CN113874489A - 细胞群体的培养方法及其利用 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供：用于由包含Tie2阳性干/祖细胞(例如，髓核干/祖细胞)的细胞群体高效制备富含具有与用途相应的规定性状的细胞(例如，II型胶原蛋白阳性髓核细胞)的细胞群体的手段。本发明的培养方法为如下培养方法：(1)在存在于未经消化处理的组织中的状态下、(2)在添加了至少1种除生长因子以外的Tie2表达增强剂的培养基中、(3)在具有进行了提高细胞的粘附性的处理的培养表面的培养容器中、或(4)在添加了细胞外基质降解剂的培养基中，边抑制球状集落的形成边培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
Description
技术领域
本发明涉及：细胞群体的培养方法中的、包含细胞表面标志物Tie2(tyrosinekinase with Ig and EGF homology domain-2，含Ig和EGF同源结构域-2的酪氨酸激酶)的表达为阳性的干细胞和/或祖细胞(本说明书中称为“Tie2阳性干/祖细胞”。)的细胞群体的培养方法等。更详细而言，本发明涉及：在扩增细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞(例如，髓核干/祖细胞)的工序和由Tie2阳性干/祖细胞分化诱导为具有规定性状的细胞(例如，表达II型胶原蛋白的髓核细胞)的工序中能利用的、包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法等。
背景技术
在日本，腰痛的主诉率排名第2，且是三分之二的成年人一生中都会经历一次的常见疾病，已成为工伤、医疗经济中的社会问题的一个原因。据说占腰痛原因的20％的椎间盘损伤是会引发椎间盘突出、退行性脊椎病变(osteoarthritis of the spine)、椎管狭窄、脊椎滑脱症等的重大问题，这些是由于椎间盘组织的不可逆变化所导致的，是病理学上称为椎间盘退变的疾病。椎间盘是环型的软骨性的器官，由中心部的髓核(NucleusPulposus；NP)、围绕其周围数圈的作为纤维性软骨的纤维环(Annulus Fibrosus；AF)、以及上下与相邻椎骨连接的软骨终板(Cartilaginous Endplate；EP)形成。明胶状的NP是无血管器官，含有大量的由NP中包含的脊索来源的髓核细胞分泌、且由大型的蛋白聚糖和胶原蛋白构成的细胞外基质(Extracellular Matrix；ECM)。据报道，包括人在内的一部分脊椎动物在生命早期脊索来源髓核细胞就消失了，在其消失后，起源尚未确定但形态学上与软骨细胞类似的软骨样细胞会形成髓核。认为：这样的细胞性状的转化会影响ECM组成，导致含水量的降低、纤维化之类的椎间盘的老化、退变，最终与腰痛、腰椎退行性疾病密切相关。需要说明的是，由于小鼠、大鼠、兔子、猪等多种动物种属终生保有脊索来源髓核细胞，几乎观察不到椎间盘退变，因此认为脊索来源髓核细胞和其它髓核细胞的调控机制与人不同。
作为预防或治疗椎间盘退变的方法的一例，正在进行同种椎间盘细胞制剂、即用于向椎间盘组织给药的含有同种髓核细胞、ECM等的细胞制剂的研究开发。为了制造这样的细胞制剂，需要到达一定程度的量的同种髓核细胞。例如，虽然可以将椎间盘突出患者通过手术而切除的椎间盘髓核组织用作用于这样的细胞制剂的髓核细胞供给源，但能够如此采集的髓核组织量、即其中包含的髓核细胞数有限。尽管如此，考虑到病毒感染症的风险等，期望避免为了确保髓核细胞数而混合使用源自多个椎间盘突出患者(供体)的髓核细胞的方式。因此，重要的是建立下述技术：通过培养单一供体来源的少量的椎间盘组织(髓核、纤维环等)中包含的、能分化诱导为成熟的髓核细胞的稀少的干细胞或祖细胞，来制备包含数量足以进行治疗的髓核细胞的细胞群体。
专利文献1中公开了：通过在“干扰细胞粘附的条件下”培养(优选在无血清培养基中培养)髓核细胞(源自椎间盘髓核的细胞群体)，从而制作由其细胞群体中包含的干细胞和祖细胞构成的“椎间盘球”(discosphere)。即，专利文献1中记载了“产生干细胞群体的方法”(权利要求3等)，所述方法包括如下步骤：在“干扰细胞粘附的条件下”使髓核细胞在培养基中生长的步骤；(b)对椎间盘干细胞(disc stem cell)、椎间盘祖细胞(discprogenitor cell)或它们的组合进行浓缩的步骤；及(c)产生包含髓核细胞的椎间盘球，由其产生椎间盘干细胞群体的步骤。需要说明的是，作为上述“椎间盘球”的说明，进行了如下说明：为包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或它们的组合的体外的悬浮性球结构物(freefloating circular-spherical structure)；为单一的椎间盘干细胞产生其自身的克隆和祖细胞而得的细胞球；包括以圆-球(circular-spherical)结构配置的悬浮性的髓核干细胞和髓核祖细胞；或者包含椎间盘球的髓核细胞彼此粘附等(第〔0024〕、〔0039〕段)。专利文献1中还记载了：将在“干扰细胞粘附的条件下”培养的椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或它们的组合浓缩而得到的“分离出的椎间盘干细胞群体”(权利要求1等)；包含由髓核细胞浓缩而得到的椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞、或其混合物，且作为“体外的悬浮性球结构物”的“分离出的椎间盘球”(权利要求10等)；包含椎间盘支架、及含有将椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或它们的组合浓缩而得到的髓核细胞的椎间盘球的“人工椎间盘替代装置”(权利要求11等)；制作椎间盘人工替代装置的方法，其包括使包含由髓核细胞浓缩而得到的椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或它们的混合物的椎间盘球在椎间盘支架内生长(权利要求12等)；“产生经浓缩的细胞群体”的方法，其包括如下步骤：在“干涉细胞粘附的条件下”培养以规定的低密度接种的髓核细胞的步骤，选择包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或其混合物的体外的“悬浮性球结构物”，由此产生经浓缩的细胞群体的步骤(权利要求17等)；“扩增经浓缩的椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或其组合的群体的方法”，其包括如下步骤：将包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞或它们的组合的椎间盘球分散成1个或多个经分散的椎间盘球细胞的步骤，及将上述1个或多个经分散的椎间盘球细胞在“干扰细胞粘附”且包含规定的添加物(例如，FGF2、EGF)的培养基中培养的步骤(权利要求18等)等。需要说明的是，可认为专利文献1中的“圆板”是原术语“disc”的直译，是指“椎间盘”。
对于专利文献1中公开的、用于培养源自椎间盘髓核组织的、包含椎间盘干细胞、椎间盘祖细胞、椎间盘细胞等的不均质的细胞群体(髓核来源细胞群体)的培养容器或培养基的相关事项，可以如下说明。
专利文献1中，作为在“干涉细胞粘附的条件下”的培养，公开了如下实施方式：通过在包含干涉细胞粘附的物质(具体而言，甲基纤维素)的无血清培养基中以低细胞密度接种并培养、或在超低粘附孔板中培养，从而由髓核来源细胞群体(其中包含的干细胞等)形成作为悬浮性球结构物的椎间盘球(参照第〔0156〕段以下、实施例1：第〔0170〕～〔0181〕段，对应于权利要求3、17等的发明)。然而，专利文献1中既没有记载也没有启示：在包含使细胞外基质分解的物质(例如，胶原酶)的培养基中或在细胞粘附性的培养表面上培养髓核来源细胞群体(其中包含的干细胞等)，在不形成椎间盘球(悬浮性球结构物)的情况下使椎间盘干细胞增殖或对其进行分化诱导。
另外，专利文献1中，作为扩增经浓缩的包含椎间盘干细胞等的细胞群体的方法，公开了如下实施方式：首先通过补充了胶原酶的培养基中的孵育而使椎间盘球(悬浮性球结构物)分散成1个或多个椎间盘干细胞，然后，将分散后的细胞再次接种在含甲基纤维素的培养基中(参照第〔0157〕段、实施例2：第〔0182〕～〔0184〕段、对应于权利要求18等的发明)。然而，该实施方式中的补充了胶原酶的培养基中的培养仅仅是用于将暂时形成的椎间盘球分散成单个的椎间盘干细胞等的临时性处理，而不是用于对椎间盘干细胞等进行分化诱导的处理，分散的椎间盘干细胞等再次在“干涉细胞粘附的条件下”(含甲基纤维素的培养基等)进行培养。专利文献1中既没有记载也没有启示如下内容：使用未形成椎间盘球的状态的(形成之前的)椎间盘干细胞等在补充了胶原酶的培养基中开始培养，对该椎间盘干细胞等进行扩增(增殖)或分化诱导；将椎间盘干细胞等彼此分散后接着持续进行在补充了胶原酶的培养基中的培养，在保持未形成作为悬浮性球结构物的椎间盘球的状态下使椎间盘干细胞等扩增(增殖)、分化。
需要说明的是，专利文献1中，虽然记载了在包含“抑制细胞成熟的化合物”(例如，FGF)或“维持细胞的幼稚性的化合物”(例如，TGF-β超家族成员、BMP、IL-6、LIF等)的无血清培养基中使椎间盘干细胞生长(第〔0035〕～〔0037〕段)，但既没有记载也没有启示在添加了促进Tie2的激活的物质的培养基中培养椎间盘干细胞。
另外，专利文献1中，对于用于获得髓核来源细胞群体的髓核组织的制备方法，仅记载了如下常用的方法：将髓核(通过手术获得的人椎间盘材料、或活检标本)碎片化，使用胶原酶II、梭菌胶原酶等进行处理，由此使髓核组织碎片化，使每个细胞分散开(制成单一细胞悬浮液)(第〔0026〕、〔0029〕、〔0030〕段、实施例1：第〔0171〕～〔0174〕段等)。
另一方面，专利文献2和非专利文献1中记载了如下内容：椎间盘组织(髓核)所含的细胞中的、作为细胞表面标志物的Tie2和/或GD2为阳性的细胞是应该称为髓核细胞的干细胞或祖细胞的细胞；特别是Tie2和GD2这两者为阳性的细胞(处于活性状态的髓核干细胞)具有形成球状集落、且经过一系列分化级联最终分化为成熟的髓核细胞的分化能力(此外也具有分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和神经细胞的分化能力)；进而通过将髓核干/祖细胞移植到椎间盘(髓核)，从而能够在组织中产生II型胶原蛋白等细胞外基质，存在维持或重建椎间盘组织、能够预防或治疗椎间盘退变疾病的可能性；等。
作为更具体的实施方式，专利文献2和非专利文献1中记载了如下内容：通过在甲基纤维素培养基中悬浮培养椎间盘组织(髓核)中包含的细胞群体而(与粘附型集落一同)形成球状集落；这样的球状集落由上述的Tie2阳性(且GD2阳性)细胞衍生；球状集落(其一部分细胞)中表达了II型胶原蛋白和蛋白聚糖；等(例如，参照专利文献2的实施例、第〔0067〕、〔0070〕段等)。然而，专利文献2和非专利文献1中也既没有记载也没有启示：在包含使细胞外基质分解的物质(例如，胶原酶)的培养基中或在细胞粘附性的培养表面上(使用未添加甲基纤维素的培养基)，在不形成球状集落的情况下使髓核干/祖细胞(Tie2和/或GD2阳性细胞)增殖或对其进行分化诱导。
另外，专利文献2和非专利文献1中，作为源自椎间盘髓核组织的细胞群体的制备方法，也仅记载了如下通常的方法：用剪刀等将组织切碎后，用蛋白质消化酶(TrypLEExpress、胶原酶P)消化(实施例：第〔0048〕段)。
需要说明的是，专利文献2和非专利文献1中记载了：为了维持Tie2阳性髓核细胞(椎间盘髓核干/祖细胞)，需要Tie2(受体)与Ang-1(angiopoietin-1，血管生成素-1，配体)之间的信号转导机制，通过在Ang-1的存在下进行培养(与强制表达Ang-1的AHESS5共培养)而能够扩增Tie2阳性细胞，因此，Ang-1被认为是控制髓核细胞的分化层次的生态位因子等(实施例：第〔0049〕、〔0069〕、〔0075〕段等)。
然而，Tie2也在血管内皮细胞中表达，通过激活Tie2也可实现血管的成熟化、正常化或稳定化，已知能够抑制例如肿瘤、类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、高脂血症、高血压等中观察到的血管无序的扩增(血管新生)、或防止、改善皱纹等。作为具有这种作用的Tie2活化剂，例如提出了樟(Cinnamomum)属植物来源的提取物(所谓的肉桂粉、专利文献3)、橄榄果实提取物(专利文献4)、以及皂树、黄杞、银杏、牡蛎、姜黄、菊、枣、枸杞、洋甘菊、假叶树、山楂、杨桃、艳山姜、莲、线状阿司巴拉妥(ASPALATHUS LINEARIS)、酸豆(Tamarindus indica)、木瓜、番石榴、荜茇、刺五加、芒果姜、红参、牛奶子、无翅猪毛菜、刺楸、山柳、重瓣萱草、大野芋、省沽油、海州常山、五指那藤、小赤车、枹栎、麻栎、翅果菊、金星果、车前草、薤白、杨梅、皂角刺、黄精、玉竹、栝楼仁、巴戟天等(专利文献5～11)各种源自动植物的提取物。进而，作为带来Tie2活化作用的成分，例如提出了熊果酸、科罗索酸、3-O-没食子酰基原花青素B-1、亚麻酸、13-羟基-9Z,11E,15E-十八碳三烯酸、原花青素B-2、表儿茶素-(4β-6)-表儿茶素(4β-8)-表儿茶素、原花青素C-1、黄芪皂苷VIII、大豆皂甙I、3’-O-甲基没食子儿茶素、荜茇壬二烯哌啶、丁香树脂醇、2-甲氧基肉桂醛、刺五加苷E、刺五加苷E1、芝麻素、eudistomins、连翘脂素、松脂醇、鹅掌楸树脂酚B二甲醚、连翘醇(forsythinol)、香豆素等(专利文献6、12～14)。
例如，专利文献3中，作为与“Tie2活化剂”相关的试验(实施例)，利用蛋白质印迹法确认了：在添加了肉桂热水提取物的培养基中培养“强制表达了Tie2的血细胞系Baf3细胞”或“正常人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)”时，在这些细胞中表达的Tie2蛋白经磷酸化者高于对照(第〔0024〕～〔0027〕段、图1～3等)。
然而，专利文献3～14中既没有记载也没有启示：在培养由椎间盘得到的髓核来源细胞群体(其中包含的Tie2阳性干/祖细胞)时利用Tie2活化剂、以及由此可带来何种作用效果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5509073号公报(对应WO2009/009020)
专利文献2：日本专利第5863639号公报(对应WO2011/122601)
专利文献3：日本特开2009-263358号公报(与WO2009/123211相关)
专利文献4：WO2016/060249
专利文献5：WO2012/073627
专利文献6：日本特开2012-236795号公报
专利文献7：日本特表2009-154237号公报
专利文献8：日本特开2011-201811号公报
专利文献9：日本特开2011-102275号公报
专利文献10：日本特开2011-102274号公报
专利文献11：日本特开2011-102273号公报
专利文献12：日本特开2014-97977号公报
专利文献13：日本特开2013-241356号公报
专利文献14：日本特开2011-102272号公报
非专利文献
非专利文献1：Sakai D et al.,Nat Commun.2012；3:1264
发明内容
发明要解决的问题
如前所述，为了制造用于预防或治疗椎间盘退变疾病等的同种椎间盘细胞制剂，需要使产生II型胶原蛋白、蛋白聚糖等细胞外基质的功能性髓核细胞的量达到一定程度。为此，例如需要使从椎间盘突出患者的患部切除的椎间盘组织(髓核等)中包含的、被认为是髓核细胞的干细胞和/或祖细胞的Tie2阳性细胞高效地增殖和分化，来大量产生功能性髓核细胞。特别是，为了提高对椎间盘退变疾病等患者给予细胞制剂时的治疗效果，重要的是在培养椎间盘中包含的Tie2阳性细胞(髓核干/祖细胞)并进行分化诱导时尽可能高效地分化为II型胶原蛋白等细胞外基质产生量多的功能性髓核细胞，而不是简单地分化为髓核细胞。与此同时，如上所述，在进行分化诱导之前预先使由组织得到的细胞群体中的Tie2阳性细胞(髓核干/祖细胞)高效地扩增对于增加最终得到的功能性髓核细胞的数量也是重要的。即，需求一种实用性手段，其通过由包含一定数量的Tie2阳性细胞(髓核干/祖细胞)的细胞群体高效地扩增和分化诱导Tie2阳性细胞(髓核干/祖细胞)，从而在最终制备、给药的细胞制剂(细胞群体)中富含功能性髓核细胞。
另外，上述专利文献1和2中记载那样的现有技术的典型的实施方式中，通过在添加有甲基纤维素的培养基中培养包含椎间盘组织所含的髓核干/祖细胞的细胞群体，从而在形成球状集落(椎间盘球、球状体)后分化为髓核细胞。然而，由于甲基纤维素是粘稠性高的物质，因此在不浪费的情况下由添加了该物质的培养基回收所生成的细胞群体(其中包含的有用的功能性髓核细胞)较难或需要大量的劳力，阻碍了细胞制剂的高效生产和实用化。
本发明的课题在于提供：用于由包含Tie2的表达为阳性的干细胞和/或祖细胞的细胞群体(例如，包含椎间盘来源的髓核干/祖细胞的细胞群体)高效制备富含具有与用途相应的规定性状的细胞(例如，产生II型胶原蛋白等细胞外基质的功能性髓核细胞)的细胞群体的手段。
用于解决问题的方案
本发明人等着眼于培养包含椎间盘髓核组织所含的Tie2阳性细胞(髓核干/祖细胞)的细胞群体时的、供于培养的细胞群体的状态和培养条件而进行了深入研究，结果发现能够有助于解决上述课题的多个特征性的技术事项。具备这些技术特征的培养方法中，有的方法在以扩增髓核干/祖细胞为主要目的的阶段(扩增培养阶段)的培养工序中非常有用，有的方法在以由髓核干/祖细胞分化诱导为功能性髓核细胞为主要目的的阶段(分化培养阶段)的培养工序中非常有用。进而还发现：通过组合这些方法并依次或同时利用、特别是为了将这些培养方法“融合”而同时实施的培养工序，从而能够协同地发挥发明的作用效果。
即，本发明的一个方面中，作为以椎间盘组织中包含的Tie2阳性细胞(髓核干/祖细胞)为代表的、包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法，提供能够组合(优选融合)的下述第1～第4的培养方法。
第1培养方法
基于本发明的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的“第1培养方法”是在存在于未经消化处理的组织中的状态下培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的方法。
目前，欲培养椎间盘髓核组织中包含的细胞群体时，通常情况是：将所采集的椎间盘的髓核组织切碎后，首先进行通过胶原酶等蛋白水解酶(蛋白酶)消化该组织的处理(消化处理)，回收通过该处理从髓核组织中分离出细胞群体并开始进行培养。然而本发明人等发现：在将髓核组织切碎后，不进行消化处理而直接将该切碎的髓核组织悬浮于培养液中，在细胞群体留在组织中的状态下培养一定时间时，与以往的进行了消化处理的情况相比，细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞(髓核干/祖细胞)的比率得到改善；每个细胞中的Tie2的表达也得到增强。可认为，这样的作用效果是由于：通过不进行髓核组织的消化处理，从而对于髓核干/祖细胞而言优选的、血管生成素-1(Ang-1)、VEGF-A等生长因子任然存在且用以维持Tie2阳性细胞的组织中的微环境(生态位)未被破坏(若没有Ang-1等，则Tie2阳性细胞最终会凋亡)，使用包含保持在这样的生态位中的状态的髓核干/祖细胞的细胞群体开始进行培养，从而Tie2的活性得到维持(与将细胞从生态位分离的现有方法相比，Tie2的表达增强)的髓核干/祖细胞能够迅速开始增殖，因此在培养后得到的细胞群体中引起上述那样的阳性率改善、表达量增加。
而且，由于未进行从髓核组织中分离细胞群体并回收这样的操作，因此能够无浪费地利用髓核组织中包含的珍贵的Tie2阳性干/祖细胞。例如，从椎间盘突出患者摘取的突出部分中包含的髓核组织量最多为1～2g左右，每1g该髓核组织中包含的Tie2阳性干/祖细胞根据患者的年龄等而波动，但例如大约为5万个左右。若与脐带血1cc中包含的白血细胞数为106个级、癌组织1g中包含的癌细胞数为108个级的情况等相比，则可知髓核组织中的Tie2阳性干/祖细胞是弥足珍贵的。从防止这样的Tie2阳性干/祖细胞因经过从髓核组织中分离细胞群体并回收这样的操作而减少、并且对于Tie2阳性干/祖细胞的扩增培养是优选的方面考虑，第1培养方法是极其有利的。
第2培养方法
基于本发明的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的“第2培养方法”是在添加了至少1种除生长因子以外的Tie2表达增强剂的培养基中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的方法。
已知：Tie2阳性干/祖细胞原本通过与作为Tie2(受体酪氨酸激酶)的配体的血管生成素-1(Ang-1)结合而使Tie2的激活(磷酸化)亢进，在添加了Ang-1的培养基中培养Tie2阳性干/祖细胞(增强Tie2的表达)的方法由于现有技术(现有技术文献等)是公知的。另外，已知FGF2(bFGF)也同样是具有增强Tie2表达的作用的生长因子，在添加了FGF2的培养基中培养Tie2阳性干/祖细胞的方法也是公知的。
然而，本发明人等发现：将种类与Ang-1、FGF2等生长因子不同的Tie2表达增强剂、例如肉桂粉的提取液之类的作为植物来源提取物的Tie2表达增强剂用于以往未报道的源自髓核组织的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养时，特别是将作为植物来源提取物的Tie2表达增强剂与FGF2等生长因子组合使用时，具有通过培养而得到的细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞(髓核干/祖细胞)的比率提高等显著的效果。
本发明人等还发现：通过将上述的“第1培养方法”和“第2培养方法”组合(特别是进行融合)，可协同高效地由髓核组织中的包含Tie2阳性干/祖细胞(髓核干/祖细胞)的细胞群体得到该干/祖细胞的细胞数量或比率高的细胞群体。
第3培养方法
另一方面，基于本发明的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的“第3培养方法”是在具有进行了提高细胞的粘附性的处理的培养表面的培养容器中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的方法。
目前，与其它众多干/祖细胞同样地，源自椎间盘髓核组织的包含Tie2阳性细胞(髓核干/祖细胞)的细胞群体也如上述专利文献1中记载所述，在“干涉细胞粘附的条件下”、即使用低粘附性的培养容器或使用甲基纤维素培养基以形成悬浮性的球状集落的方式进行培养。然而本发明人等发现：对于包含髓核干/祖细胞、优选包含利用上述那样的第1培养方法和/或第2培养方法而使Tie2的表达得到增强的髓核干/祖细胞的细胞群体而言，可以不在“干涉细胞粘附的条件下”、而是相反地在使用“具有进行了提高细胞的粘附性的处理(细胞粘附性处理)的培养表面的培养容器”、例如涂布有包含聚赖氨酸的涂层剂的培养容器的二维培养环境下(不使用甲基纤维素等)在未形成髓核干/祖细胞的球状集落的情况下粘附于该培养表面进行培养。
通过在分化培养阶段的工序中实施这样的第3培养方法，与使用培养表面未经处理的培养容器(或相反进行了抑制细胞的粘附性的处理(低粘附性处理)的培养容器)的情况相比，能够改善由髓核干/祖细胞分化为功能性髓核细胞(Col2阳性细胞等)的效率，能够制备细胞群体中的Col2阳性细胞的数量或比率高的细胞群体。
需要说明的是，第3培养方法也可以作为与上述的第2培养方法融合的方法并在扩增培养阶段的培养工序中实施。即，若在进行了细胞粘附处理的培养容器和添加了Tie2活化剂的培养基中培养Tie2阳性干/祖细胞，则能够在二维培养的环境下(不使用甲基纤维素等)高效地扩增Tie2阳性干/祖细胞。
第4培养方法
基于本发明的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的“第4培养方法”是在添加了细胞外基质降解剂的培养基中边抑制球状集落的形成边培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体方法。
以往，胶原酶或其它蛋白酶之类具有分解细胞外基质(胶原蛋白、蛋白聚糖等)的作用的物质如与第1培养方法的关系中所述，通常用于从所采集的组织中分离细胞；或者临时用于将由干/祖细胞形成的球状集落暂时分散、更换培养基并再次形成球状集落之类的培养方法中。
然而，本发明人等发现：能够将胶原酶等具有分解细胞外基质的作用的物质(细胞外基质降解剂)用于完全不同的目的(用途)。即，本发明人等发现：若是具有分化为髓核细胞的能力的髓核干/祖细胞那样的Tie2阳性干/祖细胞(更优选为利用第1培养方法和/或第2培养方法增强了Tie2的表达者)，则令人惊讶的是，在添加了细胞外基质降解剂的培养基中、即不能形成由Tie2阳性干/祖细胞通过细胞外基质彼此结合而成的球状集落的情况下也能够进行培养；进而能够边使其增殖边分化诱导为II型胶原蛋白、蛋白聚糖等细胞外基质的表达为阳性的细胞。
本发明人等还发现：通过将上述的“第3培养方法”和“第4培养方法”组合，优选通过在适宜组合了培养基中的细胞外基质降解剂的种类和浓度及培养容器表面的涂层剂的种类的基础上进行融合，由此能够协同高效地显著改善由髓核干/祖细胞分化为II型胶原蛋白(Col2)阳性细胞那样的功能性髓核细胞的效率，能够制备Col2阳性细胞等的数量或比率显著高于现有的细胞群体。
而且，本发明人等还发现：通过使用第3培养方法和/或第4培养方法，从而在Col2阳性细胞等的数量或比率达到一定水平的阶段，可以得到Tie2阳性干/祖细胞也未完全消失、保留了一定水平的数量或比率的细胞群体。这样的细胞群体由于包含一定水平的数量或比率的Tie2阳性干/祖细胞，因此具有给药时的对椎间盘髓核的治疗效果等变得更优异的有用性。
基于上述的各培养方法，本发明人等构建了：由包含Tie2阳性干/祖细胞(髓核干/祖细胞等)的细胞群体制备包含由该Tie2阳性干/祖细胞分化出的目标细胞(Col2阳性髓核细胞等)的细胞群体的方法。该细胞群体的制备方法由于边增强Tie2阳性干/祖细胞的Tie2的表达边使其增殖，因此包括用于扩增细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的培养阶段(扩增培养阶段)、以及用于使Tie2阳性干/祖细胞分化诱导为目标细胞的培养阶段(分化培养阶段)中的至少一者，优选包括两者。扩增培养阶段包括实施上述的第1培养方法和第2培养方法中的至少一者、优选两者(可以为融合这些的方法。)的工序。分化培养阶段包括实施上述的第3培养方法和第4培养方法中的至少一者、优选两者(可以为融合这些的方法。)的工序。具备包括实施第1培养方法和第2培养方法这两者(优选为融合的方法)的工序的扩增培养阶段、以及包括实施第3培养方法和第4培养方法这两者(优选为融合的方法)的工序的分化培养阶段的细胞群体的制备方法是本发明中的特别优异的实施方式，与现有公知的制备方法相比，能够制备具有规定的功能性的目标细胞的数量或比率得到显著改善的细胞群体。现有的制备方法有如下情况：有些细胞群体整体的细胞数或髓核细胞的细胞数虽然达到一定的水平，但其中具有Col2的表达为阳性等功能性的髓核细胞并不多，另外，细胞群体中的Col2阳性细胞的比率、每个细胞的表达量虽然达到一定的水平，但Col2阳性细胞的绝对数量不足(由一个供体中能采集的髓核组织所扩增的Col2阳性细胞的数量存在极限)。如此，髓核相关细胞群体难以兼顾Col2阳性细胞的数量和表达量(表达的强度)，但可以说本发明的制备方法是成功兼顾了两者的尚未提出的划时代的制备方法。
从另一个角度来看，以往为了利用(Tie2阳性)干/祖细胞具有支架非依赖性增殖能力、能够形成球状集落的性质，而且为了避免由于在培养表面(支架)上培养由该干/祖细胞分化出的细胞而失去期望的功能性，采用了边在甲基纤维素培养基中或在低粘附性的培养表面上培养采集的组织中包含的细胞群体、边由该干/祖细胞分化为具有规定的功能性的目标细胞的方法。可以说本发明人等发现了如下划时代的方法：利用上述的各培养方法(特别是第3培养方法和第4培养方法)，能够在不使用粘稠性高而难以回收细胞的甲基纤维素且在容许细胞粘附于培养表面的环境下显著提高(Tie2阳性)干/祖细胞的增殖和由该干/祖细胞分化为具有规定的功能性的目标细胞的效率性，能够容易且没有浪费地从培养基中回收所产生的细胞群体。
与上述的培养方法和制备方法相关，尤其与第1培养方法和扩增培养工序相关，本发明人等发现：通过在存在于未经消化处理的组织中的状态下冷冻保存包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体，从而能够维持Tie2被活化和/或被表达的状态、或抑制细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的减少的、包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的优选的保存方法。目前，对于所采集的椎间盘髓核组织中包含的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体，进行的是在通过比较耗时的使用胶原酶等的消化处理从该组织中分离后仅将细胞群体冷冻保存。然而，通过将所采集的椎间盘髓核组织立即冷冻保存，能够提高操作工序上的便利性、且能够在保持了(特别是由年轻供体采集的)组织中良好的生态位的状态下维持细胞群体。将这样的经冷冻保存的组织解冻后，利用上述的第1培养方法将经解冻的组织放入培养基中培养细胞群体，能够高效地扩增Tie2阳性干/祖细胞。
若将上述的技术构思与具体如后所述的(优选的)实施方式组合并具体化，则本发明例如可以表述为至少包括下述事项的发明。
[1]
一种培养细胞群体的方法(以下称为“第1培养方法”)，其为包含Tie2(含Ig和EGF同源结构域-2的酪氨酸激酶)的表达为阳性的干细胞和/或祖细胞(以下称为“Tie2阳性干/祖细胞”)的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在存在于未经消化处理的组织中的状态下培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
[2]
根据项目1所述的第1培养方法，其中，所述Tie2阳性干/祖细胞为源自椎间盘的髓核组织的Tie2阳性干/祖细胞。
[3]
根据项目1或2所述的第1培养方法，其中，所述未经消化处理的组织为椎间盘的髓核组织。
[4]
根据项目1～3中任一项所述的第1培养方法，其中，所述未经消化处理的组织是将经冷冻保存的组织解冻而得到的组织。
[5]
根据项目1～4中任一项所述的第1培养方法，其在扩增细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞时进行。
[6]
一种培养细胞群体的方法(以下称为“第2培养方法”)，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在添加了至少1种除生长因子以外的Tie2表达增强剂的培养基中培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
[7]
根据项目6所述的第2培养方法，其中，所述除生长因子以外的Tie2表达增强剂为源自动植物的提取物。
[8]
根据项目7所述的第2培养方法，其中，所述植物为樟(Cinnamomum)属的植物。
[9]
根据项目6～8中任一项所述的第2培养方法，其在扩增细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞时进行。
[10]
一种培养细胞群体的方法(以下称为“第3培养方法”。)，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在具有进行了提高细胞的粘附性的处理的培养表面的培养容器中培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
[11]
根据项目10所述的第3培养方法，其中，所述Tie2阳性干/祖细胞进行了Tie2表达增强处理。
[12]
根据项目10或11所述的第3培养方法，其中，所述提高细胞的粘附性的处理是涂布含有细胞外基质和/或聚氨基酸的涂层剂的处理。
[13]
根据项目10～12中任一项所述的第3培养方法，其在使细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞分化为目标细胞时进行。
[14]
根据项目12或13所述的第3培养方法，其中，所述细胞外基质和/或聚氨基酸为选自由IV型胶原蛋白、纤连蛋白和聚赖氨酸组成的组中的至少1种以上。
[15]
根据项目10～14中任一项所述的第3培养方法，其在扩增细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞时进行。
[16]
根据项目12～15中任一项所述的第3培养方法，其中，所述细胞外基质为明胶。
[17]
一种培养细胞群体的方法(以下称为“第4培养方法”)，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在添加了细胞外基质降解剂的培养基中边抑制球状集落的形成边培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
[18]
根据项目17所述的第4培养方法，其中，所述Tie2阳性干/祖细胞进行了Tie2表达增强处理。
[19]
根据项目17或18所述的第4培养方法，其中，所述细胞外基质降解剂至少包含对II型胶原蛋白具有降解活性的蛋白酶。
[20]
根据项目17～19中任一项所述的第4培养方法，其在使细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞分化为目标细胞时进行。
[21]
一种制备方法，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的制备方法，所述制备方法包括：包含实施项目5所述的第1培养方法和/或项目9所述的第2培养方法的工序的、用于增强Tie2阳性干/祖细胞的Tie2的表达且扩增细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的培养阶段(以下称为“扩增培养阶段”)。
[22]
根据项目21所述的制备方法，其中，在所述扩增培养实施的工序是同时实施所述第1培养方法和所述第2培养方法的工序。
[23]
根据项目21或22所述的制备方法，其中，所述扩增培养阶段还包括：在仅添加了具有Tie2表达增强作用的生长因子作为Tie2表达增强剂的培养基中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的工序。
[24]
一种制备方法，其为由包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体制备包含由该Tie2阳性干/祖细胞分化出的目标细胞的细胞群体的制备方法，
所述制备方法包括：包含实施项目13或14所述的第3培养方法和/或项目20所述的第4培养方法的工序的、用于将Tie2阳性干/祖细胞分化诱导为目标细胞的培养阶段(以下称为“分化培养阶段”)。
[25]
根据项目24所述的制备方法，其中，在所述分化培养阶段实施的工序是同时实施所述第3培养方法和所述第4培养方法的工序。
[26]
根据项目24或25所述的制备方法，其中，所述目标细胞为至少表达II型胶原蛋白的细胞。
[27]
根据项目26所述的制备方法，其中，所述至少表达II型胶原蛋白的细胞为髓核细胞。
[28]
根据项目24～27中任一项所述的制备方法，其中，通过所述分化培养阶段，得到还残留有Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
[29]
一种制备方法，其为由包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体制备包含由该Tie2阳性干/祖细胞分化出的目标细胞的细胞群体的制备方法，
所述制备方法包括：
项目21～23中任一项所述的扩增培养阶段、和
项目24～28中任一项所述的分化培养阶段。
[30]
一种细胞群体，其通过项目1～20中任一项所述的培养方法而得到。
[31]
一种培养物，其含有：项目1～20中任一项所述的培养方法中的培养基；及供于该培养方法的、经培养的或得到的细胞群体。
[32]
一种细胞群体，其通过项目21～29中任一项所述的制备方法中的扩增培养阶段和/或分化培养阶段而得到。
[33]
一种培养物，其含有：项目21～29中任一项所述的制备方法中的扩增培养阶段用培养基或分化培养阶段用培养基；及各个供于该扩增培养阶段或分化培养阶段的、经培养的或得到的细胞群体。
[34]
一种细胞治疗用组合物，其含有项目30或32所述的细胞群体。
[35]
根据项目34所述的细胞治疗用组合物，其用于治疗或预防症状表现为椎间盘的损伤、退变或突出的疾病。
[36]
一种保存方法，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的保存方法，
所述保存方法通过在存在于未经消化处理的组织中的状态下冷冻保存包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体，从而维持Tie2被激活和/或被表达的状态、或抑制所述细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的减少。
发明的效果
利用本发明的Tie2阳性干/前体细胞的培养方法，优选利用包括以扩增Tie2阳性干/祖细胞为主目的的扩增培养工序、及以由Tie2阳性干/祖细胞分化诱导具有规定性状的成熟细胞为主目的的分化培养工序的培养方法，能够制备富含目标细胞的细胞群体。通过利用基于这样的本发明的培养方法而得到的细胞群体，从而能够高效地制造对于治疗或预防规定的疾病有效的细胞制剂。
另外，本发明中，由于无需在培养基中添加如上述专利文献1和2等中记载的现有技术中使用的甲基纤维素那样粘稠性高的成分，因此能够从培养基中无浪费地回收包含Tie2阳性干/祖细胞或由其分化诱导的目标细胞的细胞群体。
根据本发明的代表性的实施方式，使用通过椎间盘突出患者的手术仅能少量采集的椎间盘(髓核)，通过使其中包含的Tie2阳性干/祖细胞(髓核干细胞等)高效地增殖和分化，从而能够简单高效率地、再现性良好且大量地获得移植时可期待高治疗效果的适合的细胞群体、即富含II型胶原蛋白等细胞外基质产生能力高的功能性髓核细胞的(而且也残留有少量的Tie2阳性干/祖细胞)细胞群体。目前，无法或难以制作这样的适合的细胞群体，但通过本发明能够实现，因此通过给予上述细胞群体(含有上述细胞群体的细胞制剂)使椎间盘的再生疗法变得非常容易进行，工业化指日可待。
需要说明的是，对于本发明的第4培养方法发挥作用效果的理由，例如推测是如图1所示那样的原理在起作用。但是，该预测是为了帮助理解本发明，而不是不必要地限制本发明。即使事后证实基于与图1所示不同的原理、作用机理发挥了本发明的一部分或全部作用效果，通过基于以下的图1的说明也不能否定现实中能够确认的本发明的作用效果、为此目的的本发明的构成特征。
图1的[A]表示将包含Tie2阳性干/祖细胞(例如，髓核干/祖细胞)的细胞群体通过二维培养(单层静置培养)使其增殖和分化时的培养细胞的状态。培养容器(烧瓶等)的培养表面有时预先进行了涂布包含细胞外基质(ECM)的涂层剂等能粘附细胞那样的表面处理。干/祖细胞粘附于培养容器的培养表面，在该培养面上边伸展、增殖边分化。这样的二维培养中，涂布于培养面上的ECM或由培养细胞分泌的ECM与在培养细胞表面表达的结合蛋白(整合素等)的相互作用导致最终产生终止ECM的产生和分泌的细胞内信号转导。例如，在二维培养髓核来源细胞群体时，从该细胞群体中原本包含的成熟髓核细胞、及该细胞群体中包含的髓核干/祖细胞边增殖边分化而生成的成熟髓核细胞中旺盛地分泌II型胶原蛋白、蛋白聚糖等ECM。然而，随着培养时间的经过，最终通过上述那样的细胞内信号转导使II型胶原蛋白等的产生和分泌停止(取而代之I型胶原蛋白的产生和分泌增加)，引起如显示出成纤维细胞样的表型等成熟髓核细胞的脱分化。因此，认为在通常的二维培养中，难以兼顾增加细胞群体中的细胞数与提高保持特定性状(未脱分化)的细胞的比例。需要说明的是，本发明的第3培养方法中，优选使用增强了Tie2的表达的Tie2阳性干/祖细胞，从而在二维培养中也能够相对容易地制备以一定的比例包含表达II型胶原蛋白等的髓核细胞的细胞群体。
图1的[B]和[C]表示：对包含Tie2阳性干/祖细胞(例如，髓核干/祖细胞)的细胞群体，通过使用了含甲基纤维素的培养基(未添加细胞外基质(ECM)分解剂)或低吸附性培养容器的培养而其增殖和分化时的培养细胞的状态。与上述图1的[A]的二维培养不同，在如图1的[B]所示那样的培养中，不发生培养容器的培养表面上的ECM等与培养细胞的相互作用，也不发生由该相互作用所致的终止ECM的产生和分泌的细胞内信号转导。因此，在培养的初期，Tie2阳性干/祖细胞边产生和分泌ECM边增殖，最终形成球状集落。然而，在所形成的球状集落中，Tie2阳性干/祖细胞或由该细胞分化的细胞(例如，髓核细胞)彼此通过所分泌的ECM而相互接触。因此，如图1的[C]所示，随着培养时间的经过，发生ECM与培养细胞的相互作用，通过该相互作用而发生ECM产生终止信号，引起与图1的[A]同样的脱分化。因此，在图1的[B]和[C]所示那样的培养方法中，难以使作为球状集落回收的细胞群体中的、规定的ECM(例如，II型胶原蛋白)的表达为阳性的细胞的比率提高至一定水平以上。
图1的[D]表示：根据本发明的第4培养方法，通过使用添加了细胞外基质(ECM)分解剂的培养基(不含甲基纤维素等)的培养使包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体增殖和分化时的Tie2阳性培养细胞的状态。这样的培养方法中，也与图1的[B]同样地，从干/祖细胞或由该细胞分化的细胞中分泌ECM。然而，分泌至细胞外的ECM被添加至培养基的ECM分解剂不断分解，因此无法形成球状集落，即使不使用低吸附性的培养容器，细胞也不会粘附于培养表面。另外，在本发明的第3/第4培养方法中，即使与图1的[A]的二维培养同样地预先在培养容器的培养表面涂布了包含ECM的涂层剂，细胞在该培养表面的粘附也较弱。因此，起因于ECM与培养细胞的相互作用的ECM产生终止信号受到抑制，变得不易发生图1的[A]、图1的[B]和[C]时那样的脱分化，因此能够制备规定的ECM(例如，II型胶原蛋白)的表达为阳性的细胞的比率与现有技术相比得到提高的细胞群体。
需要说明的是，分泌至细胞外的ECM被培养基中的ECM分解剂分解，但细胞内的ECM会蓄积而不会分解。因此，在分化培养阶段的工序中实施本发明的第4培养方法后，从培养基中回收得到的细胞群体并制造细胞制剂，则在给予了该细胞制剂的组织中细胞内蓄积的ECM迅速分泌至细胞外而能够创造出适于细胞群体生存的环境，可期待来自所给予的细胞的、之后的ECM的产生和分泌(即，基于细胞制剂的治疗效果)的促进。
附图说明
图1示出：示意性示出在通常的二维培养(单层静置培养)、使用了以往的不包含细胞外基质(ECM)分解剂的培养基的悬浮培养、和基于本发明的第4培养方法的使用了包含ECM分解剂的培养基的悬浮培养中，ECM的产生或分解与培养细胞的相互作用的图，及各自的培养细胞的照片。A(通常的二维培养)：通过粘附分子使髓核(NP)细胞粘附于培养烧瓶的培养面，由此可转导ECM产生终止信号。B(利用低吸附性烧瓶、甲基纤维素培养基等的悬浮培养)：不接触烧瓶培养面，且未转导ECM产生终止信号(×标记和虚线的箭头)。C(在培养基中无酶)：自己产生的ECM显示出与培养面同等的作用(箭头)，ECM产生终止信号被转导至细胞内。D(在培养基中有酶)：自己产生的细胞外ECM被分解，ECM产生终止信号未被转导至细胞内(×标记和虚线的箭头)，但发生了ECM在细胞内的蓄积。
图2是表示试验例1(扩增培养阶段：第1培养工序)中的、Tie2阳性率的结果的图。
图3是表示试验例1(扩增培养阶段：第1培养工序)中的、Tie2平均荧光强度(MFI)的结果的图。
图4是表示试验例2(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序)中的、Tie2阳性率的结果的图。
图5是表示试验例2(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序)中的、由每1g髓核组织产生的Tie2阳性细胞数的结果的图。
图6是表示试验例3(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3培养工序)中的、II型胶原蛋白(Col2)阳性率的结果的图。
图7是表示试验例3(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3培养工序)中的、由每1g髓核组织产生的II型胶原蛋白(Col2)阳性细胞数的结果的图。
图8是表示试验例4(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3/第4培养工序)中的、蛋白聚糖(PG)阳性率的结果的图。
图9是表示试验例4(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3/第4培养工序)中的、II型胶原蛋白(Col2)阳性率的结果的图。
图10是表示试验例5(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3/第4培养工序其2)中的、蛋白聚糖(PG)和II型胶原蛋白(Col2)的阳性率的结果的图。GEL：明胶、Col1：I型胶原蛋白、Col4：IV型胶原蛋白、FN：纤连蛋白、PLL：聚-L-赖氨酸(图11中也同样)。
图11是表示试验例6(扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3/第4培养工序其3)中的、蛋白聚糖(PG)和II型胶原蛋白(Col2)的阳性率的结果的图。
图12是试验例5-12中的细胞群体的光学显微镜照片。
图13是表示试验例7(分化培养阶段：第3培养工序)中的、Tie2阳性率的结果的图。
图14是表示试验例7(分化培养阶段：第3培养工序)中的、总Tie2阳性细胞数的结果的图。
图15是表示试验例7(分化培养阶段：第3培养工序)中的、Col2阳性率的结果的图。
具体实施方式
-术语-
“干细胞”是指具有自我复制能力和分化能力(全能性(totipotent)、多能性(pluripotent)、复能性(multipotent)或单能性(unipotent))的细胞。“祖细胞”是指：虽然最终都变为终末分化的细胞而不具有严格意义上的自我复制能力，但是具有边使其相对较活跃地增殖边逐渐分化为规定细胞的分化能力的细胞。本领域技术人员通常以包括“干细胞”或“祖细胞”的名称来理解的(特定的)细胞相当于本说明书中的“干细胞”或“祖细胞”。
本说明书中，“干细胞和/或祖细胞”是包括干细胞、祖细胞或这两者的表述，也有时表述为“干/祖细胞”。另外，本说明书中，有时将包含干细胞和/或祖细胞的细胞群体表述为“干/祖细胞群体”，将包含由干细胞和/或祖细胞分化、成熟而得到的细胞(终末分化细胞)的细胞群体表述为“成熟细胞群体”。
“干细胞”和“祖细胞”通常以1种或2种以上特定基因(标志物基因、细胞标志物)的表达为阳性或阴性来区别于其它细胞。即，具有上述那样的自我复制能力和/或分化能力的“干细胞”和“祖细胞”有时也被定义为各自的特定标志物基因的表达为阳性或阴性的细胞。
对于标志物基因(细胞标志物)的表达呈“阳性”还是呈“阴性”，依据通常的方法，定量或定性地测定由该基因(基因组)转录的mRNA或由该mRNA翻译的蛋白质的表达量，在该表达量为一定水平以上(或超过一定水平)时，可以判定为阳性，在为一定水平以下(或不到一定水平)时，可以判定为阴性。蛋白质的表达量例如可以通过流式细胞仪、免疫染色、ELISA之类的使用了该蛋白质特异性抗体和标记剂等的免疫学方法定量或定性地测定。需要说明的是，Tie2蛋白是在细胞表面表达的蛋白质，Col2是在细胞内部表达的蛋白质，分别使用作为检测细胞表面和细胞内部存在的蛋白质的方法(免疫荧光染色法等)中的适宜方法即可。mRNA的表达量例如可以利用RT-PCR、微阵列、生物芯片之类的使用该mRNA特异性的(互补的)核酸和标记剂、核酸扩增方法(手段)等的方法定量或定性地测定。对于细胞群体中的规定的标志物基因(细胞标志物)的表达为阳性或阴性的细胞的比率(阳性率或阴性率)，可以利用上述那样的各种的方法、例如利用流式细胞仪的测量分别计算出细胞群体中的总细胞数、及利用上述那样的方法判定为阳性或阴性的细胞数。
本说明书中，“Tie2的表达为阳性的干细胞和/或祖细胞”即“Tie2阳性干/祖细胞”是指：通过流式细胞仪，以蛋白质的表达而言，判定作为细胞标志物之一而已知的Tie2(含Ig和EGF同源结构域-2的酪氨酸激酶)的表达为阳性的、具有干细胞和/或祖细胞的性状的细胞。本发明中的代表性的Tie2阳性干/祖细胞是将“源自椎间盘的髓核组织的”Tie2阳性干/祖细胞、即椎间盘的髓核中存在的(能从髓核采集的)Tie2阳性干/祖细胞或该Tie2阳性干/祖细胞传代而得到的Tie2阳性干/祖细胞，是相当于以下说明的“髓核干/祖细胞”的细胞。
本说明书中，“目标细胞”是指：由Tie2阳性干/祖细胞通过规定的分化诱导而得到的、具有与用途相应的功能性的细胞，更具体而言是指：例如流式细胞仪，以蛋白质的表达而言，判定规定的基因(细胞标志物)的表达为阳性或阴性的细胞。本发明中的代表性的目标细胞是以下说明的“髓核细胞”中的Col2、聚集蛋白聚糖等细胞外基质(ECM)基因的表达为阳性的细胞。
本发明中，“髓核细胞”是指占据椎间盘(髓核)中的细胞群体的大部分的、成熟且达到终末分化的细胞、或具有与其同等性状的培养细胞。对于髓核细胞，具体而言，可以定义为作为标志物基因的Tie2和GD2为阴性(进而，通常CD24为阳性)、而且细胞外基质中至少II型胶原蛋白为阳性(进而，通常蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖)也为阳性)的细胞。例如，通过流式细胞仪，判定作为蛋白质(细胞标志物)的Tie2和GD2为阴性(且CD24为阳性)、II型胶原蛋白为阳性(且聚集蛋白聚糖也为阳性)的细胞相当于本发明中的髓核细胞。需要说明的是，对于II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖等细胞外基质，可以利用流式细胞仪测定这些蛋白质的产生量、且利用实时PCR等测定这些的mRNA的表达量。
本发明中，“髓核干/祖细胞”是指占据椎间盘的髓核组织中的细胞群体的一部分的、具有至少分化为髓核细胞的分化能力的祖细胞(髓核祖细胞)和具有分化为该祖细胞的分化能力和自我复制能力的干细胞(髓核干细胞)、或具有与其同等性状的培养细胞。对于髓核干/祖细胞，具体而言，可以定义为作为标志物基因的Tie2和/或GD2为阳性的细胞。例如，通过流式细胞仪判定作为蛋白质(细胞标志物)的Tie2为阳性且GD2为阴性、Tie2为阳性且GD2为阳性、或Tie2为阴性且GD2为阳性中的任意者的细胞相当于本发明中的髓核干/祖细胞。
需要说明的是，上述专利文献2中，基于作为髓核来源细胞的细胞标志物的Tie2和GD2的表达状态，将Tie2为阳性的细胞分类为“椎间盘髓核干细胞”(此处，GD2为阴性的细胞处于休眠状态，GD2为阳性的细胞处于活性状态)，将Tie2为阴性且GD2为阳性的细胞分类为“椎间盘祖细胞”，将Tie2为阴性且GD2为阴性的细胞分类为“完成分化的成熟的椎间盘髓核细胞”(第〔0024〕、〔0025〕、〔0032〕段)。另外，专利文献2中，对于髓核细胞的分化层次中出现的细胞，分类为：(i)Tie2阳性且GD2阴性(进而CD24阴性、CD44阳性/阴性、CD271阳性、Flt1阳性)的细胞、(ii)Tie2阳性且GD2阳性(进而CD24阴性、CD44阳性、CD271阳性、Flt1阳性)的细胞、(iii)Tie2阴性且GD2阳性(进而CD24阴性、CD44阳性、CD271阳性/阴性、Flt1阳性/阴性)的细胞、(iv)为Tie2阴性且GD2阳性(进而CD24阳性、CD44阳性、CD271阴性、Flt1阴性)的细胞、(v)Tie2阴性且GD2阴性(进而CD24阳性、CD44阳性、CD271阴性、Flt1阴性)的细胞，针对上述(i)～(iii)使用了“椎间盘髓核干/祖细胞”(NP stem/progenitor cells)这一表述，针对上述(iii)～(v)使用了“髓核定型细胞”(NP committed cells)这一表述(参照图7-2)。虽然表述的方式不同，但专利文献2的“椎间盘髓核干细胞”和“椎间盘髓核祖细胞”、即上述(i)～(iv)的细胞相当于本发明中的“髓核干/祖细胞”，专利文献2的“完成分化的成熟的椎间盘髓核细胞”、即上述(v)的细胞相当于本发明中的“髓核成熟细胞”。根据需要，可以将本发明中的细胞替换为依据专利文献2中记载的定义(特别是，对于CD24等Tie2和GD2以外的1种或2种以上细胞标志物是阳性还是阴性的定义)的细胞。
本发明中“球状集落”是包含干细胞和/或祖细胞、进而还可以包含由该细胞分化而成的细胞的球状细胞聚集体。“球状集落”是也被本领域技术人员通常称为“球体”、“球状体”等的物体，上述专利文献2中的“椎间盘球”(discosphere)或“悬浮性球结构物”(freefloating circular-spherical structure)也是相当于“球状集落”的物体。
本发明中“Tie2的表达得到增强”(Tie2表达增强)是指：每个干/祖细胞中，Tie2基因的表达得到增强、即表达比通常亢进，作为mRNA或蛋白质的表达量增加。即使在通常Tie2基因的表达几乎消失的条件下也保持一定水平的表达量而表达不消失、即维持了Tie2的表达，这也相当于“Tie2的表达得到增强”。另外，每个干/祖细胞中如此增强了Tie2的表达而使细胞群体中的被判定为Tie2的mRNA或蛋白质的表达为阳性的细胞数增加、即细胞群体中的Tie2阳性细胞的比率高于通常的情况，也可以作为“Tie2表达增强”的表述来理解。
更具体而言，例如，针对预先实施了Tie2表达增强处理的细胞群体(Tie2表达增强处理组)与未实施该处理的细胞群体(对照组)，实施对细胞表面的Tie2蛋白进行荧光标记的处理并利用流式细胞仪进行测定，与对照组相比Tie2表达增强处理组的荧光强度高于规定的水平而判定表达为阳性的细胞的比率高、和/或每个细胞的平均荧光强度高时，可以说Tie2表达增强处理组的细胞群体(中包含的Tie2表达细胞)的Tie2表达得到增强(换言之，Tie2表达增强处理发挥了规定的作用)。进而，在形态观察中，也可以通过Tie2的表达得到增强的细胞具有纺锤形(否则细胞接近球形)来加以区分。
本发明中，在本发明中将发挥上述那样的“Tie2表达增强”的作用效果的剂称为“Tie2表达增强剂”。需要说明的是，一部分生长因子(FGF2等)具有Tie2表达增强作用，可以说相当于一种“Tie2表达增强剂”，因此将除了这样的生长因子以外的情况称为“除生长因子以外的Tie2表达增强剂”。
本发明中，实施第1培养方法和/或第2培养方法相当于对包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体实施“Tie2表达增强处理”。
-培养方法-
基于本发明的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的第1～第4培养方法如下所述：
第1培养方法：在存在于未经消化处理的组织中的状态下培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的方法；
第2培养方法：在添加了至少1种除生长因子以外的Tie2表达增强剂的培养基中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的方法；
第3培养方法：在具有进行了提高细胞的粘附性的处理的培养表面的培养容器中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的方法；
第4培养方法：在添加了细胞外基质降解剂的培养基中边抑制球状集落的形成边培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体方法。
本发明的第1～第4培养方法可以单独实施，也可以组合多种依次或同时实施。组合选自第1～第4培养方法中的多个培养方法同时实施是指：将所选择的培养方法融合、即实施满足所选择的培养方法的全部技术事项的培养方法。例如，第1培养方法和第2培养方法可以进行组合并依次或同时(融合)来实施(有时将这些融合后的方法称为“第1/第2培养方法”。)。第3培养方法和第4培养方法也可以进行组合并依次或同时(融合)来实施(有时将融合这些的方法称为“第3/第4培养方法”。)。
实施本发明的第1～第4培养方法的目的没有特别限定。第1～第4培养方法也可以分别在本发明的扩增培养阶段(或相当于该阶段的阶段)、分化培养阶段(或相当于该阶段的阶段)、其它阶段的任意阶段实施。
本说明书中，关于第1～第4培养方法的记载(进而实施这些的第1～第4培养工序)，只要没有特别声明，则不仅可适宜替换为分别作为单独的方法(工序)实施时的记载，也可以适宜替换为作为与其它方法(工序)融合而得到的方法(工序)来实施时的记载。
成为本发明的第4培养方法的适用对象的细胞群体中包含的Tie2阳性干/祖细胞、和由该干/祖细胞分化的细胞只要是发挥如下作用效果的细胞则细胞的种类没有特别限定，所述作用效果为：在不含细胞外基质降解剂的通常的培养基中，会因分泌至细胞外的细胞外基质而彼此结合并形成球状集落(球状体)的细胞，在按照本发明向培养基中添加了细胞外基质降解剂的情况下，球状集落(球状体)的形成会受到抑制。
本发明的代表性的实施方式中，由Tie2阳性干/祖细胞分化而成的细胞是比通常的细胞产生、分泌更多的细胞外基质的细胞，例如，是具有在椎间盘髓核组织中产生、分泌细胞外基质的作用的髓核细胞。成熟的髓核细胞至少表达II型胶原蛋白作为细胞外基质，此外还表达蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖)等细胞外基质。本发明的优选的实施方式中，由Tie2阳性干/祖细胞分化为这样的表达II型胶原蛋白、蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖)等细胞外基质的细胞，特别是不仅II型胶原蛋白的mRNA的表达量(产生量)优异、而且II型胶原蛋白的蛋白质的表达量(产生量)优异的功能性髓核细胞。
-制备方法(培养工序)-
基于本发明的由包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体制备包含由Tie2阳性干/祖细胞分化而成的目标细胞的细胞群体的制备方法包括如下那样的扩增培养阶段和/或分化培养阶段，优选(以扩增培养阶段在先、分化培养阶段在后的顺序)包含扩增培养阶段和分化培养阶段这两者：
扩增培养阶段：用于增强Tie2阳性干/祖细胞的Tie2的表达、且扩增细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的培养阶段；
分化培养阶段：用于将Tie2阳性干/祖细胞分化诱导为目标细胞的培养阶段。
·关于扩增培养阶段的工序
本发明的优选的实施方式中，第1培养方法和第2培养方法在扩增培养阶段的工序中实施。可以仅实施第1培养方法和第2培养方法中的任一者，也可以实施两者。在实施第1培养方法和第2培养方法这两者时，在扩增培养阶段，实施第1培养方法的工序(本说明书中称为“第1培养工序”。)和实施第2培养方法的工序(本说明书中称为“第2培养工序”。)可以设为依次进行的单独的工序(第1培养工序在先、第2培养工序在后。)，也可以设为同时进行2个培养方法(实施融合了这些的第1/第2培养方法)的单一工序(本说明书中称为“第1/第2培养工序”。)，即可以设为在存在于未经消化处理的组织中的状态下、且在添加了Tie2表达增强剂的培养基中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的工序。
“扩增培养阶段的工序”是指：通过依据规定的条件的培养，以扩增Tie2阳性干/祖细胞为主要目的，(与其它作用效果细胞更强地)发挥为此目的的作用效果的工序。即，如果与培养前细胞群体相比培养后细胞群体的Tie2阳性干/祖细胞的细胞数和/或比率提高，则可以将该培养工序称为“扩增培养阶段的工序”，在该限度内允许发生由Tie2阳性干/祖细胞分化为其它细胞(目标细胞)的情况。
本发明中，由于能够协同高效地发挥增强每个Tie2阳性干/祖细胞(例如，髓核干/祖细胞)中表达Tie2(包括维持表达了Tie2的状态。)、且改善细胞群体中包含的Tie2阳性干/祖细胞的细胞数和/或比率等作用效果，因此特别优选实施第1/第2培养方法(即实施第1/第2培养工序)作为扩增培养阶段的工序。
·关于分化培养阶段的工序
本发明的优选的实施方式中，第3培养方法和第4培养方法在分化培养阶段的工序中实施。可以仅实施第3培养方法和第4培养方法中任一者，也可以实施两者。在实施第3培养方法和第4培养方法这两者时，在分化培养阶段，实施第3培养方法的工序(本说明书中称为“第3培养工序”。)和实施第4培养工序的工序(本说明书中称为“第4培养工序”。)可以设为依次进行的单独的工序，也可以设为同时进行2个培养方法(实施融合了这些的第3/第4培养方法)的单一的工序(本说明书中称为“第3/第4培养工序”。)。即，可以设为在具有进行了提高细胞的粘附性的处理的培养表面的培养容器中、且在添加了细胞外基质降解剂的培养基中边抑制球状集落的形成边培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的工序。
“分化培养阶段的工序”是指：通过依据规定的条件的培养，以使Tie2阳性干/祖细胞分化为规定的细胞为主要的目的，(与其它作用效果相比更强地)发挥为此目的的作用效果的工序。即，如果与培养前细胞群体相比培养后细胞群体的目标细胞的细胞数和/或比率高，则可以将该培养工序称为“分化培养阶段的工序”。
需要说明的是，如前所述，专利文献1中记载的、为了将球状集落(球状体、椎间盘球、悬浮性球结构物)分散而在添加了胶原酶的培养基中进行暂时处理的工序并不相当于上述所规定的本发明的第4培养方法或作为分化培养阶段的工序的第4培养工序。另外，为了分离所采集的组织中包含的细胞群体而用胶原酶等进行处理的方法(工序)、为了将在通常的二维培养中增殖的细胞传代培养而用胰蛋白酶进行处理使细胞从培养表面脱离的方法(工序)也不相当于上述所规定的本发明的第4培养方法或作为分化培养阶段的工序的第4培养工序。
本发明中，能够协同高效地增强提高由细胞群体中包含的Tie2阳性干/祖细胞(例如，髓核干/祖细胞)分化而成的具有规定的功能性的细胞(例如，Col2阳性髓核细胞)的细胞数和/或比率、另一方面Tie2阳性干/祖细胞的细胞数和/或比率也保持一定水平等的作用效果，因此特别优选实施第3/第4培养方法(即实施第3/第4培养工序)作为分化培养阶段的工序。
扩增培养阶段根据需要可以进一步包括符合扩增Tie2阳性干/祖细胞这样的该工序的目的的、除第1培养工序和/或第2培养工序以外的工序。作为这样的工序，例如可列举出在仅添加了具有Tie2表达增强作用的生长因子作为Tie2表达增强剂的培养基中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的工序(本说明书中称为“追加扩增培养工序”。)。作为追加扩增培养工序中的具有Tie2表达增强作用的生长因子，例如可列举出FGF和/或EGF。追加扩增培养工序优选在第1培养工序和/或第2培养工序、特别是第1培养工序或第1/第2培养工序之后进行。另外，在追加扩增培养工序中，适合的是不实施第1培养方法、即包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体处于通过消化处理从细胞中分离的状态而并非处于存在于未经消化处理的组织中的状态。在第1培养工序或第1/第2培养工序中实施的本发明的第1培养方法中，在存在于未经消化处理的组织中的状态下培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体，但培养达到一定水平则会抑制Tie2阳性干/祖细胞的扩增(即使延长培养时间，Tie2阳性干/祖细胞也不再扩增)，可认为是由于存在于组织中的影响所致。因此，第1培养工序或第1/第2培养工序之后，对组织进行消化处理，回收分离的细胞群体，并进行追加扩增工序，由此能够进一步扩增Tie2阳性干/祖细胞。
＜细胞群体＞
供于本发明的各培养方法或各培养工序的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体(本说明书中统称为“培养前细胞群体”。)中，Tie2阳性干/祖细胞与除此以外的细胞(由Tie2阳性干/祖细胞分化而成的细胞等)各自的比率和/或数量基本上是任意的，另外，Tie2阳性干细胞与Tie2阳性祖细胞的比率也基本上是任意的。培养前细胞群体的组成可以根据发明的实施方式并考虑各培养方法或各培养工序中的作用效果等来进行适宜调节。
对于培养前细胞群体，除供于第1培养方法或第1培养工序的情况以外，可以依据常规方法制备或准备。例如，使用由体内采集的椎间盘髓核组织中包含的细胞群体作为培养前细胞群体的情况下，首先使用剪刀等器具将髓核组织切成适合的尺寸(例：切成数平方毫米左右的碎末后)，接着用胶原酶等蛋白水解酶进行处理使细胞分散，根据需要进行过滤、离心分离、清洗等处理，由此能够分离、回收髓核组织中包含的细胞群体。可以将如此得到的细胞群体用作除第1培养方法或第1培养工序以外的培养前细胞群体。
另一方面，本发明的第1培养方法或第1培养工序中，停留在上述那样的步骤中的将髓核组织切碎的阶段(不进行蛋白水解酶处理)，将包含于该切碎的髓核组织中的状态的细胞群体用作培养前细胞群体。
如上所述制备的由组织分离出的细胞群体、或包含于组织中的状态的细胞群体(包含细胞群体的状态的组织)可以依据常规方法进行冷冻保存直至供于接下来的培养方法或培养工序之前。对于经冷冻保存的细胞群体或组织，在开始进行接下来的培养方法或培养工序时，可以利用常规方法进行解冻。在冷冻保存和解冻时，可以组合对细胞群体或组织而言优选的处理。例如，冷冻保存时可以添加冷冻保护剂(DMSO等)，在此情况下，解冻时在适合的条件下去除冷冻保护剂即可。
通过本发明的各培养方法或各培养工序得到的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体(本说明书中统称为“培养后细胞群体”。)中，Tie2阳性干/祖细胞与除此以外的细胞(由Tie2阳性干/祖细胞分化而成的细胞等)各自的比率和/或数量基本上是任意的，另外，Tie2阳性干细胞与Tie2阳性祖细胞的比率也基本上是任意的。培养后细胞群体的组成可以根据发明的实施方式并考虑通过各培养方法或各培养工序而得到的细胞群体的用途等进行适宜调节。
对于培养后细胞群体，可以依据常规方法从培养基中回收，供于接下来的培养方法或培养工序、或供于细胞制剂的制备等其它的方法或工序。
本发明的各培养方法或各培养工序的过程中的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体(本说明书中统称为“培养中细胞群体”。)中，Tie2阳性干/祖细胞与除此以外的细胞(由Tie2阳性干/祖细胞分化而成的细胞等)的比例基本上是任意的，另外，Tie2阳性干细胞与Tie2阳性祖细胞的比例也基本上是任意的。培养中细胞群体的组成是由培养前细胞群体转变为培养后细胞群体的过程中的组成，例如，培养中细胞群体的Tie2阳性干/祖细胞的比率(本说明书中称为“Tie2阳性干/祖细胞率”。)通常是介于培养前细胞群体的Tie2阳性干/祖细胞率与培养后细胞群体的Tie2阳性干/祖细胞率之间的范围内包含的数值，容许数值暂时偏离该范围。培养中细胞群体的组成根据发明的实施方式、而且根据各培养方法或各培养工序中的天数、传代的次数等而改变。
对于上述的各细胞群体所源自的“人或其它动物”(供体)，可以考虑通过本发明的Tie2阳性干/祖细胞的培养方法而最终得到的细胞群体的用途、或通过该方法中包含的各培养方法或各培养工序而得到的细胞群体的用途等进行选择。本发明的典型的实施方式中，制备用于制造规定的疾病、症状等的预防用或治疗用的细胞制剂的细胞群体时，“人或其它动物”为与该细胞制剂的给药对象(受体)同种的生物，优选人。
·关于扩增培养阶段的细胞群体
本发明中，供于第1培养方法和/或第2培养方法的细胞群体、或供于扩增培养阶段的第1培养工序和/或第2培养工序的细胞群体(本说明书中统称为“扩增培养前细胞群体”。)典型地是由人或其它动物的体内采集的组织(椎间盘)中包含的细胞群体(原代培养细胞群体)或将该原代培养细胞群体传代而得到的细胞群体(传代培养细胞群体)。
作为扩增培养前细胞群体，使用由人采集的椎间盘中包含的细胞群体时，优选通常Tie2阳性干/祖细胞率高、有生态位处于良好倾向的由10多岁或20多岁的人采集的椎间盘中包含的细胞群体。另外，扩增培养前细胞群体优选Tie2阳性干/祖细胞率尽可能高、例如为30％以上、40％以上、50％以上、60％以上的细胞群体。
需要说明的是，根据实施方式，扩增培养前细胞群体可以是不为由人或其它动物的体内采集的组织中包含的细胞群体的细胞群体，例如，可以是将使用人或其它动物的细胞制得的iPS细胞或ES细胞那样的具有全能性或多能性的细胞分化诱导而得到的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
本发明中，通过第1培养方法和/或第2培养方法而得到的细胞群体、或通过扩增培养阶段的第1培养工序和/或第2培养工序而得到的细胞群体(本说明书中统称为“扩增培养后细胞群体”。)的用途没有特别限定，得到的细胞群体的组成等可以根据用途进行适宜调节。
本发明的典型的实施方式中，扩增培养后细胞群体可用作供于第3培养方法和/或第4培养方法的细胞群体、或用作供于分化培养阶段的第3培养工序和/或第4培养工序的细胞群体。这样的实施方式(用途)中的扩增培养后细胞群体优选Tie2阳性干/祖细胞的比率和/或细胞数尽可能高。扩增培养后细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的比率根据扩增培养前细胞群体、其所源自的髓核组织的个体差异等而改变，所以不能一概而论，例如为5％以上、优选7％以上、9％以上、11％以上、13％以上、15％以上。扩增培养后细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞数根据扩增培养前细胞群体、其所源自的髓核组织的个体差异等而改变，所以不能一概而论，与扩增培养前细胞群体中的细胞数相比，例如为5倍以上、优选10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上。
·关于分化培养阶段的细胞群体
本发明中，供于第3培养方法和/或第4培养方法的细胞群体、或供于分化培养阶段的第3培养工序和/或第4培养工序的细胞群体(本说明书中称为“分化培养前细胞群体”。)优选为预先富集了Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。分化培养阶段前细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞率根据扩增培养前或扩增培养后细胞群体、其所源自的髓核组织的个体差异等而改变，所以不能一概而论，例如为5％以上、优选7％以上、9％以上、11％以上、13％以上、15％以上。
本发明的典型的实施方式中，分化培养前细胞群体是根据分化培养阶段的实施方式(培养容器的种类、尺寸等)将通过本发明的扩增培养阶段而得到的细胞群体(扩增培养后细胞群体)、例如经扩增的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体以达到适当的细胞数的方式分开而成的细胞群体。通过本发明的扩增培养阶段而得到的细胞群体包含上述那样的比率和/或细胞数的Tie2阳性干/祖细胞，而且该Tie2阳性干/祖细胞的Tie2的表达得到增强(Tie2的表达得到维持)，因此从增强分化培养阶段的作用效果这样的观点出发，也优选作为分化培养前细胞群体。
需要说明的是，根据实施方式，分化培养前细胞群体可以是并非通过本发明的扩增培养阶段(第1培养工序和/或第2培养工序)而得到的细胞群体，例如，可以是从人或其它动物的体内采集的组织中包含的细胞群体、以及将使用人或其它动物的细胞制得的iPS细胞或ES细胞那样的具有全能性或多能性的细胞分化诱导(经过Tie2阳性干/祖细胞)而得到的包含目标细胞的细胞群体。
本发明中，通过第3培养方法和/或第4培养方法而得到的细胞群体、或通过分化培养阶段的第3培养工序和/或第4培养工序而得到的细胞群体(本说明书中统称为“分化培养后细胞群体”。)的用途没有特别限定，可以根据用途来适宜调整所得到的细胞群体的组成等。例如，对于用于制造移植用的细胞制剂的细胞群体，优选：尽可能大量地包含在通过移植而发挥治疗或预防效果方面具有有用的功能性的目标细胞(例如，产生II型胶原蛋白的髓核细胞：Col2阳性髓核细胞)、且也包含一些残留有这类目标细胞产生能力的Tie2阳性干/祖细胞(例如，髓核干/祖细胞)的细胞群体。
分化培养后细胞群体中的Col2阳性(髓核)细胞的比率根据分化培养前细胞群体、其所源自的髓核组织的个体差异等而改变，所以不能一概而论，例如为5％以上、优选10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上。
分化培养后细胞群体中的Tie2阳性(髓核)干/祖细胞的比率根据分化培养前细胞群体、其所源自的髓核组织的个体差异等而改变，所以不能一概而论，例如为1％以上、优选2％以上、4％以上、6％以上、8％以上、10％以上。
需要说明的是，在分化培养工序中细胞群体中包含的细胞数通常也会增加。分化培养后细胞群体中的细胞数(Col2阳性细胞、Tie2阳性干/祖细胞等各细胞)根据分化培养前细胞群体、其所源自的髓核组织的个体差异等而改变，所以不能一概而论，与分化培养前细胞群体中的细胞数相比，例如为2倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、50倍以上、100倍以上。
＜培养基＞
本发明的各培养方法或各培养工序中使用的培养基只要适于Tie2阳性干/祖细胞和由其分化的细胞的培养即可，也可以在考虑到培养方法或培养工序的目的等的同时选择适合的基础培养基和添加成分。对于添加成分，若培养方法为扩增Tie2阳性干/祖细胞时进行的方法、即培养工序为扩增培养阶段的工序，则可选择适于Tie2阳性干/祖细胞的扩增培养的添加成分，若培养方法为对Tie2阳性干/祖细胞进行分化诱导时进行的方法、即培养工序为分化培养阶段的工序，则可选择适于由Tie2阳性干/祖细胞分化诱导为目标细胞的添加成分。
需要说明的是，本发明的第3培养方法和第4培养方法中、以及包括实施这些方法的工序的第3培养工序和第4培养工序中，无需在培养基中添加避免Tie2阳性干/祖细胞和由这些分化的细胞粘附于培养容器的培养表面的成分、例如甲基纤维素。即，本发明的第3培养方法和第4培养方法、以及包括实施这些方法的工序的第3培养工序和第4培养工序的培养基通常不含甲基纤维素等用于防止细胞粘附于培养容器的培养表面的成分。
本发明的代表性的实施方式中，在培养髓核干/祖细胞和由这些分化的髓核细胞时，扩增培养阶段和分化培养阶段的各工序用的培养基分别可以通过分别适量使用如下那样的基础培养基、添加成分、生长因子、其它成分而制备。
作为基础培养基，例如可列举出DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基、添加或不添加葡萄糖)、αMEM(伊格尔基础培养基α改良型)、Ham’sF-10培养基、Ham’sF-12培养基、或它们的混合物。
作为扩增培养用或分化培养用的添加成分，例如可列举出FBS(胎牛血清)、BSA(牛血清白蛋白)、L-抗坏血酸(作为L-抗坏血酸磷酸镁盐等)、亚硒酸(作为胰岛素-运铁蛋白-亚硒酸钠(ITS：Insulin-Transferrin-Selenium)等)和2-巯基乙醇。根据需要进而还可以在培养基中添加青霉素、链霉菌等抗生素、其它成分。需要说明的是，作为扩增培养用培养基的添加成分，也可以不含L-抗坏血酸。
作为生长因子，例如可列举出FGF(fibroblast growth factor：成纤维生长因子)、EGF(Epidermal Growth Factor：上皮生长因子)、Ang-1(血管生成素-1)。本发明的一实施方式中，添加于培养基的生长因子优选至少使用FGF，更优选使用FGF和EGF这两者，优选根据需要在这些中追加使用Ang-1。
作为FGF，例如可以使用bFGF(basic fibroblast growth factor：碱性成纤维生长因子。有时也称为FGF-2。)。培养基中的FGF的浓度通常可以是1～50ng/mL的范围、优选5～15ng/mL的范围、例如约10ng/mL。
Ang-1优选添加至无血清培养基中。另外，作为Ang-1，优选能溶于水者(可溶性Ang-1、重组Ang-1)。培养基中的Ang-1(优选可溶性Ang-1)的浓度通常可以为100～1000ng/mL的范围、例如约500ng/mL。
需要说明的是，上述的FGF、EGF、Ang-1等生长因子为“具有Tie2表达增强作用的生长因子”，广义上也可以理解为相当于“Tie2表达增强剂”，但本说明书中另行记载了本发明中的这些生长因子的处理方式。
＜Tie2表达增强剂＞
本发明的第2培养方法中，在培养基中添加具有Tie2表达增强作用的除生长因子以外的至少1种“Tie2表达增强剂”。特别是，在扩增培养阶段的工序中实施第2培养方法时，Tie2表达增强剂的添加具有在保持Tie2阳性干/祖细胞的幼稚性的同时增加细胞数的作用效果，进而在将扩增培养阶段得到的细胞群体供于分化培养工序时，具有提高分化培养工序后得到的细胞群体的细胞增加率、Tie2阳性干/祖细胞和功能性目标细胞的比率等作用效果等。Tie2表达增强剂可以使用任意1种，也可以组合使用2种以上，以可观察到上述那样的Tie2活性作用的量添加在培养基中即可。
作为“具有Tie2表达增强作用的生长因子”，例如可列举出血管生成素-1(Ang-1)、FGF2(bFGF)等。本发明的第2培养方法中，使用除这样的“具有Tie2表达增强作用的生长因子”以外的至少1种“Tie2表达增强剂”，但根据需要也可以组合使用具有Tie2表达增强作用的生长因子。特别是，在扩增培养阶段的工序中实施第2培养方法时，通过组合使用具有Tie2表达增强作用的生长因子及除此以外的Tie2表达增强剂、例如以下说明那样的源自动植物的提取物、更优选为植物来源提取物，从而能够发挥协同效果。需要说明的是，作为扩增培养阶段的工序，除必须工序、即至少使用除生长因子以外的Tie2表达增强剂(作为任意成分，可以在其中组合使用具有Tie2表达增强作用的生长因子。)的工序以外，还可以另行进行实质上仅使用具有Tie2表达增强作用的生长因子(实质上不使用除生长因子以外的Tie2表达增强剂)作为Tie2表达增强剂的工序。
作为除生长因子以外的Tie2表达增强剂，可以使用现有技术中作为“Tie2活化剂”已知的各种源自动植物的提取物。作为这样的源自动植物的提取物，例如可列举出牛奶子、翅果菊、酸豆(Tamarindus indica)、姜黄、黄杞、黄精、车前草、无翅猪毛菜、橄榄果实、牡蛎、洋甘菊、木瓜、栝楼仁、巴戟天、菊、玉竹、皂树、银杏、海州常山、枸杞、麻栎、艳山姜、红参、枹栎、山楂、小赤车、番石榴、刺五加、金星果、杨桃、皂角刺、枣、樟、薤白、莲、大野芋、刺楸、荜茇、假叶树、芒果姜、省沽油、五指那藤、重瓣萱草、杨梅、山柳、线状阿司巴拉妥等的提取物(参照上述专利文献3～10)。另外，也可以使用这样的提取物中包含的成分、例如熊果酸、科罗索酸、3-O-没食子酰基原花青素B-1、亚麻酸、13-羟基-9Z,11E,15E-十八碳三烯酸、原花青素B-2、表儿茶素-(4β-6)-表儿茶素(4β-8)-表儿茶素、原花青素C-1、黄芪皂苷VIII、大豆皂甙I、3’-O-甲基没食子儿茶素、荜茇壬二烯哌啶、丁香树脂醇、2-甲氧基肉桂醛、刺五加苷E、刺五加苷E1、芝麻素、eudistomins、连翘脂素、松脂醇、鹅掌楸树脂酚B二甲醚、连翘醇(forsythinol)、香豆素等化合物(参照上述专利文献6、12～14)作为除生长因子以外的Tie2表达增强剂。对于各提取物、成分，观察到Tie2表达增强作用的用量、适于制备的动植物的部位(材料)和提取方法、特定的成分的纯化方法等也可以由本领域技术人员适宜地基于现有已知的方法而设定。
从工业上的观点出发，有利的是使用比Ang-1、FGF2等生长因子更廉价、优选比这些生长因子的Tie2表达增强作用更优异、进一步优选与这些生长因子组合使用时发挥协同效果的、选自上述的源自动植物的提取物中的1种或2种以上、更优选选自上述的植物来源提取物中的1种或2种以上作为本发明的第2培养工序中的Tie2表达增强剂。
·樟属植物来源提取物
本发明的优选的一实施方式中，作为Tie2表达增强剂，可以使用樟属植物来源提取物。樟属(Cinnamomum)包括中国肉桂树(Cinnamomumcassia Blume)、香樟(C.camphora)、圆叶肉桂(C.daphnoides)、Cinnamomum doederleinii、天竺桂(C.japonicum)、Cinnamomumpseudo-pedunculatum、Cinnamomum sieboldii、锡兰肉桂(C.verum)、锡兰肉桂(C.zeylanicum)等300种以上的种类。例如，可以将以肉桂的嫩枝即桂枝或肉桂的树皮即桂皮、或将它们加工成粉末状的肉桂粉的形式制造销售的制品的提取物用作本发明中的樟属植物来源提取物。
樟属植物来源提取物可以利用常规方法得到，例如将成为原料的植物体(例：肉桂粉)与提取溶剂一起以常温或加热方式进行浸渍或加热回流后，回收上清液，或过滤滤液，根据需要进行浓缩，由此可以制备。作为提取溶剂，可以分别单独使用或组合使用通常用于提取的溶剂：例如水性溶剂，例如水、生理盐水、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液；或者例如有机溶剂，例如乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等醇类；水醇混合溶剂类；氯仿；二氯乙烷；四氯化碳；丙酮；乙酸乙酯；己烷等有机溶剂等通常提取中使用的溶剂。优选使用水作为溶剂。用上述溶剂提取而得到的提取物可以直接以提取液的形态使用，但从便利性的方面考虑，通过干燥或冷冻干燥等进行固化(粉末化)并保存，在使用时根据需要通过适合的溶剂进行稀释或再溶解(再分散)，进而根据需要进行过滤等处理，从而可以使用。樟属植物来源提取物可以是根据需要通过使用了离子交换树脂(例如，Amber Light XAD-2那样的多孔聚合物)的吸附法等去除了杂质者(纯化物)。
对于培养基中的樟属植物来源提取物的浓度，可以根据所使用的该提取物的性状，以及考虑作为Tie2表达增强剂的作用效果的程度等进行适宜调节。例如，使用将1mg肉桂粉用1mL水(蒸馏水)提取而得到的提取液作为樟属植物来源提取物时，可以相对于培养基以1～50v/v％左右、例如约20v/v％的量添加该提取液。在变更提取和添加的实施方式的情况下，可以使作为Tie2表达增强剂的有效成分与上述的提取和添加的实施方式时为同等程度。
＜细胞外基质降解剂(ECM分解剂)＞
本发明的第4培养方法中，为了边抑制球状集落形成边使Tie2阳性干/祖细胞分化，而在培养基中添加“细胞外基质降解剂(ECM分解剂)”。
通常，作为由干/祖细胞或由其分化的细胞分泌的细胞外基质(ECM)，例如可列举出胶原蛋白、蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、肌腱蛋白、巢蛋白、弹性蛋白、原纤蛋白、透明质酸等。胶原蛋白包括I型、II型、III型、IV型、IX型(a2)、其它型的胶原蛋白。蛋白聚糖包括聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖(versican)、permacan(以上是基于核心蛋白的尺寸、糖链的条数的分类)、硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖(以上是基于与核心蛋白结合的糖胺聚糖的分类)等。
因此，作为本发明中的ECM分解剂，使用与第4培养方法的实施方式、即由所培养的Tie2干/祖细胞或由其分化的细胞分泌的ECM对应且具有分解以上示例的ECM的活性、能够抑制球状集落的形成的物质(剂)即可。ECM分解剂可以使用任意1种，也可以组合使用2种以上。
作为典型的ECM分解剂，可列举出具有分解构成ECM的蛋白质部分的活性的蛋白酶、例如作为对胶原蛋白具有降解活性的蛋白酶的胶原酶。胶原酶有：对高分子量的胶原蛋白显示出高活性的I型胶原酶、及对低分子量的胶原蛋白片段显示出高活性的II型胶原酶。另外，脊椎动物来源的胶原酶在天然三螺旋区域(非常有限的α链上)切断胶原蛋白，而细菌来源的胶原酶作用于几乎所有的型(Type)的胶原蛋白，可以在三螺旋区域内的多个位置切断胶原蛋白。由细菌的培养上清浓缩而得到的胶原酶制剂中除了胶原酶(胶原酶I、胶原酶II)之外，包含除胶原酶以外的蛋白酶(中性蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等)、非蛋白水解酶，通过纯化等也可以制造排除了特定的成分的制剂。本发明中，可以从公知的各种胶原酶(制剂)、蛋白酶等中选择适合的酶用作ECM分解剂。
本发明的第4培养方法的代表性的实施方式中，Tie2阳性干/祖细胞是髓核干/祖细胞，通过Tie2阳性干/祖细胞的分化诱导而生成的细胞(目标细胞)为髓核细胞。髓核细胞表达II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白、蛋白聚糖等作为ECM。因此，作为该实施方式中的ECM分解剂，选择对这些ECM具有降解活性的胶原酶、例如对II型胶原蛋白等具有降解活性的胶原酶(或含有其的制剂)即可。作为这样的胶原酶(制剂)，例如可列举出“胶原酶P”(Roche公司、源自溶组织梭菌)、“Liberase”(Roche公司、胶原酶I和II以及中性蛋白酶的混合物)等。
需要说明的是，作为ECM分解剂，代表性的是对ECM中包含的蛋白质具有特异性降解活性、细胞毒性低的蛋白酶之类的酶(蛋白质)，但能够发挥本发明的作用效果的、对ECM具有一定水平以上的降解活性和一定水平以下的细胞毒性的除酶(蛋白质)以外的物质、例如低分子化合物也有可能用作ECM分解剂。
培养基中的ECM分解剂的浓度只要是能够抑制由包含Tie2干/祖细胞的细胞群体形成球状集落的浓度即可，根据所使用的ECM分解剂的种类，以及考虑到在分化培养阶段的工序实施第4培养方法(作为第4培养工序进行)的情况，可以边考虑对目标细胞的增加率、规定的基因(标志物基因)的表达量或阳性率所产生的作用等边进行适宜调节。例如，ECM分解剂的浓度过高时，有时无法充分确认由上述作用带来的有益效果(相反成为不利的效果)，因此优选根据ECM分解剂的种类在规定的范围内调节其浓度。
本发明中，融合了第3培养方法和第4培养方法的方法(第3/第4培养方法)或融合了第3培养工序和第4培养工序的工序(第3/第4培养工序)中，针对目标细胞的增加率、规定的基因(标志物基因)的表达量或阳性率等的作用效果有时会根据培养基中的ECM分解剂的种类和浓度、及培养表面的涂层剂的种类的组合而发生改变。作为本领域技术人员，可根据期待基于何种观点的作用效果并且在考虑分化诱导前细胞群体的性状、其它实施方式的情况下，通过预备性试验等来设定适合实施本发明的上述各条件。
如上所述，培养基中的ECM分解剂的浓度不能一概而论，还取决于与培养表面的涂层剂的种类的组合，例如可以在0.0025～5.0重量％、0.005～2.0重量％、0.01～1.0重量％等的范围内调节。本发明的一实施方式中，使用“胶原酶P”作为ECM分解剂时，在该培养基中的浓度可以在0.005～0.05重量％、0.0125～0.025重量％等范围内调节，例如可以设为约0.0125重量％。本发明的一实施方式中，使用“Liberase”作为ECM分解剂时，在该培养基中的浓度可以在0.25重量％～2.0重量％、0.5～1.0重量％等范围内调节，可以例如设为约1.0重量％。
＜培养时间、其它条件＞
本发明的各培养方法和各培养工序的时间和其它条件(例如，pH、CO2浓度、O2浓度等)基本上可以根据该培养工序(包括该培养工序的培养阶段)的目的进行适宜调节，以得到具有期望的细胞组成(种类和数量/比率)的细胞群体。pH可以设为弱碱性(例如，约7.15)。CO2浓度可以设为例如约5％。O2浓度可以设为5％以下(例如，约2％)。各培养方法和各培养工序(阶段)的时间内可以根据需要每隔规定的天数将培养基适宜更换为新鲜的培养基，或在经过规定的天数后追加成分或者增加或减少成分的浓度、pH等来改变培养基，或改变气氛。
本发明的扩增培养阶段的第1培养工序、第2培养工序、或融合了它们的第1/第2培养工序的时间分别通常为1～3周左右、例如约2周。另外，本发明的扩增培养阶段可以任意包括的其它工序的时间也为相同程度，例如使用添加FGF的培养基的培养工序的时间约为1周。在可以得到期望的扩增培养后细胞群体的时间点，结束扩增培养阶段即可。需要说明的是，以无法实现扩增培养的目的的短期间或短时间(例如，24小时以下)进行的培养(处理)并不相当于在本发明的扩增培养阶段进行的各工序。
本发明的分化培养阶段的第3培养工序、第4培养工序、或融合了它们的第3/第4培养工序的时间通常分别为1～3周左右、例如约1～2周。另外，本发明的增殖培养阶段可以任意包括的其它工序的时间也为相同程度，例如使用添加FGF的培养基的培养工序的时间约为1周。另外，本发明的分化培养阶段可以任意包括的其它工序的时间也为同程度。在可以得到期望的分化培养后细胞群体的时间点，结束分化培养阶段即可。需要说明的是，以无法实现分化培养的目的的短期间或短时间(例如，24小时以下)进行的培养(处理)并不相当于在本发明的分化培养阶段进行的各工序。
＜培养容器＞
本发明的各培养方法和各培养工序中使用的培养容器、培养装置等基本上可以根据其培养方法和培养工序(包括该培养工序的培养阶段)的目的进行适宜选择，以得到具有期望的细胞组成(种类和数量·比率)的细胞群体。
培养容器可以使用烧瓶、培养皿、孔板、袋等具有通常的形状的容器，可以形成有能够收纳细胞的孔。培养容器可以使用由玻璃、塑料、树脂等通常的材质制作而成者。培养容器的表面(培养表面)可以未经处理，也可以进行了与细胞的粘附性相关的处理或其它处理。培养容器的尺寸(面积、容积)、以及培养容器具备孔时其孔的尺寸(口径、深度)和数量等也可以适宜选择。可以根据需要边使培养容器振荡或旋转而搅拌培养基边培养细胞群体。
本发明的第3培养方法(工序)和第4培养方法(工序)中，培养容器和培养装置可以是基于二维培养(平面培养)的实施方式。另外，本发明的第1培养方法(工序)在细胞群体存在于组织中的状态下进行培养的方面也可以说是三维的培养，包含细胞群体的状态的组织(薄片)处于悬浮于培养液中的状态下。本发明的第2培养方法(工序)在单独实施时也可以是基于三维培养的实施方式，但与第1培养方法(工序)融合并作为第1/第2培养方法(工序)实施时，与上述的第1培养方法(工序)同样地可处于悬浮于培养液中的状态下。这些方法(工序)中，可以使用如第3培养方法(工序)那样进行了提高细胞的粘附性的表面处理的培养容器，但即使使用未经表面处理的通常的培养容器也没有问题。
＜细胞粘附处理＞
本发明的第3培养方法(工序)中，使用进行了提高细胞的粘附性的表面处理(本说明书中有时称为“细胞粘附处理”。)的培养容器。作为细胞粘附处理的典型例，可列举出将含有细胞外基质(ECM)或其它生物相关物质的涂层剂涂布于培养表面的处理。另外，作为细胞粘附处理的例子，也可列举出对由细胞粘附性低的原材料、例如疏水性强的聚苯乙烯成型而成的培养容器通过等离子体处理改性为亲水性的处理。
作为细胞粘附处理用的涂层剂所含有的ECM，可列举出公知的各种ECM，例如胶原蛋白(I型、II型、IV型等)或作为其热处理物的明胶、硫酸软骨素A、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白、血小板应答蛋白、玻连蛋白、蛋白聚糖(聚集蛋白聚糖、硫酸肝素蛋白聚糖等)。另外，作为除ECM以外的生物体相关分子，可列举出聚赖氨酸(聚-L-赖氨酸或聚-D-赖氨酸)等聚氨基酸。作为其它细胞粘附处理用的涂层剂，可列举出聚二醇酸、PLGA(聚乳酸·二醇酸共聚物)、聚羟基烷酸(PHA)、聚-ε-己内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈、聚二甲基硅氧烷、聚氨酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸2-羟基乙酯、聚酰胺、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯基吡咯烷酮、聚鸟氨酸等。细胞粘附处理用的涂层剂可以含有上述的物质中的任意1种，也可以含有2种以上。
此处，第3/第4培养方法(工序)中，如前所述，有时本发明的作用效果(细胞群体的细胞增加率、目标细胞的比率等)会根据细胞粘附处理用的涂层剂的种类与培养基中添加的ECM分解剂的种类和浓度的组合而发生改变。作为其原因之一，可认为细胞粘附处理用的涂层剂所含有的ECM或其它生物相关物质可能会受到培养基中添加的ECM分解剂所产生的降解活性的影响。然而，只要是可一定程度发挥本发明的作用效果(未完全抑制)的范围，将可能有这种影响的细胞粘附处理用的涂层剂与ECM分解剂组合使用的实施方式也是容许的。例如，以规定的浓度在培养基中添加具有II型胶原蛋白降解活性的胶原酶(制剂)作为ECM分解剂时，作为细胞粘附处理用的涂层剂，优选含有不易受到该ECM分解剂的种类和浓度所产生的影响的涂层剂、或能以一定水平实现分化诱导为目标细胞(例如，Col2阳性细胞)的涂层剂，例如，优选含有不是胶原蛋白的聚赖氨酸(聚-L-赖氨酸或聚-D-赖氨酸)或纤连蛋白、或IV型胶原蛋白的涂层剂。
本发明的第3培养方法也可以在扩增培养阶段实施。例如，在与扩增培养阶段的关系中所述的、在仅添加了具有Tie2表达增强作用的生长因子作为Tie2表达增强剂的培养基中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的工序(追加扩增培养工序)中，可以实施第3培养方法。作为这样的实施方式中的细胞粘附处理用的涂层剂所含有的ECM，例如优选明胶。
-细胞治疗用组合物-
本发明的细胞治疗用组合物可以含有通过上述那样的本发明的培养方法或制备方法而得到的细胞群体，且根据需要含有其它药学上可接受的成分。
本发明的代表性的实施方式中，细胞治疗用组合物是包含由髓核干/祖细胞分化的Col2阳性髓核细胞(优选也包含Tie2阳性干/祖细胞)的细胞治疗用组合物。作为该实施方式中的细胞治疗用组合物的适用对象、即通过给予该组合物而能够预防或治疗的疾病，可列举出症状表现为椎间盘(髓核)的损伤或退变、突出等的疾病，例如腰部或颈椎的椎间盘症、椎间盘突出、脊髓型颈椎病、神经根病、脊椎脱离/滑脱症、腰部椎管狭窄症、腰椎退行性滑脱、腰椎退行性侧弯症。
本发明的细胞治疗用组合物的剂型只要能将细胞群体移植或传递至成为靶标的部位(例如，椎间盘的髓核)即可，可以是例如注射剂、优选向椎间盘(髓核)或其附近局部给药用的注射剂、或能靶向的血管给药用注射剂。
作为药学上可接受的成分，例如作为注射剂制备时可列举出注射用水或生理盐水、细胞群体用的培养液、其它适合的溶剂/分散介质、其它添加剂等。
本发明的细胞治疗用组合物以对于发挥期望的治疗或预防效果有效的量给药即可。可以考量细胞治疗用组合物的成分、剂型、给药对象、给药途径、其它实施方式等且根据每次的给药量、给药次数和给药间隔(一定时期内的给药次数)等对这样的有效量进行适宜调整。使用了本发明的细胞治疗用组合物的治疗可以对人和除人以外的脊椎动物实施。
-保存方法-
对于本发明的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的保存方法，通过在存在于未经消化处理的组织中的状态下冷冻保存包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体，从而维持Tie2被活化和/或被表达的状态、或抑制细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的减少。
关于本发明的保存方法的技术事项可以适用和在与第1培养方法的关系中所述者同样的技术事项。针对包含Tie2阳性干/祖细胞的状态的未经消化处理的组织的冷冻保存的步骤、根据需要所使用的冷冻保护剂等可以适用与针对通过消化处理从组织中分离出的以往的包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体时基本同样者。
实施例
作为本实施例的“扩增培养阶段”的各工序中的培养基(以下的实施例中称为“扩增培养阶段用培养基”。)，制备在DMEM(no Glucose、wako)60mL和MEMα(Nacalai Tesque)40mL的混合培养基中在即将使用前添加FBS20％、进而添加(+)或未添加(-)实施例中的各表所示的追加成分者并使用。
作为本实施例的“分化培养阶段”的各工序中的培养基(以下的实施例中称为“分化培养阶段用培养基”。)，制备在DMEM(no Glucose、wako)60mL和F10(gibco)40mL的混合培养基中添加2-巯基乙醇1μL、亚硒酸(0.01％)6μL、抗坏血酸(5mg/mL)1.5mL和30％BSA 5mL且在即将使用前添加FBS 30％、进而添加(+)或未添加(-)实施例中的各表所示的追加成分者并使用。
[试验例1]扩增培养阶段：第1培养工序(WTC法)
[表1]
使用剪刀等将从椎间盘突出患者(32岁女性、28岁女性和20岁男性)的患部切除的椎间盘的髓核组织切成数平方毫米的大小。将包含细胞群体的状态的切碎的髓核组织0.1～0.5g悬浮于按照扩增培养阶段用培养基中的追加成分如表1所示的方式制备的培养基3mL中，然后注入6孔培养皿(培养表面未进行处理)的1个孔中，培养7天(WTC法)。作为对照，将切碎的髓核组织依据常规方法用胶原酶进行消化处理而并非直接培养，回收分离出的细胞群体，除此以外与WTC法同样地培养细胞群体(二维培养法)。
培养后，回收细胞群体，利用流式细胞术(FCM)法测定细胞表面的Tie2的表达为阳性的细胞的细胞数和荧光强度，计算出相对于细胞群体整体的细胞数的比率(Tie2阳性率)和平均荧光强度(MFI)。FCM法中，使用作为抗人Tie2抗体与荧光色素别藻蓝蛋白的复合物的荧光标记剂(R&D公司、Anti-Tie-2,Human,Mouse-Mono(87315),Allophicocyanin、目录编号FAB3131A)。
将结果示于图2和图3。例如，对试验例1-1和1-3进行比较，任意结果中试验例1-1均显著高(图2：p＜0.05、图3：p＜0.01、均为t检验)，证实了基于WTC法的Tie2表达增强效果。
[试验例2]扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序
[表2]
将市售的肉桂粉末1mg悬浮于蒸馏水1mL中，在37℃下进行一夜提取，得到的提取液(肉桂提取液)用于本试验。
采集了椎间盘的髓核组织的椎间盘突出患者为16岁女性、28岁女性和38岁女性，作为扩增培养阶段的第1阶段，使用按照扩增培养阶段用培养基中的追加成分如表2所示的方式制备的培养基，而且将培养时间设为14天，除此以外进行与[试验例1](试验例1-1和1-2)同样的培养工序。
第1阶段的培养工序后，在培养基中添加Roche公司制“胶原酶-P”(最终浓度0.025％)，使髓核组织分散。回收从髓核组织中分离出的细胞群体，以1.0×104/3mL的密度悬浮于添加20％FBS的MEMα中，然后注入6孔培养皿(培养表面未经处理)的1个孔中，添加10ng/mL bFGF后，进而培养7天(总计21天)。
培养后，回收细胞群体，利用与[试验例1]同样的FCM法，分别测定了细胞表面的Tie2的表达为阳性的细胞的比率和源自1g组织的细胞数。将结果示于图4和图5。
[试验例3]扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3培养工序
[表3]
采集了椎间盘的髓核组织的椎间盘突出患者为16岁女性、30岁男性和30岁女性，除此以外按照与上述试验例2同样的步骤进行总计21天的两阶段的扩增培养阶段的工序。回收培养后的细胞群体，作为分化培养阶段的工序，在涂覆有聚-L-赖氨酸(PLL)的培养皿上(试验3-1)或未涂覆的培养皿上(试验例3-2)进行14天单层培养。
培养后，回收细胞群体，利用流式细胞术(FCM)法测定细胞内的II型胶原蛋白(Col2)的表达为阳性的细胞的细胞数，计算出相对于细胞群体整体的细胞数的比率(Col2阳性率)。细胞群体预先用膜通透处理试剂“IntraPrep”(Beckman Coulter,Inc.)进行处理，使得能够对细胞内的Col2进行荧光标记。作为针对Col2的荧光标记法，使用小鼠抗人Col2抗体(PHARMA CHEMICAL CO.,LTD.(原DAIICHI FINE CHEMICAL CO.,LTD.、抗hCL(II)(纯化的IgG)、目录编号F-57)作为一抗，使用山羊抗小鼠IgG抗体和荧光色素FITC的复合物(BD公司、山羊抗小鼠Ig FITC、目录编号349031)作为二抗。将结果示于图6。另外，计算出假设1g的髓核组织来源细胞全部依据试验例2进行扩增培养、然后依据试验例3进行分化培养时的Col2阳性细胞数。将结果示于图7。与适用第3培养工序的情况(试验3-1)、未适用的情况(试验3-2)相比，Col2阳性细胞数增加约3倍。
需要说明的是，还利用FCM法测定了细胞内的蛋白聚糖(PG)的表达为阳性的细胞的细胞数，计算出相对于细胞群体整体的细胞数的比率(PG阳性率)。作为对PG的荧光标记法，使用小鼠抗人PG抗体(EMD millipore、抗软骨蛋白聚糖抗体、成人、克隆EFG-4、目录编号MAB2015)作为一抗，使用山羊抗小鼠IgG抗体与荧光色素FITC的复合物(BD公司、山羊抗小鼠Ig FITC、目录编号349031)作为二抗。结果不论是否应用第3培养工序(PLL涂覆)，PG阳性率均接近100％，未观察到显著差异(未图示)。对于与蛋白聚糖不同表达了II型胶原蛋白的功能性髓核细胞，利用现有方法难以增加最终的细胞群体中的细胞数，但通过将本发明的第1/第2培养工序和第3培养工序组合而能够实现这一点，显示出作为培养方法的优越性。
[试验例4]扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3/第4培养工序
[表4]
按照与上述试验例2同样的步骤，进行总计21天的两阶段的扩增培养阶段的工序。回收培养后的细胞群体，作为分化培养阶段的工序，在涂覆有聚-L-赖氨酸(PLL)的试管内使用在分化培养阶段用培养基中应用了表4所示的追加成分的培养基培养14天。
培养后，回收细胞群体，与[试验例3]同样地计算出PG阳性率。将结果示于图8。在培养基中添加了2种胶原酶中任一者的情况下，与未添加胶原酶的情况相比PG阳性率显著增加。
对于试验例4-1～4-3，进而分别制备各6个样品(采集椎间盘的髓核组织的椎间盘突出患者为32岁女性、28岁女性、20岁男性、16岁女性、28岁女性和38岁女性)，与[试验例3]同样地计算出Col2阳性率。将结果示于图9。虽然存在由样品所产生的差异(采集椎间盘髓核组织的个体差异)，但在6个样品的4个样品中，在培养基中添加2种胶原酶中任一者或两者的情况下，与未添加胶原酶的情况相比观察到Col2阳性率的提高。
[试验例5]扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3/第4培养工序其2
[表5]
对于分化培养阶段，如表5所示那样变更培养容器的涂层剂和培养基中的追加成分(胶原酶P)，除此以外按照与上述试验例4同样的步骤进行扩增培养阶段和分化培养阶段的工序，测定了PG阳性率和Col2阳性率。将结果示于图10。例如，在培养基中添加“胶原酶P”的情况下，观察到：虽然也取决于浓度，但使用包含Col4(IV型胶原蛋白)、FN(纤连蛋白)或PLL(聚-L-赖氨酸)的涂层剂作为涂层剂、特别是包含PLL的涂层剂作为涂层剂对于改善Col2阳性率而言是优选的。
[试验例6]扩增培养阶段(两阶段)：第1/第2培养工序+追加工序→分化培养阶段：第3/第4培养工序其3
[表6]
对于分化培养阶段，如表6所示那样变更培养容器的涂层剂和培养基中的追加成分(Liberase)，除此以外按照与上述试验例4同样的步骤进行扩增培养阶段和分化培养阶段的工序，测定了PG阳性率和Col2阳性率。将结果示于图11。例如，在培养基中添加“Liberase”的情况下，观察到：虽然也取决于浓度，但是使用包含Col4(IV型胶原蛋白)或PLL(聚-L-赖氨酸)的涂层剂作为涂层剂对于改善Col2阳性率而言是优选的。
[试验例7]分化培养阶段：第3培养工序
[表7]
本试验中，与试验例1的对照同样地(即未应用本发明的第1培养方法：WTC法)使用通过使用了胶原酶的消化处理从椎间盘突出患者的髓核组织中分离出的细胞群体。对于该细胞群体，在添加了10ng/mL的bFGF(未应用本发明的第2培养方法，未添加试验例2那样的肉桂提取液)的扩增培养阶段用培养基中培养8～9天(第1阶段)和6～8天(第2阶段)。
接着，对于如上所述进行了扩增培养的(作为扩增培养阶段，未应用本发明的第1和/或第2培养方法)包含髓核来源的Ti2阳性干/祖细胞的细胞群体，实施了作为分化培养阶段的基于本发明的第3培养方法的工序。在该工序中，与实施例3等同样地在涂覆有聚-L-赖氨酸的培养皿上进行6～7天单层培养。
培养后，回收细胞群体，与试验例1和2同样测定Tie2阳性率和总Tie2阳性细胞数，另外与试验例3等同样地测定了Col2阳性率。将结果示于图13(Tie2阳性率)、图14(总Tie2阳性细胞数)和图15(Col2阳性率)。可知：本发明的第3培养方法即使是不与本发明的第1和/或第2培养方法组合的实施方式，也可发挥提高Tie2阳性率、总Tie2阳性细胞数和Col2阳性率的效果。
Claims (36)
1.一种培养细胞群体的方法(以下称为“第1培养方法”)，其为包含Tie2(含Ig和EGF同源结构域-2的酪氨酸激酶)的表达为阳性的干细胞和/或祖细胞(以下称为“Tie2阳性干/祖细胞”)的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在存在于未经消化处理的组织中的状态下培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
2.根据权利要求1所述的第1培养方法，其中，所述Tie2阳性干/祖细胞为源自椎间盘的髓核组织的Tie2阳性干/祖细胞。
3.根据权利要求1或2所述的第1培养方法，其中，所述未经消化处理的组织为椎间盘的髓核组织。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的第1培养方法，其中，所述未经消化处理的组织是将经冷冻保存的组织解冻而得到的组织。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的第1培养方法，其在扩增细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞时进行。
6.一种培养细胞群体的方法(以下称为“第2培养方法”)，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在添加了至少1种除生长因子以外的Tie2表达增强剂的培养基中培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
7.根据权利要求6所述的第2培养方法，其中，所述除生长因子以外的Tie2表达增强剂为源自动植物的提取物。
8.根据权利要求7所述的第2培养方法，其中，所述植物为樟(Cinnamomum)属的植物。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的第2培养方法，其在扩增细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞时进行。
10.一种培养细胞群体的方法(以下称为“第3培养方法”)，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在具有进行了提高细胞的粘附性的处理的培养表面的培养容器中培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
11.根据权利要求10所述的第3培养方法，其中，所述Tie2阳性干/祖细胞进行了Tie2表达增强处理。
12.根据权利要求10或11所述的第3培养方法，其中，所述提高细胞的粘附性的处理是涂布含有细胞外基质和/或聚氨基酸的涂层剂的处理。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的第3培养方法，其在使细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞分化为目标细胞时进行。
14.根据权利要求12或13所述的第3培养方法，其中，所述细胞外基质和/或聚氨基酸为选自由IV型胶原蛋白、纤连蛋白和聚赖氨酸组成的组中的至少1种以上。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的第3培养方法，其在扩增细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞时进行。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的第3培养方法，其中，所述细胞外基质为明胶。
17.一种培养细胞群体的方法(以下称为“第4培养方法”)，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的培养方法，
所述细胞群体的培养方法在添加了细胞外基质降解剂的培养基中边抑制球状集落的形成边培养包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
18.根据权利要求17所述的第4培养方法，其中，所述Tie2阳性干/祖细胞进行了Tie2表达增强处理。
19.根据权利要求17或18所述的第4培养方法，其中，所述细胞外基质降解剂至少包含对II型胶原蛋白具有降解活性的蛋白酶。
20.根据权利要求17～19中任一项所述的第4培养方法，其在使细胞群体中的所述Tie2阳性干/祖细胞分化为目标细胞时进行。
21.一种制备方法，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的制备方法，所述制备方法包括：包含实施权利要求5所述的第1培养方法和/或权利要求9所述的第2培养方法的工序的、用于增强Tie2阳性干/祖细胞的Tie2的表达且扩增细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的培养阶段(以下称为“扩增培养阶段”)。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其中，在所述扩增培养阶段实施的工序是同时实施所述第1培养方法和所述第2培养方法的工序。
23.根据权利要求21或22所述的制备方法，其中，所述扩增培养阶段还包括：在仅添加了具有Tie2表达增强作用的生长因子作为Tie2表达增强剂的培养基中培养包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的工序。
24.一种制备方法，其为由包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体制备包含由该Tie2阳性干/祖细胞分化出的目标细胞的细胞群体的制备方法，
所述制备方法包括：包含实施权利要求13或14所述的第3培养方法和/或权利要求20所述的第4培养方法的工序的、用于将Tie2阳性干/祖细胞分化诱导为目标细胞的培养阶段(以下称为“分化培养阶段”)。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其中，在所述分化培养阶段实施的工序是同时实施所述第3培养方法和所述第4培养方法的工序。
26.根据权利要求24或25所述的制备方法，其中，所述目标细胞为至少表达II型胶原蛋白的细胞。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其中，所述至少表达II型胶原蛋白的细胞为髓核细胞。
28.根据权利要求24～27中任一项所述的制备方法，其中，通过所述分化培养阶段，得到还残留有Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体。
29.一种制备方法，其为由包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体制备包含由该Tie2阳性干/祖细胞分化出的目标细胞的细胞群体的制备方法，
所述制备方法包括：
权利要求21～23中任一项所述的扩增培养阶段、和
权利要求24～28中任一项所述的分化培养阶段。
30.一种细胞群体，其通过权利要求1～20中任一项所述的培养方法而得到。
31.一种培养物，其含有：权利要求1～20中任一项所述的培养方法中的培养基；及供于该培养方法的、经培养的或得到的细胞群体。
32.一种细胞群体，其通过权利要求21～29中任一项所述的制备方法中的扩增培养阶段和/或分化培养阶段而得到。
33.一种培养物，其含有：权利要求21～29中任一项所述的制备方法中的扩增培养阶段用培养基或分化培养阶段用培养基；及各个供于该扩增培养阶段或分化培养阶段的、经培养的或得到的细胞群体。
34.一种细胞治疗用组合物，其含有权利要求30或32所述的细胞群体。
35.根据权利要求34所述的细胞治疗用组合物，其用于治疗或预防症状表现为椎间盘的损伤、退变或突出的疾病。
36.一种保存方法，其为包含Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体的保存方法，
所述保存方法通过在存在于未经消化处理的组织中的状态下冷冻保存包含该Tie2阳性干/祖细胞的细胞群体，从而维持Tie2被激活和/或被表达的状态、或抑制所述细胞群体中的Tie2阳性干/祖细胞的减少。
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