CN110791474A

CN110791474A - 一种髓核细胞的分离及体外培养方法

Info

Publication number: CN110791474A
Application number: CN201911155632.4A
Authority: CN
Inventors: 于元竹; 唐田娟; 刘芳
Original assignee: Hangzhou Dongtang Biotechnology Co Ltd In Same Year
Current assignee: Hangzhou Dongtang Biotechnology Co Ltd In Same Year
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-02-14

Abstract

本发明公开了一种髓核细胞的分离及体外培养方法，髓核细胞分离时获得髓核组织要将血迹、软骨组织清除干净，防止杂细胞影响髓核细胞的贴壁及后续培养，消化液用胶原酶Ⅰ，使得消化过程更加温和，消化后的细胞及组织活性更高，易于贴壁，用含体积分数20％胎牛血清与DPBS的混合液终止消化，得到的细胞不易黏连，铺瓶更加均匀，所用试剂添加1％的青/链霉素，防止样本本身或采集运输中的污染；体外培养时添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，添加量为10‑40％，弥补培养基中缺少的生长因子，促进髓核细胞的生长；使得培养出来的细胞存活率高，易于贴壁，细胞形态好，质量高稳定。

Description

一种髓核细胞的分离及体外培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，特别是一种髓核细胞的分离及体外培养方法。

背景技术

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IVD)是脊柱退行性疾病的病理基础，是造成椎间盘突出及慢性腰腿痛的主要原因之一。保守和手术治疗都不能从根本上解决椎间盘退变所带来的腰腿痛问题。近年来，基于细胞特别是干细胞的新兴的退变椎间盘治疗方法引起了广泛的兴趣。研究发现，椎间盘退变时，髓核组织退变最为明显。因此髓核细胞的相关研究成为热点。

目前，髓核细胞分离培养方法多种多样，都存在很多弊端，分离过程：获取细胞存活率较低,后期不易贴壁；培养方法：细胞形态不佳，且容易衰老、退化，最终得到的细胞较少，活率较低。市场需要一种方法优化髓核细胞的分离及体外培养，以期为椎间盘退变的机制及治疗的相关研究提供稳定的细胞来源；本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种髓核细胞的分离及体外培养方法，通过优化髓核细胞分离过程，使得操作更加简便，从髓核组织中分离出更多有活力的细胞；通过优化培养方法，获得的细胞存活率高，不易退化，细胞形态好，质量高，稳定。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种髓核细胞的分离及体外培养方法，包括如下内容：

髓核细胞的分离包括如下步骤：

步骤1，获得髓核组织后，置于DPBS清洗液中，将杂质清除干净；

步骤2，加入消化液恒温水浴孵育，消化液为胶原酶Ⅰ；

步骤3，用中和液终止消化，离心，弃上清，用DPBS清洗液再清洗一次，离心后得到的细胞液备用；中和液为体积分数大于等于20％的胎牛血清与DPBS的混合液；

髓核细胞的体外培养包括如下步骤：

步骤a，将髓核细胞的分离得到的细胞液弃上清液，用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种于培养皿，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，培养；观察细胞贴壁状态，进行半量换液，直至细胞融合度达到80％～90％；

步骤b，融合度达到80％～90％后，进行传代，弃掉原培养液，用清洗液清洗，细胞消化液消化，收集细胞，计数；

步骤c，使用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，在CO2培养箱中培养；

步骤d，接种3天后，观察细胞贴壁状态，若融合度达到80％～90％，则再次进行传代；重复此步骤传至P4代。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，步骤1，获得髓核组织后，置于DPBS清洗液中，将杂质清除干净；

将杂质清除干净的具体过程为：用DPBS清洗液冲洗2～3次，1500rpm，5min离心，直至无明显血迹为止。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，步骤2，加入消化液恒温水浴孵育，消化液为髓核组织的2倍体积的0.25％胶原酶Ⅰ，孵育期间每半小时摇匀一次。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，步骤2，弃上清，用眼科剪将髓核组织剪成1mm³大小，加髓核组织的2倍体积0.25％胶原酶Ⅰ，37℃恒温水浴锅孵育3～4小时，期间每半小时摇匀一次。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，步骤3，用中和液终止消化，离心，弃上清，再清洗一次，离心后得到的髓核细胞沉淀备用；中和液为体积分数为20％的胎牛血清与DPBS的混合液。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，步骤b，融合度达到80％～90％后，进行传代，弃掉原培养液，用DPBS清洗液清洗，细胞消化液消化，收集细胞，计数；细胞消化液为Tryple E。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，步骤c，使用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，在CO2培养箱中培养；胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液为胎盘间充质干细胞培养上清液冷冻真空干燥后使用干细胞培养基复溶配制的溶液，添加量为10-40％。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，步骤c，使用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，在CO2培养箱中培养；胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液为胎盘间充质干细胞培养上清液冷冻真空干燥后使用干细胞培养基复溶配制的溶液，添加量为20％。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，F12-DMEM培养液和DPBS清洗液中都添加有1％的青/链霉素。

前述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，分离和体外培养所用试剂及培养基都提前进行37℃孵育。

本发明的有益之处在于：

本发明的消化液采用胶原酶Ⅰ，使得消化过程更加温和，消化后的细胞及组织活性更高，易于贴壁；

通过优化实验选取含体积分数20％的胎牛血清与DPBS的混合液终止消化，得到的细胞不易黏连，铺瓶更加均匀；

采用的试剂添加1％的青/链霉素，能够防止样本本身或采集运输中的污染；

本发明的试剂及培养基都提前37℃孵育，避免影响髓核细胞的活力；

通过优化实验选取合适的胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液添加量，促进髓核干细胞的活性。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

一种髓核细胞的分离及体外培养方法，包括如下内容：

髓核细胞的分离包括如下步骤：

步骤1，获得髓核组织后，置于预冷的含1％青/链霉素的F12-DMEM培养液中，1小时之内运输至实验室，将杂质清除干净；添加1％的青/链霉素，可以防止操作过程中的污染。

将杂质清除干净的具体过程为：用DPBS冲洗2～3次，1500rpm，5min离心，直至无明显血迹为止；作为一种优选，DPBS为加入青/链霉素的DPBS混合液。

获得髓核组织要将血迹清洗干净，软骨等其他组织尽量清除干净，防止杂细胞影响髓核细胞的贴壁及后续培养。

步骤2，加入消化液恒温水浴孵育，消化液为胶原酶Ⅰ；作为一种优选，具体过程为：弃上清，用眼科剪将髓核组织剪成1mm³大小，加髓核组织的2倍体积0.25％胶原酶Ⅰ，37℃恒温水浴锅孵育3～4小时，期间每半小时摇匀一次。胶原酶Ⅰ较为温和，对细胞损伤较小；消化期间每半小时摇匀一次，这样的操作使消化液与组织充分接触，有助于消化。

步骤3，用中和液终止消化，离心，弃上清，用DPBS再清洗一次，离心后得到的髓核细胞沉淀备用；中和液为体积分数大于等于20％的胎牛血清与DPBS的混合液；

髓核细胞的体外培养包括如下步骤：

步骤a，将得到的髓核细胞沉淀，用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，按照0.2～0.3E6/皿密度接种于10cm培养皿；置于37℃、5％CO2培养箱中培养。接种3天后，观察细胞贴壁状态，进行半量换液；每隔2～3天，观察细胞生长情况，并进行半量换液，直至细胞融合度达到80％～90％；需要说明的是：接种于10cm培养皿，培养基用量为10ml，培养基不宜过多，否则会使细胞及组织漂浮，不易贴壁。

步骤b，融合度达到80％～90％后，进行传代，这时，此时细胞活力最佳，弃掉原培养液，用DPBS清洗液清洗2～3遍，细胞消化液消化，收集细胞，计数；原代细胞收集后，用DPBS清洗2～3遍，这样的操作可以洗去解离的细胞及组织碎片，以免影响后续细胞贴壁。作为一种优选，细胞消化液为Tryple E，Tryple E比胰酶温和，对细胞损伤小。

步骤c，使用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，在CO2培养箱中培养；添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液的原因是因为干细胞培养上清液中含有多种因子，能够弥补培养基中缺少的生长因子，促进髓核细胞的生长。

步骤c，使用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，在CO2培养箱中培养；胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液为胎盘间充质干细胞培养上清液冷冻真空干燥后使用干细胞培养基复溶配制的溶液，添加量为10-40％。

本发明的清洗液采用的DPBS缓冲液；培养液采用的含体积分数10％的胎牛血清的F12-DMEM培养基；需要说明的是这都是一种优选，只要是采用本发明创造点的培养方法均在本发明的保护范围之内。

需要注意的是：F12-DMEM培养液和DPBS中都添加有1％的青/链霉素，能够防止储运过程中带入的污染；分离和体外培养所用试剂及培养基都提前进行37℃孵育；观察时间要短，使细胞在较小的温度范围内波动，以免影响髓核细胞的活力。尽量除去髓核组织中的其他组织，残留的杂质会影响细胞的沉降及贴壁。进行半量换液时，注意尽量不要吸到漂浮的组织。

实验一，以下用实验对比不同比例的中和液的终止消化效果；

实验目的：

探讨在干细胞培养过程中使用不同比例的中和液终止消化，所收获的细胞性状有何差别

实验原理：

消化液可以使细胞从组织中分离，或从培养容器上脱离，但对于细胞仍有一定损伤，使用中和液可以有效终止消化，保护细胞。但中和液造价较高，且残留对后期回输有一定副作用，因此需要在保护细胞的基础上最大成都降低中和液的浓度，减少残余量。

实验试剂：

DMEM/F-12培养基：美国Gibco公司；bFGF：美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)：美国Gibco公司；Tryple E：美国Thermo公司；DPBS：美国Gibco公司；台盼蓝染色液：美国Gibco公司；

实验设备

生物安全柜：美国Thermo公司；细胞培养箱：美国Thermo公司；高速冷冻离心机：美国Thermo公司；倒置显微镜：日本Nikon公司；

实验步骤：

1.复苏一支干细胞，平均分为8份接种于T75培养瓶；

2.每瓶添加干细胞培养基15ml，置于细胞培养箱内进行培养；

3.待干细胞成熟后取出轻轻摇晃几下，小心吸出培养基；

4.每瓶添加5ml DPBS摇晃清洗，小心吸出DPBS；

5.每瓶添加2ml Tryple E，迅速摇匀，置于37℃培养箱内孵育2min；

6.取出分别按照表1加入提前配制的中和液终止消化；

表1：中和液配制成分用量表

7.取样进行观察和计数，将结果记录在表2。

实验结果：

表2：终止消化结果记录表

讨论：

随着中和液中胎牛血清用量的增加，细胞黏连明显变少，团块变小，超过20％后几乎未见结团，且使用的胎牛血清浓度越高越能够有效提高细胞活率。

小结：

Tryple E消化过程中破坏细胞表面电平衡，导致细胞容易发生黏连，甚至结团，胎牛血清含有丰富的蛋白质及营养成分，可以和消化酶结合，抑制其消化作用，并在细胞表面形成保护层，有效防止细胞黏连。但高浓度胎牛血清在使用过程中会产生残留，对后期细胞的使用造成不良影响，并且提高非必要成本。因此考虑到安全性，经济性，有效性，20％浓度的胎牛血清是最优化的选择。

实验二：培养髓核干细胞时加入胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉的添加量优化实验；

实验目的：

探讨在髓核干细胞培养中添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉，其中细胞因子等成分对髓核干细胞的活性有无促进作用

实验原理：

髓核组织取自于成体组织，且多有不同程度的纤维化，所分离的髓核干细胞在培养中普遍增殖倍数较低，容易退化。胎盘间充质干细胞在生长过程中释放多种细胞因子到培养环境中，这些因子可以有效促进细胞增殖，有利于细胞保持良好形态，防止细胞分化、退化。

实验试剂：

α-MEM培养基：上海翌圣生物；bFGF：美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)：美国Gibco公司；Tryple E：美国Thermo公司；CollagenaseⅠ(胶原酶Ⅰ型)：上海翌圣生物；DPBS：美国Gibco公司；青/链霉素：美国索莱宝公司；台盼蓝染色液：美国Gibco公司；

实验设备

实验步骤：

1，培养胎盘间充质干细胞以收集培养上清液，将10ml上清液分为10份置于真空冷冻干燥机内制备成为无菌冻干粉；

2，用10ml干细胞培养基将胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶；

3，取3份髓核组织分别使用胶原酶Ⅰ型消化制备成原代髓核干细胞悬液；

4，得到的每份原代髓核干细胞平均接种于6孔培养板的5个孔内，3份共接种15个孔；

5，分5组按表3添加不同比例干细胞培养上清冻干粉复溶液及干细胞培养基，每组设3个平行对照；

表3：胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液与干细胞培养基添加比例表

6，成熟后收获P1代细胞计数，记录细胞的数量、活率等信息于表4。

7，从各瓶收获的P1代细胞内分别取等量细胞于新六孔培养板分别接种15个孔，按表1添加不同比例胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液及培养基；

8，成熟后收获P2代细胞计数，记录细胞的数量、活率等信息于表5；

9，从各瓶收获的P2代细胞内分别取等量细胞于新六孔培养板分别接种15个孔，按表1添加不同比例胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液及培养基

10，成熟后收获P3代细胞计数，记录细胞的数量、活率等信息于表6。

实验结果：

1.P1代收集细胞

表4：收获细胞信息记录表

2.P2代收集细胞

表5：收获细胞信息记录表

3.P3代收集细胞

表6：收获细胞信息记录表

讨论：

从实验结果可看出，随着培养代次增加，髓核干细胞的增殖倍数与细胞活率出现明显降低，显示细胞活性退化。其中，空白对照组的扩增倍数与细胞活率相较于其它组别明显较低；实验组1(10％)的扩增倍数也有所下降，但明显较同代次的空白对照组高；实验组2(20％)相较其它组别在扩增倍数及细胞活率方面都有明显优势；实验组4(40％)相较实验组1在扩增倍数上有优势，在细胞活率上却表现较差。

小结：

从结果来看，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉在一定程度上可以有效促进髓核干细胞的增殖，抑制细胞退化，但是用量并不是越多越好，20％的添加量较为理想。从实验组4(40％)的表现来看，猜测由于干细胞培养上清冻干粉中除了有促进细胞生长增殖，抑制细胞退化的有效因子，也存在细胞代谢过程中产生的不利因子，对于细胞的活率产生了负向调节，后期可进一步研究其中的因子成分，进行提取和纯化，增强正向调节，避免负向调节。

本发明提供一种髓核细胞的分离及体外培养方法，通过优化髓核细胞分离过程，使得操作更加简便，从髓核组织中分离出更多有活力的细胞；通过优化培养方法，获得质量更高更稳定的细胞。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，包括如下内容：

髓核细胞的分离包括如下步骤：

步骤2，加入消化液恒温水浴孵育，所述消化液为胶原酶Ⅰ；

步骤3，用中和液终止消化，离心，弃上清，用DPBS清洗液再清洗一次，离心后得到的细胞液备用；所述中和液为体积分数大于等于20％的胎牛血清与DPBS的混合液；

髓核细胞的体外培养包括如下步骤：

步骤a，将髓核细胞的分离得到的细胞液弃上清液，用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种于培养皿，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，培养；

观察细胞贴壁状态，进行半量换液，直至细胞融合度达到80％～90％；

步骤d，接种3天后，观察细胞贴壁状态，若融合度达到80％～90％，则再次进行传代；

重复此步骤传至P4代。

2.根据权利要求1所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，步骤1，获得髓核组织后，置于DPBS清洗液中，将杂质清除干净；

3.根据权利要求1所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，步骤2，加入消化液恒温水浴孵育，所述消化液为髓核组织的2倍体积的0.25％胶原酶Ⅰ，孵育期间每半小时摇匀一次。

4.根据权利要求3所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，步骤2，弃上清，用眼科剪将髓核组织剪成1mm³大小，加髓核组织的2倍体积0.25％胶原酶Ⅰ，37℃恒温水浴锅孵育3～4小时，期间每半小时摇匀一次。

5.根据权利要求1所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，步骤3，用中和液终止消化，离心，弃上清，再清洗一次，离心后得到的髓核细胞沉淀备用；所述中和液为体积分数为20％的胎牛血清与DPBS的混合液。

6.根据权利要求1所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，步骤b，融合度达到80％～90％后，进行传代，弃掉原培养液，用DPBS清洗液清洗，细胞消化液消化，收集细胞，计数；所述细胞消化液为Tryple E。

7.根据权利要求1所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，步骤c，使用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，在CO2培养箱中培养；所述胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液为胎盘间充质干细胞培养上清液冷冻真空干燥后使用干细胞培养基复溶配制的溶液，添加量为10-40％。

8.根据权利要求6所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，步骤c，使用含体积分数10％胎牛血清的F12-DMEM重悬，接种，添加胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液，在CO2培养箱中培养；所述胎盘间充质干细胞培养上清冻干粉复溶液为胎盘间充质干细胞培养上清液冷冻真空干燥后使用干细胞培养基复溶配制的溶液，添加量为20％。

9.根据权利要求1所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，所述F12-DMEM培养液和DPBS清洗液中都添加有1％的青/链霉素。

10.根据权利要求1所述的一种髓核细胞的分离及体外培养方法，其特征在于，分离和体外培养所用试剂及培养基都提前进行37℃孵育。