CN117210399A - 一种脐带血间充质干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带血间充质干细胞的培养方法，涉及细胞培养领域，所述间充质干细胞的培养包括以下使用材料：培养基、胰蛋白酶、肝素溶液和羟甲基纤维素，包括以下步骤：步骤一：准备新鲜脐带血；步骤二：分离脐带血中的单个核细胞成分；步骤三：分离间充质干细胞；步骤四：培养和扩增间充质干细胞；步骤五：组织培养后脱落，所述步骤一中，脐带是72小时内并在适当环境下保存的新鲜脐带、无大范围凝血、为乳白色、未发生水肿病变、华通氏胶部分含量丰富的脐带。本发明的有益效果是：脐带血样品培养时，在显微镜下看到大部分细胞变圆不贴壁，则拍打培养瓶两侧大量细胞脱落，此时立即终止消化，可防止胰蛋白酶消化过度。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体为一种脐带血间充质干细胞的培养方法。
背景技术
间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、增殖、多向分化能力的一类干细，MSCs作为一类具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，因其具有自我更新复制和多向分潜能，已被证明具有强大的修复再生损伤组织的能力,骨髓间充质干细胞是最早发现的间充质干细胞，研究也最为广泛，但是成人骨间充质干细胞的数量、分化增殖能力受个体年龄、身体健康状态影响较大，且取样需要对骨髓进行穿刺，对身体伤害较大，操作过程也易受到污染,与骨髓间充质干细胞相比，来源于新生儿脐带的间充质干细胞属于医疗废物，取材方便，来源丰富，成本低，数量多且增殖分化能力强，能更好地应用于医疗和美容方面，是更理想的间充质细胞来源,脐带间充质干细胞具有强大的增殖能力，可迅速扩增，还具有不易衰老、多向分化潜能等特点,为了保障脐带间充质干细胞的应用，通过体外增殖培养获得足够数量的细胞成为常用的技术手段，脐带间充质干细胞(UCMSC)的分离是指采用机械、酶消化或组织培养法等获得单细胞悬液，然后通过贴壁培养的方法从中纯化获取间充质干细胞的过程，由于间充质干细胞具有贴壁生长的特性，尤其在塑料培养瓶中生长良好，因此可利用简单的塑料培养瓶进行贴壁培养即可去除大部分的杂细胞，获得纯度相对高的UCMSC。
目前，脐带血中间充质干细胞培养过程中，容易出现胰蛋白酶消化过度的问题，需要及时处理，需要一种脐带血间充质干细胞的培养方法，能够解决现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决脐带血中间充质干细胞培养过程中，容易出现胰蛋白酶消化过度的问题，需要及时处理的问题，提供一种脐带血间充质干细胞的培养方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种脐带血间充质干细胞的培养方法，所述间充质干细胞的培养包括以下使用材料：培养基、胰蛋白酶、肝素溶液和羟甲基纤维素。
优选地，所述包括以下步骤：
步骤一：准备新鲜脐带血；
步骤二：分离脐带血中的单个核细胞成分；
步骤三：分离间充质干细胞；
步骤四：培养和扩增间充质干细胞；
步骤五：组织培养后脱落。
优选地，所述步骤一中，脐带是72小时内并在适当环境下保存的新鲜脐带、无大范围凝血、为乳白色、未发生水肿病变、华通氏胶部分含量丰富的脐带。
优选地，所述步骤二中，将准备的脐带血样品均经过肝素溶液的抗凝处理，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单个核细胞成分之后，将脐带血样品接种于包被蛋白基质成分的培养皿中。
优选地，所述步骤三中，在培养皿中加入MSCM培养基培养，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中静置于贴壁培养，期间避免振荡，目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁。
优选地，所述步骤四中，每5-8天更换MSCM培养基培养，直至细胞为80-95％融合；细胞用胰蛋白酶进行消化，接种于一般培养板，使用MSCM培养基继续培养，2-4天换液一次，直至融合。
优选地，所述步骤五中，脐带血样品培养时，在显微镜下看到大部分细胞变圆不贴壁，则拍打培养瓶两侧大量细胞脱落，此时立即终止消化。
优选地，所述步骤五中，贴壁培养成功后，更换培养液，且操作微组织脱落，将脱落下来的组织块接种至相同面积的另一塑料培养瓶的瓶底进行贴壁培养，反复多次进行，可获得多倍数的原代间充质干细胞。
优选地，所述步骤五中，计数制备的间充质干活细胞，用完全培养基稀释，收集细胞进行冻存或继续传代培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：脐带血样品培养时，在显微镜下看到大部分细胞变圆不贴壁，则拍打培养瓶两侧大量细胞脱落，此时立即终止消化，可防止胰蛋白酶消化过度。
附图说明
图1为本发明的方法流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，一种脐带血间充质干细胞的培养方法，所述间充质干细胞的培养包括以下使用材料：培养基、胰蛋白酶、肝素溶液和羟甲基纤维素。
包括以下步骤：
步骤一：准备新鲜脐带血；
步骤二：分离脐带血中的单个核细胞成分；
步骤三：分离间充质干细胞；
步骤四：培养和扩增间充质干细胞；
步骤五：组织培养后脱落。
实施例1
作为本发明的优选实施例：步骤一中，脐带是72小时内并在适当环境下保存的新鲜脐带、无大范围凝血、为乳白色、未发生水肿病变、华通氏胶部分含量丰富的脐带；
脐带形状如绳索，表面光滑透明，内含结缔组织和一支脐静脉，一对脐动脉以及华通氏胶，脐静脉沿着胎儿腹壁内面通过肝的血窦、脐动脉与胎儿主动脉相通连，这两种血管的另一端，形成许多相互联系的毛细血管网，分布于胎盘绒毛内，通过胎盘绒毛上皮的渗透作用，胎儿盘液与绒毛间隙内母体血液之间进行物质交换。
实施例2
作为本发明的优选实施例：步骤二中，将准备的脐带血样品均经过肝素溶液的抗凝处理，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单个核细胞成分之后，将脐带血样品接种于包被蛋白基质成分的培养皿中；
在无菌条件下取脐带一根，转移入离心管中加入生理盐水反复冲洗，最后用双抗水浸泡5～10分钟，用生理盐水冲洗干净后，在无菌的培养皿中，用镊子配合剪刀去除被膜、血管等，再用生理盐水冲洗去除血液和杂质，去除后，可再经过肝素溶液的抗凝处理，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单个核细胞成分。
实施例3
作为本发明的优选实施例：步骤三中，在培养皿中加入MSCM培养基培养，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中静置于贴壁培养，期间避免振荡，目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁；
在培养皿中加入DCM培养基培养，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中静置于贴壁培养，期间避免振荡，目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁。
实施例4
作为本发明的优选实施例：步骤四中，每5-8天更换MSCM培养基培养，直至细胞为80-95％融合；细胞用胰蛋白酶进行消化，接种于一般培养板，使用MSCM培养基继续培养，2-4天换液一次，直至融合；
培养基，是指供给微生物、植物或动物(或组织)生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)、维生素和水等几大类物质，胰蛋白酶，作为消化酶而起作用，在胰脏是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后，作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
实施例5
作为本发明的优选实施例：步骤五中，脐带血样品培养时，在显微镜下看到大部分细胞变圆不贴壁，则拍打培养瓶两侧大量细胞脱落，此时立即终止消化；
脐带血样品培养时，在显微镜下看到大部分细胞变圆不贴壁，则拍打培养瓶两侧大量细胞脱落，此时立即终止消化，可防止胰蛋白酶消化过度，胰酶浓度：推荐胰酶使用浓度为0.25％(含0.04％EDTA)，使用之前需预热至37℃且pH值应维持在7.2左右，切忌消化过度(包括胰酶浓度过高、消化时间过长等)，否则会导致细胞死亡、分化、状态变差，分化能力丢失等现象，细胞消化过程中需要在显微镜下观察细胞的消化程度，当看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱落，此时应立即终止消化，若细胞仍有大部分贴壁，可适当延长消化时间以避免消化不彻底的情况出现。
实施例6
作为本发明的优选实施例：步骤五中，贴壁培养成功后，更换培养液，且操作微组织脱落，将脱落下来的组织块接种至相同面积的另一塑料培养瓶的瓶底进行贴壁培养，反复多次进行，可获得多倍数的原代间充质干细胞；
培养液为：无菌条件下在500ml基础DMEM-F12培养液中加入55ml胎牛血清，再用6.6％NaHCO3溶液调节pH值至7.4后备用，脐带组织块培养后2周左右，细胞可长满瓶底，达到80％以上融合，此时可用吸除培养基，加入适量0.25％的胰酶，充分摇晃均匀，置于37℃培养箱中放置5分钟，注意观察细胞形态变化，发现细胞收缩，摇晃培养瓶有片状细胞脱落时，立即加入含10％血清的培养液10～15ml终止反应，用吸管吹打使细胞完全脱落，然后将细胞悬液移入离心管中，300～400×g离心10分钟，再加入生理盐水10ml，离心洗涤，反复3次后，计数活细胞。
实施例7
作为本发明的优选实施例：步骤五中，计数制备的间充质干活细胞，用完全培养基稀释，收集细胞进行冻存或继续传代培养；
传代培养通常采用专用细胞培养瓶，以DMEM/F12培养基为基础，按原代培养密度1∶3的比例进行传代培养，实验室创建了一种以脐带组织块培养法为基础的高效、大规模体外制备技术，组织块可反复接种培养3次以上，获得原代细胞的数量在1×10^9个细胞以上，传代培养至第3代，可获得3.6×10^10个细胞。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (9)
1.一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞的培养包括以下使用材料：培养基、胰蛋白酶、肝素溶液和羟甲基纤维素。
2.根据权利要求1所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述包括以下步骤：
步骤一：准备新鲜脐带血；
步骤二：分离脐带血中的单个核细胞成分；
步骤三：分离间充质干细胞；
步骤四：培养和扩增间充质干细胞；
步骤五：组织培养后脱落。
3.根据权利要求2所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤一中，脐带是72小时内并在适当环境下保存的新鲜脐带、无大范围凝血、为乳白色、未发生水肿病变、华通氏胶部分含量丰富的脐带。
4.根据权利要求2所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤二中，将准备的脐带血样品均经过肝素溶液的抗凝处理，羟甲基纤维素裂解红细胞，密度梯度离心获取单个核细胞成分之后，将脐带血样品接种于包被蛋白基质成分的培养皿中。
5.根据权利要求2所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤三中，在培养皿中加入MSCM培养基培养，轻轻晃动培养瓶使组织块均匀分散于培养瓶底部，然后放入5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中静置于贴壁培养，期间避免振荡，目的是使富含间充质干细胞的组织充分贴壁。
6.根据权利要求2所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤四中，每5-8天更换MSCM培养基培养，直至细胞为80-95％融合；细胞用胰蛋白酶进行消化，接种于一般培养板，使用MSCM培养基继续培养，2-4天换液一次，直至融合。
7.根据权利要求2所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤五中，脐带血样品培养时，在显微镜下看到大部分细胞变圆不贴壁，则拍打培养瓶两侧大量细胞脱落，此时立即终止消化。
8.根据权利要求2所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤五中，贴壁培养成功后，更换培养液，且操作微组织脱落，将脱落下来的组织块接种至相同面积的另一塑料培养瓶的瓶底进行贴壁培养，反复多次进行，可获得多倍数的原代间充质干细胞。
9.根据权利要求2所述的一种脐带血间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤五中，计数制备的间充质干活细胞，用完全培养基稀释，收集细胞进行冻存或继续传代培养。
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- 2023-09-21 CN CN202311221536.1A patent/CN117210399A/zh active Pending
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