CN109097320A - 一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法 - Google Patents

一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法，包括如下步骤：获取羔羊瘤胃组织；钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层；将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白；用胰蛋白酶继续消化，收集细胞；把收集到的细胞沉淀清洗，用完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；换瓶培养，定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。本发明对瘤胃上皮细胞分离培养进行改进，通过此法能有效获得活力高，贴壁早，生长快的瘤胃上皮细胞。普通消化分离方法所得的细胞接种后3～6d开始贴壁，8～10d完成铺层，而本发明的消化分离方法所得的细胞在2～3d开始贴壁，5～6d完成铺层。

Description

一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞分离培养领域，尤其是一种绵羊羔羊的瘤胃上皮细胞的分离培养方法。
背景技术
现在细胞体外培养技术已成为现代生物学研究领域中应用最广泛的技术。细胞体外培养具有实时监控(监测时可定量评估细胞形态、结构和生命活动等)、研究条件可控性强(便于各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育及凋亡等影响的研究)、样本均一性高(便于单因子和多因子分析)、应用范围广泛及费用相对低等优点。
瘤胃是反刍动物对饲料营养物质消化、吸收及能量代谢的重要场所。瘤胃上皮系统作为发挥瘤胃功能的主要部位之一，可对挥发性脂肪酸以及Ca2+的吸收产生影响，并对瘤胃的酸化起到预防作用，且对母畜的分娩期、泌乳早期健康、泌乳性能及产后恢复有直接影响。瘤胃上皮细胞在一定条件应用于体外分离和培养。王远孝等对离体瘤胃上皮细胞在瘤胃代谢的研究进行综述，得出离体瘤胃上皮细胞培养技术可以应用于研究瘤胃上皮组织形态和代谢过程。目前，在上皮细胞培养中普遍使用胰蛋白酶和胶原酶，Baldwin等应用系列胰酶消化方法，虽然成功分离出足够数量的活细胞但只能进行短期培养，在测定2h培养期内BHBA生成时，发现培养的也主要是角质层始点细胞。Galfi等采用相同的方法，成功地分离培养出了绵羊瘤胃上皮细胞，但是该法需约8h从基底层和棘层中分离出细胞，限制了上皮细胞代谢研究中的应用。此外，余燕等尝试采用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA对成年牛瘤胃上皮组织进行冷消化18h，虽然获得大量细胞但细胞活性较差，培养时发现细胞大多很快死亡，其可能原因在于低温下细胞代谢较弱，能较好地保持细胞内营养。
目前在许多瘤胃上皮细胞的体外培养试验中发现瘤胃上皮细胞贴壁时间长，增殖缓慢，容易污染且不能传代等诸多问题。说明这些瘤胃上皮细胞的分离培养方法效果不佳，因此改进和优化瘤胃上皮细胞的体外分离和培养技术有助于深入了解瘤胃上皮代谢及功能方面的作用。
发明目的
发明内容：针对现有瘤胃上皮细胞分离培养存在的问题，本发明提供一种新型羔羊瘤胃上皮细胞培养方法，该培养方法目的在于改进和优化瘤胃上皮细胞的分离培养技术，以期获得活力高，贴壁早，形态好，生长快的瘤胃上皮细胞。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
(1)获取羔羊瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织，将瘤胃内容物冲洗干净；
(2)用分离工具钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层并清洗瘤胃组织；
(3)将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，进行清洗；
(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，每隔一段时间收集一次细胞悬液，将细胞悬液过滤后混合，离心收集细胞；
(5)收集到的细胞沉淀用D-Hanks清洗，用完全培养基重悬细胞后，接种于含有完全培养基的培养瓶中培养；
(6)换瓶培养以去除成纤维细胞；定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。
其中，步骤(1)所述瘤胃内容物先用灭菌的D-Hanks溶液冲洗干净，然后用含6倍青链霉素的D-Hanks溶液各方向刷洗多次，直至溶液出现澄清为止。
其中，步骤(2)所述钝性分离为用分离工具小心地钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层，再用6倍青链霉素的D-Hanks溶液冲洗。
其中，步骤(3)所述将瘤胃组织裁剪后，用1倍青链霉素的D-Hanks溶液清洗，然后平铺在锥形瓶底部，再用添加1倍三抗(青霉素，链霉素和庆大霉素)的胰蛋白酶和乙二胺四乙酸消化。
进一步地，步骤(3)所述瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，消化时间短为2-3h；所述进行清洗加1倍青链霉素的D-Hanks液清洗。
优选地，先将步骤(3)中瘤胃组织剪成100ml锥形瓶底部面积大小，用6倍青链霉素的D-Hanks溶液清洗5～6次后平铺在锥形瓶底部，再用添加1倍三抗(青霉素，链霉素和庆大霉素)的0.25％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)消化30分钟，每隔5分钟轻轻摇晃，使其消化均匀，重复上述胰蛋白酶消化步骤3～4次；瘤胃上皮出现粘稠且乳头发白，羊的消化时间短，一般2-3h。进入超净台操作，将上述处理后的上皮组织置于无菌烧杯中，加1倍青链霉素的D-Hanks液清洗3次，更换烧杯再洗3次。
其中，步骤(4)所述每隔5-6分钟收集一次细胞悬液，前2～3次的细胞悬液不收集，收集最后2～3次消化的细胞悬液。前2～3次消化的细胞一般为坏死细胞或是颗粒层细胞，不收集。一般只收集最后2～3次消化的细胞(棘突细胞和基底细胞)。最后2-3次收集的细胞消化液(显微镜下观察消化所得细胞大部分为椭圆形细胞时进行收集)。
进一步地，所述最后2～3次消化的细胞悬液通过滤膜过滤后取上清液混合离心，离心条件转速为1000～1500rpm，时间为8～10分钟。
更进一步地，步骤(5)所述收集到的细胞沉淀用D-Hanks溶液清洗，用完全培养基重悬细胞后在显微镜下观察细胞形态均一(约95％的椭圆形细胞)，调节细胞密度至大于106/ml，台盼蓝检测细胞活率达到95％以上后接种到含有完全培养基的培养瓶中(培养瓶事先底部铺满明胶)。
优选地，步骤(5)得到的细胞沉淀用D-Hanks溶液清洗1～2次，按照步骤(4)中的方法离心，用完全培养基重悬细胞后在显微镜下观察细胞形态均一(约95％的椭圆形细胞)，调节细胞密度至大于106/ml，台盼蓝检测细胞活率达到95％以上后接种到含有完全培养基的培养瓶(底部铺满明胶)中(25ml培养瓶加10ml完全培养基，75ml的培养瓶加25ml完全培养基)置于5％CO2，37℃培养箱中培养。
步骤(6)所述换瓶时间为接种后1h，换瓶后1h后再次换瓶培养(瓶底铺满明胶)；
其中，步骤(6)所述铺层80％～90％左右时，用胰蛋白酶消化后可进行传代或者液氮保存。所述细胞传代培养使用胰蛋白酶消化，时间为4～7分钟。
机理：本发明对瘤胃上皮细胞的分离培养方法进行改进和优化，使瘤胃上皮组织的乳头能够充分接触胰蛋白酶消化液，减少消化时间和胰蛋白酶对上皮细胞的损伤，缩短细胞接种后的生长调整期和贴壁时间。同时进行换瓶培养以去除成纤维细胞和角化的细胞，对所需的瘤胃上皮细胞进行纯化。获得的瘤胃上皮细胞可以进行传代，降低试验成本，有助于深入了解瘤胃上皮代谢及功能方面的作用。
本发明中的青霉素，链霉素和庆大霉素以及0.25％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸的消化液均购买于GIBCO公司。
其中，6倍青链霉素的D-Hanks溶液为D-Hanks溶液中青霉素浓度为600u/ml，链霉素的浓度为0.6mg/ml；1倍青链霉素的D-Hanks溶液为D-Hanks溶液中青霉素浓度为100u/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml；
1倍三抗(青霉素，链霉素和庆大霉素)的0.25％的胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸为0.25％的胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸消化液，加入三抗，三抗终浓度为100u/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素和0.05mg/ml的庆大霉素。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点在于：
本发明改进和优化了瘤胃上皮细胞分离培养技术，通过此方法可以获得活力高，贴壁早，形态好，生长快的瘤胃上皮细胞，普通消化分离方法所得的细胞接种后3～6d开始贴壁，8～10d完成铺层，而通过所述的消化分离方法所得的细胞在2～3d开始贴壁，5～6d完成铺层。
附图说明
图1为普通分离方法培养的绵羊羔羊瘤胃上皮细胞(100×)；
图2为本发明分离方法培养的绵羊羔羊瘤胃上皮细胞(100×)。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
绵羊羔羊的瘤胃上皮细胞的分离培养方法：
(1)组织获取：无菌条件下，将两月龄内的绵羊羔羊颈动脉放血处死，迅速解剖后获取瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织；
(2)用6倍的青链霉素的D-Hanks溶液多次冲洗，去除瘤胃内容物，然后再漂洗7次，能有效的去除残留的细菌和真菌，用4℃遇冷的6倍的青链霉素的D-Hanks溶液将瘤胃组织带回超净台工作；在6倍青链霉素的D-Hanks溶液中小心地用分离工具如剪刀、镊子、手术刀等钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层，收集上皮组织块，分离得到瘤胃上皮组织用6倍的青链霉素的D-Hanks溶液冲洗3次；
(3)将瘤胃组织剪成100ml锥形瓶底部面积大小，用1倍青链霉素的D-Hanks溶液漂洗5次，然后平铺在锥形瓶底部，加入1倍三抗(青霉素，链霉素和庆大霉素)的0.25％的胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸(0.25％和0.02％为质量百分数)在37℃水浴中进行温浴30min进行消化，消化液没过组织即可，每隔5min进行轻轻摇晃，使其消化均匀，重复上述胰蛋白酶消化步骤3次；若中途胰蛋白酶溶液出现浑浊，可进行更换；等到瘤胃上皮组织出现粘稠且乳头发白，一般羊的瘤胃上皮组织的消化时间为2h。进入超净台操作，将上述处理后的上皮组织置于无菌烧杯中，加1倍青链霉素的D-Hanks液清洗3次，更换烧杯再洗3次。
(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，直到看到有细碎细胞脱落，间隔5min收集一次细胞悬液，前3次消化的细胞一般为坏死细胞或是颗粒层细胞，不收集。一般只收集最后3次消化的细胞(棘突细胞和基底细胞)。最后3次收集的细胞悬液(显微镜下观察消化所得细胞大部分为椭圆形细胞时进行收集)用70um的滤膜进行过滤，收集的滤液在1500rpm下离心8分钟收集细胞；
(5)用D-Hanks溶液把收集到的细胞沉淀清洗2次，按照步骤4中的方法离心，用完全培养基重悬细胞后在显微镜下观察细胞形态均一(约95％的椭圆形细胞)，调节细胞密度至大于106/ml，台盼蓝检测细胞活率达到95％以上后接种到培养瓶中(25ml培养瓶加10ml完全培养基，75ml的培养瓶加25ml完全培养基)，置于体积百分数5％CO2，37℃培养箱中养。
(6)培养1小时后，轻轻吸取上层悬液于另一培养瓶中继续培养，换瓶培养重复2次可有效去除成纤维细胞；换瓶培养48h后，更换新的完全培养液继续培养(瓶底铺满明胶的培养瓶)，5d后铺层，即绵羊羔羊瘤胃上皮细胞。
若想用于细胞冻存储备，可在铺层至80％～90％时，PBS清洗两次，用不含EDTA的质量分数0.25％胰蛋白酶消化4min，终止消化后离心处理，重悬于冻存液(胎牛血清：DMEM＝9：1，v/v)，按照冻存步骤储存于液氮中。
实施例2
绵羊羔羊的瘤胃上皮细胞的分离培养方法：
(1)组织获取：无菌条件下，将两月龄内的绵羊羔羊颈动脉放血处死，迅速解剖后获取瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织；
(2)用6倍的青链霉素的D-Hanks溶液多次冲洗，去除瘤胃内容物，然后再漂洗8次，能有效的去除残留的细菌和真菌，用4℃遇冷的6倍的青链霉素的D-Hanks溶液将瘤胃组织带回超净台工作；在6倍青链霉素的D-Hanks溶液中小心地用分离工具如剪刀、镊子、手术刀等钝性分离黏附的浆膜层和肌肉层，收集上皮组织块，分离得到瘤胃上皮组织用6倍的青链霉素的D-Hanks溶液冲洗4次；
(3)将瘤胃组织剪成100ml锥形瓶底部面积大小，用1倍青链霉素的D-Hanks溶液漂洗6次，然后平铺在锥形瓶底部，然后加入1倍三抗(青霉素，链霉素和庆大霉素)的0.25％的胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸(0.25％和0.02％为质量百分数)在37℃水浴中进行温浴30min进行消化，消化液没过组织即可，每隔5min进行轻轻摇晃，使其消化均匀，重复上述胰蛋白酶消化步骤4次；若中途胰蛋白酶溶液出现浑浊，可进行更换；等到瘤胃上皮组织出现粘稠且乳头发白，一般羊的瘤胃上皮组织的消化时间为3h。进入超净台操作，将上述处理后的上皮组织置于无菌烧杯中，加D-Hanks液清洗3次，更换烧杯再洗3次。
(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，直到看到有细碎细胞脱落，间隔6min收集一次细胞悬液，前2次消化的细胞一般为坏死细胞或是颗粒层细胞，不收集。一般只收集最后2次消化的细胞(棘突细胞和基底细胞)。最后2次收集的细胞悬液(显微镜下观察消化所得细胞大部分为椭圆形细胞时进行收集)用70um的滤膜进行过滤，收集的滤液在1000rpm下离心10分钟收集细胞；
(5)用D-Hanks溶液把收集到的细胞沉淀清洗1次，按照步骤4中的方法离心，用完全培养基重悬细胞后在显微镜下观察细胞形态均一(约95％的椭圆形细胞)，调节细胞密度至大于106/ml，胎盼蓝检测细胞活率达到95％以上后接种到培养瓶中(25ml培养瓶加10ml完全培养基，75ml的培养瓶加25ml完全培养基)，置于体积百分数5％CO2，37℃培养箱中养。
(6)培养1小时后，轻轻吸取上层悬液于另一培养瓶中继续培养，换瓶培养重复3次可有效去除成纤维细胞；换瓶培养48h后，更换新的完全培养液继续培养(瓶底铺满明胶的培养瓶)，6d后铺层，即绵羊羔羊瘤胃上皮细胞。
若想用于细胞冻存储备，可在铺层至80％～90％时，PBS清洗两次，用不含EDTA的质量分数0.25％胰蛋白酶消化5min，终止消化后离心处理，重悬于冻存液(胎牛血清：DMEM＝9：1)，按照冻存步骤储存于液氮中。
对比例1
普通瘤胃上皮细胞的分离方法参照Stumpff(Stumpff,F.,M.I.Georgi,L.Mundhenk,et al.,Sheep rumen and omasum primary cultures and sourceepithelia:barrier function aligns with expression of tight junctionproteins.Journal of Experimental Biology,2011.214(17):2871-2882.)及卢劲晔博士论文(第四章体外研究高能量日粮诱导瘤胃上皮细胞增殖的机理)的方法。
在光学显微镜下观察细胞生长情况，上述普通方法处理和本发明实施例1方法处理的瘤胃上皮细胞生长情况见图1和图2。
普通瘤胃上皮细胞的分离方法所得的细胞3～6d开始贴壁，本发明实施例1的瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞2～3d开始贴壁，说明本发明的方法能有效缩短细胞接种后生长调整期。
普通瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞铺层时间较长，8～10d完成铺层，或出现生长停滞，且细胞形态不均一，呈扁平状、多角状或长梭型；而本发明实施例1的瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞5～6d完成铺层，形态均一，呈鳞片状，说明本发明的方法能有效降低消化处理对细胞的损伤，保证细胞后期能够迅速增殖。

Claims (10)

1.一种绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获取羔羊瘤胃后腹盲囊靠近后沟处组织，将瘤胃内容物冲洗干净；
(2)钝性分离并清洗瘤胃组织；
(3)将瘤胃组织裁剪，用胰蛋白酶溶液消化，直至瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，进行清洗；
(4)清洗后用胰蛋白酶继续消化，每隔一段时间收集一次细胞悬液，将细胞悬液过滤后混合，离心收集细胞；
(5)收集到的细胞沉淀清洗，完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；
(6)换瓶培养以去除成纤维细胞；定期更换培养基，完成铺层，即培养所得的细胞为瘤胃上皮细胞。
2.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)所述瘤胃内容物先用灭菌的D-Hanks溶液冲洗干净，然后用含青链霉素的D-Hanks溶液各方向刷洗多次，直至溶液出现澄清为止。
3.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)所述钝性分离为用分离工具将黏附的浆膜层和肌肉层分离，再用含青链霉素的D-Hanks溶液冲洗。
4.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)所述将瘤胃组织裁剪后，用含青链霉素的D-Hanks溶液清洗，然后平铺在锥形瓶底部，再用添加三抗的胰蛋白酶和的乙二胺四乙酸消化。
5.根据权利要求4所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述三抗优选为青霉素，链霉素和庆大霉素。
6.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)所述瘤胃上皮组织呈现粘性且乳头发白，消化时间短为2-3h；所述进行清洗为加含青链霉素的D-Hanks液清洗。
7.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)所述每隔5～6分钟收集一次细胞悬液，前2～3次的细胞悬液不收集，收集最后2～3次消化的细胞悬液。
8.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述最后2～3次消化的细胞悬液通过滤膜过滤后取上清液混合离心，离心条件转速为1000～1500rpm，时间为8～10分钟。
9.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)所述收集到的细胞沉淀用D-Hanks溶液清洗，用完全培养基重悬细胞后在显微镜下观察细胞形态均一，然后调节细胞密度至大于106/ml，台盼蓝检测细胞活率达到95％以上后接种到的培养瓶中。
10.根据权利要求1所述绵羊羔羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(6)所述铺层80％～90％左右时，用胰蛋白酶消化后可进行传代或者液氮保存。
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