯＳをプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみを食作用アッセイのために培養した。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｎ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられた正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｃｏｎ Ｍ：対照培地、Ｄ＋ＲＯＳ＋Ｃｏｎ：対照培地でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、ＣＭ４：ｈＵＴＣ馴化培地の第４バッチ）。Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４：ＣＭ４でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＭＦＧ−Ｅ８：ＭＦＧ−Ｅ８でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。*Ｐ＜０．００１であり、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２で予処理されたＤ＋ＲＯＳと、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭ、及びＤ＋ＲＯＳと、の比較であり、**Ｐ＜０．０００１であり、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４と、Ｄ＋ＲＯＳ、及びＤ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭと、の比較である。 ＲＣＳのＲＰＥ細胞による桿体外節（ＲＯＳ）食作用に対する架橋分子及びＲＴＫリガンドの効果を示す。ＲＯＳは、対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、又はｈＵＴＣ馴化培地を用いて予備インキュベートされた。同時に、対照培地中、様々な濃度のヒトリコンビナントＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ａ）、Ｇａｓ６（図１４Ｂ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｃ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｄ）を用いて、ＲＯＳをプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみを食作用アッセイのために培養した。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｎ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられた正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｃｏｎ Ｍ：対照培地、Ｄ＋ＲＯＳ＋Ｃｏｎ：対照培地でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、ＣＭ４：ｈＵＴＣ馴化培地の第４バッチ）。Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４：ＣＭ４でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＭＦＧ−Ｅ８：ＭＦＧ−Ｅ８でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。*Ｐ＜０．００１であり、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２で予処理されたＤ＋ＲＯＳと、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭ、及びＤ＋ＲＯＳと、の比較であり、**Ｐ＜０．０００１であり、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４と、Ｄ＋ＲＯＳ、及びＤ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭと、の比較である。 ＲＣＳのＲＰＥ細胞による桿体外節（ＲＯＳ）食作用に対する架橋分子及びＲＴＫリガンドの効果を示す。ＲＯＳは、対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、又はｈＵＴＣ馴化培地を用いて予備インキュベートされた。同時に、対照培地中、様々な濃度のヒトリコンビナントＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ａ）、Ｇａｓ６（図１４Ｂ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｃ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｄ）を用いて、ＲＯＳをプレインキュベートした。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみを食作用アッセイのために培養した。（Ｎ：正常なＲＰＥ、Ｎ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられた正常なＲＰＥ、Ｄ：ジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ：食作用アッセイ中に未処理のＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｃｏｎ Ｍ：対照培地、Ｄ＋ＲＯＳ＋Ｃｏｎ：対照培地でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、ＣＭ４：ｈＵＴＣ馴化培地の第４バッチ）。Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４：ＣＭ４でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＭＦＧ−Ｅ８：ＭＦＧ−Ｅ８でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞。値は、１サンプルあたりで計数された視野における貪食されたＲＯＳの数の平均±ＳＤである（ｎ＝１０サンプル、ｎ：計数された視野数）。*Ｐ＜０．００１であり、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２で予処理されたＤ＋ＲＯＳと、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭ、及びＤ＋ＲＯＳと、の比較であり、**Ｐ＜０．０００１であり、Ｄ＋ＲＯＳ＋ＣＭ４と、Ｄ＋ＲＯＳ、及びＤ＋ＲＯＳ＋ＣｏｎＭと、の比較である。 視細胞ＯＳを、リコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ｅ）、Ｇａｓ６（図１４Ｆ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｇ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｈ）を用いて２４時間インキュベートし、続いて、ｈＵＴＣ ＣＭの不在下で、食作用アッセイのためにＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えた。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてプレインキュベートされたＯＳを、アッセイの陽性対照として用いた。ＲＣＳのＲＰＥ細胞によるＯＳの食作用を、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２によって用量依存的にレスキューした。 視細胞ＯＳを、リコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ｅ）、Ｇａｓ６（図１４Ｆ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｇ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｈ）を用いて２４時間インキュベートし、続いて、ｈＵＴＣ ＣＭの不在下で、食作用アッセイのためにＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えた。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてプレインキュベートされたＯＳを、アッセイの陽性対照として用いた。ＲＣＳのＲＰＥ細胞によるＯＳの食作用を、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２によって用量依存的にレスキューした。 視細胞ＯＳを、リコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ｅ）、Ｇａｓ６（図１４Ｆ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｇ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｈ）を用いて２４時間インキュベートし、続いて、ｈＵＴＣ ＣＭの不在下で、食作用アッセイのためにＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えた。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてプレインキュベートされたＯＳを、アッセイの陽性対照として用いた。ＲＣＳのＲＰＥ細胞によるＯＳの食作用を、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２によって用量依存的にレスキューした。 視細胞ＯＳを、リコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（図１４Ｅ）、Ｇａｓ６（図１４Ｆ）、ＴＳＰ−１（図１４Ｇ）、又はＴＳＰ−２（図１４Ｈ）を用いて２４時間インキュベートし、続いて、ｈＵＴＣ ＣＭの不在下で、食作用アッセイのためにＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えた。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてプレインキュベートされたＯＳを、アッセイの陽性対照として用いた。ＲＣＳのＲＰＥ細胞によるＯＳの食作用を、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２によって用量依存的にレスキューした。 ＲＣＳのＲＰＥ細胞を、リコンビナントヒトＢＤＮＦ（図１４Ｉ）、ＨＧＦ（図１４Ｊ）、又はＧＤＮＦ（図１４Ｋ）を用いて２４時間インキュベートし、続いて、食作用アッセイに供した。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートされたＲＣＳのＲＰＥを、アッセイの陽性対照として用いた。ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、又はＧＤＮＦは、ＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用を用量依存的に増加させた。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。****ｐ＜０．０００１であり、***ｐ＜０．００１であり、**ｐ＜０．０１であり、*ｐ＜０．０５であり、ｎ．ｓ．は非有意である。 ＲＣＳのＲＰＥ細胞を、リコンビナントヒトＢＤＮＦ（図１４Ｉ）、ＨＧＦ（図１４Ｊ）、又はＧＤＮＦ（図１４Ｋ）を用いて２４時間インキュベートし、続いて、食作用アッセイに供した。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートされたＲＣＳのＲＰＥを、アッセイの陽性対照として用いた。ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、又はＧＤＮＦは、ＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用を用量依存的に増加させた。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。****ｐ＜０．０００１であり、***ｐ＜０．００１であり、**ｐ＜０．０１であり、*ｐ＜０．０５であり、ｎ．ｓ．は非有意である。 ＲＣＳのＲＰＥ細胞を、リコンビナントヒトＢＤＮＦ（図１４Ｉ）、ＨＧＦ（図１４Ｊ）、又はＧＤＮＦ（図１４Ｋ）を用いて２４時間インキュベートし、続いて、食作用アッセイに供した。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートされたＲＣＳのＲＰＥを、アッセイの陽性対照として用いた。ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、又はＧＤＮＦは、ＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用を用量依存的に増加させた。データは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。****ｐ＜０．０００１であり、***ｐ＜０．００１であり、**ｐ＜０．０１であり、*ｐ＜０．０５であり、ｎ．ｓ．は非有意である。 ｈＵＴＣから誘導されたＲＣＳのＲＰＥにおける食作用のレスキューのためのＲＴＫリガンド及び架橋分子。（図１５Ａ）非トランスフェクトｈＵＴＣ、及びｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたｈＵＴＣから回収された細胞培養上清のＥＬＩＳＡ。（図１５Ｂ）ＲＴＫリガンドのＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦの発現は、ｈＵＴＣのｓｉＲＮＡトランスフェクションによってサイレンシングされた。ノックダウン（ＫＤ）ｈＵＴＣ ＣＭを採取した。ＲＣＳのＲＰＥをＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間インキュベートし、続いて食作用アッセイに供した。ＲＣＳのＲＰＥの食作用に対するｈＵＴＣの効果は、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、又はＧＤＮＦをノックダウンすると消滅した。（図１５Ｃ）架橋分子ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２の発現は、ｈＵＴＣ中におけるｓｉＲＮＡのトランスフェクションによってサイレンシングされた。ＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを採取した。ＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間プレインキュベートされたＯＳを、ＲＣＳのＲＰＥに与え、続いて食作用アッセイに供した。ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２のノックダウンによって、ＲＣＳのＲＰＥにおけるｈＵＴＣ媒介ＯＳ食作用レスキューが低下した。非トランスフェクト及びスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣから調製されたＣＭを対照として用いた。データは平均±ＳＥＭを表し、（Ｂ）及び（Ｃ）の場合はｎ＝３、非トランスフェクトｓｉＲＮＡ、モックｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣ ＣＭ ＥＬＩＳＡ（Ａ）の場合はｎ＝６である。****ｐ＜０．０００１であり、***ｐ＜０．００１であり、**ｐ＜０．０１であり、*ｐ＜０．０５であり、ｎ．ｓ．は非有意である。 ｈＵＴＣから誘導されたＲＣＳのＲＰＥにおける食作用のレスキューのためのＲＴＫリガンド及び架橋分子。（図１５Ａ）非トランスフェクトｈＵＴＣ、及びｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたｈＵＴＣから回収された細胞培養上清のＥＬＩＳＡ。（図１５Ｂ）ＲＴＫリガンドのＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦの発現は、ｈＵＴＣのｓｉＲＮＡトランスフェクションによってサイレンシングされた。ノックダウン（ＫＤ）ｈＵＴＣ ＣＭを採取した。ＲＣＳのＲＰＥをＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間インキュベートし、続いて食作用アッセイに供した。ＲＣＳのＲＰＥの食作用に対するｈＵＴＣの効果は、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、又はＧＤＮＦをノックダウンすると消滅した。（図１５Ｃ）架橋分子ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２の発現は、ｈＵＴＣ中におけるｓｉＲＮＡのトランスフェクションによってサイレンシングされた。ＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを採取した。ＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間プレインキュベートされたＯＳを、ＲＣＳのＲＰＥに与え、続いて食作用アッセイに供した。ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２のノックダウンによって、ＲＣＳのＲＰＥにおけるｈＵＴＣ媒介ＯＳ食作用レスキューが低下した。非トランスフェクト及びスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣから調製されたＣＭを対照として用いた。データは平均±ＳＥＭを表し、（Ｂ）及び（Ｃ）の場合はｎ＝３、非トランスフェクトｓｉＲＮＡ、モックｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣ ＣＭ ＥＬＩＳＡ（Ａ）の場合はｎ＝６である。****ｐ＜０．０００１であり、***ｐ＜０．００１であり、**ｐ＜０．０１であり、*ｐ＜０．０５であり、ｎ．ｓ．は非有意である。 ｈＵＴＣから誘導されたＲＣＳのＲＰＥにおける食作用のレスキューのためのＲＴＫリガンド及び架橋分子。（図１５Ａ）非トランスフェクトｈＵＴＣ、及びｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたｈＵＴＣから回収された細胞培養上清のＥＬＩＳＡ。（図１５Ｂ）ＲＴＫリガンドのＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦの発現は、ｈＵＴＣのｓｉＲＮＡトランスフェクションによってサイレンシングされた。ノックダウン（ＫＤ）ｈＵＴＣ ＣＭを採取した。ＲＣＳのＲＰＥをＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間インキュベートし、続いて食作用アッセイに供した。ＲＣＳのＲＰＥの食作用に対するｈＵＴＣの効果は、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、又はＧＤＮＦをノックダウンすると消滅した。（図１５Ｃ）架橋分子ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２の発現は、ｈＵＴＣ中におけるｓｉＲＮＡのトランスフェクションによってサイレンシングされた。ＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを採取した。ＫＤ ｈＵＴＣ ＣＭを用いて２４時間プレインキュベートされたＯＳを、ＲＣＳのＲＰＥに与え、続いて食作用アッセイに供した。ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２のノックダウンによって、ＲＣＳのＲＰＥにおけるｈＵＴＣ媒介ＯＳ食作用レスキューが低下した。非トランスフェクト及びスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣから調製されたＣＭを対照として用いた。データは平均±ＳＥＭを表し、（Ｂ）及び（Ｃ）の場合はｎ＝３、非トランスフェクトｓｉＲＮＡ、モックｓｉＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣ ＣＭ ＥＬＩＳＡ（Ａ）の場合はｎ＝６である。****ｐ＜０．０００１であり、***ｐ＜０．００１であり、**ｐ＜０．０１であり、*ｐ＜０．０５であり、ｎ．ｓ．は非有意である。 ｈＵＴＣ分泌架橋分子は視細胞ＯＳと結合する。個々のリコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（１２４ｎｇ／ｍＬ）、Ｇａｓ６（８．７５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＳＰ−１（１．２［ｔｇ／ｍＬ）、若しくはＴＳＰ−２（２３８ｎｇ／ｍＬ）（図１６Ａ）、又はｈＵＴＣ ＣＭ（図１６Ｂ）、又は対照培地（図１６Ｃ）を用いて２４時間インキュベートされたＯＳの免疫蛍光（ＩＦ）染色、並びにそれに続く、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体を用いたロドプシンの、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートした抗ＭＦＧ−Ｅ８、抗Ｇａｓ６、抗ＴＳＰ−１、抗ＴＳＰ−２、マウスＩｇＧ２Ａ、又はマウスＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照抗体を用いた架橋分子の２重ＩＦ染色。ロドプシン染色ＯＳ粒子は、リコンビナント架橋分子タンパク質、又はｈＵＴＣ ＣＭ中に存在する分泌された架橋分子のそれぞれを用いても陽性染色された。（図１６Ｄ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２ｂのＸアイソタイプ対照抗体を用いたＯＳの二重ＩＦ染色により、抗ロドプシン抗体の特異性が確認された。上部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）は架橋分子及びアイソタイプ抗体染色、下部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）はロドプシン抗体染色。 ｈＵＴＣ分泌架橋分子は視細胞ＯＳと結合する。個々のリコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（１２４ｎｇ／ｍＬ）、Ｇａｓ６（８．７５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＳＰ−１（１．２［ｔｇ／ｍＬ）、若しくはＴＳＰ−２（２３８ｎｇ／ｍＬ）（図１６Ａ）、又はｈＵＴＣ ＣＭ（図１６Ｂ）、又は対照培地（図１６Ｃ）を用いて２４時間インキュベートされたＯＳの免疫蛍光（ＩＦ）染色、並びにそれに続く、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体を用いたロドプシンの、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートした抗ＭＦＧ−Ｅ８、抗Ｇａｓ６、抗ＴＳＰ−１、抗ＴＳＰ−２、マウスＩｇＧ２Ａ、又はマウスＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照抗体を用いた架橋分子の２重ＩＦ染色。ロドプシン染色ＯＳ粒子は、リコンビナント架橋分子タンパク質、又はｈＵＴＣ ＣＭ中に存在する分泌された架橋分子のそれぞれを用いても陽性染色された。（図１６Ｄ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２ｂのＸアイソタイプ対照抗体を用いたＯＳの二重ＩＦ染色により、抗ロドプシン抗体の特異性が確認された。上部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）は架橋分子及びアイソタイプ抗体染色、下部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）はロドプシン抗体染色。 ｈＵＴＣ分泌架橋分子は視細胞ＯＳと結合する。個々のリコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（１２４ｎｇ／ｍＬ）、Ｇａｓ６（８．７５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＳＰ−１（１．２［ｔｇ／ｍＬ）、若しくはＴＳＰ−２（２３８ｎｇ／ｍＬ）（図１６Ａ）、又はｈＵＴＣ ＣＭ（図１６Ｂ）、又は対照培地（図１６Ｃ）を用いて２４時間インキュベートされたＯＳの免疫蛍光（ＩＦ）染色、並びにそれに続く、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体を用いたロドプシンの、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートした抗ＭＦＧ−Ｅ８、抗Ｇａｓ６、抗ＴＳＰ−１、抗ＴＳＰ−２、マウスＩｇＧ２Ａ、又はマウスＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照抗体を用いた架橋分子の２重ＩＦ染色。ロドプシン染色ＯＳ粒子は、リコンビナント架橋分子タンパク質、又はｈＵＴＣ ＣＭ中に存在する分泌された架橋分子のそれぞれを用いても陽性染色された。（図１６Ｄ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２ｂのＸアイソタイプ対照抗体を用いたＯＳの二重ＩＦ染色により、抗ロドプシン抗体の特異性が確認された。上部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）は架橋分子及びアイソタイプ抗体染色、下部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）はロドプシン抗体染色。 ｈＵＴＣ分泌架橋分子は視細胞ＯＳと結合する。個々のリコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（１２４ｎｇ／ｍＬ）、Ｇａｓ６（８．７５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＳＰ−１（１．２［ｔｇ／ｍＬ）、若しくはＴＳＰ−２（２３８ｎｇ／ｍＬ）（図１６Ａ）、又はｈＵＴＣ ＣＭ（図１６Ｂ）、又は対照培地（図１６Ｃ）を用いて２４時間インキュベートされたＯＳの免疫蛍光（ＩＦ）染色、並びにそれに続く、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体を用いたロドプシンの、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートした抗ＭＦＧ−Ｅ８、抗Ｇａｓ６、抗ＴＳＰ−１、抗ＴＳＰ−２、マウスＩｇＧ２Ａ、又はマウスＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照抗体を用いた架橋分子の２重ＩＦ染色。ロドプシン染色ＯＳ粒子は、リコンビナント架橋分子タンパク質、又はｈＵＴＣ ＣＭ中に存在する分泌された架橋分子のそれぞれを用いても陽性染色された。（図１６Ｄ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２ｂのＸアイソタイプ対照抗体を用いたＯＳの二重ＩＦ染色により、抗ロドプシン抗体の特異性が確認された。上部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）は架橋分子及びアイソタイプ抗体染色、下部パネル（図１６Ａ〜１６Ｄ）はロドプシン抗体染色。 ｈＵＴＣ、及びｈＵＴＣ馴化培地の、酸化ストレス又は損傷からの保護を示す。ｈＵＴＣ馴化培地が、４３０ｎｍの照射後に、Ａ２Ｅを含有するＲＰＥ細胞が生育不能となるのを防いだことを示す。（図１７Ａ）２色蛍光アッセイを用いて細胞死をアッセイした。Ａ２Ｅ含有（laden）ＡＲＰＥ−１９細胞を用いて、ｈＵＴＣ馴化培地、及び非馴化対照培地（２５０μＬ／ウェル）を７日間インキュベートした。２色蛍光アッセイによって生育不能細胞の割合を求めた（５複製）。図１７Ｂは、５％及び１０％ＦＢＳ処理からのプールデータを示す。値は平均＋／−ＳＥＭである。ｐ＜０．０５；一元配置分散分析法（One-way ANOVA）、及びニューマン−キュウルス多重比較試験。 ｈＵＴＣ、及びｈＵＴＣ馴化培地の、酸化ストレス又は損傷からの保護を示す。ｈＵＴＣ馴化培地が、４３０ｎｍの照射後に、Ａ２Ｅを含有するＲＰＥ細胞が生育不能となるのを防いだことを示す。（図１７Ａ）２色蛍光アッセイを用いて細胞死をアッセイした。Ａ２Ｅ含有（laden）ＡＲＰＥ−１９細胞を用いて、ｈＵＴＣ馴化培地、及び非馴化対照培地（２５０μＬ／ウェル）を７日間インキュベートした。２色蛍光アッセイによって生育不能細胞の割合を求めた（５複製）。図１７Ｂは、５％及び１０％ＦＢＳ処理からのプールデータを示す。値は平均＋／−ＳＥＭである。ｐ＜０．０５；一元配置分散分析法（One-way ANOVA）、及びニューマン−キュウルス多重比較試験。 ｈＵＴＣ、及びｈＵＴＣ馴化培地の、酸化ストレス又は損傷からの保護を示す。ｈＵＴＣ馴化培地が、Ａ２Ｅ光酸化に伴う細胞の生育可能性の低下からＡＲＰＥ−１９細胞を保護したことを示す。（図１７Ｃ）細胞の生育可能性をＭＴＴによってアッセイした。ｈＵＴＣ馴化培地及び非馴化対照培地（２５０μＬ／ウェル）を、Ａ２Ｅ含有ＡＲＰＥ−１９細胞を用いてインキュベートした（７日間、３７℃、５％ＣＯ2、５％ＦＢＳ）。バーの高さはＭＴＴの吸収度を示し、細胞の生育可能性を反映する。図１７Ｄは、５％及び１０％ＦＢＳ処理からのプールデータを示す。値は平均＋／−ＳＥＭであり、４複製／２実験である。*ｐ＞０．０５であり、**ｐ＜０．０５である、一元配置分散分析法（One-way ANOVA）、及びニューマン−キュウルス多重比較試験。 ｈＵＴＣ、及びｈＵＴＣ馴化培地の、酸化ストレス又は損傷からの保護を示す。ｈＵＴＣ馴化培地が、Ａ２Ｅ光酸化に伴う細胞の生育可能性の低下からＡＲＰＥ−１９細胞を保護したことを示す。（図１７Ｃ）細胞の生育可能性をＭＴＴによってアッセイした。ｈＵＴＣ馴化培地及び非馴化対照培地（２５０μＬ／ウェル）を、Ａ２Ｅ含有ＡＲＰＥ−１９細胞を用いてインキュベートした（７日間、３７℃、５％ＣＯ2、５％ＦＢＳ）。バーの高さはＭＴＴの吸収度を示し、細胞の生育可能性を反映する。図１７Ｄは、５％及び１０％ＦＢＳ処理からのプールデータを示す。値は平均＋／−ＳＥＭであり、４複製／２実験である。*ｐ＞０．０５であり、**ｐ＜０．０５である、一元配置分散分析法（One-way ANOVA）、及びニューマン−キュウルス多重比較試験。 ｈＵＴＣ、及びｈＵＴＣ馴化培地の、酸化ストレス又は損傷からの保護を示す。ｈＵＴＣ馴化培地が、Ｈ2Ｏ2に伴う細胞の生育可能性の急性の低下からＡＲＰＥ−１９細胞を保護したことを示す。細胞の生育可能性を、ＭＴＴ（図１７Ｅ）、及びクリスタルバイオレット（図１７Ｄ）によってアッセイした。ｙ軸は、５５０ｎｍでの補正されたＯＤ読み取り値を表す。データは平均±標準偏差として示す。二元配置分散分析法（Two-Way ANOVA）によりｐ＜０．０５である。 ｈＵＴＣ、及びｈＵＴＣ馴化培地の、酸化ストレス又は損傷からの保護を示す。ｈＵＴＣ馴化培地が、Ｈ2Ｏ2に伴う細胞の生育可能性の急性の低下からＡＲＰＥ−１９細胞を保護したことを示す。細胞の生育可能性を、ＭＴＴ（図１７Ｅ）、及びクリスタルバイオレット（図１７Ｄ）によってアッセイした。ｙ軸は、５５０ｎｍでの補正されたＯＤ読み取り値を表す。データは平均±標準偏差として示す。二元配置分散分析法（Two-Way ANOVA）によりｐ＜０．０５である。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の「発明を実施するための形態」及び実施例から、明らかとなるであろう。
様々な特許及び他の刊行物が、本明細書の全体を通して参照される。これらの刊行物のそれぞれは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。以下の例示的実施形態の詳細な説明において、本明細書の一部を構成する添付図面が参照されている。これらの実施形態は、当業者が本発明を実践できるように十分に詳細に説明されおり、本発明の趣旨又は範囲を逸脱することなく、他の実施形態を用いることができること、及び論理構造的、機械的、電気的及び化学的変更がなされ得ることが理解されよう。当業者が本明細書に記載された実施形態を実践することを可能にするために必要でない詳細な説明を避けるために、当業者に周知の特定の情報の説明が省略されている場合がある。したがって、以下の詳細な説明は限定的な意味で解釈されるべきではなく、例示される実施形態の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。
定義
本明細書及び特許請求の範囲の全体で用いられる様々な用語は、以下で定める通りに定義され、これらは本発明を明確にすることを目的とする。
幹細胞は、単一細胞の、自己複製する能力、並びに自己複製前駆細胞、非複製前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するために分化する能力の双方によって定義される、未分化細胞である。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能細胞に分化する能力によって、並びに、移植後に複数の胚葉組織を生じさせる能力、及び胚盤胞内への注入後に、全部ではないが実質的に殆どの組織に寄与する能力によっても、特徴付けられる。
幹細胞は、その発生能に応じて、（１）全能性、（２）多能性、（３）複能性、（４）少能性、及び（５）単能性に分類される。全能細胞は、全ての胚細胞型及び胚体外細胞型を生じさせることが可能である。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることが可能である。複能性細胞は、細胞系統のサブセットを生じさせることが可能であるが、全てが、特定の組織、器官、又は生理系の範囲内であるものを含む（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣを含む子孫（自己複製）、血球に制限された少能性前駆細胞、並びに血液の正常成分である全ての細胞型及び要素（例えば、血小板）を産生することができる）。少能性の細胞は、複能性幹細胞よりも制限された、細胞系統のサブセットを生じさせることができ、単能性の細胞は、単一の細胞系統を生じさせることができる（例えば、精原幹細胞）。
幹細胞はまた、それらの幹細胞を得ることができる供給源に基づいても分類される。成体幹細胞は、全般的には、複数の分化細胞型を含む組織内に見出される、複能性の未分化細胞である。成体幹細胞は、自己複製することができる。通常の状況下では、成体幹細胞はまた、その細胞が起源とする組織の、特殊化した細胞型、また恐らくは他の組織型を産生するように、分化することもできる。誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、多能性幹細胞に変換された成熟細胞である。（ＴａｋａｈａｓｈｉらのＣｅｌｌ，２００６；１２６（４）：６６３〜６７６、ＴａｋａｈａｓｈｉらのＣｅｌｌ，２００７；１３１：１〜１２）。胚幹細胞は、胚盤胞期の胚の内部細胞塊からの、多能性細胞である。胎生幹細胞は、胎児組織又は胎膜を起源とする幹細胞である。分娩後幹細胞は、出産後に入手可能な胚体外組織、すなわち、胎盤及び臍帯を実質的に起源とする、複能性若しくは多能性の細胞である。これらの細胞は、迅速な増殖、及び多くの細胞系統への分化に関する能力を含めた、多能性幹細胞に固有の特徴を保有することが見出されている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られる幹細胞のような）又は非血液由来（例えば、臍帯及び胎盤の非血液組織から得られるような）のものとすることができる。
胚組織は、典型的には、胚（ヒトの場合、受精から、約６週間の発達までの期間を指す）を起源とする組織として定義される。胎児組織は、ヒトでは約６週間の発達から分娩までの期間を指す、胎児に由来する組織を指す。胚体外組織は、胚又は胎児に関連するが、胚又は胎児を起源とはしない組織である。胚体外組織としては、胚体外膜（絨毛膜、羊膜、卵黄嚢、及び尿膜）、臍帯、及び胎盤（それ自体は、絨毛膜及び母体基底脱落膜から形成される）が挙げられる。
分化は、特殊化されていない（「コミットされていない」）細胞、又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの、特殊化細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞は、細胞の系統の範囲内で、より特殊化した（「コミットされた」）状態を呈している細胞である。コミットされた、という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下では、特定の細胞型又は細胞型のサブセットへと分化を継続して、通常の状況下では、異なる細胞型へと分化することも、又はより未分化の細胞型に復帰することもできない地点まで、分化経路が進行している細胞を指す。脱分化とは、細胞が、細胞の系統の範囲内で、比較的特殊化されて（又はコミットされて）いない状態に復帰するプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。
広義には、前駆細胞は、それ自体よりも分化した子孫を作り出す能力を有し、かつ前駆細胞のプールを補充する能力を更に保持する細胞である。その定義によれば、幹細胞自体もまた、より直接的な、最終分化細胞への前駆体であるため、前駆細胞である。以下でより詳細に説明されるように、本発明の細胞に言及する場合、この広い意味での前駆細胞の定義を使用することができる。より狭義には、前駆細胞は、分化経路での中間体である細胞として定義される場合が多く、すなわち、前駆細胞は、幹細胞から生じるものであり、成熟細胞型又は細胞型のサブセットを産生する際の中間体である。このタイプの前駆細胞は、全般的には、自己複製が不可能である。したがって、このタイプの細胞が、本明細書で言及される場合には、その細胞は、非複製前駆細胞、又は中間的前駆細胞若しくは前駆細胞と称される。
本明細書で使用するとき、語句「眼系統又は眼表現型への分化」とは、網膜及び角膜幹細胞、網膜及び虹彩の色素上皮細胞、視細胞、網膜神経節及びその他の視神経系統（例えば、網膜グリア、小神経膠、星状細胞、ミュラー細胞）、水晶体形成細胞、並びに強膜、角膜、縁、及び結膜の上皮細胞が挙げられるがこれらに限定されない、特定の眼表現型に部分的又は完全にコミットされるようになった細胞を指す。語句「神経系統又は神経表現型への分化」という語句は、ＣＮＳ又はＰＮＳの特定の神経表現型へ、すなわち、ニューロン又はグリア細胞（後者の分類としては、星状細胞、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、及び小神経膠細胞が挙げられるが、これらに限定されない）に、部分的又は完全にコミットされるようになった細胞を指す。
本明細書で例示され、かつ本発明での使用に好ましい細胞は、一般に分娩後由来細胞（又はＰＰＤＣ）と称される。これらは、時には、より具体的に、臍由来細胞又は胎盤由来細胞（ＵＤＣ又はＰＤＣ）と称される場合もある。更には、この細胞は、幹細胞又は前駆細胞として説明することができ、後者の用語は広義で使用される。由来する、という用語は、その細胞が、それらの生物学的起源から得られ、インビトロで、増殖されるか又は他の方法で操作されている（例えば、増殖培地中で培養されて、その集団を増殖させ、かつ／又は細胞株を産生する）ことを示すために使用される。臍幹細胞及び胎盤幹細胞のインビトロ操作、及び本発明の臍由来細胞及び胎盤由来細胞の独自の特徴が、以下で詳細に説明される。その他の手段によって分娩後胎盤及び臍から単離された細胞も、本発明での使用に好適であると考えられる。本明細書では、こうしたその他の細胞は、分娩後細胞と称される（分娩後由来細胞ではなく）。
様々な用語が、培養下の細胞を説明するために使用される。細胞培養物とは、一般に、生体から取得され、制御条件下で増殖される（「培養下」又は「培養される」）細胞を指す。初代細胞培養物は、最初の継代培養の前に、生物から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養物である。細胞は、細胞増殖及び／又は細胞分裂を促進する条件下で、増殖培地内に定置される場合に、培養下で増殖して、細胞の大集団を生じさせる。細胞を培養下で増殖させる場合、細胞増殖の速度は、その細胞の数が倍加するために必要な時間量によって、測定される場合がある。この時間は、倍加時間と称される。
細胞株は、初代細胞培養物の１回以上の継代培養によって形成される、細胞の集団である。継代培養の各一巡は、１継代と称される。細胞が継代培養される場合、それらの細胞は、継代されているとして言及される。特定の細胞集団、又は細胞株は、継代された回数によって言及されるか、又は特徴付けられる場合がある。例えば、１０回継代されている培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と称することができる。初代培養物、すなわち、組織から細胞を単離した後の、最初の培養物は、Ｐ０と表される。最初の継代培養後には、それらの細胞は、二次培養物（Ｐ１又は継代数１）として説明される。２回目の継代培養後には、それらの細胞は、三次培養物（Ｐ２又は継代数２）となる、といった具合である。当業者には、継代期間中には多くの集団倍加が存在し得、従って、培養物の集団倍加の数は継代の数よりも大きいということが理解されるであろう。継代の合間の期間中の細胞の増殖（すなわち、集団倍加の数）は、多くの因子に応じて変化するものであり、それらの因子としては、播種密度、基質、培地、増殖条件、及び継代の合間の時間が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「増殖培地」は、一般に、ＰＰＤＣの培養に十分な培地を指す。具体的には、本発明の細胞の培養に関して、現時点で好ましい１つの培地は、ダルベッコ変法必須培地（本明細書ではまた、ＤＭＥＭとも略される）を含む。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ−低グルコース（本明細書では、ＤＭＥＭ−ＬＧとも称される）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））である。ＤＭＥＭ−低グルコースには、好ましくは、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（例えば、規定ウシ胎児血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ））、抗生物質／抗真菌剤（好ましくは、５０〜１００単位／ミリリットルのペニシリン、５０〜１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、及び０〜０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）））、及び０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））が添加される。以下の実施例で使用するとき、増殖培地とは、１５％のウシ胎児血清及び抗生物質／抗真菌剤（ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれる場合、好ましくは、それぞれ５０Ｕ／ｍＬ及び５０マイクログラム／ｍＬであり、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンが使用される場合、好ましくは、それぞれ１００Ｕ／ｍＬ、１００マイクログラム／ｍＬ、及び０．２５マイクログラム／ｍＬである）を有する、ＤＭＥＭ−低グルコースを指す。一部の場合には、異なる増殖培地が使用されるか、又は異なる補助剤が提供され、これらは、通常は、増殖培地に対する補助剤として、本テキスト内に示される。
馴化培地は、特定の細胞又は細胞の集団が、その中で培養されて、その後取り出された、培地である。細胞が培地中で培養される場合、それらの細胞は、他の細胞に栄養的支援を提供することができる細胞因子を分泌する場合がある。そのような栄養因子としては、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、及び顆粒が挙げられるが、これらに限定されない。それらの細胞因子を含む培地が、馴化培地である。
一般に、栄養因子は、細胞の生存、成長、分化、増殖、及び／又は成熟を促進するか、あるいは細胞の活性の増大を刺激する物質として定義される。栄養因子を介した細胞間の相互作用は、異なる型の細胞間で発生し得る。栄養因子による細胞相互作用は、本質的に全ての細胞型で見出され、神経細胞型間の、特に重要な情報伝達の手段である。栄養因子はまた、自己分泌方式でも機能することができ、すなわち、細胞は、その細胞自体の生存、成長、分化、増殖、及び／又は成熟に影響を及ぼす栄養因子を、産生することができる。
培養した脊椎動物細胞に言及する場合、用語「老化」（複製老化、又は細胞老化とも称される）は、有限細胞培養物に起因する特性、すなわち、有限数の集団倍加を超えて成長できないこと（ヘイフリックの限界と呼ばれることもある）を指す。細胞老化は、最初に、線維芽細胞様細胞を使用して説明されたが、培養下で成功裏に増殖させることができる、殆どの正常ヒト細胞型が、細胞老化を経る。種々の細胞型のインビトロでの寿命は、様々であるが、最大寿命は、典型的には、１００回の集団倍加より少ない（１００は、培養中の全細胞が老化することにより、培養物が分裂不能になる倍化数である）。老化は、経時的な時間に応じて決定されるものではなく、むしろ、その培養物が経験している、細胞分裂又は集団倍加の数によって測定される。
本明細書では、用語「眼球、眼球の、及び眼の」は、「眼の、眼に関する、又は眼に関連する」を定義する同じ意味で用いられる。用語「眼球変性症（又は障害）」は、細胞の損傷、変性、又は欠失を伴う、眼と脳との神経連絡を含む、眼の急性及び慢性症状、障害、又は疾患を包含する、包括的用語である。眼球変性症は、加齢性である場合もあり、損傷若しくは外傷から生じる場合もあり、又は特定の疾患若しくは障害に関連する場合もある。急性の眼球変性症としては、脳血管機能不全に起因する症状を含む、眼に影響を及ぼす細胞死若しくは細胞の損失を伴う症状、局所性若しくはびまん性脳外傷、びまん性脳損傷、眼の感染若しくは炎症性疾患、網膜の裂傷若しくは剥離、眼球内損傷（挫傷、穿通、圧迫、裂傷）、又はその他の物理的損傷（例えば、物理的又は化学的火傷）が挙げられるが、これらに限定されない。慢性の眼球変性症（進行性症状を含む）としては、網膜色素変性症（ＲＰ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）などの網膜症及びその他の網膜／黄斑変性症；糖尿病性網膜症、閉塞性網膜症、鎌状赤血球網膜症及び高血圧性網膜症、網膜中心静脈閉塞症、頚動脈狭窄症、緑内障及び関連する症候群などの視神経症などの網膜症；例えば、化学的傷害又は熱傷などにおいて起きる輪部幹細胞欠損（ＬＳＣＤ）（輪部上皮細胞欠損（ＬＥＣＤ）とも称される）、スティーブンス・ジョンソン症候群、コンタクトレンズ由来角膜症、眼部瘢痕性類天疱瘡、無虹彩症又は外胚葉異形成症の先天性疾患、及び複数の内分泌欠乏関連角膜炎などの水晶体及び外眼の障害；が挙げられるが、これらに限定されない。
「眼球変性症を治療する（又は眼球変性症の治療）」という用語は、本明細書で定義される眼球変性症の影響を改善すること、眼球変性症の進行を遅延、中断、若しくは逆行させること、又は眼球変性症の発症を遅延若しくは予防することを指す。
用語「有効量」は、本明細書で説明されるような、インビトロ若しくはインビボでの細胞の増殖及び／又は分化、あるいは眼球変性症の治療を含む意図された結果を生じさせるために有効な、増殖因子、分化剤、栄養因子、細胞集団、若しくは他の薬剤などの試薬又は医薬組成物の濃度又は量を指す。増殖因子に関しては、有効量は、約１ナノグラム／ミリリットル〜約１マイクログラム／ミリリットルの範囲とすることができる。インビボで患者に投与されるＰＰＤＣに関しては、有効量は、数百以下の少量から、数百万以上の大量までの範囲であり得る。特定の実施形態では、有効量は、１０3〜１１11の範囲の細胞数、より具体的には、少なくとも約１０4の細胞数であり得る。投与される細胞の数は、治療される障害の詳細に応じて決定され、それらの詳細としては、医薬生物学者には周知の、他の要因の中でも特に、治療されるサイズ又は総容積／表面積、並びに治療される領域の場所に対する、投与部位の近接性が挙げられるが、これらに限定されないことが理解されるであろう。
有効期間（又は時間）及び有効条件という用語は、薬剤又は医薬組成物が、その意図された結果を達成するために必要であるか、若しくは好ましい期間又はその他の制御可能な条件（例えば、インビトロ法の場合は、温度、湿度）を指す。
患者又は被験体という用語は、その医薬組成物を使用して、又は本明細書で説明される方法に従って治療される、哺乳類、好ましくはヒトを含めた、動物を指す。
薬学的に許容できる担体（又は培地）という用語は、生物学的に適合可能な担体又は培地という用語と、互換的に使用することができ、治療的に投与される細胞及び他の薬剤と適合可能であるばかりではなく、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスクの比率に見合った、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、若しくは他の合併症を伴わない、ヒト及び動物の組織と接触させる使用に関しても好適である、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、並びに／あるいは剤形を指す。
細胞置換療法に関して、幾つかの用語が本明細書で使用される。自家移入、自家移植、自己移植片などの用語は、細胞のドナーが、その細胞置換療法のレシピエントでもある、治療を指す。同種異系移入、同種異系移植、同種移植片などの用語は、細胞のドナーが、その細胞置換療法のレシピエントと同じ種のものであるが、同じ個体ではない、治療を指す。ドナーの細胞が、レシピエントと組織適合的に一致している細胞移入は、同系移入と称される場合がある。異種移入、異種移植、異種移植片などの用語は、細胞のドナーが、その細胞置換療法のレシピエントとは異なる種のものである、治療を指す。本明細書で使用するとき、移植とは、自家又は同種異系ドナー細胞置換療法をレシピエントに導入することを指す。
本明細書で使用するとき、量、時間の長さなどの測定可能な値に関して使用する用語「約」は、指定値から±２０％〜±０．１％、好ましくは±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、これらの変動は開示される方法を実施する上で適切である。
説明
様々な原因を有する、急性、慢性、及び進行性の障害及び疾患を包含する眼球変性症は、眼球細胞の特定の群又は易損性の群の機能障害又は喪失を、共通の特徴として有する。この共通性のために、易損性の損傷した又は喪失した眼球組織の修復及び再生のための類似した治療的手法の開発が可能となり、それらの手法のうちの１つが、細胞療法である。眼球変性症のための細胞療法の開発は、眼球由来幹細胞自体（例えば、網膜及び角膜幹細胞）、胚幹細胞、及び数種類の成熟幹細胞又は前駆細胞（例えば、神経、粘膜、上皮、及び骨髄幹細胞）を含む、比較的少ない種類の幹細胞又は前駆細胞に限定されてきた。分娩後臍帯及び胎盤から単離された細胞は、この目的のための前駆細胞の重要な新供給源であると特定されている（米国特許出願公開第２００５−００３７４９１号、及び同第２０１０−０２７２８０３号）。更に、分娩後胎盤及び臍帯組織から単離した細胞から生成した馴化培地は、眼球変性症を治療するための別の新たな供給源を提供する。したがって、本明細書で説明するその様々な実施形態では、本発明は、分娩後組織から単離された前駆細胞、及び細胞集団由来の馴化培地を用いる、眼球組織の修復及び再生のための方法及び組成物（医薬組成物を含む）を特徴とする。本発明は、眼球変性症に適用可能であるが、従来は治療又は治癒が困難又は不可能であった、数多くの眼球障害に対しても特に好適であることが期待される。そうした眼球障害としては、非限定的であるが、加齢性黄斑変性、網膜色素変性症、糖尿病、及びその他の網膜症が挙げられる。
当該技術分野において既知の任意の方法に従って分娩後臍帯又は胎盤から単離した細胞などの前駆細胞由来の馴化培地は、本発明での使用に好適であることが期待される。しかしながら、一実施形態では、本発明は、好ましくは下記で説明する方法に従って血液を実質的に含まないようにした臍帯組織又は胎盤に由来する、上記で定義した臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）又は胎盤組織由来細胞（ＰＤＣ）に由来する馴化培地を用いる。ｈＵＴＣ又はＰＤＣは、培養下で増殖することが可能であり、他の表現型の細胞に分化する能力を有する。特定の実施形態は、こうした前駆細胞から調製された馴化培地、本馴化培地を含む組成物、及び急性又は慢性の眼球変性症を患う患者を治療するための、医薬組成物などの組成物の使用方法を特徴とする。本発明の分娩後由来細胞は、それらの培養下の増殖特性によって、それらの細胞表面マーカーによって、それらの遺伝子発現によって、それらの、特定の生化学的栄養因子を産生する能力によって、及びそれらの免疫学的特性によって、特徴付けられる。分娩後由来細胞から誘導された馴化培地は、細胞によって分泌される栄養因子、及び架橋分子によって特性決定される。
前駆細胞の調製
本発明の組成物及び方法に使用される、細胞、細胞集団、及び細胞溶解物、馴化培地などを含む調製物は本明細書で説明され、米国特許第７，５２４，４８９号及び同第７，５１０，８７３号、並びに米国特許出願公開第２００５／００５８６３４号で詳細に説明され、これらのいずれもが参照により本明細書に組み込まれる。本方法によれば、哺乳類の臍帯及び胎盤は、満期妊娠又は早期妊娠のいずれかの終了時に、又はその直後に、例えば、出産後の圧出の後に回収する。この分娩後組織は、出産場所から、実験室へと、フラスコ、ビーカー、培養皿、又は袋などの滅菌容器に入れて移送することができる。この容器は、溶液又は培地を含み得、これらとしては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）若しくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの、食塩水、又はウィスコンシン大学液若しくはペルフルオロ化合物溶液などの、移植に使用される器官の移送のために使用される、任意の溶液が挙げられるが、これらに限定されない。限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、１種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を、培地若しくは緩衝液に添加することができる。分娩後組織は、ヘパリン含有溶液などの抗凝固溶液ですすぐことができる。この組織は、ＰＰＤＣの抽出の前に、約４〜１０℃に保つことが好ましい。この組織は、ＰＰＤＣの抽出の前に凍結させないことが、更により好ましい。
ＰＰＤＣの単離は、無菌環境下で実施することが好ましい。臍帯は、当該技術分野において既知の手段によって、胎盤から分離することができる。あるいは、臍帯及び胎盤は、分離することなく使用される。血液及び残渣は、ＰＰＤＣの単離前に、分娩後組織から除去することが好ましい。例えば、分娩後組織は、限定するものではないが、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝溶液で洗浄してもよい。この洗浄緩衝液はまた、限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、１種又は２種以上の抗真菌剤及び／又は抗生物質も含み得る。
胎盤の全体、臍帯、又はそれらの断片若しくは切片を含む分娩後組織は、機械的な力（細断力又は剪断力）によって脱凝集させる。現時点で好ましい実施形態では、この単離手順はまた、酵素消化プロセスも利用する。多くの酵素が、培養下での増殖を促進するための、複合組織マトリックスからの個々の細胞の単離に関して有用であることは、当該技術分野において既知である。弱い消化性（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、及び中性プロテアーゼであるディスパーゼ）から、強い消化性（例えば、パパイン及びトリプシン）の範囲にわたって、そのような酵素が市販されている。本明細書に適合する酵素の非網羅的なリストとしては、粘液溶解酵素活性、メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシン、又はエラスターゼなど）、及びデオキシリボヌクレアーゼが挙げられる。メタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、及び粘液溶解活性から選択される酵素活性が、現時点で好ましい。例えば、コラゲナーゼは、組織から様々な細胞を単離するために有用であることが既知である。デオキシリボヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡを消化することができ、単離中の細胞凝集を最小限に抑えることができる。好ましい方法は、例えば、コラゲナーゼ及びディスパーゼ、あるいはコラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを使用する、酵素処理を伴い、そのような方法が提供される場合、特定の好ましい実施形態では、コラゲナーゼと中性プロテアーゼのディスパーゼとの混合物が、この解離工程で使用される。ヒストリチクス菌由来の少なくとも１種のコラゲナーゼ、並びにプロテアーゼ活性のディスパーゼ及びサーモリシンのいずれかの存在下での消化を採用する方法が、より好ましい。コラゲナーゼ酵素活性及びディスパーゼ酵素活性の双方での消化を採用する方法が、更により好ましい。また、コラゲナーゼ活性及びディスパーゼ活性に加えて、ヒアルロニダーゼ活性での消化を含む方法も好ましい。様々な組織源から細胞を単離するための、そのような多くの酵素処理が、当該技術分野において既知であることが、当業者には理解されるであろう。例えば、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（商標）Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３（Ｒｏｃｈｅ）シリーズの酵素の組合せが、本方法での使用に対して好適である。その他の酵素源が既知であり、当業者はまた、そのような酵素を、それらの天然源から直接取得することもできる。当業者は、更に、本発明の細胞を単離する際の有用性に関して、新たな、又は追加的な酵素若しくは酵素の組合せを評価するための設備を十分に備えている。好ましい酵素処理は、０．５時間、１時間、１．５時間、又は２時間以上の長さである。他の好ましい実施形態では、組織は、解離工程の酵素処理の間、３７℃でインキュベートされる。
本発明のいくつかの実施形態において、分娩後組織は、例えば、胎盤の新生児、新生児／母体、及び母体の態様などの、様々な組織の態様を含む切片へと分離される。次いで、分離された切片は、本明細書で説明される方法に従って、機械的解離及び／又は酵素的解離によって解離される。新生児又は母体系統の細胞は、当該技術分野において既知の任意の手段によって、例えば、Ｙ染色体の核型分析又はインサイチュハイブリダイゼーションによって、同定することができる。
それからＰＰＤＣが増殖する、単離された細胞又は分娩後組織を使用して、細胞培養を開始、すなわち播種することができる。細胞外マトリックス又はリガンド、例えば、ラミニン、コラーゲン（天然、変性、又は架橋）、ゼラチン、フィブロネクチン、及びその他の細胞外マトリックスタンパク質によりコーティングされていない又はコーティングされた組織培養用滅菌容器、に単離細胞を移す。ＰＰＤＣを、例えば、限定するものではないが、ＤＭＥＭ（高又は低グルコース）、改変ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ２０１、イーグル基本培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ１２）、スコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞増殖培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、及びｃｅｌｌｇｒｏ ＦＲＥＥ（商標）などといった、細胞の生育を維持することのできる任意の培養培地で培養する。培養培地は、例えば、好ましくは約２〜１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ウマ血清（ＥＳ）；ヒト血清（ＨＳ）；好ましくは約０．００１％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ又は２−ＭＥ）；１つ又は２つ以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、及びエリスロポエチン；Ｌ−バリンを含むアミノ酸；並びに、例えば、単独又は組み合わせのいずれかでの、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を制御するための１種又は２種以上の抗生物質、並びに／又は抗真菌剤を含む１種又は２種以上の成分を添加してもよい。この培養培地は、好ましくは、増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、血清、ＢＭＥ、及び抗生物質）を含む。
細胞は、細胞増殖を可能にする密度で、培養容器中に播種される。好ましい実施形態では、細胞は、空気中約０〜約５容量％のＣＯ2で培養される。一部の好ましい実施形態では、細胞は、空気中約２〜約２５％のＯ2、好ましくは、空気中約５〜約２０％のＯ2で培養される。細胞は、好ましくは約２５〜４０℃で培養され、更に好ましくは３７℃で培養される。好ましくは、細胞は、インキュベータ内で培養される。培養容器内の培地は、静的状態とすることができ、又は例えば、バイオリアクターを使用して、攪拌することもできる。ＰＰＤＣは、好ましくは、低酸化ストレス下で（例えば、グルタチオン、ビタミンＣ、カタラーゼ、ビタミンＥ、Ｎ−アセチルシステインを添加して）増殖される。「低酸化ストレス」とは、本明細書で使用するとき、フリーラジカルが培養細胞に損傷を与えないか、又は損傷が最低限に抑えられる条件を指す。
最も適切な培養培地、培地調製、及び細胞培養技術の選択法は、当該技術分野において周知であり、Ｄｏｙｌｅら（編）「ＣＥＬＬ ＆ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）（１９９５）、並びにＨｏ及びＷａｎｇ（編）「ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＢＩＯＲＥＡＣＴＯＲＳ」，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（Ｂｏｓｔｏｎ）（１９９１）を含む様々な出典に説明されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
単離された細胞又は組織断片を、十分な期間にわたって培養すると、分娩後組織からの遊走、若しくは細胞分裂のいずれか、又はその両方の結果として、ＰＰＤＣが増殖する。本発明の一部の実施形態では、ＰＰＤＣは、継代され、すなわち、取り出されて最初に使用されたものと同じ又は異なる種類の新鮮培地を収容する別個の培養容器に移され、ここで細胞の集団は有糸分裂的に増殖することができる。本発明の細胞は、継代数０と老化との間の任意の時点で使用することができる。この細胞は、好ましくは、約３回〜約２５回継代され、より好ましくは、約４回〜約１２回継代され、好ましくは、１０回又は１１回継代される。クローニング及び／又はサブクローニングを実行することにより、細胞のクローン集団が単離されていることを確認することができる。
本発明のいくつかの態様において、分娩後組織内に存在する種々の細胞型は、そこからＰＰＤＣを単離することができる下位集団に分画される。これは、分娩後組織をその構成細胞へと解離する酵素処理が挙げられるがこれに限定されない細胞分離のための標準的技術を使用し、それに続いて、例えば、形態学的マーカー及び／又は生化学的マーカーに基づく選択；所望される細胞の選択的増殖（正の選択）、不要な細胞の選択的破壊（負の選択）；例えば大豆凝集素を使用するような、混合集団中での示差的な細胞凝集能（differential cell agglutinability）に基づく分離；凍結−解凍処理法；混合集団における細胞の示差的な接着特性；濾過；従来型及びゾーン遠心分離；遠心エルトリエーション（対向流（counter-streaming）遠心分離）；単位重力分離；向流分布；電気泳動；及び蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）が挙げられるがこれらに限定されない、特定の細胞型をクローニング及び選択することによって達成することができる。クローン選択及び細胞分離技術の概説に関しては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬＳ：Ａ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＢＡＳＩＣ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，３ｒｄ Ｅｄ．」，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９４）を参照されたい。
培養培地は、例えば、必要に応じて、例えばピペットで、皿から培地を慎重に吸引して、新鮮培地を補充することによって変更される。インキュベーションは、十分な数又は密度の細胞が皿内に蓄積するまで継続される。標準的技術を使用して、又はセルスクレーパーを使用して、元の外移植組織の切片を取り出し、残余の細胞をトリプシン処理することができる。トリプシン処理の後、細胞を収集して、新鮮培地に取り出し、上記のようにインキュベートする。いくつかの実施形態において、培地は、トリプシン処理の約２４時間後に、少なくとも１回交換して、あらゆる浮遊細胞を除去する。培養下で残存する細胞が、ＰＰＤＣであると考えられる。
ＰＰＤＣは、凍結保存することができる。したがって、以下でより詳細に説明される好ましい実施形態では、自家移入に関する（母又は子のいずれかに関する）ＰＰＤＣは、子の誕生後に適切な分娩後組織から誘導して、続いて、これらが後に移植に必要とされる事象で利用可能となるように、凍結保存することができる。
前駆細胞の特徴
ＰＰＤＣなどの本発明の前駆細胞は、例えば、増殖特性（例えば、集団倍加能力、倍加時間、老化までの継代数）、核型分析（例えば、正常核型、母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、免疫組織化学及び／若しくは免疫細胞化学（例えば、エピトープの検出に関する）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、及び従来型ＰＣＲ））、タンパク質アレイ、タンパク質分泌（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、例えば、血漿凝固アッセイ又はＰＤＣ−馴化培地の分析によるもの）、混合リンパ球反応（例えば、ＰＢＭＣの刺激の指標として）、並びに／又は当該技術分野において既知の他の方法によって特徴付けることができる。
臍組織由来のＰＰＤＣの例は、２００４年６月１０日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０）に寄託され、以下のＡＴＣＣ受託番号が割り当てられている。（１）菌株表示ＵＭＢ０２２８０３（Ｐ７）には受託番号ＰＴＡ−６０６７が割り当てられ、（２）菌株表示ＵＭＢ ０２２８０３（Ｐ１７）には受託番号ＰＴＡ−６０６８が割り当てられている。胎盤組織由来のＰＰＤＣの例は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．））に寄託され、以下のＡＴＣＣ受託番号が割り当てられている。（１）菌株表示ＰＬＡ０７１００３（Ｐ８）は２００４年６月１５日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７４が割り当てられ、（２）菌株表示ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１１）は２００４年６月１５日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７５が割り当てられ、（３）菌株表示ＰＬＡ０７１００３（Ｐ１６）は２００４年６月１６日に寄託され、受託番号ＰＴＡ−６０７９が割り当てられている。
様々な実施形態では、ＰＰＤＣは以下の増殖特性のうちの１つ又は２つ以上を有する。（１）培養下で増殖するためにＬ−バリンを必要とすること、（２）約５〜少なくとも約２０％の酸素を含む大気下での増殖が可能であること、（３）老化に達する前に培養下で少なくとも約４０回の倍加を行う能力を有すること、及び、（４）コーティングされた又はコーティングされていない組織培養容器上で付着及び増殖すること（ここでコーティングされた組織培養容器は、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、ポリオミチン（polyomithine）、ビトロネクチン、又はフィブロネクチンのコーティングを含む）。
特定の実施形態では、ＰＰＤＣは、その細胞が継代される際に維持される、正常核型を有する。核型分析は、胎盤由来の母体細胞から、新生児細胞を同定して識別するために、特に有用である。核型分析に関する方法は、当業者に利用可能であり、既知である。
他の実施形態では、ＰＰＤＣは、（１）ビメンチン、及びα−平滑筋アクチンのうちの少なくとも１つの産生、並びに（２）フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、ＰＤ−Ｌ２、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生、を含む、特定のタンパク質の産生によって特徴付けることができる。他の実施形態では、ＰＰＤＣは、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＣＤ１７８、Ｂ７−Ｈ２、ＨＬＡ−Ｇ、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ細胞表面マーカーのうちの少なくとも１つの産生の欠如によって、特徴付けることができる。ビメンチン及びα−平滑筋アクチンを産生する細胞が特に好ましい。
その他の実施形態では、ＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８；レチクロン１；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１（黒色腫（melonoma）増殖刺激活性、α）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド６（顆粒球走化性タンパク質２）；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３；腫瘍壊死因子、α誘導タンパク質３；Ｃ型レクチンスーパーファミリーメンバー２；ウイルムス腫瘍１；アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリーメンバーＡ２；レニン；酸化低密度リポタンパク質受容体１；ホモサピエンスクローンＩＭＡＧＥ：４１７９６７１；プロテインキナーゼＣζ；仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ０１３；卵巣癌においてダウンレギュレート１；及びクローンＤＫＦＺｐ５４７ｋ１１１３由来のホモサピエンス遺伝子のうちの少なくとも１つをコード化する遺伝子に関して増大した遺伝子発現によって特徴付けることができる。一実施形態では、臍帯組織由来のＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８；レチクロン１；又はケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド３のうちの少なくとも１つをコード化する遺伝子に関して増大した遺伝子発現によって特徴付けることができる。別の一実施形態では、胎盤組織由来のＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、レニン、又は酸化低密度リポタンパク質受容体１のうちの少なくとも１つをコード化する遺伝子に関して増大した遺伝子発現によって特徴付けることができる。
更にその他の実施形態では、ＰＰＤＣは、線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、低身長感受性ホメオボックス２；熱ショック２７ｋＤａタンパク質２；ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１）；エラスチン（大動脈弁上狭窄症、ウィリアムズ−ビューレン症候群）；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２（クローンＤＫＦＺｐ５８６Ｍ２０２２由来）；間葉ホメオボックス２（増殖停止特異的ホメオボックス）；ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ１（ドロソフィラ）；クリスタリン、αＢ；形態形成のｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ関連アクチベータ２（disheveled associated activator of morphogenesis 2）；ＤＫＦＺＰ５８６Ｂ２４２０タンパク質；ニューラリン１の類似体；テトラネクチン（プラスミノーゲン結合タンパク質）；ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）及びシステイン豊富ドメイン；コレステロール２５−ヒドロキシラーゼ；ｒｕｎｔ関連転写因子３；インターロイキン１１受容体、α；プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー；ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ７（ドロソフィラ）；仮定的遺伝子ＢＣ００８９６７；コラーゲン、ＶＩＩＩ型、α１；テネイシンＣ（ヘキサブラキオン）；ｉｒｏｑｕｏｉｓホメオボックスタンパク質５；ヘファエスチン；インテグリン、β８；シナプス小胞糖タンパク質２；神経芽腫、腫瘍形成抑制１；インスリン様増殖因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ；ホモサピエンスｃＤＮＡ ＦＬＪ１２２８０ｆｉｓ、クローンＭＡＭＭＡ１００１７４４；サイトカイン受容体様因子１；カリウム中間体／低コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４；インテグリン、β７；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；ｓｉｎｅ ｏｃｕｌｉｓホメオボックスホモログ２（ドロソフィラ）；ＫＩＡＡ１０３４タンパク質；小胞関連膜タンパク質５（ミオブレビン）；ＥＧＦ含有フィビュリン様細胞外マトリックスタンパク質１；初期増殖応答３；ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス５；仮想タンパク質ＦＬＪ２０３７３；アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３−αヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；バイグリカン；ＰＤＺ結合モチーフ（ＴＡＺ）を有する転写コアクチベータ；フィブロネクチン１；プロエンケファリン；インテグリン、β様１（ＥＧＦ様リピートドメインを有する）；ホモサピエンスｍＲＮＡ完全長インサートｃＤＮＡクローンＥＵＲＯＩＭＡＧＥ １９６８４２２；ＥｐｈＡ３；ＫＩＡＡ０３６７タンパク質；ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ／グアニル酸シクラーゼＣ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｃ）；仮想タンパク質ＦＬＪ１４０５４；ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２（クローンＤＫＦＺｐ５６４Ｂ２２２由来）；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３様；ＡＥ結合タンパク質１；及びシトクロムｃオキシダーゼサブユニットＶＩＩａポリペプチド１（筋肉）のうちの少なくとも１つをコード化する遺伝子に関して低減した遺伝子発現によって特徴付けることができる。
その他の実施形態では、ＰＰＤＣは、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される架橋分子の分泌によって特徴付けすることができる。更に、臍帯組織由来のＰＰＤＣは、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ｂ、Ｉ３０９、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＤＣ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、臍帯組織由来のＰＰＤＣは、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＴＧＦ−β２、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＭＩＰ１ａ及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠損によって特徴付けることができる。代替的な実施形態では、胎盤組織由来のＰＰＤＣは、ＥＬＩＳＡにより検出される、ＭＣＰ−ｌ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＣＰ−２、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＴＰＯ、ＭＩＰ１ａ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＴＩＭＰ１のうちの少なくとも１つの分泌によって、並びにＴＧＦ−β２、ＭＩＰ１ｂ、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦｂｂ、ＦＧＦ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの分泌の欠如によって特徴付けることができる。更なる実施形態では、ＰＰＤＣは、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
好ましい実施形態では、それらの細胞は、上記の増殖特性、タンパク質／表面マーカーの産生特性、遺伝子発現特性、又は物質分泌特性のうちの２つ以上を含む。それらの特性のうちの３つ、４つ、又は５つ以上を含むような細胞が、より好ましい。それらの特性のうちの６つ、７つ、又は８つ以上を含むＰＰＤＣが、更により好ましい。上記の特性の全てを含むような細胞が、現時点では更により好ましい。
特に好ましい実施形態では、培養下で増殖が可能な、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離された細胞は、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生を欠如し、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現しない。一実施形態において、この細胞にはＣＤ１１７及びＣＤ４５の産生がなく、また任意で、ｈＴＥＲＴ及びテロメラーゼを発現しない。別の実施形態において、この細胞は、ｈＴＥＲＴ及びテロメラーゼを発現しない。更に別の実施形態では、培養下で増殖が可能な、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離された細胞は、ＣＤ１１７又はＣＤ４５の産生を欠如し、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼを発現せず、また、以下の特性のうちの１つ又は２つ以上を有する：ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０を発現すること；ＣＤ３１又はＣＤ３４を発現しないこと；ヒト線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞と比較して、インターロイキン８又はレチクロン１の発現レベルが増加していること；並びに分化する可能性を有していること。
その態様のうちのいくつかで本発明と共に使用するのに現時点で好ましい細胞は、とりわけ、上述の特性を有する分娩後細胞であり、より具体的には、細胞が正常核型を有し、継代で正常核型を維持する分娩後細胞であり、更には、細胞がマーカーＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれを発現する分娩後細胞であり、細胞が列記されたマーカーに対応する免疫学的に検出可能なタンパク質を産生する分娩後細胞である。前述に加えて、フローサイトメトリーによって検出されるような、マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、又はＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱのいずれかに対応するタンパク質も産生しないような細胞が、更により好ましい。更なる好適な実施形態では、細胞は、ｈＴＥＲＴ又はテロメラーゼの発現を欠如する。
各種表現型に向かう系列に沿って分化する可能性があるある種の細胞は、不安定であり、したがって自発的に分化する場合がある。例えば、神経株に沿って、自然発生的に分化することのない細胞が、本発明と共に使用するために、現時点で好ましい。好ましい細胞は、増殖培地中で増殖させる場合、それらの細胞の表面上に産生される細胞マーカーに関して、また、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰを用いて判定される様々な遺伝子の発現パターンに関して、実質的に安定である。それらの細胞は、例えば、複数回の集団倍加を経る継代にわたって、それらの表面マーカー特性を、実質的に一定なまま保持する。
しかしながら、ＰＰＤＣの１つの特徴は、分化を誘導する細胞培養条件にそれらを曝露することによって様々な系統の表現型へと分化するように、それらの細胞を意図的に誘導することができる点である。特定の眼球変性症の治療における用途では、当該技術分野において既知の１つ又は２つ以上の方法を用いて、ＰＰＤＣを神経表現型に分化するように誘導することができる。例えば、本明細書で例示されるように、ＰＰＤＣは、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有する、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中、ラミニンでコーティングされたフラスコ上にプレーティングすることができ、この培地の組合せは、本明細書では、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と称される。ＮＰＥ培地には、ｂＦＧＦ及び／又はＥＧＦを更に添加することができる。あるいは、ＰＰＤＣは、（１）神経前駆細胞と共にＰＰＤＣを共培養すること、又は（２）神経前駆細胞馴化培地中でＰＰＤＣを増殖させること、によってインビトロで分化するように誘導することができる。
ＰＰＤＣの神経表現型への分化は、伸長した突起を有する双極細胞形態によって証明され得る。誘導された細胞集団は、ネスチンの存在に関して、陽性に染色することができる。分化したＰＰＤＣは、ネスチン（nest in）、ＴｕＪ１（βＩＩＩチューブリン）、ＧＦＡＰ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＡＢＡ、Ｏ４、及び／又はＭＢＰの検出によって、評価することができる。いくつかの実施形態では、ＰＰＤＣは、ニューロスフェアのニューロン幹細胞形成に固有の、３次元体を形成する能力を呈している。
細胞集団
本発明の別の一態様は、分娩後由来細胞などの前駆細胞の集団を特徴とする。分娩後由来細胞は、胎盤又は臍帯組織から単離することができる。好ましい一実施形態では、細胞集団は上記のＰＰＤＣを含むが、この細胞集団については下記の項で説明する。
一部の実施形態では、この細胞集団は不均質である。本発明の不均質な細胞集団は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の細胞を含み得る。本発明の不均質な細胞集団は、前駆細胞（分娩後由来細胞）、又は上皮若しくは神経前駆細胞などの他の前駆細胞を更に含み得るか、あるいは完全に分化した細胞を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、この集団は、実質的に均質であり、すなわち、実質的にＰＰＤＣのみ（好ましくは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上の細胞）を含む。一部の実施形態では、この細胞集団は均質である。実施形態では、本発明の均質な細胞集団は、臍又は胎盤由来細胞を含み得る。臍由来細胞の均質な集団は、好ましくは、母体系統の細胞を含まない。胎盤由来細胞の均質な集団は、新生児又は母体系統であり得る。細胞集団の均質性は、当該技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、細胞選別（例えば、フローサイトメトリー）によって、又は既知の方法によるクローン増殖によって、達成することができる。したがって、好ましい均質なＰＰＤＣ集団は、分娩後由来細胞のクローン細胞株を含み得る。そのような集団は、極めて望ましい機能性を有する細胞クローンが単離されている場合、特に有用である。
また、所望の形成経路（例えば、神経、上皮）に沿った幹細胞分化を刺激する、１種又は２種以上の因子の存在下、又はそのような条件下でインキュベートされた細胞の集団も本明細書で提供される。そのような因子は、当該技術分野において既知であり、当業者には、分化に好適な条件の決定は、慣用の実験方法を使用して達成することができる点が、理解されるであろう。そのような条件の最適化は、統計的実験計画及び分析によって達成することができ、例えば、応答曲面法により、例えば生物学的培養での、複数の変数の同時最適化が可能となる。現時点で好適な因子としては、増殖因子若しくは栄養因子などの因子、脱メチル化剤、神経若しくは上皮性系統細胞との共培養、又は神経若しくは上皮性系統細胞馴化培地での培養、及びこれらの経路に沿って幹細胞分化を刺激する技術分野で既知のその他の条件が挙げられるが、これらに限定されない（神経分化に有用な因子については、例えば、Ｌａｎｇ，Ｋ．Ｊ．Ｄ．らのＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．７６：１８４〜１９２（２００４）、Ｊｏｈｅ，Ｋ．Ｋ．らのＧｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ．１０：３１２９〜３１４０（１９９６）、Ｇｏｔｔｌｅｉｂ，Ｄ．のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３８１〜４０７（２００２）を参照されたい）。
馴化培地
一態様では、本発明は、後述するように、インビトロ及びインビボで用いるための、分娩後由来細胞又はその他の前駆細胞などの培養した前駆細胞由来の馴化培地を提供する。こうした馴化培地の使用により、拒絶反応又は他の有害な免疫応答を誘発する恐れがある無傷細胞を導入することなく、細胞によって分泌された有益な栄養因子を、患者内で同種異系的に（allogeneically）使用することが可能となる。馴化培地は、培養培地中で細胞（細胞の集団など）を培養し、続いて、その培地から細胞を除去することによって調製される。特定の実施形態では、分娩後細胞は、ＵＴＣ又はＰＤＣであり、より好ましくはｈＵＴＣである。
上記細胞の集団から調製される馴化培地は、そのまま使用するか、例えば、限外濾過若しくは凍結乾燥によって更に濃縮するか、又は更には乾燥させるか、部分的に精製するか、当該技術分野において既知の、薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤と組み合わせるか、又は生物学的製剤、例えば薬学的に有用なタンパク質組成物などの他の化合物と組み合わせることができる。馴化培地は、インビトロ又はインビボで、単独、又は例えば自家若しくは同系の生細胞と共に使用することができる。この馴化培地は、インビボで導入される場合は、治療部位で局所的に、又は遠隔で導入して、例えば必要な細胞増殖因子若しくは栄養因子を、患者に提供することができる。
これまでに、ヒト臍帯組織由来細胞が視覚機能を改善し、網膜変性症を改善したことが実証されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号を参照されたい）。分娩後由来細胞を用いて、ＲＣＳモデルの視細胞のレスキューを促進して、視細胞を保存し得ることも実証されている。（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号を参照されたい）。ｈＵＴＣをＲＣＳラットの眼に網膜下注入することで、視力が改善し、網膜変性症が改善した。
本明細書で説明する通り、ｈＵＴＣ馴化培地の様々な調製物を調製して、食作用レスキュー活性に関して評価した。播種密度及び培養条件は、馴化培地の活性レベルに影響を及ぼすことが判明した。血清（ＣＭ１）中のｈＵＴＣに対しては、Ｔ７５細胞培養フラスコ中のｈＵＴＣ増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース＋１５％のＦＢＳ＋４ｍＭのＬ−グルタミン）中にｈＵＴＣを５，０００生育可能細胞／ｃｍ2で播種し、２４時間培養した。培地を２１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％のＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ）））と交換し、細胞を更に５４時間培養し、培養上清を回収し、−７０℃で冷凍した（凍結保存した）。
無血清培地（ＣＭ１無血清）の場合、２日目に、２１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２無血清培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））で培地を補充した。血清を含むＣＭ１又は血清を含まないＣＭ１のいずれも食作用活性を回復した（図１Ａ〜１Ｂ、及び２）。別の馴化培地（ＣＭ２）を、細胞を、１つのフラスコあたり６３ｍＬの培地を有するＴ２２５フラスコで培養して、培地交換後のインキュベート時間が４８時間であったことを除いては、血清を含むＣＭ１と同じ手順で調製した。しかしながら、この培地は活性を全く有さなかった（図３Ａ）。ＣＭ３を、１０，０００生育可能細胞／ｃｍ2であること、及びジストロフィＲＰＥ中で食作用を刺激したことを除いては、ＣＭ２と同じ条件で調製した（図３Ｂ〜３Ｄ）。
試験された条件中では、ＣＭ２は活性を欠くことが判明した（図３Ａ）。ＣＭ２は、５４時間であるＣＭ１のインキュベート時間と比較してより短い４８時間のインキュベート時間を有した。ＣＭ３を、細胞播種密度を２倍にして、培地交換後のインキュベート時間を同じにすることによって調製して、ＣＭ２と比較して、これは活性であることが判明した。したがって、活性なＣＭを得るためには、初期播種密度、及び培地交換後の細胞インキュベート時間が、２つの重要な条件である。
英国外科医師会（ＲＣＳ）ラット由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、Ｍｅｒｔｋ遺伝子中の突然変異のために、桿体外節（ＲＯＳ）の食作用に欠陥を有している。Ｍｅｒｔｋは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーのメンバーであり、ＲＰＥの食作用における役割を果たしているものと考えられる。塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ ＲＴＫのリガンドは、ＲＣＳラット由来の培養ＲＰＥ細胞中における食作用能力を誘導することが示された（ＭｃＬａｒｅｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９７；４１２：２１〜２９）。本発明の一実施形態では、ｈＵＴＣによるジストロフィＲＰＥの食作用のレスキューは、ＲＴＫリガンドの分泌によるものであり、これはＲＴＫのシグナル伝達を活性化して、また、その他の食作用関連受容体のシグナル伝達を強化すると考えられる。
本発明の一実施形態では、ＲＴＫリガンドであるＢＤＮＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、ＨＧＦ、及びエフリンＢ２は、ＲＣＳのジストロフィＲＰＥ細胞による食作用に対するレスキュー効果を有する。特定の一実施形態では、ＢＤＮＦ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、及びエフリンＢ２が、明白なレスキュー効果を有する。（図５Ａ、６Ａ〜６Ｂ、及び７Ａ〜７Ｂを参照されたい）。
非ＲＴＫリガンドは、ＲＴＫ由来の異なる受容体を活性化させ、ＲＴＫリガンドと同様な食作用に対する効果は有さない（図８Ａ〜８Ｃ、及び図９）。ｈＵＴＣは、ビトロネクチン、エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、及びＩＬ−６を分泌することが示されている。ビトロネクチンに対する受容体としては、αｖβ３及びαｖβ５インテグリンが挙げられる。Ｆｉｎｎｅｍａｎｎらは、ＲＰＥ細胞によるＲＯＳ食作用には、αｖβ５インテグリンが必要であると報告している（上記のＦｉｎｎｅｍａｎｎら（１９９７））。ｈＵＴＣ ＣＭは、ジストロフィＲＰＥ細胞中における食作用を増加させたが、エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６（濃度（２００ｎｇ／ｍＬ）、及びビトロネクチン（様々な濃度）は、ＲＣＳのＲＰＥ食作用に対して効果を全く有さなかった（図８Ａ〜８Ｃ、図９）。
馴化培地で処理したジストロフィＲＰＥ、及び未処理のジストロフィＲＰＥの遺伝子発現プロファイルに関するＲＮＡ分析は、ｈＵＴＣは１５のＲＴＫサブファミリー内でＲＴＫリガンドの複数の遺伝子を発現し（図１０、及び表１−１）、また、更に、ｈＵＴＣは、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、タンパク質Ｓ、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２を含む架橋分子の遺伝子も発現することを示す（表１−３）。ＲＣＳのＲＰＥは、１８のＲＴＫサブファミリー中で遺伝子を発現する（表１−２）。１８のＲＴＫサブファミリーの中、ＲＴＫリガンド遺伝子に対応する１５のＲＴＫサブファミリーがｈＵＴＣ中で発現した。ＲＣＳのＲＰＥは、インテグリンαｖβ３、αｖβ５、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＭｅｒＴＫ、及びＣＤ３６を含む、架橋分子の結合のための受容体遺伝子を更に発現する（表１−４）。
ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いたＲＣＳのＲＰＥ細胞、及びｈＵＴＣの両方のトランスクリプトームプロファイル、並びにそれに続くインフォマティクスデータ分析は、ＲＣＳのＲＰＥ細胞が複数のＲＴＫ遺伝子を発現し、一方でｈＵＴＣは複数のＲＴＫリガンドに対する遺伝子を発現することを示す（表１−１〜１−４、及び表２−１）。特に、７つのＲＴＫサブファミリーのＲＴＫリガンドは、比較的高い遺伝子発現レベルを有する。これらのリガンドとしては、ＴｒｋファミリーのリガンドであるＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）及びＮＴ３（ニューロトロフィン３）、ＭｅｔファミリーのリガンドであるＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＰＤＧＦファミリーのリガンドであるＰＤＧＦ−ＤＤ（血小板由来増殖因子Ｄ型）、及びＰＤＧＦ−ＣＣ（血小板由来増殖因子Ｃ型）、Ｅｐｈファミリーのリガンドであるエフリン−Ｂ２、ＥｒｂＢファミリーのリガンドであるＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合上皮成長因子）、ＲｅｔファミリーのリガンドであるＧＤＮＦ（グリア細胞由来神経栄養因子）、並びにＭｕｓｋファミリーのリガンドであるアグリンが挙げられる。
本発明の一実施形態では、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦは、ｈＵＴＣ馴化培地中で分泌され、かつ、ＥＬＩＳＡアッセイで測定した時に正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びＡＲＰＥ−１９細胞由来のものと比較してより高いレベルで分泌される（図１１Ａ〜１１Ｃ、及び１１Ｆ）。別の一実施形態では、ＮＨＤＦ又はＡＲＰＥ−１９と比較して、ｈＵＴＣはより低レベルのＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤを分泌する（図１１Ｄ、１１Ｅ）。更なる一実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイで測定した時に、エフリン−Ｂ２及びＨＢ−ＥＧＦは、ｈＵＴＣ、ＮＨＤＦ、及びＡＲＰＥ−１９の馴化培地中では検出されない。これらの細胞は、２つのタンパク質を分泌しないか、あるいはそのレベルがＥＬＩＳＡアッセイの検出限界未満であるかのいずれかである。ｈＵＴＣ、ＮＨＤＦ、及びＡＲＰＥ−１９馴化培地中のアグリンのレベルは、対照培地のそれと同様であり、全ての馴化培地サンプル中で検出されたアグリンは、培地由来であり得る。
ＲＮＡ−Ｓｅｑベースでの、ＲＣＳのＲＰＥ細胞のトランスクリプトームプロファイル分析に基づく、ｈＵＴＣ馴化培地中で分泌された架橋分子及びその他の因子のレベルは、食作用、及びその結果として、アポトーシスに対する影響を更に実証する。示されるたように、ＲＣＳのＲＰＥ細胞は、現在までに同定された、アポトーシス細胞上で「食誘引」シグナルを認識する多くの受容体の遺伝子を発現する。これらの受容体としては、スカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ、ＬＯＸ−１、ＣＤ６８、ＣＤ３６、ＣＤ１４）、インテグリン（αｖβ３及びαｖβ５）、Ａｘｌ及びＴｙｒｏ３の受容体チロシンキナーゼ、ＬＲＰ−１／ＣＤ９１、並びにＰＳ受容体スタビリン１が挙げられる（表３−１；出典：Ｅｒｗｉｇ Ｌ−Ｐ及びＨｅｎｓｏｎ ＰＭのＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００８）；１５：２４３〜２５０）。更に、ｈＵＴＣは、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、アポリポタンパク質Ｈ、及びアネキシン１を含む多くの架橋分子の遺伝子を発現する。本発明の一実施形態では、ｈＵＴＣは、ｈＵＴＣ馴化培地中で、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２を分泌する（図１２Ａ〜１２Ｅ、及び表３−２）。別の一実施形態では、ｈＵＴＣは、アポリポタンパク質Ｈ、ＳＰ−Ｄ、又はアネキシンＩを分泌しない（表３−２）。特定の実施形態では、ｈＵＴＣは、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９よりも著しく高いレベルで、ＭＦＧ−Ｅ８及びＴＳＰ−２を分泌する（図１２Ａ及び１２Ｄ）。
本発明の一態様では、ｈＵＴＣ ＣＭを用いてプレインキュベートしたＲＯＳをＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えると、ｈＵＴＣ馴化培地はＲＯＳ食作用を刺激する。ジストロフィＲＰＥ細胞の食作用は完全にレスキューされた。図１３Ａ〜１３Ｄに示すように、未処理のジストロフィＲＰＥ細胞は、正常なＲＰＥ細胞と比較すると、食作用が劣った。本発明の一実施形態では、ｈＵＴＣ ＣＭを用いてジストロフィＲＰＥ細胞をプレインキュベートすることにより、食作用がレスキューされる。これは、アッセイ中にｈＵＴＣ ＣＭが存在しない場合であっても発生する。本発明の実施形態では、食作用関連受容体、及びそれらのシグナル伝達経路は、プレインキュベート期間中に上方制御される。ｈＵＴＣ ＣＭが食作用アッセイの全体を通して存在する場合は、ジストロフィＲＰＥ細胞がｈＵＴＣ ＣＭで予処理されていたか否かに関わらず、食作用の旺盛な増強が観察された。一実施形態では、ｈＵＴＣ ＣＭで予処理したＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞は、食作用を回復、すなわちレスキューする。これは、食作用アッセイ中にｈＵＴＣ ＣＭが存在しない場合であっても発生する。本発明の特定の実施形態では、ｈＵＴＣ ＣＭは、例えば、食作用を好ましく促進する架橋分子／オプソニンを介して、ＲＯＳの結合及び内在化を強化するＲＯＳを初回刺激（prime）又は改質し得る。
本発明の実施形態では、架橋分子であるＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２は、ＲＣＳのＲＰＥ細胞によるＲＯＳ食作用を媒介する。様々な濃度のＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２でプレインキュベートされたＲＯＳを与えられてから食作用に関してアッセイされたジストロフィＲＰＥ細胞は、ＲＯＳ食作用のレスキューを示した（図１４Ａ〜１４Ｈ）。特定の実施形態では、ｈＵＴＣ馴化培地は、例えば、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２などの架橋分子の分泌を介して、ＲＣＳのＲＰＥ食作用レスキューを媒介する。
一実施形態では、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦなどのＲＴＫリガンドは、ＲＣＳのＲＰＥにおけるｈＵＴＣ媒介食作用レスキューを刺激する。ＲＴＫリガンドであるＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦは、ＲＣＳのＲＰＥにおける食作用をレスキューした（図１４Ｉ〜Ｊ）。リコンビナントＲＴＫリガンド、及び架橋分子タンパク質は、ｈＵＴＣ ＣＭの効果を模倣して、ＲＣＳのＲＰＥの食作用を回復させることができ、ＲＣＳのＲＰＥにおいてｈＵＴＣ媒介食作用レスキューに関与する。
ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、ｈＵＴＣ中でＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２がノックダウン（サイレンシング）されることを実証した。モックｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ｈＵＴＣによるこれらの因子の分泌に対して全く影響を及ぼさなかった。ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＨＧＦを標的にするｓｉＲＮＡは、ほぼ１００％のノックダウン効率を生み出し、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦに関してはそれぞれ８０％及び６５％のノックダウンが観察された（図１５Ａ〜１５Ｂ）。架橋分子であるＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２のそれぞれのノックダウンにより、ＲＣＳのＲＰＥによるＯＳ食作用が低下した（図１５Ｃ）。特定の一実施形態では、ＲＴＫリガンドであるＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦは、ＲＣＳのＲＰＥにおけるｈＵＴＣ媒介食作用レスキューに必要である。別の一実施形態では、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２などの架橋分子は、ＲＣＳのＲＰＥにおけるｈＵＴＣ媒介食作用レスキューに必要である。
細胞の改変、構成成分、及び産物
分娩後細胞などの前駆細胞は、更に、治療的に有用な遺伝子産物を産生するため、又は腫瘍治療のための抗腫瘍薬を産生するために遺伝子操作することもできる。遺伝子操作は、例えば、レトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターなどの組み込みウイルスベクター；例えば、パピローマウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、アデノウイルスベクターなどの非組み込み複製ベクター；又は複製欠陥ウイルスベクター、が挙げられるがこれらに限定されない様々なベクターのうちのいずれかを用いて達成され得る。細胞内にＤＮＡを導入する他の方法としては、リポソーム、電気穿孔法、粒子ガンの使用、又は直接的ＤＮＡ注入によるものが挙げられる。
宿主細胞は、好ましくは、とりわけ、プロモーター配列若しくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などの、１つ又は２つ以上の適切な発現制御要素によって制御されるか、あるいは有効に関連するＤＮＡ、及び選択マーカーで、形質転換又は形質移入される。任意のプロモーターを使用して、挿入遺伝子の発現を駆動することができる。例えば、ウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０、パピローマウイルス、エプスタイン−バールウイルス、又はエラスチン遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、インビボで必要とされる場合にのみ、その産物が合成されるように、目的の遺伝子の発現を制御するために使用される制御要素によって、調節された遺伝子発現が可能となり得る。一過性発現が所望される場合には、構成的プロモーターが、好ましくは、非組み込みベクター及び／又は複製欠陥ベクター内で使用される。あるいは、誘導性プロモーターを使用して、必要とされる際に、挿入遺伝子の発現を駆動することが可能である。誘導性プロモーターとしては、メタロチオネイン及び熱ショックタンパク質を伴うものが挙げられるが、これらに限定されない。
外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞を、富栄養培地中で増殖させ、次いで、選択培地に切り替えることができる。外来ＤＮＡ中の選択マーカーは、選択に耐性を付与し、細胞が、例えば、プラスミド上に、その染色体中に外来ＤＮＡを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成することを可能にし、次にこの増殖巣は、クローン化して細胞株へと増殖することができる。この方法は、有利には、遺伝子産物を発現する細胞株を操作するために、使用することができる。
細胞は、移植部位での炎症若しくは拒絶反応を促進する因子の発現を、「ノックアウト」又は「ノックダウン」するように、遺伝子組み換えすることができる。標的遺伝子発現レベル又は標的遺伝子産物活性レベルの低減のための、負調節技術を、以下で説明する。「負調節」とは、本明細書で使用するとき、調節処理が存在しない場合の標的遺伝子産物のレベル及び／又は活性と比較して、標的遺伝子産物のレベル及び／又は活性が低下することを指す。ニューロン又はグリア細胞に天然の遺伝子の発現は、例えば、相同組み換え技術を使用して遺伝子を不活性化させることによる、発現の阻害を含めた、数多くの技術を使用して、低減若しくはノックアウトすることができる。典型的には、タンパク質の重要領域をコード化するエクソン（すなわち、その領域に対して５’側のエクソン）が、陽性選択マーカー、例えば、ｎｅｏによって干渉されることで標的遺伝子からの正常なｍＲＮＡの産生が妨げられて、その遺伝子の不活性化をもたらす。遺伝子はまた、遺伝子の一部に欠失を作り出すことによって、又は遺伝子全体を欠失させることによって、不活性化させることもできる。ゲノム中で離間した２つの相同な領域を備える構築物を標的遺伝子に対して使用することによって、その２つの領域に介在する配列を、欠失させることができる（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３０８４〜３０８７）。アンチセンス、ＤＮＡザイム、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び標的遺伝子の発現を阻害する他の分子もまた、標的遺伝子活性のレベルを低減するために使用することができる。例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の発現を阻害する、アンチセンスＲＮＡ分子は、免疫反応に関して、最も汎用的であることが示されている。また更には、標的遺伝子活性のレベルを低減する際に、３重らせん分子を利用することもできる。これらの技術は、Ｌ．Ｇ．Ｄａｖｉｓら（編）、「ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２ｎｄ ｅｄ．」（１９９４）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）で詳細に説明されている。
他の態様では、本発明は、分娩後細胞、好ましくはＰＰＤＣから調製される細胞溶解物及び細胞可溶性画分、又はＰＰＤＣ細胞を含む不均質若しくは均質な細胞集団、並びに遺伝子操作されているか、又は神経形成経路に沿って分化するように刺激されている、ＰＰＤＣ若しくはその集団を提供する。こうした溶解物及びその画分は、多くの有用性を有する。インビボでの細胞溶解物の可溶性画分（すなわち、実質的に膜を含まない）の使用により、例えば、拒絶反応、又は他の有害な免疫学的応答を誘発する可能性が最も高い、相当量の細胞表面タンパク質を導入することなく、有益な細胞内環境を、患者内で同種異系的に使用することが可能となる。細胞を溶解する方法は、当該技術分野において周知であり、機械的破壊、酵素破壊、若しくは化学的破壊、又はこれらの組み合わせの様々な手段が挙げられる。そのような細胞溶解物は、増殖培地中で細胞から直接調製されるので、分泌された増殖因子等を含有した状態で調製されてもよく、又は培地を用いずに、例えば、ＰＢＳ若しくは他の溶液中で、洗浄された細胞から調製されてもよい。洗浄細胞は、好ましい場合には、元の集団密度よりも高い濃度で、再懸濁させることができる。
一実施形態では、例えば、細胞を破壊し、その後に細胞画分を分離しないことによって、細胞溶解物の全体が調製される。別の実施形態では、当該技術分野において既知の慣用的方法、例えば、遠心分離、濾過、又は同様の方法によって、細胞の可溶性画分から、細胞膜画分が分離される。
分娩後由来細胞などの前駆細胞の集団から調製される、細胞溶解物又は細胞可溶性画分は、そのまま使用するか、例えば、限外濾過若しくは凍結乾燥によって更に濃縮するか、更に乾燥させるか、部分的に精製するか、当該技術分野において既知の、薬学的に許容できる担体若しくは希釈剤と組み合わせるか、又は生物学的製剤、例えば薬学的に有用なタンパク質組成物などの他の化合物と組み合わせることができる。細胞溶解物又はその画分は、インビトロ若しくはインビボで、単独で、又は、例えば、自家若しくは同系の生細胞と共に、使用することができる。細胞溶解物は、インビボに導入される場合には、治療部位で局所的に、又は遠隔で導入して、例えば、必要な細胞増殖因子を患者に提供することができる。
更なる一実施形態では、分娩後細胞、好ましくはＰＰＤＣは、インビトロで培養することにより、生物学的産物を高収率で産生することができる。例えば、そのような細胞は、目的とする具体的な生物学的産物（例えば、栄養因子）を天然に産生するか、又は生物学的産物を産生するように遺伝子操作されており、本明細書で説明される培養技術を使用して、クローン増殖させることができる。あるいは、所望の系統への分化を誘導する培地中で、細胞を増殖させることができる。いずれの場合でも、その細胞によって産生され、培地中に分泌された生物学的産物は、例えば、幾つか例を挙げると、示差的タンパク質沈殿法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、及びＨＰＬＣなどの、標準的な分離技術を使用して、馴化培地から容易に単離することができる。「バイオリアクター」を使用して、例えば、インビトロで３次元培養物に栄養を与えるためのフロー法を活用することができる。本質的には、新鮮培地が３次元培養物を通過する際、生物学的産物は、培養物から洗い出され、次いで、上記のように、その流出物から単離することができる。
あるいは、目的の生物学的産物は、細胞内部に留まる場合があり、それゆえ、その収集には、上述のように、細胞を溶解させることが必要となる場合がある。続いて、上記の技術のうちの任意の１つ以上を使用して、その生物学的産物を精製することができる。
別の実施形態では、液体、固体、又は半固体の基質上に分娩後細胞（好ましくはＰＰＤＣ）を培養することによって産生される、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が調製、収集され、組織の修復又は置換を必要とする被験体内への生細胞の移植の代替案として利用される。細胞は、インビトロで、本明細書の他の箇所で説明される３次元フレームワーク上に、所望の量のＥＣＭがそのフレームワーク上に分泌されるような条件下で培養される。細胞及びフレームワークが取り出され、例えば、注入可能製剤としての更なる使用のために、ＥＣＭが処理される。このことを達成するために、フレームワーク上の細胞を死滅させ、そのフレームワークから、あらゆる細胞残渣を除去する。このプロセスは、多種多様な方法で実施することができる。例えば、凍結保存剤を使用することなく、その生組織を液体窒素中で急速冷凍することができ、又は細胞が浸透圧に反応して破裂するように、滅菌蒸留水中に組織を浸漬させることができる。
細胞を死滅させた後、ＥＤＴＡ、ＣＨＡＰＳ、又は双極性イオン性洗剤などの、弱い洗剤すすぎで処理することによって、細胞膜を破壊し、細胞残渣を除去することができる。あるいは、細胞膜を分解し、細胞内容物の除去を可能とする試薬で、その組織を酵素消化させ、かつ／又は抽出することができる。そのような酵素の例としては、ヒアルロニダーゼ、ディスパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。洗剤の例としては、例えば、アルキルアリールポリエーテルアルコール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．））、ＢＲＩＪ−３５、ポリエトキシエタノールラウリルエーテル（Ａｔｌａｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ ２０）、ポリエトキシエタノールソルビタンモノラウレート（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）、ポリエチレンラウリルエーテル（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）などの非イオン性洗剤、並びに、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、硫酸化高級脂肪族アルコール、分岐又は非分岐鎖中に７〜２２個の炭素原子を含有するスルホン化アルカン及びスルホン化アルキルアレーンなどのイオン性洗剤が挙げられる。
ＥＣＭの収集は、例えば、新たな組織が、生分解性又は非生分解性である３次元フレームワーク上で形成されているかどうかによって、様々な方法で達成することができる。例えば、そのフレームワークが、非生分解性である場合には、音波処理、高圧水ジェット、機械的掻き取り、又は洗剤若しくは酵素での穏和な処理、あるいは上記の任意の組合せを、そのフレームワークに施すことによって、ＥＣＭを取り出すことができる。
フレームワークが、生分解性である場合には、例えば、そのフレームワークを溶液中で分解させるか、又は溶解させることによって、ＥＣＭを収集することができる。あるいは、生分解性フレームワークが、それ自体をＥＣＭと併せて注入することが可能な材料からなる場合には、そのフレームワーク及びＥＣＭは、その後の注入のために、まとめて処理することができる。あるいは、ＥＣＭは、非生分解性フレームワークからのＥＣＭの収集に関して上述された方法のうちのいずれかによって、生分解性フレームワークから取り出すことができる。全ての収集プロセスは、好ましくは、ＥＣＭを変性させないように設計される。
ＥＣＭを収集した後、更にＥＣＭを処理することができる。例えば、ＥＣＭは、音波処理などによる、当該技術分野において周知の技術を使用して、微粒子へと均質化することができるため、そのＥＣＭは、外科用ニードルの中を通過することができる。ＥＣＭの成分は、必要に応じて、γ線照射によって架橋することができる。好ましくは、ＥＣＭは、０．２５〜２メガラドで照射することにより、ＥＣＭを滅菌及び架橋することができる。グルタルアルデヒドなどの、毒性の薬剤を使用する化学架橋も可能であるが、一般的には好ましくない。
ＥＣＭ中に存在する様々なタイプのコラーゲンなどの、タンパク質の量及び／又は比率は、本発明の細胞によって産生されるＥＣＭと、１種又は２種以上の他の細胞型のＥＣＭとを混合することによって、調整することができる。更には、タンパク質、増殖因子、及び／又は薬物などの、生物学的に活性な物質を、ＥＣＭ中に組み込むことができる。例示的な生物学的に活性な物質としては、注入部位での治癒及び組織修復を促進する、ＴＧＦ−βなどのような、組織増殖因子が挙げられる。そのような追加的薬剤は、例えば、全細胞溶解物、可溶性細胞画分、あるいは細胞によって産生される更なる精製成分及び産物と共に、本明細書で上述された実施形態のいずれかで利用することができる。
医薬組成物
別の態様では、本発明は、眼球変性症治療のための様々な方法における、分娩後細胞（好ましくはＰＰＤＣ）などの前駆細胞、その細胞集団、こうした細胞によって産生される馴化培地、並びに、こうした細胞によって産生される細胞成分及び産物を用いる医薬組成物を提供する。特定の実施形態は、生細胞（例えば、ＰＰＤＣ単独、又は他の細胞型との混合）を含む医薬組成物を包含する。その他の実施形態は、ＰＰＤＣ馴化培地を含む医薬組成物を包含する。更なる実施形態は、ＰＰＤＣの細胞成分（例えば、細胞溶解物、可溶性細胞画分、ＥＣＭ、又は前述のうちのいずれかの構成成分）、又は産物（例えば、細胞によって天然に又は遺伝子操作を通じて産生される、栄養及びその他の生物学的因子、細胞を培養することから得られる馴化培地）を用い得る。いずれの場合でも、この医薬組成物は、当該技術分野において既知の、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、増殖因子、神経栄養因子、又は神経再生薬、神経保護薬、若しくは点眼薬などの、他の活性剤を更に含み得る。
医薬組成物に添加できるその他の成分の例としては、（１）他の神経保護薬又は神経有効薬、（２）当該技術分野において既知の１つ又は２つ以上のタイプのコラーゲンなどの、選択された細胞外マトリックス成分、並びに／又は増殖因子、多血小板血漿、及び薬剤（あるいは、増殖因子を発現及び産生するように、ＰＰＤＣを遺伝子組み換えしてもよい）、（３）抗アポトーシス剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）、（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、スタチン、ＩＬ−６及びＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、及びＳＵＰＲＯＦＥＮなど）、（５）カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖薬、コルチコステロイド、及び様々な抗体などの、免疫抑制剤あるいは免疫調節剤、（６）プロブコール、ビタミンＣ及びビタミンＥ、補酵素（conenzyme）Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、並びにＮ−アセチルシステインなどの、抗酸化剤、及び（６）局所麻酔剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容できる担体又は媒質と共に配合された、分娩後細胞（好ましくはＰＰＤＣ）などの前駆細胞、これらの細胞から生成された馴化培地、又はこれらの構成成分若しくは産物を含む。好適な薬学的に許容できる担体としては、水、食塩水（リンガー液など）、アルコール、油、ゼラチン、及び炭水化物（ラクトース、アミロース、又はデンプンなど）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、並びにポリビニルピロリドンが挙げられる。そのような調製物は、滅菌することができ、また必要に応じて、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝剤、及び着色剤などの、補助剤と混合することができる。典型的であるが非限定的に、細胞成分又は産物を含むが生細胞を含まない医薬組成物は、液状で配合される。ＰＰＤＣ生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、液体、半固体（例えば、ゲル）、又は固体（例えば、眼組織工学に関して適切なマトリックス、スカフォールドなど）として配合される。
医薬組成物は、医薬品化学者又は生物学者に周知されるような補助成分を含んでもよい。例えば、医薬組成物は、用いられる抗酸化剤の種類に応じて変化する範囲の抗酸化剤を含んでもよい。一般に用いられる抗酸化剤の妥当な範囲は、約０．０１〜約０．１５ｗ／ｖ％のＥＤＴＡ、約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％の亜硫酸ナトリウム、及び約０．０１〜約２．０ｗ／ｖ％のメタ重亜硫酸ナトリウムである。当業者は、上記のそれぞれに対して約０．１ｗ／ｖ％の濃度を用い得る。その他の例示的な化合物としては、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、β−メルカプトエチルアミン、グルタチオン、及び類似の種が挙げられるが、眼投与に好適なその他の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸及びその塩、又は亜硫酸塩若しくはメタ重亜硫酸ナトリウムを用いてもよい。
緩衝剤を使用して、点眼薬配合物のｐＨを約４．０〜約８．０の範囲に維持して、その結果、眼刺激を最小化することができる。硝子体内又は眼球内直接注入のためには、配合物はｐＨ７．２〜７．５、好ましくはｐＨ７．３〜７．４であるべきである。眼科組成物は、眼への投与に好適な等張化剤を更に含んでもよい。中でも、配合物を０．９％生理的食塩水溶液とほぼ等張にするのには、塩化ナトリウムがとりわけ好適である。
特定の実施形態では、医薬組成物は増粘剤と共に配合される。例示的な剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、及びポリビニルピロリドンである。医薬組成物は、必要であれば共溶媒を添加されてもよい。好適な共溶媒としては、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、及びポリビニルアルコールが挙げられ得る。更に、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀若しくは硝酸フェニル水銀、チメロサール、又はメチル若しくはプロピルパラベンなどの防腐剤を更に添加してもよい。
注入用配合物は、単用投与用に設計して、防腐剤を含まないことが好ましい。注入剤は、０．９％の塩化ナトリウム溶液と等価の等張性を有するべきである（２９０〜３００ミリオスモルのオスモル濃度）。これは、塩化ナトリウム、若しくは上記のその他の共溶媒、又は上記の緩衝剤及び抗酸化剤などの賦形剤を添加することによって達成され得る。
眼の前房組織は房水に浸されており、一方で、網膜は硝子体に連続的に曝露されている。これらの流体／ゲルは、抗酸化化合物及び酵素を含むため、高還元性の酸化還元状態で存在する。したがって、眼科組成物に還元剤を含めることは有利となり得る。好適な還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、アスコルビン酸、又は塩形態、及び亜硫酸ナトリウム又はメタ重亜硫酸ナトリウムが挙げられ、アスコルビン酸、及び／又はＮ−アセチルシステイン若しくはグルタチオンは注入剤に特に好適である。
細胞若しくは馴化培地、又は細胞成分若しくは細胞産物を含む医薬組成物は、当該技術分野において既知のいくつかの送達モードのうちの１つ又は２つ以上で患者の眼に送達することができる。いくつかの場合で使用に好適であり得る一実施形態では、組成物は点眼液又は洗眼剤形態で眼に局所送達される。別の一実施形態では、組成物は、周期的な眼内注入によって、又は、ＢＳＳ若しくはＢＳＳ ＰＬＵＳ（Ａｌｃｏｎ ＵＳＡ（Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘ））などの潅注溶液形態での注入によって眼内の様々な位置に送達することができる。あるいは、組成物は、例えば、Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｖａｎｒｅｌｌに対する米国特許第５，７１８，９２２号で開示されるような、予形成又はインサイチュ形成されるゲル又はリポソームなどの、当業者に既知の他の眼科剤形で適用されてもよい。別の実施形態では、組成物は、コンタクトレンズ（例えば、Ｌｉｄｏｆｉｌｃｏｎ Ｂ．Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ ＣＷ７９、又はＤＥＬＴＡＣＯＮ（Ｄｅｌｔａｆｉｌｃｏｎ Ａ））、又は眼の表面に一時的に置かれる他の物体を介して、処置の必要な眼の水晶体に対して又はそれを通して送達されてもよい。他の実施形態では、コラーゲン角膜シールド（例えば、ＢＩＯ−ＣＯＲ可溶性角膜シールド、Ｓｕｍｍｉｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，Ｍａｓｓ））のような支持体を用いてもよい。また、組成物は、浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ，Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．））からカニューレを通して、又は徐放カプセル（ＯＣＣＵＳＥＮＴ）若しくは生分解性ディスク（ＯＣＵＬＥＸ，ＯＣＵＳＥＲＴ）を移植することによって、眼球中に注入することで投与されてもよい。これらの投与経路は、眼への医薬組成物の連続的な供給を提供するという利点を有する。これは例えば、角膜への局所送達のために有利となり得る。
半固形又は固形の担体中に生細胞を含む医薬組成物は、典型的には、眼の損傷又は苦痛部位における外科的移植のために配合される。更に、液体組成物も外科的処置、例えば馴化培地によって投与可能であることが理解されるであろう。特定の実施形態では、半固体又は固体の医薬組成物は、非生分解性若しくは生分解性とすることができる、半透性ゲル、格子、細胞スカフォールドなどを含み得る。例えば、特定の実施形態では、外来性の細胞を、それらの周囲から隔離するが、それらの細胞が、周囲の細胞に生体分子を分泌及び送達できるようにすることが、望ましいか、又は適切である場合がある。これらの実施形態では、細胞は、移植細胞を宿主組織から物理的に隔離する、非生分解性の選択的透過性障壁によって包囲された、生きているＰＰＤＣ、又はＰＰＤＣを含む細胞集団を含む、自律的移植片として配合されてもよい。こうした移植片は、薬理学的に誘導された免疫抑制の不在下で、免疫細胞及び巨大分子が移植細胞を殺傷することを防ぐ能力を有するため、「免疫防御性」と呼ばれる場合がある（こうした装置及び方法については、例えば、Ｐ．Ａ．ＴｒｅｓｃｏらのＡｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．４２：３〜２７（２０００）を参照されたい）。
他の実施形態では、本発明の医薬組成物に関して、多種多様な分解性ゲル及び分解性ネットワークが利用される。例えば、持続放出性製剤に関して特に好適な、分解性材料としては、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの、生体適合性ポリマーが挙げられる。薬物送達ビヒクル中の分解性ポリマーの構造、選択、及び使用については、Ａ．ＤｏｍｂらのＰｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９〜２９１（１９９２）を含むいくつかの刊行物で概説されている。米国特許第５，８６９，０７９号（Ｗｏｎｇら）は、生分解性持続放出性眼移植片における親水性物質と疎水性物質との組み合わせを開示している。加えて、米国特許第６，３７５，９７２号（Ｇｕｏら）、同第５，９０２，５９８号（Ｃｈｅｎら）、同第６，３３１，３１３号（Ｗｏｎｇら）、同第５，７０７，６４３号（Ｏｇｕｒａら）、同第５，４６６，２３３号（Ｗｅｉｎｅｒら）、及び同第６，２５１，０９０号（Ａｖｅｒｙら）が、それぞれ医薬組成物の送達に用いられ得る眼球内移植装置及びシステムについて説明している。
他の実施形態では、例えば、損傷若しくは断裂した視神経などの、神経損傷部位の修復に関しては、生分解性、好ましくは生体再吸収性又は生体吸収性のスカフォールド若しくはマトリックス上に、又はそれらの内部に細胞を送達することが望ましいか、又は適切な場合がある。これらの典型的な３次元生体材料は、スカフォールドに付着されるか、スカフォールド内部に分散されるか、又はスカフォールド内に封入された細胞外マトリックス内に組み込まれる、生細胞を含む。身体の標的領域内に移植されると、これらの移植片は、宿主組織と一体化され、ここで、移植細胞が徐々に確立されていく（例えば、上記のＰ．Ａ．Ｔｒｅｓｃｏら（２０００）を参照されたい。更に、Ｄ．Ｗ．Ｈｕｔｍａｃｈｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｄｎ．１２：１０７〜１７４（２００１）も参照されたい）。
本発明で使用できるスカフォールド又はマトリックス（「フレームワーク」と総称される場合がある）材料としては、不織布マット、多孔質発泡体、又は自己集合性ペプチドが挙げられる。不織性マットは、例えば、商標名ＶＩＣＲＹＬ（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ））で市販されているグリコール酸と乳酸との吸収性合成コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）からなる繊維を用いて形成することができる。更に、例えば、米国特許第６，３５５，６９９号に記載されているような、冷凍乾燥法又は凍結乾燥法などのプロセスにより形成されたポリ（エプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体を用いてもよい。自己集合性ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）などのヒドロゲルもまた、使用することができる。インサイチュ形成される分解性ネットワークもまた、本発明での使用に好適である（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓら，２００２，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８：１９９〜２０９、Ｗａｎｇ，Ｄら，２００３，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２４：３９６９〜３９８０、米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号（Ｈｅら）を参照）。これらの材料は、注入に好適な流体として配合し、続いて、インサイチュ又はインビボで、分解性ヒドロゲルネットワークを形成するように、様々な手段（例えば、温度、ｐＨ、露光の変更）によって誘導することができる。
別の実施形態では、このフレームワークは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬのコポリマー若しくはブレンド、又はヒアルロン酸から作製されたマルチフィラメント糸で構成することができる、フェルトである。この糸は、圧着、切断、カーディング、及びニードリングからなる標準的なテキスタイル加工技術を使用して、フェルトにされる。別の実施形態では、細胞は、複合材料構造体とすることができる発泡体スカフォールド上に播種される。
上記の実施形態の多くで、フレームワークを有用な形状に成形することができる。更には、ＰＰＤＣは、例えば、線維芽細胞含有ＧＤＣ血管内コイルを調製するために使用される方式に対応する方法によって、予備形成された非分解性の外科用装置又は移植可能装置上で培養できる点が理解されるであろう（Ｍａｒｘ，Ｗ．Ｆ．らのＡｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．２２：３２３〜３３３（２００１））。
これらのマトリックス、スカフォールド、又は装置は、細胞付着を増強するために、細胞の接種の前に処理することができる。例えば、接種の前に、ナイロンマトリックスを０．１モルの酢酸で処理して、ポリリシン、ＰＢＳ、及び／又はコラーゲン中でインキュベートすることにより、そのナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンは、硫酸を使用して、同様に処理することができる。フレームワークの外側表面もまた、そのフレームワークの血漿コーティング、あるいは１種又は２種以上のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、並びに／又は限定するものではないが、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどの他の材料の添加などによって、細胞の付着若しくは増殖、及び組織の分化を改善するように、改変することができる。
生細胞含有フレームワークは、当該技術分野で既知の方法に従って調製される。例えば、細胞は、準集密又は集密まで、培養容器内で自由に増殖させて、その培養物から取り上げ、フレームワーク上に接種することができる。必要に応じて、細胞の接種前、接種中、若しくは接種後に、培養培地に増殖因子を添加することにより、分化及び組織形成を誘発させることができる。あるいは、フレームワーク上での細胞の増殖が増強されるように、又は移植片の拒絶のリスクが低減されるように、フレームワーク自体を改変することができる。したがって、抗炎症剤、免疫抑制剤、又は増殖因子が挙げられるが、これらに限定されない１種又は２種以上の生物学的に活性な化合物を、局所放出のためにフレームワークに添加することができる。
使用方法
分娩後細胞（好ましくはｈＵＴＣ又はＰＤＣ）などの前駆細胞、若しくはその細胞集団、又はこうした細胞の馴化培地若しくはその他の成分、あるいはこうした細胞によって産生される産物を、眼球細胞及び組織の修復及び再生を支援及び促進するために様々な方法で用いてもよい。そのような有用性は、インビトロ法、エクスビボ法、及びインビボ法を包含する。以下に記載する方法は、ＰＰＤＣを対象としているが、その他の分娩後細胞も、これらの方法で用いるのに好適であり得る。
インビトロ法及びエクスビボ法
一実施形態では、分娩後細胞（好ましくはｈＵＴＣ又はＰＤＣ）などの前駆細胞、及びそれから生成された馴化培地を、インビトロで用いて、医薬品、増殖因子、調節因子などの有効性及び細胞毒性に関して、多種多様な化合物をスクリーニングすることができる。例えば、こうしたスクリーニングを、実質的に均質なＰＰＤＣの集団に対して実行して、眼球症状の治療のためにそのＰＰＤＣと共に配合されるかあるいは同時投与される候補化合物の有効性又は毒性を評価することができる。あるいは、こうしたスクリーニングは、新規の医薬品候補の有効性を評価する目的で、眼内で見出される細胞型、又はその前駆細胞へと分化するよう刺激されているＰＰＤＣに対して実行してもよい。この実施形態では、ＰＰＤＣは、インビトロで維持され、試験される化合物に曝される。細胞毒性の可能性がある化合物の活性は、培養下の細胞に損傷を与えるか又は死滅させる、その能力によって測定することができる。このことは、生体染色技術によって、容易に評価することができる。
上述のように、ＰＰＤＣは、これらの細胞によって天然に産生されるか、その他の系統に分化するように誘導される際にこれらの細胞によって産生されるか、又は遺伝子操作を介してこれらの細胞によって産生されるか、のいずれかである生物学的産物を産生するようにインビトロ培養することができる。例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８は、増殖培地中で増殖させた臍由来細胞から分泌されることが判明した。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、及びＩＬ−８は、増殖培地中で培養した胎盤由来ＰＰＤＣから分泌されることが判明した（実施例を参照）。
この点に関し、本発明の実施形態は、馴化培地を産生するためのＰＰＤＣの使用を特徴とする。ＰＰＤＣ由来馴化培地の産生は、未分化のＰＰＤＣから、又は分化を刺激する条件下でインキュベートされたＰＰＤＣから、のいずれかであってよい。こうした馴化培地は、例えば、上皮又は神経前駆細胞のインビトロ又はエクスビボ培養、あるいは、ＰＰＤＣの均質集団、又はＰＰＤＣとその他の前駆細胞とを含む不均質集団を含む移植細胞を支援するためのインビボにおける使用が想到される。
ＰＰＤＣの細胞溶解物、可溶性細胞画分若しくはその成分、又はＥＣＭ若しくはその成分が、様々な目的のために用いられ得る。上述のように、これらの成分の一部は、医薬組成物中で使用することができる。他の実施形態では、細胞溶解物又はＥＣＭを使用して、外科的な使用のための、若しくは移植のための、又はエクスビボ目的のための物質又は装置を、コーティングするか、あるいは他の方法で処理することにより、こうした処理の過程で接触する細胞又は組織の治癒又は生存が促進される。
実施例１４及び１６で説明する通り、ＰＰＤＣは、これらの細胞との共培養で増殖させた場合に、成体神経前駆細胞の生存、増殖、及び分化を支援する能力を実証している。同様に、従来の研究で、ＰＰＤＣが栄養機構を介して網膜細胞を支援するように機能し得ることが指摘されている（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。したがって、ＰＰＤＣは、その他の細胞、特に神経細胞、並びに神経及び眼前駆細胞（例えば、神経幹細胞、及び網膜又は角膜上皮幹細胞）に栄養的支援を提供するために、インビトロ共培養で有利に用いられる。共培養の場合、ＰＰＤＣ及び所望の他の細胞が、この２つの細胞型が接触する条件下で共培養されることが望ましい場合がある。このような接触は、例えば、培養培地中、又は好適な培養基質上に、不均質な細胞集団として、それらの細胞を播種することによって達成され得る。あるいは、ＰＰＤＣは、最初にコンフルエンスまで増殖されてもよく、続いて、培養下の第２の所望の細胞型のための基質としての機能を果たす。この後者の実施形態では、それらの細胞は、例えば、膜又は同様の装置によって、更に物理的に分離させることができ、これにより、共培養の期間の後に、他の細胞型を取り出して、個別に使用することができる。神経又は眼球細胞型の増殖及び分化を促進するための、共培養下でのＰＰＤＣの使用は、研究分野及び臨床／治療分野での応用性を見出し得る。例えば、ＰＰＤＣの共培養を利用して、例えば、基礎研究目的のために、又は薬剤スクリーニングアッセイでの使用のために、培養下細胞の増殖及び分化を促進することができる。ＰＰＤＣの共培養は、更に、治療目的で後に投与するための神経又は眼前駆細胞のエクスビボ増殖のために利用することもできる。例えば、神経又は眼前駆細胞を個体から採取して、ＰＰＤＣとの共培養下でエクスビボ増殖させ、続いて、その個体に戻す（自家移入）か、又は別の個体に戻す（同系移入又は同種異系移入）ことができる。これらの実施形態では、エクスビボ増殖の後に、ＰＰＤＣ及び前駆細胞を含む混合細胞集団を、治療を必要とする患者に投与することが可能である点が、理解されるであろう。あるいは、自家移入が適切であるか、又は望ましい状況では、共培養された細胞集団を培養下で物理的に分離して、患者に投与するための自家前駆細胞の取り出しを実現することができる。
インビボ法
実施例の項に記載されているように、馴化培地は、眼球変性症の治療に効果的に用いることができる。眼内の標的部位内に移植されると、ＰＰＤＣなどの前駆細胞由来の馴化培地は、インサイチュで眼球細胞に対する栄養的支援を提供する。
ＰＰＤＣなどの前駆細胞由来の馴化培地は、当該技術分野において既知の、その他の有用な薬剤、増殖因子、栄養因子などの生体分子、馴化培地（前駆細胞又は分化細胞培養由来の）、又は抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤、増殖因子、神経栄養因子、若しくは神経再生薬若しくは神経保護薬などのその他の活性剤、と共に投与することができる。馴化培地が他の薬剤と共に投与される場合、それらは、単一の医薬組成物として一緒に、あるいは別個の医薬組成物として、他の薬剤と同時に、若しくは逐次的に（他の薬剤の投与より前又は後のいずれかで）、投与することができる。
ＰＰＤＣなどの前駆細胞、及び馴化培地産物と共に投与できるその他の成分の例としては、（１）他の神経保護薬又は神経有効薬、（２）当該技術分野において既知の１つ又は２つ以上のタイプのコラーゲンなどの、選択された細胞外マトリックス成分、並びに／又は増殖因子、多血小板血漿、及び薬剤（あるいは、細胞は、増殖因子を発現及び産生するように、遺伝子組み換えすることもできる）、（３）抗アポトーシス剤（例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、肝細胞増殖因子、カスパーゼ阻害剤）、（４）抗炎症化合物（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＴＧＦ−β阻害剤、スタチン、ＩＬ−６及びＩＬ−１阻害剤、ＰＥＭＩＲＯＬＡＳＴ、ＴＲＡＮＩＬＡＳＴ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ、及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（ＴＥＰＯＸＡＬＩＮ、ＴＯＬＭＥＴＩＮ、及びＳＵＰＲＯＦＥＮなど）、（５）カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、抗増殖薬、コルチコステロイド、及び様々な抗体などの、免疫抑制剤あるいは免疫調節剤、（６）プロブコール、ビタミンＣ及びビタミンＥ、補酵素（conenzyme）Ｑ−１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、並びにＮ−アセチルシステインなどの、抗酸化剤、及び（６）局所麻酔剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
液体又は流体医薬組成物は、眼内のより一般的な位置に（例えば、局所又は眼内に）投与してもよい。
その他の実施形態は、ＰＰＤＣなどの前駆細胞由来の馴化培地、又は、これらの細胞により天然に産生されたか、若しくは細胞の遺伝子操作によって産生された、栄養及びその他の生物学的因子を含む医薬組成物を投与することにより、眼球変性症を治療する方法を包含する。この場合も、これらの方法は、当該技術分野において既知のような増殖因子、神経栄養因子、又は神経再生薬若しくは神経保護薬などの、他の活性剤を投与することを更に含み得る。
本明細書で説明されるＰＰＤＣなどの前駆細胞由来の馴化培地、又は他の医薬組成物のうちのいずれかを投与するための、剤形及び投与計画は、個々の患者の状態、例えば、眼球変性症の性質及び程度、年齢、性別、体重及び全般的な医学的状態、並びに医師には既知の他の因子を考慮して、適正な臨床に従って開発される。それゆえ、患者に投与される医薬組成物の有効量は、当該技術分野において既知のこれらの考慮事項によって決定される。
細胞療法を開始する前に、患者を薬理学的に免疫抑制することが、望ましいか、又は適切な場合がある。このことは、全身性若しくは局所性の免疫抑制剤の使用を通じて達成することができ、又は上述のように、封入装置内の細胞を送達することによって達成することができる。移植細胞に対する免疫反応を低減若しくは排除するための、これらの手段及び他の手段は、当該技術分野において既知である。別の方法として、上述のように、遺伝子操作したＰＰＤＣから馴化培地を調製して、それらの免疫原性を低減することができる。
生きている患者内での移植細胞の生存は、様々な走査技術、例えば、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴ又はＣＴ）スキャン、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）スキャン、又は陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを使用することによって判定することができる。移植片の生存の判定は、組織を摘出し、目視、又は顕微鏡を介して、それを検査することによって、死後に実施することもできる。あるいは、神経若しくは眼球細胞、又はその産物、例えば、神経伝達物質に対して特異的な染色剤で、細胞を処理してもよい。移植細胞は、更に、ローダミン標識マイクロスフェア若しくはフルオレセイン標識マイクロスフェア、ファーストブルー、第２鉄微小粒子、ビスベンズアミドなどの追跡用染料、又はβ−ガラクトシダーゼ若しくはβ−グルクロニダーゼなどの、遺伝子導入されたレポーター遺伝子産物を予め組み込むことによっても同定できる。
移植細胞又は馴化培地の被験体の眼球組織内への機能的組み込みは、損傷又は罹患した眼機能の回復を検査することによって、評価することができる。例えば、黄斑変性症、又はその他の網膜症の治療における有効性は、視力の改善、並びにステレオカラー眼底写真の異常評価及び等級付けによって判定することができる（Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔｕｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐ，ＮＥＩ，ＮＩＨ，ＡＲＥＤＳ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．８（２００１），Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１１９：１４１７〜１４３６）。
キット及びバンク
別の態様では、本発明は、上述した眼球の再生及び修復のための様々な方法における、ＰＰＤＣなどの前駆細胞、並びに細胞集団、細胞（好ましくはＰＰＤＣ）から調製された馴化培地、並びにその成分及び産物を利用するキットを提供する。眼球変性症の治療、又はその他の計画的治療のために使用する場合、キットは、少なくとも分娩後細胞又は分娩後細胞から誘導された馴化培地を含む、１つ又は２つ以上の細胞集団又は馴化培地、及び薬学的に許容できる担体（液体、半固体、又は固体）を含み得る。このキットは、更に、例えば注射によって細胞及び馴化培地を投与する手段も、任意選択的に含み得る。このキットは、細胞及び馴化培地の使用に関する使用説明書を、更に含み得る。軍事利用のためなどに野戦病院で使用するために準備されたキットは、組織スカフォールド、外科用縫合糸などを含む、完全処置のための供給品を含んでもよく、細胞又は馴化培地は、急性損傷の修復に関して用いられる。本明細書で説明するアッセイ及びインビトロ法のためのキットは、例えば、（１）ＰＰＤＣ若しくはその成分、又はＰＰＤＣの馴化培地若しくはその他の産物、（２）インビトロ法を実施するための試薬、（３）必要に応じて、その他の細胞又は細胞集団、及び（４）インビトロ法を実施するための説明書のうちの１つ又は２つ以上を含み得る。
更に別の態様では、本発明は、更に、本発明の組織、細胞、細胞集団、馴化培地、及び細胞成分のバンキングも提供する。上述のように、細胞及び馴化培地は、容易に凍結保存され得る。それゆえ、本発明は、バンク内に細胞を凍結保存する方法を提供し、細胞は、冷凍保存されて、その細胞の免疫学的特性、生化学的特性、及び遺伝的特性に基づいて、それらの細胞の完全な特性評価と関連付けられる。凍結細胞は、手順の要件、及び患者の必要性に応じて、自家療法、同系療法、若しくは同種異系療法のために、解凍して増殖させるか又は直接使用することができる。好ましくは、凍結保存された各サンプルについての情報は、コンピュータ内に保存され、その情報は、外科医、手順、及び患者の要件に基づいて検索可能であり、好適な照合が、それらの細胞又は集団の特性評価に基づいて行われる。好ましくは、本発明の細胞は、所望の細胞の量まで、増殖及び拡大培養され、治療用細胞組成物が、マトリックス若しくは支持体の存在下又は非存在下で、別個に、あるいは共培養物として、調製される。一部の用途に関しては、新たに調製された細胞を使用することが好ましい場合があるが、残余の細胞は、それらの細胞を凍結して、コンピュータに情報を入力し、そのコンピュータ入力とサンプルとを関連づけることによって、凍結保存及びバンクすることができる。そのような細胞の供給源又はドナーとレシピエントとを照合することが、必要とされない場合であっても、このバンクシステムは、免疫学的目的のために、例えば、バンク細胞の望ましい生化学的特性又は遺伝的特性と、治療的必要性とを照合することを容易にする。所望の特性とバンクのサンプルとを照合した後、そのサンプルを回収して、治療使用のために調製する。本明細書で説明されるように調製された、細胞溶解物、ＥＣＭ、又は細胞成分もまた、凍結保存若しくは他の方法で保存して（例えば、凍結乾燥によって）、本発明に従ってバンクすることができる。
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために提供される。それらの実施例は、本発明を限定することではなく、例示することを意図するものである。
以下の略語は、本明細書の実施例及びその他、並びに特許請求の範囲に出現する場合がある。ＡＮＧ２（又はＡｎｇ２）はアンジオポエチン−２を表し、ＡＰＣは抗原提示細胞を表し、ＢＤＮＦは脳由来神経栄養因子を表し、ｂＦＧＦは塩基性線維芽細胞増殖因子を表し、ｂｉｄ（ＢＩＤ）は「ビス・イン・ディエイ」（１日２回）を表し、ＣＫ１８はサイトケラチン１８を表し、ＣＮＳは中枢神経系を表し、ＣＸＣリガンド３はケモカイン受容体リガンド３を表し、ＤＭＥＭはダルベッコの最小必須培地を表し、ＤＭＥＭ：ｌｇ（又はＤＭＥＭ：Ｌｇ、ＤＭＥＭ：ＬＧ）は低グルコースのＤＭＥＭを表し、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸を表し、ＥＧＦ（又はＥ）は上皮成長因子を表し、ＦＡＣＳは蛍光活性化細胞選別法を表し、ＦＢＳはウシ胎児血清を表し、ＦＧＦ（又はＦ）は線維芽細胞増殖因子を表し、ＧＣＰ−２は顆粒球走化性タンパク質−２を表し、ＧＤＮＦはグリア細胞由来神経栄養因子を表し、ＧＦＡＰはグリア筋原線維酸性タンパク質を表し、ＨＢ−ＥＧＦはヘパリン結合上皮成長因子を表し、ＨＣＡＥＣはヒト冠動脈内皮細胞を表し、ＨＧＦは肝細胞増殖因子を表し、ｈＭＳＣはヒト間葉系幹細胞を表し、ＨＮＦ−１αは肝細胞特異的転写因子を表し、ＨＶＶＥＣはヒト臍静脈内皮細胞を表し、Ｉ３０９はケモカイン及びＣＣＲ８受容体のためのリガンドを表し、ＩＧＦ−１はインスリン様増殖因子１を表し、ＩＬ−６はインターロイキン−６を表し、ＩＬ−８はインターロイキン８を表し、Ｋ１９はケラチン１９を表し、Ｋ８はケラチン８を表し、ＫＧＦはケラチノサイト増殖因子を表し、ＬＩＦは白血病阻害因子を表し、ＭＢＰはミエリン塩基性タンパク質を表し、ＭＣＰ−１は単球走化性タンパク質１を表し、ＭＤＣはマクロファージ由来ケモカインを表し、ＭＩＰ１αはマクロファージ炎症性タンパク質１αを表し、ＭＩＰ１βはマクロファージ炎症性タンパク質１βを表し、ＭＭＰはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を表し、ＭＳＣは間葉系幹細胞を表し、ＮＨＤＦは正常ヒト皮膚線維芽細胞を表し、ＮＰＥは神経前駆細胞増殖培地を表し、ＮＴ３はニューロトロフィン３を表し、Ｏ４は乏突起神経膠細胞又はグリア分化マーカーＯ４を表し、ＰＢＭＣは末梢血単核細胞を表し、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を表し、ＰＤＧＦ−ＣＣは血小板由来増殖因子−Ｃを表し、ＰＤＧＦ−ＤＤは血小板由来増殖因子−Ｄを表し、ＰＤＧＦｂｂは血小板由来増殖因子ｂｂを表し、ＰＯは「ｐｅｒ ｏｓ」（経口）を表し、ＰＮＳは末梢神経系を表し、Ｒａｎｔｅｓ（又はＲＡＮＴＥＳ）は活性化時調節、正常Ｔ細胞発現及び分泌物を表し、ｒｈＧＤＦ−５はリコンビナントヒト増殖及び分化因子５を表し、ＳＣは皮下を表し、ＳＤＦ−１αは間質由来因子１αを表し、ＳＨＨはソニックヘッジホッグを表し、ＳＯＰは標準的操作手順を表し、ＴＡＲＣは胸腺及び活性化調節ケモカインを表し、ＴＣＰは組織培養プラスチックを表し、ＴＣＰＳは組織培養ポリスチレンを表し、ＴＧＦβ２はトランスフォーミング増殖因子β２を表し、ＴＧＦβ−３はトランスフォーミング増殖因子β−３を表し、ＴＩＭＰ１はマトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害物質１を表し、ＴＰＯはトロンボポエチンを表し、ＴＵＪ１はＢＩＩＩチューブリンを表し、ＶＥＧＦは血管内皮増殖因子を表し、ｖＷＦはヴォン・ヴィレブランド因子を表し、αＦＰはα−胎児性タンパク質を表す。
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１）
臍由来細胞馴化培地がインビトロで
ジストロフィＲＰＥ細胞を用いて食作用活性をレスキューする効果
英国外科医師会（ＲＣＳ）ラット由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、Ｍｅｒｔｋ遺伝子中の無発現変異のために損なわれた桿体外節（ＲＯＳ）食作用を示すことは明確に立証されている（Ｆｅｎｇ ＷらのＪ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００２），１０：２７７（１９）：１７０１６〜１７０２２）。ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）をＲＣＳラットの眼球に網膜下注入することで視力が改善したことが示されたが、これは、網膜変性症を改善させるものと思われる（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。本実施例では、ｈＵＴＣ由来の馴化培地（ＣＭ）を用いた治療によって、インビトロでジストロフィＲＰＥ細胞におけるＲＯＳ食作用が回復している。
ｈＵＴＣ馴化培地を、１）ｈＵＴＣ ＣＭの新たな調製物を用いてジストロフィＲＰＥの食作用に対する効果を評価するために、２）ＲＮＡ−Ｓｅｑによる遺伝子発現プロファイリングで用いるためにＣＭで処理したジストロフィＲＰＥ及び未処理のジストロフィＲＰＥから許容可能品質のＲＮＡを単離するために、３）選択されたＲＴＫリガンドが、Ｍｅｒｔｋシグナル伝達経路を用いることのできないＲＣＳラット由来のＲＰＥ中の食作用レベルを向上させ得るかどうかを調べるために、及び４）ＲＴＫとは異なる受容体を活性化させるその他の非ＲＴＫリガンドが、同様の機能を示すかどうかを試験するために、検査した。
材料及び方法
ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）を、以下の実施例６〜１８に記載され、かつ、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，５２４，４８９号、及び同第７，５１０，８７３号、並びに米国特許出願第２００５／００５８６３４号に詳述されている方法で得た。要約すると、ヒト臍帯は、生児出生後にドナーの同意を得て、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から得た。組織は細切れにしてから酵素消化した。５０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）−低グルコース（Ｌｇ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））培地を用いてほぼ完全に消化した後で、細胞懸濁液を７０［ｔｍの濾紙で濾過して、上清を３．４Ｎ（３５０ｇ）で遠心分離した。単離された細胞をＤＭＥＭ−Ｌｇ中で数回洗浄してから、１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ））、及び４ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を含有するＤＭＥＭ−Ｌｇ培地中に、５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種した。細胞が約７０％コンフルエンスに達した時、これらをＴｒｙｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を用いて継代した。細胞を数回の継代後に採取して、バンクした。
ＲＰＥ細胞の初代培養：ＲＰＥ細胞を、６〜１１日齢の着色された正常な（ＲＣＳ ｒｄｙ＋／ｐ＋）ラット（コンジェニック対照（congenic control））、又はジストロフィ（ＲＣＳ ｒｄｙ−／ｐ＋）ラットから得た。眼球の前方部分を角膜輪部の前方に移動させた。網膜を穏やかに除去して、アイカップを４％（ｗ／ｖ）ディスパーゼ（≧０．８Ｕ／ｍｇ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）））中で２０〜３０分間インキュベートした。ＲＰＥシートを除去して、増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ［（新文献（new paper）２０％］＋Ｐｅｎ（２００Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（２００μｇ／ｍＬ））中で懸濁させ、トリプシン処理を用いてトリチュレートし、８ウェルチャンバスライドウェル、又は２４ウェル皿のウェル内に配置された円形のガラスカバースリップのいずれかにプレーティングした。細胞を、５％ｖ／ｖのＣＯ2中、３７℃でインキュベートした。
ＲＰＥ細胞のスルホロダミン染色：ＲＰＥ培養物を、スルホロダミン（終濃度４０μｇ／ｍＬ）を含有する増殖培地中で２４〜７２時間維持した。細胞をＲＯＳを添加する３６〜４８時間前に染色した。ＲＯＳを添加する６〜１８時間前にスルホロダミン含有培地を除去し、培養物を新鮮な増殖培地に数回交換しながら維持した。
ラット視細胞ＯＳの単離：眼球を、２〜４又は６〜８週間齢のＬｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットから光オンセットの数時間後に得た。網膜を単離し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（８ｍｍジェネレータ）又はＤｏｕｎｃｅガラスホモジナイザーで均質化し、２７％〜５０％の直線状ショ糖密度勾配の頂部に積層し、４℃下、３８，０００ｒｐｍのＳＷ４１ローター（２３５４Ｎ（２４０，０００×ｇ））内で１時間遠心分離した。頂部の２つのＲＯＳバンドを回収し、ＨＢＳＳで希釈して、７０００ｒｐｍのＨＢ−４ローター（７８Ｎ（８０００×ｇ））中で１０分間遠心分離し、ＲＯＳをペレット状にした。
ＲＯＳのＦＩＴＣ染色：ＲＯＳペレットを無血清培養培地（ＭＥＭ基本培地のみ）中で再懸濁させた（約１ｍＬ／ペレット）。ＦＩＴＣ原液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ９．０−９．５）を終濃度１０μｇ／ｍＬまで添加して、室温で１時間インキュベートした。ＦＩＴＣ染色ＲＯＳを、８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化し、増殖培地（ＭＥＭ２０）中で再懸濁し、計数し、終濃度１０７／ｍＬまで希釈する。
ｈＵＴＣ馴化培地（ＣＭ）：３セットのｈＵＴＣ馴化培地（ＣＭ）、及び対照培地を調製して、食作用アッセイにおける試験に用いた。
１．血清含有ＣＭ１の調製
１日目に、Ｔ７５細胞培養フラスコ内のｈＵＴＣ増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース＋１５％のＦＢＳ＋４ｍＭのＬ−グルタミン）中に、ｈＵＴＣを５，０００生育可能細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ内で２４時間培養した。２日目に、培地を吸引し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、２１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地を補充した（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））。細胞を更に５４時間培養した。対照培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））のみを、同様に５４時間培養した。４日目に、細胞培養上清及び対照培地を回収して、２．５Ｎ（２５０ｇ）で５分間、室温で遠心分離し、クライオチューブ（cryotube）中で３ｍＬ／チューブにアリコートし、−７０℃のフリーザーで即座に冷凍した。
２．ＣＭ１（無血清）の調製
１日目に、Ｔ７５細胞培養フラスコ内のｈＵＴＣ増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース＋１５％のＦＢＳ＋４ｍＭのＬ−グルタミン）中に、ｈＵＴＣを５，０００生育可能細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ内で２４時間培養した。２日目に、培地を吸引し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、２１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２無血清培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））で培地を補充した。細胞を更に５４時間培養した。無血清対照培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））のみを、同様に５４時間培養した。４日目に、細胞培養上清及び対照培地を回収して、２．５Ｎ（２５０ｇ）で５分間、室温で遠心分離し、クライオチューブ中で３ｍＬ／チューブにアリコートし、−７０℃のフリーザーで即座に冷凍した。
３．ＣＭ２の調製
細胞培養フラスコが、１つのフラスコあたり６３ｍＬの培地を有するＴ２２５フラスコであり、培地を交換した後のインキュベート時間が４８時間であったことを除いては、血清調製物を含み、ｈＵＴＣが５，０００生育可能細胞／ｃｍ2で播種された、ＣＭ１と同じ調製物。
４．ＣＭ３の調製
ｈＵＴＣの播種密度が１０，０００生育可能細胞／ｃｍ2に増加し、培地交換後のインキュベート時間が４８時間であったことを除いて、ＣＭ２と同じ調製物。
食作用アッセイ：５×１０4のスルホロダミン染色ＲＰＥ細胞を複数ウェルのプレート中にプレーティングし、ＭＥＭ＋２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ中で６日間維持し、続いてＭＥＭ＋５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳで２４時間維持してから、アッセイした（１サンプルあたり２つ以上の複製）。ＲＯＳを添加する３時間前に新鮮培地を添加し、培養をＦＩＴＣ−ＲＯＳ（ＭＥＭ＋２０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ中で１０7／ｍＬ）で重層して、３７℃で３〜１９時間（一般的には８時間）インキュベートすることによってアッセイを開始した。インキュベートの完了時に、細胞を徹底的に洗浄して非結合のＲＯＳを除去し、２％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で固定した。
ＲＯＳのＲＰＥ食作用は、初代ＲＰＥの調製及び培養、ＲＯＳの調製、並びに食作用アッセイ自体のプロトコルに関して最適化された。
ＲＴＫリガンド：用いられたＲＴＫリガンドは、リコンビナントヒトエフリン−Ｂ２（カタログ番号ｐｒｏ−９３７、ロット番号１１１２ＰＥＦＮＢ２（ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．（Ｉｓｒａｅｌ）））、リコンビナントヒトＢＤＮＦ（カタログ番号２４８−ＢＤ−０２５／ＣＦ、ロット番号ＮＧ４０１２０５１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）））、リコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦ（カタログ番号２５９−ＨＥ−０５０／ＣＦ、ロット番号ＪＩ３０１２０２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）））、リコンビナントヒトＨＧＦ（カタログ番号ＰＨＧ０２５４、ロット番号７３１９７１８１Ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）））、リコンビナントヒトエフリンＡ４（カタログ番号Ｅ１９９、ロット番号１１１２Ｒ２４５（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）））、及びリコンビナントヒトＰＤＧＦ−ＤＤ（カタログ番号１１５９−ＳＢ−０２５／ＣＦ、ロット番号ＯＴＨ０４１２０７１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）））であった。個々のＲＴＫリガンド原液の復元は、供給メーカーのデータシートに従った。リコンビナントヒトＢＤＮＦ、及びリコンビナントヒトＨＢ−ＥＧＦを、滅菌ＰＢＳ中で、それぞれ１００μｇ／ｍＬ、及び２５０μｇ／ｍＬに復元した。リコンビナントヒトＨＧＦを、滅菌蒸留水中で５００μｇ／ｍＬに復元した。リコンビナントヒトエフリンＡ４を、滅菌ＰＢＳ中で１００μｇ／ｍＬに復元した。リコンビナントヒトＰＤＧＦ−ＤＤを滅菌された４ｍＭ ＨＣｌ中で１００μｇ／ｍＬに復元した。復元された原液をアリコートして、−７０℃のフリーザーで冷凍した。
培地をＭＥＭ＋５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＭＥＭ５）に交換して、リガンドをジストロフィ細胞に２００ｎｇ／ｍＬで添加してから２４時間インキュベートし、その後、リガンドの存在下でＲＯＳを添加し、細胞を食作用アッセイに供した。正常なＲＰＥの複製をＭＥＭ５中でプレインキュベートして、対照として食作用に関してアッセイした。
非ＲＴＫリガンド：用いられた非ＲＴＫリガンドは、リコンビナントヒトビトロネクチン（カタログ番号２３０８−ＶＮ−０５０、ロット番号ＮＢＨ０７１３０２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）））、リコンビナントヒトＴＧＦ−β１（カタログ番号２４０−Ｂ−０１０／ＣＦ、ロット番号ＡＶ５４１２１１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）））、リコンビナントヒトＩＬ−６（カタログ番号２０６−ＩＬ−０１０／ＣＦ、ロット番号ＯＪＺ０７１２０４１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）））、及びヒトエンドセリン−１（カタログ番号ｈｏｒ−３０７、ロット番号１２１１ＰＥＤＮ１１２（ＰｒｏＳｐｅｃ−Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．（Ｉｓｒａｅｌ））であった。個々の非ＲＴＫリガンド原液の復元は、供給メーカーのデータシートに従った。リコンビナントヒトビトロネクチン及びＩＬ−６を、滅菌ＰＢＳ中、１００μｇ／ｍＬでそれぞれ復元した。リコンビナントヒトＴＧＦ−β１を滅菌された４ｍＭ ＨＣｌ中で１００μｇ／ｍＬに復元した。リコンビナントヒトエンドセリン−１を、滅菌された１８Ｍ(−ｃｍのＨ2Ｏ中、１００μｇ／ｍＬに復元した。復元された原液をアリコートして、−７０℃のフリーザーで冷凍した。
食作用レスキュー活性に関する馴化培地のアッセイ：ジストロフィ（Ｄ）ＲＰＥの複製を、それぞれ１ｍＬの馴化培地を用いて２４時間インキュベートした。対照のために、コンジェニック対照（Ｎ）ＲＰＥの複製を対照培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））中で同じ時間インキュベートした。インキュベート後、馴化培地及び対照培地を取り除き、新鮮なＭＥＭ５と交換して、ＲＰＥを食作用アッセイに供した。
ＲＣＳのＲＰＥ細胞の食作用に対する非ＲＴＫリガンドの効果を試験するアッセイ：ｈＵＴＣ ＣＭ３をアッセイのための陽性対照として用いた。エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、及びＩＬ−６の試験のために、ジストロフィ（Ｄ）ＲＰＥを、それぞれ１ｍＬの馴化培地を用いて２４時間インキュベートした。次に馴化培地を除去し、新鮮なＭＥＭ＋５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＭＥＭ５）と交換し、食作用アッセイに供した（ＭＥＭ５中にＲＯＳを８時間与えた）。その他の対照として、正常なＲＰＥ及びジストロフィＲＰＥをＭＥＭ５中で２４時間インキュベートしてから、食作用アッセイに供した。ジストロフィＲＰＥ細胞を、ＭＥＭ５中で２００ｎｇ／ｍＬのリコンビナントヒトエンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６を用いて２４時間インキュベートし、続いて、リコンビナントヒトエンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６を含有するＭＥＭ５中にＲＯＳを添加して食作用アッセイに供した（ＲＯＳを添加した時に培地は交換しなかった）。
ビトロネクチンの試験のため、ＲＯＳを、対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、又は馴化培地を用いた３７℃のＣＯ2細胞培養インキュベータ中で２４時間プレインキュベートした。同時に、ＲＯＳを、ＣＯ2細胞培養インキュベータ中のＭＥＭ＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ＭＥＭ２０）中で、様々な濃度のヒトリコンビナントビトロネクチン（４、２、１、０．５μｇ／ｍＬ）を用いて、それぞれ３７℃で２４時間プレインキュベートした。インキュベート後、ＲＯＳを洗浄せずにスピンダウンし、ＭＥＭ２０中で再懸濁させ、食作用アッセイのために、ＭＥＭ５の存在下でジストロフィＲＰＥ細胞に与えた。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみをＭＥＭ２０中で培養し、続いて、食作用アッセイのために、未処理のＲＯＳ（ＭＥＭ２０中で再懸濁してＲＰＥ細胞に与えた）の存在下でＭＥＭ５に交換した。
撮像及び定量化：生存ＲＰＥ細胞を、落射蛍光光学素子（epifluorescence optics）、蛍光顕微鏡、及びデジタルカメラを備えた倒立顕微鏡を用いる位相差蛍光顕微鏡法によって検査した。ＭｃＬａｒｅｎら（Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．，１９９３；３４（２）：３１７〜３２６．）で定義される通りに、細胞表面に結合したＦＩＴＣ−ＲＯＳ、摂取された（ingested）ＦＩＴＣ−ＲＯＳ、及びファゴリソソームを同定した。結合して摂取されたＲＯＳの定量化を、カバースリップ上に固定された細胞で実施した。計数は、適切なフィルター及びグリッドを用いて、２５０倍率で行われた（視野サイズ、４０×４０μｍ）。様々な種類の細胞に関して、代表的な視野（培養あたり１０〜１５）を計数し、データは、２〜３の個別の実験からの時点あたりで得られたプール値の平均値として表した。ペアのデータに関するスチューデントのｔ検定によって統計的有意性を評価し、ｐ＜０．０５であると考えられた。
アッセイの受入基準：食作用の絶対レベルは、単離ＲＰＥ、及び調製されたＲＯＳの品質を含む数多くの因子に応じて、実験において変化する。細胞上での様々な処理の効果を比較するために、同じ系統、すなわち、採取及び調製時間のＲＰＥを用いる試みがなされた。正常とジストロフィとの食作用レベルの関係が約１：０．３である場合、アッセイは正当であると判断された。
相対的食作用：相対的食作用とは、基準点としてのコンジェニック対照（正常）と比較した、ジストロフィＲＰＥによって示される食作用のレベルである。食作用のレベルは、ＲＯＳ／フィールドの平均数、又はＲＯＳ／細胞の平均数として表すことができる。
ＲＮＡの単離。ｈＵＴＣを５，０００細胞／ｃｍ2で播種し、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ））及び４ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を含有するＤＭＥＭ−Ｌｇ培地中で２４時間増殖させ、続いて培地を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２培地に交換して、更に４８時間増殖させた。続いて、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ ＤＮＡｓｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用いて、全ＲＮＡを抽出して、ＤＮＡを除去するために細胞を採取した。サンプル中のＲＮＡの完全性及び量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を用いて測定した。ライブラリーの調製及び配列決定は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）によって実施された。ＲＮＡライブラリーをＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、製造者の指示に従い調製し、ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。ソフトウェアＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を用いて、配列決定読み取り値を基準ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７パッチ８）に対してマッピングした。マッピングされた１００万読み取り値あたりの転写物の１キロベースあたりの断片（ＦＰＫＭ）を用いて遺伝子発現を計算した。
単離後、ＲＣＳのＲＰＥ細胞を、最初に９６ウェルプレート中に１週間の間、三重反復で播種し、培地をｈＵＴＣ馴化培地又は対照培地のいずれかに交換した時点を０時間と見なした。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を製造者の手順に従って用いて、ＲＮＡをそれぞれ２、４、８、及び２４時間で抽出した。三重反復から各時点で抽出されたＲＮＡを１つのサンプルとしてプールした。サンプルの濃度を、吸光度比２６０／２８０の分光光度法で測定した。
下記のスキームに示すように、ジストロフィＲＰＥの複製（各約２．４×１０4）を、馴化培地を含めて、又は含めずに処理した。
Figure 2018500325
結果
馴化培地試験
方法の項で説明するように、３つの馴化培地調製物（ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ３）を、ジストロフィＲＰＥに対するその食作用レスキュー活性、及び正常なＲＰＥとの比較に関して試験した。
ＣＭ１：ＣＭ１を、１回目はｔａｎ正常ＲＰＥを用いて、２回目は着色ＲＰＥを用いて２回試験した（図１Ａ、及び１Ｂ）。食作用レスキュー活性が観察された。図１Ａでは、着色ジストロフィＲＰＥにおける食作用の基本レベルは、ｔａｎ ｈｏｏｄｅｄ正常ＲＰＥのレベルのほぼ５０％であって、これは許容範囲（正常食作用レベルの＜３０％）を超えることに留意されたい。ＣＭ１（無血清培地）の効果も試験した（図２）。ＣＭ１（無血清）を有するジストロフィ細胞と有さない細胞との間の差異は統計的に有意であった。
ＣＭ２：ＣＭ２を試験し、活性の欠如が判明した（図３）。
ＣＭ３：１日目の培地交換後、ＣＭ２（不活性）のインキュベート時間は４８時間であり、ＣＭ１（活性）のインキュベート時間は５４時間であった。活性な馴化培地を得るためには、初期播種密度、及び培地交換後の細胞インキュベート時間が、２つの検討されるべき側面である。ＣＭ３を、細胞播種密度を２倍にして、培地交換後のインキュベート時間を同じにすることによって調製して、ＣＭ２と比較した。活性の存在を確認するために、ＣＭ３を複数回アッセイしたところ（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）、最大で１００％の食作用レスキュー活性を示した。
ＲＣＳのＲＰＥにおける食作用
ＲＣＳラット眼球由来の単離ＲＰＥ細胞を、食作用アッセイのためにインビトロ培養した。正常なコンジェニック対照ラット眼球由来の未処理ＲＰＥ細胞を、食作用の正常なレベルを示すための対照として用いた。共培養をｈＵＴＣと共培養するか（図４Ａ）、又はｈＵＴＣ馴化培地（ＣＭ）で処理すると（図４Ｂ）、ＲＣＳのＲＰＥにおける欠陥食作用は正常ＲＰＥのレベルにまで回復した。ＲＣＳのＲＰＥによるＯＳ食作用は、ｈＵＴＣ ＣＭでプレインキュベートされたＯＳを細胞に与えてからｈＵＴＣ ＣＭの不在下で食作用に供するとレスキューされた（図４Ｃ）。実証されたように、ｈＵＴＣは、ＲＰＥの食作用を促進する特定の因子を分泌する。
ＲＴＫリガンドアッセイ
ＢＤＮＦ及びＨＢ−ＥＧＦのアッセイ：ジストロフィＲＰＥの二重複製をＢＤＮＦ及びＨＢ−ＥＧＦで処理して、方法の項で説明される通りに、正常対照と共に食作用に関してアッセイした（図５Ａ、５Ｂ）。１サンプルあたり１０〜１２回の観察を実施した。ジストロフィ細胞は、一般的な正常な細胞と比較して、より高い食作用率を示す傾向があったが、これは、結果の解釈を妨げはしなかった。ＢＤＮＦは、ＣＭ３よりも高い食作用レスキュー活性を示した。
ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリンＡ４、及びＨＧＦのアッセイ：各サンプルで計数される細胞の数を、１視野あたり（図６Ａ、６Ｃ、６Ｄ）、及び１細胞あたり（図６Ｂ、６Ｅ）の両方で表した。各フレームで計数された細胞数が一定であったため、結果は影響を受けなかった。ＰＤＧＦ−ＤＤ（図６Ａ）、エフリンＡ４（図６Ｃ）、及びＨＧＦ（図６Ｄ）の全てが、未処理対照と比較して、ジストロフィＲＰＥ細胞における食作用を上方調節した。ＰＤＧＦ−ＤＤは、ＣＭ３を超える最大のレスキュー効果を示した。
エフリンＢ２アッセイ：エフリンＢ２は、ＣＭ３よりも高い、非常に高い食作用レスキュー活性を示した。１視野あたり（図７Ａ）、及び１細胞あたり（図７Ｂ）の結果の両方を求めた。
非ＲＴＫリガンドアッセイ
エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６のＲＣＳのＲＰＥの食作用に対する効果：ジストロフィ（Dystropic）ＲＰＥ細胞を、エンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６で処理して、材料及び方法の項で説明する通りに、正常対照と共に食作用に関してアッセイした（図８Ａ〜８Ｃ）。１サンプルあたり１０回の観察を実施した。図８Ａ及び８Ｂは、２つの別個のアッセイを示す。ラットから単離された細胞の違い、及びＲＯＳの調製の差異のため、図８Ｂの正常ＲＰＥ細胞とジストロフィＲＰＥ細胞の基本食作用レベルは、図８Ａよりも低く、正常とジストロフィとの食作用レベルの関係が約１：０．３であるため、アッセイは有効であると見なされる。図８Ａの結果と比較するために、正常ＲＰＥ細胞及びジストロフィＲＰＥ細胞の食作用レベルが、図８Ａのそれと同じとなるように、図８Ｃのデータを正規化した。ｈＵＴＣ ＣＭ３は、ジストロフィＲＰＥ細胞中における食作用を増加させたが、アッセイで試験された濃度（２００ｎｇ／ｍＬ）でのエンドセリン−１、ＴＧＦ−β１、又はＩＬ−６は、ＲＣＳのＲＰＥの食作用に全く影響を与えなかった。
ＲＣＳのＲＰＥの食作用に対するビトロネクチンの効果：ジストロフィＲＰＥ細胞に、様々な濃度のビトロネクチンを用いてプレインキュベートされたＲＯＳを与えてから、材料及び方法の項で説明する通りに、正常対照と共に食作用に関してアッセイした（図９）。１サンプルあたり１０回の観察を実施した。
研究に用いる対照培地及びｈＵＴＣ馴化培地では、対照培地は１０％ＦＢＳを含有し、対照培地中のビトロネクチンの量は約５００ｎｇ／ｍＬであった。ｈＵＴＣがビトロネクチンを構成的に分泌するため、ｈＵＴＣ馴化培地は、対照培地よりも多くのビトロネクチンを含有し得る。ｈＵＴＣ ＣＭ３で予処理したＲＯＳとは対照的に、対照培地で予処理したＲＯＳは、ジストロフィＲＰＥの食作用に対して全く影響を与えなかったと考えられる。ビトロネクチンは、試験された全ての濃度で、対照培地のものと同様の影響を有していた。これらの結果は、従来の文献で報告されている結果と一致している（Ｅｄｗａｒｄｓら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８６，１２７：２９３〜２９６；Ｍｉｃｅｌｉら，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．，１９９７；３８（８）：１５８８〜１５９７）。ビトロネクチンは、血清の活性成分であり、血清によって刺激されるヒトドナー眼球から単離された培養ＲＰＥ細胞によるＲＯＳの取り込みを司っている（Ｍｉｃｅｌｉら，１９９７）。しかしながら、ラットＲＰＥ細胞の場合、正常なＲＰＥにおける食作用に対する血清の効果は、ジストロフィのＲＣＳのＲＰＥとは異なる。Ｅｄｗａｒｄｓらは、培養ＲＣＳラットのＲＰＥ細胞及び正常コンジェニック対照のＲＰＥ細胞は、無血清培地においては、同程度に少量のＲＯＳを貪食したことを示した。培地中の２０％の血清の存在によって、正常なＲＰＥ細胞の食作用は劇的に増加したが（６倍）、ＲＣＳのＲＰＥ細胞ではそうならなかった（Ｅｄｗａｒｄｓら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８６，１２７：２９３〜２９６）。
現行の結果は、ビトロネクチンは、ｈＵＴＣ ＣＭが媒介する、ＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用の強化に関与していないことを示唆する。
馴化培地で処理したジストロフィＲＰＥからのＲＮＡの単離
本実験を方法の項で説明する通りに数巡実施して、必要なＲＮＡサンプルを得た。ＲＮＡサンプルを、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．によるＲＮＡ配列決定に用いた。実験１では、サンプル８及び９のＲＩＮスコアは、ＲＮＡ配列決定の基準を満たさなかった。両方のサンプルを配列決定リストから除外した。実験２では、サンプル１のＲＩＮスコアがＲＮＡ配列決定の基準を満たさなかったため、配列決定リストから除外した。（以下、配列決定の結果）。
Figure 2018500325
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ＲＴＫリガンド及び架橋分子の遺伝子のｈＵＴＣ発現を、ｈＵＴＣのＲＮＡ−Ｓｅｑ系トランスクリプトームプロファイルングによって示した。１５のＲＴＫサブファミリーに対する複数のＲＴＫリガンドの遺伝子発現を検出した（表１−１）。マッピングされた１００万読み取り値あたりの転写物の１キロベースあたりの断片（ＦＰＫＭ）の値に基づき、各ＲＴＫサブファミリーに対するＲＴＫリガンド遺伝子の発現レベルを分類してグラフ化した（図１０、表１−１）。ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、タンパク質Ｓ、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２を含む架橋分子の遺伝子発現を更に検出した（表１−３）。
ＲＣＳのＲＰＥにおける対応するＲＴＫサブファミリー及び架橋分子の受容体の遺伝子発現は、ＲＴＫスーパーファミリーが、キナーゼドメイン配列に基づいて２０のサブファミリーにグループ化され得ることを示す（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＤＲら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００；１９（４９）：５５４８〜５５５７）。ＲＣＳのＲＰＥでは、２０のＲＴＫサブファミリーのうち１８の遺伝子発現が検出された（表１−２）。１８のＲＴＫサブファミリーの中、ＲＴＫリガンド遺伝子に対応する１５のＲＴＫサブファミリーがｈＵＴＣ中で発現した。更に、インテグリンａｖＰ３、ａｖＰ５、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、ＭｅｒＴＫ、及びＣＤ３６を含む、架橋分子結合に関して報告された受容体の遺伝子発現（Ｋｅｖａｎｙ ＢＭら，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０；２５（１）：８〜１５）も、ＲＣＳのＲＰＥ中で検出された（表１−４）。
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（実施例２）
ｈＵＴＣ馴化培地における受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）リガンドの測定
ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いたＲＣＳのＲＰＥ細胞、及びｈＵＴＣの両方のトランスクリプトームプロファイル、並びにインフォマティクスデータ分析は、ＲＣＳのＲＰＥ細胞が複数のＲＴＫ遺伝子を発現し、一方でｈＵＴＣは複数のＲＴＫリガンドに対する遺伝子を発現することを示した（表２−１）。ｈＵＴＣ中で比較的高い遺伝子発現レベルを有する７つのＲＴＫサブファミリーのＲＴＫリガンドを、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びＡＲＰＥ−１９細胞由来のものと比較して、ｈＵＴＣ馴化培地中で測定した。これらのリガンドとしては、ＴｒｋファミリーのＢＤＮＦ及びＮＴ３リガンド、ＭｅｔファミリーのＨＧＦ−ａリガンド、ＰＤＧＦファミリーのＰＤＧＦ−ＤＤ及びＰＤＧＦ−ＣＣリガンド、Ｅｐｈファミリーのエフリン−Ｂ２−ａリガンド、ＥｒｂＢファミリーのＨＢ−ＥＧＦ−ａリガンド、ＲｅｔファミリーのＧＤＮＦ−ａリガンド、並びにＭｕｓｋファミリーのアグリン−ａリガンドが挙げられる。
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材料及び方法
ｈＵＴＣ（ロット番号１２８９８Ｐ７、ＰＤＬ２０ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ、７ページから調製）、ＡＲＰＥ−１９細胞（継代３）、及びＮＨＤＦ（継代１０）を研究に用いた。
ヒトＢＤＮＦ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＢＤ００、ロット番号３１１６５５、標準検出範囲：６２．５〜４０００ｐｇ／ｍＬ；感度：２０ｐｇ／ｍＬ）、ヒトＨＧＦ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＨＧ００、ロット番号３０７３１９、標準検出範囲：１２５〜８０００ｐｇ／ｍＬ；感度：＜４０ｐｇ／ｍＬ）、ヒトＰＤＧＦ−ＣＣ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＣＣ００、ロット番号３０９３７６、標準検出範囲：６２．５〜４０００ｐｇ／ｍＬ；感度：４．０８ｐｇ／ｍＬ）、ヒトＰＤＧＦ−ＤＤ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＤＤ００、ロット番号３１０５１８、標準検出範囲：３１．３〜２０００ｐｇ／ｍＬ；感度：１．６７ｐｇ／ｍＬ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのものであった。ＨＢ−ＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ａｂ１００５３１、ロット番号ＧＲ１３５９７９−１、標準検出範囲：１６．４〜４０００ｐｇ／ｍＬ；感度：＜２０ｐｇ／ｍＬ）、及びＮＴ３ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ａｂ１００６１５、ロット番号ＧＲ１４１２８１−１、標準検出範囲：４．１２〜３０００ｐｇ／ｍＬ；感度：＜４ｐｇ／ｍＬ）は、ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのものであった。ヒトＧＤＮＦ用ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＲＡＢ０２０５、ロット番号０９１９１３０２７０、標準検出範囲：２．７４〜２０００ｐｇ／ｍＬ；感度：２．７４ｐｇ／ｍＬ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）からのものであった。ヒトエフリン−Ｂ２ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＭＢＳ９１６３２４、ロット番号Ｒ２１１９９４２４、標準検出範囲：１５．６〜１０００ｐｇ／ｍＬ；感度：１５．６ｐｇ／ｍＬ）、及びアグリンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＭＢＳ４５４６８４、ロット番号ＥＤＬ２０１３１０１１０、標準検出範囲：３１．２〜２０００ｐｇ／ｍＬ；感度：＜１３．６ｐｇ／ｍＬ）は、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのものであった。
ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦ馴化培地の調製：１日目に、ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦを、Ｔ７５細胞培養フラスコ内の１５ｍＬのｈＵＴＣ増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース＋１５％ｖ／ｖのＦＢＳ＋４ｍＭのＬ−グルタミン）中に、それぞれ１０，０００生育可能細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ内で２４時間培養した。２日目に、培地を吸引して、２１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地を補充した（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０％ｖ／ｖのＦＢＳ＋５０Ｕ／ｍＬのＰｅｎ／５０μｇ／ｍＬのＳｔｒｅｐ）。細胞を更に４８時間培養した。対照培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地）のみも４８時間培養した。４日目に、細胞培養上清及び対照培地を回収して、２．５Ｎ（２５０ｇ）で５分間、４℃で遠心分離し、クライオチューブ中で０．５ｍＬ／チューブにアリコートし、−７０℃のフリーザーで即座に冷凍した。冷凍したサンプルを解凍してＥＬＩＳＡのために用いた。
結果
ｈＵＴＣ馴化培地中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルを表２−２にまとめる。
Figure 2018500325
ｈＵＴＣ馴化培地中で測定された、選択されたＲＴＫリガンドのレベルも、ｐｇ／ｍＬ／１×１０6細胞に正規化した、ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９馴化培地由来のものと比較した。ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９の４８時間あたりの１００万細胞あたりでそれぞれ２０．４ｐｇ／ｍＬ及び１６．２ｐｇ／ｍＬと比較して、ｈＵＴＣは、４８時間あたりの１００万細胞あたりで７２．７ｐｇ／ｍＬのＢＤＮＦを分泌した（図１１Ａ）。対照培地中ではＢＤＮＦの量は検出されなかった（図１１Ｇ）。
ｈＵＴＣ及びＮＨＤＦは少量のＮＴ３を分泌した（図１１Ｂ）。ＡＲＰＥ−１９馴化培地、及び対照培地中ではＮＴ３の量は検出されなかった。
ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９からのそれぞれ３．９ｐｇ／ｍＬ及び０．４ｐｇ／ｍＬと比較して、ｈＵＴＣは４８時間あたりの１００万細胞あたりで２３．７ｐｇ／ｍＬのＨＧＦを分泌した（図１１Ｃ）。対照培地中ではＨＧＦの量は検出されなかった（図１１Ｇ）。
ＮＨＤＦ及びＡＲＰＥ−１９ＣＭ中と比較した、ｈＵＴＣ ＣＭ中のＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤの量を図１１Ｄ及び１１Ｅに示す。対照培地中では、０．３ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＣＣ、及び３．１ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＤＤがそれぞれ検出された。
ＮＨＤＦからの８．５ｐｇ／ｍＬのＧＤＮＦと比較して、ｈＵＴＣは４８時間あたりの１００万細胞あたりで９．５ｐｇ／ｍＬのＧＤＮＦを分泌した。ＡＲＰＥ−１９は、４８時間あたりの１００万細胞あたりで１．３ｐｇ／ｍＬの微量のＧＤＮＦしか放出しなかった（図１１Ｆ）。対照培地中ではＧＤＮＦの量は検出されなかった（図１１Ｇ）。
ｈＵＴＣ、ＮＨＤＦ、及びＡＲＰＥ−１９の馴化培地中のエフリン−Ｂ２及びＨＢ−ＥＧＦのレベルは、ＥＬＩＳＡの検出限界を下回っていた（それぞれ１５．６ｐｇ／ｍＬ及び２０ｐｇ／ｍＬ）。ｈＵＴＣ、ＮＨＤＦ、及びＡＲＰＥ−１９馴化培地中のアグリンのレベルは、対照培地のそれと同様であった。
２００ｎｇ／ｍＬの用量を用いてＲＣＳのＲＰＥの食作用アッセイで試験されたＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＤＤ、エフリン−Ｂ２、及びＨＢ−ＥＧＦの効果は、全て、ＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用のレスキューに対して明白な効果を示した（実施例１）。しかしながら、馴化培地中のｈＵＴＣから分泌されたこれらのリガンドの実際の濃度は、試験されたレベルよりも低いものと思われる。
（実施例３）
ｈＵＴＣ馴化培地中の架橋分子
ＲＣＳのＲＰＥ細胞及びｈＵＴＣのトランスクリプトームプロファイルはいずれも、ＲＣＳのＲＰＥ細胞が、アポトーシス細胞上で「食誘引」シグナルを認識する受容体の遺伝子を発現することを示した（Ｅｒｗｉｇ Ｌ−Ｐ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２００８；１５：２４３〜２５０）。こうした受容体としては、スカベンジャー受容体（ＳＲ−Ａ、ＬＯＸ−１、ＣＤ６８、ＣＤ３６、ＣＤ１４）、インテグリン（αｖβ３及びαｖβ５）、Ａｘｌ及びＴｙｒｏ３の受容体チロシンキナーゼ、ＬＲＰ−１／ＣＤ９１、並びにＰＳ受容体スタビリン１が挙げられる。更に、ｈＵＴＣは、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰ−Ｄ）、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、アポリポタンパク質Ｈ、及びアネキシン１を含む多くの架橋分子の遺伝子を発現する。ｈＵＴＣ馴化培地における架橋分子の分泌を検査し、ＡＲＰＥ−１９及び正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）由来のものとレベルを比較した。
材料及び方法
ｈＵＴＣ（ＰＤＬ２０、マスターセルバンク番号２５１２６０５７）、ＡＲＰＥ−１９細胞（継代３）（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））、及びＮＨＤＦ（継代１１）（Ｌｏｎｚａ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ））を研究に用いた。
Ａｖｉｓｃｅｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）からの、ヒトＧａｓ６ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＳＫ０００９８−０１、ロット番号２０１１１２１８）、及びヒトＳＰ−Ｄ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＳＫ００４５７−０１、ロット番号２０１１１１３５）。ヒトＧａｓ６ ＥＬＩＳＡキットの標準検出範囲は、６２．５〜８０００ｐｇ／ｍＬであり、感度は３１ｐｇ／ｍＬである。ヒトＳＰ−Ｄ ＥＬＩＳＡキットの標準検出範囲は、７８〜５０００ｐｇ／ｍＬであり、感度は３０ｐｇ／ｍＬである。ヒトＭＦＧ−Ｅ８ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＦＧＥ８０、ロット番号３０７２５４、標準検出範囲：６２．５〜４０００ｐｇ／ｍＬ；感度：４．０４ｐｇ／ｍＬ）、ヒトＴＳＰ−１ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＴＳＰ１０、ロット番号３０７１８２、標準検出範囲：７．８１〜５００ｎｇ／ｍＬ；感度：０．３５５ｎｇ／ｍＬ）、及びヒトＴＳＰ−２ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＴＳＰ１０、ロット番号３０７２６６、標準検出範囲：０．３１〜２０ｎｇ／ｍＬ；感度：０．０２５ｎｇ／ｍＬ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）からのものであった。アポリポタンパク質ＨヒトＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ａｂ１０８８１４、ロット番号ＧＲ１２６９３８、標準検出範囲：０．６２５〜４０ｎｇ／ｍＬ；感度：０．６ｎｇ／ｍＬ）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）からのものであった。ヒトアネキシンＩ（ＡＮＸ−Ｉ）ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＭＢＳ７０４０４２、ロット番号Ｎ１０１４０９４７、標準検出範囲：０．３１２〜２０ｎｇ／ｍＬ；感度：０．０７８ｎｇ／ｍＬ）は、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのものであった。
Figure 2018500325
 受容体チロシンキナーゼであるＴｙｒｏ３及びＡｘｌは、ＰＳ架橋分子受容体でもあり、Ｇａｓ６に結合することに留意されたい。
ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦ馴化培地の調製：１日目に、ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦを、Ｔ７５細胞培養フラスコ内の１５ｍＬのｈＵＴＣ増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース＋１５％のＦＢＳ＋４ｍＭのＬ−グルタミン）中に、それぞれ１０，０００生育可能細胞／ｃｍ２で播種した。３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ内で２４時間培養する。２日目に、培地を吸引して、１８ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地を補充した（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））。細胞を更に４８時間培養した。対照培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））のみを、同様に４８時間培養した。４日目に、細胞培養上清及び対照培地を回収して、２．５Ｎ（２５０ｇ）で５分間、４℃で遠心分離し、クライオチューブ中で０．５ｍＬ／チューブにアリコートし、−７０℃のフリーザーで即座に冷凍した。冷凍したサンプルを解凍してＥＬＩＳＡのために用いた。
結果
ＡＲＰＥ−１９及びＮＨＤＦからの４８時間あたりの１００万細胞あたりでそれぞれ７．６ｎｇ及び１７．５ｎｇと比較して、ｈＵＴＣは４８時間あたりの１００万細胞あたりで７７．２ｎｇのＭＦＧ−Ｅ８を分泌した（図１２Ａ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＭＦＧ−Ｅ８の濃度は１５．５ｎｇ／ｍＬであった。対照培地中ではＭＦＧ−Ｅ８の量は検出されなかった（図１２Ｅ）。
ＡＲＰＥ−１９からの１８３．９ｐｇ及びＮＨＤＦからの１，１０１ｐｇと比較して、ｈＵＴＣは４８時間あたりの１００万細胞あたりで３５２．８ｐｇのＧａｓ６を分泌した（図１２Ｂ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＧａｓ６の濃度は７０．６ｐｇ／ｍＬであった。対照培地中ではＧａｓ６の量は検出されなかった（図１１Ｇ）。
ＡＲＰＥ−１９からの４８時間あたりの１００万細胞あたりで４，７４４．６８ｎｇ、及びＮＨＤＦからの２，４８７．５５ｎｇと比較して、ｈＵＴＣは４８時間あたりの１００万細胞あたりで７５９．２ｎｇのＴＳＰ−１を分泌した（図１２Ｃ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＴＳＰ−１の濃度は１５１．８ｎｇ／ｍＬであった。対照培地中では４．０ｎｇ／ｍＬのＴＳＰ−１が検出された（図１２Ｅ）。
ｈＵＴＣは４８時間あたりの１００万細胞あたりで、ＮＨＤＦからの３０ｎｇのＴＳＰ−２と比較して、４４．２ｎｇのＴＳＰ−２を分泌した。ＡＲＰＥ−１９は４８時間あたりの１００万細胞あたりで０．０８ｎｇのごく少量のＴＳＰ−２を放出した（図１２Ｄ）。ｈＵＴＣ馴化培地中のＴＳＰ−２の濃度は８．８ｎｇ／ｍＬであった。対照培地中では微量（０．０２ｎｇ／ｍＬ）のＴＳＰ−２が検出された（図１２Ｅ）。
ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦの馴化培地中におけるアポリポタンパク質Ｈのレベルは、対照培地中と同様であった（６．８ｎｇ／ｍＬ）。ｈＵＴＣ、ＡＲＰＥ−１９、及びＮＨＤＦ馴化培地、並びに対照培地におけるＳＰ−Ｄ及びアネキシンＩのレベルは、ＥＬＩＳＡの検出限界（それぞれ＜３０ｐｇ／ｍＬ、及び＜７８ｐｇ／ｍＬ）を下回っていた。これらの細胞は、２つのタンパク質を分泌しないか、あるいはそのレベルが検出限界未満であるかのいずれかである。
ｈＵＴＣ馴化培地中で検査された架橋分子、及びそれらの濃度の要約を表３−２に記す。
Figure 2018500325
測定された架橋分子のうち、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２が、ＲＣＳのＲＰＥ細胞におけるｈＵＴＣ媒介食作用レスキューに関与する架橋性分子の候補である。
架橋分子によってオプソニン化したＲＯＳの結合は、インテグリン及びＲＴＫシグナル伝達経路を活性化し、これは、Ｍｅｒｔｋシグナル伝達の不在を補い、食作用のレスキューをもたらす。
（実施例４）
ＲＣＳのＲＰＥ細胞による桿体外節（ＲＯＳ）の食作用に対するｈＵＴＣ馴化培地及び架橋分子の効果
ｈＵＴＣ馴化培地でプレインキュベートされたＲＯＳをＲＣＳのＲＰＥ細胞に与えることにより、ＲＯＳ食作用に対するｈＵＴＣ馴化培地の直接効果を検査した（米国特許出願公開第２０１０／０２７２８０３号）。ジストロフィＲＰＥ細胞の食作用は完全にレスキューされた。ここで、ｈＵＴＣ馴化培地に存在する、又はｈＵＴＣ馴化培地中で分泌された架橋分子の効果を調査した。現在、ＲＯＳ上で同定されている唯一の「食誘引」シグナルは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）である（Ｆｉｎｎｅｍａｎｎら，ＰＮＡＳ，２０１２；１０９（２１）：８１４５〜８１４８）。
材料及び方法
ＲＰＥの単離、ＲＰＥ細胞の初代培養、ＲＰＥ細胞のスルホロダミン染色、ラットＲＯＳの単離、ＲＯＳのＦＩＴＣ染色、食作用アッセイ、撮像及び定量化の手順、アッセイの受入基準、及び相対的な食作用レベルを実施例１で説明する。
ｈＵＴＣ馴化培地（ＣＭ）：ｈＵＴＣ ＣＭ３を研究のために用いた。１日目に、Ｔ７５細胞培養フラスコ内のｈＵＴＣ増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース＋１５％のＦＢＳ＋４ｍＭのＬ−グルタミン）中に、ｈＵＴＣを１０，０００生育可能細胞／ｃｍ2で播種した。３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータ内で２４時間培養する。２日目に、培地を吸引し、２１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地を補充した（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））。細胞を更に４８時間培養した。対照培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地＋１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ（５０Ｕ／ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐ（５０μｇ／ｍＬ））のみを、同様に４８時間培養した。４日目に、細胞培養上清及び対照培地を回収して、２．５Ｎ（２５０ｇ）で５分間、室温で遠心分離し、クライオチューブ中で３ｍＬ／チューブにアリコートし、−７０℃のフリーザーで即座に冷凍した。
リコンビナントヒト架橋分子：リコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８（カタログ番号２７６７−ＭＦ−０５０、ロット番号ＭＰＰ２０１２０６１）、リコンビナントヒトＧａｓ６（カタログ番号８８５−ＧＳ−０５０、ロット番号ＧＮＴ５０１３０１１）、リコンビナントヒトＴＳＰ−１（カタログ番号３０７４−ＴＨ−０５０、ロット番号ＭＶＦ３６１３０４１）、リコンビナントヒトＴＳＰ−２（カタログ番号１６３５−Ｔ２−０５０、ロット番号ＨＵＺ１７１３０２１）は、全て、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。個々のタンパク質原液の復元は、供給業者のデータシートに従った。リコンビナントヒトＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２を、それぞれ滅菌ＰＢＳ中で１００μｇ／ｍＬに復元した。リコンビナントヒトＧａｓ６を、滅菌水中で１００μｇ／ｍＬに復元した。復元された原液をアリコートして、−７０℃のフリーザーで冷凍した。
ＲＣＳのＲＰＥ細胞の食作用に対する架橋分子の効果：ＲＯＳを、対照培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、又はＣＭ３を用いた３７℃のＣＯ2細胞培養インキュベータ中で２４時間プレインキュベートした。同時に、ＲＯＳを、３７℃のＣＯ2細胞培養インキュベータ中の、様々な濃度のヒトリコンビナントＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２を含む対照培地中で、２４時間プレインキュベートした。インキュベート後、ＲＯＳを洗浄せずにスピンダウンし、ＭＥＭ５中で再懸濁させ、食作用アッセイのために、ＭＥＭ５の存在下でジストロフィＲＰＥ細胞に与えた。対照のために、正常なＲＰＥのみ、又はジストロフィＲＰＥのみをＭＥＭ２０中で培養し、続いて、食作用アッセイのために、未処理のＲＯＳ（ＭＥＭ２０中で再懸濁してＲＰＥ細胞に与えた）の存在下でＭＥＭ５に交換した。
ＲＣＳのＰＲＥ（PRE）細胞の食作用に対するＲＴＫリガンドの効果：ＲＣＳのＲＰＥを、リコンビナントヒトＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦで個別に２４時間インキュベートし、続いて食作用アッセイのためにＯＳを添加した。ｈＵＴＣ ＣＭを用いてインキュベートされたＲＣＳのＲＰＥを陽性対照として用いた。
ｓｉＲＮＡのノックダウン：ヒトＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２に標的化されたＯｎ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓヒト用ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌｓ、並びにＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ非標的化プール（スクランブルｓｉＲＮＡプール）を、ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬（ＧＥ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を用いて、２５ｎＭの各ｓｉＲＮＡプールのそれぞれをｈＵＴＣに組み込んだ。
免疫蛍光染色用抗体：架橋分子（ヒトＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２）用の非コンジュゲートモノクローナル抗体、並びにマウスＩｇＧ２Ａ及びＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照抗体を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。これらの抗体を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光色素分子とコンジュゲートさせた。非コンジュゲートモノクローナル抗ロドプシン抗体（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ ＣＡ））をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートさせた。非コンジュゲートマウスＩｇＧ２ｂ、Ｘアイソタイプ対照抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手して、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光色素分子とコンジュゲートさせた。これは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートさせた抗ロドプシン抗体のためのアイソタイプ対照抗体として用いられた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートさせたマウスＩｇＧ２Ａを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートさせた抗ヒトＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、又はＴＳＰ−２抗体のためのアイソタイプ対照抗体として用いた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２Ｂを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたヒトＴＳＰ−１抗体のためのアイソタイプ対照抗体として用いた。
免疫蛍光：１ｍＬのｈＵＴＣ ＣＭ、１ｍＬの対照培地、又は１２４ｎｇ／ｍＬのＭＦＧ−Ｅ８、８．７５ｎｇ／ｍＬのＧａｓ６、１．２μｇ／ｍＬのＴＳＰ−１、若しくは２３８ｎｇ／ｍＬのＴＳＰ−２を含有する１ｍＬの対照培地中で、１０ｘ１０6のＯＳを３７℃で２４時間インキュベートした。ＯＳをペレット化し、洗浄して、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ））中に埋め込んだ。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０，Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）））を用いて１０ｉＡｍ（iAm）の連続切片を得た。免疫蛍光染色のために切片をガラススライド上に移動させた。ＯＳ片を有する円で囲まれた箇所を、室温で１時間、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１０％（ｖ／ｖ）ヤギ血清、１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡ、及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ ｘ １００）で処理し、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８とコンジュゲートさせた抗ＭＦＧ−Ｅ８、抗Ｇａｓ６、抗ＴＳＰ−１、抗ＴＳＰ−２、又はマウスＩｇＧ2Ａ若しくはＩｇＧ２Bアイソタイプ対照抗体を用いて、４℃で２時間二重染色した。ＰＢＳで３回洗浄した後、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ））に載せ、落射蛍光顕微鏡を搭載したＺｅｉｓｓ Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＩＩＩ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて評価した。画像をＫｏｄａｋ ２９０デジタルカメラでキャプチャして、Ｋｏｄａｋ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ２９０ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ画像解析ソフトウェア（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））を用いて解析した。適切なフィルターを用いて画像を２５０倍に拡大した。
結果
図１３Ａ及び１３Ｂ（実験１）、並びに図１３Ｃ及び１３Ｄ（実験２）に示すように、未処理のジストロフィＲＰＥ細胞は、正常なＲＰＥ細胞と比較して、食作用がより低下した。ｈＵＴＣ馴化培地を用いたジストロフィＲＰＥ細胞のプレインキュベートによって、アッセイ中にｈＵＴＣ馴化培地が存在しなくても食作用は完全にレスキューされた。ｈＵＴＣ馴化培地が食作用アッセイの全体を通して存在する場合は、ジストロフィＲＰＥ細胞がｈＵＴＣ馴化培地で予処理されていたか否かに関わらず、食作用のより旺盛な増強が観察された。ｈＵＴＣ馴化培地で予処理されたＲＯＳを与えられたジストロフィＲＰＥ細胞は、食作用アッセイ中にｈＵＴＣ馴化培地が存在しなくても食作用の回復を示した。
ジストロフィＲＰＥ細胞に様々な濃度のＭＦＧ−Ｅ８（１５．５ｎｇ／ｍＬ；３１ｎｇ／ｍＬ；６２ｎｇ／ｍＬ；１２４ｎｇ／ｍＬ）、Ｇａｓ６（７０ｐｇ／ｍＬ；３５０ｐｇ／ｍＬ；１７５０ｐｇ／ｍＬ；８７５０ｐｇ／ｍＬ）、ＴＳＰ−１（１５２ｎｇ／ｍＬ；３０４ｎｇ／ｍＬ；６０８ｎｇ／ｍＬ；１２１６ｎｇ／ｍＬ）、又はＴＳＰ−２（８．８ｎｇ／ｍＬ；２６．４ｎｇ／ｍＬ；７９．２ｎｇ／ｍＬ；２３７．６ｎｇ／ｍＬ）でプレインキュベートされたＲＯＳを与え、食作用に関してアッセイした（図１４Ａ〜１４Ｄ）。１サンプルあたり１０回の観察を実施した。ＲＯＳ食作用は、ＲＣＳのＲＰＥ細胞に、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２でプレインキュベートしたＲＯＳを与えることによってレスキューされた。
ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２はそれぞれ、ＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用レベルを用量依存的に上昇させた（図１４Ｅ〜１４Ｈ）。同様に、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦは、ＲＣＳのＲＰＥ細胞における食作用レベルを用量依存的に上昇させ、ＨＧＦが最小の用量であって最も効果が高かった。高濃度で適用した場合、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、及びＧＤＮＦは、ＲＣＳのＲＰＥにおける食作用をレスキューすることができた（図１４Ｉ〜Ｊ）。この結果は、リコンビナントＲＴＫリガンド、及び架橋分子タンパク質は、ｈＵＴＣ ＣＭの効果を模倣して、ＲＣＳのＲＰＥの食作用を回復させることができ、ＲＣＳのＲＰＥにおいてｈＵＴＣが媒介する食作用のレスキューに関与することを示す。
ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２は、ｈＵＴＣ中のｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングによってノックダウンされた。どの遺伝子も標的にしないスクランブルｓｉＲＮＡプールをノックダウン対照として用いた。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣから回収された細胞培養上清中の各因子のレベルを測定することによって各因子のノックダウン効率を検査した（図１５Ａ）。モックｓｉＲＮＡ又はスクランブルｓｉＲＮＡトランスフェクションは、ｈＵＴＣによるこれらの因子の分泌に対して全く影響を及ぼさなかった。ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、及びＨＧＦを標的にするｓｉＲＮＡは、ほぼ１００％のノックダウン効率を生み出し、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦに関してはそれぞれ８０％及び６５％のノックダウンが観察された（図１５Ａ）。ｈＵＴＣ中でＧａｓ６を標的にするｓｉＲＮＡは効果がなかった（データは示さず）。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣからＣＭを産生して、ＲＣＳのＲＰＥに適用して、ＲＴＫリガンド、及び架橋分子のノックダウンの効果を同定した。ＲＣＳのＲＰＥを、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、又はＧＤＮＦ標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣから産生されたＣＭを用いて培養するか（図１５Ｂ）、あるいは、ＲＣＳのＲＰＥに、ＭＦＧ−Ｅ８、ＴＳＰ−１、又はＴＳＰ−２を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣから産生されたＣＭで予処理されたＯＳを与えた（図１５Ｃ）。非トランスフェクト及びスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたｈＵＴＣから調製されたＣＭをノックダウン対照ＣＭとして用いた。各ＲＴＫリガンドの個々のノックダウンは、ノックダウン対照ＣＭのそれと比較して、食作用レスキューに対するｈＵＴＣ ＣＭの効果を消滅させた（図１５Ｂ）。架橋分子のそれぞれのノックダウンは、ＲＣＳのＲＰＥによるＯＳの食作用を減少させた（図１５Ｃ）。ＲＣＳのＲＰＥにおけるｈＵＴＣ媒介食作用レスキューには、これらのＲＴＫリガンド及び架橋分子が必要である。
個別の各架橋分子及びロドプシンの二重染色によって、ＯＳを確実に評価できるようにした。ロドプシンは、視細胞ＯＳに局在する視覚色素であり、ＯＳ染色の特徴（hallmark）である（Ｓｚａｂｏ Ｋら，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２０１４；３５６（１）：４９〜６３）。個々のリコンビナントヒト架橋分子でプレインキュベートされた、ロドプシン染色（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲート（レッド））された粒子は、４つの架橋分子抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲート（グリーン））ではそれぞれ陽性染色されたが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２Ａ又はＩｇＧ２Ｂアイソタイプ対照抗体では陽性染色されなかった（図１６Ａ）。同様の結果が、ｈＵＴＣ ＣＭでインキュベートされたＯＳで得られ（図１６Ｂ）、一方で対照培地でインキュベートされたＯＳでは架橋分子のいずれの染色も観察されなかった（図１６Ｃ）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８とコンジュゲートした抗ロドプシン抗体、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたマウスＩｇＧ２ｂ、Ｘアイソタイプ対照抗体を用いたＯＳ粒子の二重染色により、抗ロドプシン抗体の特異性が確認された。ＯＳは抗ロドプシン抗体でのみ陽性染色された（図１６Ｄ）。ＯＳ上でロドプシンと共局在したｈＵＴＣ ＣＭ中の架橋分子ＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２は、架橋分子がＯＳと結合することを実証した。
（実施例５）
ｈＵＴＣによる酸化損傷からのＲＰＥの保護
酸化ストレスは、網膜色素上皮の健康を損なう場合がある。酸化損傷に曝されたＲＰＥ細胞の健康を改善するための、ｈＵＴＣ及びｈＵＴＣ馴化培地の効果を調査した。
材料及び方法
過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、クリスタルバイオレット、及びチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
ハムＦ１０培地、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（５０００単位／ｍＬペニシリン／５０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％）、低グルコースＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン２００ｍＭをＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。
Ｈｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ及びホルムアルデヒドをＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。イソプロパノール、氷酢酸、及び塩酸をＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。エタノールをＤｅｃｏｎ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）から入手した。ＰＢＳをＬｏｎｚａ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）から入手した。
ＡＲＰＥ増殖培地：５％又は１０％の加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）））、１×最小必須培地−非必須アミノ酸（ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、及び０．０１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン試薬溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した、４．５ｇ／Ｌのグルコース及びピルビン酸ナトリウムを含み、Ｌ−グルタミン及びフェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））。
１０μＭのＡ２Ｅを含有する５％のＡＲＰＥ増殖培地：５％の加熱不活性化ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．０１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン試薬溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び１０μＭのＡ２Ｅ（Ｄｒ．Ｊａｎｅｔ Ｓｐａｒｒｏｗの研究所で調製）を添加したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）。
ｈＵＴＣ完全培地：１５％のＨｙｃｌｏｎｅ（登録商標）ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ））、及び４ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ低グルコース（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
ｈＵＴＣ ＦＢＳ培地：５％又は１０％の加熱不活性化ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．０１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン試薬溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を添加したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）。
ｈＵＴＣ馴化培地：２つのＴ７５培養フラスコ中のｈＵＴＣ完全培地（１５ｍＬ）中に、ｈＵＴＣ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ番号１２８９８Ｐ６、ＰＤＬ２０）を５０００細胞／ｃｍ2で播種した（３７℃、５％ＣＯ2）。播種から２４時間後、各フラスコから培地を取り出し、１５ｍＬの１Ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で細胞を３回洗浄した。３回目の洗浄の後、５％又は１０％のＦＢＳ ｈＵＴＣ培地を１５ｍＬずつ各フラスコに添加した。更に、１５ｍＬの５％又は１０％のＦＢＳ ｈＵＴＣ培地を２つの空のＴ７５フラスコに添加して、対照として供した。全てのフラスコを３７℃、５％のＣＯ2に４８時間戻した。４８時間後、各フラスコから培地を取り出し、４℃で５分間、２５０×ｇで遠心分離した。培地を氷上に配置し、アリコートして−８０℃で保存した。
Ａ２Ｅ研究のためのＡＲＰＥ−１９の細胞培養：１日目に、ＡＲＰＥ−１９細胞を、８ウェルのＮｕｎｃ（商標）Ｌａｂ−Ｔｅｋ（商標）ＩＩチャンバスライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ））中の最終容積３００μＬの１０％ＡＲＰＥ増殖培地中に、４０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。播種してから２４時間後（２日目）、細胞上の培地を取り出して、３００μＬの５％ＡＲＰＥ増殖培地と交換した。１週間後（９日目）、培地を再び取り出して、新鮮な５％ＡＲＰＥ増殖培地と交換した。１４日目、培地を取り出して、１０μＭのＡ２Ｅを含有する新鮮な５％ＡＲＰＥ増殖培地と交換した。１７日目及び２１日目、培地を再び取り出して、新鮮なＡ２Ｅ含有培地と交換した。２４日目、Ａ２Ｅ含有培地を取り出して、新鮮な５％ＡＲＰＥ増殖培地と交換し、細胞を５日間静置させた。
２９日目、各ウェルから培地を取り出して、２５０μＬの５％又は１０％のｈＵＴＣ馴化培地又は対照培地（細胞に曝されていない５％又は１０％のＦＢＳ ｈＵＴＣ培地）と交換した。３２日目及び３５日目、順化培地及び対照培地を細胞から取り出して、新鮮な順化培地又は対照培地と交換した。
３６日目、各ウェルから全ての培地を取り出して、細胞を１ＸＤＰＢＳで１回洗浄した。続いて、２００μＬの新鮮ＤＰＢＳを各ウェルに添加して、細胞をタングステンハロゲン光源から送られる４３０ｎｍの光に２０分間曝露した。光曝露の後でＤＰＢＳを取り出して細胞生存アッセイを実施した。
Ａ２Ｅ研究のためのＭＴＴアッセイ：代謝ＭＴＴ、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）比色分析マイクロタイターアッセイ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））によって細胞毒性を測定した。ＭＴＴアッセイを実施するために、２０μＬのＭＴＴ標識試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、各ウェル中の０．２ｍＬの５％培養培地に添加した。４時間のインキュベート後、更に２００μＬの可溶化溶液を各ウェルに添加して終夜インキュベートした。１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、上清を５７０ｎｍで分光光度法により測定した（ＳｐｅｃｔａＭａｘ ＭＪ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）））。還元ＭＴＴの５７０ｎｍでの吸光度の低下は、細胞の生育可能性が低下したことを示す。データをＰｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。
Ａ２Ｅ研究のためのＤｅａｄ Ｒｅｄアッセイ：標識後に、細胞死の後期に原形質膜一体性が失われたことによるアポトーシス細胞核の標識化を実現する蛍光排除アッセイ（fluorescence exclusion assay）によって標識化した後で、生育不能細胞を定量化した。光曝露の後で細胞を５％ＡＲＰＥ増殖培地に戻した。青色光への曝露から８時間後に、死細胞の細胞核を、膜不透過性染料Ｄｅａｄ Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１／５００希釈、１５分インキュベート）で染色し、全ての細胞核を、４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。要約すると、細胞を予熱した（３７℃）ハンクス緩衝塩類溶液（１ｘ）（ＨＢＳＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄した。２５０μＬのＤｅａｄ Ｒｅｄ希釈標準溶液（８μＬのＤｅａｄ Ｒｅｄストック＋４ｍＬのＨＢＳＳ）を、室温で各ウェルに１５分間添加した。１５分後、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄した。１ＸＤＰＢＳ中に調製された３００μＬの４％ホルムアルデヒドを室温で各ウェルに３０分間添加した。細胞を１ＸＤＰＢＳで３回洗浄して、ＤＡＰＩ（１ＸＤＰＢＳ中に調製された１：３００）希釈標準溶液を用いて、室温で５分間インキュベートした。細胞を１ＸＤＰＢＳで３回洗浄した。スライドを載置してカバースリップで覆い、各ウェルの照明領域内における少なくとも５つの顕微鏡視野中の、ＤＡＰＩ染色及びＤｅａｄ−Ｒｅｄ染色細胞核を計数することによって複製をアッセイした。値はＤｅａｄ−Ｒｅｄ染色細胞核／ＤＡＰＩ染色細胞核×１００として示す。
Ｈ2Ｏ2研究のための細胞培養：ＡＲＰＥ−１９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を、３７℃、５％ＣＯ2のＴ７５フラスコ中で、単層として１０％のＦＢＳ及び５０単位／ｍＬのペニシリン／５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するハムＦ１０培地中で増殖させた。ｈＵＴＣとの共培養実験のために、ＡＲＰＥ１９細胞をＴ−７５フラスコ中で８０〜９０％コンフルエンシーまで増殖させ、続いて２４ウェル細胞培養プレート中に播種した。ＡＲＰＥ−１９細胞を１０％のＦＢＳ増殖培地中で播種後３日目まで増殖させ、そこで培地を基本培地（２％のＦＢＳ及び５０単位／ｍＬのペニシリン／５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したハムＦ１０培地）と交換した。
ｈＵＴＣ完全増殖（１５％のＦＢＳ及び４ｍＭのＬ−グルタミンを添加した低グルコースＤＭＥＭ）中の細胞培養インサート（口径１μｍ）上に、ｈＵＴＣを５０００細胞／ｃｍ2で２４時間播種した。インサートを細胞培養プレート上で増殖中のＡＲＰＥ−１９細胞に７２時間移して、ｈＵＴＣ完全培地中で増殖させた。インサートを取り除き、ＡＲＰＥ−１９細胞を、無血清ハムＦ１０培地で調製されたＨ2Ｏ2（０〜１５００μＭ）で９時間処理した。
Ｈ2Ｏ2研究のためのクリスタルバイオレット細胞生存アッセイ：相対的な細胞の生育可能性をクリスタルバイオレット取り込みによって測定した。処理後、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒド中に細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレット、１０％エタノールの溶液中で染色した。水で洗浄した後、残った染料を１０％の酢酸に溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて５５０ｎｍで吸光度を測定した。
Ｈ2Ｏ2研究のためのＭＴＴアッセイ：細胞を、無血清培地中で０．２５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを用いて、３７℃で３時間インキュベートした。続いて培地を取り出して、酸性イソプロパノール（１ｍＬのイソプロパノールあたり１μＬの濃縮ＨＣＬ）を添加して、産生されたブルーホルマザン（ＭＴＴ代謝産物）を溶解させた。マイクロプレートリーダーを用いて、バックグラウンド波長を６３０ｎｍにして、５５０ｎｍでブルーホルマザンの密度を測定した。
結果
ｈＵＴＣ馴化培地は、Ａ２Ｅ含有ＲＰＥ細胞を青色光由来の損傷から保護した。膜不透過性染料Ｄｅａｄ Ｒｅｄ及びＤＡＰＩを含む全ての細胞核を含む標識化細胞によって照射後にＡＲＰＥ−１９の生育可能性を評価した。デジタル画像中で計数された細胞核は、生育可能細胞及び生育不能細胞の百分率を提供した（図１７Ａ〜１７Ｂ）。４３０ｎｍ照明が存在しない場合、１０μＭのＡ２ＥはＡＲＰＥ−１９の生育可能性に影響を全く及ぼさなかった。対照培地を用いてインキュベートされ、４３０ｎｍの照明に曝された細胞は、高レベルの生育不能細胞を示した（約５０％）。対照的に、ｈＵＴＣ馴化培地での処理は、生育不能細胞数の低下をもたらした（約２０％）。
細胞の生育可能性を、健康な細胞がイエローテトラゾリウム塩ＭＴＴをパープルホルマザン結晶に開裂させる能力に基づくＭＴＴアッセイによって更に測定した（図１７Ｃ〜１７Ｄ）。ホルマザンの産生は、培養中の生育可能細胞の数に比例する。対照培地で処理し、光に曝露させたＡＲＰＥ−１９細胞は、１０μＭのＡ２Ｅを加えて光に曝露させなかったＡＲＰＥ−１９細胞と比較して、より低い生育可能性を示した。５％又は１０％のｈＵＴＣ馴化培地で処理した細胞は、対照培地に曝されたものよりも高い生育可能性を示した。
全Ｈ2Ｏ2処理に続いて、ＡＲＰＥ１９細胞の生育可能性を、クリスタルバイオレット及びＭＴＴアッセイによって求めた（図１７Ｅ〜１７Ｆ）。ｈＵＴＣと共培養されたＡＲＰＥ−１９細胞は、１５００μＭのＨ2Ｏ2での処理の後に、未処理対照細胞と比較してより改善された生育可能性を示した。
（実施例６）
分娩後組織からの細胞の誘導
この実施例では、胎盤組織及び臍帯組織由来の分娩後由来細胞の調製について説明する。分娩後臍帯及び胎盤を、満期妊娠又は早期妊娠のいずれかの出産時に得た。細胞は、臍及び胎盤組織の、５つの別個のドナーから採取した。細胞単離の様々な方法を、これらが、１）幹細胞に共通の特性である、異なる表現型を有する細胞へと分化する能力、又は２）他の細胞及び組織に有用な栄養因子を提供する能力、を有する細胞をもたらす能力に関して試験した。
方法及び材料
臍細胞の単離：臍帯は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た。それらの組織は、正常分娩後に得られたものであった。細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。血液及び残渣を除去するために、臍帯を、抗真菌剤及び抗生物質（１００単位／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）））中で洗浄した。次いで、それらの組織を、１５０ｃｍ2の組織培養プレート内で、５０ミリリットルの培地（ＤＭＥＭ−低グルコース又はＤＭＥＭ−高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の存在下、組織が微細なパルプ状へと細断されるまで、機械的に解離させた。細断した組織を、５０ｍＬの円錐管に移した（チューブ１本当り組織約５グラム）。
次いで、それぞれ上述の通りに抗真菌剤及び抗生物質を含有させた、ＤＭＥＭ−低グルコース培地若しくはＤＭＥＭ−高グルコース培地中で、この組織を消化させた。一部の実験では、コラゲナーゼ及びディスパーゼの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコース培地中、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））５００単位／ミリリットル、及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０単位／ミリリットル）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコース中、コラゲナーゼ５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ５０単位／ミリリットル、及びヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）５単位／ミリリットル）。これらの組織、培地、及び消化酵素を収容する円錐管を、２２５ｒｐｍの軌道振とう器（Ｅｎｖｉｒｏｎ（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．））内で２時間、３７℃でインキュベートした。
消化の後、１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、組織を遠心分離して、上清を吸引した。ペレットを、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；規定ウシ血清；ロット番号ＡＮＤ１８４７５（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）））、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１ミリリットル／１００ミリリットルの上述の通りの抗生物質／抗真菌剤を添加した、２０ｍＬの増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に再懸濁させた。この細胞懸濁液を、孔径７０μｍのナイロン細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通して濾過した。増殖培地を含む、追加の５ｍＬの洗液を、濾過器に通過させた。次いで、その細胞懸濁液を、孔径４０μｍのナイロン細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通過させ、続いて、増殖培地の洗液を追加で５ｍＬ通過させた。
この濾液を、増殖培地（総容積５０ｍＬ）に再懸濁させ、１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ｍＬの新鮮増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。このプロセスを、更に２回繰り返した。
最終的な遠心分離の後、上清を吸引して、５ｍＬの新鮮な増殖培地に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー染色を使用して、生育可能細胞の数を判定した。次いで、標準条件下で、細胞を培養した。
臍帯から単離した細胞を、上述の抗生物質／抗真菌剤を含む増殖培地中で、ゼラチンコーティングされたＴ−７５ｃｍ2フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））上に、５，０００細胞／ｃｍ2で播種した。２日後に（各種実験で、細胞は、２〜４日間インキュベートした）、フラスコから、培養に使用された培地を吸引した。ＰＢＳで細胞を３回洗浄して、残渣及び血液由来細胞を除去した。次いで、細胞に、増殖培地を補充して、コンフルエンスまで増殖させ（継代数０から約１０日）、継代数１とした。その後の継代（継代数１から継代数２へ、など）の際には、細胞は、４、５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に到達した。これらの後続の継代に関しては、細胞を５０００細胞／ｃｍ2で播種した。細胞は、５％の二酸化炭素及び大気酸素に設定した加湿インキュベータ内で、３７℃で増殖させた。
胎盤細胞の単離。胎盤組織は、ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ））から得た。それらの組織は、妊婦由来のものであり、通常の外科的分娩時に得たものであった。胎盤細胞を、臍細胞の単離に関して説明されたように、単離した。
以下の実施例は、胎盤組織からの、母体由来細胞及び新生児由来細胞の別個の集団の単離に適用される。
細胞単離プロトコルを、層流フード内で、無菌的に実行した。胎盤組織を、抗真菌剤及び抗生物質（上記）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））中で洗浄して、血液及び残渣を除去した。次いで、その胎盤組織を、３つの切片：上層（新生児側又は新生児態様）、中間層（新生児と母体との混合細胞単離）、及び下層（母体側又は母体態様）へと切り分けた。
分離した切片を、個別に、抗生物質／抗真菌剤を有するＰＢＳ中で数回洗浄して、血液及び残渣を更に除去した。次いで、各切片を、１５０ｃｍ2の組織培養プレート内で、５０ミリリットルのＤＭＥＭ−低グルコースの存在下、微細なパルプへと機械的に解離させた。このパルプを、５０ミリリットル円錐管に移した。各管は、約５グラムの組織を収容するものとした。抗真菌剤及び抗生物質（１００Ｕ／ミリリットルのペニシリン、１００マイクログラム／ミリリットルのストレプトマイシン、０．２５マイクログラム／ミリリットルのアンホテリシンＢ）及び消化酵素を含有する、ＤＭＥＭ−低グルコース培地若しくはＤＭＥＭ−高グルコース培地中で、この組織を消化させた。一部の実験では、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中に、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）を５００単位／ミリリットル、及びディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０単位／ミリリットルで含有する、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素混合物（「Ｃ：Ｄ」）を使用した。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼの混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）を使用した（ＤＭＥＭ−低グルコース中、コラゲナーゼ５００単位／ミリリットル、ディスパーゼ５０単位／ミリリットル、及びヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）５単位／ミリリットル）。これらの組織、培地、及び消化酵素を収容する円錐管を、２２５ｒｐｍの軌道振とう器（Ｅｎｖｉｒｏｎ（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．））内で、３７℃で２時間インキュベートした。
消化の後、１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、組織を遠心分離して、得られた上清を吸引した。ペレットを、ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシンＢを有する２０ミリリットルの増殖培地中に、再懸濁させた。この細胞懸濁液を、７０マイクロメートルのナイロン細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通して濾過し、追加的な５ミリリットルの増殖培地を含む洗液を、続けて通過させた。細胞懸濁液の全体を、４０マイクロメートルのナイロン細胞濾過器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通過させ、追加的な５ミリリットルの増殖培地を、洗液として、続けて通過させた。
この濾液を、増殖培地（総容積５０ｍＬ）に再懸濁させ、１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、遠心分離した。上清を吸引して、５０ミリリットルの新鮮増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させた。このプロセスを、更に２回繰り返した。最終的な遠心分離の後に、上清を吸引して、５ミリリットルの新鮮増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー排除試験を使用して、細胞計数を判定した。次いで、標準条件で、細胞を培養した。
ＬＩＢＥＲＡＳＥ細胞単離：ＬＩＢＥＲＡＳＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ））（２．５ミリグラム／ミリリットルのＢｌｅｎｄｚｙｍｅ３（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ）））及びヒアルロニダーゼ（５単位／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ））を有する、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中で、臍組織から細胞を単離した。組織の消化、及び細胞の単離は、上記の他のプロテアーゼ消化に関する説明と同様であるが、Ｃ：Ｄ又はＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥを使用する組織の消化は、分娩後組織から、容易に増殖する細胞集団の単離をもたらした。
他の酵素の組合せを使用する細胞単離：様々な酵素の組合せを使用して、臍帯から細胞を単離するための手順を比較した。消化に関して比較した酵素には、ｉ）コラゲナーゼ、ｉｉ）ディスパーゼ、ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ、ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）、ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）、ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）、及び、ｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）が含まれた。これらの種々の酵素消化条件を用いて、細胞単離の差異を観察した（表６−１）。
臍帯内残留血液からの細胞の単離：様々なアプローチによって臍帯から細胞のプールを単離するためのその他の試みを実施した。一例では、臍帯を薄切りにして、増殖培地で洗浄し、血餅及びゼラチン状物質を取り除いた。血液、ゼラチン状物質、及び増殖培地の混合物を回収して１．５Ｎ（１５０×ｇ）で遠心分離した。ペレットを再懸濁させ、ゼラチンコーティングされたフラスコ上に、増殖培地中で播種した。これらの実験から、容易に増殖する細胞集団が単離された。
臍帯血からの細胞の単離：細胞を、ＮＤＲＩから入手した臍帯血サンプルからも単離した。ここでの単離プロトコルは、Ｈｏらによる国際特許出願第ＷＯ２００３／０２５１４９号（Ｈｏ，Ｔ．Ｗ．らの「Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ Ｗｈｉｃｈ Ｃｏ−Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＤ４９Ｃ ａｎｄ ＣＤ９０」、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２９９７１号）のプロトコルとした。臍帯血（ＮＤＲｌ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｐａ．））のサンプル（それぞれ、５０ミリリットル及び１０．５ミリリットル）を、溶解緩衝液（濾過除菌された１５５ｍＭの塩化アンモニウム、１０ミリモルの重炭酸カリウム、ｐＨ７．２に緩衝させた０．１ミリモルのＥＤＴＡ（全成分ともＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）より））と混合した。臍帯血と溶解緩衝液との比率１：２０で細胞を溶解させた。得られた細胞懸濁液を、５秒間ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートした。この溶解液を、遠心分離した（２Ｎ（２００×ｇ）で１０分間）。細胞ペレットを、１０パーセントのウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ））、４ミリモルのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ））、１００単位／１００ミリリットルのペニシリン、及び１００マイクログラム／１００ミリリットルのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を含有する、完全最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中に再懸濁させた。再懸濁した細胞を、遠心分離して（２Ｎ（２００×ｇ）で１０分間）、上清を吸引し、完全培地中で細胞ペレットを洗浄した。Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｎ．Ｙ．））、Ｔ７５ラミニンコーティングフラスコ、又はＴ１７５フィブロネクチンコーティングフラスコ（双方ともＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ））内に、細胞を直接播種した。
様々な酵素の組合せ及び増殖条件を用いた細胞の単離：細胞集団を様々な条件下で単離し、単離直後に様々な条件下で増殖することが可能か否かを判定するために、上記の手順に従って、０．００１パーセント（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を含む又は含まない増殖培地中で、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素の組合せを使用して細胞を消化させた。そのように単離した胎盤由来細胞を、様々な条件下で播種した。全ての細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシンの存在下で増殖させた（表６−２）。
種々の酵素の組合せ及び増殖条件を用いた細胞の単離：全ての条件で、細胞は、継代数０〜１の間に、良好に付着かつ増殖した（表６−２）。条件５〜８及び条件１３〜１６の細胞は、播種の後に継代数４まで良好に増殖することが実証され、その時点で、それらの細胞を凍結保存し、バンクした。
結果
様々な酵素の組合せを使用する細胞単離：Ｃ：Ｄ：Ｈの組合せが、単離後に最良の細胞収量をもたらし、他の条件と比較して、より多くの世代にわたって培養下で増殖する細胞を生成した（表６−１）。コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼを単独で使用しても、増殖可能な細胞集団は得られなかった。この結果が、試験したコラーゲンに特異的なものであるか否かを判定する試みは、行わなかった。
Figure 2018500325
 略語：＋＝良好、＋＋＝非常に良好、＋＋＋＝優良、Ｘ＝成功せず
種々の酵素の組合せ及び増殖条件を用いた細胞の単離：細胞は、酵素消化及び増殖に関して試験した全ての条件下で、継代数０〜１の間に、良好に付着して増殖した（表６−２）。実験条件５〜８及び実験条件１３〜１６の細胞は、播種の後、継代数４まで良好に増殖し、その時点で、それらの細胞を凍結保存した。更なる検討のために、全ての細胞を凍結保存した。
Figure 2018500325
臍帯内の残留血液からの細胞の単離：有核細胞が急速に付着及び増殖した。これらの細胞は、フローサイトメトリーによって分析したところ、酵素消化によって得られた細胞と同様であった。
臍帯血からの細胞の単離：これらの調製物は、赤血球及び血小板を含有していた。最初の３週間は、有核細胞が付着及び分裂することはなかった。播種の３週間後に、培地を交換したが、細胞の付着及び増殖は観察されなかった。
要約：細胞集団は、コラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテアーゼ）と、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）と、ヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）との酵素の組み合わせを使用して、臍帯並びに胎盤組織から効率的に誘導することができる。Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅである、ＬＩＢＥＲＡＳＥもまた、使用することができる。具体的には、コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）及びサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）である、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３もまた、細胞を単離するために、ヒアルロニダーゼと共に使用した。これらの細胞は、ゼラチンコーティングされたプラスチック上の増殖培地中で培養した場合、多数の継代にわたって、容易に増殖した。
細胞はまた、臍帯内の残留血液からも単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用した条件下で付着及び増殖する、組織から洗い流された血餅中の細胞の存在は、解剖プロセス中に細胞が遊離することによるものである可能性がある。
（実施例７）
分娩後由来細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、いずれの汚染細胞型も含まない。細胞療法に使用される細胞は、正常な染色体数（４６）及び構造を有するべきである。均質であり、かつ、非分娩後組織起源の細胞を含まない、胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株を同定するために、細胞サンプルの核型を分析した。
方法及び材料
新生男児の分娩後組織由来のＰＰＤＣを、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する増殖培地中で培養した。新生児由来細胞と母体由来細胞（Ｘ，Ｘ）との識別が可能となるように、新生男児由来の分娩後組織（Ｘ，Ｙ）が選択された。細胞を、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））内の増殖培地中に、５，０００細胞／平方センチメートルで播種し、８０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞を収容するＴ２５フラスコは、首部分まで増殖培地で充填した。臨床細胞遺伝学研究所に、急送便でサンプルを配送した（研究所間の推定輸送時間は、１時間である）。細胞は、染色体が最も良好に可視化される、分裂中期の間に分析された。計数した分裂中期の２０個の細胞のうち、５個の細胞を、正常な同種核型数（２）に関して分析した。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合に同種であると特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合に異種であると特徴付けられた。異種性の核型数（４）が同定されると、更なる分裂中期細胞を計数して、分析した。
結果
染色体分析のために送られた全ての細胞サンプルは、正常な様相を呈していると解釈された。分析された１６の細胞株のうちの３つは、新生児起源及び母体起源の双方に由来する細胞の存在を示す、不均質な表現型（ＸＸ及びＸＹ）を呈した（表７−１）。胎盤−Ｎの組織由来の細胞は、胎盤の新生児態様から単離された。継代数０では、この細胞株は、均質なＸＹを表した。しかしながら、継代数９では、この細胞株は、従前には検出されなかった母体起源の細胞の存在を示す、不均質（ＸＸ／ＸＹ）なものであった。
Figure 2018500325
 凡例：Ｎ−新生児側、Ｖ−絨毛領域、Ｍ−母体側、Ｃ−クローン
要約：染色体分析は、臨床細胞遺伝学研究所によって解釈される通り、核型が正常を表す胎盤由来細胞及び臍由来細胞を同定した。核型分析はまた、同種核型により判断される、母体細胞を含まない細胞株も同定した。
（実施例８）
ヒト分娩後由来細胞表面マーカーのフローサイトメトリーによる評価
フローサイトメトリーによる、細胞表面タンパク質又は「マーカー」の特性評価を使用して、細胞株の同一性を判定することができる。この発現の一貫性は、複数のドナーから、並びに種々の処理及び培養条件に曝された細胞において、判定することができる。胎盤及び臍から単離された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）株を、（フローサイトメトリーによって）特徴付けして、これらの細胞株の同定に関するプロファイルを提供した。
方法及び材料
培地及び培養容器：ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｒｌｓｂａｄ（Ｃａｌｉｆ．））中で、細胞を培養した。血漿処理されたＴ７５、Ｔ１５０、及びＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））内で、細胞をコンフルエントまで培養した。２％（ｗ／ｖ）のゼラチン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を、室温で２０分間インキュベートすることによって、これらのフラスコの増殖表面をゼラチンでコーティングした。
抗体染色及びフローサイトメトリー分析：フラスコ内の付着細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ中に、１×１０7／ミリリットルの細胞濃度で再懸濁させた。製造元の仕様書に従って、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（下記参照）を添加し、その混合物を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合の抗体を除去した。５００μＬのＰＢＳ中に、細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）計器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して実施した。表８−１は、使用された細胞表面マーカーに対する抗体を一覧で示す。
Figure 2018500325
胎盤と臍との比較：胎盤由来細胞を、継代数８で、臍由来細胞と比較した。
継代間の比較：胎盤由来細胞及び臍由来細胞を、継代数８、１５、及び２０で分析した。
ドナー間の比較：ドナー間の差異を比較するために、様々なドナーからの胎盤由来細胞を互いに比較し、また、様々なドナーからの臍由来細胞を互いに比較した。
表面コーティングの比較：ゼラチンコーティングフラスコ上で培養した胎盤由来細胞を、非コーティングフラスコ上で培養した胎盤由来細胞と比較した。ゼラチンコーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞を、非コーティングフラスコ上で培養した臍由来細胞と比較した。
消化酵素の比較：細胞の単離及び調製に関して使用される、４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ、２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ、３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ、及び４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼを用いる処理によって胎盤から単離された細胞を比較した。
胎盤の層の比較：胎盤組織の母体態様由来の細胞を、胎盤組織の絨毛領域由来の細胞、及び胎盤の新生胎児態様由来の細胞と比較した。
結果
胎盤と臍との比較：フローサイトメトリーによって分析された、胎盤由来細胞及び臍由来細胞は、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値によって示される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの検出可能な発現に関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と同等の蛍光値によって示された。陽性曲線の蛍光値の変動を考慮した。陽性曲線の平均（すなわち、ＣＤ１３）及び範囲（すなわち、ＣＤ９０）は、ある程度の変動を示したが、これらの曲線は、正常であると考えられ、均質な集団であることが確認された。双方の曲線が、それぞれＩｇＧ対照よりも高い値を示した。
継代間の比較−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、継代数８、１５、及び２０での胎盤由来細胞は、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値に反映されるように、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に関して、全て陽性であった。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有した。
継代間の比較−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、継代数８、１５、及び２０での臍由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、これは、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光によって示された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。
ドナー間の比較−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、別個のドナーから単離された胎盤由来細胞は、それぞれＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値を有した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であった。
ドナー間の比較−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された、別個のドナーから単離された臍由来細胞は、それぞれＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値に反映される、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
胎盤由来細胞に対する、ゼラチンによる表面コーティングの効果：フローサイトメトリーによって分析された、ゼラチンコーティングフラスコ又は非コーティングフラスコ上のいずれかで増殖させた胎盤由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、これは、ＩｇＧ対照と比較して高い蛍光値に反映された。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、このことは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示された。
臍由来細胞に対する、ゼラチンによる表面コーティングの効果：フローサイトメトリーによって分析された、ゼラチンフラスコ及び非コーティングフラスコ上で増殖させた臍由来細胞は、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現に関して陽性であり、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値を有した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であり、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値を有していた。
細胞表面マーカープロファイルに対する、細胞の調製に使用される酵素消化手順の効果：フローサイトメトリーによって分析された、様々な消化酵素を使用して単離した胎盤由来細胞は、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値によって示されるように、全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であった。
胎盤の層の比較：フローサイトメトリーによって分析された、胎盤の母体層、絨毛層、及び新生児層から単離した細胞はそれぞれ、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値によって示されるように、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの陽性発現を示した。これらの細胞は、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値によって示されるように、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現に関しては陰性であった。
要約：フローサイトメトリーによる、胎盤由来細胞及び臍由来細胞の分析により、これらの細胞株の同一性が確立された。胎盤由来細胞及び臍由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、及びＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関しては陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関しては陰性である。この同一性は、ドナー、継代数、培養容器の表面コーティング、消化酵素、及び胎盤の層を含む変数が変動しても、一貫していた。個々の蛍光値ヒストグラム曲線の平均及び範囲には、ある程度の変動が観察されたが、全ての試験条件下での、全ての陽性曲線は正常であり、発現した蛍光値は、ＩｇＧ対照よりも大きく、それゆえ、これらの細胞が、マーカーの陽性発現を有する均質な集団を含むことが確認された。
（実施例９）
分娩後組織表現型の、免疫組織化学的な特性評価
ヒト分娩後組織、すなわち臍帯及び胎盤内に見いだされる細胞の表現型を、免疫組織化学によって分析した。
方法及び材料
組織の調製。ヒト臍帯組織及びヒト胎盤組織を採取して、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中に、４℃で一晩浸漬固定した。免疫組織化学は、以下のエピトープに対する抗体を使用して実行した：ビメンチン（１：５００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）））、デスミン（１：１５０、ウサギに対して産生（Ｓｉｇｍａ）、又は１：３００、マウスに対して産生（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ）））、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００（Ｓｉｇｍａ））、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００（ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ）））。更に、以下のマーカーを試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ）））、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ）））、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ））、及び抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ））。固定標本を外科用メスを使用してトリミングし、エタノールを含有するドライアイス浴上の、ＯＣＴ包理化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆ．）））内に定置した。次いで、凍結ブロックを、一般的クライオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して切片（厚さ１０μｍ）とし、染色のためにスライドガラス上に載置した。
免疫組織化学：免疫組織化学は、従来の研究（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａら（２００３）、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１８４：８１６〜８２９）と同様に実行した。組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃ ｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ）））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に１時間曝した。目的のエピトープが細胞表面上に局在している場合には（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）、エピトープの減少を防ぐため、この手順の全ての工程でＴｒｉｔｏｎを省いた。更に、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）に対して産生された場合には、手順全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で４時間にわたって、これらの切片に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ）））及び／若しくはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））、又はロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に加えてブロックを含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。培養物を洗浄し、１０μＭ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間用い、細胞核を可視化した。
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。陽性染色は、対照染色を上回る蛍光シグナルによって表された。例示的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、階層モンタージュを準備した。
結果
臍帯の特性評価：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４マーカーは、臍帯内で見出される細胞のサブセット内で発現した。具体的には、ｖＷＦ及びＣＤ３４の発現は、臍帯内部に含まれる血管に限定されていた。ＣＤ３４＋細胞は、最内層（内腔側）に存在した。ビメンチンの発現は、臍帯のマトリックス及び血管の全域に見られた。ＳＭＡは、動脈及び静脈の、マトリックス及び外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８及びデスミンは、血管内部のみに観察され、デスミンは、中層及び外層に限定された。
胎盤の特性評価：ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦ、及びＣＤ３４は全て、胎盤内部で観察され、かつ領域特異的であった。
ＧＲＯα、ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、及びＮＯＧＯ−Ａの組織発現：これらのマーカーのいずれも、臍帯組織又は胎盤組織内部では観察されなかった。
要約：ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、ヴォン・ヴィレブランド因子、及びＣＤ３４は、ヒト臍帯及びヒト胎盤内部の細胞内で発現する。
（実施例１０）
オリゴヌクレオチドアレイを使用した分娩後組織由来細胞の分析
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰアレイを使用して、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、及びヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析により、分娩後由来細胞の特性評価が提供され、これらの細胞に関係する固有の分子マーカーが同定された。
方法及び材料
細胞の単離及び培養：ヒト臍帯及びヒト胎盤は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．））より、患者の同意を得て、正常な満期分娩から得た。これらの組織を受け取り、実施例６で説明されるように、細胞を単離した。細胞は、増殖培地（ＤＭＥＭ−ＬＧを使用）により、組織培養用ゼラチンコーティングプラスチックフラスコ上で培養した。この培養物を、５％のＣＯ2を使用して、３７℃でインキュベートした。
ヒト皮膚線維芽細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ；ロット番号９Ｆ０８４４）及びＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）より購入した。双方の株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中で培養した。これらの細胞は、標準的な組織処理プラスチック上で増殖させた。
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ；ロット番号２Ｆ１６５５、２Ｆ１６５６、及び２Ｆ１６５７）より購入し、製造元の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で培養した。これらの細胞は、５％のＣＯ2を使用して、３７℃で、標準的な組織培養プラスチック上で増殖させた。
ヒト腸骨稜の骨髄は、患者の同意を得て、ＮＤＲＩより提供された。この骨髄を、Ｈｏらによって概説される方法（国際公開第ＷＯ００３／０２５１４９号）に従って処理した。この骨髄を、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ3、及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、骨髄１部対溶解緩衝液２０部の比率で混合した。この細胞懸濁液を、ボルテックス攪拌して、周囲温度で２分間インキュベートし、５Ｎ（５００xｇ）で１０分間、遠心分離した。上清を廃棄して、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清及び４ｍＭグルタミンを添加した最小必須培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、細胞ペレットを再懸濁させた。これらの細胞を、再び遠心分離して、新鮮培地中に細胞ペレットを再懸濁させた。トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））を使用して、生育可能な単核細胞を計数した。これらの単核細胞を、組織培養プラスチックフラスコ内に、５×１０4細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、標準大気Ｏ2又は５％Ｏ2のいずれかで、５％ＣＯ2を使用して、３７℃でインキュベートした。培地を交換することなく、細胞を５日間培養した。５日間の培養の後、培地及び非付着細胞を除去した。付着細胞を培養下に維持した。
ｍＲＮＡの単離、及びＧＥＮＥＣＨＩＰ分析：活発に増殖する細胞の培養物を、冷ＰＢＳ中で、セルスクレーパーを使用してフラスコから取り出した。これらの細胞を、３Ｎ（３００xｇ）で５分間、遠心分離した。上清を除去して、新鮮なＰＢＳ中に細胞を再懸濁させ、再び遠心分離した。上清を除去して、細胞ペレットを直ちに凍結させ、−８０℃で保存した。細胞のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡへと転写させ、次いで、このｃＤＮＡをｃＲＮＡへと転写させ、ビオチンで標識した。このビオチン標識ｃＲＮＡを、ＨＧ−Ｕ１３３Ａ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ Ｃａｌｉｆ．））とハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーション及びデータ収集は、製造元の仕様書に従って実行した。分析は、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピュータソフトウェア（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｔｕｓｈｅｒ，Ｖ．Ｇ．ら（２００１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：５１１６−５１２１）を使用して実施した。
結果
１４の異なる細胞の集団を分析した。これらの細胞を、継代情報、培養基質、及び培養培地と共に、表１０−１に列記する。
Figure 2018500325
データは、これらの細胞で示差的に発現した２９０の遺伝子を分析する、主成分分析によって評価した。この分析により、集団間の類似性に関する、相対的な比較が可能となる。
表１０−２は、細胞対の比較のために計算された、ユークリッド距離を示す。これらのユークリッド距離は、細胞型間で示差的に発現した２９０の遺伝子に基づく、細胞の比較に基づいたものである。ユークリッド距離は、２９０の遺伝子の発現間の類似性に反比例する（すなわち、距離が大きくなるほど、存在する類似性が少なくなる）。
Figure 2018500325
表１０−３、１０−４、及び表１０−５は、胎盤由来細胞内で増大した遺伝子の発現（表１０−３）、臍由来細胞内で増大した遺伝子の発現（表１０−４）、並びに臍由来細胞及び胎盤由来細胞内で低減した遺伝子の発現（表１０−５）を示す。「プローブセットＩＤ」と題される縦列は、チップ上の特定の部位上に配置される、いくつかのオリゴヌクレオチドプローブのセットに関する製造元の識別コードを指し、これらのプローブのセットは、ＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ）データベース内の指定の受託番号（縦列「ＮＣＢＩ受託番号」）で見出され得る配列を含む、命名された遺伝子（縦列「遺伝子名」）とハイブリダイズする。
Figure 2018500325
Figure 2018500325
Figure 2018500325
Figure 2018500325
表１０−６、表１０−７、及び表１０−８は、ヒト線維芽細胞（表１０−６）、ＩＣＢＭ細胞（表１０−７）、及びＭＳＣ（表１０−８）内で増加した、遺伝子の発現を示す。
Figure 2018500325
Figure 2018500325
Figure 2018500325
要約：本検査は、臍帯及び胎盤由来の分娩後細胞の分子特性評価を提供するために実施された。この分析は、３つの異なる臍帯及び３つの異なる胎盤に由来する細胞を含んだ。この検査にはまた、皮膚線維芽細胞の２つの異なる株、間葉系幹細胞の３つの株、及び腸骨稜骨髄細胞の３つの株も含めた。これらの細胞が発現したｍＲＮＡを、２２，０００の遺伝子プローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを使用して解析した。結果、これら５つの異なる細胞型において、２９０の遺伝子が示差的に発現することが示された。これらの遺伝子には、胎盤由来細胞内で特異的に増加した１０の遺伝子、及び臍帯由来細胞内で特異的に増加した７の遺伝子が含まれる。他の細胞型と比較して、胎盤及び臍帯内では、５４の遺伝子が、特異的に低い発現レベルを有することが判明した。選択された遺伝子の発現が、ＰＣＲによって確認されている（以下の実施例を参照）。これらの結果は、これらの分娩後由来細胞が、例えば、骨髄由来細胞及び線維芽細胞と比較して、明確に識別可能な遺伝子発現プロファイルを有することを実証している。
（実施例１１）
分娩後由来細胞中の細胞マーカー
前述の実施例では、ヒト胎盤由来細胞とヒト臍帯由来細胞との類似性及び相違を、それらの遺伝子発現プロファイルを、他の供給源由来の細胞の遺伝子発現プロファイルと比較することによって（オリゴヌクレオチドアレイを使用して）評価した。６つの「シグネチャー」遺伝子（酸化ＬＤＬ受容体１、インターロイキン−８、レンニン、レチクロン、ケモカイン受容体リガンド３（ＣＸＣリガンド３）、及び顆粒球走化性タンパク質２（ＧＣＰ−２））が同定された。これらの「シグネチャー」遺伝子は、分娩後由来細胞中で比較的高レベルで発現していた。
この実施例で説明される手順は、マイクロアレイデータを検証して、遺伝子とタンパク質発現との間の一致／不一致を見出すと共に、胎盤由来細胞及び臍由来細胞に関する一意的識別子を検出するための、信頼性の高い一連のアッセイを確立するために実施された。
方法及び材料
細胞：ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ内で、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地中で増殖された胎盤由来細胞（核型分析によって主に新生児であると同定された１つの単離株を含む、３つの単離株）、臍由来細胞（４つの単離株）、及び正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ、新生児及び成人）。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、間葉系幹細胞増殖培地Ｂｕｌｌｅｔキット（ＭＳＣＧＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）））中で増殖させた。
ＩＬ−８プロトコルに関しては、細胞を液体窒素から解凍して、ゼラチンコーティングフラスコ内に、５，０００細胞／ｃｍ2でプレーティングして、増殖培地中で４８時間増殖させ、続いて、更に８時間、１０ミリリットルの血清飢餓培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））、及び０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））中で増殖させた。この処理の後、ＲＮＡを抽出して、１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、上清を遠心分離することにより、細胞残渣を除去した。続いて、ＥＬＩＳＡ分析のために、上清を−８０℃で冷凍した。
ＥＬＩＳＡアッセイのための細胞培養：胎盤及び臍由来の分娩後細胞、並びにヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコーティングされたＴ７５フラスコ内の増殖培地中で培養した。継代数１１で、液体窒素中で細胞を凍結させた。細胞を解凍して、１５ｍＬ遠心管に移した。１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間の遠心分離後、上清を廃棄した。４ｍＬの培養培地中に、細胞を再懸濁させ、計数した。１５ｍＬの増殖培地を収容する７５ｃｍ2フラスコ内で、３７５，０００細胞／フラスコで、細胞を２４時間生育させた。この培地を、８時間かけて血清飢餓培地に交換した。インキュベーション終了時に、血清飢餓培地を回収し、１３７Ｎ（１４，０００×ｇ）で５分間、遠心分離した（続いて−２０℃で保存した）。
各フラスコ内の細胞の数を概算するために、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を、各フラスコに添加した。フラスコから細胞を剥離した後、８ｍＬの増殖培地によりトリプシン活性を中和した。細胞を１５ｍＬ遠心管に移し、１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、遠心分離した。上清を除去し、各管に１ｍＬの増殖培地を添加して、細胞を再懸濁した。血球計数器を使用して、細胞数を概算した。
ＥＬＩＳＡアッセイ：細胞によって血清飢餓培地中へ分泌されたＩＬ−８の量を、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ．）を使用して分析した。全てのアッセイは、製造元によって提供される使用説明書に従って試験した。
合計ＲＮＡ単離：コンフルエントな分娩後由来細胞及び線維芽細胞から、あるいはＩＬ−８の発現のために上記のように処理した細胞から、ＲＮＡを抽出した。製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ）））に従って、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））を含有する３５０μＬの緩衝液ＲＬＴを使用し、細胞を溶解した。製造者の指示に従って（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ）））ＲＮＡを抽出して、ＤＮアーゼ処理（２．７Ｕ／サンプル）（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ））に供した。５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水を使用して、ＲＮＡを溶出させ、−８０℃で保存した。
逆転写：ヒト胎盤及びヒト臍からもＲＮＡを抽出した。２−メルカプトエタノールを含む７００μＬの緩衝ＲＬＴ中に、組織（３０ｍｇ）を懸濁させた。サンプルを機械的に均質化し、製造元の仕様書に従って、ＲＮＡの抽出を進めた。５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水を使用して、ＲＮＡを抽出し、−８０℃で保存した。ランダムヘキサマーをＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））とともに使用し、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＲＮＡを逆転写した。サンプルを、−２０℃で保存した。
ｃＤＮＡマイクロアレイによって分娩後細胞内で特異的に調節されていると同定された遺伝子（酸化ＬＤＬ受容体、インターロイキン−８、レンニン、及びレチクロンを含むシグネチャー遺伝子）を、リアルタイムＰＣＲ及び従来のＰＣＲを使用して、更に検討した。
リアルタイムＰＣＲ：Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（登録商標）遺伝子発現製品を使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実行した。酸化ＬＤＬ受容体（Ｈｓ００２３４０２８）、レンニン（Ｈｓ００１６６９１５）、レチクロン（Ｈｓ００３８２５１５）、ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）、ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）、ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）、及びＧＡＰＤＨ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））を、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７０００ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））を備えた７０００配列検出システムを使用して、製造元の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））に従って、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータは、製造元の仕様書（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システムに関する、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓによるＵｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃２）に従って分析した。
従来のＰＣＲ：ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ，ＵＳＡ））を使用して、従来のＰＣＲを実行することにより、リアルタイムＰＣＲからの結果を確認した。ＰＣＲは、２マイクロリットルのｃＤＮＡ溶液、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．））、及び９４℃で５分間の初期変性を用いて実行した。各プライマーセットに関して、増幅を最適化させた。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、及びレチクロンの場合（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を３０サイクル）、レンニンの場合（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を３８サイクル）、酸化ＬＤＬ受容体及びＧＡＰＤＨの場合（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、及び７２℃で３０秒間を３３サイクル）。増幅に使用したプライマーを、表１１−１に掲載する。最終ＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、１μＭとしたが、ただし、ＧＡＰＤＨに関しては、０．５μＭとした。ＧＡＰＤＨプライマーは、リアルタイムＰＣＲと同じものとしたが、ただし、製造元のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、最終ＰＣＲ反応に加えなかった。２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上に各試料を流し、臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ，（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））で染色した。画像を、６６７Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｗｉｎｐａｃｋフィルム（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．））を用いる焦点距離ポラロイド（登録商標）カメラ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．））を用いて取り込んだ。
Figure 2018500325
免疫蛍光：ＰＰＤＣを室温にて１０分間、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））を使用して固定した。継代数０（Ｐ０）（単離直後）及び継代数１１（Ｐ１１）の、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の単離株をそれぞれ１つずつ（胎盤由来細胞の単離株が２つ、臍由来細胞の単離株が２つ）と、線維芽細胞（Ｐ１１）と、を使用した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対する抗体を用いて行った：ビメンチン（１：５００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））、デスミン（１：１５０（Ｓｉｇｍａ）、ウサギに対して産生；又は１：３００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、マウスに対して産生）、α−平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００（Ｓｉｇｍａ））、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ；１：２００（Ｓｉｇｍａ））、及びＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；（ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ））。更に、次のマーカーも継代１１の分娩後細胞に対して試験した：抗ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．））、抗ヒトＧＣＰ−２（１：１００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆ．））、抗ヒト酸化ＬＤＬ受容体１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ））、及び抗ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ））。
培養物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））を含むタンパク質ブロッキング溶液に３０分間曝した。目的のエピトープが、細胞表面（ＣＤ３４、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）上に位置している場合には、エピトープの損失を防ぐために、この手順の全ての工程で、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を省略した。更には、一次抗体がヤギに対して産生された場合には（ＧＣＰ−２、ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１、ＮＯＧＯ−Ａ）、全体を通して、ヤギ血清の代わりに、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清を使用した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））及び／若しくはヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））、又はロバ抗ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に加えてブロックを含む二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ（登録商標）倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。例示的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。続いて、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ））を使用して、階層モンタージュを準備した。
ＦＡＣＳ分析のための細胞の調製：フラスコ内の付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を用いて剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０ ７／ミリリットルの細胞濃度で再懸濁させた。１００μＬのアリコートを、円錐管に移した。細胞内抗原が染色された細胞に対して、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ））によって透過処理した。製造者の使用説明書に従い、アリコートに抗体を加え、これらの細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して過剰の抗体を除去した。二次抗体試験用の細胞を、１００μＬの３％ＦＢＳ中に再懸濁させた。二次抗体を製造業者の使用説明書に従って添加し、細胞を暗所にて４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、過剰な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を、０．５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、フローサイトメトリーによって分析した。以下の抗体を使用した：酸化ＬＤＬ受容体１（ｓｃ−５８１３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ））、ＧＲＯａ（５５５０４２（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ））、マウスＩｇＧ１κ（Ｐ−４６８５及びＭ−５２８４（Ｓｉｇｍａ））、ロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ））。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して実行した。
結果
ヒト胎盤、成体及び新生児線維芽細胞、並びに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から誘導された細胞由来のｃＤＮＡに対して実行した、選択された「シグネチャー」遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、胎盤由来細胞内では、酸化ＬＤＬ受容体及びレンニンの両方が、他の細胞と比較してより高レベルで発現したことを示す。このリアルタイムＰＣＲから得られたデータを、ＡＡＣＴ法によって分析し、対数目盛上に表した。レチクロン及び酸化ＬＤＬ受容体の発現のレベルは、他の細胞と比較して、臍由来細胞内で高かった。分娩後由来細胞と、対照との間で、ＣＸＣリガンド３及びＧＣＰ−２の発現レベルに有意差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果を、従来のＰＣＲによって確認した。ＰＣＲ産物の配列決定により、これらの観察結果が更に立証された。分娩後由来細胞と、上記の表１１−１で示す従来のＰＣＲのＣＸＣリガンド３プライマーを使用した対照と、の間には、ＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意な差は存在しなかった。
分娩後のサイトカイン、ＩＬ−８の産生は、増殖培地で培養した細胞、及び血清飢餓分娩後由来細胞の双方で増加した。リアルタイムＰＣＲの全データは、従来のＰＣＲで、またＰＣＲ産物を配列決定することによって立証された。
無血清培地中で増殖させた細胞の上清を、ＩＬ−８の存在に関して検査したところ、臍細胞由来の培地、及び一部の胎盤細胞の単離株由来の培地中で、最高量が検出された（表１１−２）。ヒト皮膚線維芽細胞由来の培地からはＩＬ−８は検出されなかった。
Figure 2018500325
 ＮＤ：検出されず
胎盤由来細胞はまた、ＦＡＣＳ分析によって、酸化ＬＤＬ受容体、ＧＣＰ−２、及びＧＲＯαの産生に関しても検査された。細胞の試験結果は、ＧＣＰ−２陽性を示した。酸化ＬＤＬ受容体及びＧＲＯは、この方法によっては検出されなかった。
胎盤由来細胞はまた、免疫細胞化学分析によって、選択されたタンパク質の産生に関しても試験された。単離の直後（継代数０）に、ヒト胎盤由来細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、６つのタンパク質、すなわち、ヴォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、及びビメンチンに関する抗体に曝した。細胞は、α−平滑筋アクチン及びビメンチンの双方に関して陽性染色された。このパターンは、継代数１１まで保持された。継代数０での少数の細胞（＜５％）のみが、サイトケラチン１８に関して陽性染色された。
継代０でのヒト臍帯由来細胞を、選択されたタンパク質の産生に関して、免疫細胞化学分析によって調べた。単離の直後（継代数０）に、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、６つのタンパク質、すなわち、ヴォン・ヴィレブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、及びビメンチン、の抗体に曝した。臍由来細胞は、α−平滑筋アクチン及びビメンチンに関して陽性であり、この染色パターンは、継代数１１まで一貫していた。
要約：マイクロアレイ及びＰＣＲ（リアルタイム及び従来の両方）によって測定される遺伝子発現レベル間の一致が、酸化ＬＤＬ受容体１、レンニン、レチクロン、及びＩＬ−８の４遺伝子に関して立証された。これらの遺伝子の発現は、ＰＰＤＣにおいてｍＲＮＡレベルで異なる調節をなされ、ＩＬ−８はまた、タンパク質レベルでも異なる調節をされていた。酸化ＬＤＬ受容体の存在は、胎盤由来細胞内では、ＦＡＣＳ分析によって、タンパク質レベルでは検出されなかった。ＧＣＰ−２及びＣＸＣリガンド３の示差的発現は、ｍＲＮＡレベルでは確認されなかったが、しかしながら、ＧＣＰ−２は、胎盤由来細胞内で、ＦＡＣＳ分析によって、タンパク質レベルで検出された。この結果は、マイクロアレイ実験から最初に得られたデータには反映されていないが、これは、それらの方法の感度の差異が原因であった可能性がある。
単離の直後（継代数０）に、ヒト胎盤由来細胞は、α−平滑筋アクチン及びビメンチンの双方に関して陽性染色された。このパターンはまた、継代数１１の細胞内でも観察された。ビメンチン及びα−平滑筋アクチンの発現は、増殖培地中、これらの手順で用いられる条件下で継代する細胞内で保持され得る。継代数０でのヒト臍帯由来細胞を、α−平滑筋アクチン及びビメンチンの発現に関して調べたところ、双方に関して陽性であった。この染色パターンは、継代数１１まで保持された。
（実施例１２）
分娩後由来細胞のインビトロでの免疫学的評価
存在する場合には、インビボ移植時に分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）が誘導する免疫応答を予測する目的で、ＰＰＤＣ細胞をそれらの免疫学的特性に関してインビトロで評価した。ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の存在に関して、ＰＰＤＣを、フローサイトメトリーによってアッセイした。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰｅ）によって発現され、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の直接刺激のために必要とされる（Ａｂｂａｓ＆Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ Ｅｄ．（２００３）Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１）。これらの細胞株を、更に、ＨＬＡ−Ｇの発現に関しても、フローサイトメトリーによって分析した（Ａｂｂａｓ＆Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２００３）、上記参照）、ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓら（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２４，１８５〜１９６）、及びＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ＆Ｌｉｃｈｔｍａｎ（２００３）、上記参照、Ｂｒｏｗｎら（２００３）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７０、１２５７〜１２６６）。胎盤組織内に存在する細胞による、これらのタンパク質の発現は、子宮内の胎盤組織の免疫特権状態を媒介すると考えられる。胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株が、インビボで免疫反応を誘発する程度を予測するために、それらの細胞株を、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験した。
方法及び材料
細胞培養：細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン含有増殖培地中で、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））でコーティングしたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．））でコンフルエンスまで培養した。
抗体染色：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））で細胞を洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｍｏ．））を使用して剥離させた。細胞を採取して、遠心分離し、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに、１×１０7／ミリリットルの細胞濃度で再懸濁させた。製造業者の仕様書に従って、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に抗体（表１２−１）を添加して、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離することにより、非結合の抗体を除去した。５００μＬのＰＢＳに細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）計器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
Figure 2018500325
混合リンパ球反応：細胞株Ａとして標識される継代数１０の臍由来細胞、及び細胞株Ｂとして標識される継代数１１の胎盤由来細胞の凍結保存バイアルを、ドライアイス梱包してＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ（Ｑｕｅｂｅｃ））に送付し、ＣＴＢＲ ＳＯＰ Ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いて混合リンパ球反応を実施した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、複数の男性及び女性のボランティアドナーから収集した。刺激者（ドナー）同種異系ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、及び分娩後細胞株を、マイトマイシンＣで処理した。自家のものであり、マイトマイシンＣ処理した刺激細胞を、応答者（レシピエント）ＰＢＭＣに添加して、４日間培養した。インキュベーション後、各サンプルに［3Ｈ］チミジンを添加して、１８時間培養した。これらの細胞を採取した後に、放射標識ＤＮＡを抽出し、シンチレーション計数器を使用して、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。
同種異系ドナーに関する刺激指数（ＳＩＡＤ）は、受容者＋マイトマイシンＣ処理同種異系ドナーの平均増殖を、受容者のベースライン増殖によって除算したものとして、計算した。ＰＰＤＣの刺激指数は、受容者＋マイトマイシンＣ処理分娩後細胞株の平均増殖を、受容者のベースライン増殖によって除算したものとして算出した。
結果
混合リンパ球反応−胎盤由来細胞：７人のヒトボランティア血液ドナーをスクリーニングして、他の６人の血液ドナーとの混合リンパ球反応で旺盛な増殖反応を呈する、１人の同種異系ドナーを同定した。このドナーを、同種異系陽性対照ドナーとして選択した。残りの６つの血液ドナーを、レシピエントとして選択した。同種異系陽性対照ドナー及び胎盤由来細胞株を、マイトマイシンＣで処理し、６つの個々の同種異系受容者との混合リンパ球反応下で培養した。反応は、プレート当り３つの受容者を入れた細胞培養プレートを２つ使用して、三重反復で実施した（表１２−２）。平均刺激指数は、１．３（プレート２）〜３（プレート１）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は、４６．２５（プレート２）〜２７９（プレート１）の範囲であった（表１２−３）。
Figure 2018500325
Figure 2018500325
Figure 2018500325
混合リンパ球反応−臍由来細胞：６人のヒトボランティア血液ドナーをスクリーニングして、他の５人の血液ドナーとの混合リンパ球反応で旺盛な増殖反応を呈する、１人の同種異系ドナーを同定した。このドナーを、同種異系陽性対照ドナーとして選択した。残りの５つの血液ドナーを、レシピエントとして選択した。同種異系陽性対照ドナー及び胎盤細胞株を、マイトマイシンＣ処理して、５つの個々の同種異系受容者との混合リンパ球反応下で培養した。反応は、プレート当り３つの受容者を入れた細胞培養プレートを２つ使用して、三重反復で実施した（表１２−４）。平均刺激指数は、６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種異系ドナー陽性対照は、４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表１２−５）。
Figure 2018500325
Figure 2018500325
Figure 2018500325
抗原提示細胞マーカー−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の陰性発現を示し、これは、胎盤細胞株が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を直接刺激するのに必要な細胞表面分子を欠いていることを示す。
免疫調節マーカー−胎盤由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された胎盤由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値により示されるＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、また、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＣＤ１７８及びＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
抗原提示細胞マーカー−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された臍由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の陰性発現を示し、これは、臍細胞株が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を直接刺激するのに必要な細胞表面分子を欠いていることを示す。
免疫調節細胞マーカー−臍由来細胞：フローサイトメトリーによって分析された臍由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と比較してより高い蛍光値によって認められるＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、また、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値によって認められるＣＤ１７８及びＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示す。
要約：胎盤由来細胞系統で行った混合リンパ球反応では、平均刺激指数は１．３〜３の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は４６．２５〜２７９の範囲であった。臍由来細胞株を使用して実施された混合リンパ球反応では、平均刺激指数は、６．５〜９の範囲であり、同種異系陽性対照の平均刺激指数は、４２．７５〜７０の範囲であった。胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株は、フローサイトメトリーによって測定されたように、刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２の発現に関しては陰性であった。胎盤由来細胞株及び臍由来細胞株は、フローサイトメトリーによって測定されたように、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−Ｇ及びＣＤ１７８の発現に関しては陰性であり、ＰＤ−Ｌ２の発現に関しては陽性であった。同種異系ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８、ＣＤ８６、及びＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含むことにより、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激が可能となる。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の直接刺激に必要とされる、胎盤由来細胞及び臍由来細胞上の抗原提示細胞表面分子の不在、並びに免疫調節タンパク質であるＰＤ−Ｌ２の存在は、ＭＬＲにおいてこれらの細胞が示す、同種異系対照と比較してより低い刺激指数の原因となり得る。
（実施例１３）
分娩後由来細胞による栄養因子の分泌
胎盤由来細胞及び臍由来細胞由来の選択された栄養因子の分泌を測定した。検出のために選択された因子としては、（１）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎら（１９９７）Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２：２１５−２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）（Ｓａｌｃｅｄｏら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９６；３４〜４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）（Ｌｉら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３３６９〜７６）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓら（２００４）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７７：８１２〜８）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン−２（ＡＮＧ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α）などの、脈管形成活性を有することが知られているもの、（２）脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇら（２００３）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５８；３１９〜３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、トランスフォーミング増殖因子β２（ＴＧＦβ２）などの、神経栄養／神経保護活性を有することが知られているもの、並びに（３）マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１ａ）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１ｂ）、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性化時調節正常Ｔ細胞発現及び分泌物）、Ｉ３０９、胸腺および活性化調節ケモカイン（ＴＡＲｅ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）などの、ケモカイン活性を有することが知られているもの、が含まれた。
方法及び材料
細胞培養：胎盤及び臍由来のＰＰＤＣ、並びにヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコーティングＴ７５フラスコ上の、ペニシリン／ストレプトマイシンを含む増殖培地で培養した。継代数１１で、細胞を凍結保存し、液体窒素中で保存した。細胞の解凍後、それらの細胞に増殖培地を添加し、その後、１５ｍＬ遠心管に移して、１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、それらの細胞を遠心分離した。上清を廃棄した。４ｍＬの増殖培地中に、細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を計数した。１５ミリリットルの増殖培地を収容する、７５ｃｍ2のフラスコあたり３７５，０００細胞で細胞を播種し、２４時間培養した。この培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））に替え、８時間培養した。インキュベーションの終了時に、１３７Ｎ（１４，０００×ｇ）で５分間の遠心分離によって、無血清馴化培地を収集し、−２０℃で保存した。
各フラスコ内の細胞の数を概算するために、ＰＢＳで細胞を洗浄し、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離させた。８ｍＬの増殖培地を添加し、トリプシン活性を抑制した。１．５Ｎ（１５０×ｇ）で５分間、細胞を遠心分離した。上清を除去し、１ｍＬの増殖培地中に、細胞を再懸濁させた。血球計数器を使用して、細胞数を概算した。
ＥＬＩＳＡアッセイ：細胞を３７℃、５％二酸化炭素及び大気酸素下で増殖させた。胎盤由来細胞（バッチ１０１５０３）は、５％酸素又はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）下でも増殖させた。各細胞サンプルにより産生されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、及びＴＧＦ−β２の量をＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎ））により測定した。全てのアッセイは、製造元の使用説明書に従って実行した。
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ：ケモカイン（ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、及び血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦ）を、ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）プロテオームアレイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を用いて測定した。このプロテオームアレイは、１ウェル当り２〜１６のタンパク質を定量測定するための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。これらのアレイは、９６ウェルプレートの各ウェルに、２×２、３×３、又は４×４パターンの４〜１６の異なる捕捉抗体をスポットすることにより作製される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後に、プレート全体を画像化して、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された、化学発光シグナルを捕捉する。各スポット内で生成されるシグナルの量は、元の標準又はサンプル中の、標的タンパク質の量に比例する。
結果
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＭＣＰ−１及びＩＬ−６は、胎盤由来細胞及び臍由来細胞、並びに皮膚線維芽細胞により分泌された（表１３−１）。ＳＤＦ−１αは、５％Ｏ２中で培養された胎盤由来細胞、及び線維芽細胞により分泌された。ＧＣＰ−２及びＩＬ−８は、臍由来細胞により、及びＢＭＥ又は５％Ｏ2の存在下で培養された胎盤由来細胞により分泌された。ＧＣＰ−２はまた、ヒト線維芽細胞によっても分泌された。ＴＧＦ−β２は、ＥＬＩＳＡアッセイでは検出されなかった。
Figure 2018500325
 略語：ＮＤ：検出なし、＝／−ｓｅｍ
ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ（商標）多重ＥＬＩＳＡアッセイ：ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、及びＩＬ−８は、臍由来細胞から分泌された（表１３−２及び表１３−３）。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ、エオタキシン、及びＩＬ−８は、胎盤由来細胞から分泌された（表１３−２及び表１３−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、又はＰＤＧＦ−ｂｂは、検出されなかった。
Figure 2018500325
 略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｐ１（胎盤由来細胞（０４２３０３））、Ｕ１（臍由来細胞（０２２８０３））、
Ｐ３（胎盤由来細胞（０７１００３））、Ｕ３（臍由来細胞（０７１００３））。ＮＤ：検出されず。
Figure 2018500325
 略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｐ１（胎盤由来ＰＰＤＣ（０４２３０３））、Ｕ１（臍由来ＰＰＤＣ（０２２８０３））、
Ｐ３（胎盤由来ＰＰＤＣ（０７１００３））、Ｕ３（臍由来ＰＰＤＣ（０７１００３））。ＮＤ：検出されず。
（実施例１４）
分娩後由来細胞の短期的神経分化
胎盤由来細胞及び臍由来細胞（集合的に分娩後由来細胞又はＰＰＤＣと呼ぶ）の神経系統細胞に分化する能力を調べた。
方法及び材料
分娩後細胞の単離及び増殖：実施例６に記載されるように、胎盤組織及び臍組織からＰＰＤＣを単離して増殖させた。
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ａ）：このアッセイは、元は骨髄ストロマ細胞（１）の神経誘導能を試験するために実施されたアッセイから採用したものであった。臍由来細胞（０２２８０３）Ｐ４、及び胎盤由来細胞（０４２２０３）Ｐ３を解凍して、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、増殖培地中に、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理して、ＴｉｔｒｅｔｅｋＩＩスライドガラス（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｃｏｎｎ））の１ウェル当り、６，０００細胞で播種した。対照として、間葉系幹細胞（Ｐ３；１Ｆ２１５５（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）））、骨芽細胞（Ｐ５；ＣＣ２５３８（Ｃａｍｂｒｅｘ））、脂肪由来細胞（（Ａｒｔｅｃｅｌ）、米国特許第６，５５５，３７４（Ｂ１）号）（Ｐ６、ドナー２）、及び新生児ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ６、ＣＣ２５０９（Ｃａｍｂｒｅｘ））も同条件下で播種した。
全ての細胞を、最初に、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）））、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））、上皮成長因子（ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）で４日間増殖させた。４日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））ですすぎ、続いて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン中で２４時間培養した。２４時間後に、細胞をＰＢＳですすいだ。続いて、２００ｍＭのブチル化ヒドロキシアニソール、１０μＭの塩化カリウム、５ミリグラム／ミリリットルのインスリン、１０μＭのフォルスコリン、４μＭのバルプロ酸、及び２μＭのヒドロコルチゾン（全ての化学薬品はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．」）より）を含有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（無血清）からなる誘導培地中で、１〜６時間、細胞を培養した。次いで、１００％氷冷メタノール中で、細胞を固定し、免疫細胞化学を実行して（下記の方法を参照）、ヒトネスチンタンパク質の発現を査定した。
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ｂ）：ＰＰＤＣ（臍（０２２８０３）Ｐ１１；胎盤（０４２２０３）Ｐ１１）、及び成体ヒト皮膚線維芽細胞（１Ｆ１８５３，Ｐ１１）を解凍し、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理して、（Ａ）と同様の密度で、ただし、（１）２４ウェル組織培養処理プレート（ＴＣＰ、Ｆａｌｃｏｎブランド（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））、（２）ＴＣＰウェル＋室温で１時間吸着させた２％（ｗ／ｖ）ゼラチン、又は（３）ＴＣＰウェル＋２０μｇ／ミリリットルの吸着マウスラミニン（３７℃で最低２時間吸着（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、上に播種した。
厳密に（Ａ）と同様に、細胞を最初に増殖させ、培地を前述の時間枠で切り替えた。前述のように、培養物の１セットを、５日と６時間の時点で、この場合は、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して、室温で１０分間固定した。培養物の第２のセットでは、培地を除去して、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる、神経前駆細胞増殖培地（ＮＰＥ）に切り替えた。ＮＰＥ培地に、レチノイン酸（ＲＡ；１μＭ（Ｓｉｇｍａ））を更に添加した。４日後に、この培地を除去して、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養物を、室温で１０分間にわたって固定し、ネスチン、ＧＦＡＰ、及びＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した（表１４−１を参照）。
Figure 2018500325
二段階分化プロトコル：ＰＰＤＣ（臍（０４２２０３）Ｐ１１、胎盤（０２２８０３）Ｐ１１）、成体ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ１１；１Ｆ１８５３（Ｃａｍｂｒｅｘ））を解凍し、サブコンフルエンス（７５％）に達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理し、２，０００細胞／ｃｍ2で、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））及びＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））を添加したＮＰＥ培地の存在下で、ラミニン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．））でコーティングした２４ウェルプレートに播種した（全培地組成物はＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅとも呼ばれる）。同時に、海馬から単離された成体ラット神経前駆細胞（Ｐ４；（０６２６０３）もまた、２４ウェリアミニンコーティングプレート（24 welliaminin-coated plates）のＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ培地に培養プレーティングした。全ての培養物を、こうした条件下で６日間維持し（その期間中、細胞に１回栄養補給した）、その時点で、更に７日間にわたって、表１４−２に列記される分化条件に培地を切り替えた。培養物を室温で１０分間氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、ヒト又はラットネスチン、ＧＦＡＰ、及びＴｕＪ１タンパク質の発現に関して染色した。
Figure 2018500325
複数の増殖因子プロトコル：臍由来細胞（Ｐ１１；（０４２２０３））を解凍して、サブコンフルエンス（７５％）に到達するまで、増殖培地中、５，０００細胞／ｃｍ2で培養増殖させた。続いて、細胞をトリプシン処理して、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）の存在下で、２４ウェリアミニンコーティングプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に、２，０００細胞／ｃｍ2で播種した。更に、いくつかのウェルは、ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ＋２％ＦＢＳ、又は１０％ＦＢＳを含んだ。「予備分化」条件の４日後に、全ての培地を除去して、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ；２００ナノグラム／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））、ＦＧＦ８（１００ナノグラム／ミリリットル（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、ＢＤＮＦ（４０ナノグラム／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ））、ＧＤＮＦ（２０ナノグラム／ミリリットル（Ｓｉｇｍａ））、及びレチノイン酸（１μＭ（Ｓｉｇｍａ））を添加したＮＰＥ培地に、サンプルを切り替えた。培地交換から７日後に、氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して、培養物を、室温で１０分間固定し、ヒトネスチン、ＧＦＡＰ、ＴｕＪ１，デスミン、及びα−平滑筋アクチンの発現に関して染色した。
神経前駆細胞共培養プロトコル：成体ラット海馬前駆細胞（０６２６０３）を、ラミニンコーティング２４ウェルディッシュ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上のＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）中に、ニューロスフェア又は単一細胞としてプレーティングした（１０，０００細胞／ウェル）。
別に、臍由来細胞（０４２２０３）Ｐ１１、及び胎盤由来細胞（０２２８０３）Ｐ１１を解凍して、ＮＰＥ＋Ｆ（２０ナノグラム／ミリリットル）＋Ｅ（２０ナノグラム／ミリリットル）中に、５，０００細胞／ｃｍ2で、４８時間にわたって培養増殖させた。次いで、細胞をトリプシン処理して、既存の神経前駆細胞の培養物上に、２，５００細胞／ウェルで播種した。その時点で、既存の培地を、新鮮培地に交換した。４日後、培養物を室温で１０分間氷冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、ＰＰＤＣを同定するため、ヒト核タンパク質（ｈＮｕｃ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））に関して染色した（上記の表１４−１）。
免疫細胞化学：免疫細胞化学法を、表１４−１に列挙した抗体を用いて行った。培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、３０分間曝露した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））に加えてブロッキング溶液を含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。続いて、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ））を使用して、階層モンタージュを準備した。
結果
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ａ）：この神経誘導組成物中でのインキュベーションでは、全ての細胞型が、双極性形態及び伸長した突起を有する細胞へと形質転換した。他の、より大きい非双極性形態もまた、観察された。更には、これらの誘導細胞集団は、複能性の神経幹細胞及び前駆細胞のマーカーである、ネスチンに関して、陽性染色された。
改変Ｗｏｏｄｂｕｒｙ−Ｂｌａｃｋプロトコル（Ｂ）：組織培養プラスチック（ＴＣＰ）ディッシュ上で繰り返しても、培養表面に予めラミニンを吸着させない限りは、ネスチンの発現は観察されなかった。ネスチン発現細胞が続いて成熟ニューロンの生成へ進むことができるか否かを更に評価するため、ＰＰＤＣ及び線維芽細胞を、神経幹細胞及び前駆細胞からこうした細胞への分化を誘導することが知られている培地組成であるＮＰＥ＋ＲＡ（１μＭ）に曝露した（２、３、４）。未熟ニューロン及び成熟ニューロンのマーカーであるＴｕＪ１、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰ、並びにネスチンに関して、細胞を染色した。ＴｕＪ１が検出された条件はなく、ニューロン形態を有する細胞も観察されなかった。更に、免疫細胞化学により判定されたように、ネスチン及びＧＦＡＰは、ＰＰＤＣによってこれ以上発現されなかった。
２段階分化：臍及び胎盤ＰＰＤＣ単離株（並びにそれぞれ陰性対照細胞型及び陽性対照細胞型としてのヒト線維芽細胞及びげっ歯類神経前駆細胞）をラミニン（神経促進）コーティングディッシュにプレーティングし、神経前駆細胞からニューロン及び星状細胞への分化を促進することが知られている１３の異なる増殖条件（及び２つの対照条件）に曝露した。更に、ＰＰＤＣ分化に対する、ＧＤＦ５及びＢＭＰ７の影響を検査するために、２つの条件を追加した。全般的には、２段階分化アプローチを採択して、細胞を、最初に６日間、神経前駆細胞増殖条件に置き、その後に７日間、完全分化条件に置いた。形態学的には、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の両方が、この手順の時間経過の全体を通して、細胞形態の根本的変化を呈した。しかしながら、対照の神経前駆細胞プレーティング条件を除き、神経細胞又は星状細胞は観察されなかった。ヒトネスチン、ＴｕＪ１、及びＧＦＡＰに関して陰性の、免疫細胞化学により、これらの形態学的観察結果が確認された。
複数の増殖因子：様々な神経分化剤に１週間曝露した後、神経前駆細胞（ヒトネスチン）、ニューロン（ＴｕＪ１）、及び星状細胞（ＧＦＡＰ）の指標となるマーカーに関して、細胞を染色した。第一段階で非血清含有培地中に増殖させた細胞は、血清含有（２％又は１０％）培地中の細胞とは異なる、潜在的な神経分化を示す形態を有していた。具体的には、臍由来細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦに曝し、その後、ＳＨＨ、ＦＧＦ８、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、及びレチノイン酸に曝す２段階手順の後に、細胞は、培養星状細胞の形態と同様の、長く伸長した突起を示した。第１段階の分化で、２％ＦＢＳ又は１０％ＦＢＳを含んでいた場合、細胞数が増大し、細胞形態は、高密度の対照培養から変化しなかった。潜在的な神経分化は、ヒトネスチン、ＴｕＪ１、又はＧＦＡＰに関する免疫細胞化学分析によっては、証明されなかった。
神経前駆細胞とＰＰＤＣの共培養：２日前に、神経伸長条件（neural expansion conditions）（ＮＰＥ＋Ｆ＋Ｅ）に播種したラット神経前駆細胞培養物上にＰＰＤＣをプレーティングした。プレーティングしたＰＰＤＣの視覚的検査によって、これらの細胞が単一細胞としてプレーティングされたことが明らかとなったが、プレーティング４日後（全体で６日目）のヒト特異的核染色（ｈＮｕｃ）によって、これらは球状に固まり、神経前駆細胞との接触を回避する傾向があることを示した。更に、ＰＰＤＣが付着する場合に、これらの細胞は散開し、ラット起源のものであった分化ニューロンによって神経支配されたように思われたが、これは、ＰＰＤＣが、筋細胞へと分化した可能性があることを示唆する。この観察結果は、位相差顕微鏡下での形態に基づくものであった。もう一つの観察結果は、典型的に大型の細胞体（神経前駆細胞よりも大きい）は、複数の方向に広がる薄い突起を有する、神経前駆細胞に類似する形態を有していたことである。ｈＮｕｃ染色（細胞核の２分の１で見出される）は、これらのヒト細胞が、一部の場合には、ラットの前駆細胞と融合して、それらの表現型を呈し得ることを示した。神経前駆細胞のみを収容する対照ウェルは、臍又は胎盤ＰＰＤＣを収容する共培養ウェルよりも、前駆細胞及び明白な分化細胞の総数が少なかったが、これは、臍由来細胞及び胎盤由来細胞の両方が、ケモカイン及びサイトカインの放出によって、又は接触が媒介する効果によってのいずれかで、神経前駆細胞の分化及び挙動に影響を及ぼしたことを更に示す。
要約：ＰＰＤＣが神経系統細胞へ分化する短期的能力を判定するため、複数のプロトコルを実施した。これらのプロトコルには、それぞれ、複能性の神経幹細胞及び前駆細胞、未熟ニューロン及び成熟ニューロン、並びに星状細胞に関連するタンパク質である、ネスチン、ＴｕＪ１、及びＧＦＡＰに関する、免疫細胞化学と組み合わせた、形態の位相コントラスト画像法を含めた。
（実施例１５）
分娩後由来細胞の長期的神経分化
臍由来及び胎盤由来細胞（集合的に分娩後由来細胞又はＰＰＤＣと呼ぶ）の、神経系統細胞へと長期的に分化を受ける能力を評価した。
方法及び材料
ＰＰＤＣの単離及び増殖：上述した実施例に記載される通りに、ＰＰＤＣを単離して増殖させた。
ＰＰＤＣ細胞の解凍及びプレーティング：予め増殖培地中で増殖させたＰＰＤＣの冷凍アリコート（臍（０２２８０３）Ｐ１１；（０４２２０３）Ｐ１１；（０７１００３）Ｐ１２；胎盤（１０１５０３）Ｐ７）を解凍して、Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（１０ミリリットル）（この組合せは、本明細書では、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と称される）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））中の、ラミニン（ＢＤ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．））でコーティングしたＴ−７５フラスコ内に、５，０００細胞／ｃｍ２でプレーティングした。ＮＰＥ培地に、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））、及びＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．）））（本明細書では、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと称する）を更に添加した。
対照細胞のプレーティング：更に、成体ヒト皮膚線維芽細胞（Ｐ１１（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）））、及び間葉系幹細胞（Ｐ５（Ｃａｍｂｒｅｘ））を解凍して、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中の、ラミニンコーティングＴ−７５フラスコ上に、同じ細胞播種密度でプレーティングした。更なる対照として、線維芽細胞、臍、及び胎盤ＰＰＤＣを、増殖培地中で、全ての培養物に関して指定された期間にわたって増殖させた。
細胞の増殖：全ての培養物からの培地は、１週間に１回、新鮮培地に置き換えて、細胞の増殖を観察した。一般的には、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中での増殖の限界のため、各培養物は、１か月の期間で１回継代した。
免疫細胞化学：１か月の期間の後に、全てのフラスコを、室温で１０分間、冷４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して固定した。免疫細胞化学法は、ＴｕＪ１（βＩＩＩチューブリン；１：５００（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））、及びＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質；１：２０００（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃａｌｉｆ．））に対する抗体を用いて行った。要約すると、培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に３０分間曝露した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））に加えてブロックを含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、階層モンタージュを準備した。
Figure 2018500325
結果
ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地はＰＰＤＣの増殖を遅くし、形態を変化させる。プレーティングの直後に、ＰＰＤＣのサブセットが、ラミニンでコーティングした培養フラスコに付着した。このことは、凍結／解凍プロセスの機能としての細胞死によるものか、又は新たな増殖条件が原因であった可能性がある。付着した細胞は、増殖培地中で観察されるものとは異なる形態を取っていた。
臍由来細胞のクローンはニューロンタンパク質を発現する：解凍／プレーティングの１か月後に、培養物を固定し、ニューロンタンパク質ＴｕＪ１、及び星状細胞内に見出される中間径フィラメントであるＧＦＡＰに関して、染色した。増殖培地中で増殖させた全ての対照培養物、並びにＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地中で増殖させたヒト線維芽細胞及びＭＳＣは、ＴｕＪ１−／ＧＦＡＰ−であることが判明したが、臍由来細胞及び胎盤ＰＰＤＣでは、ＴｕＪ１が検出された。神経様形態を有する細胞、及び有さない細胞内で、発現が観察された。いずれの培養物内にも、ＧＦＡＰの発現は観察されなかった。神経様形態を有する、ＴｕＪ１を発現する細胞の百分率は、全集団の１％以下であった（試験した臍由来細胞単離株ｎ＝３）。定量化されていないが、神経形態を有さないＴｕＪ１＋細胞の百分率は、胎盤由来細胞培養物よりも、臍由来細胞培養物内で高かった。これらの結果は、増殖培地中の同齢の対照がＴｕＪ１を発現しなかったため、特異的であると考えられた。
要約：臍由来細胞から、分化ニューロンを生成するための方法（ＴｕＪ１の発現及び神経形態学に基づく）が開発された。ＴｕＪ１に関する発現は、インビトロでは、１か月よりも早い時点では検査しなかったが、臍由来細胞の少なくとも小集団は、既定の分化を通じてか、あるいはＬ−グルタミン、塩基性ＦＧＦ、及びＥＧＦを添加した最小培地に１か月曝露した後の長期誘導を通じてかのいずれかで、ニューロンを生じさせ得ることは明らかである。
（実施例１６）
神経前駆細胞支援のためのＰＰＤＣ栄養因子
非接触依存性（栄養性）機構による、成体神経幹細胞及び前駆細胞の生存及び分化に対する臍由来細胞及び胎盤由来細胞（集合的に分娩後由来細胞又はＰＰＤＣと称する）の影響を調べた。
方法及び材料
成体神経幹細胞及び前駆細胞の単離：Ｆｉｓｈｅｒ３４４成体ラットをＣＯ2窒息とその後の頸脱臼により犠牲にした。骨鉗子を使用して、脳全体を無傷な状態で摘出し、脳の運動領域及び体性感覚領域の後方の冠状切開に基づいて海馬組織を解剖した（Ｐａｘｉｎｏｓ，Ｇ．＆ Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．（１９９７）「Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」）。Ｂ２７（Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））（この組合せは、本明細書では、神経前駆細胞増殖（ＮＰＥ）培地と称される）中で組織を洗浄した。ＮＰＥ培地に、ｂＦＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．））、及びＥＧＦ（２０ナノグラム／ミリリットル、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｊ．））を更に添加し、これを本明細書ではＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦと呼ぶ。
洗浄の後に、上を覆う髄膜を除去して、外科用メスで組織を細断した。細断した組織を収集し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、総容積の７５％として添加した。更に、ＤＮアーゼ（１００マイクロリットル／総容積８ミリリットル（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）））を添加した。次に、この組織／培地を、１８ゲージのニードル、２０ゲージのニードル、及び最終的に２５ゲージのニードルに各１回、連続的に通過させた（全てのニードルは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）より）。この混合物を、２．５Ｎ（２５０ｇ）で３分間、遠心分離した。上清を除去し、新鮮なＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦを添加して、ペレットを再懸濁させた。得られた細胞懸濁液を、４０マイクロメートル細胞濾過器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に通し、ラミニンコーティングＴ−７５フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）又は低クラスター２４ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上にプレーティングし、ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ培地中で、概説される研究のために十分な細胞数が得られるまで増殖させた。
ＰＰＤＣプレーティング：予め増殖培地中で増殖させた分娩後由来細胞（臍（０２２８０３）Ｐ１２、（０４２１０３）Ｐ１２、（０７１００３）Ｐ１２；胎盤（０４２２０３）Ｐ１２）を、５，０００細胞／トランスウェルインサート（２４ウェルプレート用のサイズ）でプレーティングし、インサート内の増殖培地中で、１週間にわたって増殖させ、コンフルエンスに到達させた。
成体神経前駆細胞のプレーティング：ニューロスフェアとして、又は単細胞として増殖させた神経前駆細胞を、細胞接着を促進するために、１日間、ラミニンコート２４ウェルプレート上のＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ中に、およそ密度２，０００細胞／ウェルで播種した。１日後、分娩後細胞を含むトランスウェルインサートを次のスキームに従って加えた。
ａ．トランスウェル（増殖培地中の臍由来細胞、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｂ．トランスウェル（増殖培地中の胎盤由来細胞、２００マイクロリットル）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｃ．トランスウェル（成体ヒト皮膚線維芽細胞［増殖培地２００μＬ中の１Ｆ１８５３（Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ．）］Ｐ１２）＋神経前駆細胞（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｄ．対照：神経前駆細胞単独（ＮＰＥ＋ｂＦＧＦ＋ＥＧＦ、１ミリリットル）
ｅ．対照：神経前駆細胞単独（ＮＰＥのみ、１ミリリットル）
免疫細胞化学：共培養７日後、全ての条件を、室温で１０分間にわたって、４％（ｗ／ｖ）冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を使用して固定した。表１４−１に列記されるエピトープに対する抗体を使用して、免疫細胞化学を実行した。要約すると、培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞内抗原にアクセスするために、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｌｉｆ．））、及び０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ））を含有するタンパク質ブロッキング溶液に、３０分間曝露した。次いで、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体を、室温で、１時間にわたって、これらの培養物に適用した。次に、一次抗体溶液を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）））、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（１：２５０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））に加えてブロッキング溶液を含有する、二次抗体溶液を適用した（室温で１時間）。次いで、培養物を洗浄し、１０μＭのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化した。
免疫染色の後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立エピ蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．））上で、適切な蛍光フィルターを使用して、蛍光を可視化した。全ての場合で、陽性染色は、一次抗体溶液の適用を除いて、上記で概説した全手順に従った対照染色を上回る、蛍光シグナルを表した。代表的な画像を、デジタルカラービデオカメラ及びＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して取り込んだ。３重染色サンプルに関しては、１回に１つのみの発光フィルターを使用して、各画像を撮影した。次いで、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．））を使用して、階層モンタージュを準備した。
Figure 2018500325
神経前駆細胞分化の定量分析：海馬神経前駆細胞分化の定量化を検討した。各条件当り、最低１０００細胞を計数し、少ない場合には、その条件内で観察された細胞の総数とした。所定の染色に関して陽性の細胞の百分率を、ＤＡＰＩ（核）染色によって判定されるように、陽性細胞の数を細胞の総数で除算することによって、評価した。
質量分析及び２Ｄゲル電気泳動：共培養の結果としての固有の分泌因子を同定するため、培養物の固定の前に採取した馴化培地サンプルを、−８０℃で一晩凍結させた。次いで、限外濾過スピン装置（分画分子量３０ｋＤ）に、サンプルを適用した。リテンテートをイムノアフィニティークロマトグラフィー（抗Ｈｕ−アルブミン；ＩｇＹ）に適用した（イムノアフィニティーはこれらのサンプルからアルブミンを除去しなかった）。濾液を、ＭＡＬＤＩによって分析した。この透過物を、Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ Ｂｌｕｅアフィニティークロマトグラフィーに適用した。サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び２Ｄゲル電気泳動によって分析した。
結果
ＰＰＤＣ共培養は成体神経前駆細胞分化を刺激する：臍由来細胞又は胎盤由来細胞と共に培養した後、成体ラット海馬由来の共培養神経前駆細胞は、中枢神経系の主要な３つの系統全て沿って有意な分化を示した。この効果は、共培養５日後に、明確に観察され、数多くの細胞が、複雑な突起を作り出し、分裂中の前駆細胞に固有の、相の明るい特徴を喪失していた。反対に、ｂＦＧＦ及びＥＧＦの非存在下で、単独で増殖させた神経前駆細胞は、健常性が見られず、生存に限界があった。
この手順の完了後、未分化幹細胞及び前駆細胞（ネスチン）、未熟ニューロン及び成熟ニューロン（ＴｕＪ１）、星状細胞（ＧＦＡＰ）、並びに成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の指標となるマーカーに関して、培養物を染色した。３つの全ての系統に沿った分化が確認されたが、対照条件は、大多数の細胞中でのネスチン陽性染色の保持によって証明されるように、有意な分化を呈さなかった。臍由来細胞及び胎盤由来細胞の両方が、細胞の分化を誘導したが、３つ全ての系統に関する分化の度合いは、臍由来細胞との共培養の場合よりも、胎盤由来細胞との共培養の場合のほうが少なかった。
臍由来細胞との共培養の後に、分化した神経前駆細胞の百分率を定量化した（表１６−２）。臍由来細胞は、成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ）の数を、有意に増加させた（両方の対照条件での２４．０％対０％）。更に、共培養は、培養下のＧＦＡＰ＋星状細胞、及びＴｕＪ１＋ニューロンの数を増加させた（それぞれ、４７．２％、及び８．７％）。これらの結果は、共培養後に前駆細胞状態が喪失したことを示す、ネスチン染色（対照条件４で１３．４％対７１．４％）によって確認された。
分化はまた、成体ヒト線維芽細胞によっても影響を受けるものと考えられたが、そのような細胞は、成熟乏突起神経膠細胞の分化を促進することは不可能であり、感知し得る量のニューロンを生成することも不可能であった。しかしながら、定量化されなかったものの、線維芽細胞は、神経前駆細胞の生存を増進させるものと思われた。
Figure 2018500325
固有化合物の同定：臍由来共培養物及び胎盤由来共培養物由来の馴化培地を、適切な対照（ＮＰＥ培地±１．７％血清、線維芽細胞との共培養由来培地）と共に差異に関し検査した。潜在的に固有な化合物を同定して、それらの対応する２Ｄゲルから切除した。
要約：成体神経前駆細胞の臍又は胎盤ＰＰＤＣとの共培養は、それらの細胞の分化を生じさせる。この実施例で提示される結果により、臍由来細胞との共培養後の成体神経前駆細胞の分化が、特に顕著であることが示される。具体的には、有意な百分率の成熟乏突起神経膠細胞が、臍由来細胞の共培養物内に生成された。
（実施例１７）
分娩後由来細胞の移植
分娩後の臍及び胎盤由来細胞は、再生療法に有用である。ＳＣＩＤマウスに生分解性材料と共に移植された分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）によって産生された組織を評価した。評価する材料は、バイクリル不織布、３５／６５ ＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体、及びＲＡＤ１６自己集合性ペプチドヒドロゲルとした。
方法及び材料
細胞培養：胎盤由来細胞及び臍由来細胞を、ゼラチンコーティングフラスコ中の増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆ．））、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（カタログ番号ＳＨ３００７０．０３（Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）））、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））中で増殖させた。
サンプルの調製：１００万個の生育可能細胞を、１５マイクロリットルの増殖培地中、直径５ｍｍ、厚さ２．２５ｍｍのバイクリル不織布スカフォールド（６４．３３ミリグラム／ｃｃ；ロット番号３５４７−４７−１）又は直径５ｍｍの３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体（ロット番号３４１５−５３）上に播種した。２時間にわたって細胞を付着させた後、更なる増殖培地を追加して、これらのスカフォールドを覆った。スカフォールド上で一晩、細胞を増殖させた。細胞を有さないスカフォールドもまた、培地中でインキュベートした。
ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド（３Ｄ Ｍａｔｒｉｘ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））を水中１％（ｗ／ｖ）の滅菌溶液として得、これを使用直前にダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ））中の、１０％（ｗ／ｖ）スクロース（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ中で、１×１０6個の細胞と１：１で混合した。ＲＡＤ１６ヒドロゲル中の細胞の最終濃度は、１×１０6細胞／１００マイクロリットルとした。
試験材料（Ｎ＝４／Ｒｘ）
ａ．バイクリル不織布＋１×１０6個の臍由来細胞
ｂ．３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０6個の臍由来細胞
ｃ．ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド＋１×１０6個の臍由来細胞
ｄ．バイクリル不織布＋１×１０6個の胎盤由来細胞
ｅ．３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体＋１×１０6個の胎盤由来細胞
ｆ．ＲＡＤ１６自己集合性ペプチド＋１×１０6個の胎盤由来細胞
ｇ．３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ発泡体
ｈ．バイクリル不織布
動物の準備：動物福祉法の現行の要件に従って、動物を取扱いかつ維持した。上記公法との準拠性は、動物福祉規則（９ＣＦＲ）を遵守し、「ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（第７版）」で公布された現行標準に従うことによって達成した。
マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ／雄（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．））、５週齢。ＳＣＩＤマウスの取扱いは全てフード下で行った。マウスを個々に秤量して、６０ミリグラム／ｋｇのＫＥＴＡＳＥＴ（塩酸ケタミン（Ａｖｅｃｏ Ｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ，Ｉｏｗａ）））及び１０ミリグラム／ｋｇのＲＯＭＰＵＮ（キシラジン（Ｍｏｂａｙ Ｃｏｒｐ．（Ｓｈａｗｎｅｅ，Ｋａｎｓ）））と生理食塩水との混合物の腹腔内注射を使用して麻酔した。麻酔導入の後、動物用電気バリカンを使用して、背側頸部区域から背側腰仙区域までの、動物の背部全体の毛を刈り取った。次いで、その区域を、二酢酸クロルヘキシジンを使用して擦り洗いし、アルコールですすぎ、乾燥させ、有効ヨウ素１％のヨードフォア水溶液を塗布した。眼用軟膏を眼に塗布して、麻酔期間中の組織の乾燥を防止した。
皮下移植技術：マウスの背に、各約１．０ｃｍ長の４つの皮膚切開部を作った。２つの頭蓋部位を、背外側胸部領域の上に、触診した肩胛骨の下縁の５ｍｍ尾側で、一方は脊柱の左に、もう一方は右に、横方向で配置した。別の２つは、尾の仙腰レベルの臀筋区域の上に、触診した腸骨稜の約５ｍｍ尾側で、正中線の各側上に１つずつ、横方向で配置した。実験計画に従って、これらの部位内に、移植片を無作為に定置した。下層の結合組織から皮膚を分離して、小さいポケットを作製し、その切開部の約１ｃｍ尾側に、移植片を定置した（あるいはＲＡＤ１６の場合は、注射した）。適切な試験材料を、皮下空間内に移植した。皮膚の切開部は、金属クリップで閉鎖した。
動物の飼育：マウスは実験過程の全体を通して個々に小型隔離ケージで、温度範囲６４°Ｆ〜７９°Ｆ、相対湿度３０％〜７０％で飼育し、約１２時間明期／１２時間暗期の周期に維持した。温度及び相対湿度は、可能な限り、記載の範囲内に維持した。食餌は、Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｐｉｃｏ Ｍｏｕｓｅ Ｃｈｏｗ ５０５８（Ｐｕｒｉｎａ Ｃｏ．）からなるものとし、水は自由に摂取させた。
指定の時間間隔で、二酸化炭素吸入によってマウスを安楽死させた。皮下移植部位を、それらの部位を覆う皮膚と共に切除して、組織学のために凍結した。
組織学：移植片と共に切り取った皮膚を１０％中性緩衝ホルマリン（Ｒｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈ．））で固定した。サンプルを、上を覆う隣接組織と共に、中央で２等分して、パラフィン処理を施し、慣用の方法を使用して割面上に埋め込んだ。ミクロトームによって５マイクロメートルの組織切片を得て、常法を用いて、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｐｏｌｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂａｙ Ｓｈｏｒｅ，Ｎ．Ｙ））で染色した。
結果
３０日後の、ＳＣＩＤマウス内に皮下移植された発泡体（細胞を有さず）内への組織の内植は、最小限のものであった。対照的に、臍由来細胞又は胎盤由来細胞と共に移植された発泡体内には、広範囲の組織充填が存在した。バイクリル不織布スカフォールド内には、ある程度の組織の内植が観察された。臍由来細胞又は胎盤由来細胞が播種された不織布スカフォールドは、マトリックス沈着及び成熟血管の増大を示した。
要約：合成吸収性不織／発泡体ディスク（直径５．０ｍｍ×厚さ１．０ｍｍ）又は自己集合性ペプチドヒドロゲルにヒト臍又は胎盤のいずれかに由来する細胞を播種し、ＳＣＩＤマウスの背棘領域の両側に皮下移植した。それらの結果は、分娩後由来細胞が、生分解性スカフォールド内の良質の組織形成を、劇的に増大させることが可能である点を実証した。
（実施例１８）
臍帯組織由来細胞におけるテロメラーゼ発現
テロメラーゼは、染色体の完全性を保護し、また細胞の複製寿命を延長するために役立つ、テロメア繰り返し体を合成するように機能する（Ｌｉｕ，Ｋら，ＰＮＡＳ（１９９９）９６：５１４７〜５１５２）。テロメラーゼは、テロメラーゼＲＮＡテンプレート（ｈＴＥＲ）、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の２つの成分からなる。テロメラーゼの調節は、ｈＴＥＲではなく、ｈＴＥＲＴの転写によって決定される。ｈＴＥＲＴｍＲＮＡに関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、それゆえ、細胞のテロメラーゼ活性を判定するための容認された方法である。
細胞単離。リアルタイムＰＣＲ実験を実施して、ヒト臍帯組織由来細胞のテロメラーゼ産生を評価した。ヒト臍帯組織由来細胞を、上述の実施例に従って調製した。全般的には、正常な分娩後の、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）から得た臍帯を洗浄して、血液及び残渣を除去し、機械的に解離させた。続いて、組織を、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、及びヒアルロニダーゼを含む消化酵素と共に、３７℃の培養培地中でインキュベートした。ヒト臍帯組織由来細胞を、上記の実施例に記載される方法に従って培養した。間葉系幹細胞及び正常真皮線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ロット番号９Ｆ０８４４）をＣａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ）から得た。多能性ヒト精巣胎児性癌（テラトーマ）細胞株ｎＴｅｒａ−２細胞（ＮＴＥＲＡ−２ｃｌ．Ｄｌ）（ＰｌａｉａらのＳｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００６），２４（３）：５３１〜５４６を参照）を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）から購入し、上記で説明した方法に従って培養した。
合計ＲＮＡの単離。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａ．）を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出した。５０マイクロリットルのＤＥＰＣ処理水を使用して、ＲＮＡを溶出させ、−８０℃で保存した。ランダムヘキサマーと、ＴａｑＭａｎ（登録商標）逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ．）とを使用し、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、及び９５℃で１０分間、ＲＮＡを逆転写した。サンプルを、−２０℃で保存した。
リアルタイムＰＣＲ。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙｓ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）（ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイとしても既知）を、製造業者の仕様書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用して、ｃＤＮＡサンプルに対してＰＣＲを実行した。この市販のキットは、ヒト細胞内のテロメラーゼに関してアッセイするために、広く使用される。簡潔には、ｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ遺伝子）（Ｈｓ００１６２６６９）及びヒトＧＡＰＤＨ（内部対照）を、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ７０００ ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に７０００配列検出システムを使用して、ｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスと混合した。熱サイクル条件は、最初に５０℃で２分間及び９５℃で１０分間とし、その後に、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルとした。ＰＣＲデータを、製造業者の仕様書に従って分析した。
ヒト臍帯組織由来細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）、線維芽細胞、及び間葉系幹細胞を、ｈＴＥＲＴ及び１８Ｓ ＲＮＡに関してアッセイした。表１８−１に示すように、ｈＴＥＲＴ、よってテロメラーゼは、ヒト臍帯組織由来細胞内では検出されなかった。
Figure 2018500325
ヒト臍帯組織由来細胞（単離株０２２８０３、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６０６７）及びｎＴｅｒａ−２細胞をアッセイしたところ、それらの結果は、ヒト臍帯組織由来細胞の２つのロットでは、テロメラーゼの発現を示さなかったが、一方で、テラトーマ細胞株は、高レベルで発現することが明らかとなった（表１８−２）。
Figure 2018500325
したがって、本発明のヒト臍帯組織由来細胞は、テロメラーゼを発現しないということを、結論付けることができる。
様々な特許及び他の刊行物が、本明細書の全体を通して参照される。これらの刊行物のそれぞれは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。

Claims (26)

  1. 被験体の眼球に分娩後由来細胞の集団を投与することを含む網膜変性の治療方法であって、前記細胞集団は架橋分子を分泌し、前記架橋分子はＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される、方法。
  2. 分娩後由来細胞の集団を被験体の眼球に投与する方法であって、前記細胞集団は架橋分子を分泌し、前記架橋分子はＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される、方法。
  3. 前記分娩後由来細胞の集団は、血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離されたヒト臍帯組織由来細胞を含有する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離された細胞集団は、培養系で増殖することができ、少なくとも神経表現型の細胞に分化する能力を有し、継代時に正常核型を維持し、かつ、
    ａ）培養下で４０回集団倍加する能力、
    ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３及びＣＤ９０の産生、
    ｃ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７及びＣＤ１４１の産生の欠如、並びに、
    ｄ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコード化する遺伝子をより多く発現すること、
    を特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記細胞集団は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）栄養因子を分泌する、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記栄養因子はＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ及びＧＤＮＦである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記細胞集団は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）栄養因子を分泌する、請求項４に記載の方法。
  8. 前記栄養因子はＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ及びＧＤＮＦである、請求項７に記載の方法。
  9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって調製された馴化培地。
  10. 被験体の眼球に分娩後由来細胞の集団を投与することを含む、酸化損傷を低減させるか、又は酸化損傷から網膜細胞若しくは組織を保護する方法であって、前記分娩後由来細胞は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離される、方法。
  11. 網膜変性における網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の機能障害をレスキューする方法であって、前記方法は被験体の眼球に分娩後由来細胞の集団を投与することを含み、前記分娩後由来細胞は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、前記細胞集団は架橋分子を分泌し、前記架橋分子はＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される、方法。
  12. 網膜変性における視細胞の喪失を低下させるための方法であって、前記方法は、被験体の眼球に前記視細胞の喪失を低下させるのに有効な量の分娩後由来細胞の集団を投与することを含み、前記分娩後由来細胞は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、前記分娩後由来細胞の集団は架橋分子を分泌し、前記架橋分子はＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される、方法。
  13. 前記分娩後由来細胞の集団は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）栄養因子を分泌する、請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 前記栄養因子はＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ及びＧＤＮＦである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記分娩後由来細胞の集団は、少なくとも１つのその他の剤と共に投与される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  16. 被験体の眼球に分娩後由来細胞の集団を含む組成物を投与することを含む、網膜変性における視細胞の喪失を低下させるための方法であって、前記組成物は、前記視細胞の喪失を低下させるのに効果的な量で投与され、前記分娩後由来細胞は血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離され、前記分娩後由来細胞は架橋分子を分泌し、前記架橋分子はＭＦＧ−Ｅ８、Ｇａｓ６、ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２から選択される、方法。
  17. 前記分娩後由来細胞の集団は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）栄養因子を分泌する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記栄養因子はＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤ及びＧＤＮＦである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記組成物は医薬組成物である、請求項１５に記載の方法。
  20. 前記医薬組成物は薬学的に許容できる担体を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記網膜変性は、加齢性黄斑変性である、請求項１１、１２又は１６に記載の方法。
  22. 前記加齢性黄斑変性は、萎縮型加齢性黄斑変性である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記血液を実質的に含まないヒト臍帯組織から単離された細胞集団は、培養下で増殖することができ、少なくとも神経表現型の細胞に分化する能力を有し、継代時に正常核型を維持し、かつ、
    ａ）培養下で４０回集団倍加する能力、
    ｂ）ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０の産生、
    ｃ）ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７及びＣＤ１４１の産生の欠如、並びに
    ｄ）線維芽細胞、間葉系幹細胞、又は腸骨稜骨髄細胞であるヒト細胞と比較して、インターロイキン８及びレチクロン１をコード化する遺伝子をより多く発現すること、
    を特徴とする、請求項１０、１１、１２又は１６に記載の方法。
  24. 前記細胞集団は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関して陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関して陰性である、請求項４に記載の方法。
  25. 前記細胞集団は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに関して陽性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに関して陰性である、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記眼球への投与は、眼球内部への投与又は前記眼球の背後への投与から選択される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
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