KR20090069013A - 골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법 - Google Patents

골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 골수기원 중간엽 줄기세포로부터 연골세포 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 골수기원 중간엽 줄기세포를 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059의 존재 하에서 배양하는 것을 특징으로 하는 연골세포 분화 유도 방법 및 상기 방법으로 분화된 연골세포를 함유하는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 연골세포로 전분화된 중간엽 줄기세포를 생체 내에 이식하면, 이식된 중간엽 줄기세포가 뼈 등의 다른 세포로 분화할 우려가 적어 보다 안전하게 치료에 이용할 수 있다.
골수기원 중간엽 줄기세포, 연골세포, 세포 분화, 부갑상선 호르몬-관련 단백질, PD 98059

Description

골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법{Chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells}
본 발명은 조직공학 또는 세포치료제로서 연골을 제작하는 방법에 관한 것으로, 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
관절 연골은 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. 관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. 연골세포는 연골 총부피의 10% 미만을 차지하고 있으며, 세포외기질을 합성, 분비하므로 관절 연골의 유지에 중요한 역할을 한다. 노화에 따른 연골세포 수 및 연골세포 대사작용의 감소는 유병률이 높은 노인성 질환인 골관절염의 병인 중의 하나로 생각되고 있다( Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, Dec, 63(12), pp.1618-1622, 2004). 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다. 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이 다.
자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없다는 것, 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 예측 가능하고, 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자 하는 노력이 바로 연골의 조직공학적 재생이다(kang et al. Tissue Engineering, 11(3-4), pp.438-447, 2005).
인공연골의 제작에 관한 연구가 이미 외국에서 활발하게 수행 중이며, 유럽에서는 이미 연골세포운반체와 함께 연골세포를 이식하는 치료법이 사용되고 있는 실정이다 (Meyer U et al, Eur Cell Mater, Apr 26(9), pp.39-49, 2005).
줄기세포에서 분화된 연골세포의 조직공학적 관절연골 제작은 중심 요인들인 연골세포화된 줄기세포, 생분해성 지지체가 필수적이고 연골 세포화된 줄기세포는 골수로부터 단일핵 세포를 분리 후 배양하면서 연골세포로 분화를 유도한다. 이상적인 연골세포는 증식능력이 좋아야 하며, 연골세포의 특이 표현형인 콜라젠 타입(collagen type) II를 유지하는 세포이다.
한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell:MSC)는 여러종류의 결합조직의 수선세포(repair cell)로 알려져 있으며, 이들 세포는 중간엽계의 여러 종류의 세포로 분화할 수 있다. 중간엽 줄기세포를 관절연골의 손상을 치유하는 데 사용하기 위해서는 생체 내 및 실험실 내에서 줄기세포를 직접적으로 연골세포주로 분화시키는 효율적이면서도 잘 정리된 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이러한 미분 화된 중간엽 줄기세포는 복구된 조직의 장기간 동안의 안정성에 대한 정보가 부족하고, 다른 형태의 세포로 분화하는 경향에 의해서 생체 내에서 이형조직이 형성될 위험이 있기 때문에 그 이용이 제한적이다(De Bari, C et al., Arthritis Rheum, 50:142, 2004). 유전적 재조합을 하지 않거나 미분화된 중간엽 줄기세포를 무릎 관절에 직접 주사하였을 때, 분화되어 연골조직을 복원시키지 못하고, 오히려 식하여 종양을 형성하였다는 보고가 있다(Gilbert, JE et al., Am. J. Knee Surg., 11:42, 1998, Noel, D et al., Stem Cells, 22:74, 2004, Butnariu-Ephrat, Metal., Clin. Orthop. Relat., 330:234, 1996).
본 발명은 연골세포에 비하여 원래의 조직을 손상시키지 않고 쉽게 비교적 많은 양이 분리되어 증식되어 연골형성에 유용하게 이용될 수 있는 중간엽 줄기세포 중에서 특히 골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키면서도, 연골 형성 후기에 연골세포의 비후화와 골 형성을 억제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 위의 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 포함하는 연골손상 질환 치료용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 위의 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 포함하는 인공관절의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 위의 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 포함하는 인공관절을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 데 있어서, 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059의 존재 하에서 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059의 존재 하에서 배양하는 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료 용 조성물을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059의 존재 하에서 배양하는 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절의 제조방법을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059의 존재 하에서 배양하는 방법으로 제조된 분화된 연골세포를 사용하여 제조된 인공관절을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
중간엽 줄기세포로는 윤활막(synovium), 제대혈 또는 지방조직 기원 줄기세포 등의 종류가 있지만, 지방조직 기원 중간엽 줄기세포는 분화능이 떨어지는 단점이 있고, 제대혈 줄기세포는 분화조절 능력이 떨어지는 단점이 있으므로, 본 발명의 연골세포로 분화시키기 위한 성체줄기세포로는 골수기원 중간엽 줄기세포를 사용하는 것이 분화능이 뛰어나다는 점에서 유리하다.
본 발명의 골수로부터 골수기원 중간엽 줄기세포를 분리하기 위해서는 피콜(ficoll)을 이용하여 농도구배 차이를 이용하면 분리하기 용이하다. 분리된 골수기원 중간엽 줄기세포는 2 ~ 5 회, 바람직하게는 3 ~ 4회, 가장 바람직하게는 3 회 계대배양한 것을 연골형성에 사용하는 것이 분화가능한 줄기세포만을 분리한다는 점에서 바람직하다.
본 발명에서 골수기원 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법으로는 공지의 3차원 배양방법을 이용할 수 있다. 현재까지 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 3 차원 배양방법으로는 펠렛(pellet) 배양과 알지네이트 비드 및 알지네이트 층 배양이 주로 이용되고 있다.
특히, 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이고, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있다.
또한, 세포를 알지네이트 비드에 인캡슐레이션(encapsulation)시켜 세포주위에 생리적으로 적합한 환경을 제공하하는 알지네이트를 이용하여 연골화를 유도하는 방법도 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킴에 있어서, 반드시 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 및 PD 98059 중에서 선택된 어느 하나의 연골을 형성하는 신호를 조절하는 물질을 포함시키는 것을 특징으로 한다. 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 및 PD 98059은 연골세포로 분화과정에서 연골형성은 촉진시키면서도 연골의 비후화 또는 비대화를 억제하여 골 형성을 억제한다. 즉, 연골형성의 표지인자인 프로테오글리칸 및 제2형 콜라겐의 발현을 증가시키면서, 연골 비후화의 표지인자인 제10형 콜라겐의 발현을 억제시킨다. 따라서 본 발명의 방법으로 분화된 연골세포는 생체 이식 후에 발생할 수 있는 연골 비후화 또는 골 세포로 대체되는 현상을 억제되므로 연골 손상 질환의 치료용 조성물이나 인공 관절의 구성성분으로 사용되었을 때 부작용의 발생을 방지할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059은 연골세포로의 분화 초기가 아닌 분화의 중간 단계 또는 후기에 사용되는 것이 연골 분화 뿐만아니라 골세포로 분화되는 것을 억제한다는 점에서 바람직하므로, 골수기원 중간엽 줄기세포를 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059이 존재하지 않는 배지에서 1차 배양시킨 후, 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059이 존재하는 배지에서 2차 배양시키는 것이 바람직하다.
상기 1차 배양기간은 2차 배양기간의 0.5 ~ 3 배, 바람직하게는 0.8 ~ 1.5 배인 것이 바람직하다. 예를 들어 분리 후 3회 계대배양한 골수기원 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화하기 위해 4주 배양할 경우, 배양 10일 내지 20일째, 바람직하게는 12일 내지 15일째 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059을 첨가한 배지를 사용하여 배양하는 것이다.
또한, 본 발명에서는 TGF-β(transforming growth factor-β)를 상기 1차 배양 또는 2차 배양용 배지에 포함시켜 배양하는 것이 연골형성에 효과적이라는 점에서 바람직하다. 특히, TGF-β1보다 소량의 약제로 분화를 유도한다는 점에서 TGF-β2 를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 1차 배양 또는 2차 배양용 배지에는 IGF-1, 아스코르빈산, 인슐린, 소듐 셀레나이트, 트랜스페린 및 덱사메타손을 첨가하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 1차 배양 배지와 2차 배양 배지는 5 ~ 10 ng/ml의 TGF-β2, 10 ~ 100 nM의 아스코르빈산, 1 (w/v)% ITS(인슐린 1g/L, 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L, 트랜스페린 0.5 g/L) 및 10-7 M 덱사메타손이 첨가된 것이 바람직하다.
또한, 더욱 바람직하게 상기 1차 배양 배지와 2차 배양 배지는 10 ng/ml의 TGF-β2, 100 ng/ml의 IGF-1, 50 nM의 아스코르빈산, 1% ITS(인슐린 1g/L, 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L, 트랜스페린 0.5 g/L) 및 10-7 M 덱사메타손이 첨가된 것이 바람직하다.
본 발명의 방법으로 생산되는, 골수기원 중간엽 줄기세포로부터 분화된 연골세포는 연골손상 등을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 본 발명의 방법으로 생산된 연골세포를 이용하여 치료할 수 있는 연골손상 질환으로는 퇴행성 관절염, 류마치스성 관절염, 외상에 의한 관절 손상 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 연골세포를 유효성분으로 하는 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이식될 수도 있으며(Kim, G. et al, J. Vet. Med. Sci., 66:263, 2004, Lee,J.W. et al., Yonsei Med. J., 30:41, 2004), 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경료, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 분화된 연골세포를 일정한 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 통상의 방법을 사용하여 일정 형태의 인공연골을 얻을 수 있으며, 이를 이용하여, 인공관절 또는 귀나 코의 성형에 사용되는 인공연골을 제조할 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 방법으로 제조된 분화된 연골세포는 세포나 조직의 이식을 통한 생물학적인 방법으로 골관절염을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 분화된 연골세포는 골세포 등 다른 세포로 분화할 우려가 적어 보다 안전하게 치료에 이용할 수 있다.
본 발명자들은 골수기원 중간엽 줄기세포에 성장인자와 신호전달체계의 변화를 유발하여 효과적인 신생 연골형성을 할 수 있는 조건을 제공하기 위해, (i) 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리하였고, (ii) 각종 조건을 달리하여 연골세포의 형성을 유도하였으며, (iii) 각종 조건에 따른 연골 형성정도, 골 형성정도 및 연골의 비후화 억제 정도를 평가하였다.
이하, 본 발명을 제조예, 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 골수기원 중간엽 줄기세포의 분리
골수는 인공고관절 전치환수를 시행받는 환자의 근위 대퇴부에서 추출한 1 X 106 개의 추출된 세포를 10% 우태혈청(FCS), 1% 항균제를 함유한 F12/DMEM 배양액에 서 37℃, 5% CO2 의 조건에서 배양접시에 배양하였고, 세포들이 바닥의 80%를 덮을 때(80% confluence) 트립신/EDTA를 이용하여 바닥에 부착된 세포를 분리하였다. 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 수득한 세포는 다시 상기 배지로 현탁하여 동일하게 3회 계대배양한 후 다음 실험에 사용하였다.
제조예 2: 연골 분화
제조예 1에서 3회 계대배양된 분리된 1 X 106 개의 골수기원 중간엽 줄기세포를 DMEM 배지에 10 ng/ml의 TGF-β2, 100 ng/ml의 IGF-1, 50 nM의 아스코르빈산, 1% ITS(인슐린 1g/L, 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L, 트랜스페린 0.5 g/L), 10-7 M 덱사메타손을 첨가한 연골형성 배지(chondrogenic-defined medium)에 접종하여, 펠렛 배양(pellet culture) 형태로 37 ℃, 5% CO2 조건에서 2 주간 배양하였다.
상기 2 주간 배양한 세포 펠렛을 상기 연골형성 배지(비교예 1), 연골형성 배지에 100 ng/ml의 재조합 인간 노긴(Noggin)을 첨가시킨 것(비교예 2), 연골형성 배지에 100 ng/ml의 재조합 인간 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP)을 첨가시킨 것(실시예 1), 연골형성 배지에 10 μM의 PD 98059를 첨가시킨 것(실시예 2), 또는 연골형성 배지에 10 μM의 SB 203580을 첨가시킨 것(비교예 3)에 옮겨 다시 2 주간 추가 배양하였다. 상기 실험은 서로 다른 환자에서 나온 세포를 가지고 5회 반복되었다.
실험예 1: DNA 함량 측정
게놈 DNA를 정제하여 펠렛 당 총 게놈 DNA의 양을 측정하는 방법으로 세포 증식을 확인하기 위하여 DNA 함량을 측정하였다. 연골형성 배지에서만 배양한 경우(비교예 1)를 1로 하여 상대적인 DNA 함량을 도 1에 도시하였다.
도 1에 의하면, 연골형성 배지(CM)에서만 배양한 경우(비교예 1)에 비하여, 노긴(비교예 2) 군에서는 DNA 함량이 감소되었고, PTHrP(실시예 1), PD 98059(실시예 2) 및 SD 203580(비교예 3) 군의 경우에는 DNA 함량이 증가하였다.
실험예 2: 글루코스아미노글루칸(Glucosaminoglycan : GAG) 측정
제조예 2에서 4 주간 배양한 실시예 1, 2, 비교예 1, 2, 3의 세포 펠렛을 10 %(W/V) 파파인으로 처리한 후, 시료 100㎕를 1 ml의 블리스칸 염색약(1,9-dimethyl-methylene blue)과 반응시킨 후 656 nm에서 흡광도를 측정하였고. 그 수치를 DNA양으로 나누어서 세포당 글루코스아미노글리칸의 양을 추정하였다.
연골형성 배지(CM)에서만 배양한 경우(비교예 1)에 비하여, 글루코스아미노글리칸의 양은 노긴(비교예 2)의 경우는 감소하였고, PTHrP(실시예 1) 및 PD 98059(실시예 2)에서는 증가하였다(도 2).
실험예 3: RT-PCR을 통한 mRNA 발현 양의 측정
역전사-중합효소 연쇄반응을 이용하여 연골형성의 표지자인 Sox-9, 제2형 콜 라겐, 그리고 비후연골의 표지자인 제10형 콜라겐의 발현양을 확인하였다.
연골형성 배지(CM)에서만 배양한 경우(비교예 1)를 1로 하여 상대적인 발현양을 도 3에 도시하였다. 도 3의 발현양을 살펴보면, PTHrP(실시예 1) 및 PD 98059(실시예 2)는 제2형 콜라겐과 sox-9의 발현을 증가시키고, 비후 연골의 표지자인 제10형 콜라겐의 발현은 오히려 감소시키는 것을 알 수 있습니다.
실험예 4: 조직학적 검사
상기 제조예 2의 배양 4주 후 세포를 고정하여 조직편을 제작하고, 기본적으로 헤마톡실린 에오신(hematoxylin eosin)염색을 실시한 후 연골기질에 대한 사프라닌-O 염색과 제2형 콜라겐 및 제10형 콜라겐에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다.
프로테오글리칸의 발현 정도를 사프라닌-O 염색 결과로 나타내어 도 4에 나타내었다. PTHrP(실시예 1)와 PD 98059(실시예 2)의 두 군에서 프로테오글리칸의 발현이 현저히 증가했으나, 노긴(비교예 2) 군에서는 오히려 프로테오글리칸의 발현이 감소하였다.
제2형 콜라겐에 대한 면역조직화학 염색 결과는 도 6에 나타내었다. 제2형 콜라겐의 발현에서도 PTHrP(실시예 1)와 PD 98059(실시예 2)의 두 군에서 현저히 증가했으나, 노긴(비교예 2) 군에서는 발현이 감소하였다.
제10형 콜라겐에 대한 면역조직화학 염색 결과는 도 5에 나타내었다. PTHrP(실시예 1), PD 98059(실시예 2) 및 노긴(비교예 2) 군 모두에서 제10형 콜라 겐의 발현이 현저히 감소하였다. 오히려 연골형성 배지에서만 배양한 경우(비교예 1)과 SB 203580(비교예 3) 군에서만 제10형 콜라겐의 발현이 현저히 증가되었다.
위와 같은, 사프라닌-O, 제2형 콜라겐, 제10형 콜라겐 발현 결과를 종합해 보면, 실시예 1 및 2는 사프라닌-O와 제2형 콜라겐의 발현은 현저히 증가시키지만, 제10형 콜라겐의 발현은 현저히 감소시키는 것을 확인할 수 있고, 따라서 골수기원 중간엽 줄기세포의 분화과정에서 PTHrP 또는 PD 98059의 첨가는 연골세포로의 분화는 유도하면서, 분화 후기에 연골세포가 골세포로 대체되지 않고 효과적으로 연골의 비후화(또는 비대화)가 억제됨을 확인하였다.
도 1은 세포 증식을 확인하기 위한 DNA 함량을 측정결과를 그래프로 나타내었다.
도 2는 프로테오글리칸(글루코스아미노글리칸)의 측정결과를 그래프로 나타내었다.
도 3은 제2형 콜라겐(왼쪽)과 SOX-9(가운데), 제10형 콜라겐(오른쪽)의 발현 양을 그래프로 나타내었다.
도 4는 사프라닌-O 염색을 통해 프로테오글리칸의 양을 확인한 것으로, 위쪽은 10 배 확대한 사진, 아래쪽은 100 배 확대한 사진이다.
도 5는 면역분석학적 염색에 의하여 제10형 콜라겐의 양을 확인한 것으로, 위쪽은 10 배 확대한 사진, 아래쪽은 100 배 확대한 사진이다.
도 6은 면역분석학적 염색에 의하여 제2형 콜라겐의 양을 확인한 것으로, 위쪽은 10 배 확대한 사진, 아래쪽은 100 배 확대한 사진이다.

Claims (9)

  1. 골수기원 중간엽 줄기세포를 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059의 존재 하에서 배양하여 연골세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 골수기원 중간엽 줄기세포를 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059이 존재하지 않는 배지에서 1차 배양시킨 후, 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059이 존재하는 배지에서 2차 배양시키는 것을 특징으로 하는 연골세포로 분화시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 1차 배양기간은 2차 배양기간의 0.5 ~ 3 배인 것을 특징으로 하는 연골세포로 분화시키는 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 1차 배양 배지와 2차 배양 배지는 TGF-β2, IGF-1, 아스코르빈산, 인슐린, 소듐 셀레나이트, 트랜스페린 및 덱사메타손이 포함된 것임을 특징으로 하는 연골세포로 분화시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 1차 배양 배지와 2차 배양 배지는 10 ng/ml의 TGF-β2, 100 ng/ml의 IGF-1, 50 nM의 아스코르빈산, 1% ITS(인슐린 1g/L, 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L, 트랜스페린 0.5 g/L) 및 10-7 M 덱사메타손이 포함된 것임을 특징으로 하는 연골세포로 분화시키는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항의 방법 중 어느 하나의 방법을 통해 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환 치료용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 연골손상 질환은 퇴행성 관절염 또는 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항의 방법으로 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절의 제조방법.
  9. 제8항의 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 인공관절.
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011065661A2 (ko) * 2009-11-30 2011-06-03 동국대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포를 dkk-1 또는 sfrp-1을 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법
WO2013162330A1 (ko) * 2012-04-27 2013-10-31 이화여자대학교 산학협력단 키메라 중간엽 줄기세포군, 그의 제조방법 및 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법
KR101386352B1 (ko) * 2012-04-04 2014-04-16 동국대학교 산학협력단 전기천공법을 이용한 골수 간엽줄기세포를 연골세포로 분화촉진 시키는 방법
KR20150079439A (ko) * 2013-12-31 2015-07-08 동국대학교 산학협력단 Klf10 발현 억제제를 포함하는 연골세포 분화 촉진 또는 연골질환 치료용 조성물, 및 이를 이용한 연골분화 촉진 방법
WO2015102351A1 (ko) * 2013-12-31 2015-07-09 동국대학교 산학협력단 Ｋｌｆ１０ 발현 억제제를 포함하는 연골세포 분화 촉진 또는 연골질환 치료용 조성물， 및 이를 이용한 연골분화 촉진 방법
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011065661A2 (ko) * 2009-11-30 2011-06-03 동국대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포를 dkk-1 또는 sfrp-1을 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법
WO2011065661A3 (ko) * 2009-11-30 2011-09-01 동국대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포를 dkk-1 또는 sfrp-1을 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법
KR101386352B1 (ko) * 2012-04-04 2014-04-16 동국대학교 산학협력단 전기천공법을 이용한 골수 간엽줄기세포를 연골세포로 분화촉진 시키는 방법
WO2013162330A1 (ko) * 2012-04-27 2013-10-31 이화여자대학교 산학협력단 키메라 중간엽 줄기세포군, 그의 제조방법 및 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법
KR20150079439A (ko) * 2013-12-31 2015-07-08 동국대학교 산학협력단 Klf10 발현 억제제를 포함하는 연골세포 분화 촉진 또는 연골질환 치료용 조성물, 및 이를 이용한 연골분화 촉진 방법
WO2015102351A1 (ko) * 2013-12-31 2015-07-09 동국대학교 산학협력단 Ｋｌｆ１０ 발현 억제제를 포함하는 연골세포 분화 촉진 또는 연골질환 치료용 조성물， 및 이를 이용한 연골분화 촉진 방법
US9963744B2 (en) 2013-12-31 2018-05-08 Dongguk University Industry—Academic Cooperation Foundation Composition for promoting chondrocyte differentiation or treating cartilage diseases, containing KLF10 expression inhibitor, and method for promoting cartilage differentiation by using same
CN107405363A (zh) * 2015-02-06 2017-11-28 可隆生命科学株式会社 用于治疗由超免疫反应诱导的炎性疾病的组合物
EP3254685A4 (en) * 2015-02-06 2018-09-19 Kolon Life Science, Inc. Composition for treating inflammatory diseases caused by hyper-immune responses
US11191787B2 (en) 2015-02-06 2021-12-07 Kolon Life Science, Inc. Composition for treating inflammatory disease induced by hyperimmune response

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