JP2022502034A - ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法および使用 - Google Patents

ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法および使用 Download PDF

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Abstract

本願は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４および／またはＣＤ１０の使用を提供する。本願はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、Ｄ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０および／もしくはＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、ならびに／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５および／もしくはＣＤ４４の量を測定することを含んでなる方法を提供する。本発明はまた、軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するために対象を選択するための方法であって、対象の生体サンプルからＭＳＣを回収すること；そのＭＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を得ること；本明細書に開示されるような方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定すること；およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有すれば、軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するためにその対象を選択することを含んでなる方法を提供する。

Description

本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法および使用に関する。より詳しくは、本発明は、１以上の細胞マーカーを測定することを含んでなる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法および使用に関する。
骨分化へ運命決定された細胞の、または骨形成能を有する細胞の骨分化を遂行し得る幹細胞の移植は、特に、その治療が新たな骨組織の産生を必要とする場合に骨関連疾患の治療のための有望な手段である。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、これまでに骨障害を治療するために使用されてきた(Gangji et al.、2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42)。しかしながら、このような比較的未分化の幹細胞は移植可能であるものの、それらは骨芽細胞系譜に運命決定されておらず、骨組織の形成への寄与は主としてパラ分泌効果により媒介される可能性がある。さらに、治療用として対象から得ることができるＭＳＣの量は満足できないものである場合が多い。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＳＣを拡大培養し、ＭＳＣから骨前駆細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞を得るためのいくつかの方法が開発されている。このような方法により得られた細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて様々な程度の骨形成能を有し得る。結果として、このような細胞の移植時にｉｎ ｖｉｖｏで産生される新たな骨組織の量は常に予測できるわけではなく、臨床目的に対して最適でない場合もある。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化 ＭＳＣ由来細胞などのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞の移植前に、その細胞が臨床上有用な骨形成能を有するかどうかを決定する必要がある。
発明の概要
本発明の特定の代表的実施形態を示す実験の節によって確証されるように、本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来細胞などのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能が、前記細胞の特定の細胞表面マーカー発現プロフィールを決定することにより評価され得ることを認めた。より詳しくは、本発明者らは、細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、ならびにＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちのいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量を測定することにより、骨形成能、より詳しくは、その細胞を臨床現場に有用なものとする骨形成能を決定することができることを見出した。さらに、本発明者らはまた、本明細書に開示されるようなＭＳＣ由来細胞の骨形成能を決定するための方法を用い、ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞を調製するためのＭＳＣのドナーとして特に好適な対象を選択することができることを見出した。
よって、１つの側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の使用を提供する。
好ましくは、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０の使用を提供する。
さらなる側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちのいずれか１以上の量を測定することを含んでなる方法を提供する。
好ましくは、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、ならびに／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちのいずれか１以上の量を測定することを含んでなる方法を提供する。
さらなる側面において、本発明は、軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するために対象を選択するための方法であって、
対象の生体サンプルからＭＳＣを回収すること；
前記ＭＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を得ること；
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を本明細書において教示されるような方法により決定すること；および
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有すれば、軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するために前記対象を選択すること
を含んでなる方法を提供する。
本発明のこれらおよびさらなる側面および好ましい実施形態を以下の節および添付の特許請求の範囲に記載する。添付の特許請求の範囲の主題は、これにより本明細書に具体的に組み込まれる。
図１は、賦形剤単独（対照条件）、ＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１を用いて形成）またはＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成）の投与２週間後の、マウスおよびヒトカルシウム結合蛍光色素を証拠とするマウス骨頭蓋冠冠状切片上の骨新形成を示す。 図２は、賦形剤単独（陰性対照）、ＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１を用いて形成）またはＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成）の投与２週間に、マウス頭蓋冠冠状切片に対して行った骨形成（％）の定量を示す。 図３は、ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成）の投与２週間後に、マウス骨頭蓋冠冠状切片に対して行った抗マウスおよび抗ヒトＩ型コラーゲン二重免疫染色（免疫蛍光）を示す。図３ａは抗ヒトおよび抗マウスＩ型コラーゲン二重免疫染色（マージ）を示し、図３ｂおよび３ｃはそれぞれ抗ヒトおよび抗マウスＩ型コラーゲン免疫染色を示す。 図４は、賦形剤単独、ＭＳＣ、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１を用いて形成したＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ｂ−ｆ細胞Ａ）、またはＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成したＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与２週間後のマウス骨頭蓋冠冠状切片の組織染色を示す。（Ａ）骨新形成（矢印）を明らかにし、骨形成の動態を評価するために、カルシウム結合蛍光色素を順次腹腔内注射し（アリザリンレッド→カルセイングリーン→カルセインブルー→テトラサイクリン）；（Ｂ）免疫蛍光（ＩＦ）ヒト＋マウスＩ型コラーゲン；（Ｃ）ＩＦマウスＩ型コラーゲン；（Ｄ）ＩＦヒトＩ型コラーゲン。骨基質により分泌されるヒトおよびマウスＩ型コラーゲンの検出を可能とするために、抗ヒトおよび抗マウスＩ型コラーゲン二重免疫蛍光を行い；（Ｅ）ＡＬＰ＋ゴールドナー染色：ＡＬＰ：黒（実践および領域）で骨芽細胞活性の検出、マッソントリクロームゴールドナー：黒い点線で類骨（非石灰化骨組織）検出、濃いグレーの線で石灰化した骨；（Ｆ）酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）：濃いグレー／黒で破骨細胞活性の検出。 図５は、賦形剤単独；ＭＳＣ；ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１を用いて形成したＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ｂ−ｆ細胞Ａ）；またはＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成したＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与２週間後のマウス骨頭蓋冠冠状切片に対する骨新形成を示す写真である。骨新形成は、蛍光（種々の蛍光色素：アリザリンレッド→カルセイングリーン→カルセインブルー→テトラサイクリンイエローの連続的組み込みにより標識）を証拠とする。赤、緑および青染色は薄いグレーで示し、骨新形成厚は二重矢印で示す。黄色染色は点線で囲まれている。 図６は、ＭＳＣ（濃いグレー）または骨形成細胞Ｂ（薄いグレー）の投与２週間後にマウス頭蓋冠切片で測定された新たに形成した骨の総表面積を示すグラフを表す（平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５）。 図７は、骨形成細胞Ｂの投与１日後（Ｄ１）および経時的に（Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１）投与２８日後（Ｄ２８）までの、マウス骨頭蓋冠矢状切片に対して行った石灰化結節の軟骨基質のサフラニンオレンジ染色を示す（破線で囲まれている）。 図８は、分節大腿骨未臨界サイズ欠損モデル中、ＭＳＣ由来細胞の効果を示す。（Ａ）は、外科手術／品目投与当日（Ｄ０）および賦形剤単独、骨形成細胞Ａ（ｂ−ｆ細胞Ａ）または骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与後、経時的に（１、２、３、４、５週間）６週間（６Ｗ）までのＸ線像に対する欠損サイズの測定を示すグラフを表し；平均±ＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；（Ｂ）は、Ｄ０および賦形剤単独または骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与後６Ｗの分節大腿骨欠損の代表的Ｘ線像を表し；（Ｃ）は、賦形剤単独（ｎ＝７）および骨形成細胞Ｂ（ｎ＝８）の投与後６Ｗの、マイクロコンピューター断層撮影法（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）分析による骨修復の体積測定を示すグラフを表す；平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５。 図９は、実施例５で用いたフローサイトメトリーゲート設定計画を示す。 図１０は、それぞれＭＳＣ、骨形成細胞Ａ、ＢおよびＣにおいてフローサイトメトリーにより分析されたＣＤ７３（上のパネル）およびＣＤ４４（下のパネル）発現レベルを示す（ＭＳＣ、骨形成細胞Ａ、ＢおよびＣそれぞれについて、Ｎ＝１２、６、２２、１５（ＣＤ７３）およびＮ＝２２、８、２２、１８（ＣＤ４４）ここで、Ｎは、各実験の数を表す）。 図１１は、Ｘ線分析により評価された骨誘導および骨形成を示す。Ａ：骨誘導（Ａ、左のパネル）は、骨の不透明度、従って、骨の厚さと直接相関があるグレー強度値を測定することにより評価される。骨形成（Ａ、右のパネル）は、Ｘ線撮像によってより屈折して見える結節の表面を測定することにより評価される。Ｂ：骨の不透明度は、賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）で有意に高い（ｎ＝２０（賦形剤）およびｎ＝３４（５つの異なるバッチからのＢ−Ｆ細胞Ｃ）。Ｃ：骨形成の表面は、石灰化した結節が見られなかった賦形剤に比べて有意に高い（ｎ＝２０（賦形剤）およびｎ＝３４（５つの異なるバッチからのＢ−Ｆ細胞Ｃ）。Ｄ〜Ｅ：骨形成（絶対的骨形成により表される）を伴う骨誘導（図８Ｄ）または伴わない骨誘導（図８Ｅ）は賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）で有意に高い。マン・ホイットニーのＵ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｆ：骨誘導活性に加えて、骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）は、４／５の骨髄ドナー（またはバッチ生産）および６５％のマウスにおける少なくとも１つの石灰化した結節の存在により示される、高い骨形成活性を促進する（ｎ＝２０（賦形剤）およびｎ＝３４（５つの異なるバッチからのＢ−Ｆ細胞Ｃ）。 図１２は、骨形成細胞Ｃ凍結保存品または賦形剤の単回投与の４週間後の冠状組織切片を示す。骨形成細胞Ｃ凍結保存品は、以下の２つの機序により活性を示す：（ｉ）「骨誘導」：膜内骨化をもたらす、パラ分泌による宿主骨形成の刺激および（ｉｉ）「骨形成」：軟骨内骨化による「直接的」骨形成（ドナー由来／ヒト起源）の促進。 図１３は、骨形成細胞Ｃ凍結保存品の単回注射を受けてから４週間後のマウス頭蓋冠の組織学的分析を示す。骨形成細胞Ｃ凍結保存品は、骨誘導および骨形成特性（「ｆｌｕｏ」）を示した。石灰化した結節においてヒト骨形成（「ヒトＩ型コラーゲン」）が強調された（骨形成）。骨芽細胞活性（３つ目のパネルに黒い矢印で示される「ＡＬＰ」）および破骨細胞活性（４つ目のパネルに黒い矢印で示される「ＴＲＡＰ」）はほとんどが石灰化した結節において検出され、結節における骨リモデリングプロセスが投与４週間後になお進行していることを示す。類骨（「ゴールドナーのマッソントリクローム染色」）は強調されず、骨形成プロセスが完了していることを示す。 図１４は、分節大腿骨未臨界サイズ欠損モデル(segmental femoral sub-critical size defect model)における骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）の効果を示す。Ｘ線画像は、賦形剤単独または骨形成細胞Ｃ凍結保存品の投与の０日目から１０週後までの分節大腿欠損を示す。 図１５は、分節大腿骨未臨界サイズ欠損モデル（ｓｕｂ−ＣＳＤモデル）における骨形成細胞Ｃ凍結保存品の効果を示す。このグラフは、外科手術／品目投与（「Ｗ０」）当日および賦形剤単独、または骨形成細胞Ｃ凍結保存品（「Ｂ−Ｆ細胞Ｃ」）の投与１０週後（「Ｗ１０」）までの経時的なＸ線像における骨修復のパーセンテージを表す；平均±ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１（２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ）。 図１６は、分節大腿骨未臨界サイズ欠損モデル（ｓｕｂ−ＣＳＤモデル）における骨形成細胞Ｃ凍結保存品の効果を示す。このグラフは、外科手術／品目投与の当日（「Ｗ０」）および賦形剤単独、または骨形成細胞Ｃ凍結保存品（Ｂ−Ｆ細胞Ｃ）の投与１０週後（「Ｗ１０」）までの経時的なＸ線像から決定されたＲＵＳスコアを表す；平均±ＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（２元配置反復測定ＡＮＯＶＡ）。
発明の詳細な説明
本明細書で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が別段のことを明らかに示さない限り、単数の指示対象および複数の指示対象の両方を含む。
用語「を含んでなる(“comprising”, “comprises” and “comprised of”)」は、本明細書で使用する場合、「含む(“including”, “includes”)」または「含有する(“containing”, “contains”)」と同義であり、包含またはオープンエンドを示し、列挙されていない付加的なメンバー、要素または方法工程を排除しない。これらの用語はまた、特許技術用語において十分に確立された意味を有する「からなる」および「から本質的になる」も包含する。
端点による数の範囲の列挙は、各範囲内に包含される総ての数および分数、ならびに列挙される端点を含む。
用語「約」または「およそ」は、パラメーター、量、時間などの測定可能な値に関して本明細書で使用する場合、指定の値の、また、指定の値からの変動、例えば、指定の値の、また、指定の値からの±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動を包含することを意味する。修飾語「約」が指す値それ自体も具体的かつ好ましく開示されていることが理解されるべきである。
用語「１以上の」または「少なくとも１つの」、例えば、メンバーの群の１以上のメンバーまたは少なくとも１つのメンバーはそれ自体、さらなる例示により明らかになるが、この用語は、とりわけ、前記メンバーのいずれか１つ、または前記メンバーのいずれか２つ以上、例えば、前記メンバーのいずれか≧３、≧４、≧５、≧６または≧７など、および前記メンバーの最大総ての言及を包含する。別の例において、「１以上の」または「少なくとも１つの」は、１、２、３、４、５、６、７またはそれを超えるものを指し得る。
本明細書において本発明の背景の記述は、本発明の内容を説明するために含まれる。これは、言及される材料のいずれかが特許請求の範囲のいずれの優先日を基点としていずれかの国で公開されていた、公知であった、または共通の一般知識の一部であったことを認めるものではない。
本開示中に、種々の刊行物、特許および公開特許明細書が特定可能な引用により参照される。本明細書に引用される総ての文献はそれらの全内容が本明細書の一部として援用される。特に、本明細書において具体的に参照されるこのような文献の教示または節は本明細書の一部として援用される。
別段の定義がない限り、本発明の開示に使用される総ての用語は、技術用語および科学用語を含め、本発明が属する技術分野の熟練者により共通に理解されているものと同様の意味を有する。さらなる指針によって、用語の定義は本発明の教示をより良く理解するために含まれる。特定の用語が本発明の特定の側面または本発明の特定の実施形態に関して定義される場合、このような内包は、別段の定義がない限り、本明細書全体、すなわち、本発明の他の側面または実施形態に関しても当てはまるものとする。
後段で、本発明の異なる側面または実施形態をさらに詳しく定義する。このように定義される各側面または実施形態は、別段のことが明らかに示されない限り、他のいずれの側面または実施形態と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれの特徴も、好ましいまたは有利であるとして示されるいずれの他の１または複数の特徴と組み合わせてもよい。
本明細書において「１つの実施形態」、「ある実施形態」という場合には、実施形態に関して記載される特定の特徴、構造または特性は本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書の様々な場所で「１つの実施形態において」または「ある実施形態において」という句が見られる場合、必ずしも総てが同じ実施形態に関するとは限らないが、その場合もある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１以上の実施形態において、本開示から当業者には自明であるような好適ないずれの様式で組み合わせてもよい。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが他の特徴は含まないが、当業者により理解されるように、異なる実施形態の特徴の組合せは本発明の範囲内にあることが意味され、異なる実施形態を形成する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態はいずれも、いずれの組合せで使用してもよい。
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するために有用な特定の細胞表面マーカーを具現化した。より詳しくは、本発明者らは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量がｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのマーカーとして使用可能であることを見出した。
本明細書で使用する場合、「ＣＤ７３」、「ＣＤ１０５、「ＣＤ４４」または「ＣＤ１０」という場合には、文脈から明らかであるように、当技術分野で前記表記の下で一般に知られているように、個々のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸を表す。これらの用語には、見出される場合、任意の生物、特に、動物、好ましくは、温血動物、より好ましくは、脊椎動物、さらにより好ましくは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物、さらにより好ましくは、ヒトのこのようなペプチド、ポリペプチド、タンパク質または核酸を包含する。
用語「タンパク質」は、本明細書で使用する場合、一般に、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の１以上のポリペプチド鎖、すなわち、ポリマー鎖を含んでなる高分子を包含する。この用語は、天然の、組換えにより、半合成的にまたは合成的に生産されたタンパク質を包含し得る。この用語はまた、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ユビキチン化、シグナルペプチド除去、Ｎ末端Ｍｅｔ除去、プロ酵素前駆体またはプロホルモンの活性型への変換などの、ポリペプチド鎖の１以上の共発現型または発現後型修飾を有するタンパク質も包含する。この用語はさらにまた、対応する天然タンパク質に対するアミノ酸配列の変化、例えば、アミノ酸欠失、付加および／もしくは置換を有するタンパク質変異体または突然変異体も含む。この用語は、全長タンパク質とタンパク質部分または断片、例えば、このような全長タンパク質のプロセシングから生じる天然タンパク質部分の両方を企図する。
用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、一般に、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマー鎖を包含する。ゆえに、タンパク質が単一のポリペプチド鎖からのみ構成される限り、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書では、このようなタンパク質を表して互換的に使用され得る。この用語は、ポリペプチド鎖のいずれかの最小長に限定されない。この用語は、天然の、組換えにより、半合成的にまたは合成的に生産されたポリペプチドを包含し得る。この用語はまた、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、スルホン化、メチル化、ユビキチン化、シグナルペプチド除去、Ｎ末端Ｍｅｔ除去、プロ酵素前駆体またはプロホルモンの活性型への変換などの、ポリペプチド鎖の１以上の共発現型または発現後型修飾を有するポリペプチドも包含する。この用語はさらにまた、対応する天然ポリペプチドに対するアミノ酸配列の変化、例えば、アミノ酸欠失、付加および／もしくは置換を有するポリペプチド変異体または突然変異体も含む。この用語は、全長ポリペプチドとポリペプチド部分または断片、例えば、このような全長ポリペプチドのプロセシングから生じる天然ポリペプチド部分の両方を企図する。
用語「ペプチド」は、本明細書で使用する場合、好ましくは、本明細書で使用する場合、アミノ酸５０個以下、例えば、アミノ酸４５個以下、好ましくは、アミノ酸４０個以下、例えば、アミノ酸３５個以下、より好ましくは、アミノ酸３０個以下、例えば、アミノ酸２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下または５個以下から本質的になるポリペプチドを指す。
用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、一般に、ヌクレオシド単位から本質的に構成されるいずれの長さのポリマー（好ましくは、直鎖ポリマー）も指す。ヌクレオシド単位は、一般に複素環式塩基および糖基を含む。複素環式塩基は、とりわけ、プリン塩基およびピリミジン塩基、例えば、天然核酸に広まっているアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、その他の天然塩基（例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）ならびに化学的または生化学的に修飾された（例えば、メチル化された）、非天然の、または誘導体化された塩基を含み得る。例示的修飾核酸塩基としては、限定されるものではないが、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。特に、５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を高めることが示されており、例えば、アンチセンス剤における、さらにより詳しくは、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に、好ましい塩基置換であり得る。糖基としては、とりわけ、ペントース（ペントフラノース）基、例えば、好ましくは、天然核酸に一般的なリボースおよび／もしくは２−デオキシリボース、またはアラビノース、２−デオキシアラビノース、トレオースもしくはヘキソース糖基、ならびに修飾または置換糖基（例えば、限定されるものではないが、２’−Ｏ−アルキル化、例えば、２’−Ｏ−メチル化または２’−Ｏ−エチル化糖、例えば、リボース；２’−Ｏ−アルキルオキシアルキル化、例えば、２’−Ｏ−メトキシエチル化糖、例えば、リボース；または２’−Ｏ，４’−Ｃ−アルキレン結合、例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン結合または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン結合糖、例えば、リボース；２’−フルオロ−アラビノースなど）を含み得る。ヌクレオシド単位は、とりわけ、天然核酸に一般的なホスホジエステル結合、およびさらなる修飾リン酸またはホスホン酸に基づく結合、例えば、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、例えば、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、例えば、メチルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、例えば、アルキルホスホトリエステル、ホスホルアミダート、ホスホロピペラジデート、ホスホロモルホリデート、架橋ホスホルアミダート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート；およびさらなるシロキサン、カーボネート、スルファメート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、例えば、３’−Ｎ−カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、３’−チオアセタール、およびスルホンヌクレオシド間結合を含む、多くの既知のヌクレオシド間結合のうちいずれか１つによって互いに連結されてよい。好ましくは、ヌクレオシド間結合は、修飾されたリン酸に基づく結合、例えば、より好ましくは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合またはそれらの組合せを含むリン酸に基づく結合であり得る。用語「核酸」はまた、限定されるものではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノホスホロジアミデート骨格核酸（ＰＭＯ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを伴う骨格セクションを有する核酸（例えば、Kurreck 2003(Eur J Biochem 270:1628-1644) 参照）を含む核酸模倣剤などのポリマーを含有する他の任意の核酸塩基も包含する。「アルキル」は、本明細書で使用する場合、特に、低級炭化水素部分、例えば、Ｃ１−Ｃ４直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和炭化水素、例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル、およびイソプロピルを包含する。核酸は、本明細書で意図する場合、天然ヌクレオシド、修飾ヌクレオシドまたはそれらの混合物を含み得る。修飾ヌクレオシドは、修飾複素環式塩基、修飾糖部分、修飾ヌクレオシド間結合またはそれらの組合せを含み得る。用語「核酸」は、さらに好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子、具体的には、例えば、ｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅産物、オリゴヌクレオチド、および合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを包含する。核酸は、天然の、例えば、天然に存在するまたは天然から単離されたものであり得、組換え型であり得る、すなわち、組換えＤＮＡ技術により生産することができ、および／または部分的もしくは完全に、化学的にもしくは生化学的に合成することができる。「核酸」は、二本鎖、部分的二本鎖、または一本鎖であり得る。一本鎖である場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。加えて、核酸は、環状または直鎖であり得る。
さらなる指針として、ＣＤ７３はまた当技術分野でエクト−５’−ヌクレオチダーゼ、ＮＴ、ｅＮ、ＮＴ５、ＮＴＥ、ｅＮＴ、Ｅ５ＮＴおよびＣＡＬＪＡとしても知られる。ＣＤ７３は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞表面酵素である。例として、ヒトＣＤ７３遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)遺伝子ＩＤ ４９０７として注釈され、ヒトＣＤ７３タンパク質はＵｎｉｐｒｏｔ(www.uniprot.org)に受託番号Ｐ２１５８９．１として注釈されている。ヒトＣＤ７３のｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、以下のＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＤ７３ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００２５２６．３；ＮＭ＿００１２０４８１３．１）、ＣＤ７３タンパク質（ＮＰ＿００２５１７．１；ＮＰ＿００１１９１７４２．１）として注釈されている。
さらなる指針として、ＣＤ１０５はまた当技術分野でエンドグリン（ＥＮＧ）、ＥＮＤ、ＦＬＪ４１７４４、ＨＨＴ１、ＯＲＷおよびＯＲＷ１としても知られる。ＣＤ１０５は、細胞表面に存在するＩ型膜糖タンパク質である。例として、ヒトＣＤ１０５遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ遺伝子ＩＤ ２０２２として注釈され、ヒトＣＤ１０５タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔに受託番号Ｐ１７８１３．２として注釈されている。ヒトＣＤ１０５のｍＲＮＡ配列およびタンパク質配列は、以下のＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＤ１０５（ＮＭ＿００１１１４７５３．２；ＮＭ＿０００１１８．３；ＮＭ＿００１２７８１３８．１）、ＣＤ１０５タンパク質（ＮＰ＿００１１０８２２５．１；ＮＰ＿０００１０９．１；ＮＰ＿００１２６５０６７．１）として注釈されている。さらなる指針として、ＣＤ４４はまた当技術分野でホーミング細胞接着分子（ＨＣＡＭ）、Ｐｇｐ−１（食作用糖タンパク質−１）、Ｈｅｒｍｅｓ抗原、リンパ球ホーミング受容体（ＬＨＲ）、ＥＣＭ−ＩＩＩ、ＨＵＴＣＨ−１、ＩＮ、ＭＣ５６、ＭＤＵ２、ＭＤＵ３、ＭＩＣ４、Ｐｇｐ１、ＣＤＷ４４、ＣＳＰＧ８、ＨＣＥＬＬ、ＨＵＴＣＨ−ＩおよびＥＣＭＲ−ＩＩＩとしても知られる。ＣＤ４４は、細胞−細胞相互作用、細胞間接着および遊走に関与する細胞表面糖タンパク質である。例として、ヒトＣＤ４４遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ遺伝子ＩＤ ９６０として注釈され、ヒトＣＤ４４タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔで受託番号Ｐ１６０７０．３として注釈されている。ヒトＣＤ４４のｍＲＮＡ配列およびタンパク質配列は、以下のＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＤ４４ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００６１０．３、ＮＭ＿００１００１３８９．１、ＮＭ＿００１００１３９０．１、ＮＭ＿００１００１３９１．１、ＮＭ＿００１００１３９２．１、ＮＭ＿００１２０２５５５．１、ＮＭ＿００１２０２５５６．１、ＮＭ＿００１２０２５５７．１）、ＣＤ４４タンパク質（ＮＰ＿０００６０１．３、ＮＰ＿００１００１３８９．１、ＮＰ＿００１００１３９０．１、ＮＰ＿００１００１３９１．１、ＮＰ＿００１１８９４８４．１、ＮＰ＿００１１８９４８４．１、ＮＰ＿００１１８９４８５．１、ＮＰ＿００１１８９４８６．１）として注釈されている。
さらなる指針として、ＣＤ１０はまた当技術分野で膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）、ＮＥＰ、ＳＦＥ、ＣＡＬＬＡ、ＣＭＴ２ＴおよびＳＣＡ４３としても知られる。ＣＤ１０は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。例として、ヒトＣＤ１０遺伝子は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)遺伝子ＩＤ ４３１１として注釈され、ヒトＣＤ１０タンパク質はＵｎｉｐｒｏｔで受託番号Ｐ０８４７３．２として注釈されている。ヒトＣＤ１０のｍＲＮＡ配列およびタンパク質配列は、以下のＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＤ１０ ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００９０２．３、ＮＭ＿００７２８７．２、ＮＭ＿００７２８８．３、ＮＭ＿００７２８９．３、ＮＭ＿００１３５４６４２．１、ＮＭ＿００１３５４６４３．１、ＮＭ＿００１３５４６４４．１）、ＣＤ１０タンパク質（ＮＰ＿０００８９３．２、ＮＰ＿００９２１８．２、ＮＰ＿００９２１９．２、ＮＰ＿００９２２０．２、ＮＰ＿００１３４１５７１．１、ＮＰ＿００１３４１５７２．１、ＮＰ＿００１３４１５７３．１）として注釈されている。読者は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＵｎｉｐｒｏｔエントリーが前駆体ポリペプチドまたはタンパク質の配列を提供する場合、対応する成熟型（例えば、シグナルペプチドを欠く）は、細胞の細胞表面に存在すると考えられることに想到するであろう。
用語「ＣＤ７３」、「ＣＤ１０５」、「ＣＤ４４」および「ＣＤ１０」は、特に、天然配列、すなわち、一次配列が天然に見られるまたは天然に由来するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸と同じである配列を有するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸を包含する。当業者は、天然配列が、このような種の遺伝的発散のために別の種とは異なる場合があることを理解する。さらに、天然配列は、所与の種内での通常の遺伝的多様性（バリエーション）のために、同じ種の異なる個体間または個体内で異なる場合がある。また、天然配列は、体細胞突然変異、または転写後もしくは翻訳後修飾のために、同じ種の異なる個体間または個体内で異なる場合がある。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸のこのような変異体またはアイソフォームはいずれも本明細書で意図される。よって、天然に見られるまたは天然に由来するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸の総ての配列は、「天然」と見なされる。これらの用語は、生細胞の一部を形成する場合のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸を包含する。
第１の側面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の使用を提供する。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうち１つの使用；ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうち２つの使用；およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の３つ総ての使用も提供される。
特定の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）の使用を提供する。
特定の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ４４の使用を提供する。特定の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ４４と、ＣＤ７３およびＣＤ１０５のいずれか一方または両方の使用を提供する。特定の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ４４と、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の使用を提供する。
特定の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ１０の使用を提供する。特定の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ１０と、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の使用を提供する。
用語「骨形成能」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｖｏ、および場合によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞の骨基質分泌細胞へ（転換）分化する能力、または細胞の骨基質を分泌する（すなわち、（転換）分化工程の必要がない）能力を指す。この用語は、細胞の膜内骨化または軟骨内骨化により骨組織を形成する能力を包含する。細胞の膜内骨化により骨組織を形成する能力は一般に、細胞の、鋳型としての石灰化した軟骨基質の必要なく骨組織を形成する能力を表す。細胞の軟骨内骨化により骨組織を形成する能力は一般に、細胞の、まず石灰化した軟骨基質を形成し、次に前記の石灰化した軟骨基質を骨組織形成のための鋳型として使用することにより骨組織を形成する能力を表す。この用語は、細胞の、他の骨基質分泌細胞を誘引する能力および／または他の細胞の骨基質分泌細胞への（転換）分化を誘導する能力を表す細胞の骨誘導能を包含しない。当業者には、本目的はｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定することであるが、細胞は骨形成能に加えて骨誘導能も有してよいが、その必要はないことが理解されるであろう。
特定の実施形態において、骨形成能は、細胞の軟骨内骨化により骨基質を形成する能力である。
用語「軟骨内骨化」は、本出願で使用する場合、最初の軟骨細胞が軟骨細胞外基質を形成し、これが次に沈着中の骨基質の鋳型として骨芽細胞により使用される骨組織形成のプロセスを指す。軟骨内骨化中、軟骨細胞の一部は骨芽細胞に分化転換し得る。
好ましい実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総てがｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するために使用される。
特定の実施形態において、ＣＤ１０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するために、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４のうちいずれか１以上に加えて、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総てに加えて使用される。従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０の使用も提供される。
さらなる側面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、（ａ１）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つもしくは４つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、および／または（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つもしくは３つ総て）の量を測定することを含んでなる方法を提供する。従って、本明細書ではまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、（ａ１）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうち１つを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうち２つを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、より好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうち３つを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、最も好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の４つ総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること；および／または（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうち１つの量を測定すること、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうち２つの量を測定すること、最も好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうち３つ総ての量を測定することを含んでなる方法も提供される。従って、本明細書ではまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、（ａ１）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の４つ総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、および／または（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４の３つ総ての量を測定することを含んでなる方法も提供される。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４に加え他のマーカーを測定することは含まない。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＣＤ４４と、ＣＤ７３およびＣＤ１０５のいずれか一方または両方を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＣＤ４４と、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＣＤ１０を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ＣＤ１０と、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３と、ＣＤ１０５およびＣＤ４４のいずれか一方または両方の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３と、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０５の量を測定することを含んでなる、特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０５と、ＣＤ７３およびＣＤ４４のいずれか一方または両方の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０５と、ＣＤ７３、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ４４の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ４４と、ＣＤ７３およびＣＤ１０５のいずれか一方または両方の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ４４と、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面の、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面の、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０と、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を測定することを含んでなる。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ａ１）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、ならびに／または（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を測定することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ａ１）ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、ならびに／または（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４もしくはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）の量を測定することを含んでなる。
用語「を発現する」または「発現」は、本明細書で使用する場合、一般に、細胞表面のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の提示と同様に、細胞によるＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質などの任意の転写産物または翻訳産物の生成も包含する。
さらなる指針として、細胞が所与の遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４に関して陽性である、またはそれを発現する、またはその発現を含んでなると言われる場合、当業者は、その細胞内または細胞上でその遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を検出または定量することができる測定を行う場合に、その遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の明瞭なシグナルの存在または証拠を結論付ける。好適には、その遺伝子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の明瞭なシグナルの存在または証拠は、その細胞に関して得られた測定結果と陰性対照（例えば、そのマーカーを発現しないことが知られる細胞）および／または陽性対照（例えば、そのマーカーを発現することが知られる細胞）に対して行った同じ測定の結果との比較に基づいて結論付けられる。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくは核酸などの分子もしくは分析物、または２以上の分子もしくは分析物、例えば、２以上のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくは核酸の群は、サンプルにおいて前記分子もしくは分析物または前記分子もしくは分析物の群の有無および／または量が、好ましくは、実質的に他の分子および分析物を除外して検出または決定される場合に、サンプルにおいて「測定される」。用語「量(quantity)」、「量(amount)」および「レベル」は同義であり、一般に当技術分野で十分に理解されている。この用語は、本明細書で使用する場合、特に、サンプル中の細胞数、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくは核酸の絶対的定量、またはサンプル中の細胞数、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくは核酸の相対的、すなわち、別の値に対して相対的、例えば、本明細書に教示されるような参照値に対して相対的な定量を指し得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の量はまた、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性によって表してもよい。サンプル中のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の活性はまた、絶対項で、例えば、容量当たりの酵素単位で、または相対項で表してもよい。
サンプル中のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸の絶対量は、有利には、重量としてもしくはモル量として、またはより一般には濃度として、例えば、容量当たりの重量もしくは容量当たりのモルとして表され得る。
サンプル中のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸の相対量は、有利には、前記の別の値に対する、例えば、本明細書の他所に記載されているような参照値に対する増加もしくは減少としてまたは増加倍率もしくは減少倍率として表され得る。第１のパラメーターと第２のパラメーター（例えば、第１の量と第２の量）の間の相対比較の実施は、前記第１および第２のパラメーターの絶対値をまず決定してもよいが、必ずしもその必要はない。例えば、測定方法は、前記第１および第２のパラメーターの定量可能な読み取り値（例えば、シグナル強度）を生成し得るものであり、前記読み取り値は前記パラメーターの値の関数であり、読み取り値をまず各パラメーターの絶対値に変換する実際の必要なく、前記読み取り値が直接比較されて、第１のパラメーターと第２のパラメーターの相対値が得られる。
細胞の相対量は、分析された細胞の総数、より詳しくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の発現が決定される細胞の総数に対する細胞のパーセンテージ（割合）として表し得る。よって、本明細書に教示されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定することは一般に、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞によるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０および／またはＣＤ４４の発現（すなわち、存在）を決定すること、（ｉｉ）工程（ｉ）においてＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０および／またはＣＤ４４を発現することが決定されたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の数を計数すること；および（ｉｉｉ）工程（ｉ）において検討されたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の総数に対する、工程（ｉ）においてＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０および／またはＣＤ４４を発現すると決定されたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を計算することを含み得る。ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量は、当技術分野で公知の任意の手段により、例えば、フローサイトメトリーにより測定され得る。
よって、特定の実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量は、全分析ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞に対する、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現すると決定されたｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞によるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の存在の決定および／またはその量の測定は、細胞または細胞集団の内部または表面のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸の有無（例えば、有り、無しという読み取り；もしくは検出可能な量、検出不能な量）および／または量（例えば、絶対量もしくは相対量としての読み取り）を測定するために使用される既存の、利用可能なまたは従来のいずれの検出および／または定量方法によって行ってもよい。例えば、このような方法としては、生化学的アッセイ法、イムノアッセイ法、質量分析法、もしくはクロマトグラフィー法、またはそれらの組合せを含み得る。
特定の実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の存在および／または量の測定は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、またはＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４ ｍＲＮＡまたはその両方の測定を含んでなる。
好ましい実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の存在および／または量の測定は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の測定を含んでなる。
ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のそれぞれは一般に細胞の表面に発現されるので、当業者は、細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上と言う場合には、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質が意図され、いずれか１以上のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質という場合には、細胞表面上のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上が意図されることを理解するであろう。
特定の実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の存在および／または量の測定が、細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の測定を含んでなる。
より詳しい実施形態において、生細胞の細胞表面の非変性形態のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のうちいずれか１以上の存在および／または量が測定される。
より詳しい実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のうちいずれか１以上の存在および／または量の測定は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４とそれぞれ特異的に結合し得る１以上の薬剤を使用する技術の使用を含んでなり、好ましくは、１以上の薬剤はそれぞれ独立に、１以上の抗体、抗体断片、抗体様タンパク質足場、またはアプタマーである。
このような方法は、親和性に基づくアッセイ方法を含み得、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸を検出および／または定量するためのアッセイ能力は、検出可能なおよび／または定量可能な結合剤とｉ）ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸の間の特異的結合により付与される。結合剤は免疫学的結合剤（抗体）または非免疫学的結合剤であり得る。ヒトＣＤ７３と結合し得る抗体の例としては、限定されるものではないが、以下の販売者から入手可能なもの（「＃」はカタログ番号を表す）：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートマウスモノクローナル抗体、＃５６０８４７；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートマウスモノクローナル抗体、＃５６１２５４；Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートマウスモノクローナル抗体、＃５５０２７）、Ａｂｃａｍ（マウスモノクローナル抗体、＃ａｂ５４２１７；ウサギモノクローナル、＃ａｂ７９４２３；マウスモノクローナル、＃ａｂ３４１９９）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ビオチン化ポリクローナルヤギ抗体、＃ＢＡＦ１１８２；モノクローナルマウス、＃ＭＡＢ１１８２；ＰＥコンジュゲートポリクローナルヤギ抗体、＃ＦＡＢ８１６０Ｐ）が含まれる。ヒトＣＤ１０５と結合し得る抗体の例としては、限定されるものではないが、以下の販売者から入手可能なもの（「＃」はカタログ番号を表す）：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＰＣコンジュゲートマウスモノクローナル抗体、＃５６２４０８；ＰＥ標識マウスモノクローナル抗体、＃５６０８３９）、Ａｂｃａｍ（マウスモノクローナル、＃ａｂ１５６７５６；マウスモノクローナル、＃ａｂ２５２９；ウサギモノクローナル、＃ａｂ２２１６７５）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲートモノクローナルマウス、＃ＦＡＢ１０９７１Ｇ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートモノクローナルマウス、＃ＦＡＢ１０９７１Ｒ；ヤギポリクローナル、＃ＡＦ１０９７）が含まれる。ヒトＣＤ４４と結合し得る抗体の例としては、限定されるものではないが、以下の販売者から入手可能なもの（「＃」はカタログ番号を表す）：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰＥ−コンジュゲートマウスモノクローナル抗体、＃５５０９８９；ＦＩＴＣコンジュゲートマウスモノクローナル抗体、＃５５５４７８）、Ａｂｃａｍ（ウサギポリクローナル、＃ａｂ１５７１０７、ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナル、＃ａｂ４６７９３；ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナル、＃ａｂ５８７５４）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲートラットモノクローナル、＃ＦＡＢ６１２７Ｓ；ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナル、＃ＦＡＢ３６６０Ｐ）が含まれる。ヒトＣＤ１０と結合し得る抗体の例としては、限定されるものではないが、以下の販売者から入手可能なもの（「＃」はカタログ番号を表す）：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナル抗体、＃５５５３７５）、Ａｂｃａｍ（ウサギモノクローナル、＃ａｂ７９４２３；ウサギポリクローナル、＃ａｂ８２０７３；ＰＥコンジュゲートマウスモノクローナル、＃ａｂ２１０３８０）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）コンジュゲートマウスモノクローナル、＃ＦＡＢ１１８２Ｎ；ビオチン化ヤギポリクローナル、＃ＢＡＦ１１８２）が含まれる。親和性に基づくアッセイ方法、このような免疫学的アッセイ法としては、限定されるものではないが、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡、マイクロ流体システムを用いた蛍光に基づく細胞選別、アフィニティークロマトグラフィーなどの（免疫）アフィニティー吸着に基づく技術、マイクロ流体システムを用いた磁気活性化細胞選別またはマイクロ流体システムを用いたビーズに基づく細胞選別、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＥＬＩＳＰＯＴに基づく技術、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロットなどが含まれる。
ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を検出および／または定量するためのさらなる技術は、場合により、上記の分析方法のいずれと組み合わせて使用してもよい。このような方法としては、限定されるものではないが、質量分析（ＭＳ）技術、化学抽出分配、等電点電気泳動（ＩＥＦ）（キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）などを含む）、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）、フリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）などが含まれる。
ＲＮＡレベル（例えば、ｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡのレベル）などでの核酸の有無および／または量は、当技術分野で公知の標準的な定量的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ測定ツールを用いて検出され得る。限定されない例としては、ハイブリダイゼーションに基づく分析、マイクロアレイ発現分析、デジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）、ＲＮＡ−ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＩＳＨ）、ノーザンブロット分析など；ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、デジタルＰＣＲなど；補助オリゴヌクレオチド検出、パイロシーケンシグ、合成によるポロニーサイクリックシーケンシング、同時二方向シーケンシング、一分子シーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、トゥルー一分子シーケンシング、ハイブリダイゼーション補助ナノポアシーケンシング、合成によるシーケンシングなどが含まれる。
さらなる例において、本明細書に述べられているものなどの方法のいずれの組合せも使用可能である。
特定の実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４はペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を表し、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の発現は、それぞれＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の細胞表面発現を表す。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の細胞表面発現は、好ましくは、フローサイトメトリーにより決定される。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；および／または（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定することを含んでなる。従って、また、（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうち１つを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうち２つを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること、より好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうち３つを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること、最も好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；および／または（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうち１つの量を測定すること、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうち２つの量を測定すること、より好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量を測定することを含んでなる、本明細書に教示されるような方法が提供される。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、
（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を測定すること；
（ｂ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；
（ｂ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す１以上の個々のカットオフ値と比較すること；
（ｃ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；
（ｃ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のいずれか１つ（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；ならびに
（ｄ）前記偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰すること
を含んでなり得る。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、
（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）の量を測定すること；
（ｂ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；
（ｂ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す１以上の個々のカットオフ値と比較すること；
（ｃ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；
（ｃ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）の量の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；ならびに
（ｄ）前記偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰すること
を含んでなり得る。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の測定；および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量の測定は、フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、蛍光顕微鏡、アフィニティー分離、磁気細胞分離、マイクロ流体分離、およびそれらの組合せからなる群から選択される技術を用いて行われる。
フローサイトメトリーは、細胞集団の個々の細胞が、それらがレーザー光の中、一列縦隊で狭い流路を通過する際に、それらの光学特性（例えば、吸光度、光散乱および蛍光特性など）により分析される方法を包含する。フローサイトメトリー法としては、特定の光学特性を有する細胞集団が他の細胞から分離される蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法が含まれる。
元素質量分析に基づくフローサイトメトリー、またはマスサイトメトリーは、蛍光色素標識結合試薬を、質量タグを有する、すなわち、規定の質量を有する元素または同位体でタグ付けされた結合試薬で置換することにより細胞を分析するためのアプローチを提供する。これらの方法において、標識粒子がマスサイトメーターに導入され、そこで、それらは個々に霧化およびイオン化される。次に、個々の粒子に対して元素分析を行い、使用した質量タグを同定し、その存在量を測定する。各粒子に関連する同位元素が何であるか、およびその量を蓄積し、分析する。元素分析の分解能および使用可能な元素同位体の数により、単一の粒子に対して最大１００以上のパラメーターを同時に測定することができる。
蛍光顕微鏡は、細胞集団の個々の細胞がそれらの蛍光特性により顕微鏡的に分析される方法を広く包含する。蛍光顕微鏡アプローチは、手動または好ましくは半手動または自動であり得る。
アフィニティー分離は、アフィニティークロマトグラフィーとも呼ばれ、好適な液相などの移動相中に存在する細胞（例えば、水性懸濁液中の細胞集団）の、それによる好適な固相などの固定相への細胞の吸着との特異的相互作用；その後の残りの移動相からの固定相の分離および固定相からの吸着細胞の回収（例えば、溶出）を含む技術を広く包含する。アフィニティー分離は、カラム式であってもよいし、あるいはまた、バッチ処理を伴ってもよく、固定相は遠心分離または磁場の適用（例えば、この場合、固定相は磁気粒子またはビーズなどの磁気基質を含んでなる）などの好適な技術により液相から回収／分離される。よって、本明細書では、磁気細胞分離も想定される。
マイクロ流体システムは、多様な物理原理を採用する正確なハイスループット細胞検出、定量および／または選別を可能とる。マイクチップ上での細胞選別は、必要な装置の縮小、生物学的に危険である可能性のあるエアロゾルの排除、および一般に細胞選別に関連する複雑なプロトコールの簡略化により多くの利点を提供する。用語「マイクロ流体システム」は、本明細書で使用する場合、１以上の流体マイクロチャネルを備えたシステムを広く指す。マイクロチャネルは、その最大が一般に１ｍｍ未満、好ましくは５００μｍ未満、より好ましくは４００μｍ未満、より好ましくは３００μｍ未満、より好ましくは２００μｍ未満、例えば１００μｍ以下である横断面寸法を有する流体チャネルを表す。このようなマイクロ流体システムは、液滴、気泡、カプセル、粒子、細胞などの流体および／または物体を操作するために使用可能である。マイクロ流体システムは、例えば、蛍光標識に基づく（例えば、蛍光団コンジュゲート結合剤、例えば、蛍光団コンジュゲート抗体を使用する）、ビーズに基づく（例えば、ビーズコンジュゲート結合剤、例えば、ビーズコンジュゲート抗体）、または標識不含の細胞選別を可能とし得る（Shields et al., Lab Chip. 2015, vol. 15: 1230-1249に総説）。特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の測定；およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量の測定は、フローサイトメトリーを用いて行われる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、蛍光色素（例えば、ＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｃｙ５、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（登録商標）、ＦＩＴＣ、パシフィックブルー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（登録商標））にコンジュゲートされた抗体を用いて、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１以上に関して標識され、次に、レーザーにより特定の波長（蛍光色素の励起波長）で励起されて異なる波長（蛍光色素の発光波長）で発光し得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートＣＤ１０５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６２４０８）、ＡＰＣコンジュゲートＣＤ７３抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６０８４７）、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＣＤ１０抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５３７５）および／またはＰＥコンジュゲートＣＤ４４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５０９８９）を用いて標識され得る。当業者には、レーザーの波長と抗体を標識するために使用される蛍光色素の励起波長は適合しなければならないことが理解されるであろう。例えば、ＦＩＴＣの励起波長は４８８ｎｍであって、発光波長は５００〜５６０ｎｍであり；ＰＥの励起波長は４８８〜５６１ｎｍであって、発光波長は５６０〜５９５ｎｍである。ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうち２つ以上の存在または量は、異なる波長で異なる光を発する異なる蛍光色素にそれぞれコンジュゲートされた抗体を使用することによって同時に測定可能である。
ほとんどの細胞は、本来、蛍光を発さない。よって、蛍光色素コンジュゲート抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上と結合させれば、細胞がフローサイトメーターのレーザー光を通過する際に蛍光シグナルが取得される。フローサイトメトリー分析に使用される蛍光色素コンジュゲート抗体のそれぞれに関して、陽性カットオフを設定することができる。例えば、陽性カットオフは、対照アイソタイプ抗体の陽性の１％に設定することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発せられた蛍光シグナルの平均強度または強度中央値として表され得る。蛍光シグナルの平均強度または強度中央値は、全分析細胞集団（すなわち、蛍光シグナルを発さなかった細胞を含む）の各細胞に関して検出された蛍光シグナルから決定される。より詳しくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量は、正規化蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）により表すことができる。正規化ｎＭＦＩは一般に、１以上の蛍光色素コンジュゲート抗体で標識された全分析細胞集団のＭＦＩを陰性対照（例えば、１以上の蛍光色素コンジュゲートアイソタイプ対照抗体、例えば、ＦＩＴＣ、ＡＰＣおよびＰＥコンジュゲート免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照で標識された細胞）で割ることにより決定される。
「蛍光強度の正規化中央値」または「ｎＭＦＩ」は、本明細書で使用する場合、ＦＩＴＣ、ＡＰＣまたはＰＥなどの蛍光色素がコンジュゲートされた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照などの１以上の蛍光色素コンジュゲートアイソタイプ対照抗体で標識されたその細胞集団のＭＦＩ（ＭＦＩｉｓｏｔｙｐｅ＿ｃｈａｎｎｅｌ）に対する、１以上の蛍光色素コンジュゲート抗体で標識された全分析細胞集団のＭＦＩ（ＭＦＩｍａｒｋｅｒ＿ｃｈａｎｎｅｌ）の比を指す。ｎＭＦＩ結果は、対象とする集団の細胞表面に存在するマーカーの量に比例する。（ｎ）ＭＦＩは一般に、蛍光シグナルの放出が測定される波長に関連する。例えば、励起波長は、ＦＩＴＣでは４８８ｎｍ、ＰＥでは４８８ｎｍ、およびＡＰＣでは６３３ｎｍであり得る。例えば、発光波長は、ＦＩＴＣでは５３０ｎｍ、ＰＥでは５８０ｎｍ、およびＡＰＣでは６６０ｎｍであり得る。
フローサイトメーターは、レーザーを通過する標識ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の総数ならびに特定の波長で光を発する標識ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の数を計数し得る。この情報は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量、好ましくは、陽性蛍光細胞パーセンテージ（ＰＰＦＣ）としても知られる割合を決定するために使用することができる。
当業者には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の存在または量を測定する前に、例えば、ゲート設定計画により、それらの前方および側方散乱特性に基づいて対象とする細胞集団が他の細胞または残渣から識別され得ることが理解されるであろう。
フローサイトメトリーデータ分析は、固定数の検出イベント（例えば、フローサイトメーターのレーザーを通過する細胞の数）に対して行うことができる。例えば、フローサイトメトリーデータ分析は、１００００イベントのゲート設定細胞集団に対して行うことができる。
フローサイトメトリーは、当技術分野で公知のいずれのサイトメーターを用いて行ってもよい。例えば、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を使用。
フローサイトメトリーデータ分析は、当技術分野で公知のフローサイトメトリーソフトウエアを用いて行うことができる。例えば、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ（登録商標）８．０ソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｂ１）本明細書の他所に記載のように測定されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値と比較すること、および（ｂ２）本明細書の他所に記載のように測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つまたは３つ総て）の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値と比較することを含んでなる。従って、また、本明細書では、（ｂ１）本明細書の他所に記載のように測定されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値と比較すること、ならびに（ｂ２）本明細書の他所に記載のように測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値と比較することを含んでなる、本明細書に教示されるような方法も提供される。
より詳しい実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｂ１）本明細書の他所に記載のように測定されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つもしくは４つ総て）を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること、および／または（ｂ２）本明細書の他所に記載のように測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つもしくは３つ総て）の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較することを含んでなる。従って、また、本明細書では、（ｂ１）本明細書の他所に記載のように測定されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；ならびに／または（ｂ２）本明細書の他所に記載のように測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較することを含んでなる、本明細書に教示されるような方法も提供される。
より詳しい実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｂ１）本明細書の他所に記載のように測定されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；および／または（ｂ２）本明細書の他所に記載のように測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つもしくは３つ総て）の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較することを含んでなる。特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｂ１）本明細書の他所に記載のように測定されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；および／または（ｂ２）本明細書の他所に記載のように測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４もしくはＣＤ１０のうちいずれか１以上（例えば、１つ、２つ、３つもしくは４つ総て）の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較することを含んでなる。
既知の骨形成能を有する細胞は、特定の程度の骨形成能（例えば、無骨形成能、低骨形成能、高骨形成能または所望の程度の骨形成能）を有することが知られる細胞であり得る。
骨形成能の程度は、形成される骨基質の量として、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏにおける骨基質形成の速度として表すことができる。骨基質の量および／または骨基質形成の速度は、骨組織形態計測、組織学（例えばコラーゲンＩ、マッソントリクロームゴールドナー）および免疫蛍光（例えばコラーゲンＩ、テトラサイクリン骨標識）などの当技術分野で公知の任意の方法により測定され得る。例えば、新たに石灰化した骨の厚さ、新たに形成した骨の表面積、または少なくとも１つの石灰化した結節の存在は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、皮下注射によりマウスに細胞を投与した後に評価され得る。
例えば、細胞の骨形成能の程度は、このような細胞の骨形成活性を測定することにより決定することができる。ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成活性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、頭蓋冠への皮下注射によりマウスに細胞を投与した後に少なくとも１つの石灰化した結節（例えば、ヒト起源のまたはヒト−マウス混合起源の）の存在を決定することにより測定することができる。ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成活性は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えば、頭蓋冠への皮下注射によりマウスに細胞を投与した後に新たに石灰化した結節（例えば、ヒト起源のまたはヒト−マウス混合起源の）の厚さを評価することによるか、またはマウス大腿分節未臨界サイズ欠損（ｓｕｂ−ＣＳＤ）モデルにおいて骨修復の程度を評価することにより測定することができる。
例えば、１００μｌの賦形剤に調剤された２．５×１０６細胞などの量のヒト細胞を、頭蓋冠骨への単回皮下投与によりヌードマウスに投与することができる。経時的に骨新形成を標識するために、アリザリンレッド（赤）、カルセイン（緑）、カルセイン（青）およびテトラサイクリン（黄）などのカルシウム結合蛍光色素を、細胞投与のそれぞれ３日前、ならびに４、８、および１２日後に腹腔内注射によりマウスに順次投与することができる。細胞投与の２週間後にマウスを安楽死させ、各マウスの頭蓋冠を、組織形態計測（例えば、骨形成の定量）により骨形成特性を評価するために採取することができる。頭蓋冠の初期厚および最終厚を用いて細胞の投与後の新骨形成のパーセンテージを計算することができる。さらに、骨形成特性はまた、免疫蛍光（例えば、マウス起源またはヒト起源の骨形成）によっても評価することができる。骨芽細胞活性は、頭蓋冠切片でＡＬＰ酵素活性検出法を用いて評価することができる。破骨細胞活性は、頭蓋冠切片でＴＲＡＰ酵素活性検出法を用いて評価することができる。新たに形成した骨の石灰化の状態は、例えば、市販のキット（例えば、Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ（登録商標））を用いてＡＬＰで染色した頭蓋冠切片で、マッソントリクロームゴールドナー染色を用いて評価することができる。軟骨形成は、頭蓋冠矢状パラフィン切片でサフラニンオレンジ染色を用いて評価することができる。
さらなる例において、５０μｌの賦形剤に調剤された１．２５×１０６細胞などのヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞をマウスに、それらが大腿分節未臨界サイズ欠損を受けた１日後に経皮注射により骨欠損部位に局所的に投与することができる。骨修復はＸ線撮像により定量することができる。骨欠損サイズは、骨欠損の２端間の距離を測定することにより定量することができる。
特定の実施形態において、既知の骨形成能を有する細胞は、鋳型としての石灰化軟骨基質の必要なく骨基質を形成することが知られる細胞（例えば、膜内骨化により骨を形成することが知られる細胞）またはまず石灰化軟骨基質を形成し、次に、前記石灰化軟骨基質を骨組織形成の鋳型として用いることにより骨基質を形成することが知られる細胞（例えば、軟骨内骨化により骨を形成することが知られる細胞）であり得る。骨形成のタイプ（例えば、軟骨内骨化または膜内骨化）は、骨組織形態計測、組織学（例えば、コラーゲンＩ、マッソントリクロームゴールドナー、サフラニンオレンジ、ＳＯＸ９、ＩＩ型コラーゲン）および免疫蛍光（例えば、コラーゲンＩ、テトラサイクリン骨標識、ＩＩ型コラーゲン）などの当技術分野で公知の任意の方法により決定され得る。例えば、本明細書の他所に記載したような皮下注射によりマウスに細胞を投与した後の少なくとも１つの石灰化結節の存在は、骨基質が軟骨内骨化により形成されることを示し得る。
特定の実施形態において、既知の骨形成能を有する細胞は、軟骨内骨化により骨を形成することが知られる細胞である。例えば、既知の骨形成能を有する細胞は、皮下注射によりマウスに細胞を投与した後にｉｎ ｖｉｖｏでヒト起源の少なくとも１つの石灰化結節を形成するヒト細胞であり得、好ましくは、この皮下注射は頭蓋冠骨に行われる。
特定の実施形態において、既知の骨形成能を有する細胞は、例えばマウスへの皮下注射による細胞の投与後に、例えばマウスに皮下注射により対照細胞（例えば、骨形成能が無い細胞もしくは低骨形成能の細胞）またはビヒクルが投与された場合に見られる骨形成に比べて、少なくとも約２０％（約１．２倍以上）、または少なくとも約３０％（約１．３倍以上）、または少なくとも約４０％（約１．４倍以上）、または少なくとも約５０％（約１．５倍以上）、または少なくとも約６０％（約１．６倍以上）、または少なくとも約７０％（約１．７倍以上）、または少なくとも約８０％（約１．８倍以上）、または少なくとも約９０％（約１．９倍以上）、または少なくとも約１００％（約２倍以上）のｉｎ ｖｉｖｏ骨形成（例えば、ヒト起源の）の増加を示す細胞（例えば、ヒト細胞）を示し、好ましくは、この皮下注射は頭蓋冠骨に行われる。例えば、既知の骨形成能を有する細胞と同じドナーから得られた未分化ＭＳＣが対照細胞として使用可能である。
低骨形成能を有することが知られる細胞の限定されない例は、以下のようにして得られるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ＭＳＣ由来細胞（本明細書では「細胞製品Ａ」または「骨形成細胞Ａ」と呼称）が含まれる：骨髄白血球を培養培地に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートする。細胞播種の４日後に、非接着細胞を除去し、培地を、５％Ｏｃｔａｓｅｒｕｍ（５０：５０自己血清およびＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ））、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を添加した従来の培養培地に更新する。播種７日および１１日後に、培養培地の半分を除去し、新鮮培地に置き換える。細胞を一次培養として１４日間培養する。１４日目に、細胞を、例えばＴｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取する（第1継代：Ｐ１）。中間細胞を、培養培地、１０％Ｏｃｔａｓｅｒｕｍ（５０：５０自己血清およびＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ））、１０％ＤＭＳＯ）を含んでなる凍結培地中で凍結保存し、液体窒素中で保存する。二次培養として、細胞を解凍し、１１４４細胞／ｃｍ２の密度で再播種する。細胞を二次培養として１４日間培養する。２８日目に、細胞を、例えばＴｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取する（第２継代：Ｐ２）。最終細胞製品を得るために、細胞を例えばＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させる。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ａ」または「骨形成細胞Ａ」と呼称する。
高骨形成能を有することが知られる細胞の限定されない例としては、以下のようにして得られるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化ＭＳＣ由来細胞（本明細書では「細胞製品Ｂ」または「骨形成細胞Ｂ」と呼称）が含まれる：骨髄白血球を、５％ＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．１ＵＩ／ｍｌヘパリン（ＬＥＯ Ｐｈａｒｍａ）、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を含んでなる従来の培養培地に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートする。細胞播種４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新する。播種７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、増殖因子を更新するために新鮮培地と置き換える。細胞を一次培養として１４日間培養する。１４日目に、細胞を、例えばＴｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取する（第1継代：Ｐ１）。中間細胞を凍結保存し（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ））、液体窒素中で保存する。次に、中間細胞を解凍し、二次培養のために２８６細胞／ｃｍ２の密度で再播種する。細胞を二次培養として１４日間培養する。２８日目に、細胞を、例えばＴｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取する（第２継代：Ｐ２）。最終細胞製品を得るために、細胞を例えばＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させる。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｂ」または「骨形成細胞Ｂ」と呼称する。
特定の実施形態において、既知の骨形成能を有する細胞は、臨床上有用な骨形成能を有する細胞である。
特定の実施形態において、（ｂ１）のカットオフ値および／または（ｂ２）の前記各カットオフ値は、臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値である。
用語「臨床上有用な」とは、細胞の骨形成能に関して使用される場合、対象骨基質に細胞を移植する際に、筋骨格疾患または骨関連障害に罹患している対象などの対象に臨床関連利益を提供するなど、対象にとって治療上意味のある量で、および／または機序（例えば、軟骨内骨化または膜内骨化）により細胞を形成することを可能とする程度の細胞の骨形成能を指す。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、頭蓋冠への皮下注射により動物（例えば、マウス）に細胞を投与した後に動物（例えば、マウス）の少なくとも５０％が石灰化結節（例えば、ヒト起源またはヒト−マウス混合起源の）を形成すれば、臨床上有用な骨形成能を有し得る。特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、頭蓋冠への皮下注射により動物（例えば、マウス）に細胞を投与した後に動物（例えば、マウス）の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０、または少なくとも９５％が石灰化結節（例えば、ヒト起源またはヒト−マウス混合起源の）を形成すれば、臨床上有用な骨形成能を有し得る。
筋骨格疾患の限定されない例としては、例えば原発性、閉経後、老年性、コルチコイド誘発性、ビスホスホネート誘発性、および放射線療法誘発性などの任意のタイプの骨粗鬆症またはオステオペニア；任意の続発性、一部位または多部位骨壊死；例えば、癒合不能、変形癒合、癒合遅延骨折または圧迫、顎顔面骨折などの任意のタイプの骨折；骨固定（例えば、脊椎固定および再建）を必要とする病態；先天性骨欠損；例えば外傷性損傷または癌手術後の骨再建、および頭蓋顔面骨再建；外傷性関節炎、限局性軟骨および／または関節欠陥、限局性変形性関節炎；変形性関節症、変形性関節炎、変形性膝関節症、および変形性股関節症；骨形成不全症；溶骨性骨癌；パジェット病；内分泌障害；低リン酸血症；低カルシウム血症；腎性骨異栄養症；骨軟化症；無形成骨症、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症；歯周病；ゴーハム病(Gorham-Stout disease)およびマッキューン・オルブライト症候群；関節リウマチ；強直性脊椎炎を含む脊椎関節症、乾癬性関節炎、腸疾患性関節症、および未分化脊椎関節炎および反応性関節炎；全身性紅斑性狼瘡および関連症候群；硬皮症および関連障害；シェーグレン症候群；巨細胞性動脈炎（ホートン病）、高安動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、ＡＮＣＡ関連血管炎（例えば、ウェゲナー肉芽腫、顕微鏡的多発性血管炎、およびチャーグ−ストラウス症候群）、ベーチェット症候群、およびその他の多発性動脈炎および関連障害（例えば、結節性多発性動脈炎、コーガン症候群、およびバージャー病）を含む全身性血管炎；アミロイドーシスおよびサルコイドーシスを含む他の全身性炎症性疾患を伴う関節炎；通風、ピロリン酸カルシウム二水和物病、リン酸カルシウムまたはシュウ酸カルシウム結晶の関節沈着に関連する障害または症候群を含む結晶性関節症；軟骨石灰沈着症および神経因性関節症；フェルティー症候群およびライター症候群；ライム病およびリウマチ熱といった局部性または全身性障害を含み得る。
例として、限定されるものではないが、臨床上有用な骨形成能を有する細胞の移植から利益を受け得る骨関連障害としては、例えば原発性、閉経後、老年性、コルチコイド誘発性などの任意のタイプの骨粗鬆症またはオステオペニア；任意の続発性、一部位または多部位骨壊死；任意のタイプの骨折、例えば、癒合不能、変形癒合、癒合遅延骨折または圧迫などの任意のタイプの骨折；骨固定（例えば、脊椎固定および再建）を必要とする病態；顎顔面骨折、例えば外傷性損傷または癌手術後の骨再建、および頭蓋顔面骨再建、骨形成不全症、溶骨性骨癌、パジェット病、内分泌障害、低リン酸血症、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、関節リウマチ、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、ゴーハム病およびマッキューン・オルブライト症候群といった局部性または全身性障害を含み得る。
既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞の限定されない例としては、本明細書の他所に記載したように得られる「細胞製品Ｂ」または「骨形成細胞Ｂ」が含まれる。既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞のさらなる限定されない例には、本明細書の他所に記載したように得られる「細胞製品Ｃ」または「骨形成細胞Ｃ」が含まれる。
特定の実施形態において、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞は、本明細書の他所に記載したように得られる「細胞製品Ｂ」または「骨形成細胞Ｂ」である。特定の実施形態において、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞は、「細胞製品Ｃ−凍結」または「骨形成細胞Ｃ凍結（保存）」を含む、本明細書の他所に記載したように得られる「細胞製品Ｃ」または「骨形成細胞Ｃ」である。
特定の実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量の参照値は、参照細胞（例えば、臨床上有用な骨形成能を有することが知られる細胞）においてＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量をそれぞれ決定し、それにより参照値を得ることにより決定され得る。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量の参照値は、参照細胞（例えば、臨床上有用な骨形成能を有することが知られる細胞）において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量をそれぞれ決定し、それにより参照値を得ることにより決定され得る。
１以上の参照細胞種から得られる１以上の参照値は、細胞の特定の程度の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を提供することが当技術分野で一般に知られるように閾値またはカットオフ値を決定するために使用可能である。
特定の実施形態において、（ｂ１）本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量（もしくは割合）を、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値もしくはカットオフ値と比較すること；および／または（ｂ２）本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値と比較することにおける参照値またはカットオフ値は、臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表す参照値もしくはカットオフ値である。
広範な研究により、本発明者らは、骨形成能を有するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団、特に、高骨形成能を有し、かつ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて軟骨内骨化により骨基質を形成するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現することを見出した。さらに、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞はまた、ＭＳＣにおけるそれぞれＣＤ７３、ＣＤ４４およびＣＤ１０５の量に比べて、高い量のＣＤ７３および／またはＣＤ４４、ならびに低い量のＣＤ１０５を発現する。
よって、特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｃ１）本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量（もしくは割合）の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値もしくはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと、および／または（ｃ２）本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１つ、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値もしくはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと、ならびに（ｄ）（ｃ１）および／もしくは（ｃ２）で見出された偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰することを含んでなる。従って、また、本明細書では、（ｃ１）本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量（もしくは割合）の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと、および／または（ｃ２）本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと、ならびに（ｄ）（ｃ１）および／または（ｃ２）で見出された偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰することを含んでなる本明細書に教示されるような方法が提供される。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｃ１）本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量（もしくは割合）の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと、および／または（ｃ２）本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１つ（例えば、１つ、２つもしくは３つ総て）；好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の総ての量の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値もしくはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；ならびに（ｄ）（ｃ１）および／または（ｃ２）で見出された偏差の有無を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰することを含んでなり得る。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、（ｃ１）本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量（もしくは割合）の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値またはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと、および／または（ｃ２）本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１つ（例えば、１つ、２つ、３つもしくは４つ総て）、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０の総ての量の、既知の骨形成能を有する細胞を表す参照値もしくはカットオフ値からの偏差の有無を見出すこと、ならびに（ｄ）（ｃ１）および／または（ｃ２）で見出された偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰することを含んでなり得る。
第１の値と第２の値の「偏差」は一般に、いずれの方向（例えば、増加：第１の値＞第２の値；または減少：第１の値＜第２の値）およびいずれの程度の変化も包含し得る。
例えば、偏差は、比較がなされる第２の値に比べての第１の値の、限定されるものではないが、少なくとも約１０％（約０．９倍以下）、または少なくとも約２０％（約０．８倍以下）、または少なくとも約３０％（約０．７倍以下）、または少なくとも約４０％（約０．６倍以下）、または少なくとも約５０％（約０．５倍以下）、または少なくとも約６０％（約０．４倍以下）、または少なくとも約７０％（約０．３倍以下）、または少なくとも約８０％（約０．２倍以下）、または少なくとも約９０％（約０．１倍以下）の減少を包含し得る。
例えば、偏差は、比較がなされる第２の値に比べての第１の値の、限定されるものではないが、少なくとも約１０％（約１．１倍以上）、または少なくとも約２０％（約１．２倍以上）、または少なくとも約３０％（約１．３倍以上）、または少なくとも約４０％（約１．４倍以上）、または少なくとも約５０％（約１．５倍以上）、または少なくとも約６０％（約１．６倍以上）、または少なくとも約７０％（約１．７倍以上）、または少なくとも約８０％（約１．８倍以上）、または少なくとも約９０％（約１．９倍以上）、または少なくとも約１００％（約２倍以上）、または少なくとも約１５０％（約２．５倍以上）、または少なくとも約２００％（約３倍以上）、または少なくとも約５００％（約６倍以上）、または少なくとも約７００％（約８倍以上）などの増加を包含し得る。
好ましくは、偏差は、統計的に有意な観測された変化を指し得る。例えば、偏差は、所与の参照細胞において参照値の許容誤差の範囲外にある、観測された変化（例えば、標準偏差もしくは標準誤差により、またはその所定の倍率、例えば、±１×ＳＤまたは±２×ＳＤまたは±３×ＳＤ、または±１×ＳＥまたは±２×ＳＥまたは±３×ＳＥにより表される）を指し得る。偏差はまた、所与の参照細胞の値により定義される参照範囲の外側（例えば、所与の参照細胞における値の≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧７５％または≧８０％または≧８５％または≧９０％または≧９５％またはさらには≧１００％を含んでなる範囲の外側）にある値も指し得る。
さらなる実施形態において、偏差は、観測された変化が所与の閾値またはカットオフを超えるかどうかを結論とし得る。例えば、偏差は、観測された変化が所与の閾値またはカットオフ未満であるか、同じであるか、またはそれを超えるかどうかを結論とし得る。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、
（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定すること；
（ｂ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；
（ｂ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す１以上の各カットオフ値と比較すること；
（ｃ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；
（ｃ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１つの量の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；および
（ｄ）前記偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰すること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる。
従って、本発明ではまた、
（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面でＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量を測定すること；
（ｂ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；
（ｂ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す１以上の各カットオフ値と比較すること；
（ｃ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の、前記カットオフ値の偏差の有無を見出すこと；
（ｃ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；ならびに
（ｄ）前記偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰すること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる本明細書に教示されるような方法も提供される。
参照細胞が臨床上有用な骨形成能を有さないと知られる細胞である特定の実施形態において、
・本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量もしくは割合が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られるカットオフ値細胞に比べて同等以下であることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有さないことを示し；または
・本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量もしくは割合が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞を表すカットオフ値に比べて増加していることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示し、および／または
・本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ４４および／もしくはＣＤ１０の量が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて同等以下であり、かつ、本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０５の量が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて同等以上であることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有さないことを示し；または
・本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ４４および／もしくはＣＤ１０のうちいずれか１つの量が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて増加しており、かつ／もしくは本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０５の量が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて減少していることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示し、
好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上の発現は、細胞表面でのそれぞれＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４の発現を表す。
参照細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することが知られる細胞である特定の実施形態において、
・本明細書の他所に記載のように測定されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量もしくは割合が、本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られる細胞を表すカットオフ値に比べて減少していることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能を有さないことを示し、または
・本明細書の他所に記載のように測定される、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量または割合が、本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られるカットオフ値細胞に比べて同等以上であることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することを示し；および／または
・本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ４４および／もしくはＣＤ１０のうちいずれか１つの量が、本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて減少しており、かつ／もしくは本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０５の量が、本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて増加していることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能を有さないことを示し、または
・本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ４４および／もしくはＣＤ１０の量が、本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて同等以上であり、かつ、本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０５の量が、本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて同等以下であることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することを示し、
好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１以上の発現は、細胞表面でのＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４の発現を表す。
参照細胞が臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞である特定の実施形態において、
・本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０の量が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて同等以下であることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有さないことを示し；または
・本明細書の他所に記載のように測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０の量が、本明細書の他所に記載したような臨床上有用な骨形成能を有さないことが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて増加していることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示し、
好ましくは、ＣＤ１０の発現は、細胞表面でのＣＤ１０の発現を表す。
参照細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することが知られる細胞である特定の実施形態において、
・本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０の量が、本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られる細胞を表す各カットオフ値と比較して減少していることが、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能を有さないことを示し、または
・本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ１０の量が本明細書の他所に記載したような所望の骨形成能を有することが知られる細胞を表す各カットオフ値に比べて同等以上であることが、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することを示し、
好ましくは、ＣＤ１０の発現は、細胞表面でのＣＤ１０の発現を表す。
特定の実施形態は、
・（ａ１）で測定されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合が（ｂ１）のカットオフ値に比べて同等以上であることが、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示し；かつ
・（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ４４および／またはＣＤ１０の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等以上であり、かつ、（ａ２）で測定されるようなＣＤ１０５の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等以下であることが、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示す、
本明細書に教示されるような方法が提供される。
特定の実施形態において、前記（ｂ１）のカットオフ値は、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３の正規化蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）が５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩが４０である。特定の実施形態において、前記（ｂ１）のカットオフ値は、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３のｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩが５０である。
特定の実施形態において、前記（ｂ１）のカットオフ値は、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３の正規化ｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩが４０である。特定の実施形態において、前記（ｂ１）のカットオフ値は、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３の正規化ｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩが５０である。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量が測定される。特定の実施形態において、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３のｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０である。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０の量が測定される。特定の実施形態において、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３のｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０、およびＣＤ１０のｎＭＦＩが４０である。特定の実施形態において、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３のｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０、およびＣＤ１０のｎＭＦＩが４０である。特定の実施形態において、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３のｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０、およびＣＤ１０のｎＭＦＩが４０である。特定の実施形態において、前記（ｂ２）のカットオフ値は、ＣＤ７３のｎＭＦＩが５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩが１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩが１５０、およびＣＤ１０のｎＭＦＩが５０である。
特定の実施形態において、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ１）のカットオフ値は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％；９６％；９７％、９８％または９９％、好ましくは、９０％であり、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１以上の発現は、細胞表面でのそれぞれＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４の発現を表す。従って、本明細書では、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ１）のカットオフ値が提供され、それはＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％；９６％；９７％、９８％または９９％、好ましくは、９０％であり、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総ての発現は、細胞表面でのそれぞれＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の発現を表す。特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％；９６％；９７％、９８％または９９％、好ましくは、９０％以上がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１以上、好ましくは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現する場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有する。従ってまた、本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の約９０％以上がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４の総てを発現する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することが示される。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により細胞表面に発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４および／またはＣＤ１０のうちいずれか１以上の量を既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ２）のカットオフ値は、ｎＭＦＩＣＤ７３が５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０または９００、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３が５００、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００または３５０、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、ｎＭＦＩＣＤ１０５が１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０または１００、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０５が１５０および／またはｎＭＦＩＣＤ１０が１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０が５０であり；好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ならびに／またはｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。
従って、また、本明細書では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により細胞表面に発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量を既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ２）のカットオフ値も提供され、それはｎＭＦＩＣＤ７３が５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０または９００、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３が５００、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００または３５０、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、およびｎＭＦＩＣＤ１０５が１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０または１００、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０５が１５０であり、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により細胞表面に発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４およびＣＤ１０のうちいずれか１以上の量を既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ２）のカットオフ値は、ｎＭＦＩＣＤ７３が５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０または９００、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３が５００、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００または３５０、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、ｎＭＦＩＣＤ１０５が１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０または１００、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０５が１５０、ｎＭＦＩＣＤ１０が１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０が５０であり；好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍであり、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により細胞表面に発現されるＣＤ１０の量を既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ２）のカットオフ値は、ｎＭＦＩＣＤ１０ １０、１５、２０、２５、または３０、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０ ２０である。特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により細胞表面に発現されるＣＤ１０の量を、臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ２）のカットオフ値は、ｎＭＦＩＣＤ１０ ４０、４５、５０、５５、または６０、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０ ４０；より好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０ ５０；いっそうより好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０ ６０である。好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。
記載「ＣＤ７３のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩＣＤ７３」は、本明細書で使用する場合、ＡＰＣコンジュゲートＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５７５１）で標識された細胞集団のＭＦＩに対するＡＰＣコンジュゲートＣＤ７３抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６０８４７）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される。
記載「ＣＤ４４のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩＣＤ４４」は、本明細書で使用する場合、ＰＥコンジュゲートＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５６６５０）で標識された細胞集団のＭＦＩに対するＰＥコンジュゲートＣＤ４４抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５０９８９）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。
記載「ＣＤ１０５のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩＣＤ１０５」は、本明細書で使用する場合、ＡＰＣとコンジュゲートされたＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５７５１）で標識された細胞集団のＭＦＩに対するＡＰＣコンジュゲートＣＤ１０５抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６２４０８）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される。
記載「ＣＤ１０のｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩＣＤ１０」は、本明細書で使用する場合、ＰＥコンジュゲートＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５６６５０）で標識された細胞集団のＭＦＩに対するＰＥコンジュゲートＣＤ１０抗体（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５３７５）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。
特定の実施形態において、本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現される５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０または９００、好ましくは、５００以上のｎＭＦＩＣＤ７３は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することを示す。
特定の実施形態において、本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現される１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００または３５０、好ましくは、１００以上のｎＭＦＩＣＤ４４は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することを示す。
特定の実施形態において、本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現される１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０または１００、好ましくは、１５０以下のｎＭＦＩＣＤ１０５は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有する。
特定の実施形態において、本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現される少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、または少なくとも６０、好ましくは、少なくとも５０のｎＭＦＩＣＤ１０は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することを示す。
好ましい実施形態において、本明細書の他所に記載のように測定される、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現される５００以上のｎＭＦＩＣＤ７３、１００以上のｎＭＦＩＣＤ４４、および１５０以下のｎＭＦＩＣＤ１０５は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が所望の骨形成能、好ましくは、臨床上有用な骨形成能を有することを示し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、かつ／またはｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により細胞表面に発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４および／またはＣＤ１０のうちいずれか１以上の量を、既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ２）のカットオフ値は、ｎＭＦＩＣＤ７３が５００、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、ｎＭＦＩＣＤ１０５が１５０および／またはｎＭＦＩＣＤ１０が４０であり、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、かつ／またはｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。
特定の実施形態において、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ１）のカットオフ値は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により細胞表面に発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４および／もしくはＣＤ１０の量を、既知の骨形成能、好ましくは、既知の臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較する（ｂ２）のカットオフ値は、ｎＭＦＩＣＤ７３が５００、ｎＭＦＩＣＤ４４が１００、ｎＭＦＩＣＤ１０５が１５０および／もしくはｎＭＦＩＣＤ１０が４０であり、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、かつ／またはｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定される。
特定の実施形態において、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、多能性幹細胞（ＰＳ）、例えば、哺乳動物ＰＳおよびヒトＰＳ、好ましくは、ヒトＰＳから取得または誘導される。
用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞がある細胞種から別の細胞種へ遷移することを可能とする適当な条件下で培養されたいずれの細胞も指す。細胞の分化は、所望の細胞種へ向かう細胞の分化を誘導し得る条件下でＭＳＣを培養すること、より一般には、所望の細胞種へ向かう細胞の分化を誘導し得る１以上の薬剤（例えば、増殖因子）を含んでなる培地で細胞を培養することを含み得る。用語「幹細胞」は、一般に、自己再生し得る、すなわち、分化することなく増殖し得る、かつそれまたはその後代が少なくとも１つの比較的さらに専門化した細胞種を生じ得る、専門化していないまたは比較的専門化していない、かつ増殖能のある細胞を指す。この用語は、幹細胞の後代または少なくともその一部が、母幹細胞の専門化していないまたは比較的専門化していない表現型、分化能、および増殖能を実質的に保持する、実質的に無制限の自己再生をし得る幹細胞、ならびに限定された自己再生を示す幹細胞、すなわち、後代またはその一部のさらに増殖および／または分化する能力が、母細胞と比較して著しく低下している幹細胞を包含する。例として、限定されるものではないが、幹細胞は、１以上の系譜に分化してますます比較的さらに専門化した細胞を生産し得る子孫（このような子孫および／もしくはますます比較的さらに専門化した細胞はそれ自体、本明細書において定義されるような幹細胞であり得る）を生じ得るか、または有糸分裂後であり得る最終分化細胞、すなわち完全に専門化した細胞さえも生じ得る。
ｍＰＳ細胞の定義には、限定されるものではないが、例えば、Evans & Kaufman 1981 (Nature 292: 154-6)およびMartin 1981 (PNAS 78: 7634-8)により記載されているようなマウス胚性幹細胞；例えば、Iannaccone et al. 1994 (Dev Biol 163:288-292)により記載されているようなラット多能性幹細胞；例えば、Doetschman et al. 1988 (Dev Biol 127:224-227)により記載されているようなハムスター胚性幹細胞；例えば、Graves et al. 1993 (Mol Reprod Dev 36:424-433)により記載されているようなウサギ胚性幹細胞；例えば、Notarianni et al. 1991 (J Reprod Fertil Suppl 43:255-60)およびWheeler 1994 (Reprod Fertil Dev 6:563-8) により記載されているようなブタ多能性幹細胞；例えば、Notarianni et al. 1991（前掲）により記載されているようなヒツジ胚性幹細胞；例えば、Roach et al. 2006 (Methods Enzymol 418:21-37)により記載されているようなウシ胚性幹細胞；例えば、Thomson et al. 1998 (Science 282:1145-1147)により記載されているようなヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞；例えば、Shamblott et al. 1998 (PNAS 95:13726)により記載されているようなヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞；例えば、Thomson et al. 1995 (PNAS 92:7844-7848)により記載されているようなアカゲザル幹細胞、または例えば、Thomson et al. 1996 (Biol Reprod 55:254-259)により記載されているようなマーモセット幹細胞などのその他の霊長類由来の胚性幹細胞により例示される、様々なタイプの胚性幹細胞が含まれる。
この用語にはまた、胚組織から誘導されたか、胎児組織から誘導されたかまたはその他の供給源から誘導されたかに関わらず、三胚葉の総ての誘導物を含む後代を誘導し得る哺乳動物起源のいずれの細胞でもあるような他のタイプのｍＰＳ細胞も含まれる。ｍＰＳ細胞は、好ましくは、悪性供給源から誘導されたものではない。細胞または細胞株は、癌性ではなく、既知の癌遺伝子で変更されてもいない初代組織から樹立されていれば「非悪性供給源」に由来する。ｍＰＳが適当な条件下で長期培養中、正常な核型を維持することは、望ましいものであり得る。また、常に必要なわけではないが、ｍＰＳが適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で自己再生能を実質的に無期限に維持することは、望ましいものであり得る。
本明細書で使用する場合、修飾語句「多能性」は、生物の三胚葉、すなわち、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の総てに起源する細胞種を生じる、およびおそらくは、完全な生物体に成長する能力はないものの生物のありとあらゆる細胞種を生じる細胞の能力を表す。
より詳しい実施形態において、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）から取得または誘導される。本明細書に教示されるような使用または方法のより詳しい実施形態において、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、ＭＳＣから取得または誘導される。
用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、本明細書で使用する場合、間葉系、一般に２つ以上の間葉系、より一般には３つ以上の間葉系、例えば、軟骨骨芽細胞系譜（骨および軟骨）、骨芽細胞系譜（骨）、軟骨芽細胞系譜（軟骨）、筋細胞系譜（筋肉）、腱細胞系譜（腱）、線維芽細胞系譜（結合組織）、脂肪細胞系譜（脂肪）および間質形成系譜（骨髄間質）の細胞を生成し得る成体中胚葉由来幹細胞を指す。ＭＳＣは、生体サンプル、好ましくは、ヒト対象の生体サンプル、例えば、骨髄、骨梁、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、具体的には、胎児期および青年期皮膚、骨膜、歯髄、腱および脂肪組織から単離され得る。
用語「生体サンプル」または「サンプル」は、本明細書で使用する場合、生物供給源、例えば、生物、例えば、動物またはヒト対象、細胞培養、組織サンプルなどから得られるサンプルを指す。動物またはヒト対象の生体サンプルは、動物またはヒト対象から取り出され、それらの細胞を含んでなるサンプルを指す。動物またはヒト対象の生体サンプルは、１以上の組織種を含んでなり、１以上の組織種の細胞を含んでなり得る。動物またはヒト対象の生体サンプルを得る方法は、例えば、組織生検または採血など、当技術分野で周知である。ヒトＭＳＣ、それらの単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大培養、および分化は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；同第５，８１１，０９４号；同第５，７３６，３９６号；同第５，８３７，５３９号；または同第５，８２７，７４０号に記載されている。当技術分野に記載され、当技術分野で記載されているいずれの方法により単離されたＭＳＣも本方法において好適であり得る。特に、ＭＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へと三系譜間葉分化能を示すとして定義され得る(Dominici et al., 2006, vol. 8, 315)。
用語「胚性幹細胞」または「ＥＳＣ」は、本明細書で使用する場合、胚盤胞の内部細胞塊などの胚に由来し、とりわけ、ＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力、または組織培養において三胚葉総ての同定可能な細胞を形成する能力など、技術分野で認知されている標準的試験に従って、適当な条件下で、三胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の総ての誘導物である異なる細胞種の後代を産生し得る多能性幹細胞を指す。
用語「ｈＥＳ細胞」の範囲は、胚盤胞期において、または細胞の三胚葉への実質的分化の前にヒト胚から誘導される多能性幹細胞を包含する。ＥＳ細胞、特に、ｈＥＳ細胞は一般に、胚盤胞の内部細胞塊または全胚盤胞に由来する。桑実期からのｈＥＳ細胞株の誘導は文献に記載されており、このようにして得られたＥＳ細胞もまた、本発明で使用可能である(Strelchenko et al. 2004. Reproductive BioMedicine Online 9: 623-629)。用語「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」は、本明細書で使用する場合、成体細胞から初期化により生成される多能性幹細胞を指す。ｉＰＳ細胞は、自己再生可能であり、生物三胚葉の、すなわち、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の総てに起源する細胞種を生じることができ、およびおそらくは、完全な生物体に成長する能力はないものの生物のありとあらゆる細胞種を生じることができる。ｉＰＳ細胞の例は、とりわけ、Yamanaka et al. 2006 (Cell 126: 663-676)およびYamanaka et al. 2007 (Cell 131: 861-872)により教示されているようなものである。
用語「ＭＳＣ」、「ＥＳＣ」、または「ｉＰＳ」はまた、それぞれＭＳＣ、ＥＳＣまたはｉＰＳの後代、例えば、動物またはヒト対象の生体サンプルから得られる、それぞれＭＳＣ、ＥＳＣまたはｉＰＳのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ増殖(proliferation)（増殖(propagation)／拡大培養）により得られる後代を包含する。
用語「成体幹細胞」は、本明細書で使用する場合、胎児期または好ましくは、生後（例えば、特に、限定されるものではないが、ヒト生物では、生後少なくとも１か月齢、例えば、生後少なくとも２か月齢、少なくとも３か月齢、例えば、少なくとも４か月齢、少なくとも５か月齢、例えば、少なくとも６か月齢、例えば、生後１歳以上、５歳以上、少なくとも１０歳以上、１５歳以上、２０歳以上、または２５歳以上）、例えば、成年に達した後に生物体に存在するまたは生物体から得られる（例えば、単離された）幹細胞を指す。例として、成体幹細胞は、そうでなければ従来の用語「乳児」、「小児」、「若年」、「青年」、または「成人」で記載されるヒト対象から得ることができる。
記載されている場合を除き、「対象」、「ドナー」、または「患者」は互換的に使用され、動物、好ましくは、脊椎動物、より好ましくは、哺乳動物を指し、具体的には、ヒト患者および非ヒト哺乳動物を含む。好ましい患者は、ヒト対象である。動物対象は、例えば胎仔などの動物の出生前形態を含む。
本明細書に教示されるような使用または方法の特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞はヒト細胞である。
本方法およびプロトコールは好ましくは、「未分化」である多能性幹細胞集団（例えば、ｍＰＳまたはｈＰＳ細胞集団）から逸脱してもよく、すなわち、幹細胞集団中の実質的割合（例えば、少なくとも約６０％、好ましくは、少なくとも約７０％、いっそうより好ましくは、少なくとも約８０％、なおより好ましくは、少なくとも約９０％および１００％まで）の細胞が、分化を受けている細胞からそれらを明瞭に識別する未分化ｍＰＳ細胞の特性（例えば、形態学的特徴および／またはマーカー）を示す。
未分化ｍＰＳ細胞は一般に、当業者により容易に認識され、高い核／細胞質比および明瞭な核小体を有する二次元の顕微鏡像で見られ、鮮明な境界を有するコンパクトなコロニーとして増殖し得る。集団内の未分化細胞のコロニーは、より分化した隣接細胞により取り囲まれている場合が多いと理解される。しかしながら、集団がそれ自体既知の適当な条件下で培養または継代培養され、個々の未分化細胞が細胞集団の実質的な割合を構成する場合には、未分化コロニーが存続する。未分化ｍＰＳ細胞は、ステージ特異的胎児抗原（ＳＳＥＡ）３および４、ならびにＴｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と呼称される抗体（Thomson et al. 1998、前掲）を用いて検出可能なマーカーを発現し得る。未分化ｍＰＳ細胞はまた、一般に、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４およびＴＥＲＴも発現し得る。未分化ｍＰＳ細胞はまた、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の発現（例えば、好適なＡＰ活性アッセイで決定される）も含んでなり得る。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、軟骨骨芽細胞系（骨および軟骨）、骨芽細胞系譜（骨）、例えば、骨軟骨前駆細胞および／または骨前駆細胞および／または前骨芽細胞および／または骨芽細胞および／または骨細胞など；軟骨芽細胞（軟骨）系譜、例えば、骨軟骨前駆細胞および／または軟骨前駆細胞および／または前軟骨芽細胞および／または軟骨芽細胞および／または軟骨細胞；脂肪生成系譜（脂肪）；筋形成系譜（筋肉）；腱系譜（腱細胞）；線維芽細胞（結合組織）系譜、例えば、線維芽細胞、線維細胞；または滑膜系譜（滑液）のものである。
用語「軟骨骨芽細胞系」は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞に関して本明細書で使用する場合、骨芽細胞系譜の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞、骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞などに、または軟骨芽細胞系譜の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞、軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／または軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞に分化する能力を有する細胞を指し得る。当業者には、物理的因子に曝されるか、および／または増殖因子などの化学的もしくは生物学的成分に曝されるかという条件によって、骨芽細胞系譜の細胞（例えば、前骨芽細胞もしくは骨芽細胞）に分化するか、または軟骨芽細胞系譜の細胞（例えば、前軟骨芽細胞または軟骨芽細胞）に分化するかのいずれかであることが理解されるであろう。
特定の実施形態において、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、骨芽細胞系譜の細胞（例えば、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、もしくは骨細胞）または軟骨芽細胞系譜の細胞（軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞）のものである。
軟骨骨芽細胞系譜、骨芽細胞系譜または軟骨芽細胞系譜の細胞のＭＳＣの分化は、ＭＳＣの、軟骨骨芽細胞系譜、骨芽細胞系譜または軟骨芽細胞系譜の細胞への分化を誘導し得る条件下でＭＳＣを培養すること、より一般には、ＭＳＣの、軟骨骨芽細胞系譜、骨芽細胞系譜または軟骨芽細胞系譜の細胞への分化を誘導し得る１以上の薬剤（例えば、増殖因子）を含んでなる培地でＭＳＣを培養することを含み得る。ＭＳＣの、軟骨骨芽細胞系譜、骨芽細胞系譜または軟骨芽細胞系譜の細胞への分化のプロトコールは、ＭＳＣを本明細書の他所に記載したような「骨形成細胞Ｂ」に分化させるための工程およびＭＳＣを「細胞製品Ｃ」または「骨形成細胞Ｃ」に分化させるための工程を含み、これは次の通りである：骨髄白血球を、５％ＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．１ＵＩ／ｍｌヘパリン（ＬＥＯ Ｐｈａｒｍａ）、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）およびＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ））を含んでなる従来の培養培地に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートする。細胞播種の４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新する。播種の７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、増殖因子を更新するために新鮮な培地に置き換える。細胞を一次培養として１４日間培養する。１４日目に、細胞を、例えば、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取する（第１継代：Ｐ１）。中間細胞を凍結保存し（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０中）、液体窒素中で保存する。次に、中間細胞を解凍し、二次培養として５７２細胞／ｃｍ２の密度で再播種する。細胞を二次培養として１０日間培養する。２４日目に、細胞を、例えば、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取する（第２継代：Ｐ２）。中間細胞を凍結保存し（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０中）、液体窒素中で保存する。次に、中間細胞を解凍し、三次培養として５７２細胞／ｃｍ２の密度で再播種する。細胞を三次培養として１０日間培養する。３４日目に、細胞を、例えば、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取する（第３継代：Ｐ３）。最終細胞製品を得るために、細胞を例えば、ＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に、終濃度２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させる。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｃ−新鮮」と呼称する。三次培養の終了時に、細胞をまた長期保存用に凍結保存する。そのために、細胞を所望の濃度（２５×１０６細胞／ｍｌ）となるように凍結保存培地に再懸濁させる。次に、この細胞懸濁液をクライオチューブに移し、液体窒素中で保存する。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｃ−凍結」と呼称する。凍結保存培地は：ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、または５０％（ｖ／ｖ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ）および５０％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、または９５％（ｖ／ｖ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ）および５％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、または８０％（ｖ／ｖ）Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ）１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、および１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）であり得る。
ＭＳＣの、骨芽細胞系譜または軟骨芽細胞系譜の細胞への分化のためのさらなるプロトコールとしては、とりわけ、ＷＯ２００９／０８７２１３；ＷＯ２００７／０９３４３１；およびさらにREGER, R.L. et al. ‘Differentiation and Characterization of Human MSCs’. In: Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), D.J. Prockop et al.編 Humana Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107; VERMURI, M.C. et al. (編). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, 特に201〜352頁)が含まれる。
用語「増殖因子」は、本明細書で使用する場合、単独でまたは他の物質により媒介される場合に、様々な細胞種の増殖、成長、分化、生存および／または遊走に影響を及ぼし、生物の発生的、形態的および機能的変化に影響を及ぼし得る生物学的に活性な物質を指す。増殖因子は一般に、当該増殖因子に応答する細胞内に存在する受容体（例えば、表面または細胞内受容体）に、リガンドとして結合することにより作用する。本明細書において増殖因子は、特に、１以上のポリペプチド鎖を含んでなるタンパク質性の実体であり得る。例として、限定されるものではないが、用語「増殖因子」は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、骨形成因子（ＢＭＰ）ファミリー、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリー、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリー、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）ファミリー、成長分化因子（ＧＤＦ）ファミリー、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）ファミリー、造血増殖因子（ＨｅＧＦ）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、アンギオポエチン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、グルココルチコイドなどのメンバーを包含する。当業者には、増殖因子または増殖因子の組合せは、ＭＳＣの所望の細胞種への分化を誘導し得ることが知られるいずれの増殖因子または増殖因子の組合せであってもよいことが理解されるであろう。当業者は、ＭＳＣの所望の細胞種への（例えば、骨軟骨芽細胞系譜、骨芽細胞系譜、または軟骨芽細胞系譜の細胞への）分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、所望の細胞種の実質的に純粋な（すなわち、主としてそれからなる）細胞集団を生じ得ることを認識するであろう。限定されるものではないが、このようにして誘導された細胞集団は、少なくとも９０％（数で）の所望の細胞種、例えば、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、または１００％の所望の細胞種を含有し得る。
当業者には、本明細書に教示されるような方法がｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の評価に関し、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、本明細書で意図する場合、一般に、ＭＳＣなどの多能性細胞の、軟骨骨芽細胞系譜、骨芽細胞系譜または軟骨芽細胞系譜の細胞への分化を誘導し得る条件下で培養されることが理解されるであろう。これに沿って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、本明細書で意図する場合、一般に、ＭＳＣなどの多能性細胞の、筋細胞系譜（筋肉）、腱細胞系譜（腱）、線維芽細胞系譜（結合組織）、脂肪細胞系譜（脂肪）または間質形成系譜（骨髄間質）の細胞への分化を誘導し得る条件下で培養されない。
さらなる側面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定すること；ならびに
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０のうちいずれか１以上を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、および／または ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定されること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる方法を提供する。
好ましくは、さらなる側面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定すること；ならびに
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩがして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０のうちいずれか１以上を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定されること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる方法を提供する。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１５０またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０のうちいずれか１以上を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定されることを含んでなり得る。
特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法は、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１以上の量を測定すること；ならびに
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも４０、例えば、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０のうちいずれか１以上を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４ は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されることを含んでなり得る、から本質的になり得る、またはからなり得る。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも５０のうちいずれか１以上を示す場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されることを含んでなり得る。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも４０、例えば、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０のうちいずれか１以上を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されることを含んでなり得る。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも５０のうちいずれか１以上を示す場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されることを含んでなり得る。
１つの側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ１０の量を測定すること；ならびに
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも４０、例えば、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を示すことを決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる方法を提供する。
特定の好ましい実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも５０を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されることを含んでなり得る。
１つの側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ１０の量を測定すること；ならびに
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも４０、例えば、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる方法を提供する。
特定の好ましい実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも５０を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有することを決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されることを含んでなり得る。
さらなる側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ１０の量を測定すること；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも４０、例えば、少なくとも５０、少なくとも５５または少なくとも６０を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる方法を提供する。
特定の好ましい実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも５０を有する場合に、骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されることを含んでなり得る。
好ましくは、さらなる側面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量を測定すること；ならびに
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定されること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる方法を提供する。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が、
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０のうちいずれか１以上；
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０；
ｎＭＦＩＣＤ７３として少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０または少なくとも９００；ｎＭＦＩＣＤ４４として少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００または少なくとも３５０；またはｎＭＦＩＣＤ１０５として多くても１８０、多くても１７０、多くても１６０、多くても１５０、多くても１４０、多くても１３０、多くても１２０、多くても１１０または多くても１００のうちいずれか１以上；
ｎＭＦＩＣＤ７３として少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０または少なくとも９００；ｎＭＦＩＣＤ４４として少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００または少なくとも３５０；およびｎＭＦＩＣＤ１０５として多くても１８０、多くても１７０、多くても１６０、多くても１５０、多くても１４０、多くても１３０、多くても１２０、多くても１１０または多くても１００；
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも７００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも２００またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０のうちいずれか１以上；および／または
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも７００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも２００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０
を有する場合に、
それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能、特に、臨床上有用な骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定されること
を含んでなり得る。
特定の実施形態において、本明細書に教示されるような方法は、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％がＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する場合、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が、
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０のうちいずれか１以上；
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも１００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０；
ｎＭＦＩＣＤ７３として少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０または少なくとも９００；ｎＭＦＩＣＤ４４として少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００または少なくとも３５０；またはｎＭＦＩＣＤ１０５として多くても１８０、多くても１７０、多くても１６０、多くても１５０、多くても１４０、多くても１３０、多くても１２０、多くても１１０または多くても１００のうちいずれか１以上；
ｎＭＦＩＣＤ７３として少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０または少なくとも９００；ｎＭＦＩＣＤ４４として少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００または少なくとも３５０；およびｎＭＦＩＣＤ１０５として多くても１８０、多くても１７０、多くても１６０、多くても１５０、多くても１４０、多くても１３０、多くても１２０、多くても１１０または多くても１００；
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも７００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも２００またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０のうちいずれか１以上；および／または
ＣＤ７３のｎＭＦＩとして少なくとも７００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして少なくとも２００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして多くても１５０
を有する場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能、特に、臨床上有用な骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される。
本発明者らは、本明細書に教示されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法は、臨床上有用な骨形成能を有する細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化可能なＭＳＣを含んでなるＭＳＣドナーを選択するために使用可能であることを見出した。
よって、さらなる側面は、軟骨骨形成系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するための対象を選択するための方法であって、
対象の生体サンプルからＭＳＣを回収すること；
前記ＭＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を得ること；
本明細書に教示されるような方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定すること；および
それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有する場合にその対象をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化軟骨骨芽細胞系譜細胞を調製するために選択すること
を含んでなる方法を提供する。
特定の実施形態において、対象の生体サンプルからのＭＳＣの回収は、本発明の他所に記載したように実施することができる。特定の実施形態において、ＭＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の取得は、本発明の他所に記載したように実施することができる。
特定の実施形態において、対象はヒト対象である。
当業者には、本明細書に記載されるような定義および特定の実施形態は、本明細書に開示されるような総ての方法および使用に当てはまることが理解されるであろう。
本願はまた、以下の記載に示されるような側面および実施形態を提供する。
記載１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の使用。
記載２ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定することを含んでなる、方法。
記載３
（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定すること；
（ｂ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；
（ｂ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す１以上の各カットオフ値と比較すること；
（ｃ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；
（ｃ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１つの量の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；ならびに
（ｄ）前記偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰すること
を含んでなる、記載２に記載の方法。
記載４ 前記（ｂ１）のカットオフ値および前記（ｂ２）の各カットオフ値が臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値である、記載３に記載の方法。
記載５
（ａ１）で測定されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合が（ｂ１）のカットオフ値に比べて減少していることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有さないことを示すか、または
（ａ１）で測定されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合が（ｂ１）のカットオフ値に比べて同等以上であることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示し；および
（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３およびＣＤ４４のうちいずれか１つの量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて減少しており、かつ／または（ａ２）で測定されるようなＣＤ１０５の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて増加していることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有さないことを示すか、または
（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３およびＣＤ４４の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等以上であり、かつ（ａ２）で測定されるようなＣＤ１０５の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等以下であることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示す、
記載４に記載の方法。
記載６ 前記（ｂ１）のカットオフ値が、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ前記（ｂ２）のカットオフ値が、ＣＤ７３の正規化蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）として５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１００および／またはＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０であり、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、および／またはｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される、記載３〜５のいずれか１つに記載の方法。
記載７ ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量が測定され、かつ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量が測定される、記載１〜６のいずれか１つに記載の方法。
記載８ 前記（ｂ１）のカットオフ値が細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ前記（ｂ２）のカットオフ値がＣＤ７３のｎＭＦＩとして５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０であり、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定され、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定され、およびｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに関して励起波長６３３ｎｍおよび発光波長６６０ｎｍで測定される、記載７に記載の方法。
記載９ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得られる、記載１〜８のいずれか１つに記載の方法。
記載１０ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がヒト細胞である、記載１〜９のいずれか１つに記載の方法。
記載１１ 軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するための対象を選択するための方法であって、
対象の生体サンプルからＭＳＣを回収すること；
前記ＭＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を得ること；
記載１〜１０のいずれか１つに定義される方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定すること；および
それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有する場合にその対象をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化軟骨骨芽細胞系譜細胞を調製するために選択すること
を含んでなる、方法。
記載１２ 前記対象がヒト対象である、記載１１に記載の方法。
記載１３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、およびＣＤ１０の使用。
記載１４ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定することを含んでなる、方法。
記載１５
（ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
（ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定すること；
（ｂ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；
（ｂ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す１以上の各カットオフ値と比較すること；
（ｃ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；
（ｃ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１つの量の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；および
（ｄ）前記偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰すること
を含んでなる、記載１４に記載の方法。
記載１６ 前記（ｂ１）のカットオフ値および前記（ｂ２）の各カットオフ値が臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値である、記載１５に記載の方法。
記載１７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちいずれか１以上の量が測定される、記載１４〜１６のいずれか１つに記載の方法。
記載１８
（ａ１）で測定されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合が（ｂ１）のカットオフ値に比べて同等以上であることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示し；かつ
（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ４４および／またはＣＤ１０の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等以上であり、かつ、（ａ２）で測定されるようなＣＤ１０５の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等以下であることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示す、
記載１６または１７に記載の方法。
記載１９ 前記（ｂ１）のカットオフ値が細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ前記（ｂ２）のカットオフ値がＣＤ７３の正規化蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）として５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして４０である、記載１５〜１８に記載の方法。
記載２０ 前記（ｂ１）のカットオフ値が細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ前記（ｂ２）のカットオフ値がＣＤ７３の正規化蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）として５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして４０である、記載１５〜１８に記載の方法。
記載２１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量が測定される、記載１４〜２０のいずれか１つに記載の方法。
記載２２ 前記（ｂ２）のカットオフ値がＣＤ７３のｎＭＦＩとして５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０である、記載２１に記載の方法。
記載２３ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得られる、記載１３に記載の使用または記載１４〜２２のいずれか１つに記載の方法。
記載２４ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がヒト細胞である、記載１３に記載の使用または記載１４〜２３のいずれか１つに記載の方法。
記載２５ 軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するための対象を選択するための方法であって、
対象の生体サンプルからＭＳＣを回収すること；
前記ＭＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を得ること；
記載１４〜２４のいずれか１つに定義される方法によりｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定すること；および
それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有する場合にその対象をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化軟骨骨芽細胞系譜細胞を調製するために選択すること
を含んでなる、方法。
記載２６ 対象がヒト対象である、記載２５に記載の方法。
記載２７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ１０の量を測定すること；および
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも４０を有する場合に、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は骨形成能を有する決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０は、ＰＥに関して励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されること
を含んでなる、から本質的になる、またはからなる、方法。
本発明をその特定の実施形態に関して説明してきたが、以上の説明に照らせば当業者には多くの代替、改変、および変形が明らかであることは明白である。よって、以下のようなこのような代替、改変、および変形は総て、添付の特許請求の範囲の趣旨および広義の範囲に包含することが意図される。
本明細書に開示される本発明の側面および実施形態は、以下の限定されない例によりさらに裏づけられる。
実施例１：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびＭＳＣ由来細胞を得るための方法
間葉系幹細胞
未分化ＭＳＣは、健康なボランティアドナーの腸骨稜からヒト骨髄（ＢＭ）穿刺液を得ることにより調製した。採取後、骨髄白血球を計数し、培養培地に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。２４時間後、培養培地を除去し、細胞新鮮培養培地を加えた。培養培地は２〜３日毎に置き換えた。半分を超えるコロニーが集密度８０％に達した際または数コロニーが集密度１００％に達した際に、細胞を採取した（第１継代１：Ｐ１）。この第１継代時に、細胞をそのままＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）中で凍結保存した。培養プロセスを終了させるために、ＭＳＣを解凍し、二次培養として５７２細胞／ｃｍ２で播種し、培養した。半分を超えるコロニーが集密度８０％に達した際または数コロニーが集密度１００％に達した際に、第２継代（Ｐ２）のＭＳＣを得るために細胞を採取した。この細胞製品を本明細書では「ＭＳＣ」と呼称する。
細胞製品Ａ（本明細書では骨形成細胞Ａとも呼称）
５％Ｏｃｔａｓｅｒｕｍ（５０：５０自己血清およびＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ））、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を含んでなる従来の培養培地。
１０％Ｏｃｔａｓｅｒｕｍ（５０：５０自己血清およびＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ））、１０％ＤＭＳＯを含んでなる凍結培地
健康なボランティアドナーの腸骨稜からヒトＢＭ穿刺液を得ることにより、本明細書において「細胞製品Ａ」と呼称されるｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＭＳＣ由来細胞を作製した。採取後、骨髄白血球を計数し、５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で培養培地に播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。細胞播種の４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新した。播種の７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、新鮮培地に置き換えた。細胞は一次培養として１４日間培養した。１４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第１継代：Ｐ１）。中間細胞を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）または凍結培地中で凍結保存し、液体窒素中で保存した。
二次培養のために、細胞を解凍し、１１４４細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。細胞を二次培養として１４日間培養した。２８日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第２継代：Ｐ２）。最終細胞製品を得るために、細胞をＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ａ」と呼称する。
細胞製品Ｂ（本明細書では骨形成細胞Ｂとも呼称）
５％ＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．１ＵＩ／ｍｌヘパリン（ＬＥＯ Ｐｈａｒｍａ）、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を含んでなる従来の培養培地。
健康なボランティアドナーの腸骨稜からヒトＢＭ穿刺液を得ることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＭＳＣ由来細胞を作製した。採取後、骨髄白血球を計数し、培養培地中に５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。細胞播種４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新した。播種７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、増殖因子を更新するために新鮮培地と置き換えた。細胞を一次培養として１４日間培養した。１４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第１継代：Ｐ１）。中間細胞をＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）中で凍結保存し、液体窒素中で保存した。
次に、中間細胞を解凍し、二次培養として２８６細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。細胞を二次培養として１４日間培養した。２８日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第２継代：Ｐ２）。最終細胞製品を得るために、細胞をＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｂ」と呼称する。
細胞製品Ｃ（すなわち、細胞製品Ｃ新鮮および細胞製品Ｃ凍結；本明細書では骨形成細胞Ｃとも呼称）
５％ＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、０．１ＵＩ／ｍｌヘパリン（ＬＥＯ Ｐｈａｒｍａ）、ＦＧＦ−ｂ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）およびＴＧＦβ−１（Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ）を含んでなる従来の培養培地。
健康なボランティアドナーの腸骨稜から２０〜６０ｍｌのヒト骨髄（ＢＭ）穿刺液を得た。採取後、骨髄白血球を計数し、５０，０００細胞／ｃｍ２の密度で培養培地に播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにて３７℃でインキュベートした。細胞播種の４日後に、非接着細胞を除去し、培地を培養培地に更新した。播種の７日後および１１日後に、培養培地の半分を除去し、増殖因子を更新するために新鮮な培地に置き換えた。細胞を一次培養として１４日間培養した。１４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第１継代：Ｐ１）。中間細胞を凍結保存し（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０中）、液体窒素中で保存した。各細胞保存株は１名のドナーから供給し、ドナー間でプールは行わなかった。
次に、中間細胞を解凍し、二次培養として５７２細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。細胞を二次培養として１０日間培養した。２４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第２継代：Ｐ２）。中間細胞を凍結保存し（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０中）、液体窒素中で保存した。
次に、中間細胞を解凍し、三次培養として５７２細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。細胞を三次培養として１０日間培養した。３４日目に、細胞を、Ｔｒｙｐｚｅａｎ（Ｌｏｎｚａ）を用いて剥離し、旋回撹拌し、ピペットで上下させることにより採取した（第３継代：Ｐ３）。最終細胞製品を得るために、細胞をＯｃｔａＰｌａｓＬＧ（登録商標）に終濃度２５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｃ−新鮮」と呼称する。
三次培養の終了時に、細胞をまた長期保存用に凍結保存した。そのために、細胞を所望の濃度（２５×１０６細胞／ｍｌ）となるように凍結保存培地に再懸濁させた。次に、この細胞懸濁液をクライオチューブに移し、液体窒素中で保存した。この細胞製品を本明細書では「細胞製品Ｃ−凍結」または「骨形成細胞Ｃ凍結（保存）」と呼称し、「Ｂ−Ｆ細胞 Ｃ」とも略す。凍結保存培地は、次の通りであった。
ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、または
５０％（ｖ／ｖ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）および５０％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、または
９５％（ｖ／ｖ）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）および５％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）または
８０％（ｖ／ｖ）Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、および１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清アルブミン（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）。
実施例２：ＭＳＣ由来軟骨骨芽細胞系譜細胞のｉｎ ｖｉｖｏ骨形成特性
材料および方法
細胞培養
ＭＳＣ、骨形成細胞Ａ、ＢおよびＣは、実施例１に記載の通りに調製した。
マウス
９〜１０週齢の雌ＮＭＲＩ−Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）マウスをＪａｎｖｉｅｒ Ｓ．Ａ．Ｓ．（Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）から購入し、食物および水を自由に摂らせる標準的条件で飼育した。本試験には合計１９６個体のマウスを使用した。
頭蓋冠骨形成マウスモデル
１２週齢の雌ＮＭＲＩ−Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）マウス（ｎ＝１３７）をイソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標））で麻酔し、頭蓋冠骨にＭＳＣ、骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１を用いて形成）、または骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成）（マウス当たり１００μｌ中２．５×１０６細胞）または賦形剤（１００μｌ）の単回の皮下投与を施した。経時的に骨新形成を標識するために、カルシウム結合蛍光色素をマウスに順次投与した。アリザリンレッド（赤）、カルセイン（緑および青）およびテトラサイクリン（黄）（総てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から）をそれぞれ細胞投与の３日前および４日、８日、および１２日後に腹腔内投与した。試験動物の、投与後２週間の体重、全身の臨床徴候、および投与部位の臨床徴候を経過観察した。細胞投与の２週間後に頚椎脱臼によりマウスを安楽死させ、各マウスの頭蓋冠を採取して、骨形成細胞の骨形成特性をＸ線撮像、組織形態計測（骨形成の定量）および免疫蛍光により評価した。
頭蓋冠骨形成マウスモデル−細胞製品Ｃ凍結
１２週齢の雌ＮＭＲＩ−Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）マウスをイソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標））で麻酔し、細胞製品Ｃ凍結（マウス１個体当たり１００μｌ中２．５×１０６細胞）または賦形剤（１００μｌ）を頭蓋冠骨に単回の皮下投与を施した。経時的に骨新形成を標識するために、カルシウム結合蛍光色素をマウスに順次投与した。アリザリンレッド（赤）、カルセイン（緑および青）およびテトラサイクリン（黄）（総てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から）をそれぞれ細胞投与の２日または３日前および５日、１２日、および１９日後に腹腔内投与した。試験動物の、投与後４週間の体重、全身の臨床徴候、および投与部位の臨床徴候を経過観察した。細胞投与の４週間後に頚椎脱臼によりマウスを安楽死させ、各マウスの頭蓋冠を採取して、骨形成細胞の骨形成特性をＸ線撮像、組織形態計測（骨形成の定量）および免疫蛍光により評価した。
サンプル包理および組織切片化
組織形態計測、ＡＬＰ、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）、マッソントリクロームゴールドナー染色および免疫蛍光のために、頭蓋冠を固定し、４℃で穏やかに振盪しながら、各１２時間の７０％、８０％および９０％エタノール浴での連続インキュベーションで脱水し、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）プラスチック樹脂（ＨｉｓｔｏＲｅｓｉｎ、Ｌｅｉｃａ（登録商標））に包埋した。４μｍ厚および８μｍ厚の冠状切片を、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ（登録商標）、ＲＭ２２５５）を用いて切片化した。サフラニンオレンジ染色およびイムノペルオキシダーゼについては、頭蓋冠を３．７％ホルムアルデヒドで２４時間固定し１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ｐＨ７．４中で３日間、脱石灰化し、パラフィンに包埋した。７μｍ厚の冠状および矢状パラフィン切片を、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ（登録商標）、ＲＭ２２５５）を用いて切片化した。
免疫蛍光染色
頭蓋冠の４μｍ厚冠状プラスチック組織切片に対してヒトおよびマウスコラーゲンＩの免疫蛍光による評価を行った。簡単に述べれば、室温で３０分間、ＰＢＳ １Ｘ／Ｔｒｉｔｏｎ０．３％の溶液を用いた透過化工程の後、組織切片を、室温で１時間、ブロッキング溶液（すなわち、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ウマ血清／Ｔｒｉｔｏｎ（商標））中でインキュベートして非特異的結合部位を飽和させた。次に、これらの組織スライドをマウス抗ヒトおよびウサギ抗マウスコラーゲンＩ一次抗体（それぞれＡｂｃａｍ；＃ａｂ１３８４９２およびＡｂｃａｍ；＃ａｂ２１２８６）とともに４℃で一晩インキュベートした。ＲＴで５分のＰＢＳ中での３回の洗浄の後、室温で１時間、ブロッキング溶液でブロッキングを行った。次に、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体を室温で２時間加え、遮光した。二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１２０６）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｃｙ３（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ；＃ａｂ９７０３５）を、それぞれマウスコラーゲンＩを緑でおよびヒトコラーゲンＩを赤で可視化するために使用した。次に、これらのスライドをＰＢＳ １×中、室温で５分、３回すすぎ、室温で１分、ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）溶液とともにインキュベートすることによって核を染色した。最後に、これらのスライドをＰＢＳ中で１回、軽くすすいだ後、ＧｌｙｃｅｒＧｅｌ（登録商標）試薬にマウントした。免疫蛍光の陰性対照として、隣接する組織スライドでは一次抗体を除いた。
組織染色
骨芽細胞および破骨細胞活性をそれぞれ頭蓋冠切片で、それぞれＡＬＰおよびＴＲＡＰ酵素活性検出法を用いて評価した。ＡＬＰ染色では、４μｍ厚の頭蓋冠冠状プラスチック切片を、Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ ＲＲ Ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））およびＮａｐｈｔｏｌ ＡＳ−ＭＸアルカリ性リン酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の溶液とともに１時間インキュベートした。８μｍ厚の頭蓋冠冠状プラスチック切片に対し、Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ（ＴＲＡＰ）キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を製造者の説明書に従って用い、ＴＲＡＰ染色を行った。新たに形成された骨の石灰化の状態を評価するために、ＡＬＰで染色した頭蓋冠切片に対し、キット（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ（登録商標））を製造者の説明書に従って用い、マッソントリクロームゴールドナー染色を行った。軟骨形成を明らかにするために、７μｍ厚頭蓋冠矢状パラフィン切片に対してサフラニンオレンジ染色を行った。簡単に述べれば、脱パラフィン後、組織切片をワイゲルトヘマトキシリン（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ（登録商標））で１０分間、０．１％Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ（登録商標））で５分間、１％酢酸（ＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で１５秒間および０．１％サフラニンオレンジ（Ｆｌｕｋａ（登録商標）参照：８４１２０）で５分間、順次インキュベートした。脱水後、Ｐｅｒｔｅｘ（登録商標）（ＨｉｓｔｏＬａｂ（登録商標））を用い、スライドにカバーガラスを載せた。デジタル画像を、光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ（登録商標））およびＬｅｉｃａ（登録商標）ＬＡＳ ＥＺソフトウエアを用いて取得した。
イムノペルオキシダーゼ
脱パラフィン後、７μｍ厚の頭蓋冠冠状または矢状パラフィン切片を、２．５％ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））とともに３７℃で３０分間、３％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））中、室温で３０分間、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を含有するＰＢＳ中、室温で３０分間、およびブロッキング溶液（すなわち、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ウマ血清／Ｔｒｉｔｏｎ）中、室温で１時間、順次インキュベートした。切片をマウス抗ヒトＩ型コラーゲン一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９０３９５）、ウサギ抗マウスＩ型コラーゲン一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１２８６）またはウサギ抗Ｋｕ８０一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０５９２）とともに４℃で一晩インキュベートした。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＫ６２００）および３，３’ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、製造者の説明書に従って用いて染色を可視化した。切片を、マイヤーヘマトキシリン（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ（登録商標））を用いて対比染色した。Ｐｅｒｔｅｘ（登録商標）を用い、スライドにカバーガラスを載せた。
Ｘ線分析による骨形成の定量（骨形成細胞Ｃ）
安楽死時に、横に並べた各マウスの頭蓋冠のｅｘ ｖｉｖｏ Ｘ線撮像をＦａｘｉｔｒｏｎ（登録商標）ＭＸ−２０装置を用いて行った。デジタル画像は、手動モードにて、３５ｋＶに設定した電圧、曝露時間４．８秒、明度／対比 ８３００／６０００として、倍率１．５倍で撮影した。作成されたＸ線像は、０（ブラック領域）〜２５５（ホワイト領域）の範囲のグレー強度値を用いたグレーレベル画像であり、放射線不透性および従って骨不透明度または骨厚に正比例する。頭頂骨の骨形成の骨誘導部分（選択から除外された石灰化結節）（手による選択）のグレーレベル強度値を、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウエアのヒストグラムツールを用いて解析した。
Ｘ線撮像およびＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウエアは、石灰化結節（手による選択）の表面積を定量するためにも使用した。
頭蓋冠の組織形態計測的解析：骨形成の定量
骨形成（すなわち、絶対的骨形成）の定量をプラスチック包埋組織で行った。石灰化結節有りおよび無しの絶対的新形成骨の厚さ（アリザリンレッドにより蛍光標識された基底石灰化前線からカルセインおよびテトラサイクリンにより蛍光標識された骨新形成まで）を、４μｍ厚の冠状切片でＺＥＮ（登録商標）画像解析ソフトウエア（Ｚｅｉｓｓ）により測定した（μｍ）。各動物について、５つの独立したレベルで、各レベル間の距離を２００μｍとして絶対的厚さの４回の測定を行った、第一段階として、各動物について、厚さの平均（結節有りまたは無し）±ＳＤ（すなわち、５つのレベルの各レベル当たり４回の測定の平均）を計算した。
組織画像上での新たに形成した骨の表面積の定量（ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエア）
骨誘導および骨形成結節の表面積分析のために、頭蓋冠のプラスチック樹脂組織切片（４μｍ）から冠状縫合糸を取った後に、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ Ａ１、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）の多重蛍光および明視野フィルターの組合せを用いて６つの独立したレベルのデジタル画像を２レベル毎に取得した。各測定レベルで、骨誘導性の骨新形成の選択はＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエアを用い、明視野ステッチ画像において手により画定した。この選択領域の石灰化表面積および総表面積を測定した（ｍｍ２）。骨形成結節の石灰化表面積および総表面積にも同じ手順を行った。
骨誘導および骨形成結節については、その後、実験動物当たりおよび群当たりの総表面積の平均および石灰化表面積の平均を計算した。最後に、骨新形成の総表面積を骨誘導および骨形成結節表面積の合計として計算した。
統計分析
結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。統計分析は、ＪＭＰ（登録商標）（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）またはＧａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウエアを用いて行った。群間の差異は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意と見なした。
結果
骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１を用いて形成）および骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成）は両方とも、投与２週間後に対照（賦形剤）よりも有意に高い骨形成を示した（図１〜２、表１）。より詳しくは、図３は、骨形成細胞Ｂは骨誘導特性（頭蓋冠にマウス起源の均質な骨形成）、および骨形成特性（ヒトおよびマウス起源の石灰化結節）を呈したことを示す。
Figure 2022502034
 略語: SD: 標準偏差
骨誘導特性（すなわち、移植後に新たに形成されたマウス骨の量）は、骨形成細胞ＡとＢで同等であった（図１〜２）。
極めて興味深いことに、本発明の骨形成細胞Ｂは、移植後に新たに形成されたヒトおよびマウス骨の高い量で示されるように（ヒトおよびマウスＣｏｌＩ ＩＦ染色、図３）、強い骨形成特性および骨誘導特性を示した。
結節の存在は、骨形成細胞Ｂでは７／８ドナーおよびマウスの８０％に、また、骨形成細胞Ａでは４／１１ドナーおよびマウスの２０％に見られた。ＭＳＣまたは賦形剤の投与後には、結節は見られなかった。従って、骨形成細胞Ｂは、骨誘導活性に加え、処置マウスの８０％に見られる大きな石灰化結節の存在により強調される高い骨形成活性を促進するが、骨形成細胞Ａは処置マウスのわずか２０％に弱い骨形成活性、すなわち、小さな結節を示す（表２）。
Figure 2022502034
 略語: MSC: 間葉系幹細胞; NA: 適用不可
投与（賦形剤単独、ＭＳＣ、骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１を用いて形成；ｂ−ｆ細胞Ａ）または骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンを用いて形成；ｂ−ｆ細胞Ｂ））２週間後のマウス骨頭蓋冠冠状切片の組織染色は、総ての処置条件（ＭＳＣ、ｂ−ｆ細胞Ａおよびｂ−ｆ細胞Ｂ）が骨誘導により形成された骨において中等度のリモデリング活性（ＡＬＰおよびＴＲＡＰ染色）で高い骨誘導能を有することを明らかにした。
興味深いことに、骨形成細胞Ｂで処置したマウスに見られる石灰化結節は、マウス（宿主）およびヒト（ドナー）両方の骨組織から構成され（ヒトおよびマウスＩ型コラーゲン染色を証拠とする）、骨形成プロセス：骨形成（ドナー骨形成）と骨誘導プロセス（宿主骨形成）の両方によって形成されていたことを示す。高い骨芽細胞および破骨細胞活性（ＡＬＰ＋ＴＲＡＰ染色）に加え、これらの結節は類骨組織（非石灰化組織）を示し、骨形成が投与２週間後になお進行しているたが、総ての条件で見られた骨誘導プロセスはすでに完了していたことを示唆する（図４）。
図４は、ヒト骨形成（すなわち、骨形成）（抗ヒトＩ型コラーゲン染色として観察される）、ならびに高い骨芽細胞および破骨細胞活性（それぞれＡＬＰ＋ゴールドナー染色およびＴＲＡＰ染色として観察される）はほとんどが骨形成細胞Ｂを投与したマウスの結節で検出されたことを示し、それにより、完了していると見られたＭＳＣおよび骨形成細胞Ａの骨誘導プロセスとは異なり、結節の骨形成プロセスは２週間の時点では進行中であって完了していなかたったことを示す。総ての処置条件（ＭＳＣ、ｂ−ｆ細胞Ａ、ｂ−ｆ細胞Ｂ）が、骨誘導性骨形成において中等度のリモデリング活性（ＡＬＰおよびＴＲＡＰ染色）で高い骨誘導能を有していた（図４）。
骨新形成を、賦形剤単独、ＭＳＣ、ｂ−ｆ細胞Ａまたはｂ−ｆ細胞Ｂで処置した２週間後の蛍光により評価した（図５）。この目的で、特定の時点で、骨カルシウム結合蛍光色素（すなわち、アリザリンレッド、カルセイングリーンおよびブルー、テトラサイクリンイエロー）を、新たに形成した骨を標識するためにマウスに投与した。投与した最後の蛍光色素はテトラサイクリンであり、細胞投与の１２日後に投与した。
図５に示されるように、骨形成細胞Ｂを投与したマウスの結節は、テトラサイクリン蛍光色素（図５で黄色の染色が点線に囲まれている）によりほとんど染色され、骨誘導性の骨形成（アリザリンレッド（赤）、カルセイン（緑）およびカルセインブルー(calecin blue)（青）：これらの染色は薄いグレーとして見え、二重矢印は骨形成厚を示す）に見られる骨誘導に比べて形成の後期であることが確認される。
処置マウスの骨新形成は、組織画像における新たに形成した骨の表面積の定量により評価した（ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエア）。新たに形成した骨の総表面積は、各分析レベルおよび各マウスについての骨誘導表面積と骨結節表面積の合計で求めた。
結果は、骨形成細胞Ｂ（ｎ＝７マウス、図６に薄いグレーで示される）は細胞投与の２週間後に、ＭＳＣ（ｎ＝６マウス、図６に濃いグレーで示される；表３）の約２倍に、骨新形成を有意に増進したことを示す。この差は骨形成細胞Ｂによって示される高い骨形成特性によるものであり、ＭＳＣにはこのような特性は無かった。
Figure 2022502034
 略語: MSC: 間葉系幹細胞; SD: 標準偏差
さらに、組織染色を用いた経時的な骨新形成の評価は、骨形成細胞Ｂを投与したマウスの頭蓋冠に見られた結節が軟骨内骨化機序によって骨化していたことを明らかにした。図７で、サフラニンオレンジ染色は、プロテオグリカン（軟骨に特異的）基質（破線で囲まれている）；核；骨組織；および細胞質を示す。膜内骨化により産生された骨誘導性の骨に対して、骨結節は軟骨内骨化を経て産生され、軟骨基質は投与１週間後〜３週間後に見られる（図７）。
ヒトＩ型コラーゲン、マウスＩ型コラーゲンおよびヒト核（すなわち、Ｋｕ８０）を標的とする免疫組織化学染色を、結節においてヒト骨の存在が確認された骨形成細胞Ｂの投与４週間後に行った。さらに、Ｋｕ８０染色は、骨形成細胞Ｂがｉｎ ｖｉｖｏ投与後に骨基質（結節）内に生着し、骨細胞となったことを明らかにした。細胞製品Ｃ凍結を投与したマウスは、投与４週間後に対照よりも高い骨形成を示した（図１１Ａ〜Ｃ）。骨不透明度は、賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結で有意に高かった（図１１Ｂ）。骨形成の表面積は、石灰化結節が見られなかった賦形剤に比べて有意に高かった（図１１Ｃ）。骨形成を伴うまたは伴わない骨誘導（絶対的骨形成により表される）の組織形態計測的尺度は、賦形剤に比べて骨形成細胞Ｃ凍結で有意に高かった（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。また、骨誘導活性に加え、骨形成細胞Ｃ凍結は、石灰化結節の存在により強調される高い骨形成活性を促進した。この骨形成活性は４／５の骨髄ドナー（またはバッチ生成物）および６５％のマウスに見られた（図１１Ｆ）。１ドナー／バッチは、各群１個体のマウスで少なくとも１つの石灰化結節が見られた場合に骨形成性（陽性）であると見なした。賦形剤の投与後には結節は見られなかった。
より詳しくは、細胞製品Ｃ凍結は、骨誘導特性（頭蓋冠でのマウス起源の均質な骨形成）および骨形成特性（ヒトおよびマウス起源の石灰化結節）の両方を示した（図１２）。
頭蓋冠表面に膜内宿主骨化が誘導された（図１２および１３）。より詳しくは、骨形成細胞Ｃ凍結は、骨誘導特性および骨形成特性を示した（図１３「ｆｌｕｏ」）。マウス／ヒトＩ型コラーゲン二重免疫標識（図１３「ヒトＩ型コラーゲン」）は、宿主およびドナー起源の骨の存在（骨形成）を明らかにした。骨芽細胞活性（図１３「ＡＬＰ＋」）および破骨細胞（図１３「ＴＲＡＰ」）活性はほとんど石灰化結節に検出され、結節内の骨リモデリングプロセスが投与後４週間目になお進行していたことを示した。この所見は結節の大きさに依存し、結節が大きいほど高いＡＬＰ活性およびＴＲＡＰ活性が投与後４週間目になお存在していた。弱い類骨（図１３「ゴールドナーのマッソントリクローム染色」）が強調され、骨形成が完了していることを示す。
よって、骨形成細胞Ｃ凍結保存は骨新形成を高めた。
このことは、扁平骨ならびに長骨における骨欠損の治療のための、本明細書および実施形態に記載されるような細胞製品および細胞組成物の有用性を実証する。
実施例３：骨形成細胞Ａ、骨形成細胞Ｂおよび骨形成細胞Ｃ凍結保存により修復されたｉｎ ｖｉｖｏマウス大腿分節未臨界サイズ欠損（ｓｕｂ−ＣＳＤ）
試験手順
細胞培養
骨形成細胞Ａ、骨形成細胞Ｂおよび骨形成細胞Ｃ凍結保存は、実施例１に記載されているように調製した。
大腿分節ｓｕｂ−ＣＳＤモデル
文献(Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80; Manassero et al., 2016, Journal of Visualized Experiments; (116): 52940)に従い、無菌条件下で外科手術を行った。簡単に述べれば、１３週齢の雌ＮＭＲＩ−Ｎｕｄｅ（ｎｕ／ｎｕ）マウス（ｎ＝７３）をデクスメデトミジン塩酸塩（Ｄｅｘｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）、Ｏｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ、１ｍｇ／体重ｋｇ）とケタミン（Ｎｉｍａｔｅｋ（登録商標）、Ｅｕｒｏｎｅｔ、１５０ｍｇ／体重ｋｇ）の混合物の腹腔内注射で麻酔し、加温プレート上に腹臥位に置いた。左大腿の前側に４個または５個のねじで固定した６穴チタンマイクロロッキングプレート（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ（登録商標））を適用した後、ギグリのこぎりおよびジグ（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ（登録商標））を用い、２ｍｍ長の大腿骨幹中部骨切り術を行った。予防的投薬として、抗生物質（Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標）、１０ｍｇ／体重ｋｇ）を手術前日に投与し（飲用水中）および鎮痛剤（ブプレノルフィン塩酸塩、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、０．１ｍｇ／体重ｋｇ）を手術前日と手術後少なくとも３日間１２時間毎に投与した。ＭＳＣ由来細胞（マウス当たり３０μｌ容量中２．２５×１０６細胞）または賦形剤（対照群）を手術当日（外科縫合糸で創傷を閉じた直後）に、骨欠損部位に局所的に、５０μｌハミルトンシリンジを用いた経皮注射により投与した。細胞または賦形剤投与の６週間後または１０週間後に頚椎脱臼によりマウスを安楽死させた。各マウスの左大腿を切開し、採取し、Ｘ線撮像まで０．９％ＮａＣｌ中、室温で維持した。
Ｘ線分析による骨修復の定量
各マウスの左大腿のｉｎ ｖｉｖｏＸ線撮像は、手術直後に、プレートの固定、分節大腿骨欠損サイズを制御するために、また、ベースラインを得るために、Ｆａｘｉｔｒｏｎ（登録商標）ＭＸ−２０装置を用いて２週毎に行った。デジタル画像は、手動モードにて、３５ｋＶに設定した電圧、曝露時間４．８秒、明度４，３００および対比７，１００として、倍率５倍で内外像および前後像を撮影した。ｅｘ ｖｉｖｏＸ線撮像は、細胞投与６週間後の安楽死の際に採取した左大腿に対して行った。骨形成細胞Ａおよび骨形成細胞Ｂの実験については、欠損サイズは、各マウスについて、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエアを用い、内外および前後Ｘ線像で、骨欠損の両端間の距離（μｍ）を３か所（欠損の右、中央、および左）で測定すること（合計６回の測定）により経時的に定量した。各マウスの各時点で、６回の測定値の平均を計算した。
骨形成細胞Ｃ凍結保存の実験については、欠損サイズは、各マウスについて、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエアを用い、内外および前後Ｘ線像で、骨欠損の両端間の距離（μｍ）を２か所（両皮質）で測定すること（合計４回の測定）により経時的に定量した。各マウスの各時点で、４回の測定値の平均を計算した。
ＳＦＣＳＤモデルに関して適合されたＲＵＳ（ラジオグラフィックユニオンスコア）は、骨新形成、接合および骨折線（前後画像および内外ラジオグラフィック画像から）の有無に基づく半定量的測定値である。スコアリングは、両像で２つの皮質欠損部位において決定した４スコアの合計（各１〜４の範囲の４スコアの合計）に相当する。従って、スコアリングは、４（治癒の徴候無し）〜１６（完全な癒合）の範囲である。
癒合スコアは、大腿欠損の両端間の癒合率を評価するバイナリスコアである。癒合を定義するために使用される放射線学的基準は、少なくとも３つの皮質における欠損の接合の可視化である(Cekich E et al., Acta Orthop Traumatol Turc. 2014, 48(5), 533-40)。スコアは０（癒合無し）または１（癒合）である。このパラメーターについては、最後の時点のみ分析した（ここでは、Ｗ１０）。
マイクロコンピューター断層撮影法（ｍｉｃｒｏ−ＣＴ）解析
安楽死の際に採取した後、左大腿を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、マイクロＣＴ解析のためにCenter For Microscopy and Molecular Imaging（ＣＭＭＩ、ＵＬＢ、Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）に移した。マルチモーダルマイクロＰＥＴ／ＣＴナノスキャン（登録商標）ＰＥＴ／ＣＴカメラ（Ｍｅｄｉｓｏ）およびＮｕｃｌｉｎｅ（商標）ｖ２．０１ソフトウエア（Ｍｅｄｉｓｏ）を用い、サンプルをスキャンした。スキャンは半円スキャン、最大ズーム、チューブテンション３５ｋＶｐ、ガントリ１回転当たり７２０投影、１投影当たり曝露時間３００ｍｓ、デテクターピクセルビニング１：１を用いて行った。ＸおよびＹ方向のスキャン長は取得毎に適合させた。マイクロＣＴスキャニングの総時間は３分４２秒であった。各マイクロＣＴスキャンは、Ｓｈｅｐｐ−Ｌｏｇａｎフィルターおよび８規格サンプルのマルチサンプリングモードを用い、４０μｍ辺の立方体ボクセルで後に再構成した。ＸおよびＹ画像の寸法は再構成毎に適合させた。Ｚ画像のサイズは、取得のために定義されたスキャン長に相当した。骨修復の質的評価はマイクロＣＴ画像に対して、骨をＺ軸（スキャナー軸）と一致するように再配向させ、Ｚ軸上の大腿骨内の１本の近位ねじから他の近位ねじまでの、横断（Ｘ−Ｙ）面ができるだけ狭い画像をクロッピングした後に行った。次に、３Ｄ最大値投影法（ＭＩＰ）レンダリングを作成した。骨修復を定量的に評価するために、マイクロＣＴスキャン上の欠損スペースに直径２ｍｍおよび軸長２ｍｍの仮想円柱を置き、この円柱内の平均骨体積を、１５００ＨＵ以上の放射線強度でボクセルを二値化することにより評価した。
結果
骨形成細胞Ｂおよび骨形成細胞Ｃ凍結はマウス大腿未臨界分節欠損の修復を改善した
ＮＭＲＩ−ヌードマウスの未臨界サイズ分節欠損（ＣＳＤ）モデルにおいて、骨形成細胞Ｂ（ｎ＝１２マウス、２バッチ）は、投与２〜６週間後に、賦形剤（ｎ＝１１マウス）、および骨形成細胞Ａ（ｎ＝４マウス）に比べて骨欠損サイズの有意な縮小により示されるように、骨折修復を改善した（図８Ａ）。
賦形剤、骨形成細胞Ａ（示されていない）または骨形成細胞Ｂの投与後Ｄ０および６Ｗ時点における分節大腿骨欠損のＸ線像は、本発明の実施形態に従って骨形成細胞Ｂを投与したマウスでは、賦形剤（図８Ｂ）または骨形成細胞Ａ（示されていない）を投与したマウスに比べて骨欠損サイズの縮小を示した。
分節大腿骨欠損の骨修復体積は、賦形剤および骨形成細胞Ｂの投与後６Ｗ時点でのマイクロコンピューター断層撮影法（マイクロＣＴ）解析により定量した。これらの結果から、骨形成細胞Ｂが賦形剤に比べて高い骨修復を誘導したことが確認された（図８Ｃ）。
分節大腿骨ｓｕｂ−ＣＳＤモデルにおいて、骨形成細胞Ｃ凍結保存は、投与２〜１０週間後に賦形剤に比べて骨折修復のパーセンテージを有意に改善および加速化した（図１４および１５）（ｎ＝３８マウス（処置１９および賦形剤対照１９、２バッチ；ｐ＜０．００１）。さらに、ＲＵＳスコアは、賦形剤群に比べて骨形成細胞Ｃ凍結保存群で有意に増大していた（図１６）。そして最後に、癒合率も、賦形剤投与後の癒合無しに比べて、骨形成細胞Ｃ凍結保存の投与１０週後のマウスでは、９／１９（４７％）の癒合と改善されていた。
実施例４：実施例２および３で骨形成能を示すＭＳＣ由来細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞特性評価
材料および方法
細胞培養
ＭＳＣ、細胞製品Ａおよび細胞製品Ｂ、細胞製品Ｃ新鮮および細胞製品Ｃ凍結は、実施例１に記載されているように得られる。
フローサイトメトリー分析
細胞表面マーカーの特性決定はフローサイトメトリーにより行った。５０，０００細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡ中、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で、５μｌの抗体とともに暗所で１０分間インキュベートした。このインキュベーション時間の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞外染色に使用した種々の抗体は以下である：ＣＤ１０５に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６２４０８）、ＣＤ７３に対するＡＰＣコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６０８４７）、ＣＤ１０に対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５３７５）、ＣＤ４４に対するＰＥコンジュゲート抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５０９８９）。非特異的染色は、細胞を、ＦＩＴＣ、ＡＰＣおよびＰＥとコンジュゲートされた免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照（総てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：それぞれ５５６６４９；５５５７５１；５５６６５０）とともにインキュベートすることにより決定した。分析前に、図９に記載されるように、対象とするシングレットおよび集団のゲーティングを行った。フローサイトメトリー分析は、１００００イベントのゲーティング集団に対してＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））およびＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）８．０ソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を用いて行った。分析に使用した設定パラメーターを、ビーズ（ＢＤ ＣｏｍｐＢｅａｄｓ Ｐｌｕｓ（登録商標）、カタログ番号５６０４９７）を用いて自動実行した。各コンジュゲートに関して、陽性カットオフを対照アイソタイプ抗体陽性１％に固定し、各マーカーの陽性を決定した。全分析集団の蛍光の中央値（ＭＦＩ）も求め、対応するアイソタイプ対照抗体のＭＦＩにより割って正規化ＭＦＩ（ｎＭＦＩ）を得た。
結果
フローサイトメトリー分析は、細胞製品Ａ、細胞製品Ｂ（従来技術による比較方法を用いて形成）、および最終の凍結保存有りまたは無しの細胞製品Ｃ（本発明を示す方法を用いて形成）の細胞表面マーカー発現プロフィールに基づく一般的な細胞識別は匹敵していたことを明らかにした。
それらは総て、間葉マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現し、造血マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３を発現していなかった（細胞集団の５％未満はこれらのマーカーを発現していた）（表４）。細胞製品Ａ、細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）は、低レベルのＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体、例えば、ＨＬＡ−ＤＲを発現した。ＨＬＡ−ＤＲの弱い発現により呈される弱い免疫原性は有利には、例えば同種異系対象への細胞移植を可能とする（表４）。加えて、細胞製品Ａ、細胞製品Ｂ、および細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）は、未分化ＭＳＣに比べてそれらの表面に酵素ＡＬＰの発現が高かった（表４および５）。高いＡＬＰ発現は、細胞製品Ａ、細胞製品Ｂ、および細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）の骨芽細胞系譜への運命決定を強調する。細胞製品Ａ、細胞製品Ｂ、および細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）はまた、未分化ＭＳＣに比べて細胞マーカーＣＤ１０の発現も高かった（表４）。
Figure 2022502034
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Figure 2022502034
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 略語:ＡＬＰ：アルカリ性ホスファターゼ；ＡＰＣ：アロフィコシアニン；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート；ＨＬＡ−ＤＲ：ヒト白血球抗原−ＤＲアイソタイプ；ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ：ヒト白血球抗原−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱアイソタイプ；ＭＳＣ：間葉系幹細胞；ＮＤ：決定されず；ＰＥ：フィコエリトリン；ＳＤ：標準偏差
Figure 2022502034
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 略語：ＡＬＰ：アルカリ性ホスファターゼ；ＮＤ：決定されず；ＰＥ：フィコエリトリン
細胞表面マーカー発現プロフィールは、細胞表面のマーカーの存在（集団陽性パーセンテージ）によるだけでなく、種々のマーカーの細胞表面に発現されるマーカーの量（集団正規化蛍光中央値）を分析することによっても特徴付けた。これらの分析により、異なるＭＳＣ由来細胞間のいくつかの差異が強調された。
ヘパリンの存在下で培養された細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）は、ヘパリンの不在下で培養されたＭＳＣおよび細胞製品Ａよりも高いレベルのＡＬＰを発現し（ＡＬＰ−ＰＥ ｎＭＦＩ結果）、それらの骨形成細胞の骨芽細胞系譜への運命決定を強めた。
細胞表面での間葉マーカーＣＤ７３およびＣＤ１０５の発現は、細胞種にも依存していた。ヘパリンの存在下で作製された細胞製品（最終の凍結保存有りまたは無しの細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃ）は、細胞製品Ａよりも高いレベルのＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現した。加えて、細胞製品Ｃは、特に、細胞製品Ｃが最終の凍結保存を受けなかった場合に、それらの表面に細胞製品Ｂよりも多いＣＤ７３およびＣＤ１０５を有していると思われた（表６）。分化細胞製品Ａ、ＢおよびＣは、未分化ＭＳＣよりも高い量の細胞マーカーＣＤ１０を発現する。加えて、細胞製品Ｃは、それらの表面に細胞製品ＡおよびＢよりも多いＣＤ１０を有する（表６）。
上記を考慮すると、細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃ（最終の凍結保存有りまたは無し）、（その製品ＢおよびＣは実施例２および３で骨誘導および高い骨形成能を示した）は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上を発現する量；および／または細胞表面に発現されたＣＤ７３、ＣＤ１０５もしくはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量に基づき、細胞製品Ａ（その製品Ａは実施例２および３で骨誘導および低い骨形成能を示した）から区別することができると思われる。
より詳しくは、表４および６に基づくと、細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃの細胞の少なくとも９０％が細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現し（表４）、細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃの細胞は、少なくとも５００のｎＭＦＩＣＤ７３、少なくとも１００（または少なくとも１５０）のｎＭＦＩＣＤ４４、および多くても１５０のｎＭＦＩＣＤ１０５を有する（表６）と思われる。他方、細胞製品Ａの細胞は、５００未満のｎＭＦＩＣＤ７３および１００未満（または１５０未満）のｎＭＦＩＣＤ４４を有し；ＭＳＣは５００未満のｎＭＦＩＣＤ７３および１５０を超えるｎＭＦＩＣＤ１０５を有する（表６）。
従って、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量と組み合わせることが、細胞製品Ｂおよび細胞製品Ｃの細胞をＭＳＣまたは細胞製品Ａの細胞から区別するために適切かつ十分である。これに沿って、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量と組み合わせることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が骨形成能を有するかどうかを決定するため、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が高い骨形成能を有するかどうかを決定するために適切かつ十分である。
Figure 2022502034
Figure 2022502034
 略語：ＡＬＰ：アルカリ性ホスファターゼ；ＡＰＣ：アロフィコシアニン；ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート；ＨＬＡ−ＡＢＣ：ヒト白血球抗原ＡＢＣ；ＨＬＡ−ＤＲ：ヒト白血球抗原−ＤＲアイソタイプ；ＭＳＣ：間葉系幹細胞；ＮＡ：利用不可；ＮＤ：決定されず；ＰＥ：フィコエリトリン；ＳＤ：標準偏差
さらに、ｎＭＦＩフローサイトメトリー分析により、ＣＤ７３およびＣＤ４４タンパク質発現が骨形成細胞Ｂを含む他の細胞種よりも骨形成細胞Ｃでより上昇していた（図１０）ことが明らかになった。

Claims (15)

  1. ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するためのＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、およびＣＤ１０の使用。
  2. ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の量を測定すること、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちいずれか１以上の量を測定することを含んでなる、方法。
  3. （ａ１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を測定すること；
    （ａ２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちのいずれか１以上の量を測定すること；
    （ｂ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合を、既知の骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値と比較すること；
    （ｂ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちのいずれか１以上の量を、既知の骨形成能を有する細胞を表す１以上の各カットオフ値と比較すること；
    （ｃ１）（ａ１）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；
    （ｃ２）（ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ４４のうちのいずれか１つの量の、前記カットオフ値からの偏差の有無を見出すこと；ならびに
    （ｄ）前記偏差の有無をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能の特定の決定に帰すること
    を含んでなる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記（ｂ１）のカットオフ値および前記（ｂ２）の各カットオフ値が、臨床上有用な骨形成能を有する細胞を表すカットオフ値である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面上のＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ４４またはＣＤ１０のうちのいずれか１以上の量が測定される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ａ１）で測定されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の割合が（ｂ１）のカットオフ値に比べて同等または増加していることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示し；かつ
    （ａ２）で測定されるようなＣＤ７３、ＣＤ４４および／またはＣＤ１０の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等または増加していること、ならびに（ａ２）で測定されるようなＣＤ１０５の量が（ｂ２）の各カットオフ値に比べて同等または減少していることが、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有することを示す、
    請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記（ｂ１）のカットオフ値が細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ、前記（ｂ２）のカットオフ値が、ＣＤ７３の正規蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）として５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１００、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして４０である、請求項３〜６に記載の方法。
  8. 前記（ｂ１）のカットオフ値が、細胞表面にＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現するｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の９０％であり；かつ、前記（ｂ２）のカットオフ値が、ＣＤ７３の正規化蛍光強度中央値（ｎＭＦＩ）として５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１５０、ＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０および／またはＣＤ１０のｎＭＦＩとして４０である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞により発現されるＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４の量が測定される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記（ｂ２）のカットオフ値が、ＣＤ７３のｎＭＦＩとして５００、ＣＤ４４のｎＭＦＩとして１００およびＣＤ１０５のｎＭＦＩとして１５０である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得られる、請求項１に記載の使用または請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の使用または請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するために対象を選択するための方法であって、
    対象の生体サンプルからＭＳＣを回収すること；
    前記ＭＳＣからｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を得ること；
    前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を請求項２〜１２のいずれか一項に定義される方法により決定すること；および
    前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が臨床上有用な骨形成能を有すれば、軟骨骨芽細胞系譜のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞を調製するために前記対象を選択すること
    を含んでなる、方法。
  14. 前記対象がヒト対象である、請求項１３に記載の方法。
  15. ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の骨形成能を決定するための方法であって、
    前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞表面のＣＤ１０の量を測定すること；および
    前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞がＣＤ１０のｎＭＦＩとして少なくとも４０を有する場合に前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞が骨形成能を有すると決定し、好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ１０はＰＥでは励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５８０ｎｍで測定されること
    を含んでなる、方法。
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