CN106047801A - 一种髓核细胞分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种髓核细胞分离纯化方法，包括：冲洗步骤，将获取的椎间盘髓核组织用PBS冲洗干净；剪碎步骤，将所述组织剪碎；消化步骤，加入2倍体积的消化液，消化液是体积比为1：1的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液，在恒温水浴箱震荡消化设定时长，静置后吸取上清液，加入含体积分数10％FBS的DMEM培养基终止消化，剩余组织加所述消化液继续消化，如此重复多次；收集步骤，将终止消化后的液体离心，离心转速为1000～1500rpm，离心时间为5～10min，去上清，用含体积分数10％FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。本方法分离纯化过程简单快捷，消化过程温和，消化时间短，所需仪器设备简单；所获得的髓核细胞量大，存活率高，更易于在培养瓶内贴壁、附着、延伸，细胞活性比较强。

Description

一种髓核细胞分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种分离纯化方法，具体来说是指一种椎间盘髓核细胞的分离纯化方法。

背景技术

腰痛构成了一个可观的流行病学和经济学问题，尽管腰痛的原因有许多，但是一个很明显的原因是与椎间盘的退变极大相关。椎间盘随年龄增长由于各种原因而导致退变，而髓核组织中存在最明显的改变。椎间盘的退变速度远比其他组织要快，从而改变了脊柱的力学，而这种损伤极难自我修复。目前的治疗包括非手术治疗(例如锻炼、物理治疗如热/冷刺激、电刺激、针灸、牵引以及止痛药物)和手术治疗(融合术和微创)，但是手术常常达不到缓解疼痛的目的，还可能加速邻近间盘的退变性改变。组织工程技术提供了修复退变椎间盘功能的一条有效方法。大多数研究直接指向了髓核组织工程，因为椎间盘退变被认为起源于髓核组织区域，而临床微创手术可获取大量退变髓核组织，研究者试图通过从髓核组织内分离得到髓核细胞，从而在体外通过髓核细胞来研究椎间盘退变的机制。目前，关于人髓核细胞的分离培养方法不一，所用消化酶及消化时间(2-4h，4-6h，6-8h、过夜)差异较大，而且所获取的细胞量较少，存活率也较低。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的髓核细胞分离纯化方法。

本发明的一种髓核细胞分离纯化方法，包括如下步骤：

冲洗步骤，将椎间盘髓核组织冲洗干净；

剪碎步骤，将所述组织剪碎；

消化步骤，利用消化液消化所述组织；

收集步骤，收集消化下来的髓核细胞。

所述消化步骤可以重复多次。

所述消化液包含II型胶原酶和胰蛋白酶中的至少一种。

所述消化液是体积比为1：1的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液。

所述消化步骤中，终止液是含体积分数10％FBS的高糖DMEM。

所述收集步骤中，通过离心作用收集消化下来的髓核细胞。

所述剪碎步骤中，剪碎后的所述组织的直径不大于1mm。

一种髓核细胞分离纯化方法，包括如下步骤：

a)将获取的髓核组织置于含双抗的PBS中，分离髓核组织周围的纤维环组织，然后用PBS冲洗干净；

b)将冲洗干净后的髓核组织剪碎，加入消化液，在恒温水浴箱中震荡消化过夜，并用终止液终止消化；

c)离心，弃上清及用DMEM重悬细胞。

所述步骤b)中，所述消化液是2倍体积的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液，且所述II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶的体积比是1：1。所述步骤b)中，所述终止液是含体积分数10％FBS的DMEM。

一种髓核细胞分离纯化方法，包括如下步骤：

冲洗步骤，将获取的椎间盘髓核组织用PBS冲洗干净；

剪碎步骤，将所述组织剪碎；

消化步骤，加入2倍体积的消化液，消化液是体积比为1：1的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液，在恒温水浴箱震荡消化设定时长，静置后吸取上清液，加入含体积分数10％FBS的DMEM培养基终止消化，剩余组织加所述消化液继续消化，如此重复多次；

收集步骤，将终止消化后的液体离心，离心转速为1000～1500rpm，离心时间为5～10min，去上清，用含体积分数10％FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。

较佳的是，离心转速为1500rpm，离心时间为10min。

本发明的有益效果是：分离纯化过程简单快捷，消化过程温和，消化时间短，所需仪器设备简单，成本较低；所获得的髓核细胞量大，存活率高，更易于在培养瓶内贴壁、附着、延伸，细胞活性比较强。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

本实施方式髓核细胞分离纯化方法包括如下步骤：获取手术椎间盘髓核组织后，将组织用PBS冲洗三遍，尽量将组织上残留的血液冲洗干净；洗净后尽 量吸去残留的PBS溶液，无菌条件下用眼科剪将组织尽可能的剪碎；加入2倍体积的胶原酶-胰酶混合液(0.5％浓度的II型胶原酶和0.25％浓度的胰蛋白酶的体积比是1:1)，37℃消化15min，静置后吸取上清液，加入含体积分数10％FBS(FBS，胎牛血清)的DMEM培养基终止消化，剩余组织加胶原酶-胰酶混合液继续消化，如此重复三次。将终止消化后的液体离心，离心转速1500rpm，离心时间10min，去上清，用含体积分数10％FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。

本实施方式中，获取的髓核组织需用PBS洗多次，尽量去除血液残留，髓核组织用眼科剪剪碎，要尽可能剪到直径1mm以下。

本实施方式中，所用消化液为0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶等体积混合液。当然，II型胶原酶和胰蛋白酶的体积比也可以是2：1或1：2。较佳的是，体积比是1：1，此时，消化时间和细胞存活率较佳。

本实施方式中，消化时间15min是指每次加入消化液后、37℃恒温水浴震荡消化15min，剩余未被消化的组织继续加消化液消化，反复重复多次；每次消化可以使用同样的消化液。重复次数如3次。

本实施方式中，消化反应的终止液可以选用含10％FBS的高糖DMEM。当然，终止液可以选用含10％FBS的RPMI1640。

本实施方式中，离心转速为1500rpm，离心时间为10min。

本实施方式的关键是手术所取髓核组织消化前要尽可能将血液洗净，以免残留血细胞影响髓核细胞的沉降贴壁；眼科剪要尽可能将组织剪碎，以减少消化时间，从而减少酶对细胞的损伤；消化液为胶原酶和胰蛋白酶的混合液，一方面避免单独用胶原酶消化时间过长，另一方面避免胰蛋白酶作用太强对细胞造成损伤；消化过程重复三次，每次作用15min，可避免酶对已消化下来的髓核细胞造成损伤；离心1500rpm、10min可以最大程度收集消化下来的髓核细胞。

实施例1：

手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素)的PBS中，小心分离周围少量的纤维环组织，然后用PBS冲洗三次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径约1mm大小，加入2倍体积0.5％Ⅱ型胶原酶，37℃恒温水浴箱中震荡消化过夜。用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1000r/min离心5min；弃上清(主要作用为去除残存的消化酶)，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM重悬细胞。使用台盼蓝染色检测细胞存活率、血球计数板计 算细胞浓度，调整细胞浓度为2×10⁵/ml后，接种于T25培养瓶，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h换液1次，以后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

实施例2：

手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素)的PBS中，小心分离周围少量的纤维环组织，然后用PBS冲洗三次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm大小，加入2倍体积0.5％Ⅱ型胶原酶，37℃恒温水浴箱中震荡消化过夜。用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1500r/min离心10min；弃上清(主要作用为去除残存的消化酶)，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM重悬细胞。使用台盼蓝染色检测细胞存活率、血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2×10⁵/ml后，接种于T25培养瓶，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h换液1次，以后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

实施例3：

手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素)的PBS中，小心分离周围少量的纤维环组织，然后用PBS冲洗三次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm大小，加入2倍体积0.25％胰蛋白酶，37℃恒温水浴箱中震荡消化2h。用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1500r/min离心10min；弃上清(主要作用为去除残存的消化酶)，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM重悬细胞。使用台盼蓝染色检测细胞存活率、血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2×10⁵/ml后，接种于T25培养瓶，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h换液1次，以后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

实施例4：

手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素)的PBS中，小心分离周围少量的纤维环组织，然后用PBS冲洗三次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm大小，加入2倍体积0.5％Ⅱ型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液(体积比1:1)，37℃恒温水浴箱中震荡消化4h。用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，1500r/min离心10min；弃上清(主要作用为去除残存的消化酶)，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM重悬细胞。使用台盼蓝染色检测细胞存活率、血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2×10⁵/ml 后，接种于T25培养瓶，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h换液1次，以后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

实施例5：

手术摘取的髓核组织置于含双抗(青-链霉素)的PBS中，小心分离周围少量的纤维环组织，然后用PBS冲洗三次，直至无明显血迹为止。用眼科剪将髓核组织剪成直径小于1mm大小，加入2倍体积0.5％Ⅱ型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液(1:1)，37℃恒温水浴箱中震荡消化15min。静置后取上清，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，剩余组织加酶继续消15min，如此重复三次直至组织完全消化，终止消化后1500r/min离心10min；弃上清(主要作用为去除残存的消化酶)，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM重悬细胞。使用台盼蓝染色检测细胞存活率、血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2×10⁵/ml后，接种于T25培养瓶，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h换液1次，以后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

现有文献显示常用消化酶组分为Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、DNA酶、链霉蛋白酶等单独或混合使用，而文献报道的消化时间为20min，45min，1h，2-4h，4-6h，6-8h、过夜等，差异较大，国内外说法各异，而有研究者认为0.2％Ⅱ型胶原酶消化髓核组织块4h为获取髓核细胞的最佳条件。本申请人用0.5％Ⅱ型胶原酶进行了尝试，即使把组织剪碎成糜烂状，4h仍不能完全消化组织，因而不能获得全部细胞。同时本申请人也用0.25％胰蛋白酶进行消化，消化过程很快(1h左右)，但死细胞很多，细胞存活率很低，说明胰蛋白酶对细胞损伤很大。而最后本申请人混合胶原酶和胰蛋白酶，加快了消化过程(分三次消化，每次15min，如果组织小于500mg，两次即可完全消化)，减少了获取髓核细胞操作过程所需要的时间。而且混合胶原酶可使作用温和，避免胰蛋白酶强的作用对细胞造成的损伤。

各种消化液的消化结果如表1所示。

表1 各种消化液的消化结果对比

本消化时间和所获细胞量以500mg组织计算，如果组织大于500mg，则需消化三次。当0.5％Ⅱ型胶原酶/0.25％胰蛋白酶体积比是1：1时，如果组织小于500mg，可以只消化两次；如果大于500mg，则需消化三次。表1中，当体积比是1：1时，消化总时间较短、所获总细胞较多且细胞存活率较高。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

冲洗步骤，将椎间盘髓核组织冲洗干净；

剪碎步骤，将所述组织剪碎；

消化步骤，利用消化液消化所述组织；

收集步骤，收集消化下来的髓核细胞。

2.如权利要求1所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化步骤重复多次。

3.如权利要求1或2所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化液包含II型胶原酶和胰蛋白酶中的至少一种。

4.如权利要求3所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化液是体积比为1：1的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液。

5.如权利要求1-3中任意一项所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述消化步骤中，终止液是含体积分数10％FBS的高糖DMEM。

6.如权利要求1-3中任意一项所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述收集步骤中，通过离心作用收集消化下来的髓核细胞。

7.如权利要求1-3中任意一项所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述剪碎步骤中，剪碎后的所述组织的直径不大于1mm。

8.一种髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)将获取的髓核组织置于含双抗的PBS中，分离髓核组织周围的纤维环组织，然后用PBS冲洗干净；

b)将冲洗干净后的髓核组织剪碎，加入消化液，在恒温水浴箱中震荡消化过夜，并用终止液终止消化；

c)离心，弃上清及用DMEM重悬细胞。

9.如权利要求8所述的髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述消化液是2倍体积的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液，且所述0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶的体积比是1：1。

10.一种髓核细胞分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

冲洗步骤，将获取的椎间盘髓核组织用PBS冲洗干净；

剪碎步骤，将所述组织剪碎；

消化步骤，加入2倍体积的消化液，消化液是体积比为1：1的0.5％II型胶原酶和0.25％胰蛋白酶混合液，在恒温水浴箱震荡消化设定时长，静置后吸取上清液，加入含体积分数10％FBS的DMEM培养基终止消化，剩余组织加所述消化液继续消化，如此重复多次；

收集步骤，将终止消化后的液体离心，离心转速为1000～1500rpm，离心时间为5～10min，去上清，用含体积分数10％FBS的DMEM培养基重悬髓核细胞沉淀。