JPH11503320A

JPH11503320A - Ｈｌａ−ｇ検出用抗体

Info

Publication number: JPH11503320A
Application number: JP8530319A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．フィッシャー、スーザン; リブラッチ、クリフォード; ダムスキー、キャロライン; ティー．マックマスター、マイケル
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-03-21
Publication date: 1999-03-26
Also published as: AU696118B2; CA2213620A1; WO1996031604A1; AU5256896A; EP0819171A1

Abstract

(57)【要約】クラスＩ分子ＨＬＡ−Ｇは侵入栄養膜細胞層によって特異的に発現される。ＨＬＡ−Ｇに対して特異的な抗体を誘発する抗原およびこれらの抗原と結合する抗体を提供する。生物学的液体中のＨＬＡ−Ｇレベルの測定に関する方法もまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＬＡ−Ｇ検出用抗体本発明は、米国国立衛生研究所の許可HD-82903号の下、政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する。発明の背景妊娠に関する主要な問題は、胎児−胎盤セットが如何にして母体の免疫拒絶を回避するかということである。妊娠期間を通して胎児と母体の細胞は相互に作用しあうが、典型的には胎児は依然として排除されない特権的部位である。胎児と母体の接触面にある細胞の特定の性状およびそれらの産物が、母体の免疫系による胎児の排除するのを防止するのに役立っているようである。着床と胎盤の発達によってホ乳類の胚は母体の子宮と物理的に連結する。この連結が確立されることがその後の発育に必須である。胚で生じる初期のこの発達に関する事象によって、胎盤の前駆細胞である固有の胚体外細胞系が将来に向けて準備される。分化の最初の事象によって栄養膜が生じるが、栄養膜は物理的に胚及び子宮を連結する胎盤の特殊化した上皮細胞である（着床と胎盤形成の周辺における事象の包括的概説についてはクロスらの論文を参照のこと:Crossら、Sc ience 266:1508(1994)）。卵管での受精後、一連の細胞分裂によって全能の細胞集団（桑実胚）が生じる。桑実胚の圧縮化後に、最初の分化が起こり胚盤胞の形成をもたらす。一連の複雑な細胞間および細胞内シグナル発生に関する事象の流れの中で、栄養膜系の細胞は桑実胚でのその位置にしたがって形成される。霊長類では、胚盤胞の着床は胚盤胞が透明帯から生じた直ぐ後で起こる。子宮は、卵巣のエストロゲンおよびプロゲステロンの産生によって大きく制御される事象の結果として着床を受容するようになる。着床中に、栄養膜は受容性を示す子宮の上皮に付着し、子宮内膜でいくつかの変化を誘導する。血管の変化、例えば子宮の血管の透過性が増大し、炎症性細胞が着床部位に補充される。前炎症性サイトカインが子宮で産生され、いくつかの細胞変化が生じる。例えば、子宮の上皮は失われ、子宮脱落膜細胞は類上皮遷移を起こして増殖し、ぶ厚く肥厚した子宮壁をつくる。この脱落膜はまた多数のマクロファージ、リンパ球および他の骨髄由来細胞を含む。これらの細胞は通常ではない特性、例えばアロ反応性（alloreactivity）の低下およびＣＤ３抗体による刺激に対する反応性を示す。ヒトでは着床後、個々に区別できる分化栄養膜集団が形成される。増殖性栄養膜細胞層の幹細胞は、２種類の絨毛膜絨毛内で支質中心部を取り巻く基底膜に固定される。浮動性絨毛では、栄養膜層幹細胞は下層の基底膜から分離して融合し、絨毛を覆い母体の血液と直接接触する合胞体（多核細胞）を形成する。固定絨毛では、栄養膜細胞層幹細胞はそれらの基底膜から分離し、凝集して子宮脱落膜（間隙侵入）およびその動脈系（血管内侵入）に付着し侵入する単核細胞柱を形成することによって分化する。間隙侵入によって、栄養膜細胞層は妊娠中に子宮に回帰する高度に特殊化された白血球サブセットと直接接触できる。血管内侵入によって、栄養膜細胞層は（固定絨毛を覆う合胞体栄養膜と同様に）母体血液と直接接触できる。したがって、栄養膜による母体−胎児接触面での抗原の表出は、妊娠中の母体の免疫学的反応の重要な要素である。ＭＨＣクラスＩ分子およびそれが表わすペプチドはアロ反応性を調節する(She rmanら、Annu．Rev．Immunol．11:385(1993))。したがって、胎児の半同種異系移植片に対する母体の寛容を理解するキーの１つは、クラスＩ分子の栄養膜発現を知ることに有るであろう。ヒトのＭＨＣによってコードされる新規なクラスＩ遺伝子を求めて、胎盤細胞によって発現される分子ＨＬＡ−Ｇをクローニングした(Geraghtyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:9145(1987))。この遺伝子は、クラスＩａ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃ）のイントロン／エクソン構成と同一の構成を有し、ＨＬＡ−Ｇタンパク生成物はクラスＩのコンセンサス配列と８６％の配列同一性を有している(Parhamら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，85:4005(1988))。ＨＬＡ−Ｇは、細胞質の尾部の６個のアミノ酸を除く全ての欠落をもたらすエクソン６における終止コドンのゆえにクラスＩａより小さい分子量（37〜39ｋＤａ）を有する(Shimizuら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:2 27(1988))。この遺伝子の5'側領域に関して、ＨＬＡ−Ｇプロモーターは、クラスＩａ遺伝子で見出される配列と同様な要素（例えばＡＰ−１、ＮＦκＢ）を有するが、インターフェロン応答要素を欠く。これは新規な転写調節メカニズムの存在を示唆している。主要なＨＬＡ−ＧＲＮＡ転写物はまた特異的なスプライシングを受ける。完全な長さのｍＲＮＡの他に、エクソン２、エクソン２と３の両方(Ishitani & Geraghty，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:3947(1992))またはエクソン４(Kirszenbaumら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:4209(1994))の何れかを欠く転写物が産生される。これら選択的なスプライシングを受けるｍＲＮＡがどの程度翻訳されるかは明らかではない。最近になって、イントロン４を含むｍＲＮＡによってコードされるＨＬＡ−Ｇの可溶形が報告された(Fujiiら、J. Immunol．153:5516(1994))。一方、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃは高度に多形性であるが、ＨＬＡ−Ｇは比較的低い多形性を示すようである。13人の個々人およびヒト絨毛癌（悪性栄養膜）細胞系から得たＨＬＡ−Ｇの免疫沈降は二次元電気泳動で同一像を示した。これはこの遺伝子座における多形性の低下を示唆している。ゲノム配列とｃＤＮＡ配列の情報はまた、ＨＬＡ−Ｇが比較的制限された多形性を有することを示している。しかしながら、最近の研究は、少なくともある集団（すなわちアフリカ系アメリカ人）ではＨＬＡ−Ｇは相当な多形性を示すことを示唆している（van de r Ven & Ober，J．Immunol．153:5628(1994)）。ＨＬＡ−Ｇは内在性栄養膜ペプチドと複合体を形成するのか、さらにこのことは多形性の程度によってどの様に影響を受けるのかは明らかではない。ＨＬＡ−Ｇは妊娠していない成人では発現されず、妊娠診断の適切なマーカーとなっている。本発明は、可溶性および膜結合性ＨＬＡ−Ｇの両方に対する特異的抗体を作製するための抗原を代表的な抗体とともに提供する。さらに、母体血液のＨＬＡ−Ｇレベルは、栄養膜細胞層の侵入の強さとそれに対応する胎盤母体接触面の健康度を示す。ＨＬＡ−Ｇは通常は成人では発現されないので、妊娠の診断とそのモニタリングのために、さらに生物学的液体から栄養膜細胞層を検出するために理想的なマーカーである。しかしながら、成人で発現されるクラスＩａ分子とＨＬＡ−Ｇとの高度な類似性のために、ＨＬＡ−Ｇに対する適切な抗体をデザインし、これを得ることは以前は可能ではなかった。本発明は、ＨＬＡ−Ｇに特異的な抗体を作製することができる特異的エピトープ、代表的な抗体およびそれらの使用方法を提供することによってこれらの問題を解決した。発明の概要本発明は、ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体を誘発するために用いることができるポリペプチドを提供する。これらの抗体を用いて、例えば母体血液中の可溶性ＨＬＡ−Ｇレベルをモニターする。母体血液中の可溶性ＨＬＡ−Ｇレベルは妊娠診断、または胎児母体接触面の健康度をモニターするのに用いることができる。したがって、本発明は、ヒトＨＬＡ−Ｇタンパクのα１ドメインのアミノ酸残基61〜83から本質的になるアミノ酸配列より選ばれる、連続した少なくとも５個のアミノ酸を含む精製ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、免疫原として提供されるときＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体の産生を誘発し、かつ該ペプチドは、配列番号１のペプチドで完全に免疫吸着させたＨＬＡ−Ｇに対して作製した抗血清とは結合しない。代表的なポリペプチドは、配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）からなるか又は本質的になるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、免疫原組成物の成分として有用である。ある種の態様として、このペプチドは、例えば免疫原担体（例えばカギアナカサガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン）のような付加ポリペプチドと共有結合している。本発明は、ヒトＨＬＡ−Ｇタンパクのα１ドメインのアミノ酸残基61〜83から本質的になるアミノ酸配列より選ばれる、連続した少なくとも５個のアミノ酸を含む上記のポリペプチドをコードする核酸を提供する。該ポリペプチドは、免疫原として提供されるときＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体の産生を誘発し、かつ該ペプチドは、配列番号１のペプチドで完全に免疫吸着させたＨＬＡ−Ｇに対して作製した抗血清とは結合しない。例えば、ある好ましい態様として、本発明は、配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）と実質的に同一であるポリペプチドをコードする。ＨＬＡ−Ｇのα１ドメイン内のサブ配列と特異的に結合する抗体、およびこれらの抗体を作製する方法を提供する。ある種の態様として、この抗体はアミノ酸配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）のサブ配列と特異的に結合する。代表的な抗体として、本明細書に開示する１Ｂ８および３Ｆ６が挙げられる。ポリクローナル抗体のほかにモノクローナル抗体も提供する。上記ポリペプチドをコードする核酸および抗体を含む組換え細胞もまた提供する。代表的な細胞系として、１Ｂ８および３Ｆ６が挙げられる。適切な種々の検出様式があり、これらにはＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロットおよび他の免疫アッセイが含まれる。本発明は、さらに上記の種々の要素を含むキットを提供する。定義特記しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的、学術的用語は、本発明が属する分野で通常の技術を有する者が通常考えるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似するか又は等価ないずれの方法および材料も本発明を実施または検査するために用いることが可能であるが、好ましい方法および材料を説明する。本発明のために下記の用語を以下のように定義する。 “抗体”という用語は、１つもしくは複数の免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントによって実質的にコードされるポリペプチドを指す。既知の免疫グロブリン遺伝子として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常部遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変部遺伝子が挙げられる。軽鎖はカッパまたはラムダの何れかに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、それらは順次ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥという免疫グロブリン型にそれぞれ規定される。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を有する。各四量体は２つの同一なポリペプチド鎖ペアを含み、各ペアは１本の“軽鎖”（約25ｋＤ）および１本の“重鎖”（約50〜70ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識能力をもつ約 100個から 110個のアミノ酸またはそれより多いアミノ酸の可変部を規定する。可変軽鎖（Ｖ_L）および可変重鎖（Ｖ_H）という用語は、それぞれこれらの重鎖および軽鎖を指す。抗体は、例えば完全な免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼの消化によって産生した十分に性状が明らかな多くのフラグメントとして存在する。したがって、例えばペプシンは、ちょうつがい領域のジスルフィド結合の下部で抗体を消化してＦ(ａｂ)'₂を生じる。Ｆ(ａｂ)'₂は、それ自体ジスルフィド結合でＶ_H−Ｃ_H１と結合した軽鎖であるＦａｂの二量体である。Ｆ(ａｂ)'₂は穏やかな条件下で還元してちょうつがい領域のジスルフィド結合を破壊し、それによてＦ(ａｂ)'₂二量体をＦａｂ’単量体に変換できる。このＦａｂ’単量体は、本質的にはちょうつがい領域の一部分をもつＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明についてはFundamental Immunology第３版（この文献は参考として本明細書に含まれる）(W.E．Paul編、Raven Press 刊、ニューヨーク(1993)) を参照されたい）。種々の抗体フラグメントは無傷の抗体の消化を基に規定されている一方、当業者にはそのようなＦａｂ’フラグメントは化学的にまたは組換えＤＮＡの手法によって新たに合成できることは理解されよう。したがって、本明細書で用いられるとき、抗体という用語はまた、無傷の抗体を修飾することによって生成した抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ手法を用いて新たに合成したものを含む。 “生物学的サンプルまたは液体”という用語は、生きた生物体由来の材料を指し、例えば血液、頸管膣分泌物、羊水、臍帯血、尿、組織、骨および細胞が含まれる。本明細書で用いる“血液サンプル”という用語は、全血および当業者に周知の全血誘導体を含む。したがって、血液サンプルには、血漿もしくは血清のような種々の分画された血液形態および全血、又は貯蔵もしくは特定のアッセイでの処理を容易にするために添加される種々の希釈剤をさらに含む分画血液が含まれる。そのような希釈剤は当業者には既知で、種々の緩衝液、抗凝固剤、保存料などが含まれる。 “ＨＬＡ−Ｇ”という用語はヒト白血球抗原Ｇを指し、特記しない限り、可溶形と不溶形の双方が含まれる。この用語はそれぞれの文脈で抗原またはその遺伝子座の何れかを指す。 “イムノアッセイ”とは、分析物と特異的に結合する抗体を利用するアッセイである。イムノアッセイは、分析物を分離するか、目標として狙うかまたは定量するために特定の抗体の特異的な結合特性を用いるという特徴を有する。 “単離した”、“精製した”または“生物学的に純粋”とは、天然の状態で見出されるようにある物質に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を指す。 “核酸”とは、一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、また特に限定がなければ、天然に生じるヌクレオチドと同様な態様で機能することができる天然のヌクレオチドの既知類似体をも包含する。 “核酸プローブ”とは、核酸の特異的な配列またはサブ配列と結合する分子を指す。プローブは、好ましくは標的核酸の完全な配列またはサブ配列と相補的な塩基対を介して結合する核酸である。プローブは、このプローブとの完全な相補性を欠く標的配列とハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー（string ency）に応じて結合することができることは当業者には理解されよう。好ましくはこのプローブを、例えば同位元素、発色原子団、発光原子団、色素原で直接に標識化するか、または例えばビオチン（これに後でストレプトアビジン複合体が結合することができる）で間接的に標識化する。該プローブの有無を調べることによって、選別しようとする配列またはサブ配列の有無を検出することができる。 “ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は、アミノ酸残基ポリマーを指すべく本明細書で用いられる。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマーと同様に、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的、化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも用いられる。 “標識”とは、分光顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出できる組成物である。有用な標識として、例えば³²Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡで通常用いられるもの）、ビオチン、ジオキシゲニン、または抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよびタンパク質（例えばペプチドＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）は、例えば放射性標識を該ペプチドに取り込ませることによって検出することができ、該ポリペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いることができる）が挙げられる。 “標識化核酸プローブ”とは、プローブに結合した標識の存在を検出することによってプローブの存在を検出できるように、リンカーを介する共有結合、またはイオン結合、ファン・デル・ワールス力もしくは水素結合のいずれかによって標識を結合させた核酸プローブである。 “組換え体”という用語は細胞に関して用いられる場合は、該細胞にとって外来性起源を有する核酸を含む細胞を指す。したがって、例えば組換え細胞は、該細胞の天然型（非組換え体）には見出されない遺伝子を複製および／または発現する。２つの核酸配列またはポリペプチド配列について、“同一”という用語は、この２つの配列を最大に一致するように並べたとき同一である２つの配列の残基についていう。比較のための配列の最適な並べ方は、例えばスミスとウォーターマンの局所相同性アルゴリズム(Smith & Waterman，Adv．Appl.Math．2:482(1981) )、ニードルマンとウンシュの相同配列アルゴリズム（Needleman & Wunsch，J. Mol．Biol．48:443(1970)）、ピアソンとリップマンの類似性検索法(Pearson & Lipman，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:2444(1988))、これらアルゴリズムのコンピュータ処理（ウィスコンシン・ジネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Genetics Computer Group，575 Science Dr.，マジソン、ウィスコンシン）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または精査によって実施することができる。これらの文献は参考として本明細書に含まれる。ポリペプチドについて“実質的に同一”または“実質的に類似”とは、ポリペプチドが、対象配列と少なくとも80％の配列同一性、好ましくは90％、より好ましくは95％の配列同一性を約20個のアミノ酸の比較ウィンドーにわたって有する配列を含むことを意味する。２つのポリペプチド配列が実質的に同一であるという場合は、１つのペプチドが、第二のペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に反応することを示唆する。したがって、この２つのペプチドが保存的置換によってのみ互いに相違する場合、このポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である場合、第一の核酸がコードするポリペプチドは第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応することを示唆する。さらに、２つの核酸が実質的に同一である場合、この２つの分子はストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることを示唆する。ストリンジェント条件は配列に左右され、環境パラメーターが変われば異なってくるであろう。一般に、ストリンジェント条件は、限定されたイオン強度とｐＨにおける特定の配列融解温度（Ｔ_m）よりも約５℃から20℃低くなるように選択される。Ｔ_mは、（所定のイオン強度とｐＨ下で）50％の標的配列が完全に適合するプローブとハイブリダイズする温度である。しかしながら、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならば依然として実質的に同一である。これは、例えば核酸コピーが遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮退を用いて作製されるときに生じる。 “特異的に結合する”、“特異的にハイブリダイズする”または“特異的に免疫反応する”という語句は抗体に関していう場合、タンパク質および他の生物学的物質の異種集団の存在下で該タンパク質の存在を決定しえる結合反応を指す。したがって、定められたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体はもっぱら特定のタンパク質と結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質と顕著な量では結合しない。そのような条件下でタンパク質と特異的に結合するためには、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体が必要となる。例えば、配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）を含むタンパク質（例えばＨＬＡ−Ｇ）と特異的に結合し、血液サンプル中に存在する他のタンパク質とは結合しない抗体は、ペプチドＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）に対して作製することができる。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選別するには、種々のイムノアッセイ様式が適している。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイはタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選別するために日常的に用いられる。特異的な免疫反応性を調べるために用いることができるイムノアッセイ様式とその条件についてはハーロウとレーンの文献を参照されたい（Harlow & Lane(1988)、Antibod y: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Publications 刊、ニューヨーク）。命名に関する註記：個々の抗体および該抗体を産生する細胞はしばしば同じ名称で呼ばれる。例えば、モノクローナル抗体１Ｂ８は、永代細胞系１Ｂ８によって産生される。詳細な説明ヒト胎盤栄養膜は母体−胎児接触面に存在し、母体の胎児寛容を仲介する。この仲介の中心は栄養膜の通常ではないＭＨＣクラスＩの発現である。栄養膜はクラスＩａの産生を抑制する一方、クラスＩｂ分子、ＨＬＡ−Ｇを発現する。ＨＬＡ−Ｇタンパクのα１ドメインのアミノ酸61〜83の領域に対応する合成ペプチドを用いて、ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合するモノクローナル抗体を作製した。このエピトープは構造的エピトープではなく直線状エピトープであるという利点を有し、変性させることなく抗体に用いることができる。このエピトープは強い抗原性を有し、全ての型のＨＬＡ−Ｇを検出できる高力価、高結合性抗体を生じる。本発明以前には、この合成ペプチドがＨＬＡ−Ｇに対して特異的であるか否か、または天然のＨＬＡ−Ｇの構造はこの領域に抗体が結合することを許容するか否かを知る方法はなかった。したがって、本発明以前には、合成ペプチドに対する抗体が作製できるか否か、または作製されたいずれの抗体がＨＬＡ−Ｇに結合しえるかを知る方法はなかった。本発明は、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインのアミノ酸61〜83の領域に対応するペプチドに対して抗体を作製し、さらにこれらの抗体がＨＬＡ−Ｇと特異的に結合することを示す。抗体の特異性は、絨毛癌細胞由来のＨＬＡ−Ｇの免疫親和性精製によって明らかにされた。分化の全段階の栄養膜細胞層を含む母体−胎児接触面の組織片とこれらの抗体をインキュベートしたところ、子宮に侵入した栄養膜細胞層のみがＨＬＡ−Ｇを発現することがわかった。本明細書に示すインビトロ実験は、妊娠初期の栄養膜細胞層の幹細胞を培養したとき、それらは侵入経路の道筋にしたがって迅速に分化してＨＬＡ−Ｇ産生のアップレギュレーションを生じることを示している。インビトロでの侵入能が低下している妊娠終了期胎盤から得た栄養膜細胞層はまた、インビトロでＨＬＡ−Ｇタンパク質発現をアップレギュレーションさせる能力が低下していた。高い侵入能をもつ第一期および第２期トリメスターの胎盤から単離した栄養膜細胞層で、高レベルのＨＬＡ−ＧｍＲＮＡが検出された。これに較べて、妊娠終了期細胞はＨＬＡ−ＧｍＲＮＡのレベルが極めて低下していた。総合すると、これらの結果は、ＨＬＡ−Ｇ産生は侵入経路にしたがって栄養膜細胞層が分化するための構成要素であることを示している。本発明は、ＨＬＡ−Ｇを特異的に認識する抗体の作製と使用の方法および組成物を提供する。これらの抗体は、インビボおよびインビトロでの栄養膜のＨＬＡ −Ｇの発現を測定するために用いられる。これらの結果は、ＨＬＡ−Ｇ産生は栄養膜の分化の必須部分としてアップレギュレーションを受けることを示している。一般的技術クローニング、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＡＳ、３ＳＲおよびＱＢ増幅本発明は、他の技術、例えばＰＣＲ、ＴＡＳ、３ＳＲ、ＱＢ増幅およびクローニングと合わせて用いて、生物学的サンプル中のいずれの核酸も増幅させることができる。本発明の核酸は、ＨＬＡ−Ｇに特異的であるＨＬＡ−Ｇα１ドメイン領域、即ち他のクラスＩ分子と少なくとも類似性を示すα１ドメイン領域をコードする。好ましい態様として、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のα１ドメインのアミノ酸残基61〜83をコードする核酸の隣接領域を増幅用プライマー結合部位として用いることができる。生成物を通常の発現系と組み合わせて用いて、抗体産生用抗原を得る目的で配列番号１のペプチドを製造することができる。特に、本発明の核酸は、クローニングするか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写型増幅系（Transcription Based Amplification System，ＴＡＳ）、自家保定型配列複製系（Self-Sustained Seq uence Replication System，３ＳＲ）およびＱβレプリカーゼ増幅系（ＱＢ）などのインビトロ法によって増幅させることができる。多様なインビトロ増幅法、クローニング系および発現系が当業者に知られている。このような技術の例および多くのクローニング演習によって当業者を指導するために十分な手引きは以下の文献で見出されるであろう：Berger & Kimmel，Guide to Molecular Cloning Techniques、Methods in Enzymology 152、Academic Press，Inc.刊、サンディエゴ、カリフォルニア(Berger); Sambrookら、Molecular Cloning: A Laborator y Manual第２版、１−３巻、Cold Spring Harbor Laboratory(1989)、Cold Sp ring Harbor Laboratory Press刊、ニューヨーク(Sambrookら);Current Protoco ls in Molecular Biology、F.M．Ausubelら編(“Current Protocols”はGreene Publishing Associates，Inc.とJohn Wiley & Sons，Inc．との合同事業である) (増補(1994))(Ausubel); Cashionら、米国特許第 5,017,478号; Carr，欧州特許第 0,246,864号。インビトロの増幅技術をとおして当業者を指導するために十分な技術の例はバーガー(Berger)、サンブルック(Sambrook)、およびオースベル(A usubel)の論文の他に以下の文献で見出されるであろう。Mullisら、米国特許第 4,683,202号(1987)；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Inn isら編)Academic Press，Inc.刊、サンディエゴ、カリフォルニア(1990)(Innis) ; Arnheim & Levinson(1990年10月１日)C&EN36-47; The Journal of NIH Resear ch(1991)，3:81-94; Kwohら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:1173(1989); Gu atelli ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:1847(1989);Lomellら、J. Clin． Chem 35:1826(1989); Landegrenら、Science 241:1077-1080(1988); Van Brunt ，Biotechnology 8:291-294(1990); Wu & Wallace，Gene 4:560(1989);及び Bar ringerら、Gene 89:117(1990)。配列番号１のペプチドの合成または化学的製造手段もまた周知である。自動ペプチド合成装置も種々の販売元から市販入手可能である。ＨＬＡ−Ｇに対する抗体個体間差異、対立遺伝子座による差異、株間差異または種による差異をもつ変種とそれらのフラグメントを含む本発明のポリペプチドに対する抗体を、天然（完全な長さをもつ）型および組換え型で作製することができる。さらに抗体は、天然の形状または人工の形状のいずれかをとるこれらのペプチドに対して作製することができる。抗イディオタイプ抗体もまた用いることができる。多くの抗体作製方法が当業者に知られている。利用可能な技術の一般的概要として以下の考察を提示するが、当業者には以下の方法について多くの変型が知られていることは理解されよう。ａ．抗体製造多くの免疫原を用いてＨＬＡ−Ｇポリペプチドと特異的に反応する抗体を製造することができる。ヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質（ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１））のα１ドメインのアミノ酸残基61〜83の領域を含む組換えまたは合成ポリペプチドは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の製造のための好ましいポリペプチド免疫原である。しかしながら完全なＨＬＡ−Ｇ部分またはそのサブ配列（特にＨＬＡ−Ｇのα１ドメイン；Gera ghtyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:9145(1987)を参照のこと）も抗原として用いることができる。得られた抗体を、本明細書で述べる種々の競合的および非競合的結合アッセイで、特に競合物としてのペプチドＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）に対して得られた抗体を用いて、ＨＬＡ−Ｇ特性についてスクリーニングすることができる。天然に生じるポリペプチドもまた精製型または非精製型のいずれかで用いることができる。ポリペプチドを、真核細胞もしくは原核細胞で発現させるかまたは化学的に合成し、さらに標準的技術を用いて精製する。このポリペプチドまたはその合成型を抗体を産生することができる動物に注射することができる。該ポリペプチドの有無および量を測定するその後のイムノアッセイで使用するために、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを作製することができる。ポリクローナル抗体を製造する方法は当業者には既知である。簡単に記せば、免疫原、好ましくは精製ポリペプチド、適切な担体（例えばカギアナカサガイヘモシアニン）に共役させたポリペプチド、または組換えワクシニアウイルス（米国特許第 4,722,848号参照）に組み込んだポリペプチドのような免疫ベクターをアジュバントと混合し、この混合物で動物を免疫化する。この免疫原調製物に対する動物の免疫反応は、検査血液を採取して問題のポリペプチドに対する反応力価を求めることによってモニターする。この免疫原に対して適切な強さの力価をもつ抗体が得られたとき、動物から血液を採集して抗血清を調製する。所望の場合には当該ポリペプチドに反応する抗体を豊富に含むようにさらに抗血清を分画する。例えば、Coligan、Current Protocols in Immunology(1991)、Wiley/Gree ne刊、ニューヨーク; Harlow & Lane、Antibodies: A Laboratory Manual(1989) 、Cold Spring Harbor Press刊、ニューヨークを参照されたい。これらは参考として本明細書に含まれる。予め定めたポリペプチドフラグメントに対する、結合フラグメントおよびその単鎖組換え体を含む抗体は、上記のようなフラグメントと担体タンパク質との共役物で動物を免疫化することによって作製することができる。典型的には問題の免疫原は少なくとも約３個のアミノ酸のペプチドであり、より典型的には該ペプチドは長さが５個以上のアミノ酸である。該ペプチドは典型的には担体タンパク質に共役されるか、または免疫ベクター内で組換え体として発現される。抗体が結合するペプチド上の抗原決定基は典型的には長さが３個〜10個のアミノ酸である。モノクローナル抗体は所望の抗体を分泌する細胞から調製される。正常または改変ポリペプチドへの結合について、または作動薬もしくは拮抗薬活性、例えば膜結合性ＨＬＡ−Ｇを介して仲介される活性についてこれらの抗体をスクリーニングすることができる。特異的なモノクローナルおよびポリクローナル抗体は通常、Ｋ_Dが少なくとも約 500μＭであり、最も好ましくは少なくとも約１μＭまたはそれより低い濃度で結合するであろう。いくつかの事例では、マウス、ゲッ歯類、霊長類などの種々のホ乳類ホスト由来のモノクローナル抗体を調製することができる。そのようなモノクローナル抗体を調製する技術についての説明は例えば以下の文献で見出される。Stitesら編、Basic and Clinical Immunology 第４版、Laneg Medical Publications刊、ロスアントス、カリフォルニア、およびその中に引用された文献;Harlow & Lane，上掲書; Goding、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice第２版(198 6)、Academic Press刊、ニューヨーク、ニューヨーク; Kohler & Milstein，Nat ure 256:495-497(1975)。簡単に要約すると、この方法は動物に免疫原を注射することを必要とする。続いてこの動物を屠殺し、その脾臓から細胞を採取し、続いてこれら細胞をミエローマ細胞と融合させる。その結果、インビトロで増殖可能なハイブリッド細胞即ち“ハイブリドーマ”が得られる。続いてこのハイブリドーマ集団をスクリーニングし個々のクローンを単離する。これらのクローンの各々は該免疫原に対してただ１種の抗体を分泌する。このようにして得られた個々の抗体種は、免疫誘発物質上に認識される特異的部位に反応して産生された該免疫動物の単一Ｂ細胞の永代化クローンの生成物である。別の永代化法にはエプスタインバーウイルス（Epstein Barr Virus）、腫瘍遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で既知の他の方法が含まれる。ただ１つの永代化細胞から生じたコロニーを、抗原について所望の特異性と親和性をもつ抗体産生についてスクリーニングする。そのような細胞によって産生したモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物の腹腔への注入を含む種々の技術によって高められる。本発明のポリペプチドおよび抗体は変更を加え、または変更を加えることなく用いられ、ヒト化ネズミ抗体などのキメラ抗体が含まれる。他の適切な技術は、ファージまたは同様なベクターでの組換え抗体ライブラリの選別を伴う。Huseら、Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda、Science 246:1275-1281(1989); 及びWardら、Nature 341:544-546(1989)を参照されたい。ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質と共有結合的にまたは非共有結合的に結合させることによってしばしば標識化される。広範な標識および共役技術が知られており、学術文献および特許文献の両方で詳細に報告されている。適切な標識には放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補助因子、抑制物質、蛍光分子団、化学発光分子団、及び磁性粒子などが含まれる。そのような標識の使用を開示する特許には、米国特許第 3,817,837号、同 3,850,752号、同 3,939,350号、同 3,996,345号、同 4,277,437号、同 4,275,149号および同 4 ,366,241号が含まれる。組換え免疫グロブリンもまた製造することができる。Ca bolly、米国特許第 4,816,567号; 及びQueen ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，86:10029-10033(1989)を参照のこと。本発明の抗体はまた、ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを単離するために親和性クロマトグラフィーで使用できる。カラムは、例えば固相支持体（例えばアガロース、セファデックスなどの粒子）に結合させた抗体を用いて調製される。このカラムに細胞溶解物を通して洗浄し、さらに穏やかな変性剤の濃度を高めながら処理しそれによって精製ＨＬＡ−Ｇポリペプチドを遊離させる。この抗体を用いて、ＨＬＡ−Ｇなどの特定の発現産物について発現ライブラリーをスクリーニングするか、又はＨＬＡ−Ｇ発現細胞の位置を確認するために組織学的検査に用いることができる。そのような工程で使用する抗体は通常、抗体結合により抗原の存在を容易に検出できる分子団で標識化される。ｂ．イムノアッセイ生物学的サンプルのＨＬＡ−Ｇの濃度を、種々のイムノアッセイ法で測定できる。一般的な免疫学的およびイムノアッセイ関連方法に関する概要について、例えばSites & Terr編、Basic and Clinical Immunology ７版(1991)を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイは、幾つかの形態のいずれ（例えば次の文献に概括されているもの）においても実施できる。Maggio編、Enzyme Immunoass ay、CRC Press 刊、Boca Raton，フロリダ(1980)；Tijan(1985)、Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、Elsevier Science Publishers B.V.刊、アムステルダム; Harlow & Lane,上掲書; Chan 編(1987)、Immunoassay: A Practical Guide、Aca demic Press刊、Orlando、フロリダ; Price & Newman編(1991)、Principles and Practice of Immunoassays、Stockton Press刊、ニューヨーク; Ngo 編(1988) 、Non-isotopic Immunoassays、Plenum Press刊、ニューヨーク。イムノアッセイでは、捕捉剤と分析物によって形成される結合複合体に特異的に結合しこれを標識する標識剤がしばしば利用される。この標識剤自体は、抗体／分析物複合体を含む部分の１つであろう。したがって、この標識剤は標識化ＨＬＡ−Ｇペプチドであるか、または標識化抗ＨＬＡ−Ｇ抗体であろう。また、この標識剤は、抗体／ＨＬＡ−Ｇ複合体と特異的に結合する第三の部分（例えばまた別の抗体）、またはＨＬＡ−Ｇペプチドもしくは抗ＨＬＡ−Ｇ抗体に共有結合している修飾捕捉団（例えばビオチン）と特異的に結合する第三の部分であろう。好ましい態様として、この標識剤は捕捉剤（抗ＨＬＡ−Ｇ）と特異的に結合する抗体である。そのような薬剤は当業者には周知で、最も代表的なものにはこの捕捉剤が得られた特定の動物種の抗体と特異的に結合する標識化抗体が含まれる。したがって、例えば該捕捉剤がマウス由来抗ヒトＨＬＡ−Ｇ抗体である場合、この標識剤はヤギ抗マウスＩｇＧ、すなわちマウス抗体の定常部に対して特異的な抗体である。免疫グロブリンの定常部と特異的に結合することができる他のタンパク質、例えばストレプトコッカスタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇもまた標識薬剤として用いられるであろう。これらのタンパク質は、ストレプトコッカス細菌の細胞壁の通常の構成部分である。それらは、多様な種の免疫グロブリンの定常部と強い非免疫学的反応性を示す。概論として、Kronval ら、J．Immunol．111:1401-140 6(1973);及び Akerstromら、J．Immunol．135:2589-2542(1985)を参照のこと。アッセイを通して、インキュベーションおよび／または洗浄工程は試薬を組み合わせた後に必要とされるであろう。インキュベーション工程は、約５秒〜数時間、好ましくは約５分〜約24時間と変動しうるであろう。しかしながら、インキュベーション時間はアッセイ様式、分析物、溶液の体積、濃度などに左右されるであろう。通常、アッセイは周囲温度で実施されるが、ある範囲の温度、例えば５℃〜45℃の範囲で実施することができる。（ｉ）非競合アッセイ様式ＨＬＡ−Ｇを検出するイムノアッセイは競合的、非競合的のいずれでもよい。非競合的イムノアッセイは、捕捉分析物（この場合はＨＬＡ−Ｇ）の量が直接測定されるアッセイである。例えば好ましい“サンドイッチアッセイ”の例では、捕捉剤（抗ＨＬＡ−Ｇ抗体）は、それら抗ＨＬＡ−Ｇ抗体が固定される固形基礎材に直接結合させることができる。続いてこれら固定抗体は被験サンプル中に存在するＨＬＡ−Ｇを捕捉する。このようにして固定されたＨＬＡ−Ｇをその後、第二の標識運搬ＨＬＡ−Ｇ抗体などの標識剤と結合させる。また、第二のＨＬＡ −Ｇ抗体は標識を欠くが、第二の抗体が得られた動物種の抗体に対して特異的な第三の標識抗体にそれに代わって結合させてもよい。ＨＬＡ−Ｇ検出用および／または定量用サンドイッチアッセイを構築できる。上記のように、固定された抗ＨＬＡ−Ｇは、配列番号１によって表されるエピトープを介してサンプル中に存在するＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する。続いて、第二の標識化抗ＨＬＡ−Ｇ（必ずしもＨＬＡ−Ｇ特異的ではない）がこの結合ＨＬＡ−Ｇ分子と結合する。未結合標識化抗体を洗い流し、残存する結合標識化抗ＨＬＡ−Ｇを検出する（例えば標識が放射性である場合、γ線検出器を用いる）。（ii）競合アッセイ様式競合アッセイにおいて、サンプル中に存在する分析物（ＨＬＡ−Ｇ）の量は、サンプル中に存在する分析物によって捕捉剤（抗ＨＬＡ−Ｇ抗体）にとってかわる（または競合される）（外から）添加された分析物の量を測定することによって間接的に測定される。競合アッセイの１つでは、既知量の分析物をサンプルに添加し、このサンプルを捕捉剤、この場合において、該分析物と特異的に結合する抗体と接触させる。該抗体と結合した分析物の量は、サンプル中に存在する分析物の濃度に反比例する。特に好ましい態様として、この捕捉剤を固形基礎材に固定する。捕捉剤に結合したＨＬＡ−Ｇの量は、ＨＬＡ−Ｇ／抗体複合物中に存在するＨＬＡ−Ｇ量を測定するか、また残存する非結合ＨＬＡ−Ｇ量を測定することによって求めることができる。ＨＬＡ−Ｇ量は標識化ＨＬＡ−Ｇを提供することによって検出できる。ハプテン抑制アッセイは、その他の好ましい競合アッセイである。このアッセイでは、既知の分析物、この場合はＨＬＡ−Ｇを固形基礎材に固定する。既知量の抗ＨＬＡ−Ｇ抗体をサンプルに添加し、続いてこのサンプルを固定ＨＬＡ−Ｇと接触させる。この場合、固定ＨＬＡ−Ｇと結合した抗ＨＬＡ−Ｇ抗体の量は、サンプル中に存在するＨＬＡ−Ｇ量と比例する。また、固定された抗体量は、抗体の固定分画または溶液中に残存する抗体分画のいずれかを検出することによって測定できる。検出は、抗体が標識されている場合は直接的であってもよく、また上記のように該抗体に特異的に結合する標識化部分を続いて添加することによって非直接的に実施してもよい。ＨＬＡ−ＧペプチドのアッセイＨＬＡ−Ｇペプチドは、抗体および抗血清に対するその結合特性によってその範囲を定めることができる。本明細書の定義の項で述べたように、２つのペプチドが実質的に類似していることは、それらがともに同じ１つの抗体または複数の抗体と特異的に結合することを示唆している。逆に、ペプチドが実質的に類似しているならば、１つのペプチドは第二のペプチドと特異的に結合しない抗体とは特異的に結合しない。したがって、本発明のペプチドは、本明細書で述べる種々のイムノアッセイでのその結合特性によって、その範囲を定めることができる。例えば、もはや配列番号１のペプチドと結合しなくなるまで配列番号１のペプチド（ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）で免疫吸着させたＨＬＡ−Ｇに対して作製した抗血清は、配列番号１のペプチドと実質的に同一であるペプチドとは反応しないであろう。配列番号１のペプチドともはや特異的に結合しなくなるまで配列番号１のペプチドで免疫吸着させた抗血清は、 “完全に免疫吸着された”と称される。これらのイムノアッセイで使用する抗血清を製造するために、ＨＬＡ−Ｇを用いて、ＢＡＬＢ／ｃのような同系株由来マウスを、フロイントのアジュバントなどの標準的なアジュバントと標準的なマウス免疫プロトコル(Harlow & Lane、上掲書参照）により免疫化する。また、ＨＬＡ−Ｇ由来であり、かつ配列を含む担体タンパク質又はペプチドベクターと結合させた合成ペプチドを免疫原として用いてもよい。ポリクローナル血清を採集し、本明細書で述べるようなイムノアッセイで免疫原タンパク質に対する力価を測定する。そのようなイムノアッセイは、例えば固形支持体に固定された免疫原（例えばＨＬＡ−Ｇ合成ペプチド）による固相イムノアッセイである。10⁴またはそれより高い力価をもつポリクローナル抗血清を選択し、例えばＨＬＡ−Ｇとは無関係な一般的な競合物質（例えばウシ血清アルブミン）を用いて上記のような競合結合イムノアッセイを用いて、ＨＬＡ−Ｇとの結合能について検査する。ＨＬＡ−Ｇと結合する抗血清を問題のペプチド、即ち配列番号１のペプチドと実質的に同一であるペプチドの性状を決定するために選択する。その後、配列番号１と標的ペプチド間の交差反応性を決定するのに競合結合様式のイムノアッセイを用いる。例えば、配列番号１のタンパク質を固形支持体に固定して、これを用いて抗血清から配列番号１のペプチドと特異的に結合する抗体を単離することができる。その後、抗血清プールから単離した抗体と結合することができる標的タンパク質の結合能力と、配列番号１のペプチドと結合する抗体を取り除いた抗血清プールと結合することができる標的タンパク質の結合能力とを、配列番号１のペプチドについて観察された能力と比較する。標的ポリペプチドと配列番号１のペプチドが、免疫吸着ポリクローナル抗血清（配列番号１のペプチドと特異的に結合しない抗血清）と免疫吸着工程中に単離した抗体（配列番号１のペプチドと結合する抗血清）の両方に対して、この系の実験誤差（＋10 ％または−10％）内で同じ親和性を有する場合、これらポリペプチドは実質的に同一である。この系の実験誤差は、ある実験から次の実験、即ち同一のポリペプチドは同じ抗体結合特性を有し、一切の相違はこの系の実験誤差として現れるコントロールとして同一のポリペプチドを用いることによって、モニターすることができる。可溶性ＨＬＡ−ＧのアッセイＡ．サンプルの採集と処理可溶性ＨＬＡ−Ｇは、患者から得た生物学的サンプルで定量化するのが好ましい。特に好ましい生物学的サンプルとして、血液および子宮頸部膣分泌物が挙げられる。米国特許第 5,096,830号には診断用アッセイサンプルとして子宮頸部膣分泌物が記載され、そのようなサンプルの採取手段が提供されている。好ましい態様として、ＨＬＡ−Ｇは全血または血漿もしくはは血清などの血液誘導体で定量化する。血液サンプルは、当業者に周知の標準的な方法にしたがって、もっとも典型的には静脈穿刺によって患者から単離する。サンプルは、必要に応じて適切な緩衝液で希釈するか、または所望の場合は濃縮して予備処置を行うことができる。生理的ｐＨのリン酸緩衝液またはトリス緩衝液などの多様な緩衝液を利用して、多数の標準的な水性緩衝液のいずれも用いることができる。Ｂ．ＨＬＡ−Ｇの定量ＨＬＡ−Ｇは、当業者に周知の多くの手段のいずれかによって検出および定量することができる。これらの手段には、電気泳動、毛細管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び高拡散クロマトグラフィーなどの分析生化学的手法並びに液体又はゲル沈降反応、免疫拡散（単層または重層）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び免疫蛍光アッセイなど種々の免疫学的手法が含まれる。生物学的サンプル（例えば血清）中の可溶性ＨＬＡ−Ｇレベルが低い（例えば１〜 100ｎＭ）場合、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および毛細管電気泳動が可溶性ＨＬＡ−Ｇレベルをモニターするのに好ましい方法である。ある種の態様として、アッセイを実施する前に例えば非ＨＬＡ−Ｇ成分を除去することによってこの生物学的サンプルの可溶性ＨＬＡ−Ｇの濃度を高める。上記技術を実施する前に生物学的サンプルを分画して、可溶性ＨＬＡ−Ｇ検出のために上記の全てのアッセイ感度を高めることがしばしば必要となる。例えば、可溶性ＨＬＡ−Ｇを他の生物学的成分から最初に大雑把に単離するために、この生物学的サンプルの適切な遠心沈殿、濾過、カラムクロマトグラフィーまたは等張性洗浄を行ってもよい。さらに、生物学的サンプルのある種の非ＨＬＡ−Ｇ成分は本明細書で述べる技術を用いて特に除去することができるが、その場合には、非ＨＬＡ−Ｇ成分に対して特異的な捕捉剤を用いてこれら非ＨＬＡ−Ｇ成分をサンプルから除去する。例えば、赤血球は、免疫吸着または親和性クロマトグラフィーによって血液を含む生物学的サンプルから特に除去することができる。Ｃ．非特異的結合の減少当業者には、イムノアッセイおよび分析物精製において非特異的結合を減少させることがしばしば必要となることは理解されよう。アッセイが固形基礎材に固定した抗原、抗体または他の捕捉剤を必要とする場合は、この基礎材への非特異的結合の量を最小限にすることが望ましい。そのような非特異的結合を減少させる手段は当業者には周知である。典型的には、この手段は、該基礎材をタンパク質性組成物で被覆することを含む。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳およびゼラチンなどのタンパク質組成物が広く用いられる。Ｄ．他のアッセイ様式ウェスタンブロット分析を用いて、サンプル中に存在するＨＬＡ−Ｇを検出および定量化することができる。一般に、この技術は、分子量を基にサンプルのタンパク質をゲル電気泳動によって単離し、別々にしたタンパク質を適切な固形支持体（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、またはナイロンフィルター誘導物）に移し、このサンプルをＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体とともにインキュベートすることを含む。この抗ＨＬＡ−Ｇ抗体は固形支持体上のＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する。これらの抗体は直接標識化していてもよいが、他には、抗ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する標識化抗体（例えば、ＨＬＡ−Ｇに対する抗体がマウスの抗体の場合は標識化ヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続いて検出してもよい。他のアッセイ様式にはリポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が含まれるが、これは特定の分子（例えば抗体）と結合するようにデザインされたリポソームを用い、被包化試薬またはマーカーを遊離する。その後、遊離した化学物質を標準的技術によって検出する（Monroeら、Amer．Clin．Prod．Rev．5:34-41(1986)を参照のこと。この文献は参考として本明細書に含まれる）。Ｅ．標識アッセイで用いられる特定の標識または検出可能な基そのものは、それが当該アッセイで用いられる抗体の特異的結合に著しく干渉しない限り、本発明の重要な特徴ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有するいずれの物質でもよい。そのような検出可能な標識はイムノアッセイの分野で開発が進み、そのような方法において有用なほとんどの標識が一般に本発明に応用できる。したがって標識は、分光光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段で検出可能な一切の組成物である。本発明で有用な標識には、磁性ビーズ（例えばDynabeads^TM）、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサス赤、及びローダミンなど）、放射線標識（例えば³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、又は³²Ｐ）、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで通常用いられるその他のもの）および比色定量標識（例えばコロイダル金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、及びラテックスなど）ビーズが含まれる。標識は、当技術分野で周知の方法で直接的または間接的に所望のアッセイ成分に結合させることができる。上記で示唆したように、必要とされる感度、化合物の結合の容易さ、必要とされる安定性、利用可能な装置および廃棄の容易さにしたがって選択しながら多様な標識を用いることができる。非放射線標識はしばしば直接的手段によって結合させられる。一般には、リガンド分子（例えばビオチン）を分子に共有結合させる。続いてこのリガンドを抗リガンド（例えばストレプトアビジン）分子に結合させる。後者は、そのもの自体を検出できるものであるか、またはシグナル系（例えば検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物）に共有結合させてもよい。多数のリガンドおよび抗リガンドを用いることができる。リガンドが天然の抗リガンド、例えばビオチン、チロキシンおよびコルチソルを有する場合、これら天然の標識抗リガンドを組み合わせて用いることができる。また、ハプテン化合物または抗原性化合物を抗体とともに用いてもよい。分子はまた、例えば酵素または蛍光団との共役によってシグナル発生化合物に直接結合させてもよい。標識として考えられる酵素は主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、または酸素還元酵素、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。種々の標識またはシグナル発生系に関する有用な概説として米国特許第 4,391,904号（この文献は参考として本明細書に含まれる）を参照されたい。標識の検出手段は当業者に周知である。したがって、例えば標識が放射能標識の場合、検出手段にはシンチレーション計測器またはオートラジオグラフィーの場合は写真用フィルムが含まれる。標識が蛍光標識の場合、適切な波長の光で蛍光色素団を励起し、生じた蛍光を例えば顕微鏡、肉眼検査、光学フィルム、電荷共役装置(charge coupled devices(ccd))または光増幅装置などの電子検出器によって検出することによって標識を検出できる。同様に、酵素標識は、酵素のための適切な基質を提供し、生じた反応生成物を検出することによって標識を検出できる。最後に、簡単な比色定量標識では標識に付随する色を観察することによって簡単に検出できる。したがって、種々の浸漬用スティックアッセイでは、共役された金はしばしば桃色になる一方、種々の共役ビーズはビーズの色を示す。いくつかのアッセイ様式では標識成分は必要とされない。例えば、凝集アッセイは標的抗体の存在を検出するために用いることができる。この場合、抗原被覆粒子が標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この様式では、成分のいずれも標識する必要がなく、標的抗体の存在は単純な肉眼検査で検出できる。Ｆ．基礎材上記で述べたように、アッセイによって抗原、標的抗体または抗イディオ抗体を含む種々の成分を固形表面に結合させることができる。生物学的分子を種々の固形表面に固定する多くの方法が当技術分野で知られている。例えば、固形表面には、膜（例えばニトロセルロース）、マイクロタイター皿（例えばＰＶＣ、ポリプロピレンまたはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、浸漬用スティック（例えばガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスなど）、微量遠心沈殿管、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属もしくはポリマービーズがある。所望の成分は共有結合または非特異的結合による非共有結合によって連結される。広範囲の有機または無機ポリマー（天然および合成を含む）を固形表面用素材として用いることができる。ポリマーの実例としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリル酸、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、セルロースアセテート、及びニトロセルロースなどが含まれる。その他に用いることができる物質には、紙、ガラス、セラミック、金属、非金属、半導体物質、又はセメントなどが含まれる。さらに、ゲルを形成する物質も含まれ、例えばタンパク質（例えばゼラチン）、脂質多糖類、ケイ酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドを用いることができる。幾つかの水性層を形成するポリマー、例えばデキストラン、ポリアルキレングリコールまたは界面活性剤、例えばホスホリピド、長鎖（12〜24個の炭素原子）アルキルアンモニウム塩などもまた適切である。固形表面が多孔性の場合、系の性質にしたがって種々の孔径を用いることができる。そのような表面を調製する場合、種々の特性を得るために複数の異なる物質を例えばラミネートのように用いることができる。例えば、ゼラチンなどのタンパク質被覆を用いて非特異的結合、単純な共有結合を避け、シグナル検出を高めることができる。化合物と表面との間で共有結合が望まれる場合、そのような表面を通常、多官能基性であるか、または多官能基化することができる。表面に存在し、連結に用いることができる官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、及びメルカプト基などが含まれる。広範囲の化合物を種々の表面に連結する態様は周知であり、文献にも多数例示されている。例えば、Immobilized Enzymes、Ichiro Chibata，Halsted Press 刊、ニューヨーク、1978；及びCuatrecasas，J．Biol．Chem．245:3059(1970)を参照されたい。これらの文献は参考として本明細書に含まれる。さらに共有結合の他に、アッセイ成分を非共有結合するための種々の方法が用いられる。非共有結合は、典型的には該表面への化合物の非特異的吸着である。典型的には表面を第二の化合物でブロックし、標識化アッセイ成分の非特異的結合を防止する。また、１つの成分とは非特異的に結合するが別の成分とは著しく結合しないように、表面を設計する。例えば、コンカナバリンＡのようなレクチンを有する表面は炭水化物含有化合物と結合するが、グリコシル基をもたない標識化タンパク質とは結合しないであろう。アッセイ成分の非共有結合的付加で使用できる種々の固形表面は米国特許第 4,447,576号および 4,254,082号で概説されている。これらの文献は参考として本明細書に含まれる。Ｇ．サンプル集団とのＨＬＡ−Ｇレベルの比較ある種の好ましい態様として、本発明のアッセイを用いて、例えば特定の妊婦患者と比較するために参照妊婦集団の平均可溶性ＨＬＡ−Ｇレベルが定量される。例えば母体血液中のＨＬＡ−Ｇの平均レベルを当該集団について推論できるように、本明細書で開示するいずれの分析物の定量用技術もある特定集団の生物学的サンプル中のＨＬＡ−Ｇレベルの定量に用いることができる。当該集団は、その集団の全てのメンバーが同じ妊娠期間にあり、外見上健康で正常な妊娠であり、さらに全てのメンバーが同様な遺伝的背景（すなわち単一の人種型、例えば北部ヨーロッパ系）にあるように選択される。この集団は“参照集団”と呼ばれる。一般的に同じ遺伝的背景と同じ妊娠期間を有する個々の患者を、その後参照集団と比較し、そのＨＬＡ−Ｇレベルが正常（すなわち参照集団と同じである）か否かを決定する。妊娠経過観察のためのＨＬＡ−Ｇレベルの決定成人はＨＬＡ−Ｇを発現しないので、例えば血中のＨＬＡ−Ｇの存在は患者が妊娠していることを示唆する。母体血液中のＨＬＡ−Ｇの存在は上記の方法で決定できる。母体血液のＨＬＡ−Ｇレベルは、胎児母体接触面の健康度の一般的な指標とすることができる。ＨＬＡ−Ｇは侵入栄養膜によって主に発現されるので、参照集団と比較した患者の母体血液のＨＬＡ−Ｇレベルの上昇または減少は、栄養膜侵入が異常に進行していることを示唆する。本発明はまた、妊娠診断および循環ＨＬＡ−Ｇレベルの異常に関連する病的状態を診断するためのキットを提供する。このキットは、ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体を含むのが好ましい。この抗体は遊離状態であるか、または上記のように固形支持体に固定されている。このキットはまた、例えば妊娠検出用アッセイでの抗体の使用を説明する指示用資料、適切な希釈剤、及び化学薬品などを含む。ＨＬＡ−Ｇの発現場所の決定胎盤性ＨＬＡ−Ｇの時間的および空間的発現パターンを決定する位置決定実験の解釈は、他のクラスＩ分子と反応する抗体およびプローブを使用したために以前は複雑を極めた。胎盤性ＭＨＣクラスＩ発現に関する初期の免疫的位置決定実験は、クラスＩａおよびクラスＩｂ分子間を区別できないモノクローナル抗体を用いて実施された。最近になって、研究者らは in situハイブリダイゼーションによって胎盤内のＨＬＡ−ＧｍＲＮＡの位置を決定した。これらの実験では全て栄養膜細胞層の外絨毛にＨＬＡ−ＧｍＲＮＡが検出された。この研究者のうち２人は、妊娠初期の栄養膜細胞層の絨毛および間葉絨毛にＨＬＡ−ＧｍＲＮＡを検出した（Yelavarthiら、J．Immunol．146:2847(1991); 及びChumbleyら、 Hum．Immunol.37:17(1993)）。対照的に、他の研究者らは、転写物が合胞体栄養細胞層にのみ存在すると報告した（Lata J．Exp．Med．175:1027(1992)）。 in situハイブリダイゼーションの研究と同じように、本明細書で示す免疫的位置決定実験（下記実施例を参照のこと）は、栄養膜細胞層の外絨毛がＨＬＡ− Ｇタンパク質を発現することを示した。しかしながら、栄養膜細胞層絨毛、合胞体栄養細胞層（第１期トリメスターのブラシ縁の弱い染色を除く）または絨毛コアの構成成分では抗ＨＬＡ−Ｇ抗体との反応性は認められなかった。特定組織におけるＨＬＡ−ＧｍＲＮＡとＨＬＡ−Ｇタンパク質間の矛盾は、ＨＬＡ−Ｇ転写物が翻訳されないことを示しているか、またはスプライスされることによって特定の抗体によって認識されないタンパク質形態が出現することを示唆している。しかしながら、これらの抗体がそれに対して作製されたアミノ酸配列は、これまでに記載されてきた別にスプライスされたｍＲＮＡのいずれにおいても欠落していない。以前の実験で用いられた核酸プローブは、絨毛コアに存在するクラスＩａｍＲＮＡとのプローブの交差反応による人為的産物を生じた可能性もまた存在する。ＨＬＡ−ＧｃＤＮＡの3'非翻訳領域から得た 450ｂｐのＰｖｕＩＩフラグメントに対応するプローブを用いるノザンハイブリダイゼーションは、高い相同性が要求されるストリンジェント条件以外の全てでクラスＩａｍＲＮＡと交差反応して、この可能性を支持した（下記の実施例参照）。精製第１期および第２期栄養膜細胞層はＨＬＡ−Ｇのインビトロ発現をアップレギュレートする侵入経路に沿った栄養膜細胞層の分化の動的様相を調べるために、この過程のインビトロモデルを用いた。妊娠初期胎盤から単離した栄養膜細胞層の幹細胞は、それら幹細胞を播種した細胞外マトリックスに迅速に侵入する。この過程で、幹細胞はインテグリンの細胞外マトリックスレセプターのそれらのレパートリーのスイッチを入れ（栄養膜細胞層がインビボで子宮に侵入するように）、92ｋＤａのコラゲナーゼＩＶ型の合成／活性化をアップレギュレートする(Librachら、 J. Biol．Chem．269:17125(1994))。粘着分子またはタンパク質分解酵素機能のいずれかの妨害によって侵入が抑制される。これは、これらの分子が栄養膜細胞層の侵入に重要な役割を果たすということを示唆している。これらの分子の発現は、少なくとも部分的には翻訳レベルで制御されるが、インビトロでのタンパク質分解酵素およびインテグリン発現のアップレギュレーションは、対応するｍＲＮＡの産生におけるアップレギュレーションと対応する。栄養膜細胞層のタンパク質分解酵素とインテグリンのインビトロにおける発現はまた、妊娠の経過につれて劇的に変化する。既にその侵入能を喪失している分娩期の栄養膜細胞層は、 92ｋＤａのコラゲナーゼＩＶ型をほとんど産生せず、インテグリンのスイッチ機能を受けることができず、これらの分子をコードする検出可能なｍＲＮＡを含まない。タンパク質分解酵素およびインテグリンの場合のように、第１期および第２期トリメスターの栄養膜細胞層はＨＬＡ−Ｇの発現を培養でアップレギュレートした。組織切片で実施した免疫的位置決定実験は、絨毛栄養膜細胞層が抗ＨＬＡ− Ｇ抗体と反応しないことを示した。したがって、予想されたように、単離された絨毛細胞のほんの数％が播種後直ちにＨＬＡ−Ｇを産生する。培養12時間後に、第１期トリメスターの栄養膜細胞層の64％がＨＬＡ−Ｇを発現した。しかしながら、栄養膜細胞層のＨＬＡ−Ｇ発現がインテグリンおよびタンパク質分解酵素の発現とは異なる調節をうけることは明白である。ＨＬＡ−ＧｍＲＮＡレベルは培養期間を通じて一定であった。この現象について２つの説明が可能である。第一に、栄養膜細胞層の幹細胞は高レベルのＨＬＡ−ＧｍＲＮＡを含むかもしれない。すなわちそれらを単離することはＨＬＡ−ＧｍＲＮＡレベルに変化を与えないが翻訳を促進する。第二に、ＨＬＡ−ＧｍＲＮＡの産生は、単離工程の間に最大レベルまで誘発することができるかもしれない。いずれの場合でも、栄養膜細胞層のインビトロでのＨＬＡ−ＧｍＲＮＡ産生の経時変化は、タンパク質分解酵素および粘着分子のそれと異なることは明らかである。驚くべきことに、もはや侵入に必要とされる抗原を発現しない分娩期細胞の顕著な割合（42％）が、それらが妊娠初期の細胞よりはるかに低いＨＬＡ−ＧｍＲＮＡレベルしか含まないにもかかわらず、培養時のＨＬＡ−Ｇ発現をアップレギュレートした。これらの観察を総合すると、胎盤は多くの固有の機能を発揮し、それらのいくつかは妊娠中に劇的に変化するという事実を示している。金属結合タンパク質分解酵素発現の強化およびインテグリンのスイッチ機能の強化は、子宮侵入を仲介する妊娠初期栄養膜細胞層の特性である。これら遺伝子発現のダウンレギュレーションは、栄養膜細胞層の侵入を制御する１つの機構である。対照的に、全妊娠期間における外絨毛栄養膜細胞層は、インビトロでＨＬＡ−Ｇ発現をアップレギュレートする能力を保持する。これらの観察は、細胞が侵入特性を一時的にのみ発現する必要がある一方、母体の免疫監視を常時回避するという事実と一致する。実施例以下の実施例は、例示のためにのみ提供するのであって、限定するものではない。当業者には、実質的に同様な結果を得るために変更または改変可能な種々の非必須パラメーターが存在することは理解されよう。実施例１：抗ＨＬＡ−Ｇモノクローナル抗体の性状決定ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインのアミノ酸61〜83（ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１））と一致する合成ペプチドでマウスを免疫化して、ＨＬＡ−Ｇに対するモノクローナル抗体を作製した。このペプチドは、製造元の指示にしたがってＣ末端システイン（この目的のために付加）を介してマレイミド活性化カギアナカサガイヘモシアニン（KLH; Imj ect; Pierce Chemical Co.，ロックフォード、イリノイ）と共役させた。２ヵ月齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス(Charles River)にフロイントの完全アジュバント中で乳化した 100μｇのペプチドＫＬＨ共役物を腹腔内に注射し、14日後に不完全アジュバント中の抗原50μｇで追加免疫した。試験採血は10日後に尾静脈から得た。ペプチド免疫原に対する反応性についてはＥＬＩＳＡ（下記で説明）で血清をスクリーニングした。最も良好な液性反応を示したマウスに最後の静脈内追加免疫（50μｇ）を施し３日後に屠殺した。脾臓細胞を単離し、公表された方法（Kohler & Milstein，Nature 256:495(1975);及び Harlow & Lane，上掲書(198 8)）にしたがってＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。培養をＨＡＴ培地（ UCSF Cell Culture Facility）で選別し、限定希釈でクローニングした。上記の方法で単離したＨＬＡ−Ｇ抗体はＩｇＭクラスに属した。少なくとも２つの因子がこの出現に寄与した。第一は、ハイブリドーマ産生前に比較的短期間でマウスを免疫したことであり、初期抗原反応は主にＩｇＭクラスの抗体産生をもたらす。第二に、ハイブリドーマのスクリーニングに用いたレポーター抗体はＩｇＧとともにＩｇＭと反応することである。上記の方法を用いて、少なくとも１％またはそれより高い割合でＨＬＡ−Ｇ特異的抗体を産生するハイブリドーマを再現性をもって得ることができる。１Ｂ８抗体がクラスＩａ分子（ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）と反応するか否か決定するために２つの方法を用いた。フローサイトメトリ実験（フローサイトメトリ技術は下記で説明する）は、12人の血液から単離された末梢血の白血球がこの抗体と結合しないことを示した。対照的に、ＨＬＡ−Ｇを発現するベクターで安定的に核酸感染させたＪＥＧ−３細胞およびＢ−類リンパ芽球のＨＬＡ−ｎｕｌ１細胞系（ＬＣＬ７２１．２２１）は、１Ｂ８またはＷ６／３２で染色したとき強い陽性シグナルを発した。１Ｂ８またはＷ６／３２は、全てのクラスＩ重鎖の単形態性決定基／β２−ミクログロブリン複合体を認識する抗体である(Barnsta bleら、Cell 14:9(1978))。しかしながら、親（非核酸感染）類リンパ芽球細胞は何れの抗体とも反応しなかった。アイソタイプ適合性非関連ＩｇＭ(Sigma)は何れの細胞とも反応しなかった。抗体がクラスＩａ分子と反応しないということは、出願人らの免疫的位置決定データ（下記の節で詳細に考察する）によってさらに支持される。胎盤および胎盤床はクラスＩａ抗原を発現する多くの細胞を含んでいる。例えばヒトの妊娠の特徴は脱落膜の白血球浸潤である(Ferryら、Immunology 70:446(1990))。完全に胎児性細胞からなる自由絨毛膜絨毛は、豊富な間質細胞とマクロファージ（Hofb auer細胞）を含むが、これはまたクラスＩａタンパク質を発現する(Nakamuraら、Hum．Pathol．21:936(1990))。しかしながら、26人の胎盤組織で実施した免疫的位置決定実験によって、これらのクラスＩａ発現細胞集団のいずれもが、ＨＬＡ−Ｇ抗体で染色されないことが示された。すなわち１Ｂ８および３Ｆ６ｍＡｂは栄養膜細胞層の特定集団とのみ反応した。実施例２：抗体スクリーニングペプチド免疫原に対する反応性について、標準的方法にしたがい抗体捕捉ＥＬＩＳＡ(Harlow & Laneの上掲書参照)によってハイブリドーマをスクリーニングした。マイクロタイタープレートを合成ペプチド10μｇ／ｍｌを含むＰＢＳ50μ ｌで被覆し、ＰＢＳで３回洗浄し、さらに0.02％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０、0. 25％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび0.02％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（封鎖用緩衝液）で室温で１時間封鎖した。室温で１時間被験液（被験血清またはハイブリドーマ上清）とともにプレートをインキュベートし、続いて１：2000に封鎖緩衝液で希釈したアルカリ性ホスファターゼ（Jacson Immuno Research Lab s.，Inc.，ウエストグローブ、ペンシルバニア）共役ウサギ抗マウスＩｇＧでインキュベートした。ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質溶液50μｌ(３ｍＭＰＮＰＰ、0.05ＭＮａＣＯ₃、0.5ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ9.5)を加え、マイクロタイタープレート読取り装置（Molecular Devices Inc.，メンローパーク、カリフォルニア）を用いて 405ｎｍでの吸収を測定することによって、反応性を調べた。また、固定絨毛を含む第２期トリメスター胎盤の初期（16〜18週）の栄養膜細胞層の組織切片との反応性についてハイブリドーマをスクリーニングした。ハイブリドーマの上清とサイトケラチンに対するラット・モノクローナルＩｇＧ（７Ｄ３）を用いて二重間接免疫蛍光を実施した。サイトケラチン抗原は分化上皮細胞に存在するが、結合組織、内皮、筋肉または血液細胞には存在しない。胎盤組織をカルシウム含有ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒド(ｐＨ7.2)で3 0分間固定した。続いてこれを10ｍＭグリシン中でインキュベートして未反応アルデヒド基の反応を停止させ、15％ショ糖を浸透させてＯＣＴ（Miles Scientif ic，ナッパビル、イリノイ）中に包埋し液体窒素で凍結した。切片（５μｍ）をクリオスタット(Slee HRクリオスタット)で切り出し、22ｍｍ²のカバースリップ上に集めた。染色前に、切片をＰＢＳおよび 0.2％ＢＳＡ含有ＰＢＳで各回10分間洗浄した。一次抗体は、未希釈ハイブリドーマ上清として組織切片に１時間室温で用いた。洗浄後、フルオレセイン共役ヤギ抗マウスＩｇＧとローダミン共役ヤギ抗ラットＩｇＧ(１：200 希釈、Jackson Immuno Research)の１：１混合物で切片を室温で30分間インキュベートした。サンプルをマウントし、ツァイスのエピフルオレセンス相顕微鏡で調べ、コダックフィルム(Tri X)で撮影した。更なる性状検査のために選択した抗体のクラスは、イムノタイプキット(Immun oType Kit，Sigma，セントルイス、ミズーリ)を用い製造元の支持にしたがって決定した。ＥＬＩＳＡを用いてＨＬＡ−Ｇペプチドと結合する幾つかの抗体を単離し、第１期トリメスター胎盤の栄養膜細胞層を染色した。これらの抗体のうち、１Ｂ８および３Ｆ６、ともにＩｇＭクラスの２抗体の性状をさらに調べた。実施例３：ＨＬＡ−Ｇの親和性精製これらの抗体の特異性の性状を調べるために、１Ｂ８ｍＡｂを用いて親和性カラムを作製し、このカラムに³⁵Ｓで標識化したＪＥＧ−３の洗剤抽出物を通した。この絨毛癌細胞系はＨＬＡ−Ｇを発現するが、クラスＩａ分子は発現しない。洗浄後、結合タンパク質を溶出させ、10％ＳＤＳ−ＰＡＧＥと蛍光写真法（fl uorography）で分析した。ＨＬＡ−Ｇ α鎖の分子集団に対応する、単一の38ｋＤａタンパク質が検出された。β２−ミクログロブリン（12ｋＤａ）は、用いた条件下で、ゲルの底から流出したものと思われる。１Ｂ８抗体を用いて、免疫親和性カラムを以下のように作製した。第一に、製造元の指示にしたがって、ペプチド免疫原をチオプロピル活性化セファロース６Ｂ(Pharmacia，ピスカタウェー、ニュージャージ)に共役させた。続いて、ＰＢＳで１：10に希釈した１Ｂ８腹水液をカラムに通し、さらに20ベッド容積のＰＢＳで洗浄することによって抗体をマトリックスに結合させた。抗体が特異的に結合したことは、100ｍＭグリシン(ｐＨ2.5)でカラムを溶出させることによって証明した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの銀染色で調べたところ、この分画は純粋なＩｇＭを含んでいた。以下のように³⁵Ｓ標識化ＪＥＧ−３絨毛癌細胞抽出物からＨＬＡ−Ｇを精製するために、この抗体カラムを用いた。0.5ｍＣｉ／ｍｌの³⁵Ｓ−タンパク質標識化ミックス(EXPRE³⁵Ｓ³⁵Ｓ Protein Labling Mix，＞1000Ci/mmol，New England Nuclear，ボストン、マサチューセッツ)を含むメチオニン−システインフリーＤＭＥＭ(Gibco，ガイザースバーグ、メリーランド)中で一晩インキュベートして、１×10⁷ ＪＥＧ−３細胞を代謝によって標識化した。標識化後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、50ｍＭトリスと１％ＮＰ−４０、ｐＨ8.0 を含む冷緩衝液で溶解させた。溶解物を16,000×ｇで４℃、10分間遠心して清澄にし、上清をカラムに重層した。カラムに20ベッド容積のＰＢＳを流し、さらに 100ｍＭグリシン、ｐＨ2.5 で溶出させた。溶出液と流出分画(800ｃｐｍ／サンプル)を10％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単離し、蛍光写真法で処理し、エックス線フィルムに−80℃で露光させた。実施例４：フローサイトメトリー全血をフィコール−ハイパーク1077（Ficoll-Hypaque 1077，Sigma）中で遠心して末梢血白血球（ＰＢＬ）を調製した。10％ウシ胎児血清添加イーグルの最少必須培地(UCSF Cell Culture Facility)中で増殖させたＪＥＧ−３の単層培養をトリプシン消化して単一細胞浮遊液を得た。ＰＢＬまたはＪＥＧ−３細胞をＢＳＡ１ｍｇ／ｍｌを含むＰＢＳで洗浄し、１Ｂ８（ハイブリドーマ上清１：10希釈）またはＷ６／３２（１μｇ／ｍｌ）のいずれかとインキュベートし、続いてフルオレセイン共役抗マウスＩｇＭまたはＩｇＧ(１：100 希釈、Jackson Immuno Research)でそれぞれインキュベートした。続いて細胞を洗浄して 0.2％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳｃａｎサイトメータ（Becton Dickinson，マウンテンビュー、カリフォルニア）で調べた。実施例５：胎盤と胎盤床におけるＨＬＡ−Ｇの免疫蛍光による位置決定：ＨＬＡ−Ｇはインビボで侵入経路に沿って分化する栄養膜細胞層で発現される第１期、第２期および第３期トリメスターの妊娠時に得た組織から調製した胎盤と胎盤床の凍結切片で蛍光検出を用いて免疫組織化学分析を実施した。凍結切片は、第１期、第２期および第３期トリメスターのヒト絨毛膜絨毛または胎盤床の生検材料から先に記載されたように調製した(Damskyら、J．Clin．Invest．89 :210(1992))。１Ｂ８または３Ｆ６（抗ＨＬＡ−Ｇ抗体）および７Ｄ３（抗サイトケラチン）を用いて二重間接免疫蛍光を本質的に上記で述べたように実施した。１Ｂ８および３Ｆ６抗体の反応性は、蛍光共役ヤギ抗マウスＩｇＭ(Jackson I mmuno Research，１：200希釈)を用いて検出した。コントロール実験は一次もしくは二次抗体単独、非免疫マウス血清または正常マウスＩｇＧとの組織のインキュベーションを含んでいた。切片は、脱落膜化子宮内膜および子宮筋層とともに自由絨毛膜絨毛および固定絨毛（栄養膜細胞層細胞柱を含む）を含んでいた。したがって、栄養膜細胞層幹細胞は分化栄養膜（合胞体栄養細胞層および侵入栄養膜細胞層）と同様に、明白であった。切片は、胎盤床では栄養膜細胞について特異的である抗サイトケラチン抗体（７Ｄ３）と１Ｂ８または３Ｆ６抗ＨＬＡ−ＧｍＡｂ（上記で説明）のいずれかとで二重染色した。３Ｆ６ｍＡｂは、１Ｂ８の染色パターンと同一パターンを生じた。絨毛基底膜に固定された未分化栄養膜細胞層および絨毛コア内の胎児性要素を含む自由絨毛の成分はいずれも、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体とは反応しなかった。対照的に、固定絨毛の細胞柱内の侵入栄養層細胞膜は明るく染色された（図２、パネルＢ）。抗体反応性は、栄養膜細胞層が子宮壁と接触したとき細胞柱の遠位部に最初に検出された。間質侵入に加わる栄養膜細胞層もまた明るく染色された。妊娠のこの時期に、血管内侵入がピークになるとき、血管内の栄養膜細胞層も、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体との強い反応性を示した。一次または二次抗体単独、非免疫マウス血清または正常マウスＩｇＧと組織とのインキュベーションでは反応は認められなかった。第１期トリメスターサンプルで染色される栄養膜細胞層は、第２期トリメスター組織でのそれとほとんど同一であった。自由絨毛成分のいずれもが、いずれの抗体とも反応しなかった。唯一の例外は、まれに認められる合胞体ブラシ縁の染色であった。第３期トリメスター組織は同じパターンを示した。すなわち、自由絨毛（合胞体ブラシ縁を含む）は染色されなかった一方、間質および血管内栄養膜細胞層は抗体と反応した。しかしながら、第３期トリメスターでは、子宮壁内の栄養膜細胞層は、妊娠のより初期の匹敵する場所の細胞より少ない明るさで染色された。実施例６：ＨＬＡ−Ｇはインビトロでの侵入経路に沿って分化する栄養膜細胞層によって発現される高度に精製し、マトリゲル（Matrigel）上に播種した妊娠初期栄養膜細胞層の幹細胞は、時期特異的抗原の発現によって示されるように凝集し、侵入表現型を獲得する。この実験系を用いて、インビトロでの侵入経路に沿った栄養膜細胞層分化過程でのＨＬＡ−Ｇ産生を調べた。２種の培養条件を用いた。第一に、妊娠初期栄養膜細胞層を、大きな凝集物の形成を促進するマトリゲル栓子に播種した。これら凝集物の切片を染色することによって、細胞が細胞外マトリックスの基礎材に侵入するとき、間質でのＨＬＡ−Ｇ発現パターンを決定することが可能になる。マトリゲルに侵入しない表面の細胞は染色されなかった一方、基礎材に侵入した細胞は１Ｂ８抗体と反応した。以前に記載(Fisherら、J．Cell Biol．109:891(1989);及び Librachら、J．Ce ll Biol．113.437(1991))されたように、第１期、第２期および第３期トリメスターの絨毛膜絨毛から高度精製栄養膜細胞層を調製した。２％ニュートリドーマ（Nutridoma，Boehringer Mannheim Biochemicals,インジアナポリス、インジアナ）を含むＭＥＭ（UCSF Cell Culture Facility）中でラミニン高含有細胞外マトリックス調製物マトリゲル（Collaborative Research，ベッドフォード、マサチューセッツ）に細胞を播種した。大型凝集物の形成を促進するために、カプセル（直径 6.5ｍｍ）中に作ったマトリゲル栓子に 2.5×10⁵細胞を播種した。３日培養後、マトリゲル栓子と栄養膜細胞層の凝集物を３％パラホルムアルデヒドで固定し、切片を作製し、免疫染色のために処理した。マトリゲル栓子に侵入した凝集物の切片は本質的に上記で述べたように染色した。但し、反応性は、製造元の指示にしたがって、ベクタステイン（Vectastain）ＡＢＣキット（Vector L aboratories，Burlingame，カリフォルニア）を用いて検出した。第二の培養条件を用いて、ＨＬＡ−Ｇタンパク質のインビトロ産生の経時変化を決定した。異なる妊娠時期の胎盤から単離した栄養膜細胞層をマトリゲルの薄層上で培養した。これらの条件下で、マトリゲル栓子で培養したときと同じように（Damskyら、Development 120:3657(1994)）侵入経路に沿って細胞は分化した。しかしながら、それらはより小型の凝集物を形成し、この凝集物は切片を形成する必要がなく個々の細胞の染色パターンを決定することを可能にした。全妊娠時期の栄養膜細胞層はＨＬＡ−Ｇ産生を培養でアップレギュレートした。例えば、播種直後では第１期トリメスター細胞の約25％はＨＬＡ−Ｇを発現したが、培養12時間までにほぼ60％が抗体と反応した。このレベルは48時間のアッセイ時間中一定であった。妊娠期間が長くなるとともに、殆どの時点で免疫陽性細胞の割合は減少した。例えば、12時間後には第１期トリメスター細胞よりも極めて少ない第３期細胞がＨＬＡ−Ｇを発現した（34％対63％）。このアッセイは下記に記載するように実施した。種々の培養時間後にＨＬＡ−Ｇを発現する細胞の割合を決定するために、マトリゲルの薄層（10μｌ）で被覆したカバースリップ（22ｍｍ²）上に 2.5×10⁵細胞を播種した。０〜48時間培養後、細胞を３％パラホルムアルデヒドで室温で５分間固定し、ＰＢＳで洗浄して冷メタノールを５分間浸透させ、上記に記載したとおりに免疫蛍光のために処理した。実施例７：ノザンブロットハイブリダイゼーションは、栄養膜細胞層のＨＬＡ−ＧｍＲＮＡのインビトロ産生が妊娠期間で調節されることを示す第１期、第２期および第３期トリメスターの栄養膜細胞層培養のｍＲＮＡレベルを定量するために、ノザンハイブリダイゼーションを用いた。第１期および第２期トリメスター栄養膜細胞層で単離直後に高レベルのＨＬＡ−ＧｍＲＮＡが検出され、ｍＲＮＡ発現レベルは培養時間によって変化しなかった。対照的に、分娩期細胞のＨＬＡ−ＧｍＲＮＡレベルは培養期間中顕著に低下していた。下記のようにノザン分析を実施した。公表された方法（Chomczynski & Sacchi，Anal．Biochem．162:156(1987)）にしたがって、培養栄養膜細胞層から全ＲＮＡを抽出した。簡単に記せば、サンプル当たり２〜５×10⁷細胞をグアニジン緩衝液 500μｌ（４Ｍグアニジンイソチオシアネート、25ｍＭクエン酸ナトリウム、0.5％サルコシル）中で均質化し、その後、２Ｍ酢酸ナトリウム50μｌ（ｐＨ４）、水性飽和フェノール 500μｌおよびクロロホルム 100μｌを加えた。遠心沈殿後、イソプロパノール 500μｌを添加して水相からＲＮＡを沈澱させ、４ＭＬｉＣｌで抽出し、さらに10ｍＭトリス(ｐＨ7.5)、１ｍＭＥＤＴＡおよび 0.5％ＳＤＳを含む溶液から再沈澱させた。続いて沈澱塊を70％エタノールで洗浄し、真空乾燥して滅菌水に溶解した。ＲＮＡの濃度は 260ｎｍでの吸収を測定して求めた。ＨＬＡ−Ｇ特異的ｃＤＮＡプローブは、標準的方法(Taborら、Current Protoc ols in Molecular Biology１巻、p.3.0.1,K．Jannssen 編、John Wiley & Sons 刊、ニューヨーク)にしたがって³²Ｐ−ＣＴＰとクレノーフラグメントを用い、ＨＬＡ−Ｇの3'非翻訳領域から得た 450ｂｐの大きさのＰｖｕＩＩフラグメントのランダムプライミングによって合成した。プローブの比活性は２×10⁹ｄｐｍ／μｇであった。全ＲＮＡ（10μｇ）はホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動で単離し、ニトラン（Nytran）膜(Schleicher & Schuell，Keene，ニューハンプシャー)に移し、先に記載されたとおり(Lehrachら、Biochemistry 16:4743(19 77); Deら、J．Biol．Chem．265:15267(1990))ノザンブロットハイブリダイゼーションで分析した。全ての実験で、膜に移す前にアクリジンオレンジでゲルを染色し、ＲＮＡサンプルが完全なことを確認し、さらに等量のＲＮＡが各レーンに添加されたことを確認した。最後のハイブリダイゼーション後洗浄は 0.3×ＳＳＣ(150ｍＭＮａＣｌ、15ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ7.4)および 0.1％ＳＤＳ中で68℃で実施した。本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願は、参考として本明細書に含まれる。前述の発明は、理解を容易にするために図示と実施例によって説明したが、当業者には本発明の教示を基に添付の請求の範囲を越えることなく一定の変更または改変を行い得ることは理解されるところである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/02 ＡＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 15/00 ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リブラッチ、クリフォードカナダ国Ｍ６Ｃ２Ｇ７オンタリオ州トロントオールドフォレストヒルロード 177 (72)発明者ダムスキー、キャロラインアメリカ合衆国 94002 カリフォルニア州ベルモントテラスドライブ 1746 (72)発明者マックマスター、マイケルティー. アメリカ合衆国 94619 カリフォルニア州オークランドフェアアベニュ 4305

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質のα１ドメインのアミノ酸残基61〜83から本質的になるアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した５個のアミノ酸の配列を含む精製ポリペプチドであって、該ポリペプチドが免疫原として存在するとき、ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体の産生を誘発し、かつ該ペプチドが配列番号１のペプチドで完全に免疫吸着されているＨＬＡ−Ｇに対して作製した抗血清とは結合しない、上記精製ポリペプチド。２．配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）を有する請求項１記載のポリペプチド。３．配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）を有するポリペプチドと実質的に同一なポリペプチド。４．配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）を有する請求項３記載のポリペプチド。５．請求項１記載のポリペプチドおよび医薬上許容可能な賦形剤を含有する免疫原組成物。６．請求項１記載のポリペプチドが第二のポリペプチドと共有結合している請求項５記載の免疫原組成物。７．免疫原組成物がさらにカギアナカサガイのヘモシアニンを有する請求項５記載の免疫原組成物。８．ヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質のα１ドメインのアミノ酸残基61〜83から本質的になるアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した５個のアミノ酸の配列を含むポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドが免疫原として存在するとき、ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体の産生を誘発し、かつ該ペプチドが配列番号１のペプチドで完全に免疫吸着されているＨＬＡ−Ｇに対して作製した抗血清とは結合しない、上記核酸。９．核酸が配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）と実質的に同一のポリペプチドをコードする請求項８記載の核酸。 10．ＨＬＡ−Ｇのα１ドメイン内のサブ配列と特異的に結合する抗体であって、該サブ配列が配列番号１の配列内に存在する、上記抗体。 11．抗体が１Ｂ８及び３Ｆ６からなる群から選ばれる請求項10記載の抗体。 12．ヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質のα１ドメインのアミノ酸残基61〜83から本質的になるアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した５個のアミノ酸の配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む組換え細胞であって、該ポリペプチドが免疫原として存在するとき、ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合する抗体の産生を誘発し、かつ該ペプチドが配列番号１のペプチドで完全に免疫吸着されているＨＬＡ− Ｇに対して作製した抗血清とは結合しない、上記組換え細胞。 13．配列番号１と特異的に結合する抗体を産生する細胞。 14．細胞系１Ｂ８及び３Ｆ６からなる群から選ばれる請求項13記載の細胞。 15．ヒトＨＬＡ−Ｇタンパク質のα１ドメインのアミノ酸残基61〜83から本質的になるアミノ酸配列から選ばれる少なくとも連続した５個のアミノ酸の配列を有するポリペプチドを含む免疫原組成物に動物を曝すことを含む、特異的にＨＬＡ −Ｇと結合する抗体の作製方法であって、該ポリペプチドが配列番号１のペプチドで完全に免疫吸着されているＨＬＡ−Ｇに対して作製した抗血清とは結合しない、上記抗体の作製方法。 16．ポリペプチドが配列ＥＥＥＴＲＮＴＫＡＨＡＱＴＤＲＭＮＬＱＴＬＲＧ（配列番号１）からなる請求項15記載の方法。 17．方法が免疫原組成物に曝した動物の抗体産生細胞を永代化させ、かつ永代化細胞を単離することをさらに含む請求項15記載の方法。 18．請求項15記載の方法によって産生された抗体。 19．ｉ）配列番号１によって特定されるエピトープからなる、ＨＬＡ−Ｇのα１ドメインの部分と特異的に結合する抗体を生物学的サンプルにハイブリダイズさせる工程、およびii）該抗体と該生物学的サンプル間の特異的結合を検出する工程を有する、生物学的サンプル中のＨＬＡ−Ｇを同定する方法。 20．工程ii）が生物学的サンプル中の可溶性ＨＬＡ−Ｇの濃度を検出することを含む請求項19記載の方法。 21．工程ii）が生物学的サンプル中の不溶性ＨＬＡ−Ｇの濃度を検出することを含む請求項19記載の方法。 22．生物学的サンプルがヒトの女性の血液サンプルである請求項19記載の方法。 23．生物学的サンプルが子宮頸管膣分泌物である請求項19記載の方法。 24．ラジオイムノアッセイを用いて工程（ii）を行う請求項19記載の方法。 25．抗体が固形基礎材に連結されている請求項19記載の方法。 26．生物学的サンプルが可溶性ＨＬＡ−Ｇを含むヒトの女性の血液であり、抗体が可溶性ＨＬＡ−Ｇと特異的に結合し、かつ特異的抗体−可溶性ＨＬＡ−Ｇ複合体の形成が妊娠の診断となる請求項19記載の方法。 27．生物学的サンプルが可溶性ＨＬＡ−Ｇを含むヒトの女性の血液であり、方法が抗体とヒト女性血液中の該可溶性ＨＬＡ−Ｇとの特異的結合を定量化することをさらに含む請求項19記載の方法。 28．生物学的サンプルが可溶性ＨＬＡ−Ｇを含むヒトの女性の血液であり、方法がiii）抗体と可溶性ＨＬＡ−Ｇとの特異的結合のレベルを定量化する工程、およびiv）該特異的結合のレベルを参照集団と比較する工程をさらに有する請求項 19記載の方法。 29．配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体を含む容器を有するＨＬＡ−Ｇ検出用キット。 30．配列番号１から本質的になるポリペプチドを含む容器をさらに有する請求項 29記載のキット。 31．ＨＬＡ−Ｇを含む容器をさらに有する請求項29記載のキット。