CN111088226A

CN111088226A - 一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法

Info

Publication number: CN111088226A
Application number: CN201911397112.4A
Authority: CN
Inventors: 赵蓝; 刘小翠; 李静静; 江嘉豪; 孙灿兴; 何美第
Original assignee: Guangdong Vitalife Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Vitalife Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-05-01

Abstract

本发明涉及胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，属于干细胞与再生医学技术领域。该方法，包括以下步骤：将P3代胎盘间充质干细胞培养、待融合度达到80‑90％后将其吸出培养基，更换DMEM培养基培养24h后收集上清液，去除细胞碎片，再通过0.22μm无菌过滤膜过滤，取滤液在13000r/min转速下离心60min，上清液通过0.22μm无菌过滤膜过滤，即得到高纯度外泌体，最后用生理盐水重悬并13000r/min离心65min，获得浓缩的外泌体；外泌体加入含SR无血清培养基、甘油和维生素C的冻存液，‑80℃冰冻24h后取出，再放入‑196℃液氮中冻存。上述胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，针对常规技术中的不足，通过调整提取方法和改良冻存液，取得高纯度、高密度且能保持活性的外泌体。

Description

一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法

技术领域

本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，特别是涉及一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一类来源于中胚层的具有高度更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以在体外培养扩增并在特定的条件下分化为脂肪细胞、骨细胞、肝脏细胞等组织细胞。因此，间充质干细胞在临床上被广泛应用于细胞移植治疗中。但是有研究表明，干细胞移植后的增值率很低，并不能代替整个组织，细胞移植治疗的主要机制很可能为干细胞的外泌体促进组织修复而不是简单的细胞代替。

外泌体是由活细胞分泌的直径30-150nm、包含了复杂的RNA和蛋白质的双层脂膜囊泡状结构。间充质干细胞的外泌体内包含多种趋化因子、细胞因子以及生长因子的转录因子等，不仅可以招募血管内皮细胞、促进其增殖和迁移来促进血管再生，以改善宿主血供，进而促进组织损伤修复；还可以刺激宿主内源性细胞，激活其活性，从而改善组织环境、增强内源性修复系统。

胎盘属于医疗废弃物，是胎儿出生后排出母体的产后废弃物，简单易得。胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)来源于胎盘绒毛膜。与其他来源的间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞的获取简单，且具有更强的增殖能力强，还能分泌更多的免疫调节因子。另外，间充质干细胞发挥作用的关键分子CD105在胎盘间充质干细胞中的含量更高。并且，胎盘间充质干细胞在体内向损伤组织迁移的能力更强，且具有更强的促进血管新生的能力。

由此，将胎盘来源的间充质干细胞进行分离、培养和纯化，并进一步获取其外泌体，能够一定程度上提高干细胞临床应用的成功率。然而，传统的对胎盘间充质干细胞外泌体的分离提取方法中最常用的为超速离心法，采用低速、高速离心交替进行，但该手段比较费时、回收率不稳定、外泌体的纯度受多种因素影响；另外，重复高速离心还可能对囊泡造成伤害，进而影响外泌体的纯度。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，

一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

培养：将P3代胎盘间充质干细胞接种在干细胞培养基中培养、待融合度达到80-90％后将其吸出培养基，更换DMEM培养基培养24h，收集上清液，去除细胞碎片，得到包含外泌体的溶液；

纯化：取上述包含外泌体的溶液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取滤液，随后将滤液置于10000-20000r/min转速下离心50-90min，离心后取上清液通过0.22μm无菌过滤膜过滤，用生理盐水重悬，并于10000-20000r/min离心50-90min，所得上清液即为外泌体。

上述胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，针对常规技术中提取时间长、提取纯度不高的不足，通过调整提取方法，在较短时间内取得高纯度、高密度的外泌体。

具体的，去除细胞碎片后的间充质干细胞在10000-20000r/min转速下离心50-90min获得高纯度外泌体，再进一步离心纯化浓缩，得到总蛋白浓度高的外泌体。

在其中一个实施例中，干细胞培养基包括：2％FBS，终浓度为40ng/mL的抗坏血栓和10ng/mL的bEGF。采用上述培养基有利于促进P3代胎盘间充质干细胞的增殖。

在其中一个实施例中，将P3代细胞接种于干细胞培养基后，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

在其中一个实施例中，上述去除细胞碎片的方法包括：第一次离心，以1800-5000r/min转速离心25min，取上清液进行第二次离心；第二次离心，以8000-10000r/min转速离心30min，保留上清液，即为包含外泌体的溶液。

在其中一个实施例中，所述P3代胎盘间充质干细胞可以通过以下方法获得：

1)胎盘预处理：将采取得到的组织加入清洗液清洗至无血液残留，离心，保留沉淀，即获得干净的胎盘组织；

2)胎盘组织消化：将上述胎盘组织剪成小块，并加入组织消化液消化，获得分离的胎盘间充质干细胞；

3)胎盘间充质干细胞的原代培养：在上述胎盘间充质干细胞中加入细胞培养液培养，即P0代培养，每隔3天半量换含双抗的完全培养液一次；

4)胎盘间充质干细胞的传代培养：待原代培养至第15天、且细胞融合度达到80-90％时，完全弃掉培养液，清洗细胞并加入传代培养消化液消化，消化结束后加入完全培养液终止消化，再分装培养直至获得P3代胎盘间充质干细胞；

在其中一个实施例中，步骤1)中的清洗液包括：生理盐水，终浓度为10ug/mL的硫酸庆大霉素，10ug/mL的两性霉素B和总体积的50％的红细胞裂解液。加入红细胞裂解液，将红细胞裂解，可以实现清除血液、减少血液对外泌体纯度的影响。

在其中一个实施例中，步骤2)中的组织消化液包括：含青霉素和链霉素的DMEM培养基，50％Tryple酶和终浓度为0.6-0.7mg/mL的I型胶原酶。

在其中一个实施例中，步骤4)中的传代培养消化液包括：0.25％的胰蛋白酶和0.004％的EDTA。

胎盘间充质干细胞的活性能够影响外泌体的提取量及纯度，通过改进胎盘间充质干细胞的分离培养过程中使用的消化液以及消化方法和培养方法，一定程度上提高了胎盘间充质干细胞外泌体提取的提取率和纯度。

一种胎盘间充质干细胞外泌体的储存方法，包括以下步骤：向外泌体中加入等体积的冻存液，其中冻存液包括SR无血清培养基、甘油和维生素C，放入-80℃低温冰箱冰冻24h，再取出放入-196℃液氮中冻存。将获得的外泌体保存在改良的冻存液中，使得外泌体在长期冻存后仍能保持较高的活性和功能；具体的，外泌体在SR无血清培养基、甘油、维生素C的冻存液中冻存，降低冻存过程对外泌体失活的影响程度；另外，冻存液中不含有DMSO和血清成分，防止外泌体用于治疗时引起机体的不良反应。

在其中一个实施例中，所述冻存液包括：20％SR无血清培养基，25-30％甘油和15％维生素C。采用改良的冻存液，使间充质干细胞在冻存过程中仍能保持较高的活性，再次利用率高。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，针对常规技术中提取时间长、提取纯度不高的不足，通过调整提取方法，在较短时间内取得高纯度、高密度的外泌体；并将获得的外泌体保存在改良的冻存液中，使得外泌体在长期冻存后仍能保持较高的活性和功能。

去除细胞碎片后的间充质干细胞在10000-20000r/min转速下离心50-90min获得高纯度外泌体，再进一步离心纯化浓缩，得到总蛋白浓度高的外泌体；外泌体在SR无血清培养基、甘油、维生素C的冻存液中冻存，降低冻存过程对外泌体失活的影响程度；另外，冻存液中不含有DMSO和血清成分，防止外泌体用于治疗时引起机体的不良反应。

胎盘间充质干细胞的数量、活性影响外泌体的提取量和纯度，因此，通过改进胎盘间充质干细胞的分离培养过程中使用的消化液以及消化方法和培养方法，一定程度上提高了胎盘间充质干细胞外泌体提取的提取率和纯度。

并且，本发明还对其中各步骤所选用的条件和参数进行了优选，得到能够有效、高效提取得到高纯度、高密度的胎盘间充质干细胞外泌体的方法，相比现有的制备提取和储存方法更简单有效，而且冻存后取出用于临床应用的外泌体对机体刺激小。胎盘来源的间充质干细胞来源丰富、易于获得、不引起供者不适，并且胎盘间充质干细胞的外泌体具有比其他来源的间充质干细胞更强的活性，是间充质干细胞外泌体获取的优良来源。

附图说明

图1为本发明P0代胎盘间充质干细胞的显微镜图；

图2为本发明P3代胎盘间充质干细胞的显微镜放大图；

图3为本发明P3代胎盘间充质干细胞的流式检测结果图；

图4为本发明高纯度外泌体在扫描电子显微镜下的形态图；

图5为本发明总蛋白浓度检测结果图；

图6为本发明流式检测冻存前外泌体表面标记物的结果图；

图7为本发明的外泌体的颗粒直径分布范围示意图；

图8为本发明流式检测冻存复苏后的外泌体表面标记物的结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例中所用原料，如非特别说明，均为市售购得。

一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，包括以下步骤：

一、胎盘预处理。

医院采集足月剖腹产胎儿胎盘组织，采集前签署客户之情同意书。

1，上述采集到的胎盘组织用无菌直剪剪取，用组织清洗液清洗，直至无血液残留；

其中，组织清洗液由生理盐水添加终浓度为10ug/mL的硫酸庆大霉素、10ug/mL的两性霉素B和总体积的50％的红细胞裂解液配制。

2，将无血液残留的胎盘组织放入50mL无菌离心管中，1500r/min离心5min后去除上清液，得到清洗干净的胎盘组织。

二、胎盘组织消化。

1，将清洗干净的胎盘组织用无菌直剪剪成0.1-1cm³体积的小块，眼观如糊状。

2，取剪碎的小块，加入等体积的组织消化液，组织消化液在使用之前37℃预热，小块组织与组织消化液混合后在恒温震荡仪中37℃、200r/min震荡消化1h；

其中，组织消化液由含青霉素和链霉素的DMEM培养基15mL和10mg I型胶原酶配制。

3，震荡消化结束后，混合液置于4℃下、1800r/min离心5min，收集沉淀，用PBS清洗3次；

其中，PBS清洗的步骤为：向沉淀中添加PBS，1800r/min离心5min，去除上清液。

4，上述步骤最终得到的沉淀用生理盐水重悬，并用100μm无菌滤网过滤，去除大块的组织，过滤所得的滤液1800r/min离心5min，获得分离的胎盘间充质干细胞。

三、胎盘间充质干细胞的原代培养。

向上述消化得到的分离的胎盘间充质干细胞中加入20mL细胞培养液，每10mL接种在一个T75的细胞培养瓶中，并置于37℃、5％CO₂的培养箱中静置培养；

其中，细胞培养液为市购所得(Gibco公司，C11330500BT)；此步骤培养得到的胎盘间充质干细胞为P0代间充质干细胞。

附图1为本发明P0代间充质干细胞在显微镜下观察得到的形态图，由图可知，细胞形态良好。

四、胎盘间充质干细胞的传代培养。

1，P0代间充质干细胞培养至15天左右，并且细胞融合度达到80-90％时，完全弃掉培养液，用PBS清洗细胞2次，PBS清洗步骤如上，不再赘述。

2，向上述清洗后的P0代间充质干细胞中加入传代培养消化液3mL消化，消化结束后加入完全培养液终止消化，再分装传代培养，传代比例为1：2；此后每3天待细胞融合度达到70-80％时传代一次，直至培养得到P3代间充质干细胞；

其中，传代培养消化液的由细胞培养液(Gibco公司，C11330500BT)中添加0.25％的胰蛋白酶和0.004％的EDTA配制。

附图2为本发明培养得到的P3代间充质干细胞在显微镜的形态图，由图可知，细胞形态良好。

进一步，通过流式检测P3代胎盘间充质干细胞的表面标记物，结果如附图3所示，由此可知，培养获得的胎盘间充质干细胞活性较高。

五、外泌体的提取及纯化。

1，将P3代间充质干细胞接种在干细胞培养基中，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，待细胞待融合度达到80-90％，将其吸出培养基，更换DMEM培养基培养24h后，收集上清；

其中，干细胞培养基为DMEM培养基中添加终浓度为40ng/mL的维生素C、10ng/mL的bEGF和2％的FBS配制。

2，将上一步骤取得的上清液收集到无菌离心管中，离心去除细胞碎片；其中，离心具体为：2000r/min转速下第一次离心25min，取上清液；10000r/min转速下第二次离心30min，取上清液，得到包含外泌体的溶液。

3，将上述得到的包含外泌体的溶液通过0.22μm无菌过滤膜过滤，取滤液，13000r/min转速下离心60min，取上清液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤，取滤液，用适量生理盐水重悬清洗，13000r/min离心65min，所得上清液即为外泌体。

对上述得到的外泌体进行总蛋白测定，结果如附图5所示，步骤2离心前外泌体总蛋白浓度为(1.82±0.16)μg/mL，上述步骤最后得到的外泌体总代表浓度为(7.2±0.26)μg/mL。

通过流式检测上述所得的外泌体的表面标记物，结果如图6所示，外泌体的表面标记物达到80％以上，说明获得的提取物为外泌体；测得外泌体颗粒直径的分布范围，结果如附图7所示，绝大部分外泌体的粒径分布在100-700nm，粒径为300-400nm的外泌体浓度最高。

六、外泌体的储存。

将需要储存的外泌体与等量的冻存液混匀加入冻存管中，置于程序降温仪中程序降温至-80℃，取出放入-80℃低温冰箱中冰冻24h，取出，放入-196℃液氮中冻存；其中，冻存液由20％SR无血清培养基，30％甘油和15％维生素C配制。

将按上述冻存步骤冻存的外泌体取出复苏，对复苏后的外泌体的表面标记物进行流式检测，结果如图8所示。由此可知，冻存复苏后的外泌体活性与冻存前活性相差不大，即通过改良的冻存剂能够很好地保持外泌体的活性。

除特殊说明外，本实验运用的仪器、检测方法和操作方法均为本领域公知。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，干细胞培养基包括：2％FBS，终浓度为40ng/mL的维生素C10ng/mL的bEGF。

3.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，其特征在于，将P3代细胞接种于干细胞培养基后，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

4.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，上述去除细胞碎片的方法包括：第一次离心，以1800-5000r/min转速离心25min，取上清液进行第二次离心；第二次离心，以8000-10000r/min转速离心30min，保留上清液，即为包含外泌体的溶液。

5.根据权利要求1所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述P3代胎盘间充质干细胞可以通过以下方法获得：

1)胎盘预处理：将采取得到的组织加入清洗液清洗至无血液残留，离心保留沉淀，即获得干净的胎盘组织；

3)胎盘间充质干细胞的原代培养：在上述胎盘间充质干细胞中加入细胞培养液培养，即P0代培养，每隔3天半量换含青霉素和链霉素的完全培养液一次；

4)胎盘间充质干细胞的传代培养：待原代培养至第15天、且细胞融合度达到80-90％时，完全弃掉培养液，清洗细胞并加入传代培养消化液消化，消化结束后加入完全培养液终止消化，再分装培养直至获得P3代胎盘间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的清洗液包括：生理盐水，终浓度为10ug/mL的硫酸庆大霉素，10ug/mL的两性霉素B和总体积的50％的红细胞裂解液。

7.根据权利要求5所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备和储存方法，其特征在于，所述步骤2)中的组织消化液包括：含青霉素和链霉素的DMEM培养基，50％Tryple酶和终浓度为0.6-0.7mg/mL的I型胶原酶。

8.根据权利要求5所述的胎盘间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中的传代培养消化液包括：0.25％的胰蛋白酶和0.004％的EDTA。

9.一种胎盘间充质干细胞外泌体的储存方法，其特征在于，包括以下步骤：

取权利要求1-8任一项的制备方法制备得到的外泌体，向所述外泌体中加入等体积的冻存液，其中冻存液包括SR无血清培养基、甘油和维生素C，放入-80℃低温冰箱冰冻24h，再取出放入-196℃液氮中冻存。

10.根据权利要求9所述的胎盘间充质干细胞外泌体的储存方法，其特征在于，所述冻存液包括：20％SR无血清培养基，25-30％甘油和15％维生素C。