JPH07505528A - αｖβ３インテグリンに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 αＶβ３インテグリンに対する抗体 発明の技術分野 この出願は、αＶβ３インテグリンに対するモノクローナル抗体の産生のｊこめ のハイブリッド細胞株（リンパ球／％イブリドーマ）、そのような均一な抗体、 およびそのような抗体の診断および治療目的への使用に関する。

発明の背景 αＶβ３は、細胞接着を促進する細胞表面糖タンパク質レセプターのインテグ１ ルスーパー遺伝子ファミリーの成員である。各細胞は、その接着能を定める特定 の範囲のレセプターを有している。インテグリンは、非共有結合的ζ＝全会合ｔ こαおよびβサブユニットのヘテロダイマーとして発現される。ノ１インズ（Ｈ ｙｎｅｓ。

Ｒ，Ｏ，）によって提唱された命名法によれば［Ｃｅ１１迭旦、８７５〜８８６ ’（１９８７）］、イインチグリは、それぞれ共通のβサブユニツトと該共通の βサブユニットと会合することが知られている一連の種々のαサブユニットと力 １らなるファミリーに分けることができる。異なるα鎖は、起源の細胞の種類１ こよって、最初の発見者によって用いられた下つき文字によって、まｔこ１まα Ｖβ３レセプターの場合のようにリガンドの性質によって（すなわち、α工（マ ビトロネクチンレセブターのα鎖を意味する）表示される。すべてではなし１カ （多くのインテグ１ノンレセプターは、フィブロネクチンの細胞結合ドメインの 研究力）ら最初１こ定められた［ルオスラーテイ　（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｅ 、　）およびピエールシュノくフタ−（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｔｅｒ、Ｍ、Ｄ 、）　、　Ｃｅｌ↓　４４、５１７０５１８　（１９８６）　：　ルオスラーテ ィおよびビニールツユバクター、５　ｃｉｅｎｃｅ里、４９１〜４９７（１９８ ７）］、トリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　（ま？：Ｉｄ１文字アミノ 酸コードを用いてＲＧＤ）を介してタンｌくり質と相互作用することが示されて いる。

α■β３（ビトロネクチンレセプターまたはＶ　Ｎ　Ｒとも呼１ｉれる）１マβ ３インテグリンサブフアミリーの成員であり、内皮細胞、メラノーマ細胞、平滑 筋細胞を含む種々の細胞上で発現され、他のインテグリンであるα２βｌ　（Ｖ ＬＡ−２）（コラーゲン１型およびラミニンに対するレセプター）とともに破骨 細胞の表面上で発現される［ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ、　Ｍ、　Ａ、　）および デービーズ（Ｄａｖｉｅｓ、　Ｊ、）、Ｊ　、　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ、　Ｒｅｓ、 ４．８０３〜８０８　（１９８９）：デービーズら′、ＪＣｅｌｌ、　Ｂｉｏｌ 、１０９．１８１７〜１８２６　（１９８９）；ホートン、■ｎｔ、Ｊ。

Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、ヱ↓、７４１−７５９　（１９９０）：Ｉ　、ａｖβ ３は、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、トロンポスポン ジン、オステオボンチン、骨ンアロプロテインＩＩ　（ｂｏｎｅ　５ｉａｌｏ　 ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｆ）およびフォノ・ビルプラント因子への細胞接着を媒体す る。

破骨細胞は、骨組織の吸収に関与する主要タイプの骨細胞である。吸収過程は、 発育中の破骨細胞の造血部位から骨格部分への増殖および走化性、その後の吸収 部位への成熟細胞の移動、骨基体への破骨細胞の付着、およびその結果として骨 吸収に直接関与する極性化した機能性の成熟最終細胞の生成を含む。αＶβ３は 、ＲＧＤ配列を含有する骨マトリックスタンパク質への破骨細胞の接着を媒体す る。

αＶβ３に対する抗体は、このインテグリンの生物学的役割および構造／機能相 関をその種々のリガンドを用いて研究するうえで重要な診断および治療手段とな ることが期待される。とりわけ、破骨細胞上の独特のエピトープを検出するモノ クローナル抗体は、破骨細胞の発達を理解するうえで大きな価値を有するであろ う。さらに重要なことには、破骨細胞の骨マトリックスタンパク質への結合を阻 覧するαＶβ３特異的な中和モノクローナル抗体は、過剰な骨吸収と関連する病 的状態の治療に有用な治療剤として大きな可能性を秘めている。

αＶβ３上の種々のエピトープに結合する当該技術分野で知られた幾つかのモノ クローナル抗体が存在する。破骨細胞腫（骨巨細胞腫瘍）からの破骨細胞で免疫 して、ホートンら［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４５．５６６３〜５６６９　（１９ ８５）］は正常ヒト胎児肯および種々の腫瘍性および非腫瘍性の骨病変における 破骨細胞に結合するモノクローナル抗体を分泌する１１のマウスハイブリドーマ を産生させた。これらのうちの一つで２３ＣＧと呼ばれるものは、その後、αＶ β３複合体に結合することが示され、破骨細胞の機能を破砕し得ることが示され た［ホートンら、Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ　ユ」シ互、３６８〜３７５　 （１９９１）］　、ＰＣＴ出願公開第Ｗ０８９１０５１５５号公報（１９８９年 ６月１５日公開）およびチェレジ、　（Ｃｈｅｒｅｓｈ）らのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｗ、２６２　：　１７７０３〜１７７１１　（１９８７）に開示された他の モノクローナル抗体ＬＭ６０９（ハイブリドーマＬＭ６０９　ＡＴＣＣＨＢ９５ ３７中で産生）もまたαＶβ３複合体に結合することがわかり、腫瘍細胞および 血管形成内皮細胞の表面上に存在するＥＣｒ分子のビトロネクチン、フィブリノ ーゲンおよびフォノ・ビルプラント因子への結合を阻害する能力のため、腫瘍増 殖インヒビターとして治療目的に使用することが提唱されている。モノクローナ ル抗体１３Ｃ２（ホートンら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　１９８５、上記）はα Ｖβ３のαＶ部分に結合することが示されたが、一方、幾つかの他のモノクロー ナル抗体はβ３部分を認識することが報告されている［ポスビット（Ｎｅｓｂｉ ｔｔ、　Ｓ、）ら、ビトロネクチンレセプター（ＣＤ５１）のエピトープ分析、 「白血球分類ＩＶＪ白血球分化抗原、クナップ（Ｋ　ｎａｐｐ、　Ｗ、　）ら（ ｉｌ）１９９１、ｐ、１０３７中］。当該技術分野で種々報告されている特異的 モノクローナル抗体もまた、内皮細胞および種々のメラノーマ細胞株に結合する ことが示された。

αＶβ３発現細胞のαＶβ３リガンド（ビトロネクチンおよびフィブロネクチン など）への結合を有効に阻害し得るαＶβ３インテグリンに対する高親和性モノ クローナル抗体に対する必要性が存在する。

破骨細胞および任意にαＶβ３を発現することがわかっている他の細胞に結合す るαＶβ３に対するモノクローナル抗体を提供することがさらに望ましい。

αＶβ３の対応リガンドへの結合の有効なインヒビターであり、αＶβ３を発現 することがわかっている他の細胞には結合することなく破骨細胞に特異的に結合 する、すなわち破骨細胞上の標的インテグリンに対して一層特異的であるモノク ローナル抗体を提供することが特に望ましい。

発明の要約 本発明は、αＶβ３インテグリンに対するモノクローナル抗体の産生および広範 な特徴付けに係る成功した研究に基づいている。従って、本発明は、αＶβ３上 の独特のエピトープを認識することができ、および／またはαＶβ３に対する高 親和性を示すモノクローナル抗体に関する。本発明はとりわけ、αＶβ３複合体 またはそのβ３部分上の独特のエピトープを認識するモノクローナル抗体に関す る。本発明はさらに、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンへのα・Ｖβ３発 現細胞の結合を有効に阻害するモノクローナル抗体に関する。特に重要な側面に おいて、本発明は、破骨細胞上のαＶβ３には特異的に結合するが他の細胞（た とえば、メラノーマ細胞Ｃ３２Ｒ，Ｍ−２１、ＨＡ−Ａ、ＨＡ−ＬおよびＨＴ− １４４およびヒト謄帯静脈内皮細胞）上の他のαＶβ３には結合しないモノクロ ーナル抗体に関する。

一つの観点において、本発明は、（１）αＶβ３を現細胞のフィブリノーゲンへ の結合を阻害することができ、（２）破骨細胞に結合することができ、および（ ３）１０Ｃ４，１，３，９Ｇ２．１．３および９Ｄ４．９．１よりなる群から選 ばれたモノクローナル抗体のいずれか一つによって認識されるエピトープと実質 的に同じエピトープに結合することができ、または上記３つの抗体とほぼ同じか またはそれより大きなαＶβ３に対する親和性を有する抗αＶβ３モノクローナ ル抗体に関する。

他の観点において、本発明は、そのような抗体をコードする単離核酸、およびそ のような抗体を産生ずるハイブリドーマまたは組換え細胞に関する。

別の観点において、本発明は、そのような抗体の治療目的または診断目的での使 用に関する。本発明のモノクローナル抗体は、過剰な骨吸収を特徴とする疾患ま たは病的状態を治療し、および／または腫瘍の増殖を阻止するため、単独でまた は（化学）療法剤と組み合わせて治療剤として有用である。本発明のモノクロー ナル抗体はまた、細胞上のαＶβ３の存在を決定するための診断および分析アッ セイ、細胞の分類および組織化学的組織染色に有用である。

これらおよび他の観点は、以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。

図面の簡単な記載 図１は、抗αＶβ３抗体の産生方法を示す模式図である。

図２は、この発明の抗体、２つの陽性コントロール（２３Ｃ６および１３Ｃ２） およびＴｇＧ陰性コントロールを用いたα■β３成分の免疫沈降を示す。

図３Ａ−Ｆは、モノクローナル抗体２３Ｃ６αＶβ３エピトープをこの発明の幾 つかのモノクローナル抗体のエピトープと比較したフローサイトメトリーによる 比較を示す。図３Ａは、αＶβ３形質転換細胞の蛍光標！１２３ｃ６単独による 染色を示し、図３Ｂは、非標１１２３ｃ６と競合した蛍光標１１２３ｃ６による 染色を示し、図３Ｃ，３Ｄ、３Ｅおよび３Ｆは、本発明の４種のモノクローナル 抗一体による標識２３Ｃ６と競合した染色を示す。

図４Ａ−Ｂは、αＶβ３形質転換２９３細胞がフィブリノーゲン（図４Ａ）また はビトロネクチン（図４Ｂ）に結合するのを阻害するモノクローナル抗体の能力 を示す。興味深いことに、２３０６は他のモノクローナル抗体が阻害したように フィブリノーゲンへの細胞の結合を阻害することができた。しかしながら、９Ｄ ４．９．１は、試験した他のモノクローナル抗体のいずれよりも実質的に高い親 和性を示した。下のパネルに示すように、モノクローナル抗体１０Ｃ４，１，３ および９Ｄ４．９．１のみがビトロネクチンへの細胞の結合を実質的に阻害する ことができ、この場合も、後者は試験した他のモノクローナル抗体よりも高い親 和性を示した。

図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、フィブリノーゲンおよびビトロネクチンへの可 溶性αＶβ３の結合の種々のモノクローナル抗体による阻害を示す。結果は、は ぼ図４Ａ−Ｂに示した結果と似ている。

図６Ａ−Ｂは、骨巨細胞腫瘍からのヒト破骨細胞（多核細胞）のイムノペルオキ シダーゼ組織化学染色を示す。６Ａ：モノクローナル抗体１０Ｃ４，１，３゜６ Ｂ　＋　Ｉ　ｇＧコントロール抗体。写真は３３０×の倍率で撮った。

本明細書において使用する「モノクローナル抗体」なる語は、抗体の実質的に均 一な集団をいう、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在するか もしれない天然に生じ得る変異を別として特異性および親和性が同一である。

モノクローナル抗体組成物は、１種を越えるモノクローナル抗体を含有してよい ことに注意すべきである。

本発明の範囲に包含されるモノクローナル抗体には、採取源の種や免疫グロブリ ンクラスやサブクラスの表示のいかんに拘わらずハイブリッドおよび組換え抗体 （たとえば、「ヒト化」抗体）もそれらが本明細書に記載する新規で非自明な特 徴を有する限りにおいて含まれ、好ましい態様においてはモノクローナル抗体１ ０Ｃ４，１，３，９Ｇ２．１．３または９Ｄ４．９．１によって認識されるのと 実質的に同じエピトープに結合することができ、および／または２３Ｃ６または ９Ｄ４、９．１と同じかまたはそれ以上のエピトープ親和性を有する抗体である 。

それゆえ、修飾語の「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団としての 抗体の特性を示し、抗体を特定の方法によって産生ずることを要求することを意 味しない。たとえば、本発明のモノクローナル抗体は、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ ）とミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって最初に記載されたハイブリッ ド法（Ｎａｔｕｒｅλ旦旦：４９５　（１９７５）　）を用いて製造することが できるし、または組換えＤＮＡ法によって製造することもできる。たとえば、カ ビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らの米国特許第４．８１６．５６７号またはタイプ（ Ｍａｇｅ）およびラモイ（Ｌａ＋ａｏｙｉ）のＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ ｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ、　７９〜９７頁（マーセル・デツカ−（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋ ｅｒ、　Ｉ　ｎｃ、　）、ニューヨーク、１９８７）を参照。

ハイブリッド法においては、マウスまたは他の適当な宿主動物を皮下、腹腔内ま たは筋肉内経路によりαＶβ３インテグリンで免疫し、免疫に使用したタンｌ（ り質に特異的に結合する抗体を産生ずるかまたは産生じ得るリンパ球を生成させ る。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。ついで、ポリ 合させてハイブリドーマ細胞を生成させる［ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｍ ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎ ｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　５９−１０３頁（アカデミツク・プレス、１９８６） ］。実施例に示すように、αＶβ３の細胞外ドメイン（経膜ドメインまたは細胞 質ドメインを含有しない欠けたαＶβ３）で免疫すると驚くほど多数の抗αＶβ ３抗体が得られ、そのような免疫が幾つかのモノクローナル抗体の独特の特異性 および高親和性に一部寄与するものと思われる。

加えて、リンパ節細胞（膵臓細胞または他の組織よりもむしろ）の融合パートナ −としての使用は有用であると思われた。

このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親ミエローマ細 胞の増殖または生存を抑制する１種または２種以上の物質を好ましくは含有する 適当な培地中に植えて増殖させる。たとえば、親ミエローマ細胞が酵素のヒポキ サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲ Ｔ）を欠失している場合には、ハイブリドーマのための培地は、一般にヒボキサ ンチン、アミノプテリンおよびチミジン（これら物質はＨＧＰＲＴ−欠失細胞を 増殖させない）を含有しているであろう（ＨＡＴ培地）。

好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択した抗体−産生細胞による抗 体の安定な高レベル発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるもので ある。これらのうち好ましいミエローマ細胞株は、サーク・インスティチュート ・セル・ディストリビューション・センター（Ｓａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　 Ｃｅ１ｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ）　、サンジエゴ、カリフォ ルニア、米国から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由 来するもの、およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビ ル、メリーランド、米国から入手可能な５Ｐ−２細胞、またはＰ３Ｘ６３Ａｇ８ Ｕ、１マウスミエローマ細胞スーヒトへテロミエローマ細胞株もまたヒトモノク ローナル抗体の産生のためにヨーク、１９８７）］。上述したように、これらハ イブリドーマはリンパ節融合により調製した。

ハイブリドーマ細胞を増殖させた培地を、個々の鎖または好ましくはαＶβ３複 合体に対するモノクローナル抗体の産主についてアッセイする。好ましくは、結 合特異性の決定は、免疫沈降により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や 酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＩｊＳＡ）などのインビトロ結合アッセイに より、または蛍光発色セルソーターにより行う。本発明のモノクローナル抗体は 、以下に説明するように、可溶性のまたは細胞に結合したαＶβ３に結合し中和 能を有するものである。ついで、種々の細胞タイプ上のαＶβ３への結合の特異 性を決定するが、その目的は、α■β３以外のいずれの他のインテグリンにも結 合せず、好ましくはメラノーマ腫瘍細胞、内皮細胞および破骨細胞上のαＶβ３ を識別することができる、すなわちそのような細胞タイプのいずれか一つに対し て実質的に特異的である抗体を同定することにある。実質的な特異性とは、一般 に、少なくとも細胞株Ｃ３２’Ｒ，Ｍ−２１、ＨＡ７Ａ、ＨＡ−Ｌ、ＨＴ−６３ またはＭＧ−６３のいずれかに比べて破骨細胞に対してモノクローナル抗体１０ Ｃ４，１，３によって示された識別の程度で候補の細胞タイプに対して抗体が特 異的であることを意味する。明らかにこのことは、結合する抗体の量によってま たは他の通常の測定手段によって表現される。最後に、スクリーニングを任意に 狭めて抗体１０Ｃ４，１，３，９Ｇ２．１．３または９Ｄ４．９．１によって認 識されるエピトープと実質的に同じエピトープに結合する抗体を検出する（以下 に２３Ｃ６について記載する種類の競合アッセイにより決定される、ただし、本 発明の３種のモノクローナル抗体は候補のエピトープ結合を決定するための標識 競合試薬として用いられるであろう）。「同じエピトープ」とは、たとえばαＶ β３のアラニンスキャニング変異（ａｌａｎｉｎｅ　５ｃａｎｎｅｄ　ｖａｒｉ ａｎｔｓ）を用いたエピトープマツピングによって決定されるように、上記３種 の基準抗体が結合する正確なアミノ酸または炭水化物を意味するものでないこと に注意すべきである。「同じエピトープ」は、天然の基準抗体の一つが完全な形 態でα■β３に結合することによってブロツクされるαＶβ３ドメインを意味す る。もちろん、「同じエピトープ」は、基準ＣＤＲに構造的に相互作用または結 合するαＶβ３ドメイン残基または炭水化物を含む。

本発明の好ましい態様において、モノクローナル抗体は、たとえばマンソンおよ びポラール（Ｍｕｎｓｏｎ　＆　Ｐｏ１ｌａｒｄ）のスキャソチャード分析（Ａ ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍな親和性および好ましくは９Ｄ４．９．１と同じかま たはそれより大きな親和性を有するであろう。

本明細書において使用する「中和抗体」とは、αＶβ３の生物学的活性を実質的 に阻害または除去することのできるモノクローナル抗体をいう。一般に中和抗体 は、モノクローナル抗体２３Ｃ６と同じかまたはそれより大きな程度で、および 好ましくはモノクローナル９Ｄ４．９．１．１０Ｃ４，１，３または９Ｇ２．１ ．３と同じかまたはそれより大きな程度でビトロネクチンやフィブリノーゲンな どの細胞マトリックスリガンドへのαＶβ３の結合を阻害するであろう。

所望の特異性および親和性を有する中和抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞が同 定されたら、これらクローンを一般に限界希釈法によってサブクローニングし、 標準法により増殖させる。ゴーディング、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ ｄｉｅｓ　：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　５９〜１０ ４頁（アカデミツク・プレス、１９８６）、この目的に適した培地としては、た とえば、ダルベツコの変性イーグル培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げら れる。加えて、ハイブリドーマ細胞は動物中で腹水腫瘍としてインビボで増殖さ せることもできる。

これらサブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、たとえば、プロ ティンＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電 気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブ リン精製法により培地、腹水または血清から適当に分離する。

本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、通常の方法（たとえば、マ ウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできる オリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）を用いて容易に単離およびノ ークエンシングすることができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのような りＮＡの好ましい採取源として用いることができる。単離されたら、ＤＮＡを発 現ベクターまたはクローニングベクター中にライゲートし、ついでこれをノミア ンＣＯ８細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の仕方で は免疫グロブリンタンパク質を産生じないミエローマ細胞中にトランスフエクノ ヨンする。これら形質転換細胞を培養して組換え宿主細胞培地中でモノクローナ ル抗体を合成する。

ＤＮＡは、その発現によって産生される免疫グロブリンの特性を変化させるため に任意に修飾させる。免疫グロブリンの変異体はよく知られている。たとえば、 キメラ抗体は、相同なマウス配列の代わりにヒトＨ鎖およびＬ鎖定常ドメインの コード配列で置換することにより製造する（カビリーら、前掲書、またはモリソ ン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、旦 ニー：　６８５１　（１９８４））。

加えて、選択するＦｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＴｇＧ−１、−２ 、−３または−４、またはＩｇＭのいずれからのものであってもよい。Ｆｃドメ インは、補体結合などのエフェクター機能を任意に有していてよい。

ヒト化形態のマウス抗体は、ヒト枠組み構造ドメイン中にマウス抗体の相補性決 定領域を置換することにより製造する（たとえば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２ ６５３号（１９９２年１２月２３日公開）参照）。幾つかの態様において、選択 したマウス枠組み構造残基もまたヒト免疫グロブリン中に置換される。

本発明の免疫グロブリンと細胞毒性残基との融合物は、たとえば、免疫グロブリ ンコード配列に細胞毒性非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部また は一部をライゲートすることにより製造される。そのような非免疫グロブリンポ リペプチドとしては、リシン、ジフテリアトキシンまたは７ユードモナス外毒素 などのポリペプチド毒素が挙げられる。

また、結合体はインビトロ法によって製造することができる。たとえば、イムノ トキシンは、ジスルフィド交換反応を用い、または免疫グロブリンと毒素ポリペ プチドとの間にチオエーテル結合を生成させることにより構築することができる 。この目的のための適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル− ４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。加えて、他の融合物を同様の組 換え法により容易に製造することができる。本発明の免疫グロブリンのための適 当な融合パートナ−としては、ウィルス配列、Ｔ細胞レセプターなどの細胞レセ プター、ＴＮＦ、インターフェロンもしくはインターロイキンなどのサイトカイ ン、および他の生物学的または免疫学的に活性なポリペプチドが挙げられる。

一般に、そのような非免疫グロブリン性の融合ポリペプチドは、本発明の抗体の 定常ドメインと置換する。別法として、本発明の抗体の一方の抗原結合部位の可 変ドメインと置換する。

αＶβ３以外の抗原に対して特異性を有する抗体のＦｒまたはＣＤＲを置換する と、αＶβ３に対する特異性を有する一方の抗原結合部位と、異なる抗原に対す る特異性を有する他方の抗原結合部位とからなるキメラ２価抗体が作製されるで あろう。そのような態様では、Ｌ鎮を欠失させ、Ｈ鎖のＦｖを所望のポリペプチ ドと置換する。これら抗体は、使用したＦｃドメインが有する免疫グロブリン「 アーム」の数に依存して２価または多価であると呼ばれる（ＩｇＭは多価であろ う）。上記非免疫グロブリンは別として、抗体はまた、１を越える特異性を有す る抗体の組換えによっても多価とすることができる。たとえば、ある態様におけ る抗体は、本明細書に記載するαＶβ３に結合することができるとともに、ＣＤ ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ１１ｃなど のＴ細胞決定基にも結合することができる。これら他の抗体はよく知られている 。冬物異的（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）で多価な抗体は、両抗体のＨ鎖およ びＬ鎮をコードするＤＮＡで細胞を共形質転換することにより製造され、発現さ れた抗体の一部はイムノアフィニティークロマトグラフィーなどによって回収さ れた所望の構造を有する。別法として、そのような抗体は複数の１側坑体を通常 の仕方でインビトロで組換えることにより製造される。

１側坑体もまた、それ自体通常の技術によって製造される。Ｌ鎖と修飾Ｈ１との 組換え発現が適している。Ｈ鎖の架橋を防ぐため、一般にＦｃ領域中のいずれの 部位においてもＨｆ１ｍ１を切り出すことができる。別法として、架橋を防ぐた めに関連するシスティンを他の残基で１換するかまたは欠失させる。１側坑体を 製造するためにインビトロ法を用いることもできる、たとえば、完全な抗体を酵 素開裂することによりＦａｂ断片が調製される。

診断的応用のためには、本発明の抗体は一般に検出可能な残基で標識されるであ ろう。検出可能な残基は、直接かまたは間接に検出可能なシグナルを生成し得る ものであればいかなるものであってもよい。たとえば、検出可能な残基はｓＨ。

＋４ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５１などの放射性同位元素、フルオレセイン イソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリンなどの蛍光または化学ルミ ネッセンス化合物；たとえば、＋２５！、３２ｐ％＋４（：、テクネチウムまた は３Ｈなどの放射性同位元素標識、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトンダ ーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であってよい。

抗体を検出可能な残基に別々に結合させるため、）＼ンター（Ｈｕｎｔｅｒ）ら 、２１９（１９８１）；およびナイグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）　、Ｊ　、　Ｈｉｓ ｔｏｃｈｅｍ、　ａｎｄＣｙｔｏｃｈｅｍ、３０　；　４０７　（１９８２）に 記載された方法を含む当該技術分野で公知のいずれの方法をも用いることができ る。

本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サントイ・ソチア・ソセイ 、および免疫沈降アッセイなどのいずれの公知のア・ソセイ法においても用ＬＸ ることができる。シラ（Ｚｏｌａ）　、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　＋　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、。

１４７〜１５８頁（ＣＲＣブレス、１９８７）。

競合結合アッセイは、限られた量の抗体への結合に対して標識標準（α■β３ま たはその免疫学的反応領域であってよい）が被験試料分析対象物と競合する能力 に依存する。被験試料中のαＶβ３の量は、抗体に結合した標準の量１こ反比例 する。結合した標準の量の決定を容易にするため、抗体に結合しｔこ標準および 分析対象物を結合しないで残った標準および分析対象物から都合よく分離できる よう、競合の前または競合後に抗体を一般に不溶化させる。

サンドイッチアッセイは、それぞれ検出すべきタンｌ＜り質の異なる免疫原部分 すなわちエピトープと結合することのできる２種の抗体を使用する。サントイ・ ソチアソセイにおいては、被験試料分析対象物は固相支持体上に固定化された第 一の抗体に結合し、その後、第二の抗体が該分析対象物に結合して不溶性の３部 分複合体を形成する。デーピッド（Ｄａｖｉｄ）およびグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ ）　、米国特許第４，３７６．１１０号。第二の抗体はそれ自体検出可能な残基 で標識されてＬｌてもよいしく［接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な 残基で標識しｔこ抗免疫グロブＩル抗体を用いて測定することもできる（間接サ ンドイノチア・ソセイ）。

たとえば、サンドイッチアッセイの一つのタイプはＥＬＩ　ＳＡアッセイであり 、この場合、検出可能な残基は酵素である。

本発明の抗体はまたインビボ造影にも有用であり、放射性オバック試薬（ｒａｄ ｉ−ｏｐａｑｕｅ　ａｇｅｎｔ）または放射性同位元素などの検出可能な残基で 標識した抗体を宿主に好ましくは血流中に投与し、該標識抗体の宿主中での存在 および位置をアッセイする。この造影法は、腫瘍形成または骨の異常の病期の決 定および治療に有用である。抗体は、核磁気共鳴、放射線学または当該技術分野 で公知の他の検出手段によろうと、宿主中で検出可能ないかなる残基で標識して もよい。

本発明の中和抗体は、所望でない骨吸収や腫瘍細胞の増殖または転移を予防また は治療するため治療学的応用において特に有用である。明らかに、１０Ｃ４゜１ ３タイプのモノクローナル抗体は以下の表２に記載したのと同じタイプの腫瘍の 治療またはインビボ造影のために有用ではない。というのは、これらモノクロー ナル抗体はそのような細胞上に認められるαＶβ３に結合しないからである。

その代わり、これらモノクローナル抗体は、骨の吸収または分解の病的状態、た とえば骨粗鬆症において認められるものやある種の腫瘍によるＰＴＨｒ濾過剰発 現の結果として認められるものの治療に特に有用である。

治療学的応用のため、本発明の抗体を哺乳動物、好ましくはヒトに薬理学的に許 容し得る剤型にて投与する。本発明の抗体は、巨丸として静脈内に、または長期 にわたる連続注入により、または筋肉内、皮下、関節内、滑液のう内、鞘内、経 口、局所または吸入経路により投与する。抗体が適当な作用を有している場合に は、全身的治療効果とともに局所効果を得るために、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内 または病変周囲経路により適当に投与することもできる。

そのような剤型には、もともと非毒性で治療用でない薬理学的に許容し得る担体 が含まれる。そのような担体の例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリ ン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク賀、リン 酸またはグリシジなどの緩衝液、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性 脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または硫酸プロタミンなどの電解質、 塩化ナトリウム、金属塩、コロイド状ンリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニ ルビロリドン、セルロース性ポリマー、およびポリエチレングリコールが挙げら れる。抗体の局所剤型またはゲルペース剤型のための担体としては、カルボキシ メチルセルロースナトリウムやメチルセルロースなどの多糖類、ポリビ；ルビロ リドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレンーポリオキシブロピレンーブロ ックポリマー、ポリエチレングリコール、および木ロウアルコールが挙げられる 。

通常のデボ剤型には、たとえば、マイクロカプセル、ナノ−カプセル、リポソー ム、プラスター、舌下錠剤、およびポリラクチド：ポリグリコライドコポリマー などのポリマーマトリックスが含まれる。凍結乾燥させるのではな（水溶液の剤 型として存在する場合には、抗体は一般に約０．’１ｍｇ／ｍ］から１００ｍｇ ／ｍ１の濃度で調合するが、これら範囲から大きくはずれることも許容される。

疾患の予防または治療のため、抗体の適当な投与量は、上記のように処置しよう とする疾患の種類、該疾患の重篤度および経過（抗体が予防目的または治療目的 で投与されるかにかかわらず）、以前行った治療の経過、患者の病歴および該抗 体に対する応答、および担当医の裁量に依存するであろう。抗体は一度または一 連の処置にわたって患者に適当に投与する。

疾患の種類および重篤度に応じて、たとえば１回または２回以上の分割投与によ るかまたは連続的な注入によるかにかかわらず、約０．０１５〜１５ｍｇ抗体／ Ｋｇ患者体重が、患者に投与するための投与量の最初の候補として挙げられる。

数日もしくはそれより長期にわたって投与を繰り返す場合、病的状態に応じて疾 患の兆候の所望の抑制が生じるまで処置を繰り返す。しかしながら、他の投与計 画も有用であり、本発明の範囲から逸脱するものではない。

本発明の他の態様によれば、主要な抗体とは異なるエピトープに対する他の抗体 、または意図する治療適応症、たとえば骨粗セ症などの過剰の骨吸収に付随する 病的状態の予防または治療または腫瘍細胞の増殖または転移の阻害のための公知 の１種または２種以上の通常の治療剤などのような、同じ臨床目的のために有効 な他の薬剤と連続的にまたは組み合わせて該抗体を投与することにより、疾壱を 予防または治療するうえでの抗体の有効性は改善することができる。

本発明の抗体はまた、アフィニティー精製剤としても有用である。この手順にお いて、αＶβ３に対する抗体を当該技術分野で公知の方法を用いてセファデック ス樹脂や濾紙などの適当な支持体上に固定化する。ついで、固定化抗体を精製す べきαＶβ３を含有する試料と接触させ、その後、支持体を適当な溶媒で洗浄し て固定化抗体に結合したαＶβ３以外は試料中の実質的にすべての物質を除去す る。最後に、支持体をグリシン緩衝液（ｐＨ５，０）などの他の適当な溶媒で洗 浄して抗体からαＶβ３を放出させる。

以下に提供する実施例は説明のためであって、本発明を限定することを意図する ものでは決してない。

αＶβ３インテグリンに特異的なモノクローナル抗体を産生させるため、αＶβ ３複合体を発現する２９３−１５Ｄ細胞株（αＶまたはβ３を発現するＰＭＮＣ ■ベクターから調製したＤＮＡとネオマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡで ２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）をトランスフェクションすることにより 生成）から精製したαＶβ３インテグリンでＢａ１ｂ／ｃマウスを免疫した。

αＶβ３の精製は、レンチル（ｌｅｎｔｉｌ）レクチンカラムを用いることによ り２９３−１５Ｄ細胞のＮＰ−４０細胞溶解液から行った。ついで、調製したα Ｖβ３の純度を等電点電気泳動により確認した。マウスをＭＰＬ／ＴＤＭアジュ バント（リビ・イムノケム・リサーチ（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅａ、　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）　、ハミルトン、モンタナ州）中に乳濁したαＶβ ３（５μｇ）で１回、ついでＭＰＬ／ＴＤＭアジュバント中に浸した（ｉ止ｅｒ ｓｉｆｉｅｄ）　ａ　ｖβ３　（５ｍｇ）で２週間の間隔で６回、足祉中に免疫 した。最後の免疫から３日後、記載に従い（ヤームッシュ（Ｙａｒｍｕｓｈ）ら 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ヱユ：　２８９９．１９８０ ）、これらマウスからのリンパ節細胞を３５％ポリエチレングリコールを用いて Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ、１ミエローマ細胞（イニルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、Ｃｕ ｒｒ、　ＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、８１　：　１．１９７ ８）と融合させた。以後の手順は図１に示しである。ＥＬＴＳＡによる可溶性α Ｖβ３への結合能およびＦＡＣ３ＣＡＮ（ベクトンーディッキンソン・ＦＡＣ３ ・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ　ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦ　Ａ　ＣＳ　ｓｙｓｔｅｍ ｓ）　、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を用いた流動微小蛍光測定分析 による種々のインテグリンを発現する細胞株への結合能により、抗αＶβ３抗体 産生についてハイブリドーマ細胞株を選択した。これら陽性モノクローナル抗体 のイソタイプ（表１）の決定を、イソタイプ特異的なアルカリホスファターゼ結 合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（バーロウ（Ｈａｒｌｏｔ）およびレイン（Ｌａ ｎｅ）　、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、５９７頁、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１１９８８）を用いた ＥＬＩＳＡにより行った。

９Ｄ４．９．１　１ｇＧ１、Ｋ　−＋　β３９Ｇ２．１．３　１ｇＧ２ａ、Ｋ　 −＋　ａｖβ３１０Ｃ４，１，３ＩｇＧ１、Ｋ　−＋　αｖβ３陽性ハイブリド ーマ細胞株を限界希釈法により２回サブクローニングした。

Ｂ　モノクローナル抗体によるαＶβ３複合体の免疫沈降１０％ＦＣ３を含有す るＦ１２／ＤＭＥＭ培地で増殖させた２９３−１５Ｄトランスフ工クンヨン体を ＥＤＴＡ処理することにより回収し、ＮＨ３−ＬＣ−ビオチンを用いてビオチン 化した。細胞（５Ｘ１０’細胞／ｍ１）をＮＩＨ−ＬＳ−ビオチン（１μｇ／ｍ ｌ）とともに室温にて１時間インキュベートした。ついで、０．５Ｍ　ＮａＣ］ 　ｍ　１ｍｍ、ＣａＣ１，および１　ｍＮ　Ｍｇ　Ｃｌ　ｔを含有する０、０５ ｍＭトリス緩衝液（細胞洗浄緩衝液）中で洗浄することにより未結合のビオチン を除去した。細胞を１％ＮＰ−４０で処理して溶解し、１０分間ミクロ遠心分離 して細胞破砕物を除去した。この上澄み液を免疫沈降に用いた。

０．５ＭＮａＣ］および０．１％ツイーン−２０を含有する０、０５Ｍ）リス緩 衝液（ＩＰ洗浄緩衝液）中のプロティン−Ｇ（５０μｌ）をモノクローナル抗体 （１００μｌ：１００μｇ／ｍｌ）とともに室温にて３０分間インキュベートし た。

ＩＰ洗浄緩衝液中で２回洗浄した後、プロティン−Ｇ上の非特異的結合部位を１ ％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックし、２回洗浄し、ビオチン化膜タンノ（り質 を含有する上澄み液とともに室温にて１時間インキュベートした。複合体を６回 洗浄し、２−ＭＥを含有するＳＤＳ　ＰＡＧＥ−試料緩衝液中で沸騰させること により還元し、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分 析した。図２はその結果を示す。

１０％ＦＣ３，グルタミンおよび抗生物質を含有するＦ１２／ＤＭＥＭ培地（１ ：　１　ｏ１０重合物）中で増殖させたトランスフェクションした細胞および腫 瘍細胞を１．ＯＯＯｒｐｍにて５分間遠心分離することによりセルソーター緩衝 液（Ｃ３Ｂ、１％ＦＣ３および領０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）中で３回洗 浄し、Ｃ３Ｂ中に４Ｘ１０’細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。細胞（２５μ ｍ）を９６ウエルＵ−底プレート中に加え、抗体（１００μｍ）とともに氷上で ３０分間インキュベートした。インキュベーションの終了時、細胞をＣ３Ｂ中で ２回洗浄し、細胞をＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体とともに氷上で３０分間 インキュベートすることにより、細胞に結合したモノクローナル抗体を検出した 。細胞をＣ８Ｂ中で２回洗浄し、ＣＢＳ　（０，５ｍｌ’）中に再懸濁し、記載 に従い（ローケン（Ｌｏｋｅｎ）ら、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、２５ ４　：１６３−；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、Ｒｅｖ、　Ｓｃｉ、　Ｉｎｓｔｒ Ｕｍ、　４９　：１１３７　９．１９８７）、流動微小蛍光測定により分析した 。その結果を表２に示す。

表２は、可溶性インテグリンタンパク質を用いたＥＬＩ　ＳＡによると同様に異 なるインテグリンを発現するトランスフェクションした細胞のＦＡＣＳ分析によ る、これらモノクローナル抗体により認識されるαＶβ３の部分の決定を示す。

モノクローナル抗体９Ｇ２．１．３はαＶβ３を発現する２９３−１５Ｄに強く 結合し、ｌ１ｂ−１１１ａを発現する２９３−ＣＬＢには非常に弱Ｘ結合したが 、αＶβ３を発現する２９３−５２Ｂには結合しなかった。モノクローナル抗体 １０Ｃ４，１，３は２９３−１５Ｄのみに結合し他には結合しなかった。それゆ え、これら２つのモノクローナル抗体（９Ｇ２．１．３および１０Ｃ４，１，３ ）はαＶβ３を認識すると結論された。対照的に、モノクローナル抗体９Ｄ４． ９．１は２９３−１５Ｄおよび２９３−ＣＬＢ（７）両方１１ｍ強＜Ｍ合したが ２９３−５２Ｂｌ：は結合しなかった。それゆえ、モノクローナル抗体９Ｄ４． ９．１はαＶβ３のβ３部分に結合すると結論された。

表２はまた、モノクローナル抗体９Ｃ９，１１，１１が破骨細胞、ヒト内皮細胞 および種々のメラノーマ細胞に結合することを示している。この染色パターンは ２３０６の染色パターンに似ている。対照的に、モノクローナル抗体１０Ｃ４１ ，３は破骨細胞のみを認識し、驚くべき非常に狭い特異性を示唆している。ヒト メラノーマ腫瘍細胞、神経膠腫細胞および正常内皮細胞に対するモノクローナル 抗体９Ｄ４．９．１および９Ｇ２．１．３の染色パターンは、モノクローナル抗 体２３０６の染色パターンと似ている。これらモノクローナル抗体は種々のヒト ミエローマ細胞を認識し、破骨細胞を強く認識し、ヒト破骨細＃８！腫ＭＧ−６ ３細胞およびヒト内皮細胞を弱く認識した。対照的に、モノクローナル抗体１０ ｃ４゜１．３は、ヒト破骨細胞に対する強い結合およびヒトミエローマ細胞の一 つであるＭ−２１に対する弱い結合を示したが、他の細胞に対する結合は示さな かった。

これら結果は、１０Ｃ４，１，３がヒト破骨細胞に独特のエピトープを認識する ことを示唆している。

αＶβ３トランスフェクションした２９３−１５Ｄ細胞（Ｉ　Ｘ　１０’細胞／ １００μｌ）を第一精製モノクローナル抗体（１００μｌ）とともに氷上で３０ 分間インキュベートし、２回洗浄し、第二モノクローナル抗体であるＦＩＴＣ結 合モノクローナル抗体２３０６とともに３０分間インキュベートした。不ンキュ ベーノヨンの終了時、細胞をＣＳＢ中で２回洗浄し、ＣＢＳ　（０，５ｍ１）中 に再懸濁し、２９３−１５Ｄ細胞上へのＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体２３０ ６の結合レベルを流動微小蛍光測定（ＦＡＣＳＣＡＮ）により調べた。その結果 を図３に示す。パネルは以下の通りである：（３Ａ）　なし　＋　ＦＬ−２３Ｃ ６ （随影の部分は非染魚細胞を示す） （３Ｂ）　２３Ｃ６＋　ＦＬ−２３Ｃ６（３Ｃ）　９Ｄ４．９．１　＋　ＦＬ− ２３Ｃ６（３Ｄ）　９Ｇ２．１．３　＋　ＦＬ−２３Ｃ６（３Ｅ）　１０Ｃ４， １，３＋　ＦＬ−２３Ｃ６（３Ｆ）　ＩｇＧ　＋　ＦＬ−２３Ｃ６αＶβ３のα −Ｍ（ＣＤ５１と呼ばれる）またはビトロネクチンレセプターのβ−Ｍ（ＣＤ６ １）を認識する幾つかのモノクローナル抗体が記載されている（ポスビット（Ｎ ｅｓｂｉｔｔ）ら、１９９１、”　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｔｙｐｉｎｇ　Ｔ　Ｖ 、１０３７頁）。

さらに最近の研究（ホートン、Ｉ　ｎｔ、　Ｊ　、　Ｅ　ｘｐ、　Ｐ　ａｔｈｏ ｌ、、７１ニア４１　［１９９０］）は、ＣＤ５１のβエピトープを認識するモ ノクローナル抗体として分類されたモノクローナル抗体２３Ｃ６およびＬＭ６０ ９が完全なαＶβ３複合体を認識するかもしれないことを示した。それゆえ、α Ｖβ３複合体に結合するモノクローナル抗体が２３０６とは異なるエピトープを 認識することを確しするため、１００倍高レベルの非標識モノクローナル抗体の 存在下での２９３−１５Ｄのフルオレセイン処理２３０６による染色を調べ、Ｆ ＡＣＳＣＡＮにより分析した。

図３に示す結果は、モノクローナル抗体９Ｄ４．９．１および１０Ｃ４，１，３ はフルオレセイン処理２３０６の１５ＤＩ！！胞への結合に対して全く干渉しな いことを示した。同じ実験において、同量の非標識２３Ｃ６はＦ−２３Ｃ６の結 合を完全に阻害したが、関連のないコントールのモノクローナル抗体は何ら影響 を及ぼさなかった。それゆえ、少なくともこれら２つのモノクローナル抗体は２ ３ｃ６によって認識されるエピトープとは異なるエピトープを確かに認識するこ とが確認された。対照的に、モノクローナル抗体９Ｇ２．１．３は、高濃度にて Ｆ−２３Ｃ６結合に若干の阻害効果を示したが、Ｆ−２３Ｃ６結合を完全に阻害 することはできなかった。それゆえ、モノクローナル抗体９Ｇ２．１．３はＦ− ２３Ｃ６によって認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識するが、こ れらエピトープは指向が近接していると思われる。ＬＭ６０９（チェレシュら、 Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、２６２　：１７７０３〜１７７１１　［１ ９８７］　）は２３ｃ６と同じエピトープを認識することが報告されているので 、本発明者らのモノクローナル抗体はモノクローナル抗体ＬＭ６０９によって認 識されるエピトープとは異なるエピトープを認識すると結論される。

実施例４ リガンド（フィブリノーゲンおよびビトロネクチン）への２９３−１５Ｄ細胞の 結合に対するモノクローナル抗体による阻害マイクロプレート（ヌンク、プレイ カバードＣ８マクンソープ（Ｂ　ｒｅａｋａｐａｒｔＣ８Ｍａｘｉ　５ｏｒｐ） 　）をフィブリノーゲンまたはビトロネクチン（１００μｍ／ウェル、１０μｇ ／ｍ＋）で４℃にて一夜コーティングした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、プレー トをＰＢＳ中の１％ＢＳＡで１時間ブロックし、ついで種々の濃度のモノクロー ナル抗体とともに３０分間インキュベートし、ついで″’Ｃｒ標識した２９３− １５Ｄ細胞（１００ｍｌ）を加えた。プレートを６０Ｏｒｐｍにて２分間遠心分 離し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーションの終了時にプ レートを３回洗浄し、リガンドに結合したＭｌｃ、１識２９３−１５Ｄ細胞をガ ンマカウンターでカウントした。αＶβ３を発現する”Ｃｒ１１１１３ｍ２９３ −１５Ｄ）ランスフェクション体の調製は以下のようにして行った。】０％ＦＣ ３，０，１％グルコースおよび２ｍＭグルタミンを含有するＦ　１２／ＤＭＥλ τ中で細胞を４０時間ｆ％１Ｍさせ、ＰＢＳ中の１０ｍＭ　ＥＤＴＡで２分間処 理することによって回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、Ｆｅ２を含有しない培地中 に５ＸＩＯ’細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。ついで、２９３−１５Ｄ細胞 （０，５ｍ１）を２５０ｍＣ４”Ｃｒとともに３７℃にて１時間インキュベート した。インキュベーション終了時にＦ１２／ＤＭＥＭ培地中で３回洗浄すること によって過剰の未結合５１Ｃｒを除き、Ｆｅ２を含有しない培地中に６×・１０ ５細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。図４Ａ−Ｂはその結果を示す。

図４の上のパネルは、種々の濃度のモノクローナル抗体の存在下でフィブリノー ゲンコーティングしたウェルへの”Ｃｒ−２９３１５Ｄの結合を示す。３つのす べてのモノクローナル抗体が、フィブリノーゲンへの”Ｃｒ−２９３１５Ｄの結 合を非常に有効に阻害した。最も強い阻害はモノクローナル抗体９Ｄ４９．１の 場合に示された。下のパネルは、ビトロネクチンをコーティングしたウェルへの ”Ｃｒ−２９３１５Ｄの結合を示す。試験した条件下で、９Ｄ４９１および１０ Ｃ４，１，３はこの相互反応を阻害することができたが、９Ｇ２．１゜３および ２３Ｃ６はもしあったとしても非常に弱い阻害を示した。一般に、αＶβ３トラ ンスフェクションした細胞とビトロネクチンとの相互反応を阻害することは、α Ｖβ３トランスフェクションした細胞とフィブリノーゲンとの相互反応を阻害す ることに比べて一層困難であった。

マイクロタイタープレートを精製フィブリノーゲンまたはビトロネクチン（１０ ０μｍ／ウェル、１０μｇ／ｍ］）で４℃にて一層コーティングした。ＰＢＳ中 で３回洗浄した後、プレートを１％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。ＰＢ Ｓ中でプレートを洗浄した後、種々の濃度のモノクローナル抗体とともに氷上で ３０分間ブレインキュベートした”Ｃｒ−２９３−１５Ｄ細胞をリガンドをコー ティングしたプレートに移した。ついで、プレートを６０Ｏｒｐｍにて２分間遠 心分離し、３７℃にて９０分間インキュベートした。インキュベーションの終了 時、プレートをＰＢＳ中で３回洗浄し、リガンドに結合したｓ＋Ｃｒ標識２９３ −１５Ｄ細胞をガンマカウンターによりカウントした。得られた結果（実施例４ に示す結果と似ている）を図５ａおよび５ｂに示す。

実施例７ ヒト破骨細胞腫瘍およびヒト胎児四肢骨（妊娠１４週）、新生ウサギおよびラッ トの骨、ニワトリ胚の骨および成体アカシカの枝角からの骨インプリント（ｉｍ ｐｒｉｎｔｓ）の凍結切片、およびヒト成人由来の以下の組織（肝臓、腎臓、膵 臓、直腸、腸骨、心臓、肺、胸腺、扁桃、膵臓、詫盤、皮膚、子宮頚、澗帯、乳 癌、悪性黒色腫、末梢血および骨髄単核細胞の塗抹標本）からの凍結切片を紀要 に従って調製した［ホートンら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、旦、５６６３〜５６６ ９　（１９８５）］。

これらを空気乾燥し、アセトン中に室温にて１０分間固定し、使用時まで一２０ ℃にて貯蔵した。スライドを室温とし、ＰＢＳ中で再び水和させ、ついで精製モ ノクローナル抗体（１μｇ）を含有する１％ＦＣ３／ＰＢＳ　（１５０μｍ）と ともに１時間インキュベートした。１％ＦＣ３／ＰＢＳ中で洗浄した後、スライ ドをビオチン化抗マウスＩｇと、ついでアビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオ キシダーゼ複合体とともに順番に製造業者の推奨する希釈にて（ベクター・ラブ （Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂ）　、バーリンゲーム、カリフォルニア州）】時間イン キュベートした。さらに洗浄した後、結合したペルオキシダーゼをｐＢＳ中に０ ．０７％Ｈ２Ｏ２を含有するジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（オー ガノン・テクニナ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｎａ　Ｃｏｒｐ、）　、ダーハ ム、ノースカロライナ州）（０，１ｍｇ／ｍｌ）中で発色させ、０．５％メチル グリーンで５分間対比染色した。ついで、スライドを等級アルコール中で脱水し 、ついでキシレン中で清澄化させ、顕微鏡観察のため積載台（ｐｅｒｍｏｕｎｔ ａｎｔ）上に積載した（フィッシャー・サイエンティフィー／り（Ｆｉｓｈｅｒ 　５ｃｉｅｎｔｊｆｉｅ　Ｃｏ、）　、サンフランシスコ、カリフォルニア州） 。

図６は、モノクローナル抗体１０Ｃ４，１，３を用いたヒト骨インプリントから の多核破骨細胞および前回細胞腫瘍の凍結切片の明瞭な膜集合を示す。コントロ ールのモノクローナル抗体は染色を示さなかった。モノクローナル抗体９Ｄ４゜ ９．１および９Ｇ２．１．３はモノクローナル抗体１０Ｃ４，１，３と類似の染 色パターンを示した。いずれのモノクローナル抗体も、従来のホルマリン−固定 およびパラフィン−包埋組織切片において破骨細胞ビトロネクチンレセプターを 認識しなかった。

本発明者らは、ヒトと対比してラット、ウサギ、ニワトリおよびシカ由来の骨イ ンプリント中に存在する破骨細胞へのこれらモノクローナル抗体の結合を調べた 。

骨インプリントをモノクローナル抗体、ついでＦ−ヤギ抗マウスＴｇＧを用いて 染色した。蛍光染色のレベルを蛍光顕微鏡を用いて調べ、弱い（＋）、中位（＋ ＋）および強い（＋＋千）または不在（−）として等級分けした。

表３ 種々の種からの破骨細胞へのモノクローナル抗体の結合の決定ヒト　＋＋十＋＋ ＋　＋＋＋　＋＋＋ ＋＋クローナル抗体９Ｇ２．１．３は、ヒトに加えてウサギ、ニワトリ、シカか らの破骨細胞を認識する。この分布は２３Ｃ６の場合に認められる分布と似てい る（ホートンら、前掲書）。対照的にモノクローナル抗体９Ｄ４．９．１および １０Ｃ４，１，３はヒト破骨細胞のみを認識した。現在まで、いかなるαＶβ３ 複合体特異的モノクローナル抗体もそのような種特異性を示していない。

上記３つのモノクローナル抗体によって認識される抗原の分布を、上記正常成体 および胎児起源の凍結切片上の免疫組織化学により分析した（データは示してい ない）。モノクローナル抗体９Ｄ４．９．１は、試験したすべての組織において 血小板（および骨髄中の巨核球）を強く染色した。加えて、すべての組織におい て血管内皮が種々、弱く染色された。モノクローナル抗体９Ｇ２．１．３もまた 血管内皮を染色したが、血小板および巨核球とは反応しなかった。両抗体とも、 腎臓（糸球体、細管）、肝シヌソイド、直腸および回腸平滑筋、胎盤（栄養膜細 胞層および合胞体層）および悪性黒色腫における腫瘍性メラノサイトを染色した 。

対照的に、モノクローナル抗体１０Ｃ４，１，３はモノクローナル抗体９Ｇ２． １゜３によって認識された組織において染色しないかまたははるかに弱い反応を 示した。たとえば、モノクローナル抗体１０Ｃ４，１，３は消化管の平滑筋また は胎盤を染色しなかった。

ヒト黒色腫細胞、骨肉腫細胞および正常ヒ）ＩＩ帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ） を含む種々の細胞株へのこれらモノクローナル抗体の結合を流動微小蛍光測定に よって調べることにより、これらモノクローナル抗体により認識される抗原特異 性をさらに検討した。モノクローナル抗体９Ｄ４．９．１および９Ｇ２．１．３ は種々のヒト黒色腫細胞に強（結合し、ＭＧ−６３ヒト骨肉腫細胞およびＨＵＶ ＥＣには一層弱く結合した。対照的に、モノクローナル抗体１０Ｃ４，１，３は ヒト黒色腫細胞株のうちの一つであるＭ−２１にのみ弱く結合した。これらの結 果から、１０Ｃ４，１，３が新規な抗原エピトープを認識することがさらに確認 される。

以下の抗体産生ハイブリドーマをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン、１２３０１パークレインドライブ、ロックビル、米国（ＡＴＣＣ）に寄託し １０Ｃ４，１，３ＨＢ１１０２９　１９９２年４月２９日９Ｇ２．１．３　ＨＢ １１０３０　１９９２年４月２９日９Ｄ４．９．Ｉ　ＨＢ１１０３１　１９９２ 年４月２９日これら寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関する ブダペスト条約の条項およびその規則下に行った（ブダペスト条約）。このこと は、生存微生物株の維持を、寄託の日から３０年間または特許の実施できる期間 または最後の請求後の５年間または特許の有効期間のうちいずれか長い期間保征 する。該微生物は、ブダペスト条約の約定下に、ならびにジエネンテクとＡＴＣ Ｃとの間の契約（当該米国特許の発行または米国または外国特許出願の公開のう ちいずいれか早いときから該寄託微生物株の継代物の永久的かつ非制限的な入手 可能性を保証し、３５ＵＳ（Ｊ１２２およびそれに従う特許商標長官の規則に従 って米国特許商標長官によって決定された権利を有する者に該継代物の入手可能 性を保証する）に基づいて、ＡＴＣＣより入手可能である。

本出願の譲り受け人は、寄託されている微生物株が適当な条件下で培養されてい るときに死亡もしくは紛失もしくは破壊された場合には、通知によって同じ微生 物株の生存株で速やかに取り替えることに同意した。寄託した株の入手可能性は 、その特許法に従って政府の権限下に付与された権利を侵害するような該特許の 実施を許諾するものとして解釈されるべきではない。

ヨーロッパ特許がめられている指定国に関しては、寄託微生物の試料は、ヨーロ ッパ特許の登録の公告の発行までまたは該出願が拒絶されもしくは取り下げられ もしくは取り下げられたとみなされるまでは、該試料を請求する者によって指名 された専門家へのそのような試料の供給によってのみ入手可能とされるであろう （ＲＰＣ規則２８（４））。

ＦＩＧ、　に ＦＩＧ、４Ａ　抗体源Ｉ！　（７７ｇ／ｍ　Ｉ　）０．１　１　１０　１００　 １０００ ＦＩＧ・４Ｂ　抗体濃度（μｇ／ｍｌ）、０１　１　１　１０　１００ ＦＩＧ、５Ａ　抗体濃度（μ５　／ｍ　Ｉ　）ＦＩＧ、５Ｂ　抗体濃度Ｃｕ３／ ｍｌ）ＦＩＧ、　６Ａ ＦＩＧ、６Ｂ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＣＩ　２　Ｎ　５／１ ０ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０２ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳＩ

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．１０Ｃ４．１．３、９Ｇ２．１．３または９Ｄ４．９．１よりなる群から選 ばれたモノクローナル抗体により認識されるものと実質的に同じαｖβ３エピト ープに結合することのできる抗αｖβ３モノクローナル抗体組成物。
2. ２．（１）破骨細胞に結合することができ、かつ（２）αｖβ３発現細胞のフィ ブリノーゲンへの結合を阻害することができる、請求項１に記載のモノクローナ ル抗体組成物。
3. ３．αｖβ３発現細胞のビトロネクチンへの結合を阻害することができる、請求 項２に記載のモノクローナル抗体組成物。
4. ４．αｖβ３複合体を認識する、請求項２に記載のモノクローナル抗体組成物。
5. ５．モノクローナル抗体１０Ｃ４．１．３または９Ｇ２．１．３によって認識さ れるエピトープに結合する、請求項４に記載のモノクローナル抗体組成物。
6. ６．該αｖβ３分子のβ３部分を認識する、請求項２に記載のモノクローナル抗 体組成物。
7. ７．モノクローナル抗体９Ｄ４．９．１によって認識されるエピトープに結合し 、モノクローナル抗体９Ｄ４．９．１に等しいかまたはそれ以上のαｖβ３に対 する親和性を有する、請求項６に記載のモノクローナル抗体組成物。
8. ８．ＩＩｂＩＩＩａに実質的に結合することができない、請求項２に記載のモノ クローナル抗体組成物。
9. ９．破骨細胞以外のαｖβ３発現細胞には実質的に結合することができない、請 求項２に記載のモノクローナル抗体組成物。
10. １０．請求項１に記載の抗体をコードする単離核酸。
11. １１．請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
12. １２．請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
13. １３．請求項７に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
14. １４．請求項９に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
15. １５．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１ １０２９として寄託されているハイブリドーマ細胞（以下、１０Ｃ４．１．３と いう）。
16. １６．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１ １０３０として寄託されているハイブリドーマ細胞（以下、９Ｇ２．１．３とい う）。
17. １７．アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション受託番号ＡＴＣＣＨＢ１ １０３１として寄託されているハイブリドーマ細胞（以下、９Ｄ４．９．１とい う）。
18. １８．請求項１５に記載のハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ ル抗体。
19. １９．請求項１６に記載のハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ ル抗体。
20. ２０．請求項１７に記載のハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナ ル抗体。
21. ２１．治療学的有効量の請求項１に記載の抗体を含む医薬組成物。
22. ２２．（ａ）被験試料を請求項１に記載のモノクローナル抗体と接触させ、つい で （ｂ）該モノクローナル抗体に結合した被験試料中のαｖβ３の量を決定するこ とを特徴とするイムノアッセイ。
23. ２３．破骨細胞上のαｖβ３には結合することができるが、ヒト臍帯静脈内皮上 のαｖβ３には実質的に結合することができないモノクローナル抗体を含むモノ クローナル抗体組成物。
24. ２４．検出可能なマーカーで標識してある請求項２３に記載のモノクローナル抗 体組成物。
25. ２５．水不溶性マトリックスに共有結合させてある請求項２３に記載のモノクロ ーナル抗体組成物。
26. ２６．２特異的である請求項２３に記載のモノクローナル抗体組成物。
27. ２７．抗体がαｖβ３およびＴ−細胞マーカーに対して特異的である請求項２６ に記載のモノクローナル抗体組成物。
28. ２８．Ｔ−細胞マーカーがＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、Ｃ Ｄ１１ｂまたはＣＤ１１ｃである、請求項２７に記載のモノクローナル抗体組成 物。
29. ２９．免疫グロブリンエフェクター機能を有するＦｃドメインを含む請求項２３ に記載のモノクローナル抗体組成物。
30. ３０．一価である請求項２３に記載のモノクローナル抗体組成物。
31. ３１．ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃドメインを含む、請 求項２３に記載のモノクローナル抗体組成物。
32. ３２．該抗体を細胞毒素に結合してある請求項２３に記載のモノクローナル抗体 組成物。