CN102822677B - Hla-g亚型作为成骨标记物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及至少一种HLA-G亚型作为评估哺乳动物成骨标记物的用途。

Description

HLA-G亚型作为成骨标记物的用途
技术领域
本发明涉及一个新的成骨标记物，以及其在评价哺乳动物成骨的方法中的用途。
背景技术
成骨是一个骨组织形成和发展的过程。骨由以下形成：
-骨细胞外基质（大约22%至25%），其为基本上由I型胶原蛋白组成的有机基质，但也含有其它的蛋白质，如骨结合素和骨钙素，
-非常富含钙的矿物基质（大约70%），
-两种类型的骨细胞：成骨细胞（来源于间质干细胞的成骨细胞、骨细胞和衬细胞）和破骨细胞（来源于造血干细胞的细胞），和
-水（5%至8%）。
成骨细胞是立方体形或圆柱形单核上皮样细胞，其存在于生长中的骨组织。其特征性地表达I型胶原蛋白、碱性磷酸酶（ALP（法文为PA）或ALPL）、甲状旁腺激素受体1（PTHR1）、骨结合素（SPARC）、骨钙素、Osterix转录因子（OSX）和α-肌动蛋白（ASMA）（Cohen，2006）。
骨细胞是分化的成骨细胞，其高度地分枝且能够分裂。其维持骨细胞外基质。
衬细胞是静止细胞，其具有扁平的长的形状，并位于骨表面的无活性区，即，既不处于骨的形成中，也不处于骨的吸收中的区域。如果它们被刺激，则可分化成成骨细胞。
破骨细胞是直径为20至100μm的多核细胞。它们负责骨的吸收。
具有成骨标记物对于评估骨骼退化（例如骨质疏松）个体中的骨折风险、对于监控骨折后骨骼再建以及对于监控骨肿瘤的发展都是重要的。如果处于早期，这种风险评估和监控对于建立有效的治疗是重要的。
举一个例子，患有胫骨骨折的10至30%的成年人出现假关节，即，发生骨折后两个骨折片缺乏固结作用。在法国，这代表了每年大约3000个病例。假关节的治疗非常困难（自体移植、骨髓注射、生长因子注射等），而且昂贵，且不能保证病人快速恢复独立性。在法国，胫骨缺乏固结作用的年花费估计在3百至3千万欧元。因而，假关节的早期检测使更有效地治疗患此病的病人成为可能。
目前在市场上没有几个骨形成（成骨）的标记物。这些标记物基本上是骨碱性磷酸酶、骨钙素和前胶原蛋白延伸前肽（Srivastava，2005和Vesper，2005）：
-碱性磷酸酶（ALP（法文为PA）或ALPL）是普遍存在的酶。在人类中可分为6种同工酶：肝脏、肠、骨、肾、胎盘和肿瘤同工酶。在肝功能正常的成人中，ALP血清活性的大约60-70%来自肝脏，30-40%来自骨，少于5%来自肠。骨ALP的循环水平取决于成骨细胞的活性，但也取决于它的肝脏清除；结果，在肝病的情况下，有可能出现循环中的骨ALP水平的改变；
-骨钙素（OC）是成骨细胞分泌的5.7kDa的蛋白质。在血流中，骨钙素快速降解和清除（循环中的骨钙素的1/3为全长蛋白，2/3为各种大小的片段），因而，限制了其作为骨形成标记物的临床应用；
-I型胶原蛋白以前胶原蛋白的形式由成骨细胞合成。这种前体包括在N-末端和C-末端的两个前肽，分别为PINP（N-末端延伸前肽）和PICP（C-末端延伸前肽），在前胶原蛋白装配成三螺旋时，其被蛋白酶切断，并释放入循环中。因而，分析血清中的这些前肽可以评估I型胶原蛋白的形成。但是，这种分析反映的不仅仅是骨中的I型胶原蛋白的形成，也包括其它组织中的。
因而，目前使用的成骨标记物是不十分满意的。因此，需要鉴别新的成骨标记物。
主要组织相容性复合物（MHC）（法文为CMH）抗原被分为几类：Ｉ类抗原（HLA-A、HLA-B和HLA-C），其具有3个球形结构域（α1、α2和α3），且其α3结构域与β2微球蛋白相关，II类抗原（HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR）和III类抗原（补体）。I类抗原除了上面提到的抗原以外，还包括其它的命名为非传统I类抗原的（Ib类）抗原，以及特别地，HLA-E、HLA-F和HLA-G抗原。
HLA-G基因（HLA-6.0基因）的核苷酸序列已被Geraghty等人(1987)描述了：其包括4396个碱基对，具有与HLA-A、-B和-C基因的内含子/外显子结构同源的内含子/外显子结构。这个基因包括8个外显子、7个内含子和一个非翻译3'端。HLA-G基因不同于其它I类MHC基因，因为框内翻译终止密码子位于外显子6的第二个密码子；因而，此HLA-6.0基因编码的蛋白的胞质区域比HLA-A、-B和-C蛋白的胞质区域短。
Ishitani和Geraghty(1992)已经表明HLA-G基因的初级转录物可以以几种方式被剪接，并生成至少3种不同的成熟mRNA：初级HLA-G转录物提供了1200bp的全长拷贝（G1），900bp的片段(G2)和600bp的片段(G3)。G1转录物不包括外显子7，且对应于Ellis等人(1990)描述的序列，即，其编码含有信号序列、三个胞外球形结构域(α1、α2和α3)、跨膜结构域和胞质内结构域的蛋白。G2mRNA不包含外显子3（编码α2结构域），并编码α1和α3结构域直接连接的亚型。G3mRNA既不含有外显子3又不含外显子4（编码α3结构域）；因而，该转录物编码α1结构域和跨膜结构域直接连接的亚型。为了得到HLA-G2抗原，流行的剪接导致了腺嘌呤（A）（源于α1编码结构域）与腺嘌呤-胞嘧啶（AC）序列（源于α3编码结构域）的结合，其导致取代存在于编码HLA-G1中的α3结构域的序列5’位置中GAC（天冬氨酸）密码子的AAC（天冬酰胺）密码子的产生。为了获得HLA-G3产生的剪接并没有引起在剪接区域中新密码子的形成。
一些发明人已经表明HLA-GmRNA的其它剪接形式的存在：不包含外显子4的HLA-G4转录物；HLA-G5转录物，其在外显子4和5之间包括内含子4，从而在此转录物的翻译期间引起读码框的改变，特别是在内含子4的氨基酸21后出现一个终止密码子；HLA-G6转录物，其具有内含子4，但没有外显子3；和HLA-G7转录物，其包含内含子2，从而在此转录物的翻译期间引起读码框的改变，且在内含子2的氨基酸2后出现一个终止密码子(Kirszenbaum等人，1994和1995；Moreau等人，1995；欧洲申请EP0677582)。
因而，至少有7种不同的HLA-GmRNA，其编码7种HLA-G的亚型，其中的4个是细胞膜亚型(HLA-G1、-G2、-G3和-G4)，3个是可溶的亚型(HLA-G5、-G6和–G7，其不包含跨膜结构域）(综述参见Carosella等人，2008a)。
HLA-G基因(HLA-6.0基因)的核苷酸序列及其外显子/内含子组织，以及HLA-G各种亚型的氨基酸序列是本领域技术人员公知的。其特别地被描述于上面提及的Geraghty等人(1987)和Carosella等人(2008a)中。
HLA-G蛋白表达正常地被限于滋养层（在母胎层面）、胸腺、角质层、内皮的和成红细胞前体和间质干细胞(Carosella等人，2008a)。但是，事实上在身体的所有细胞中都检测到处于基础水平的HLA-GmRNA，其可被扩增，并在DNA-脱甲基化制剂、细胞因子如干扰素（IFN）、应激因子或缺氧的作用下诱导可被翻译成蛋白(Carosella等人，2008b)。因而，在特定的条件下，例如组织移植、某些肿瘤或炎症反应的发生时，HLA-G蛋白可以在正常条件下不表达其的组织中表达。
在血液中，发现了可溶性亚型和分离自膜的膜亚型，例如HLA-G1(其也被称为HLA-G1s，对应于“HLA-G1脱落”)。
已经鉴定出来HLA-G的一些生物特性：NK-细胞介导的和CTL-介导的细胞溶解的抑制，异常增殖的（alloproliférative）T反应的抑制，CD8+NK细胞和T细胞中凋亡的诱导，和对免疫系统B细胞的抗增殖作用(Carosella等人，2008a和2008b)。
一些发明人近来表明培养的间质干细胞（MSC）（法文为CSM）分泌HLA-G5，因而，发挥对T和NK（天然杀伤细胞）免疫应答的免疫抑制活性(Selmani等人，2008)。
源自成人骨髓的间质干细胞是为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的前体的多能细胞(Friedenstein等人，1976；Pittenger等人，1999)。
在这些研究的上下文中，发明人研究了在从MSC培养中获得的成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞自身能否也表达HLA-G。令人惊奇的，通过ELISA方法，发明人表明仅成骨细胞表达可溶的HLA-G形式。通过RT-PCR技术，他们还表明成骨细胞表达HLA-G1、-G2、-G3、-G4和-G5mRNA。另外，发明人观察到在人体内HLA-G仅仅在骨形成（成骨）期间的正常或病理的（特别是肿瘤）成骨细胞表达。
根据表明HLA-G被骨形成期间的成骨细胞表达的这些结果，从而，无论是在骨折后的骨重建中，还是在监控骨肿瘤的进展中，均可以通过分析或确定由成骨细胞表达的至少一种HLA-G的亚型进行个体中成骨的评估：至少一种HLA-G亚型浓度或表达的增加是成骨的指标。
发明内容
因而，本发明的主旨是体外监控受试者骨重建的方法，该受试者被诊断为骨折，所述方法包括下述步骤：
a）检测来自所述受试者的生物液体样本中至少一种HLA-G亚型的浓度，
b）将步骤a）中测定的HLA-G亚型的浓度与健康受试者的所述生物液体中这种或这些HLA-G亚型的参照浓度相比较，
其中，来自所述受试者的所述生物液体样本中至少一种HLA-G亚型的浓度比所述参照浓度高，表示所述受试者中骨重建（成骨）。
术语“骨折”意指骨的连续性中断。其可以特别地是骨裂缝（没有骨移位的骨折）或粉碎性骨折（包括多个骨碎片；多碎片的骨折）。例如，可以通过放射线、扫描技术或体层密度测量法诊断骨折。
为了本发明的目的，术语“受试者”意指哺乳动物，优选人。
为了本发明的目的，术语“健康受试者”意指没有骨损伤，即骨折的受试者。
为了本发明的目的，术语“生物液体”意指血液及其衍生物（如血浆和血清），也指滑液，优选血液。
为了本发明的目的，术语“HLA-G亚型”意指选自HLA-G的膜亚型(HLA-G1、-G2、-G3和-G4)和可溶的亚型(HLA-G5、-G6和–G7)的HLA-G亚型。
当然，在生物液体中测量HLA-G膜亚型的浓度时，其意思为该亚型分离自细胞膜（例如，通过蛋白水解），并包含于所述生物液体中。
根据所述用于骨重建监控的方法的一个优选的实施方案，测量至少一种选自HLA-G1、HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7的HLA-G亚型的浓度。
根据所述用于骨重建监控的方法的另一个优选的实施方案，测量两种不同的HLA-G亚型的浓度，优选HLA-G1和HLA-G5，或HLA-G5和HLA-G6。
根据所述用于骨重建监控的方法的另一个优选的实施方案，使用血液样本测量如上定义的至少一种HLA-G亚型的血浆或血清浓度，优选自HLA-G1、HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7，或更优选使用血液样本测量两种不同的HLA-G亚型，例如HLA-G1和HLA-G5，以及HLA-G5和HLA-G6。
使用血液样本检测HLA-G亚型的血浆浓度是本领域技术人员公知的。可以通过使用利用所述HLA-G亚型的至少一种特异抗体的恰当的免疫方法（例如，ELISA、RIA、免疫荧光、免疫组化）来进行。
为了本发明的目的，术语“抗体”意指人或非人的多克隆或单克隆抗体，例如，鼠的、人源化的、嵌合的；重组或合成的；或含有识别所述初始抗体靶抗原的初始抗体结构域的抗体片段（例如，Fab'2或Fab片段）。
特异于一种或多种HLA-G亚型的多种单克隆或多克隆抗体是本领域技术人员公知的。通过商业可购的抗人HLA-G单克隆抗体的实例，可以提及获自4H84克隆的抗HLA-G抗体（其识别所有的HLA-G亚型）(McMaster等人，1998)、获自MEM-G/4克隆(也称为MEM-G/04；Menier等人，2003)的抗HLA-G1、-G2、-G5和G6抗体(即，其识别HLA-G1、-G2、-G5和G6亚型)、获自MEM-G/9克隆(也称为MEM-G/09；Menier等人，2003)或87G克隆(Rebmann等人，1999；Hackmon等人，2004)的抗HLA-G1和抗HLA-G5抗体(即，其识别HLA-G1和–G5亚型)，和获自5A6G7克隆(LeRond等人，2004)的抗HLA-G5和抗HLA-G6抗体(即，其识别HLA-G5和-G6亚型)。
如上所述的生物液体中HLA-G亚型的参照浓度不仅仅取决于指定的HLA-G亚型，也取决于检测浓度所使用的方法。
通过使用获自MEM-G/9克隆的单克隆抗体的ELISA检测到的在健康的个体中（即没有骨折的个体中）的HLA-G1(HLA-G1s)和HLA-G5亚型的参照血浆浓度少于20ng/ml(Ugurel等人，2001；LeRond等人，2006；Naji等人，2007)。
因而，根据该实施方案的一个特别的安排，通过使用既抗HLA-G1又抗HLA-G5的抗体（例如，获自MEM-G/9克隆的单克隆抗体）并使用来自所述被诊断为骨折的人类受试者的血液样本，利用适当的免疫方法，优选利用ELISA测定的HLA-G1(HLA-G1s)和HLA-G5亚型的血浆浓度在20ng/ml以上、优选在50ng/ml以上、更优选在100ng/ml以上，则表明了所述受试者中的骨重建。
通过使用获自5A6G7克隆的单克隆抗体并利用ELISA测定的在所述健康个体中HLA-G5和HLA-G6亚型的参照血浆浓度小于10ng/ml(LeRond等人，2006；Naji等人，2007)。
因而，根据该实施方案的另一个特别的安排，通过使用既抗HLA-G5又抗HLA-G6的抗体（例如，获自5A6G7克隆的单克隆抗体）并通过使用来自所述被诊断为骨折的人类受试者的血液样本，利用适当的免疫方法，优选利用ELISA测定的HLA-G5和HLA-G6亚型的血浆浓度在10ng/ml以上、优选在50ng/ml以上、更优选在100ng/ml以上，则表明了所述受试者中的骨重建。
通过使用获自MEM-G/9克隆的单克隆抗体并利用ELISA测定的在所述健康个体中的HLA-G1（HLA-G1s）和HLA-G5亚型的参照血清浓度大约为20ng/ml(Rouas-Freiss等人，2005)。
因而，根据该实施方案的另一个特别的安排，通过使用既抗HLA-G1又抗HLA-G5的抗体（例如，获自MEM-G/9克隆的单克隆抗体）并通过使用来自所述被诊断为骨折的人类受试者的血液样本，利用适当的免疫方法，优选利用ELISA测定的HLA-G1(HLA-G1s)和HLA-G5亚型的血浆浓度在25ng/ml以上、优选在50ng/ml以上、更优选在100ng/ml以上，则表明了所述受试者中的骨重建。
本发明还涉及用于体外监控受试者（被诊断为骨肿瘤者）的骨肿瘤改变（发展或减缓）的方法，其使用在时间t0和时间t1获得的所述受试者的生物样本，所述方法包括确定所述生物样本中至少一种HLA－G亚型的浓度或定量地确定所述生物样本中至少一种HLA-G亚型的表达的步骤：
－其中，在时间t0和时间t1之间至少一种HLA－G亚型的浓度或表达水平的增加表示所述受试者中所述骨肿瘤的进展，
－其中，在时间t0和时间t1之间至少一种HLA－G亚型的浓度或表达水平的降低表示所述受试者中所述骨肿瘤的减缓（或衰退）。
为了本发明的目的，术语“生物样本”意指如上定义的生物液体的样本或包含通过肿瘤的骨活检获得的成骨细胞的生物样本。
活检可以是从骨骼的任何部分获取的样本，例如，脊柱、骨盆、股骨、胫骨、肱股、肩胛骨和颅骨。
骨肿瘤选自骨肉瘤、骨母细胞瘤、Ewing's肉瘤和巨细胞瘤。
根据用于体外评估骨肿瘤的该方法的一个优选的实施方案，例如，通过如上定义的适当的免疫方法并通过使用来自所述人类受试者的血液样本来确定如上定义的HLA－G的至少一种亚型的血浆或血清浓度。
根据该实施方案的一个有利安排，确定两种不同的HLA－G亚型的浓度，优选HLA-G1和HLA-G5，或HLA-G5和HLA-G6。
根据用于体外评估骨肿瘤的该方法的另一个优选的实施方案，使用含有成骨细胞的生物样本定量地确定由成骨细胞表达的如上定义的至少一种HLA-G亚型，所述样本获得于所述肿瘤的骨活检。
根据该实施方案的一个有利安排，通过如上所定义的免疫方法，优选适当的免疫组化方法，使用至少一种如上定义的HLA－G的所述亚型的特异抗体，体外确定至少一种由成骨细胞表达的HLA-G亚型。
根据该实施方案的另一个有利安排，通过检测编码至少一种HLA－G亚型的mRNA，体外确定至少一种由成骨细胞表达的HLA-G亚型。可以通过使用所述mRNA的特异核苷酸探针（附着于例如生物芯片）的杂交，或通过使用所述mRNA的特异核苷酸引物的扩增（例如，通过RT－PCR）进行mRNA检测。适于扩增HLA－GmRNA的引物的例子，可以提及的有由核苷酸序列SEQIDNo15和16组成的引物对，以及LeDiscorde等人，2005中描述的那些。
本发明的主旨还涉及体外筛选调节（增加或降低）成骨的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：
a）定量地确定由成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型；
b）使所述成骨细胞与检测试剂接触；然后
c）定量地确定由所述成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型，
其中，在步骤a）和c）之间，由所述成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型水平的不同表明所述试剂调节了成骨。
在上述步骤a）和c）之间，由所述成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型水平的增加表明所述试剂诱导成骨过程。
在上述步骤a）和c）之间，由所述成骨细胞表达的至少一种HLA-G亚型水平的降低表明所述试剂抑制成骨过程。
可以通过如上所述的方法定量地确定由所述成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型，即通过免疫方法或通过检测编码HLA－G亚型的mRNA。
根据所述筛选方法的一个优选的实施方案，所述成骨细胞是人来源的。
根据所述筛选方法的另一个优选的实施方案，确定HLA-G1和HLA-G5，或HLA-G5和HLA-G6的表达。
本发明的主旨还涉及HLA－G亚型或编码HLA－G亚型的核酸分子（例如mRNA）用做所述受试者成骨的标记物，所述HLA－G亚型或编码HLA－G亚型的核酸分子分离于受试者，优选人类，所述标记物优选为血液标记物。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述HLA－G亚型选自HLA-G1、HLA-G5和HLA-G6。
附图说明
除了上述安排，本发明还包括其它安排，其将出现于下面的说明书，其参照本发明主旨方法的实例性实施方案，以及附图，其中：
－图1表明由新生儿骨生长区（A）和成年人骨折后骨痂（B）的成骨细胞表达的HLA－G。多指的和早期的及晚期的骨痂薄切片与抗HLA-G5和抗HLA-G6抗体(克隆5A6G7)孵育，然后与连接过氧化物酶的抗小鼠二抗孵育。然后在光学显微镜下观察切片。在骨生长区域，位于骨小梁和骨膜周围的成骨细胞被抗HLA-G5/-G6抗体标记（参见黑色箭头）。在骨骨痂中，在新形成的骨小梁处密集的成骨细胞也被抗HLA-G5/-G6抗体标记。（C）：在非病理性的成年骨髓中没有观察到HLA-G+细胞；
－图2表明骨肿瘤中HLA－G的检测。来自骨肉瘤（A）、骨母细胞瘤（B）、Ewing's肉瘤和巨细胞瘤（Ｃ）的骨肿瘤活检薄切片与抗HLA-G5/-G6抗体（克隆5A6G7）孵育。骨肉瘤和骨母细胞瘤的肿瘤成骨细胞被标记（Ａ和Ｂ），而仅仅Ewing's肉瘤或巨细胞瘤的肿瘤微环境的正常成骨细胞是HLA-G5/-G6表达阳性（Ｃ）；
－图3表明由原位免疫荧光检测的SaOs2细胞系中的HLA-G。SaOs2骨肉瘤细胞系在带孔培养皿中培养，然后固定，并与连接FITC的抗HLA-G1和抗HLA-G5抗体（克隆87G）孵育。用DAPI标记细胞核。放大率X400；
－图4表明来自MSC的成骨细胞表达的HLA－GmRNA。裂解成骨细胞并回收mRNA。逆转录后，通过PCR扩增cDNA。（A）：在成骨培养基中培养的细胞上找到成骨细胞特征的转录物(BSP、ALP、PTHR1、SPARC、Osterix和ASMA的mRNA)。使用GAPDH（甘油醛－3－磷酸脱氢酶；结构性基因）mRNA做对照。（B）：在来自MSC的三种不同成骨细胞培养物(MSC1、MSC2、MSC3)中找到了不同形式的HLA-G(G1、G2、G3、G4和G5)表达；
-图5表明通过原位免疫荧光，由来自MSC的成骨细胞表达的HLA－G。在含有孔的培养皿中以汇合状态培养并诱导MSC，使分化成成骨细胞。使用的诱导剂是：BMP-2、BMP-4和BMP-7。在非诱导培养基（扩张培养基）中培养的MSC被用作阴性对照（WOBMP）。经10天的培养后，在与抗胶原1（CO1）、抗骨桥蛋白（OPN）、抗骨钙素（OSC）和抗HLA-G1/-G5(克隆87G)抗体孵育前，固定成骨细胞并使其渗透化。通过向反应介质添加DAPI标记细胞核。然后在荧光显微镜下检测荧光。由抗体存在发射的荧光回归到由DAPI发出的荧光，以便考虑相对于孔中存在的细胞数的目标分子的表达水平（“观察到的荧光的相对值”）；
－图6表明在成骨期间由流式细胞术测定的HLA－G表达。在成骨培养基中培养MSC，在培养的第2（A）和第4（B）周通过流式细胞术监控HLA-G5/-G6和碱性磷酸酶（ALP（法文为PA））的联合表达。HLA-G+细胞数从66%（第2周）降至10%（第4周）。图代表了4个独立的实验；给出的值是所有实验中观察到的平均值；
－图7表明在来自MSC的成骨细胞培养基上清中的可溶性HLA－G的分析。在诱导生骨分化（BPM4、地塞米松）、软骨形成分化(软骨，TGF-β)，脂肪生成分化(脂肪)和血管生成分化(VEGF)的培养基或在不存在任何诱导的培养基（对照）中培养MSC。孵育4天后，取上清部分，并在其中通过ELISA分析HLA-G5和–G6亚型。结果以ng/ml报告；
－图8表明微团培养后在软骨细胞中寻找HLA-G表达。在软骨形成培养基中在微团条件下培养MSC。培养4周后，回收、固定、石蜡包埋微团。与抗HLA-G抗体（克隆5A6G7）或与对照抗体（同种型对照）孵育再水合的薄切片。洗涤后，用苏木青/曙红染色切片，然后在光学显微镜下观察；
－图9表明由来自骨肉瘤（OS）的人成骨细胞系CAL72、MG-63、HOS和U2OS表达的HLA-G1和HLA-G5。WB=WesternBlot；
－图10表明DLX5或RUNX2基因对人骨髓间质干细胞中诱导的GAPDH、ALPL、SPARC、COL1α1、HLA-G1和HLA-G5表达的抑制作用，以分化成成骨细胞。分析利用RT－PCR进行；
－图11表明由过表达RUNX2的人源Δ4A5和Δ6A2的成骨细胞系表达的HLA-G1和–G5、COL1α1和ALPL。A：利用qPCR的分析。B：利用Westernblot的分析；检测HLA-G1和HLA-G5亚型，肌动蛋白β亚型用作内部阳性对照。C：利用流式细胞术的分析；HLA-G1和-G5的表达由粗线柱图表示，而阴性阈值由同种型对照的柱图给出（灰色）。
具体实施方式
实施例1:由成骨细胞表达的HLA-G的证实
1)材料和方法
细胞和细胞培养：
从进行整形手术的健康志愿者收集成人骨髓（BM）（法文为MO）样本。根据法国图尔的TrousseauCHU[大学教学医院中心]的伦理委员会的建议取得这些样本。将单核细胞（MNC（法文为CMN））接种于补充有10%胎牛血清(FCS)（法文为SVF)(PerbioHyclone;Logan)和1%青霉素/链霉素(InVitrogenLtd;佩斯利，英国)的α-MEM培养基（MEM）。在第14天，在80%汇合下，将间质干细胞（MSC）分成两份，扩增。所有的实验用至少3个不同的供体进行。
在与MSC扩张条件相同的条件下培养SaOs2骨肉瘤细胞系（ECECC，索尔兹伯里，英国）。
成骨细胞和软骨母细胞的诱导：
根据Pittenger等人，1999描述的方案诱导MSC细胞分化成成骨细胞和软骨细胞。
简言之，为了诱导成骨，培养基由DMEM4.5g/l葡萄糖、3mMNaH2PO4(InVitrogen)、25mg/l抗坏血酸(Sigma)和10-7M地塞米松(InVitrogen)组成。所述培养基能使细胞在培养14天后分化成成骨细胞。
为了诱导软骨形成，离心细胞并微团培养，即直接以片状沉淀物培养而不再悬浮。所用的分化培养基由DMEM3M葡萄糖(InVitrogen)、2mM丙酮酸钠(Sigma,SaintQuentinFallavier,法国)、0.17mM抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma)、10-7M地塞米松(InVitrogen)、0.35mM脯氨酸(Sigma)和1x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)添加物(Sigma)组成。在每次更新培养基时以10ng/ml的浓度加入转化生长因子β1型(TGFβ1)(AbCys)。该培养基允许在培养21天后的软骨形成的分化。
利用流式细胞术的分析：
为了进行膜和胞质内的抗原检测，使用偶联荧光染料的特异性单克隆抗体标记200,000个细胞。在黑暗中在4°C孵育30分钟后获得膜标记。然后用磷酸缓冲盐(PBS)冲洗细胞，然后用(BectonDickinson,Erembodegem，比利时)固定。为了细胞内标记，使用CytoFix/CytoPerm试剂盒固定并使细胞通透。然后使细胞通过流式细胞仪(FACSBectonDickinson)，该流式细胞仪配有氩激光，其发出488nm的波长。使用CellQuest软件(BectonDickinson)分析数据；结果表示为检测到的信号比背景噪音的平均荧光强度比率(RMFI)。使用以下的单克隆抗体（mAb）：连接Alexa488的抗HLA-G1/-G5mAb(克隆87G)(Exbio,Vestec，捷克共和国)、抗HLA-G5/-G6mAb(克隆5A6G7，Exbio)和连接藻红蛋白(PE)的抗碱性磷酸酶(ALP（法文为PA），把ALP指定为碱性磷酸酶)mAb。
利用ELISA(酶联免疫吸附试验)的分析：
在成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管诱导后测定了含于滤过的MSC培养基上清中的可溶HLA-G的浓度。M8-HLA-G5细胞系细胞的培养基上清用作阳性对照(LeRond等人，2006)。使用的ELISA方法包括使用作为捕获抗体的抗HLA-G5/-G6抗体(克隆5A6G7，Exbio)和作为用于检测HLA类Ia分子的抗体的pan-HLA类IW6/32(Betts等人，2003)(Rebmann等人，2005)。
利用原位免疫荧光的分析：
将从3种新鲜肿瘤选择的细胞以10000个细胞/孔接种于含有表面积为1cm2的孔的培养皿(NuncInternational，Rochester，纽约，美国)中。在增殖培养基中培养48小时后，用3.7%甲醛（Sigma）或纯甲醇（InVitrogen）将其固定10分钟。为了鉴别细胞内蛋白，使用PBS、0.5%FCS（法文为SVF）和0.2%Tween20(BioRad,Hercules，加利福尼亚，美国)的溶液在环境温度下30分钟的通透步骤是必要的。然后，将细胞与单克隆一抗在4°C孵育1小时，接着是连接Alexa488或594型荧光染料，识别一抗的二抗(InVitrogen)。冲洗后，加入含有4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(VectorCliniscience,Montrouge，法国)的包埋剂，以观察细胞核。不含抗体溶液的孔作为阴性对照。在装配有照相机(DMX1200，尼康欧洲，Badhoevedorp，荷兰)的落射荧光显微镜(Solms，德国)下读切片。使用Lucia软件进行影像处理。使用的抗体如下所述：抗HLA-G1/-G5单克隆抗体(克隆87G，Exbio)、抗骨钙素(SantaCruz;Tebu,LePerayenYvelines，法国)、抗骨桥蛋白(RnD)和抗胶原1a1(SantaCruz)多克隆抗体。
免疫组化分析：
用10%甲醛(Sigma)固定活检样本。然后使用连续的75%、90%和100%乙醇浴(Merck和CarboErba,SaintHerblain，法国)使其脱水。最后，在4°C下将其置于二甲苯浴(InVitrogen)30分钟，然后石蜡包埋(InVitrogen)，以便于在切片机切片。然后用苏木青和曙红染色切片。使用抗HLA-G5/-G6单克隆抗体(克隆5A6G7)和连接过氧化物酶的抗小鼠多克隆抗体进行用于检测抗原的免疫标记。
利用RT-PCR分析：
用(InVitrogen)裂解细胞后，加入200μl氯仿(Sigma)，以使细胞和蛋白碎片、以及含于上清中的脱氧核糖核酸（DNA）（法文为ADN）和核糖核酸（RNA）（法文为ARN）分离。然后使用500μl异丙醇(Sigma)沉淀回收的RNA、然后用1ml乙醇在75°C清洗(Merck和CarboErba)，并露天干燥30分钟，然后再溶于50ml不含DNA酶和RNA酶的DEPC水中。
使用TakaraPrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(TakaraBioInc.)并利用逆转录进行从RNA的互补DNA(cDNA)（法文为ADNc）的合成。
将1μgRNA的溶液加入到第一反应混合物中，该混合物由1μloligodT引物、1μldNTP混合物和不含RNA酶的水组成，总混合物容积至10μl。在65°C下经过5分钟变性阶段后，加入新的反应混合物。其由4μl的缓冲液、1μlPrimeScriptTM逆转录酶、0.5μlRNA酶抑制剂和4.5μlDEPC水组成。
然后将20μl终混合物放置于热循环器(AppliedBiosystems,FosterCity，CA，美国)中。使用的条件如下：在30°C下引物/RNA杂交10分钟；在42°C下cDNA合成60分钟；在95°C下酶失活5分钟。
使用TaKaRaExTaqTM试剂盒(TakaraBioInc.)进行所需DNA序列的扩增。
将50ng/μl的cDNA溶液加入反应混合物中，该反应混合物由2.5μl缓冲液、2μldNTP混合物、2μl用于被研究DNA的引物、0.125μlTaq聚合酶和DEPC水至总混合物容积为25μl。根据以下程序进行RT-PCR：94°C、5分钟；35个循环(94°C、45秒，55°C、45秒，72°C、1分钟)；70°C、7分钟。
用于扩增成骨分化、未成熟和细胞致瘤性的特征性的各种基因的引物如下表I所示。
表I：
2）结果
a）在骨形成期间由成骨细胞体内表达的HLA-G
如用抗HLA-G5/-G6抗体(克隆5A6G7)获得的成骨细胞染色所证明的，在新生儿中，衬于骨松质（或骨髓）的骨小梁的成骨细胞表达HLA-G5和–G6（参见图1A)。相反地，增殖和肥大的软骨细胞不表达HLA-G5/-G6。而且，应当注意到某些靠近HLA-G+成骨细胞（用抗HLA-G5/-G6抗体标记的）的血管的血管周细胞也表达此蛋白。
在健康成年人中，在活性的成骨期间，如在骨折后的骨重建时检测HLA-G5和–G6。在骨折后骨重建时，在骨固结作用早期，间质细胞密集以生成能够形成骨的成骨细胞。在此骨折后早期，成骨细胞较弱地表达HLA-G5和–G6，然而，在骨重建的后期，在骨痂中负责骨新生合成的成骨细胞非常强地被抗HLA-G5/-G6抗体所标记（参见图1B）。而且，在受试者非病理的正常骨髓中检测不到HLA-G5和G6（参见图1C）。
这些结果表明成骨细胞能够表达HLA-G。但是，在非病理的成人骨髓中没有观察到HLA-G+细胞。因而，由这些结果可断定，在人体内在骨形成（成骨）期间由成骨细胞表达HLA-G。而且，紧密连接成骨细胞的血管周细胞自身也可以表达HLA-G。
b)HLA-G由正常和病理的成骨细胞表达
研究了基于人病理的骨髓，来自骨肉瘤、骨母细胞瘤、Ewing's肉瘤或巨细胞瘤(GCT)（法文为TCG）的切片的HLA-G5和-G6表达概况。
由图2表示的结果表明，不考虑研究的病理骨髓，成骨细胞被抗HLA-G5/-G6抗体标记(HLA-G+)。但是，很大程度上依赖于病理情况，HLA-G5和-G6的表达或多或少。
更特别地，来自骨肉瘤和来自骨母细胞瘤的异常成骨细胞以及在肿瘤周围的正常的成骨细胞为HLA-G+（参见图2A和2B）。
在来自巨细胞瘤（GCT）（法文为TCG）或来自Ewing's肉瘤的骨髓切片上，仅在肿瘤周围环境的成骨细胞中检测到HLA-G5和–G6（参见图2C）。
通过研究来自成骨细胞的骨肉瘤的SaOs2肿瘤细胞系确认了HLA-G的表达。由图3代表的结果表明细胞被识别HLA-G5(HLA-G的可溶形式)和HLA-G1(HLA-G的膜形式)的87G抗体标记。
这些结果表明，正常成骨细胞和病理的，特别是肿瘤成骨细胞表达HLA-G。
c)由从间质干细胞的培养物产生的正常成骨细胞表达HLA-G
研究了从间质干细胞培养物产生的成骨细胞表达的HLA-G。间质干细胞（MSC）（法文为CSM）的培养物与不同的成骨细胞诱导剂孵育，如地塞米松和骨形态发生蛋白（BMP）。
在间质来源的培养细胞中检测了碱性磷酸酶(ALP)（法文为PA）、骨唾液酸糖蛋白(BSP)、甲状旁腺激素受体1(PTHR1)、骨结合素(SPARC)、Osterix转录因子(osterix)和α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的mRNA表达(参见图4A)。这些不同转录物的组合已知为成骨细胞特征性的(Cohen,2006)。
得到的成骨细胞也表达HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4和HLA-G5的mRNA(参见图4B)。
用抗HLA-G1/-G5抗体(克隆87G)并使用原位免疫荧光技术得到的结果由图5表示。表达成骨细胞标记物的细胞也是HLA-G1/-G5阳性的。但是，应当注意到，与其他的BMP(BMP-2和BMP-7)相比，当成骨细胞与BMP-4孵育时HLA-G的表达显著更高。
使用流式细胞技术得到的结果由图6表示。如通过HLA-G和碱性磷酸酶（ALP）（法文为PA）的共同表达所示的，大部分成骨细胞表达HLA-G1/-G5。但是，该表达随时间而降低：在诱导2周后检测到66%的HLA-G+成骨细胞，而在诱导4周后仅检测到10%的HLA-G+成骨细胞。
由于MSC能生成成骨细胞和成软骨细胞和脂肪细胞，所以调查了HLA-G能否被这些其他类型的细胞表达。通过ELISA，仅在生骨培养物（用BMP-4和地塞米松诱导的细胞）的上清中检测到可溶形式的HLA-G5和-G6。在软骨形成的、脂肪生成的和血管生成的培养物中没有检测到或检测到很少的可溶HLA-G(图7)。
而且，由微团技术在培养物中生成的软骨细胞并不表达HLA-G（图8）。另外，在脂肪细胞中没有检测到HLA-G。
实施例2:证实来自骨肉瘤的成骨细胞表达HLA-G
1)材料和方法
细胞：
骨肉瘤细胞系：HOS-154732(McAllister等人，1971)、U2OS(Ponten等人，1967)、MG-63(Billiau等人，1977)、SaOS2(Fogh等人，1975)、CAL72(Rochet等人，1999)和SaOS2RUNX2DNN(Ghali等人，2010)。
被研究的各种活检样本来自于TrousseauCentreHospitalierUniversitaire(CHU)的病理解剖学系[图尔的大学医院教学中心（法国）]。
间质干细胞(MSC)(法文为CSM)：
使用的MSC来自于在图尔（法国）CHU的整形创伤外科治疗，并为了全髋关节置换的植入而入院的健康的供体。获得了病人的书面知情书。在操作中从髂嵴后取20ml骨髓。这些细胞被用作所述研究中进行的所有测试的对照。
细胞培养：
-标准培养：在培养瓶(BDBiosciences,VWR,Strasbourg,法国)中培养各种细胞系的细胞，初始密度为5000个细胞/cm2。培养基由具有10%(v/v)胎牛血清(FCS)（法文为SVF)(PerbioHyclone,Logan，美国)、1%(v/v)L-谷氨酸、1%(v/v)青霉素和链霉素(InVitrogen)以及100μM两性霉素(BristolMyersSquibb,RueilMalmaison，法国)的α-MEM最小必需培养基（MinimumEssentialMedium）(InVitrogen)组成。每2至3天更换培养基。
-以相同的方式用包含另外加入的1ng/mlFGF2(AbCys,巴黎，法国)的相同的培养基培养MSC。
-分化培养基：为了骨细胞的分化，培养基由补充了2%(v/v)FCS和50ng/ml的BMP4(Peprotech，伦敦，英国)的αMEM组成。该培养的期间为8至10天。
流式细胞术：
使用偶联到荧光染料：藻红蛋白(PE)或荧光素异硫氰酸盐(FITC)的抗体标记200000个细胞。为了证明在细胞表面表达的抗原，将分离的活细胞与识别这些抗原的抗体孵育45分钟，清洗，然后用CellFixTM(BectonDickinson,Erembodegem，法国)固定。为了证明细胞内抗原，在免疫标记前有必要进行使用CytoFix/CytoPermTM(BectonDickinson)的在先的细胞通透作用步骤。利用非特异的免疫球蛋白获得阴性对照。
然后使细胞通过具有放出488nm波长的氩激光的细胞计数器(FACSCaliburTM,BectonDickinson)。使用CellQuest3.1TM软件解释结果。
使用连接alexa488的抗HLA-G1和-G5抗体87G和连接APC的MEM/G9或4H84(Exbio;Prague;捷克共和国)和抗ALPL抗体(R&DSystems)。
利用RT-PCR的分析：
●提取：
使用(InVitrogen)裂解后，加入200μl氯仿（Sigma），然后离心，得到三层：含有蛋白的底层、含有脱氧核糖核酸（DNA）（法文为ADN）的中间层和含有核糖核酸（RNA）（法文为ARN）的上层。提取所述上层，然后从500μl异丙醇(Sigma)沉淀，然后用1ml75%乙醇(Merck和CarboErba)洗脱，置于周围空气中干燥至得到完全透明物。最后，将RNA溶解于50ml的焦炭酸二乙酯(DEPC-为了抑制RNA酶)水中。
●RNA分析：
将2微升RNA在98μlDEPC水中稀释，然后在制备空白（仅有水）后，将其置于GeneQuantII剂量仪(AmershamPharmacia,Sarclay，Orsay，法国)的石英杯中。通过利用在260nm的激光发射测量光密度进行分析。
●逆转录：
在DEPC水中稀释1μgRNA，直到得到8μl。加入随机六聚体和dNTP(TakaraPrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(TakaraBioInc.))。在热循环器(AppliedBiosystems,FosterCity，CA，美国)中变性(65°C，5分钟)后，加入PrimeScriptTM逆转录酶。根据以下程序在热循环器中孵育该溶液：第一步，30°C，10分钟，第二步，42°C，60分钟，然后第三步，95°C，5分钟。得到的互补DNA(cDNA)（法文为ADNc）储存于-20°C。
●聚合酶链反应(PCR)：
将25ngcDNA与dNTP、靶向目标序列的引物（参见下面的表II）和Taq聚合酶(TaKaraTMExTaq试剂盒)混合。然后，根据由以下组成的程序在热循环器中孵育全部混合物：35个循环，每个循环由98°C、1分钟，随后55°C、30秒，随后72°C、1分钟组成。
表II:
●在琼脂糖凝胶上的迁移：
将PCR产物加载于含有0.01%溴化乙锭(Sigma)的1%琼脂糖(Sigma)凝胶上。然后使用紫外灯(VilbertLourmat,Eberhardzell，德国)观察凝胶。然后使用ChemicaptTM软件(BioRad,CA，美国)分析条带。
●定量聚合酶链反应(qPCR)：
将50ngcDNA与含有荧光分子(SyberGreen,InVitrogen)的溶液混合。然后将该溶液置于预先放置引物的孔（96-孔板）中。
将板置于热循环器(BioRad)中。使用以下的程序：95°C、30秒，56°C、30秒，72°C、30秒，39个循环。为了证实扩增的DNA的质量，制作解链曲线。
通过以下公式评估DNA的量：
2-(基因的C(t)-C(t)GAPDH)或2-Δc(t)
●Westernblot:
分离细胞，离心，然后吸取于由0.1%(v/v)TritonX-100(Sigma)组成的500μl裂解缓冲液中。离心后，移上清，然后在Laemmli缓冲液中稀释蛋白提取物，然后将其煮沸2分钟。
根据Bradford技术，使用MRXII(Dynextechnologies,Chantilly，美国)通过测量光密度分析样本。
在十二烷基磺酸钠(SDS–Biorad)缓冲液中，在依赖于目标蛋白的不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶(碱性磷酸酶和HLA-G所用浓度为10%)上进行电泳。将蛋白印迹转移至聚偏乙烯氟化物膜上，然后用乳蛋白使该膜饱和，并与目标抗体过夜孵育。在施加二抗后，通过化学发光(ECL试剂盒，Amersham)进行可视化。
●转染：
用3种不同的靶向RUNX2(SelectRNAiTM、siRNA、商品号1299003)或DLX5(StealthSelectRNAiTM、siRNA、商品号1299003)的siRNA(InVitrogen)转染细胞。非特异的siRNA被用作对照(InVitrogen)。20nMsiRNA被用于转染，其使用AmaxaNucleofactor试剂盒(Lonza，法国)并根据供应商的说明书进行。在24小时后，在成骨分化的培养基中，细胞被诱导分化。2、4和6天后，收集细胞，检测其成骨细胞特征性的或编码HLA-G的基因的表达。
2）结果
通过流式细胞术和免疫标记(Westernblotting)研究了在各种人来源的成骨细胞系，CAL72、MG-63、HOS和U2OS中，HLA-G1(膜HLA-G)和HLA-G5(细胞内HLA-G)亚型的表达。结果在图9中表示。在所有细胞系中检测到HLA-G1和HLA-G5亚型，但是，表达程度非常不同。观察到HLA-G5通常被强表达，而对于HLA-G1，仅仅在CAL72和MG-63细胞系中强表达；其在HOS和U2OS中的表达显著少。
在人来源（成年人）的正常骨组织（在骨生长区）和病理的骨组织中，由免疫组化研究的HLA-G（HLA-G1和HLA-G5）的表达的结果在以下的表III中表示。该表显示仅仅正常或肿瘤成骨细胞和某些肥大的软骨细胞表达HLA-G1和-G5。
表III：在正常或病理的人骨组织中HLA-G1和–G5的表达。
组织 HLA-G表达
正常组织
骨髓内皮 -
破骨细胞 -
骨小梁成骨细胞 +
皮质的成骨细胞 +
休止区的软骨细胞 -
增殖区软骨细胞 -
肥大区软骨细胞 ±a
骨髓脂肪细胞 -
血管平滑肌细胞和周细胞 +b
骨膜的间质细胞 +
软骨膜的间质细胞 +
肿瘤组织
成骨细胞的骨肉瘤 +
成纤维细胞的骨肉瘤 ±
骨母细胞瘤 +
软骨肉瘤 ±
软骨母细胞瘤 -
Ewing's肿瘤细胞 -
巨细胞肿瘤(GCT) -
由肿瘤诱导的正常成骨细胞 +c
a：某些软骨细胞表达HLA-G
b：在活性骨形成位点的HLA-G阳性血管周细胞
C：由骨肿瘤诱导的正常成骨细胞均为HLA-G阳性。
为了确认由成骨细胞表达的HLA-G的特异性，涉及成骨诱导的DLX5和RUNX2基因的表达被RNA干扰抑制。在用靶向DLX5或RUNX2的siRNA转染人源骨髓间质干细胞后，在成骨培养基（添加BMP4）中培养该细胞。培养6天，研究成骨细胞特征的基因(碱性磷酸酶或ALPL、骨结合素或SPARC、胶原1α1或COL1α1)和HLA-G基因的表达。观察到（参见图10）降低的DLX5和RUNX2表达引起了ALPL、SPARC和COL1α1基因，以及HLA-G表达的降低。
为了确认这些结果，使用表达非活性形式的RUNX2(RUNX2显性隐性或DNN)的2株SaOS2细胞系：Δ6A2和Δ4A5细胞系。转导的不含RUNX2DNN的细胞系被用作对照细胞系(C-)。Δ4A5强烈地表达DNNRUNX2，而其在Δ6A2的表达更温和。这些结果在图11表示。
首先，通过定量PCR(qRT-PCR)和Westernblot研究了COL1α1的表达，因为其是被RUNX2诱导的。然后在RUNX2DNN细胞系中检测到了COL1α1在RNA水平和蛋白质水平的表达的降低。在Δ4A5细胞系中这些降低比在Δ6A2中显著增加。
然后通过流式细胞术和Westernblot研究了HLA-G(HLA-G1和HLA-G5亚型)的表达。发现HLA-G的表达在Δ4A5中实质上是被抑制的，而在Δ6A2中比对照细胞系C-表达更弱。
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Claims (7)

1.化合物在制备用于监控被诊断为骨折的受试者中骨重建的试剂中的用途，其中所述化合物用于检测来自所述受试者的生物液体样本中HLA-G亚型的浓度，
其中所述生物液体样本是血液、血浆或血清样本。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述受试者是人。
3.根据权利要求1-2任一项所述的用途，其特征在于
所述化合物是特异于所述HLA-G亚型的抗体。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述HLA-G亚型选自：HLA-G1、HLA-G5和HLA-G6。
5.一种体外筛选调节成骨的试剂的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)定量地确定由成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型；
b)使所述成骨细胞与检测试剂接触；然后
c)定量地确定由所述成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型，
其中，在步骤a)和c)之间，由所述成骨细胞表达的至少一种HLA－G亚型水平的不同表明所述试剂调节成骨。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于确定HLA-G1和HLA-G5，或HLA-G5和HLA-G6的表达。
7.一种分离自受试者的HLA-G亚型或编码HLA-G亚型的核酸分子作为所述受试者中的成骨标记物在制备成骨诊断的试剂中的用途。
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