CN106399236A - 一种促进脂肪干细胞生长的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，包括以下步骤：采集脂肪组织，用洗涤液进行洗涤，去除肉眼可见的血管和纤维部分；将脂肪组织破碎成体积为0.5‑1.5mm3的组织块，用洗涤液清洗若干次至洗出液清亮；加入胶原酶，在37℃温度下均匀震荡消化55‑100分钟，使脂肪细胞充分消化，过滤，去除表层脂肪，获得含有脂肪干细胞的滤液，用离心机分离，沉淀即为脂肪干细胞群；将脂肪干细胞群重悬浮；将脂肪干细胞群重悬液置于培养瓶，加入培养液，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶‑EDTA进行消化获得培养后的脂肪干细胞，其具有纯度高、增殖能力强的特点。

Description

一种促进脂肪干细胞生长的培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种促进脂肪干细胞生长的培养方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的细胞。人脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从人体脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现脂肪干细胞在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等，同时具有较低的免疫原性和免疫调节功能，移植同种异基因ADSCs将不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应，为ADSCs的同源异体移植提供了有利条件。此外，ADSCs来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。
但现有的脂肪干细胞培养方法存在以下几个缺点：1、不能够完全去除组织块和大量杂细胞；2、有一定分化，脂肪细胞的生长率低。
为克服上述技术的不足，我们在实际操作中更进一步的改进和优化了脂肪干细胞的分离培养方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种促进脂肪干细胞生长的培养方法的制备方法，其具有纯度高、增殖能力强的特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，包括以下步骤：
1）采集脂肪组织，用洗涤液进行洗涤，去除肉眼可见的血管和纤维部分；
2）将步骤1）获得的脂肪组织破碎成体积为0.5-1.5mm3的组织块，用洗涤液清洗若干次至洗出液清亮，洗去体积较大的杂组织和杂细胞，可清洗到的组织表面积较大，使更多的脂肪细胞溶入洗涤液中，提高了下一步获得更多脂肪干细胞的几率；
3）加入胶原酶，在37℃温度下均匀震荡消化55-100分钟，使脂肪细胞充分消化，过滤，去除表层脂肪，获得含有脂肪干细胞的滤液，用离心机分离，沉淀即为脂肪干细胞群；
4）将步骤3）的脂肪干细胞群重悬浮，获得脂肪干细胞群的重悬液；
5）将步骤4）获得的脂肪干细胞群重悬液置于培养瓶，加入培养液，以后每24小时更换培养液一次，更换两次，使脂肪干细胞群获得足够养分充分生长，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的脂肪干细胞。
有益效果在于：使用本发明方法培养的脂肪干细胞有效去除杂质，纯度高，增殖速度快。
优选地，洗涤液为5％葡萄糖盐水或磷酸缓冲液。
优选地，步骤1）中的洗涤液的pH值为7.0-7.3。
优选地，步骤3）所述胶原酶为与步骤2）的脂肪组织等体积的0.5-0.7％( m/v )混合胶原酶。
优选地，离心机的转速1800-2000转/分钟，离心时间为15-20分钟，转速较快，使密度不同的两层物质快速分离，避免速度过慢而产生密度较小的物质夹杂在脂肪干细胞群中而无法达到分离纯化的目的，离心时间足够长，分离充分。
优选地，步骤4）所述培养液为含10%胎牛血清的高糖DMEM，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，高糖型DMEM有利于细胞停泊于一个位置生长，有利于定位增长脂肪细胞。
具体实施方式
为能进一步理解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本实施例的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，包括以下步骤：
1）采集脂肪组织100ml，用pH值为7.0的5％葡萄糖盐水进行洗涤，去除肉眼可见的血管和纤维部分；
2）将步骤1）获得的脂肪组织破碎成体积为0.5-1.0mm3的组织块，用pH值为7.0的5％葡萄糖盐水清洗若干次至洗出液清亮，获得92ml脂肪组织；
3）加入92ml的0.5-0.7％( m/v )混合胶原酶，在37℃温度下均匀震荡消化55分钟，使脂肪细胞充分消化，过滤，去除表层脂肪，获得含有脂肪干细胞的滤液，用离心机分离，离心机的转速1800转/分钟，离心时间为15分钟，沉淀即为脂肪干细胞群；
4） 将步骤3）的脂肪干细胞群重悬浮，获得脂肪干细胞群的重悬液；
5）将步骤4）获得的脂肪干细胞群重悬液置于培养瓶，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM，以后每24小时更换培养液一次，更换两次，使脂肪干细胞群获得足够养分充分生长，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的脂肪干细胞。
实施例2
本实施例的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，包括以下步骤：
1）采集脂肪组织100ml，用PH值为7.2的磷酸缓冲液进行洗涤，去除肉眼可见的血管和纤维部分；
2）将步骤1）获得的脂肪组织破碎成体积为0.8-1.2mm3的组织块，用PH值为7.2的磷酸缓冲液清洗若干次至洗出液清亮，获得94ml脂肪组织；
3）加入94ml的0.5-0.7％( m/v)混合胶原酶，在37℃温度下均匀震荡消化70分钟，使脂肪细胞充分消化，过滤，去除表层脂肪，获得含有脂肪干细胞的滤液，用离心机分离，离心机的转速1900转/分钟，离心时间为18分钟，沉淀即为脂肪干细胞群；
4）将步骤3）的脂肪干细胞群重悬浮，获得脂肪干细胞群的重悬液；
5）将步骤4）获得的脂肪干细胞群重悬液置于培养瓶，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM，以后每24小时更换培养液一次，更换两次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的脂肪干细胞。
实施例3
本实施例的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，包括以下步骤：
1）采集脂肪组织100ml，用pH值为7.3的5％葡萄糖盐水进行洗涤，去除肉眼可见的血管和纤维部分；
2）将步骤1）获得的脂肪组织破碎成体积为0.8-1.5mm3的组织块，用pH值为7.3的5％葡萄糖盐水清洗若干次至洗出液清亮，获得95ml脂肪组织；
3）加入95ml的0.5-0.7％( m/v)混合胶原酶，在37℃温度下均匀震荡消化100分钟，使脂肪细胞充分消化，过滤，去除表层脂肪，获得含有脂肪干细胞的滤液，用离心机分离，离心机的转速2000转/分钟，离心时间为20分钟，沉淀即为脂肪干细胞群；
4）将步骤3）的脂肪干细胞群重悬浮，获得脂肪干细胞群的重悬液；
5）将步骤4）获得的脂肪干细胞群重悬液置于培养瓶，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM，以后每24小时更换培养液一次，更换两次，使脂肪干细胞群获得足够养分充分生长，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的脂肪干细胞。
将实施例1至3方法与传统脂肪干细胞培养方法进行对照，结果如表1。
由上述对照试验可知，实施例1至3方法比传统方法得到的干细胞生长速度快，纯度高，增殖能力强。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）采集脂肪组织，用洗涤液进行洗涤，去除肉眼可见的血管和纤维部分；
2）将步骤1）获得的脂肪组织破碎成体积为0.5-1.5mm3的组织块，用洗涤液清洗若干次至洗出液清亮；
3）加入胶原酶，在37℃温度下均匀震荡消化55-100分钟，使脂肪细胞充分消化，过滤，去除表层脂肪，获得含有脂肪干细胞的滤液，用离心机分离，沉淀即为脂肪干细胞群；
4） 将步骤3）的脂肪干细胞群重悬浮，获得脂肪干细胞群的重悬液；
5）将步骤4）获得的脂肪干细胞群重悬液置于培养瓶，加入培养液，以后每24小时更换培养液一次，更换两次，使脂肪干细胞群获得足够养分充分生长，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化获得培养后的脂肪干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，其特征在于：所述洗涤液为5％葡萄糖盐水或磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，其特征在于：步骤1）所述洗涤液的pH值为7.0-7.3。
4.根据权利要求1所述的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，其特征在于：步骤3）所述胶原酶为与步骤2）的脂肪组织等体积的0.5-0.7％( m/v )混合胶原酶。
5.根据权利要求1所述的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，其特征在于：所述离心机的转速1800-2000转/分钟，离心时间为15-20分钟。
6.根据权利要求1所述的一种促进脂肪干细胞生长的培养方法，其特征在于：步骤4）所述培养液为含10%胎牛血清的高糖DMEM。
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