CN109456937A

CN109456937A - 一种制备子宫内膜干细胞的培养基以及制备方法

Info

Publication number: CN109456937A
Application number: CN201811610790.XA
Authority: CN
Inventors: 葛啸虎; 陈海佳; 张梦晨; 王小燕; 姜交华
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-03-12

Abstract

本发明涉及组织培养技术领域，公开了一种制备子宫内膜干细胞的培养基以及制备方法。本发明以无血清培养基为基础，添加Pall血清替代物、青/链霉素、硫酸庆大霉素、谷氨酰胺、MEM NEAA、EGF、bEGF、丙酮酸钠和VEGF作为子宫内膜干细胞的培养成分，能够显著的提高子宫内膜干细胞的存活率；在此基础上配合胶原酶I和Dispase II的混合消化，能够更进一步提高子宫内膜干细胞的存活率，促进了子宫内膜干细胞的发展应用。

Description

一种制备子宫内膜干细胞的培养基以及制备方法

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及一种制备子宫内膜干细胞的培养基以及制备方法。

背景技术

干细胞是指在一定条件下可以无限自我更新和增殖分化的细胞，包括从胚胎发育到成人生长发育过程中各种未分化的细胞。从受精卵到胚胎发育，直至最终衰老死亡的整个生命过程中都贯穿干细胞的存在、自我更新和发育分化。干细胞研究是近年生命科学领域发展最快、最受重视的前沿生物技术，涉及生命科学和生物医药的所有领域，在细胞治疗、器官移植、基因治疗、新药筛选等方面发挥重要作用。

干细胞按发生源，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是指存在于成体组织和器官中的未分化细胞。由于分离和使用成体干细胞不存在伦理学问题，在体外培养时可根据需要大量扩增，便于临床应用，且不存在免疫排斥等优势，成体干细胞显示出更广泛的应用前景。目前已经在骨髓、神经、肝脏、肌肉、脂肪等多种组织中发现干细胞的存在。1978年，Prianishnikov提出子宫内膜干细胞的概念，并认为其可使子宫内膜功能层增生修复，并提示，子宫内膜干细胞位于基底层，并存在上皮和基质两种类型干细胞。

很多研究表明，许多子宫内膜异常增生所致的疾病与内膜干细胞的异常生物行为密切相关。从子宫内膜中可体外分离培养出的干细胞，其本身的生物学特性、取材方便使它在组织替代治疗等方面具有广阔应用前景。也有实验发现子宫内膜干细胞能促进血管生成修复烧伤；将子宫内膜干细胞注入帕金森模型的小鼠体内可生成多巴胺治疗帕金森病。目前国际上子宫内膜干细胞研究尚处于早期阶段，建立子宫内膜干细胞分离方法与体系，对未来子宫内膜干细胞及其相关疾病的治疗方面的研究与临床应用具有深远影响与意义。

现有技术普遍采用如下方法或类似方法：在无菌条件下，对获得的子宫内膜组织材料，进行剪碎处理放入冰浴DMEM/F12培养基中；加入约1-4倍体积的消化液，37℃消化30-90min，获得单细胞悬液；离心后，基质细胞和上皮细胞存于上清液中；对分离的细胞悬液进行培养，即获得所述子宫内膜干细胞。

然而，现有技术所制备或分离出的子宫内膜干细胞存在存活率不高的问题，限制了子宫内膜干细胞的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备子宫内膜干细胞的培养基，使得所述培养基能够提高制备的子宫内膜干细胞的存活率；

本发明的另外一个目的在于提供一种子宫内膜干细胞的制备方法，使得所述制备方法能够提高子宫内膜干细胞的存活率。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种制备子宫内膜干细胞的培养基，以无血清培养基为基础，含有Pall血清替代物、青/链霉素、硫酸庆大霉素、谷氨酰胺、MEM NEAA、丙酮酸钠、EGF、bEGF和VEGF。

针对现有子宫内膜干细胞存活率不高的问题，本发明从培养基入手，通过调整优化培养基的组分，显著提高了所制备的子宫内膜干细胞的存活率。

其中，作为优选，所述培养基以无血清培养基为基础，含有1％-3％(w/v)Pall血清替代物、0.8％-1.2％(w/v)青/链霉素、0.8％-1.2％(w/v)硫酸庆大霉素、1mM-3mM谷氨酰胺、1mM-3mM MEM NEAA、0.8mM-1.2mM丙酮酸钠、0.5μg/ml-1.5μg/ml EGF、0.8μg/ml-1.2μg/ml bEGF和0.8μg/ml-1.2μg/ml VEGF。

更具体地，以无血清培养基为基础，含有2％(w/v)Pall血清替代物、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素、2mM谷氨酰胺、2mM MEM NEAA、1μg/ml EGF、1mM丙酮酸钠、1μg/ml bEGF和1μg/mlVEGF。

更为具体地，所述无血清培养基为Lonza无血清培养基。

采用本发明培养基对消化后的子宫内膜组织进行培养，子宫内膜干细胞的存活率高达95％以上，因此本发明提供了所述培养基在制备子宫内膜干细胞和/或制备子宫内膜干细胞的试剂产品中的应用。

根据上述应用，本发明提供了一种制备子宫内膜干细胞的试剂产品，包括本发明所述培养基。

为了能够进一步提高子宫内膜干细胞的存活率，本发明还从酶消化环节入手，调整常规使用的胶原酶I和胶原酶IV的混合消化液为胶原酶I和DispaseII的混合消化液，结果显示，子宫内膜干细胞的存活率可高达99％以上。故本发明所述试剂产品中还包括胶原酶I和Dispase II。

同时，本发明还提供了一种制备子宫内膜干细胞的方法，先清洗子宫内膜组织，酶解消化后过滤，滤液采用本发明所述培养基培养，获得所述子宫内膜干细胞。

其中，所述酶解消化优选为采用含4mg/ml胶原酶I和2mg/ml Dispase II的高糖DMEM基础培养基在37℃消化30-90min。所述培养为在37℃、5％CO₂环境下培养。

在本发明具体实施方式中，本发明提供了较为具体的制备方法：

对获得的子宫内膜组织材料，进行清洗处理，加入10倍体积预冷的、含有2×双抗、0.1％胎牛血清的氯化钠注射液，震荡摇匀，吸去清洗液；再加入10倍体积的75％酒精，浸泡不超过30s，弃去酒精；最后加入组织清洗液再清洗2次；

将清洗后的子宫内膜组织剪碎至20-50mm³，加入等体积的混合消化液，消化液中含4mg/ml胶原酶I和2mg/ml Dispase II，恒温震荡器里200R、37℃消化30-90min，获得单细胞悬液；将消化好的单细胞悬液过100μm一次性滤网，弃去微小组织块；500g离心10min，用Lonza无血清培养基将细胞沉淀重悬接种于培养瓶中，加入2％Pall血清替代物、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素、2mM谷氨酰胺、2mM MEM NEAA、1μg/ml EGF、1μg/mlbEGF、1mM丙酮酸钠、1μg/mlVEGF，37℃、5％CO₂培养箱孵育，获得所述子宫内膜干细胞。

培养期间，首次间隔72h换液，之后每2-4天换一次液，待细胞长至80-90％可传代、冻存处理。

由以上技术方案可知，本发明以以无血清培养基为基础，添加Pall血清替代物、青/链霉素、硫酸庆大霉素、谷氨酰胺、MEM NEAA、丙酮酸钠、EGF、bEGF和VEGF作为子宫内膜干细胞的培养成分，能够显著的提高子宫内膜干细胞的存活率；在此基础上配合胶原酶I和Dispase II的混合消化，能够更进一步提高子宫内膜干细胞的存活率，促进了子宫内膜干细胞的发展应用。

具体实施方式

本发明公开了一种制备子宫内膜干细胞的培养基以及制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述培养基及其应用和制备方法已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述培养基及其应用和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

如未特别说明，本发明具体实施例的对比试验中，实验组和对比组除去应有的区别外，所采用的子宫内膜组织以及各试剂、试验环境均相同。

以下就本发明所提供的一种制备子宫内膜干细胞的培养基以及制备方法做进一步说明。

实施例1：本发明所述培养基

以Lonza无血清培养基为基础，含有2％(w/v)Pall血清替代物、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素、2mM谷氨酰胺、2mM MEM NEAA、1mM丙酮酸钠、1μg/ml EGF、1μg/ml bEGF和1μg/ml VEGF。

其中，Lonza为瑞士龙沙集团购买，批号：0000699907；Pall血清替代物为美国PALL公司，批号：259509/R349-01；青/链霉素为以色列BI，批号：1807212；硫酸庆大霉素Solarbio货号：G8170；谷氨酰胺sigma货号：RNBG6180；MEM NEAA为Gibco货号：195809；丙酮酸钠为Sigma货号：N1633-1

实施例2：本发明制备子宫内膜干细胞的方法

将清洗后的子宫内膜组织剪碎至20-50mm³，加入等体积的混合消化液，消化液中含4mg/ml胶原酶I和2mg/ml Dispase II，恒温震荡器里200R、37℃消化30-90min，获得单细胞悬液；将消化好的单细胞悬液过100μm一次性滤网，弃去微小组织块；500g离心10min，用Lonza无血清培养基将细胞沉淀重悬接种于培养瓶中，加入2％Pall血清替代物、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素、2mM谷氨酰胺、2mM MEM NEAA、1mM丙酮酸钠、1μg/mlEGF、1μg/ml bEGF、1μg/mlVEGF，37℃、5％CO₂培养箱孵育，获得所述子宫内膜干细胞。

实施例3：不同工艺制备的子宫内膜干细胞存活率对比试验

实验组：实施例2方法：

对照组1：方法同实施例2，区别在于以α-MEM为基础培养基，2％Pall血清替代物、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素、2mM谷氨酰胺、2mM MEM NEAA、1mM丙酮酸钠、1μg/ml EGF、1μg/ml PDGF-BB；

对照组2：方法同实施例2，区别在于混合消化液中含4mg/ml胶原酶I和2mg/ml胶原酶IV；

对照组3：方法同实施例2，区别在于混合消化液中含4mg/ml胶原酶I和2mg/ml胶原酶IV；以及以DMEM/F12为基础培养基，含15％(v/v)胎牛血清、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素；

对照组4：方法同实施例2，区别在于混合消化液中含4mg/ml胶原酶I和2mg/ml胶原酶IV；以及以DMEM/F12为基础培养基，含15％(v/v)胎牛血清、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素、2mM谷氨酰胺、2mM MEM NEAA、1mM丙酮酸钠；

结果见表1。

表1

	实验组	对照组1	对照组2	对照组3	对照组4
						4天后所得细胞数	6.8×10<sup>6</sup>	4.4×10<sup>6</sup>	3.7×10<sup>6</sup>	2.9×10<sup>6</sup>	3.1×10<sup>6</sup>
存活率	99.28％	93.85％	88.38％	90.19％	91.89％

由表1可知，本发明所述培养基和制备方法能够明显的提高细胞数和细胞存活率，相比较其他对照组有明显的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种制备子宫内膜干细胞的培养基，其特征在于，以无血清培养基为基础，含有Pall血清替代物、青/链霉素、硫酸庆大霉素、谷氨酰胺、MEM NEAA、EGF、丙酮酸钠、bEGF和VEGF。

2.根据权利要求1所述培养基，其特征在于，以无血清培养基为基础，含有1％-3％(w/v)Pall血清替代物、0.8％-1.2％(w/v)青/链霉素、0.8％-1.2％(w/v)硫酸庆大霉素、1mM-3mM谷氨酰胺、1mM-3mM MEM NEAA、0.8mM-1.2mM丙酮酸钠、0.5μg/ml-1.5μg/ml EGF、0.8μg/ml-1.2μg/ml bEGF和0.8μg/ml-1.2μg/ml VEGF。

3.根据权利要求2所述培养基，其特征在于，以无血清培养基为基础，含有2％(w/v)Pall血清替代物、1％(w/v)青/链霉素、1％(w/v)硫酸庆大霉素、2mM谷氨酰胺、2mM MEMNEAA、1μg/ml EGF、1mM丙酮酸钠、1μg/ml bEGF和1μg/mlVEGF。

4.根据权利要求1-3任意一项所述培养基，其特征在于，所述无血清培养基为Lonza无血清培养基。

5.权利要求1-4任意一项所述培养基在制备子宫内膜干细胞和/或制备子宫内膜干细胞的试剂产品中的应用。

6.一种制备子宫内膜干细胞的试剂产品，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述培养基。

7.根据权利要求6所述试剂产品，其特征在于，还包括胶原酶I和Dispase II。

8.一种制备子宫内膜干细胞的方法，其特征在于，清洗子宫内膜组织，酶解消化后过滤，采用权利要求1-4任意一项所述培养基培养，获得所述子宫内膜干细胞。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述酶解消化为采用含4mg/ml胶原酶I和2mg/ml Dispase II的高糖DMEM基础培养基在37℃消化30-90min。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述培养为在37℃、5％CO₂环境下培养。