KR101920128B1 - 성장 인자 조합을 사용하는 골수 줄기 세포 및 간엽 줄기 세포의 골발생 분화 - Google Patents

성장 인자 조합을 사용하는 골수 줄기 세포 및 간엽 줄기 세포의 골발생 분화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 골수 줄기 세포 (BMSC) 또는 간엽 줄기 세포 (MSC) 의 골발생 분화 방법, 특히, 인간 혈장 또는 혈청 및 FGF 및 TGFB 성장 인자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이렇게 수득된 세포 및 세포 집단 뿐 아니라, 이들을 포함하는 추가의 생성물 및 뼈 치료법에서의 이의 용도를 제공한다.

Description

성장 인자 조합을 사용하는 골수 줄기 세포 및 간엽 줄기 세포의 골발생 분화 {OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF BONE MARROW STEM CELLS AND MESENCHYMAL STEM CELLS USING A COMBINATION OF GROWTH FACTORS}
본 발명은 골수 줄기 세포 (BMSC) 및 간엽 줄기 세포 (MSC) 의 골발생 분화 방법, 상기 방법에 의해 수득가능한 세포 및 세포 집단 및 특히 뼈 치료 분야에서의 이의 용도에 관한 것이다.
골발생 분화를 진행할 수 있는 줄기 세포 또는 골발생 분화에 대한 잠재성이 있는 세포의 이식은 골-관련 질환의 치료, 특히 새로운 뼈의 생성이 치료에 필요한 경우에 유망한 방도이다.
골수 줄기 세포 (BMSC) 및 간엽 줄기 세포 (MSC) 는 뼈 질환을 치료하기 위해 이미 사용되어 왔다 (Gangji et al., 2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42). 그러나, 이러한 비교적 미분화된 줄기 세포를 이식할 수 있긴 해도, 골발생 계통에 대한 잠재성이 없으므로, 이렇게 이식된 줄기 세포의 상당 부분이 결국은 바람직한 뼈 조직의 형성에 기여할 수 없다.
게다가, 골수 또는 다른 기원 조직으로부터 수득가능한 이러한 줄기 세포의 양은 종종 불만족스럽고, 심지어는 유전적 원인 또는 글루코코르티코이드 사용 또는 알코올 남용과 같은 다양한 상황에서 더욱 감소될 수 있다.
WO 2007/093431 호에는 단리된 BMSC 또는 MSC 의 적절한 범위의 시험관 내 증식을 달성하고, 이미 골모세포성 표현형을 나타내는 세포를 산출하는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법에서, 인간 BMSC 또는 MSC 를 혈청 또는 혈장 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 의 존재하에서 배양하였다. WO 2007/093431 호에는 골모세포를 수득하기 위해 FGF 및 TGF 성장 인자의 특이적 조합을 사용하는 교시는 없으며, 이의 임의의 장점을 언급하지도 않았다.
BMSC 및 MSC 로부터 유용한 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포성 표현형 세포를 제조하기 위한 좀더 단순하고 신뢰성 있는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 방법은 세포 증식 증대를 달성하고/하거나 예를 들어, 동종이형 대상 내 조직 거부를 덜 일으키는 세포와 같은 부가적인 유리한 특성을 갖는 세포를 제조하고자 하는 경우 특히 바람직하다.
본 발명의 주제는 상기와 같은 방법 및 이에 의해 수득가능한 골모세포 표현형 세포를 제공하는 것이다.
본 발명자는 성체 줄기 세포, 더욱 구체적으로는 골수 줄기 세포 (BMSC) 및 간엽 줄기 세포 (MSC) 의 증식 잠재성이, 상기 세포를 혈청 또는 혈장, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 형질전환 성장 인자 베타 (TGFB) 의 존재하에서 배양하는 경우 골발생 분화 시 상당히 증가될 수 있고, 이로써 유용한 골조상세포 또는 골모세포 표현형 세포 및 세포 집단의 양의 증가를 달성할 수 있다는 것을 발견하였다.
그러므로, 하나의 양상에서 본 발명은 인간 골수 줄기 세포 (BMSC) 또는 인간 간엽 줄기 세포 (MSC) 를 인간 혈장 또는 혈청, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체, 및 형질전환 성장 인자 베타 (TGFB) 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 골수 줄기 세포 (BMSC) 또는 인간 간엽 줄기 세포 (MSC) 로부터 시험관 내 또는 체외에서 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 처리된 줄기 세포의 상당한 부분, 예를 들어 대다수를 골조상세포 또는 골모세포 표현형으로 분화시킬 수 있다. 그러므로, 하나의 양상에서 본 발명의 방법은 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 그 자체를 수득하기 위해 이용할 수 있다.
그러나, 본 발명의 방법이 일반적으로, 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포의 상당한 부분, 예를 들어 대다수를 포함하는 세포 집단을 제공할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이러한 세포 집단에는 임의로 추가의 세포 유형이 포함될 수 있다.
따라서, 하나의 양상에서 본 발명은 인간 BMSC 또는 인간 MSC 를 인간 혈장 또는 혈청, FGF 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체, 및 TGFB 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 BMSC 또는 인간 MSC 로부터 시험관 내 또는 체외에서 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 방법을 포함한다.
본 방법은 이식 목적을 위해 다수의 골발생 세포를 발생시킬 수 있다. 이것은 출발 BMSC 또는 MSC 세포를 수득하기 위해 대상으로부터 채취할 필요가 있는 조직의 양을 좀더 감소시킬 수 있다. 이것은 또한 적은 수의 BMSC 또는 MSC 세포를 갖는 대상으로부터 적합한 수의 골발생 세포를 수득할 수 있다. 또한, 본 방법은 분화된 세포를 환자에게 이식할 수 있는 시간을 단축시켜, 더 빠른 치료를 가능하게 할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) BMSC 또는 MSC 를 포함하는 인간 대상의 생물학적 샘플로부터 세포를 회수하는 단계;
(b) 임의로, 상기 단계 (a) 에서 회수된 세포로부터 단핵 세포를 단리하는 단계;
(c) 상기 단계 (a) 또는 (b) 의 세포를 인간 혈장 또는 혈청, FGF 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체, 및 TGFB 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체를 포함하는 배지에 첨가하고, 세포를 기질 표면에 부착시키기 위한 것과 같이 세포-배지 혼합물을 배양하는 단계;
(d) 비부착 물질을 제거하고, 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포-유사 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하기 위한 것과 같이 부착 세포를 상기 단계 (c) 에서 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계.
상기 방법 중 임의의 하나의 구현예에서, BMSC 또는 MSC 세포를 FGF 및 TGFB, 또는 상기 임의의 것의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체에, 함께, 즉 동시에 노출시킬 수 있다.
상기 방법 중 임의의 추가의 구현예에서, 인간 혈장 또는 혈청은 BMSC 또는 MSC 세포에 대해 자가형일 수 있거나, BMSC 또는 MSC 세포에 대해 동종이형 (상동) 일 수 있다.
상기 방법 중 임의의 추가의 구현예에서, 비-인간 동물 물질 (예를 들어, 혈청 성분) 은 BMSC 또는 MSC 세포의 배양물에 사용되지 않는다. 이것은 인간에서 배양된 세포의 이종 거부 위험을 감소시킬 뿐 아니라, 환자의 병원체 오염 위험을 줄인다.
상기 방법의 부가적인 바람직한 구현예는 단독으로 또는 본 세포 및 세포 집단의 공급과 추가하여 조합으로의, 추가의 특성, 예컨대 제한 없이 인큐베이션 시간, 계대, 성분 품질 등에 관한 것이다.
본 발명자는 또한 놀랍게도, 본 발명의 방법을 사용하여 수득된 골모세포 표현형 세포 내 HLA-DR 주 조직적합성 복합체의 발현이 WO 2007/093431 호의 방법을 적용하였을 때 관찰되었던 HLA-DR 발현보다 유의하게 낮음을 발견하였다. 이러한 낮은 HLA-DR 발현은 본원에서 수득되는 골모세포 표현형 세포의 면역특권 특성을 향상시켜, 이러한 세포의 거부 위험을 감소시키고 또한 동종이형 환자에서의 이의 광범위한 적용을 가능하게 할 수 있다.
그러므로 본 발명은 또한 종래 기술에 비해 신규하고 유리한 특성을 나타내는 골모세포 표현형 세포를 제공한다. 따라서, 하나의 양상에서 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 수득가능하거나 직접적으로 수득되는 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 뿐 아니라 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다.
또한 본 발명자는 본원에서 성립된 골모세포성 세포를 치료, 특히 뼈 이식 치료에 특정한 우월성을 제공할 수 있는 새로운 세포 유형 및 세포 집단으로 정의하기 위해 분석하였다.
그러므로, 하나의 양상에서 본 발명은 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 뿐 아니라 이러한 세포를 포함하는 세포 집단이, (1) CD90, CD105, CD73, CD63, CD166 및 알칼리 포스파타아제 (ALP), 더욱 구체적으로는 뼈-간-신장 유형의 ALP 의 발현을 포함하고, (2) CD45, CD14, CD19 를 발현하지 않고, (3) 세포의 25% 미만, 바람직하게는 세포의 20% 미만, 더욱 더 바람직하게는 세포의 15% 미만, 예컨대 세포의 10% 미만 또는 세포의 7% 미만이 HLA-DR 을 발현하는 (즉, 세포의 상당한 부분이 HLA-DR 을 발현하지 않음) 것을 특징으로 하는 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 뿐 아니라 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 예시적인 세포 집단은 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 예를 들어, 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 예를 들어 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 예를 들어 95% 이상의 본원에 정의된 바와 같은 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 집단은 50% 미만, 바람직하게는 40% 미만, 더욱 더 바람직하게는 30% 미만, 더욱 더 바람직하게는 20% 미만, 더욱 더 바람직하게는 10% 미만, 예를 들어, 7% 미만, 5% 미만 또는 2% 미만의, 본원에 정의된 바와 같은 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 이외의 세포 유형을 포함할 수 있다.
관련 양상은 골-관련 질환에서의, 본 발명에 교시된 바와 같은 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단의 치료적 용도 및 상기 세포 또는 세포 집단을 포함하는 상응하는 약학 제형에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 특징은 본원에 이하에서 더욱 상세히 설명될 뿐 아니라, 비제한적인 실시예에 의해 설명된다.
도 1 은 혈장 및 10 ng/ml TGFB-1 을 함유하는 배지 또는 혈장 및 10 ng/ml FGF2 와 10 ng/ml TGFb-1 을 모두 함유하는 배지 내에서의 골모세포 1 차 배양 수율의 상자-수염도 비교 (n=4) 를 보여준다.
도 2 는 10 ng/ml TGFb-1 이 보충된 배지 대 보충되지 않은 배지 내에서의 골모세포 배양 수율의 비교를 보여준다. (A) 1 차 배양, (B) 2 차 배양, (C) 전반적.
도 3 은 매트릭스 알리자린 레드 염색에 의해 검정된 (A) 오직 FGF2 만 또는 (B) FGF2 및 TGFb-1 의 존재하에서 배양된 세포의 광화작용을 보여준다.
도 4 는 PHA 에 의해 자극된 PBMC 에 대한 TGFb-1/FGF2 내에서 배양된 세포의 면역억제 효과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본원에서 사용되는 바와 같은 단수형에는 문맥에서 다르게 명확하게 표시되지 않는 한 단수형 및 복수형이 모두 포함된다. 예를 들어, "세포" 는 하나의 또는 1 개 초과의 세포를 말한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "포함하는", "포함하다" 및 "~ 으로 구성되는" 이라는 용어는 "포함되는", "포함되다" 또는 "함유하는", "함유하다" 와 동의어로 사용되며, 포괄적이거나 개방적이며 부가적인, 비-언급된 일원, 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는다.
종결점에 의한 수치 범위 한정에는 언급된 종결점 뿐 아니라 범위 내에 포함되는 모든 숫자 및 분수가 포함된다.
파라미터, 양, 시간 기간 등과 같은 측정값을 언급하는 경우 본원에서 사용되는 바와 같은 "약" 이라는 용어는, 구체적인 값의 그리고 그로부터의 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 더욱 바람직하게는 +/-1% 이하, 더욱 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변화값을, 이러한 변화값이 기재된 발명 내에서 수행하기에 적합하다면 포함한다. 수식어 "약" 으로 언급되는 값은 그 자체가 또한 구체적으로, 그리고 바람직하게 기재되는 것으로 이해된다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 인용된다. 특히 본원에 구체적으로 언급되는 모든 문헌의 교시가 참조로서 인용된다.
다르게 정의되지 않는다면, 기술적 과학적 용어를 비롯해 본 발명을 설명하면서 사용되는 모든 용어는 본 발명에 속하는 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
1. 발명의 방법
요약 부분에 상세히 설명된 바와 같이, 하나의 양상에서 본 발명은 인간 골수 줄기 세포로부터 시험관 내 또는 체외에서 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포의 수득 뿐 아니라 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 포함하는 세포 집단의 수득 방법에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포라는 구절은 일반적으로, 뼈 물질 또는 뼈 매트릭스의 형성에 기여할 수 있는, 또는 이러한 형성에 기여할 수 있는 세포를 발달시킬 수 있는 세포를 포함한다. 특히, 본 발명의 방법은 본 발명자에 의해 실험적으로 입증되는 바와 같이, 치료적 분야에서 뼈 형성을 복구하는데 유용한 세포 및 세포 집단을 산출한다. 따라서, 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포라는 구절은 본 발명의 방법으로부터 수득되는 골발생 계통의 임의의 이러한 유용한 세포를 포함하고자 하는 것으로 해석되어야만 한다.
골수는 긴 뼈의 골수강, 일부 하버스관, 및 해면성 또는 스폰지성 뼈의 잔기둥 사이의 공간을 점유하는 연 조직이다. 본 용어는 특히 그러나 제한 없이 초기 생명의 모든 뼈 및 성체 내 제한적인 위치 (예를 들어, 스폰지성 뼈) 에서 발견되는 적색 골수뿐 아니라, 황색 골수를 포함한다.
전체적으로, 골수는 특히 조혈 줄기 세포, 적혈구 및 백혈구 및 이들의 전구체, 간엽 줄기 세포 (MSC), 간질 세포 및 이들의 전구체, 및 섬유모세포, 망상적혈구, 지방세포, 및 "간질" 이라고 불리는 결합 조직 네트워크를 형성하는 세포를 비롯한 세포 그룹으로 구성된 복합 조직이다.
골수 세포는 마우스 및 인간 모두에서 전신 이식 후 많은 다양한 조직에 기여한다. 이러한 능력은 골수에 존재하는 다양한 줄기 세포, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및/또는 골수 다능 줄기 세포의 활성을 반영할 수 있다.
그러므로 본원에서 사용되는 바와 같은 "골수 줄기 세포" 또는 "BMSC" 와 같은 용어는 골수에 존재하는, 특히 골수 샘플에 존재하는 또는 이로부터 (부분적으로) 단리된 임의의 성체 줄기 세포를 말한다. 골수 (BMSC) 샘플은 예를 들어, 대상의 장골능선, 대퇴, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 기타 골수강으로부터 수득될 수 있다. BMSC 라는 용어는 또한 BMSC 의 후손, 예를 들어, 대상의 샘플로부터 수득된 BMSC 의 시험관 내 또는 체외 증식에 의해 수득된 후손을 포함한다.
특정 성분과 관련하여 "단리하는" 이라는 용어는 하나의 성분을, 그 성분이 단리되게 되는 조성물의 1 종 이상의 기타 성분으로부터 분리하는 것을 나타낸다. 임의의 세포 집단과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 "단리된" 이라는 용어는 또한 이러한 세포 집단이 동물 또는 인간 신체의 일부를 형성하지 않는 것을 의미한다.
"줄기 세포" 라는 용어는 일반적으로, 자가-부활이 가능한, 즉 분화 없이 증식가능한 미특화된 또는 비교적 덜 특화된 증식-잠재능 세포를 말하고, 이것 또는 이의 자손은 하나 이상의 비교적 더욱 특화된 세포 유형을 낳을 수 있다. 상기 용어는 상당히 비제한된 자가-부활이 가능한 줄기 세포, 즉, 줄기 세포의 후손 또는 이의 일부 이상이, 모 줄기 세포 뿐 아니라, 제한된 자가-부활을 나타내는 줄기 세포의 상당히 미특화된 또는 비교적 덜 특화된 표현형, 분화 잠재성, 및 증식 능력을 보유하는, 즉, 추가의 증식 및/또는 분화에 대한 후손 또는 이들의 부분의 능력이 모 세포와 비교하여 현저하게 감소된 세포를 포함한다. 제한 없이 예를 들어, 줄기 세포는 점점 더 비교적 더욱 특화된 세포를 생산하는, 또는 심지어 종결적으로 분화된 세포, 즉, 후-유사분열일 수 있는 완전히 특화된 세포를 생산하는 하나 이상의 계통으로 분화될 수 있는 자손을 낳을 수 있으며, 상기 자손 및/또는 점점 더 비교적 더욱 특화된 세포는 그들 자체가 본원에 정의된 바와 같은 줄기 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "성체 줄기 세포" 라는 용어는 태아 단계에서 또는 출생 후 유기체에 존재하는 또는 이로부터 (예컨대 이로부터 단리됨) 수득된 줄기 세포를 말한다.
본 발명에 따른 바람직한 골수 줄기 세포는 적어도 골발생 (뼈) 계통, 예를 들어, 골발생 세포 및/또는 골조상세포 및/또는 전-골모세포 및/또는 골모세포 및/또는 골세포 등의 세포를 발생시키는 잠재성을 갖는다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 일부 이상의 골수 줄기 세포는 또한 본 발명의 방법으로부터 수득되는 세포 집단에 포함되는 세포, 예를 들어, 내피 계통 세포, 예를 들어 내피 전구 세포 및/또는 내피 세포를 추가로 발생시키는 잠재성을 가질 수 있다.
적어도 골발생 계통의 세포를 발생시키는 잠재성을 갖는 BMSC 유형의 비제한적인 예는 간엽 줄기 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "간엽 줄기 세포" 또는 "MSC" 라는 용어는 간엽 계통의 세포, 전형적으로는 2 가지 이상의 간엽 계통의 세포를 발생시킬 수 있는 성체, 중배엽-유래 줄기 세포, 예를 들어, 골세포성 (뼈), 연골세포성 (연골), 근육세포성 (근육), 힘줄세포성 (힘줄), 섬유모세포성 (결합 조직), 지방세포성 (지방) 및 간질세포성 (골수 간질) 계통을 말한다. MSC 는 예를 들어, 골수, 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황, 피부 (진피), 구체적으로는 태아 및 청년기 피부, 골막 및 지방 조직으로부터 단리될 수 있다. 인간 MSC, 이들의 단리, 시험관 내 증식 및 분화는 예를 들어, 미국 특허 제 5,486,359 호; 미국 특허 제 5,811,094 호; 미국 특허 제 5,736,396 호; 미국 특허 제 5,837,539 호; 또는 미국 특허 제 5,827,740 호에 기재되어 있다. 당업계에 기재되고, 당업계에 기재된 임의의 방법에 이해 단리되는 임의의 MSC 는, 이러한 MSC 가 적어도 골세포 (뼈) 계통의 세포를 발생시킬 수 있다면 본 발명에 적합할 수 있다.
MSC 라는 용어는 또한 MSC 의 후손, 예를 들어, 동물 또는 인간 대상의 생물학적 샘플로부터 수득된 MSC 의 시험관 내 또는 체외 증식에 의해 수득된 후손을 포함한다.
잠재적으로는, 그러나 제한 없이, 일부 이상의 MSC 는 또한 본 발명의 방법으로 수득된 세포 집단에 포함되는 세포를 추가로 발생시킬 수 있을 것이다.
예에서 제시되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 특정 배양 조건하에서 기질 표면에 부착하는 BMSC 세포를 선별하는 것을 수반한다. MSC 를, 기질 표면, 예를 들어, 플라스틱 표면에 부착할 수 있는 이들 (단핵) 세포를 선별함으로써 골수 (또는 기타 기원) 로부터 단리할 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다. 그러므로, 임의의 가설에 제한되지 않으면서, 본 발명자는 본 발명의 방법으로, MSC 가 BMSC 로부터의 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포의 수득에 적어도 부분적으로 기여할 수 있다는 것을 추측한다.
그러므로, 하나의 양상에서, 본 발명은 또한 인간 간엽 줄기 세포 (MSC) 를 인간 혈장 또는 혈청, FGF 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체, 및 TGFB 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 인간 간엽 줄기 세포 (MSC) 로부터 시험관 내 또는 체외에서 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 수득하는 방법을 포함한다.
MSC 는 생물학적 샘플, 예를 들어, BMSC 를 포함하는 샘플에 포함될 수 있거나, 당업계에 공지된 바와 같은 방법으로 적어도 부분적으로 단리될 수 있다. 게다가, MSC 는 골수 또는 골수 이외의 MSC 를 포함하는 임의의 적합한 기원, 예를 들어, 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황, 피부 (진피), 구체적으로는 태아 및 청년기 피부, 골막 및 지방 조직으로부터 적어도 부분적으로 단리될 수 있다.
BMSC 세포는 이의 임의의 및 모든 하위유형, 예컨대 제한 없이, Colter et al. 2000 (PNAS 97(7): 3213-8) 에 기재된 바와 같은 "빠르게 자가-부활하는 세포" RS-1 또는 RS-2; Goodell et al. 1997 (Nat Med 3(12): 1337-45) 에 기재된 바와 같은 "사이드 집단" (SP) 세포; 저밀도 (예를 들어, 밀도 구배 원심분리시), 비-부착 특성 및 골발생 마커의 저발현 수준 (Long et al. 1995. J Clin Invest. 95(2): 881-7; US 5,972,703 에 기재된 바와 같음) 에 의해 처음에 확인되는 골발생 전구체 (OP) 세포; Krause et al. 2001 (Cell 105: 369-377) 및 Dominici et al. 2004. (PNAS 101 (32): 11761-6) 에 기재된 바와 같은 조혈 및 비-조혈 계통 모두의 세포를 발생시킬 수 있는 원시 전구체 세포; 및 기타를 포함하는 것으로 의도된다.
골수 줄기 세포 집단의 복합성을 제시하면서, 본 발명은 1 종 이상의 특정 BMSC 유형에 제한되지 않아야만 한다는 것으로 이해된다. 게다가, 본 방법에서, 1 종 이상의 BMSC 세포 유형, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 유형들이 아마도 상이한 범위로 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 수득하는데, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는데 기여할 수 있을 것이다. 반면, 본 방법이 또한 특정 BMSC 집단, 예를 들어, 기타 BMSC 집단으로부터 적어도 부분적으로 단리된 MSC 를 사용할 수 있다는 것으로 이해된다.
"시험관 내" 라는 용어는 일반적으로, 동물 또는 인간 신체의 외부 또는 외면을 나타낸다. "생체 외" 라는 용어는 전형적으로는, 조직 또는 세포를 동물 또는 인간 신체로부터 제거하고 신체 외부에서, 예를 들어, 배양 용기 내에서 유지 또는 증식시키는 것을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "시험관 내" 라는 용어는 "생체 외" 에 포함되는 것으로 이해되어야만 한다.
하나의 구현예에서, BMSC 또는 MSC 는 대상의 생물학적 샘플로부터 수득된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "대상" 이라는 용어는 동물, 더욱 특히 비-인간 포유동물 및 인간 유기체를 말한다. 비-인간 동물 대상에는 또한 동물로부터의 출생전 형태, 예를 들어, 배아 또는 태아가 포함될 수 있다. 또한 인간 대상은 태아를 포함할 수 있으나, 바람직하게는 배아는 포함되지 않는다. 인간 대상이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "생물학적 샘플" 또는 "샘플" 이라는 용어는 일반적으로, 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, 유기체, 기관, 조직 또는 세포 배양물 등으로부터 수득되는 샘플을 말한다. 동물 또는 인간 대상의 생물학적 샘플은 동물 또는 인간 대상으로부터 제거되고 이의 세포를 포함하는 샘플을 말한다. 동물 또는 인간 대상의 생물학적 샘플은 1 종 이상의 조직 유형 및 1 종 이상의 조직 유형의 세포를 포함할 수 있다. 동물 또는 인간 대상의 생물학적 샘플의 수득 방법은 예를 들어, 조직 생검 또는 채혈과 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
대상의 유용한 생물학적 샘플은 그들의 BMSC 또는 MSC 를 포함한다. 이러한 샘플은 전형적으로는 골수로부터, 예를 들어, 대상의 장골능선, 대퇴, 경골, 척추, 갈비뼈 또는 기타 골수강으로부터 수득될 수 있다. MSC 를 포함하는 또다른 유용한 생물학적 샘플은 예를 들어, 혈액, 탯줄, 태반, 태아 난황, 피부 (진피), 구체적으로는 태아 및 청년기 피부, 대상의 골막 또는 지방 조직으로부터 유래될 수 있다
하나의 구현예에서, BMSC 또는 MSC 는 상기 BMSC 또는 MSC 로부터 수득되는 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포의 기능성 확보를 도울 수 있는 건강한 대상으로부터 수득될 수 있다.
또다른 구현예에서, BMSC 또는 MSC 는 골-관련 질환의 위험이 있거나 상기 질환을 가진 대상, 및 그러므로 특히 본 발명의 방법에 따라 상기 BMSC 또는 MSC 로부터 수득된 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포의 투여로부터 이점을 가질 수 있는 대상으로부터 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "골-관련 질환" 이라는 용어는 임의의 유형의 골 질환을 말하고, 이의 치료는 장애를 갖는 대상에게 골발생 계통 세포, 예를 들어, 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포를 투여하여 이점을 가질 수 있다. 특히, 이러한 장애는, 예를 들어, 뼈 형성 감소 또는 과도한 뼈 재흡수에 의해, 뼈 내에 존재하는 골모세포 또는 골세포의 수, 생존력 또는 기능 감소에 의해, 대상 내 뼈 질량 감소, 뼈의 가늘어짐, 제대로 발휘되지 못하는 뼈 강도 또는 탄성 등에 의해 특징화될 수 있다.
예를 들어 제한 없이, 본 발명의 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포의 투여로부터 이점을 가질 수 있는 골-관련 질환에는 국부적 또는 전신적 장애, 예컨대 임의의 유형의 골다공증 또는 골감소증, 예를 들어, 1 차, 폐경후, 노인성, 코르티코이드-유도, 임의의 2 차, 1 부위 또는 다 부위 골괴사, 임의의 유형의 골절, 예를 들어, 불유합, 부정유합, 지연유합 골절 또는 압박, 골 유합이 필요한 상태 (예를 들어, 척추유합 및 재건), 상악안면 골절, 골 재건축, 예를 들어, 트라우마 상해 또는 암 수술 후, 두개안면 골 재건축, 불완전골생성증, 골용해성 뼈암, 파제트병, 내분비계 장애, 저인산혈증, 저칼슘혈증, 신장성 골발생장애, 골연화증, 무력성 골 질환, 류마티스 관절염, 부갑상샘 기능항진, 1 차 부갑상샘항진증, 2 차 부갑상샘항진증, 치주질환, 골함-스타우트 질환 및 맥쿤-올브라이트 증후군이 포함될 수 있다.
본 방법에서, BMSC 또는 MSC 는 인간 혈장 또는 혈청, FGF 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체, 및 TGFB 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체와 접촉된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "접촉하는" 이라는 용어는 하나 이상의 분자, 성분 또는 물질을 또다른 것과 직접적으로 또는 간접적으로 함께 묶어, 그들 사이의 상호작용을 용이하게 하는 것을 의미한다. 전형적으로는, 성장 인자 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체, 및 인간 혈장 또는 혈청은, BMSC 가 배양되고 있는 배지 내 함입에 의해 BMSC 와 접촉될 수 있다.
당업자는 인간 혈장 및 혈청이 성장 인자, 사이토카인 또는 호르몬 1 종 이상을 포함할 수 있는 복합 생물학적 조성물이라는 것을 인지한다. 그러므로, 언급된 성장 인자 FGF 및 TGFB 또는 이들의 각각의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체가 혈장 또는 혈청에 더해, 즉 외생적으로 또는 보충적으로 제공된다는 것으로 의도된다.
추가의 구현예에서, BMSC 또는 MSC 는 - FGF 및 TGFB 외에 - 1 종 이상의 부가적인, FGF 및 TFGB 외의 외생적으로 첨가된 성장 인자와 접촉될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "성장 인자" 라는 용어는 다양한 세포 유형의 증식, 성장, 분화, 생존 및/또는 이동에 영향을 미치고, 단독으로 또는 기타 물질에 의해 조절되어 유기체의 발달적, 형태학적 및 기능적 변화에 영향을 줄 수 있는 생물학적으로 활성인 성분을 말한다. 성장 인자는 전형적으로는 성장 인자에 반응하는 세포에 존재하는 수용체 (예를 들어, 표면 또는 세포내 수용체) 에, 리간드로서 결합함으로써 작용할 수 있다. 본원에서의 성장 인자는 특히 1 개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질성 실재일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 하나 이상의 또는 모든 성장 인자 (본원에서 사용되는 바와 같은 성장 인자에 대한 일반적인 참조는 특히 FGF 및 TGFB 성장 인자 뿐 아니라, 임의의 하나 이상의 추가의 성장 인자를 포함함) 는 인간 성장 인자이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "인간 성장 인자" 라는 용어는 자연적으로 발생하는 인간 성장 인자와 실질적으로 동일한 성장 인자를 말한다. 예를 들어, 성장 인자가 단백질성 실재인 경우, 이의 구성 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들) 은 자연적으로 발생하는 인간 성장 인자와 일치하는 1 차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 발명의 방법에서 인간 성장 인자의 사용은, 성장 인자가 인간 세포 기능에 대해 바람직한 효과를 도출할 것으로 예상되는 것이 바람직하다.
"자연적으로 발생하는" 이라는 용어는 인간에 의해 인위적으로 제조된 것과 구별되는 자연에서 발견될 수 있는 물질 또는 실재를 기술하기 위해 사용된다. 예를 들어, 자연에서 기원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 개질되지 않은, 유기체에 존재하는 폴리펩티드 서열이 자연적으로 발생하는 것이다. 특정 실재, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질을 언급하는 경우, 상기 용어는 자연에서 발생하는 모든 형태 및 이의 변이체, 예를 들어 종과 개체 사이의 정상 변이로 인한 것을 포함한다. 예를 들어, 단백질성 성장 인자와 관련되는 경우, "자연적으로 발생하는" 이라는 용어는 종과 개체 사이의 정상 대립형질 변이 사이의 유전적 다양성으로 인한 구성 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들) 의 1 차 서열 간의 차이를 갖는 성장 인자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "FGF" 라는 용어는 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 계열의 성장 인자의 임의의 및 모든 일원을 포함한다. 특히, 본 발명의 방법에서 사용되는 FGF 는 FGF-1, FGF-2 및 FGF-3 으로부터 선택될 수 있고, 더욱 바람직하게는 FGF-2 이다.
산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-1) 는 또한 헤파린-결합 성장 인자 1 (HBGF-1), aFGF, 베타-내피 세포 성장 인자, 또는 ECGF-베타로서 통상적으로 알려져 있다. 예시적인 인간 FGF-1 에는 제한 없이, Uniprot/Swissprot (http://www.expasy.org/) 접근 번호 P05230 로 주석이 달려진 1 차 아미노산 서열을 갖는 FGF-1 이 포함된다. 당업자는 상기 서열이 전구체 FGF-1 의 것이고, 성숙 FGF-1 로부터 진행되어 가는 일부를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예시적인 인간 FGF-1 은 또한 특히 Jaye et al. 1986 (Science 233: 541-545) 및 Harper et al. 1986 (Biochemistry 25: 4097-4103) 에 기재되어 있다.
염기성 섬유모세포 성장 인자는 또한 FGF-b, FGF-2, BFGF, HBGH-2, 프로스타트로핀, 또는 헤파린-결합 성장 인자 2 전구체 (HBGF-2) 로서 통상적으로 알려져 있다. 예시적인 인간 FGF-2 에는 제한 없이, Uniprot/Swissprot 접근 번호 P09038 로 주석이 달려진 1 차 아미노산 서열을 갖는 FGF-2 가 포함된다. 당업자는 상기 서열이 전구체 FGF-2 의 것이고, 성숙 FGF-2 로부터 진행되어 가는 일부를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예시적인 인간 FGF-2 는 또한 특히 Abraham et al. 1986 (EMBO J 5: 2523-8) 및 Kurokawa et al. 1987 (FEBS Lett 213: 189-94) 에 기재되어 있다.
섬유모세포 성장 인자 3 (FGF-3) 은 또한 INT-2 원형-종양유전자 단백질, 또는 HBGF-3 으로서 통상적으로 알려져 있다. 예시적인 인간 FGF-3 에는 제한 없이, Uniprot/Swissprot 접근 번호 P11487 로 주석이 달려진 1 차 아미노산 서열을 갖는 FGF-3 이 포함된다. 당업자는 상기 서열이 전구체 FGF-3 의 것이고, 성숙 FGF-3 으로부터 진행되어 가는 일부를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예시적인 인간 FGF-3 은 또한 특히 Brooks et al. 1989 (Oncogene 4: 429-436) 에 기재되어 있다.
본원에 기재되어 있는 바와 같이 "TGF 베타" 또는 "TGFB" 라는 용어는 형질전환 성장 인자 베타 (TGFB) 계열의 성장 인자의 임의의 및 모든 일원을 포함한다. 특히, 본 발명의 방법에서 사용되는 TGFB 는 TGFB-1, TGFB-2 및 TGFB-3 으로부터 선택될 수 있고, 더욱 바람직하게는 TGFB-1 이다.
형질전환 성장 인자 베타-1 은 또한 TGFB-1 및 TGF-베타-1 로서 알려져 있다. 예시적인 인간 TGFB-1 에는 제한 없이, Uniprot/Swissprot 접근 번호 P01137 로 주석이 달려진 1 차 아미노산 서열을 갖는 TGFB-1 이 포함된다. 당업자는 상기 서열이 전구체 TGFB-1 의 것이고, 성숙 TGFB-1 로부터 진행되어 가는 일부를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예시적인 인간 TGFB-1 은 또한 특히 Derynck et al. 1985 (Nature 316: 701-5) 에 기재되어 있다.
형질전환 성장 인자 베타-2 는 또한 TGFB-2, 교모세포종-유래 T-세포 억제 인자, G-TSF, BSC-1 세포 성장 억제제, 폴리에르긴 또는 세테르민으로서 알려져 있다. 예시적인 인간 TGFB-2 에는 제한 없이, Uniprot/Swissprot 접근 번호 P61812 로 주석이 달려진 1 차 아미노산 서열을 갖는 TGFB-2 가 포함된다. 당업자는 상기 서열이 전구체 TGFB-2 의 것이고, 성숙 TGFB-2 로부터 진행되어 가는 일부를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예시적인 인간 TGFB-2 는 또한 특히 Webb et al. 1988 (DNA 7: 493-497) 에 기재되어 있다.
형질전환 성장 인자 베타-3 은 또한 TGFB-3 으로서 알려져 있다. 예시적인 인간 TGFB-3 에는 제한 없이, Uniprot/Swissprot 접근 번호 P10600 으로 주석이 달려진 1 차 아미노산 서열을 갖는 TGFB-3 이 포함된다. 당업자는 상기 서열이 전구체 TGFB-3 의 것이고, 성숙 TGFB-3 으로부터 진행되어 가는 일부를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다. 예시적인 인간 TGFB-3 은 또한 특히 ten Dijke et al. 1988 (PNAS 85: 4715-4719) 및 Derynck et al. 1988 (EMBO J. 7: 3737-3743) 에 기재되어 있다.
본 발명의 방법은 각각의 성장 인자 중 임의의 하나 이상 또는 모두의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 성장 인자의 "생물학적으로 활성인" 변이체 또는 유도체는 다른 조건이 실질적으로 동일한 경우 각각의 성장 인자와 BMSC 로부터 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 수득을 적어도 약 동일한 정도로 달성한다.
성장 인자가 유사한 인지 수용체에 대한 결합에 의해 효과를 발휘하는 경우, 상기 성장 인자의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체는 그 인지 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 특이성을 나타낼 수 있고, 이것은 적어도 대략, 그 결합에 대한 성장 인자의 친화성 및/또는 특이성만큼 높다. 예를 들어, 상기 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체는 수용체 결합에 대한 각각의 성장 인자의 친화성 및/또는 특이성의 80% 이상, 예를 들어, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 또는 심지어 100% 이상인 인지 수용체에 대한 결합 친화성 및/또는 특이성을 가질 수 있다. 상기 결합 파라미터는 그 자체로 알려진 시험관 내 또는 세포 검정법을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
제시된 성장 인자의 활성을 성립된 검정법, 예를 들어, 시험관 내 또는 세포 검정법 (예를 들어, 세포 배양물 내의 분열촉진 활성의 측정) 으로 쉽게 측정가능한 경우, 상기 성장 인자의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체는 이러한 검정법에서, 적어도 대략, 성장 인자의 활성만큼 높은 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체는 각각의 성장 인자의 활성의 80% 이상, 예를 들어, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 또는 심지어 100% 이상인 활성을 보일 수 있다.
폴리펩티드의 "변이체" 는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 실질적으로 일치하는 (즉, 대부분 그러나 완전히 일치하는 것은 아님) 아미노산 서열을 갖는다. 여기서, "실질적으로 일치하는" 은 85% 이상 일치하는, 90% 이상 일치하는, 바람직하게는 95% 이상 일치하는, 예를 들어, 99% 이상 일치하는 것을 말한다. 서열 차이는 하나 이상의 아미노산의 삽입 (부가), 결실 및/또는 치환으로부터 산출될 수 있다.
2 가지 폴리펩티드 사이의 서열 상동성은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 최적으로 배열 (2 개의 단백질 서열의 최적 배열은 도입된 갭에 대해 임의의 패널티를 제하고 쌍 점수의 합을 최대화하는 배열이고; 바람직하게는 Needleman and Wunsch 1970 (J MoI Biol 48: 443-453) 의 알고리즘을 사용하는 "Gap" 또는, Smith and Waterman 1981 (J MoI Biol 147: 195?197) 의 알고리즘을 사용하는 "Bestfit" (예를 들어, Accelrys 의 GCG™ v. 1 1.1.2 패키지에서 이용가능) 과 같은 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 수행될 수 있다) 하고, 한편으로는 폴리펩티드가 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 배열 내의 위치의 수, 및 다른 한편으로는 2 개의 폴리펩티드의 서열이 상이한 배열 내의 위치의 수를 점수화하여 측정될 수 있다. 2 개의 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 그 위치에 상이한 아미노산 잔기를 함유하는 경우 (아미노산 치환), 또는 폴리펩티드 중 하나가 그 위치에 아미노산 잔기를 함유하는 반면 다른 것은 함유하지 않는 경우 또는 그 반대의 경우 (아미노산 삽입 또는 결실), 배열 내의 제시된 위치에서 서열이 상이하다. 서열 상동성은 배열 내 위치의 총 수에 대한 폴리펩티드가 동일한 아미노산 잔기를 함유하는 배열 내 위치의 비율 (%) 로서 계산된다. 서열 배열 수행 및 서열 일치성의 측정에 더욱 적합한 알고리즘에는 본래 Altschul et al. 1990 (J Mol Biol 215: 403-10) 에 의해 기재된 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), 예컨대 Tatusova and Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250) 에 의해 기재된 "Blast 2 서열" 알고리즘에 근거한 알고리즘이 포함된다.
변이체와 변이체가 실질적으로 일치하는 각각의 폴리펩티드의 아미노산 서열 사이의 차이의 일부 이상은 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 차이의 바람직하게는, 85% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 예를 들어, 100% 가 아미노산 치환일 수 있다. 바람직하게는, 상기 아미노산 치환은 보존적일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "보존적 치환" 이라는 용어는 하나의 아미노산 잔기가 또다른, 생물학적으로 유사한 아미노산 잔기로 대체된 것을 나타낸다. 보존적 치환의 비제한적인 예에는 하나의 소수성 아미노산 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 다른 것으로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 다른 것으로의 치환, 예컨대 아르기닌과 리신 사이의, 글루탐산과 아스파르트산 사이의 또는 글루타민과 아스파라긴 사이의 치환 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 폴리펩티드의 "변이체" 에는 또한 구체적으로는 상기 폴리펩티드와 특정 정도의 유사성을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는, 이러한 변이체는 90% 이상 유사, 예를 들어, 바람직하게는 91% 이상 유사, 예를 들어, 92% 이상 유사, 93% 이상 유사, 더욱 바람직하게는 94% 이상 유사, 예를 들어, 95% 이상 유사, 더욱 더 바람직하게는 96% 이상 유사, 예를 들어, 97% 이상 유사, 더욱 더 바람직하게는 98% 이상 유사, 예를 들어, 99% 이상 유사할 수 있다.
2 개의 폴리펩티드 사이의 서열 유사성은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 (상기 참조), 한편으로는 폴리펩티드가 동일한 또는 유사한 (즉, 보존적으로 치환된) 아미노산 잔기를 함유하는 배열 내의 위치의 수, 및 다른 한편으로는 반대로 2 개의 폴리펩티드의 서열이 상이한 배열 내의 위치의 수를 점수화하여 측정될 수 있다. 반대로 2 개의 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 그 위치에 비-보존적 아미노산 잔기를 함유하는 경우, 또는 폴리펩티드 중 하나가 그 위치에 아미노산 잔기를 함유하는 반면 다른 것은 함유하지 않는 경우 또는 그 반대의 경우 (아미노산 삽입 또는 결실), 배열 내의 제시된 위치에서 서열이 상이하다. 서열 유사성은 배열 내 위치의 총 수에 대한 폴리펩티드가 동일한 또는 유사한 아미노산 잔기를 함유하는 배열 내 위치의 비율 (%) 로서 계산된다.
변이체 성장 인자는 하나 이상의 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들) 로 구성될 수 있고, 이 중 하나 이상은 성장 인자의 각 구성 펩티드 또는 폴리펩티드의 상기 정의된 바와 같은 변이체이다.
폴리펩티드의 "유도체" 는 하나 이상의 아미노산 잔기의 화학적 변형 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 하나 이상의 부분의 첨가에 의해, 예를 들어, 당화, 인산화, 아실화, 아세틸화, 황화, 지질화, 알킬화 등에 의해 유도체화될 수 있다. 전형적으로는, 유도체 폴리펩티드 내 아미노산의 50% 미만, 예를 들어, 40% 미만, 바람직하게는 30% 미만, 예를 들어, 20% 미만, 더욱 바람직하게는 15% 미만, 예를 들어, 10% 미만 또는 5% 미만, 예를 들어, 4% 미만, 3%, 2% 또는 1% 가 또한 유도체화될 수 있다. 유도체 단백질성 성장 인자는 하나 이상의 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들) 로 구성될 수 있고, 이 중 하나 이상은 하나 이상의 아미노산 잔기에 대해 유도체화될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 성장 인자 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체는 재조합될 수 있다, 즉, 재조합 핵산 분자의 발현을 통해 숙주 유기체에 의해 생성될 수 있고, 이것은 숙주 유기체 (예를 들어, 박테리아, 예컨대 제한 없이 E. 콜라이, S. 팀피무리움 (S. tymphimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis); 효모, 예를 들어 S. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris); 배양된 식물 세포, 예컨대 특히 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 및 니코티아나 토바쿰 (Nicotiana tobaccum) 세포; 동물 세포, 예컨대 포유류 및 곤충 세포; 또는 다세포 유기체, 예컨대 식물 또는 동물) 또는 이의 조상 내에 도입되고, 이것은 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 재조합적으로 발현된 성장 인자 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체를 사용하는 것은 병원성 작용제의 전달 위험을 감소시킨다. TGFB-1 의 재조합 생성은 특히 Bourdrel et al. 1993 (Protein Expr Purif 4: 130-40) 에 기재되어 있다. 재조합 성장 인자는 또한 통상적으로 시판된다 (예를 들어, Sigma, Biological Industries, R&D Systems, Peprotech, 등).
"혈장" 이라는 용어는 통상적으로 정의된 바와 같다. 혈장은 통상적으로 항응고제, (예를 들어, 헤파린, 시트레이트, 옥살레이트 또는 EDTA) 와 함께 제공된 또는 이와 접촉된 전혈 샘플로부터 수득된다. 이어서, 혈액 샘플의 세포 성분은 적합한 기술에 의해, 전형적으로는 원심분리에 의해 액체 성분 (혈장) 으로부터 분리된다. 그러므로 "혈장" 이라는 용어는 인간 또는 동물 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 말한다.
"혈청" 이라는 용어는 통상적으로 정의된 바와 같다. 혈청은 통상적으로, 먼저 샘플 내에서 응고가 일어나게 한 후, 적합한 기술에 의해, 전형적으로는 원심분리에 의해 액체 성분 (혈청) 으로부터 혈액 샘플의 그렇게 형성된 응고물 및 세포 성분을 분리함으로써 수득될 수 있다. 응고는 비활성 촉매, 예를 들어 유리 비이드 또는 분말에 의해 용이해질 수 있다. 대안적으로는, 혈청은 항응고제 및 피브린을 제거함으로써 혈장으로부터 수득될 수 있다. 그러므로 "혈청" 이라는 용어는 인간 또는 동물 신체의 일부를 형성하지 않는 조성물을 말한다.
단리된 혈장 또는 혈청은 본 발명의 방법에 직접적으로 사용될 수 있다. 이들은 또한 추후 사용을 위해 적합하게 저장될 수 있다 (예를 들어, 혈장 또는 혈청의 각각의 빙점을 초과하나, 주위 온도 미만인 온도에서 단기간 동안, 예를 들어, 약 1 ~ 2 주 이하 (상기 온도는 통상적으로 약 4℃ 내지 5℃ 일 것임); 또는 냉동 저장에 의해 (통상 약 -70℃ 내지 약 -80℃) 장기간 동안).
단리된 혈장 또는 혈청은 당업계에 공지된 바와 같이, 특히 보체를 제거하기 위해 열 불활성화될 수 있다. 본 발명의 방법이 혈장 또는 혈청의 존재하에서 배양되는 세포와 자가형인 혈장 또는 혈청을 사용하는 경우, 혈장 또는 혈청을 열 불활성화시킬 필요는 없을 것이다. 혈장 또는 혈청이 배양되는 세포에 적어도 부분적으로 동종이형인 경우, 혈장 또는 혈청을 열 불활성화시키는 것이 유리할 것이다.
임의로, 혈장 또는 혈청은 또한 저장 또는 사용 전에 통상적인 미생물학적 필터 (바람직하게는 직경 크기가 0.2μm 또는 그 이하인) 를 사용하여 멸균될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 접촉되는 인간 BMSC 또는 MSC 와 자가형인 인간 혈장 또는 혈청을 사용할 수 있다. 혈장 또는 혈청과 관련하여 "자가형" 이라는 용어는 혈장 또는 혈청이, 상기 혈장 또는 혈청과 접촉되는 BMSC 또는 MSC 와 동일한 대상으로부터 수득되는 것을 나타낸다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 그와 접촉하는 인간 BMSC 또는 MSC 에 "상동" 또는 "동종이형" 인, 즉, BMSC 또는 MSC 가 수득되는 대상 외의 하나 이상의 (수집된) 인간 대상으로부터 수득되는 인간 혈장 또는 혈청을 사용할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 정의된 바와 같은 자가형 및 상동 (동종이형) 혈장 또는 혈청의 혼합물을 사용할 수 있다.
명시된 바와 같이, 하나의 양상에서, 본 발명은 통상적으로 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) BMSC 또는 MSC 를 포함하는 인간 대상의 생물학적 샘플로부터 세포를 회수하는 단계;
(b) 임의로, 상기 단계 (a) 에서 회수된 세포로부터 단핵 세포를 단리하는 단계;
(c) 상기 단계 (a) 또는 (b) 의 세포를 인간 혈장 또는 혈청, FGF 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체, 및 TGFB 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체를 포함하는 배지에 첨가하고, 세포를 기질 표면에 부착시키기 위한 것과 같이 세포-배지 혼합물을 배양하는 단계;
(d) 비부착 물질을 제거하고, 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포-유사 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하기 위한 것과 같이 부착 세포를 상기 단계 (c) 에서 정의된 배지에서 추가로 배양하는 단계.
단계 (b) 는 통상적인 방법, 예를 들어, 밀도 구배 원심분리를 사용하여 수행될 수 있다.
단계 (a) 또는 (b) 로부터의 세포 현탁액을 배지, 통상적으로는 액체 세포 배양 배지의 존재하에서 배양한다. 전형적으로는, 배지는 당업계에 공지된 바와 같은 기본적인 배지 제형을 포함할 것이다. 이글 최소 필수 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium: MEM), 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 알파 개질 최소 필수 배지 (alpha modified Minimum Essential Medium: alpha-MEM), 기본적인 필수 배지 (Basal Medium Essential: BME), BGJb, F-12 영양 혼합물 (Nutrient Mixture) (Ham), 이스코브 개질 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM), 또는 X-Vivo-10 무혈청 배지 (임상 등급), Invitrogen 또는 Cambrex (New Jersey) 로부터 이용가능, 및 이의 개질형 및/또는 조합을 포함하나 이에 제한되지 않은 많은 기본적인 배지 제형 (예를 들어, American Type Culture Collection, ATCC; 또는 Invitrogen, Carlsbad, California 로부터 이용가능) 이 본원에서 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 상기 기본적인 배지의 조성은 일반적으로는 당업계에 알려져 있고, 배양되는 세포에 필요한 배지 및/또는 배지 보충물의 농도를 개질 또는 변형하는 것은 당업계의 기술 내에 있다.
이러한 기본적인 배지 제형은 그 자체로 알려진 포유류 세포 발달에 필요한 성분을 함유한다. 예를 들어 제한 없이, 이러한 성분에는 무기염 (특히 Na, K, Mg, Ca, Cl, P 및, 가능하게는 Cu, Fe, Se 및 Zn 를 함유하는 염), 생리학적 완충액 (예를 들어, HEPES, 비카르보네이트), 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및/또는 핵산 염기, 리보오스, 데옥시리보오스, 아미노산, 비타민, 항산화제 (예를 들어, 글루타티온) 및 탄소원 (예를 들어, 글루코오스, 나트륨 피루베이트, 나트륨 아세테이트) 등이 포함될 수 있다.
배양에 사용하기 위해, 기본적인 배지에는 하나 이상의 추가의 성분이 보충될 수 있다. 예를 들어, 부가적인 보충물은 필수 미량 원소 및 최적 성장 및 증식을 위한 성분을 세포에 공급하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 보충물에는 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 염 및 이의 조합이 포함된다. 이러한 성분은 행크 균형 염 용액 (Hanks' Balanced Salt Solution: HBSS), 얼 염 용액 (Earle's Salt Solution) 과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 염 용액에 포함될 수 있다. 추가의 항산화제 보충물에는, 예를 들어, β-메르캅토에탄올을 추가할 수 있다. 많은 기본적인 배지가 이미 아미노산을 함유하는 반면, 일부 아미노산은 후에, 예를 들어, 용액인 경우 덜 안정한 것으로 알려져 있는 L-글루타민이 보충될 수 있다. 배지에는 항생제 및/또는 항진균제 화합물, 예컨대 전형적으로는, 페니실린 및 스트렙토마이신의 혼합물, 및/또는 예를 들어 암포테리신, 암피실린, 젠타마이신, 블레오마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 마이토마이신, 마이코페놀산, 날리딕스산, 네오마이신, 니스타틴, 파로모마이신, 폴리마이신, 푸로마이신, 리팜피신, 스펙티노마이신, 테트라사이클린, 타일로신 및 제오신 그러나 이에 제한되지 않는 기타 화합물이 추가로 보충될 수 있다.
지질 및 지질 담체는 또한 세포 배양 배지를 보충하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 지질 및 담체에는 그 중에서도 시클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민에 공액된 리놀레산, 알부민에 공액된 리놀레산과 올레산, 미공액 리놀레산, 알부민에 공액된 리놀레산-올레산-아라키돈산, 알부민에 공액된 올레산 및 미공액된 올레산이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 알부민은 지방산이 없는 제형에서 유사하게 사용될 수 있다.
구현예에서, 인간 혈장 또는 혈청은 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 15% 의 비율 (혈장 또는 혈청의 부피/배지의 부피) 로 상기 배지에 포함될 수 있다. 본 발명의 방법은 비교적 적은 양의 혈장 또는 혈청, 예를 들어, 약 5 또는 10 부피% 이하, 예를 들어, 약 1, 약 2, 약 3 또는 약 4 부피% 로 만족스럽게 수행될 수 있어, BMSC 를 배양하기 위해 수득될 필요가 있는 혈장 또는 혈청의 부피를 감소시킬 수 있다.
FGF 및 TGFB 는 상기 배지 내에 BMSC 의 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포로의 분화를 유도하기에 충분한 농도로 포함된다. 전형적으로는, FGF 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체는 배지 내에 0.1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 0.5 내지 20 ng/ml, 예를 들어, 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml 이하, 예를 들어, 약 4, 3, 2, 1 또는 0.5 ng/ml 의 농도로 포함될 수 있다. 전형적으로는, TGFB 또는 이의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체는 배지 내에 0.1 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 0.25 내지 20 ng/ml, 예를 들어, 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 또는 6 ng/ml, 또는 약 5 ng/ml 이하, 예를 들어, 약 4, 3, 2, 1 또는 0.5 ng/ml 의 농도로 포함될 수 있다. 상기 값은 배지에 외생적으로 보충된, 각각의 성장 인자 또는 이들의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체의 농도를 말하는 것으로 의도된다.
하나의 구현예에서, BMSC 또는 MSC 는 인간 혈장 또는 혈청, FGF 및 TGFB 또는 이들의 생물학적으로 활성인 변이체 또는 유도체와 지속적으로 접촉될 수 있다, 즉, 상기 성분은 BMSC 또는 MSC, 이의 자손 및/또는 그로부터 유래된 세포가 본 발명의 방법으로 배양되는 모든 배지 내에 포함될 것이다. 전형적으로는, 상기 혈장 또는 혈청 및 성장 인자는 본 발명의 방법 동안 BMSC 또는 MSC 를 배양하는데 사용되는 모든 (신선한) 배지 내에서 실질적으로 동일한 각각의 농도로 공급될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 단계 (a) 또는 (b) 의 세포는 단계 (c) 에서 배양하기 위해 5×102 내지 5×106 세포/㎠, 바람직하게는 5×103 내지 5×105 세포/㎠, 더욱 전형적으로는 약 5×104 세포/㎠ 로 플레이팅될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 배양 용기는 세포 부착을 가능하게 하기 위해서 플라스틱 표면으로 제공될 수 있다. 또다른 구현예에서, 표면은 유리 표면일 수 있다. 또다른 구현예에서, 표면은 세포의 부착 및 성장에 도움이 되기에 적합한 물질, 예를 들어, 매트리젤 (Matrigel(R)), 라미닌 또는 콜라겐으로 코팅될 수 있다.
구현예에서, 세포는 단계 (d) 에서 비부착 물질을 제거하기 전 약 1 내지 8 일, 더욱 전형적으로는 약 2 내지 6 일, 더욱 전형적으로는 약 4 일 동안 부착되도록 방치시킬 수 있다.
전형적으로는, 세포는 약 7 내지 약 18 일, 통상 약 11 내지 약 15 일, 더욱 바람직하게는 약 12 ~ 14 일의 기간 동안 함께 취합된 단계 (c) 및 (d) 에서 배양될 수 있다. 다르게는, 세포는 컨플루언스 (confluence) 가 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 심지어 100% 까지 도달할 때까지 함께 취합된 단계 (c) 및 (d) 에서 배양될 수 있다.
하나의 구현예에서, 단계 (d) 후 상기 방법은 그렇게 수득된 세포 또는 세포 집단을 수집하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 단계 (d) 후 획득된 세포를 1 회 이상, 전형적으로는 1 또는 2 회, 더욱 바람직하게는 1 회 계대시킬 수 있다. 계대 번호는 배양 용기로부터 세포 집단을 제거하고 서브배양을 시행하는 횟수, 즉 계대 (passage) 를 말한다. 예를 들어, 계대 작업은 통상적으로 2 가 이온 킬레이트제 (예를 들어, EDTA 또는 EGTA) 및/또는 트립신 또는 적합한 프로테아제를 사용하여 세포를 떼어내는 단계; 떨어진 세포를 재현탁하는 단계; 및 세포를 동일한 또는 새로운 배양 용기에 원하는 세포 밀도로 재플레이팅하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 기재된 바와 같이 단계 (d) 후에 본 방법은, 특히 1 회 계대하고, 상기 (c) 에 정의된 배지에서 단계 (d) 로부터의 세포 또는 세포 집단을 추가로 배양하는 단계 (e) 를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계 (e) 후 세포 또는 세포 집단을 수집할 수 있다.
계대 단계 (e) 에서, 세포는 추가 배양을 위해 바람직하게는 5×101 내지 5×106 세포/㎠, 바람직하게는 5×102 내지 5×104 세포/㎠, 더욱 전형적으로는 약 5×103 세포/㎠ 로 플레이팅된다.
전형적으로, 계대 단계 후, 세포를 단계 (e) 에서 약 3 내지 약 12 일, 통상적으로는 약 6 내지 약 10 일, 더욱 전형적으로는 약 1 주일의 기간 동안 배양한다. 이 기간 동안 세포가 만족스럽게 증식하게 된다.
본 발명의 상기 상세한 방법은, 특히 고 증식 속도 및 저 HLA-DR 발현과 같은 우수한 특성을 갖는 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 집단을 산출하고, 상기 세포 및 세포 집단은 환자 골 조직 내 예방적 또는 치료적 이식에 적합하다.
따라서, 하나의 양상에서 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 방법을 사용하여 수득가능한 또는 직접적으로 수득되는 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단, 골-관련 질환 (예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 열거된 것들과 같은) 의 치료법에 사용하기 위한 및/또는 이를 치료하는데 사용하기 위한 이러한 세포 또는 세포 집단, 및 골-관련 질환의 치료용 의약의 제조에 있어서의 이러한 세포 또는 세포 집단의 용도에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 사용하여 수득가능한 또는 직접적으로 수득되는 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하고 뼈 병반 부위에 투여하기에 적합한 약학 조성물에 관한 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 하기를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서의 골 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다:
(i) 상기 기재된 바와 같이 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하기 위해 본 발명의 방법을 수행하는 단계, 및 (ii) 이렇게 수득된 세포 또는 세포 집단을 상기 대상에, 예를 들어, 수술 또는 골절과 같은 뼈 병반 부위에 투여하는 단계.
2. 본 발명의 세포 및 세포 집단
본 발명에 의해 수득되는 골모세포성 세포의 추가의 연구로, 뼈 치료법에서 사용시 발견되는 유리한 특성을 근거로 할 수 있는 신규 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 유형을 정의할 수 있다.
특히, 하나의 양상에서 본 발명은 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포뿐 아니라, 이러한 세포를 포함하는 세포 집단이, (1) CD90, CD105, CD73, CD63, CD166 및 알칼리 포스파타아제 (ALP), 더욱 구체적으로는 뼈-간-신장 유형의 ALP 의 발현을 포함하고, (2) CD45, CD14, CD19 를 발현하지 않고, (3) 세포의 25% 미만, 바람직하게는 세포의 20% 미만, 더욱 더 바람직하게는 세포의 15% 미만이 HLA-DR 을 발현하는 것을 특징으로 하는 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포뿐 아니라, 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다.
세포가 특정 마커에 대해 양성인 것으로 말해지는 경우, 이것은 당업자가 적합한 대조군과 비교해, 적합한 측정을 수행하였을 때 그 마커에 대해 예를 들어, 항체-검출가능 또는 역전사 폴리머라아제 사슬 반응에 의한 검출과 같은 구별되는 신호의 존재 또는 증거로 판단할 것이라는 것을 의미한다. 방법이 마커의 정량적 평가를 가능하게 하는 경우, 양성 세포는 대체로, 대조군 세포에 의해 발생되는 신호보다 예를 들어 그러나 제한 없이, 1.5 배 이상 높은, 예를 들어, 2 배 이상, 4 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 30 배 이상, 40 배 이상, 50 배 이상 높은 또는 심지어 더 높은, 대조군과 유의하게 구별되는 신호를 발생시킬 수 있다.
상기 세포-특이적 마커의 발현은 당업계에 공지된 임의의 적합한 면역학적 기술, 예컨대 면역-세포화학 또는 친화성 흡착, 웨스턴 블롯 분석, FACS, ELISA, 등을 사용하여, 또는 효소 활성 (예를 들어, ALP 에 대한) 의 임의의 적합한 생화학적 검정에 의해, 또는 마커 mRNA 의 양을 측정하기 위한 임의의 적합한 기술, 예를 들어, 노던 블롯, 반정량적 또는 정량적 RT-PCR 등에 의해 검출될 수 있다. 본 설명에서 언급된 마커에 대한 서열 데이터는 공지되어 있고, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 와 같은 공개 데이터베이스로부터 수득될 수 있다.
추가의 구현예에서, 상기 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포는 골발생 배지에 노출되는 경우 외부 주위환경을 광화하거나, 칼슘-함유 세포외 매트릭스를 합성하는 능력이 있다는 증거를 보인다 (Jaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64: 295-312). 세포 내부 칼슘 축적 및 매트릭스 단백질 내로의 침전은 통상적으로는 예를 들어, 45Ca2+ 에서 배양하고, 세척하고 재배양한 다음, 세포 내부에 존재하는 또는 세포외 매트릭스에 침전된 임의의 방사능활성을 측정함으로써 (U.S. Pat. No. 5,972,703), 또는 Ca2+ 검정 키트 (Sigma Kit #587) 를 사용하여 광화작용에 대한 배양 기질을 검정함으로써, 또는 본 실시예에 기재된 바와 같이 측정할 수 있다.
또다른 구현예에서, 상기 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포는 지방세포 계통 (예를 들어, 지방세포) 또는 연골세포 계통 (예를 들어, 연골세포) 의 세포 중 임의의 것, 바람직하게는 어느 것으로도 실질적으로는 분화되지 않는다. 상기 세포 계통으로의 분화의 부재는 당업계에서 성립된 표준 분화 유도 조건 (예를 들어, Pittenger et al. 1999. Science 284: 143-7 참조), 및 검정법 (예를 들어, 유도되는 경우, 지방세포는 전형적으로는 지질 축적을 나타내는 오일 레드 O 로 염색되고; 연골세포는 전형적으로는 알시안 블루 또는 사프라닌 O 로 염색된다) 을 사용하여 시험될 수 있다. 지방세포 또는 연골세포 분화에 대한 경향이 실질적으로 결핍된다는 것은 시험된 세포의 전형적으로는 65% 미만, 또는 50% 미만, 또는 35% 미만, 또는 20% 미만 또는 10% 미만이 각 시험에 적용되는 경우 지방세포 또는 연골세포 분화 징조를 보일 것임을 의미할 수 있다.
추가의 구현예에서, 상기 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포는 또한 오스테오칼신 (OCN) 을 발현할 수 있다 (특히 실험에서는 FACS 에 의해 검출되는 바와 같이 OCN 을 발현하는 세포가 8 내지 85% 에 이르렀다).
추가의 구현예에서, 상기 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포는 또한 골 시알로단백질 (BSP) 를 발현할 수 있다 (특정 반정량적 RT-PCR 실험에서 세포는 약한 ~ 중간 수준의 BSP 를 발현하였다).
상기 본원에서 특징화되는 바와 같은 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 집단은 특히 고 증식 속도 및 저 HLA-DR 발현과 같은 우수한 특성을 나타내고, 상기 세포 및 세포 집단은 환자 골 조직 내 예방적 또는 치료적 이식에 적합하다.
따라서, 하나의 양상에서 본 발명은, 골-관련 질환 (예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 열거된 것들과 같은) 의 치료법에 사용하기 위한 및/또는 이를 치료하는데 사용하기 위한 상기 본원에서 특징화되는 바와 같은 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단, 및 골-관련 질환의 치료용 의약의 제조에 있어서의 이러한 세포 또는 세포 집단의 용도에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 상기 본원에서 특징화되는 바와 같은 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하고 뼈 병반 부위에 투여하기에 적합한 약학 조성물에 관한 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명은 또한 상기 본원에서 특징화되는 바와 같은 인간 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 또는 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을, 상기 대상에, 예를 들어, 수술 또는 골절과 같은 뼈 병반 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서의 골 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
3. 본 발명의 세포 및 집단과 관련된 양상
하기 설명은 상기 섹션 1 에 기재되어 있는 방법에 의해 수득된 또는 수득가능한, 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 및 이러한 세포를 포함하는 집단; 또는 상기 섹션 2 에 특징화되어 있는 바와 같은 골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포, 및 이러한 세포를 포함하는 세포 집단을 포함하는 상기 언급된 양상 및 추가의 양상에 관한 것이다.
설명된 바와 같이, 본 발명의 세포 또는 세포 집단은 수술 또는 골절 부위에서 인간 대상의 뼈 내에 도입될 수 있다. 본 발명의 골모세포를 뼈에 도입하는 것은 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에 열거된 것들과 같은 뼈 골절 및 골-관련 질환의 치료에 유용하다.
하나의 구현예에서, 골모세포성 세포는 분화된 골모세포가 도입되는 대상의 BMSC 또는 MSC 로부터 수득될 수 있다 (즉, 자가형 세포). 특히 본원에서 본 세포에 의한 저 HLA-DR 발현으로 인해 이용가능할 수 있는 또다른 옵션에서, 골모세포성 세포는 분화된 골모세포가 도입되는 인간 대상 이외의 하나 이상의 인간 대상의 BMSC 또는 MSC 로부터 수득될 수 있다 (즉, 동종이형 세포). 또다른 구현예에서, 골모세포성 세포는 비-인간 동물, 바람직하게는 비-인간 포유류의 BMSC 또는 MSC 로부터 수득되고 인간 대상에 도입될 수 있다 (즉, 이종 세포).
명시된 바와 같이, 본 발명의 골모세포성 세포는 약학 조성물로서 제형화되고 투여될 수 있다.
이러한 약학 조성물은 본원에 기재된 골모세포성 세포 외에, 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 방부제, 안정화제, 항산화제 또는 당업자에게 잘 알려진 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야만 하고, 세포의 활성을 간섭해서는 안된다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 조성물은 발열원이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다. 의약 제형의 일반적인 원리는, [Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996; and Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000] 를 참조한다.
이러한 약학 조성물은 세포의 생존력을 보장하는 추가의 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 바람직한 pH, 더욱 통상적으로는 중성에 가까운 pH 를 달성하기 위해 적합한 완충제 시스템 (예를 들어, 포스페이트 또는 카르보네이트 완충제 시스템) 을 포함할 수 있고, 삼투압 스트레스를 방지하기 위해 세포의 등장성 조건을 보장하기 위한 충분한 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 목적에 적합한 용액은 당업계에 알려져 있는 인산염-완충 식염수 (PBS), 염화나트륨 용액, 링거 주사액 (Ringer's Injection) 또는 락테이트 링거 주사액 (Lactated Ringer's Injection) 일 수 있다. 또한, 조성물은 세포의 생존력을 증가시킬 수 있는 담체 단백질, 예를 들어 알부민을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 뼈 부상 및 결함을 복구하는데 유용한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 성분에는 제한 없이 뼈 형태형성 단백질, 히드록시아파타이트/트리인산칼슘 입자 (HA/TCP), 젤라틴, 폴리-락트산, 폴리-락트 글리콜산, 히알루론산, 키토산, 폴리-L-라이신, 및 콜라겐이 포함될 수 있다. 예를 들어, 골모세포성 세포는 합성 골발생 (그 자체만의 뼈 형성) 뿐 아니라 골유도를 일으키기 위해 탈광화된 뼈 매트릭스 (DBM) 또는 기타 매트릭스와 조합될 수 있다. 동종이형 DBM 와 함께 자가형 골수 세포를 사용하는 유사한 방법이 양호한 결과를 산출하였다 (Connolly et al. 1995. Clin Orthop 313: 8-18).
약학 조성물은 보조적 생물활성 인자, 예컨대 뼈 형태형성 단백질, 예컨대 BMP-2, BMP-7 또는 BMP-4, 또는 임의의 기타 성장 인자를 추가로 포함하거나 이들과 공동-투여될 수 있다. 기타 잠재적인 동반 성분에는 뼈 재생을 돕는데 적합한 칼슘 또는 포스페이트의 무기 공급원이 포함된다 (WO 00/07639). 바람직한 경우, 세포 제제는 개선된 조직 재생을 제공하기 위해 담체 매트릭스 또는 물질 상에 투여될 수 있다. 예를 들어, 물질은 과립 세라믹, 또는 생중합체, 예컨대 겔라틴, 콜라겐, 오스테오넥틴, 피브리노겐 또는 오스테오칼신일 수 있다. 다공성 매트릭스는 표준 기술에 따라 합성될 수 있다 (예를 들어, Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997).
대안적으로는 또는 부가적으로는, BMSC 또는 MSC 세포 또는 본 발명의 수득되는 골모세포성 세포 또는 세포 집단은 대상의 뼈 병반, 예를 들어 수술 또는 골절 부위 내로 도입 전에 관심의 핵산으로 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다. 관심의 핵산 서열에는 골모세포의 성장, 분화 및/또는 광화작용을 향상시키는 유전 산물을 인코딩하는 서열이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, BMP-2 에 대한 발현 시스템은, 비-치유 골절 또는 골다공증의 치료 목적을 위해 안정적 또는 일시적 방식으로 BMSC 또는 MSC 내에 도입될 수 있다. BMSC 또는 MSC 및 골모세포의 형질전환 방법은 당업자에게 알려져 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 본 발명의 세포를 상기 하나 이상의 부가적인 성분과 혼합하는 상기 약학 조성물의 제조 방법을 포함한다.
추가의 양상에서, 본 발명은 뼈 병반 부위에 조성물의 투여를 위한 외과적 기구를 포함하고 본 발명의 골모세포성 세포 또는 세포 집단, 또는 상기 세포 또는 세포 집단을 포함하는 약학 조성물을 추가로 포함하는 배열물로서, 뼈 병반 부위에 약학 조성물의 투여를 위해 조정되는 배열물에 관한 것이다. 예를 들어, 적합한 외과적 기구는 뼈 병반 부위에 본 발명의 세포를 포함하는 액체 조성물을 주입할 수 있다.
골조상세포, 골모세포 또는 골모세포 표현형 세포 또는 세포 집단은 의도되는 조직 부위로 이식 또는 이동하고 기능적으로 결손된 영역을 재구성 또는 재생하도록 하는 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 투여는 복구되는 근골격 부위에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 골발생은 조직 재건 또는 스필릿, 또는 고관절 대체물과 같은 보철물 장치의 삽입을 위한 수술 절차에 따라 용이할 수 있다. 다른 경우에는, 외과적 수술이 필요하지 않다면, 조성물은 주사에 의해 또는 (예를 들어, 척주 복구를 위해) 조작 내시경을 사용하여 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 약학 세포 제제는 액체 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포 또는 이들을 포함하는 약학 조성물은 전신적으로, 국소적으로 또는 병반 부위에 투여될 수 있다.
또다른 구현예에서, 골모세포성 세포 또는 세포 집단은 이식물을 제공하기에 적합한 기질로 이동되고/되거나 상기 기질 상에 배양될 수 있다. 세포가 적용되고 배양될 수 있는 기질은 티타늄, 코발트/크롬 합금 또는 스테인레스 스틸과 같은 금속, 인산칼슘과 같은 생물활성 표면, 폴리에틸렌과 같은 중합체 표면 등일 수 있다. 덜 바람직하긴 하지만, 유리 세라믹과 같은 규산 물질도 기질로서 사용될 수 있다. 가장 바람직한 것은 티타늄과 같은 금속, 및 인산칼슘이다 (비록 인산칼슘이 기질의 필수적인 성분은 아니지만). 기질은 다공성 또는 비-다공성일 수 있다.
예를 들어, 증식되는 세포, 또는 배양 접시에서 분화되는 세포는, 필요하다면 본 발명의 액체 영양 배지 내에서 고체 지지체를 인큐베이션함으로써 분화 과정을 증대 및/또는 지속시키기 위해 3 차원 고체 지지체 상으로 이동될 수 있다. 세포는 상기 세포를 함유하는 액체 현탁액으로 3 차원 고체 지지체를 함침함으로써, 3 차원 고체 지지체 상으로 이동될 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 함침된 지지체를 인간 대상에게 이식할 수 있다. 이러한 함침된 지지체는 또한 최종적으로 이식되기 전에, 액체 배양 배지에 지지체를 담금으로써 재배양될 수 있다.
3 차원 고체 지지체는 인간에게 이식될 수 있게 하기 위해 생체적합성일 필요가 있다. 이것은 실린더, 구형, 플레이트 또는 임의의 형상의 일부와 같은 임의의 적합한 형상일 수 있다. 생체적합성 3 차원 고체 지지체로서 적합한 물질 중에서, 특히 탄산칼슘, 특히 아라고나이트, 구체적으로는 산호 뼈대의 형태, 알루미나 기재, 지르코니아 기재, 트리인산칼슘 및/또는 히드록시아파타이트 기재 다공성 세라믹, 탄산칼슘을 히드록시아파타이트로 전환되게 할 수 있는 열수 교환에 의해 수득된 모조 산호 뼈대, 또는 그 밖의 아파타이트-규회석 유리 세라믹, Bioglass(TM) 유리와 같은 생물활성 유리 세라믹이 언급될 수 있다.
상기 양상 및 구현예는 하기의 비제한적 실시예에 의해 더욱 뒷받침된다.
실시예
실험 절차
세포 배양 및 혈장 조제
골질환을 앓고 있는 환자 또는 건강한 지원자의 장골능선으로부터 20 내지 60 ml 의 헤파린화된 골수 (BM) 를 채취하였다. BM 을 인산염-완충 식염수 (PBS, 2v:v) 와 혼합하고, 밀도 구배 Ficoll 용액 상에 쌓아두었다. 원심분리후, 경계면으로부터 단핵 세포를 수확하고, PBS 에서 2 회 세척하였다. 동시에, 건조된 튜브 내로 채혈된 혈액 160 ml 을 원심분리한 후 환자 또는 건강한 지원자로부터 혈청을 수득하였다. 세포를 동종이형 혈장 15% (자가형 혈장은 실질적으로 동일한 결과로 사용될 수 있음), FGF2 10 ng/ml 및 TGFb-1 10 ng/ml 이 보충된 DMEM 배지에 재현탁하였다. 세포를 1×108 세포/175㎠ 플라스크로 플레이팅하고, 5% CO2 함유 37℃ 습윤 분위기에서 유지시켰다. 세포를 초기 배지 교환 전에 1 일 동안 부착되도록 두었다. 제 7 일 및 제 11 일에 2 가지 다른 일부 배지를 교환하였다 (부피 절반 교환). 트립신/EDTA 용액을 1 ~ 5 분 동안 37℃ 에서 사용하여 제 14 일에 세포를 떼어냈다. 세포를 계수하고 또다른 1 주일 배양을 위해 1×105 세포/175㎠ 로 플레이팅하였다.
표현형 분석
세포내 및 세포 표면 마커를 상이한 시점에 (제 14 일 및 제 21 일) 유세포 분석에 의해 분석하였다. 세포 표면 마커의 경우: 세포를 하기 공액된 모노클론 항체: 항-CD45, CD90, CD105, CD73, CD166, CD63, CD14, CD19, HLA-ABC, HLA-DR, CD28, CD80, CD86 및 CTLA-4 와 15 분 동안 인큐베이션한 다음 PBS 로 세척한 후, 원심분리하고, 0.3 ml PBS 에 재현탁시켰다. 세포내 마커 (OCN 및 ALP) 의 경우, 삼투 키트를 사용하고 특이적 항 ALP 공액된 모노클론 항체를 제조사 프로토콜 (Analis) 에 따라 사용하였다. 그 다음 세포를 PBS 로 세척한 후, 0.3 ml PBS 에 재현탁시켰다.
ALP 검정법
pNPP (p-니트로페닐 포스페이트) 의 가수분해에 기초한 생화학적 검정법에 의해 알칼리 포스파타아제 효소 활성을 측정하였다. pNPP 가 ALP 에 의해 탈인산화되면, 이것은 황색으로 변하고, 분광광도계에 위해 410 nm 에서 검출될 수 있다. 세포의 ALP 효소 활성은 정제된 소 창자 알칼리 포스파타아제 활성에 기초한 표준 곡선에 대해 제 21 일에 측정하였다. ALP 활성은 ALP (Unit)/단백질 mg 으로 기록한다. 1 unit 의 ALP 는 37℃ 에서 1 분 내에 1 μmol 의 pNPP 를 가수분해한다.
광화작용 검정법
배양물에 골발생 배지를 첨가하여 세포 광화작용 잠재성 유도를 평가하였다. 제 14 일에, 5,700 골형성 세포/㎠ 를, 0.1 μM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산 및 3 mM 글리세롤 포스페이트가 보충된 혈장의 존재하에서 6 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 배양 2 주 후, 세포를 3.7% 포름알데히드/PBS 로 고정시키고 알리자린 레드로 염색하였다. 광화작용 점수는 다음과 같이 각 배양물에 제시되었다: 0 = 광화작용 없음, 1 = 광화작용 지속 및 2 = 광화작용 완료.
T 세포 증식 검정법
10 ng/ml TGFb-1 이 보충된 또는 보충되지 않은 개체 A (PREOBa) 로부터의 2,000 내지 20,000 전-골모세포성 세포/ml 를 개체 B (PBMCb) 로부터의 200,000 T 세포/ml 과 공동배양하였다. 농도가 10μg/ml 인 파이토헤마글루타닌 (PHA) 을 T 세포 증식의 양성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 24 웰 마이크로타이터 플레이트에서 7 일 동안 배양시키고, 3H-티미딘으로 배양 기간의 마지막 18 시간 동안 펄스하여 T 세포 증식을 측정하였다. 세포를 빙냉 PBS 로 2 회, 빙냉 5% 트리클로로아세트산 (TCA) 으로 2 회 세척하였다. 마지막으로, 세포를 0.1 N NaOH 및 0.1% Triton-X100 함유 용액으로 용해시켰다. 상청액을 수확하고 섬광 액체와 혼합하여 베타-카운터로 분석하였다.
결과
혈장 및 TGF 대 혈장 및 TGF/FGF2
먼저 15% 동종이형 혈장 함유 배지에 첨가된 단독 성장 인자로서 TGFb-1 위 효과를 시험하였다. 도 1 에서 제시되는 바와 같이, 오직 TGFB-1 만으로의 1 차 배양은 적합한 양의 세포가 증식되는 데는 실패하였다: 게다가, TGFb-1 단독만을 함유하는 플라스크보다 FGF2 및 TGFb-1 을 모두 함유하는 배지 플라스크로부터 수확된 세포가 거의 20 배 많았다 (p = 0.0317, 양쪽-꼬리 Mann Whitney 검정).
혈장 및 FGF 대 혈장 및 TGF/FGF2
10 ng/ml TGFb-1 이 보충되거나 보충되지 않은 동종이형 혈장 및 FGF2 함유 배지에서 15 명의 환자로부터의 골모세포의 증식 속도를 평가하였다 (도 2). 하기 실험은 TGFb-1 이 보충된 혈장에서 배양된 세포의 평균 증식 수율이 1 차 (1.07x), 2 차 (2.5x) 및 전반적인 (3.08x) 배양물 모두에서 TGFb-1 없이 배양된 세포의 수율보다 크게 우세하다는 것을 보여주었다 (표 1).
표 1: FGF2 및 FGF2/TGFb-1 과 함께 배양된 세포의 배양 수율
Figure 112016029149769-pat00001
게다가, TGFb-1 과 함께 배양된 세포의 증식 속도는 표 2 에서 제시되는 바와 같이 TGF 의 부재하에서 배양된 세포에 비해 장기간 동안 유지되었다. 오직 FGF 로만 배양된 세포는 대략 4 계대 후에 증식이 중단되었던 반면, FGF2 및 TGFb-1 모두의 존재하에서 배양된 세포는 7 계대까지 증식이 지속되었다. 이것은 800 배 이상의 증식 증가로 해석된다 (857.1).
표 2: FGF2 및 FGF2/TGFb-1 과 함께 배양된 세포의 누적 수율 (%)
Figure 112016029149769-pat00002
세포 표현형
유세포 분석으로, FGF2 및 TGFb-1 이 모두 보충된 배지에서 수득된 세포의 표현형이 TGFb-1 이 없이 배양된 세포의 표현형과 대부분의 마커에 대해 유사하였음을 밝혔다. 두 세포 유형은 CD90, CD105, CD73, CD63 CD166 및 ALP 를 발현하였으나, CD45, CD14 또는 CD19 의 발현은 관찰되지 않았다 (표 3). FGF2/TGFb-1 배양 조건에서의 ALP 발현이 FGF2 단독 조건과 비교하여 감소하였다 (각각 42.2% 대. 73.6%).
또한, TGFb-1 로 인큐베이션된 세포는 상기 인자 없이 배양된 세포에 비해 높은 수준의 HLA-ABC (HLA-I), 그러나 낮은 수준의 HLA-DR 을 발현하였다. 게다가, 시험된 모든 동시 자극성 분자 (CD80, CD86, CD28, CD40L 및 CTLA-4) 는 TGFb-1 처리된 세포에서 무시할 정도의 양으로 발현되었다 (표 3).
표 3: 10 ng/ml TGFb-1 이 보충된 또는 보충되지 않은 배지에서 배양된 골모세포의 표현형 마커 (FACS 에 의해 양성으로 간주되는 세포의 %).
Figure 112016029149769-pat00003
ALP 효소 활성:
색도 검정법으로 세포의 ALP 효소 활성을 평가하였고, TGFb-1 과 함께 배양된 세포가 상기 성장 인자 없이 배양된 세포에 비해 낮은 ALP 활성을 갖는다는 것을 보여준다 (표 4). 이러한 결과는 FACS 에 의해 측정된 ALP 발현과 강한 상관관계를 갖는다.
표 4: 계대 2 에서 FGF2 및 FGF2/TGFb-1 과 함께 배양된 세포에 대한 ALP 활성, ALP 발현 및 평균 형광 강도 (MIF)
Figure 112016029149769-pat00004
광화작용:
비교적 적은 ALP 발현으로도, FGF2/TGFb-1 과 함께 배양된 세포는 오직 FGF2 와 함께 배양된 세포와 동일한 생물학적 활성 (광화작용) 을 나타내는 것으로 나타났다. 이것은 광화작용에 의해 측정되었다.
FGF2 (A) 또는 FGF2/TGFb-1 (B) 의 존재하에서 배양된 세포의 광화작용은 동일하였다 (65% 초과의 광화작용화된 웰 표면 - 도 3). 유사하게, FGF2 에서 배양된 세포의 평균 광화작용 점수 (1.75) 는 최대 2 로, FGF2/TGFb-1 에서 배양된 세포의 점수 (1.83) 와 중복되었다.
T 세포 증식
TGFb-1 의 존재하에서 배양된 뼈 형성 세포가 동종이형 T 세포에 의한 증식 반응을 유도하는지의 여부를 측정하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 뼈 형성 세포의 수를 증가시키면서 (2,000 ~ 20,000/ml) 배양하였다. 표 5 및 도 4 에서 제시되는 바와 같이, FGF2/TGFb-1 생성 골모세포는 PBMC 의 동종이형 반응을 유도하지 않았고 (좌측) 또한 PHA 자극 PBMC 의 증식 억제를 90% 까지 유도할 수 있었다.
표 5. T 세포 증식에 대한 골모세포의 억제 효과 (값은 PHA/PBMC 증식 백분율로서 제시됨).
Figure 112016029149769-pat00005
결론
면역특권화 BMSC 또는 MSC 유래 뼈-형성 세포를 빠르고 유의하게 증식시키는 방법을 개발하기 위해서, TGFB 의 효능을 세포 성장 및 특성에 대해 평가하였다.
놀랍게도, TGFb 및 혈장 단독으로의 배양 조건은 MSC 를 뼈 형성 세포로 증식 및 분화시킬 수 없었으나, FGF2 와의 조합은 매우 유의한 증식 및 분화 효과를 갖는다 (혈청/FGF 단독에 비해 12 배까지의 증식). 게다가, TGFb 의 존재하에서 배양된 세포의 표현형 상태는 간질 및 조혈 마커에 대해 불변한 채로 남아있었으며, 오직 ALP 발현만이 약간 감소하였으나, 이것은 세포의 생물학적 활성에는 영향을 주지 않았다.
흥미롭게도, TGFb 조건하에서의 HLA-DR 발현은 골 세포 상에서 매우 낮은/미검출 수준으로 존재하였다. 또한, 혈장/FGF 조건으로 TGFb 의 존재하에서 배양된 세포가 동종이형 반응을 유도하지 않으므로 면역특권화되는 혼합 백혈구 반응에서는, 그러므로 동종이형 이식의 경우 면역 거부를 일으키지 않을 것이다. 최종적으로 TGFb 의 존재하에서 성장하는 세포가 그들의 생물학적 기능을 유지하는 것을 보여주었다.
TGFb 가 보충된 배지를 사용하는 것이, BMSC 또는 MSC 가 세포 표현형의 변화 없이 골모세포성 세포로 증식되기 위해서는 TGFb 가 없는 배양 조건보다 우수하다는 결론을 낼 수 있다.
추가의 예에서, 상기 기재된 실험 절차는 FGF2 이외의 FGF 인자 (예를 들어, FGF-1 또는 FGF-3) 및/또는 TGFb-1 이외의 TGF 인자 (예를 들어, TGFb-2 또는 TGFb-3) 를 사용하는 실질적으로 동일한 또는 유사한 방식으로 실시되어, 필적할만한 결과 및/또는 효과를 제공한다.

Claims (20)

  1. 성인 골수 줄기 세포 (BMSC) 또는 성인 간엽 줄기 세포 (MSC) 를 인간 혈장 또는 혈청, 및 유일한 외생적 성장인자로서 섬유모세포 성장 인자-2 (FGF-2) 및 형질전환 성장 인자 베타-1 (TGFB-1) 와 접촉시키는 것을 포함하는, 성인 골수 줄기 세포 (BMSC) 또는 성인 간엽 줄기 세포 (MSC) 로부터 시험관 내 또는 체외에서 면역특권화 골조상세포 또는 골모세포를 수득하는 방법으로서, 상기 골조상세포 또는 골모세포의 15% 미만이 HLA-DR 을 발현하는 것인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
    (a) BMSC 또는 MSC 를 포함하는 인간 대상의 생물학적 샘플로부터 세포를 회수하는 단계;
    (c) 회수된 세포를 인간 혈장 또는 혈청, FGF-2 및 TGFB-1 를 포함하는 배지에 첨가하고, 세포-배지 혼합물을 배양하는 단계;
    (d) 비부착 물질을 제거하고, 부착 세포를 상기 단계 (c) 에서 정의된 배지에서 추가로 배양하여, 골조상세포 또는 골모세포를 수득하는 단계.
  3. 제 2 항에 있어서, 함께 취합된 단계 (c) 및 단계 (d) 에서 세포를 7 내지 18 일의 기간 동안 배양하는 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 단계 (d) 에서 수득된 세포를 수집하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 (c) 에서 정의된 배지에서 단계 (d) 로부터의 세포를 계대하고 추가로 배양하는 단계 (e) 를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 세포를 상기 단계 (e) 에서 3 내지 12 일의 기간 동안 배양하는 방법.
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  17. 제 2 항에 있어서, (a) 단계와 (c) 단계 사이에,
    (b) 단계(a) 에서 회수된 세포로부터 단핵 세포를 단리하는 단계;
    를 추가로 포함하는 방법.
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