DE69828154T2 - Anti-alphavbeta3 humanizierte monoklonale antikörper - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft neue humanisierte monoklonale Antikörper (mAbs) und diese codierende Gene. Insbesondere betrifft diese Erfindung humane monoklonale Antikörper, die spezifisch reaktiv gegenüber einem Epitop des humanen Vitronektinrezeptor, αvβ3, sind. Solche Antikörper sind nützlich zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung von u.a. Restenose und angiogenisch assoziierten Krankheiten (z.B. Krebs, Krebsmetastase, rheumatoide Arthritis, Atherosklerose).
  • Hintergrund der Erfindung
  • Integrine sind eine Superfamilie für Zelladhäsionsrezeptoren, die heterodimere Transmembran-Glycoproteine sind, die an einer Vielzahl von Zellen exprimiert werden. Diese Zelloberflächenadhäsionsrezeptoren schließen den Vitronektinrezeptor αvβ3 ein. Der Vitronektinrezeptor αvβ3 wird an einer Anzahl von Zellen exprimiert, einschließlich Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Osteoklasten und Tumorzellen, und besitzt deshalb eine Vielzahl von Funktionen.
  • Zum Beispiel wurde postuliert, daß der an der Membran von Osteoklastenzellen exprimierte αvβ3-Rezeptor den Knochenresorptionsprozeß vermittelt und zur Entwicklung von Osteoporose beiträgt [Ross et al., J. Biol. Chem., 1987, 262: 7703]. Als ein weiteres Beispiel wurde postuliert, daß der an humanen aortalen glatten Muskelzellen exprimierte αvβ3-Rezeptor deren Migration in die Neointima stimuliert, was zur Bildung von Atherosklerose und Restenose nach Angioplastie führt [Brown et al., Cardiovascular Res. 1994, 28: 1815].
  • Die Verbindung zwischen einem Antagonismus des Vitronektinrezeptors und Restenose nach vaskulären Verfahren wurde von Choi et al. beschrieben, J. Vasc. Surg., 1994, 19:125-34. WO 95/25543, veröffentlicht am 9. März 1995, bezeichnet ein Verfahren zur Inhibierung der Angiogenese durch Verabreichung eines Antagonisten des Vitronektinrezeptors.
  • Zusätzlich bezeichnete eine kürzliche Untersuchung einen αvβ3-Antagonisten als Förderer der Tumorregression durch Induzierung von Apoptose angiogener Blutgefäße [P.C. Brooks et al., Cell, 1994, 79: 1157-1164]. Ähnlich wurde ein muriner monoklonaler Antikörper LM609, der für den Vitronektinrezeptor entwickelt wurde, angegeben in WO 89/05155, veröffentlicht am 15. Juni 1995, als nützlich in der Inhibierung von Tumorwachstum bezeichnet. Siehe ebenfalls D.A. Cheresh et al., Cell, 1989, 57:59-69.
  • Während eine passive Immuntherapie, die monoklonale Antikörper aus einer heterologen Art (z.B. murin) einsetzt, als nützlicher Mechanismus zur Behandlung oder Prävention verschiedener Krankheiten oder Störungen nahegelegt wurde, besteht eine Alternative zur Reduzierung des Risikos einer unerwünschten Immunreaktion seitens des Patienten, die gegen den fremden Antikörper gerichtet ist, im Einsatz "humanisierter" Antikörper. Diese Antikörper sind im wesentlich humanen Ursprungs, wobei nur die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) und bestimmte Gerüstreste, die die CDR-Konformation beeinflussen, nicht-humanen Ursprungs sind. Besonders nützliche Beispiele für diesen Ansatz zur Behandlung einiger Störungen werden in PCT/GB91/01554 (WO 92/04381) und PCT/GB93/00725 (WO 93/20210) offenbart.
  • Ein zweiter und besonders bevorzugter Ansatz besteht darin, vollständig humane mAbs einzusetzen. Unglücklicherweise gab es nur wenige Erfolge in der Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper durch die klassische Hybridomtechnik. Tatsächlich wurden akzeptable humane Fusionspartner nicht identifiziert, und murine Myelomfusionspartner funktionieren nicht gut mit humanen Zellen, weil sie instabile und wenig produzierende Hybridomlinien liefern.
  • Neue humane mAbs oder humanisierte Antikörper sind besonders nützlich allein oder in Kombination mit bestehenden Molekülen zur Bildung immuntherapeutischer Zusammensetzungen. Es besteht ein Bedarf auf diesem Gebiet an vollständig humanen mAbs für den Vitronektinrezeptor αvβ3 oder an humanisierten Antikörpern dafür, die selektiv das Integrin αvβ3 blockieren können und eine lange Serumhalbwertszeit zeigen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem Aspekt betrifft diese Erfindung einen neuen humanisierten monoklonalen Antikörper, der gegen αvβ3 gerichtet ist, und funktionelle Fragmente davon. Dieser humanisierte Antikörper ist spezifisch reaktiv gegenüber dem humanen αvβ3 (Vitronektinrezeptor) und kann dessen Funktion neutralisieren.
  • In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Modifikationen an neutralisierenden Fab-Fragmenten oder F(ab')2-Fragmenten bereit, die für den humanen αvβ3-Rezeptor spezifisch sind, hergestellt durch zufällige kombinatorische Klonierung von humanen Antikörpersequenzen und isoliert aus einer filamentösen Phagen-Fab-Display-Bibliothek.
  • In noch einem anderen Aspekt wird ein umgeformter humaner Antikörper bereitgestellt, der humane konstante Regionen der schweren und leichten Kette aus einem ersten humanen Donor und variable Regionen der schweren und leichten Kette oder die CDRs daraus enthält, abgeleitet aus humanen neutralisierenden monoklonalen Antikörpern für den humanen αvβ3-Rezeptor, abgeleitet aus einem zweiten humanen Donor.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen (oder mehrere) veränderte Antikörper und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur passiven Immuntherapie einer Störung bereit, die durch den αvβ3-Rezeptor vermittelt wird, wie unter anderem Restenose, Krebsmetastase, rheumatoide Arthritis oder Atherosklerose, in einem Menschen durch Verabreichung einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung an den Menschen zur prophylaktischen oder therapeutische Behandlung der Störung.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit bereit, die durch den Vitronektinrezeptor in einem Menschen vermittelt wird, durch Verabreichen einer immuntherapeutisch wirksamen Menge des Antikörpers der Erfindung an den Menschen, gefolgt von der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines kleinen chemischen Moleküls an den Menschen, das ein Antagonist des Rezeptors ist.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die rekombinante Herstellung von humanisierten und veränderten Antikörpern (zum Beispiel manipulierte Antikörper, CDRs, Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Analoga davon) und darin nützliche Komponenten bereit, die aus neutralisierenden monoklonalen Antikörpern (mAbs) für den den humanen αvβ3-Rezeptor stammen. Diese Komponenten schließen isolierte Nukleinsäuresequenzen, die diese codieren, und rekombinante Plasmide ein, die die Nukleinsäuresequenzen unter der Kontrolle ausgewählter regulatorischer Sequenzen enthalten, die die Expression davon in Wirtszellen (bevorzugt vom Säugetier) ausrichten können, die mit den rekombinanten Plasmiden transfiziert sind. Das Herstellungsverfahren beinhaltet das Kultivieren einer transfizierten Wirtszellinie der vorliegenden Erfindung unter solchen Bedingungen, daß der humane oder veränderte Antikörper in den Zellen exprimiert wird, und das Isolieren des exprimierten Produkts daraus.
  • Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose der Gegenwart der humanen αvβ3-Rezeptorüberexpression in einem Menschen, welches das Inkontaktbringen einer Biopsieprobe mit den Antikörpern und veränderten Antikörpern der vorliegenden Erfindung und das Testen auf das Auftreten von Bindung zwischen dem Antikörper (oder veränderten Antikörper) und dem humanen αvβ3-Rezeptor umfaßt.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung betrifft sie eine pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens eine Dosis einer immuntherapeutisch wirksamen Menge der Antikörper dieser Erfindung in Kombination mit wenigstens einem zusätzlichen monoklonalen oder veränderten Antikörper umfaßt. Eine besonders wünschenswerte Zusammensetzung umfaßt als zusätzlichen Antikörper einen anti-humanen αvβ3-Rezeptorantikörper, der vom gegenständlichen Antikörper dadurch verschieden ist, daß er reaktiv gegenüber einem unterschiedlichen Epitop des humanen αvβ3-Rezeptor ist.
  • Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in der ausführlichen Beschreibung und den bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Diagramm, das die Bindung von mAbs an den humanen αvβ3-Rezeptor über ELISA veranschaulicht, wie beschrieben in Beispiel 3 für D12 und LM609.
  • 2 ist ein Diagramm, das die Bindung von mAbs an den αvβ3-Rezeptor über einen Origen-Marker für D12 und LM609 und Mu19 als Kontrolle veranschaulicht (siehe Beispiel 9).
  • 3 ist ein Diagramm, das BIAcore-Daten von D12 und LM609 (6 nM) darstellt, die mit immobilisiertem αvβ3 binden, wie in Beispiel 8 beschrieben.
  • 4 ist ein Diagramm, das die Charakteristika von Antikörpern (D12 und die in Tabelle I aufgeführten Unterstützungsantikörper) zur Fähigkeit zur Verhinderung von 1 μg/ml von LM609 an der Bindung von 1 μg/ml αvβ3 in einem ORIGEN-Markerexperiment veranschaulicht. Siehe Beispiel 9.
  • 5 ist ein Diagramm, das die Wirkung der humanisierten D12-Konzentration im HEK293-Zelladhäsionstest veranschaulicht.
  • 6 ist ein Balkendiagramm, das die Inhibierung der Bindung von 1 μg/ml LM609 an 1 μg/ml αvβ3 durch Vorinkubation mit LM609 oder D12 veranschaulicht.
  • 7 ist ein Balkendiagramm, das die Inhibierung der Bindung von 1 μg/ml D12 an 1 μg/ml αvβ3 durch Vorinkubation mit LM609 oder D12 veranschaulicht.
  • 8 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse der Durchflußcytometrie der murinen und humanisierten D12-Antikörper gegen zwei humane Zelltypen und einen Kaninchenzelltyp veranschaulicht. Siehe Beispiel 6.
  • 9 ist ein Balkendiagramm, das die Inhibierung von glatten Muskelzellen des Kaninchens im Test von Beispiel 10 durch den murinen D12-mAb (schwarze Balken) und das humanisierte HZ D12 IgG1 (weiße Balken) veranschaulicht.
  • 10A ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse des Kaninchen-Restenosetests von Beispiel 15 veranschaulicht, der die Wirkung der Behandlung mit einer Kontrolle oder der Behandlung mit murinem D12, verabreicht in einer Dosierung von 3 mg/kg i.v., auf die Lumenfläche mißt. N ist die Anzahl der behandelten Tiere.
  • 10B ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse des Kaninchen-Restenosetests veranschaulicht, der die Wirkung auf die Gesamtgefäßfläche der verletzten Gefäße mißt, behandelt wie in 10A.
  • 10C ist ein Balkendiagramm ähnlich demjenigen von 10A, außer daß das murine D12 mit einer Dosierung von 9 mg/kg i.v. verabreicht wurde.
  • 10D ist ein Balkendiagramm ähnlich demjenigen von 10B, außer daß das murine D12 mit einer Dosierung von 9 mg/kg i.v. verabreicht wurde.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt nützliche Antikörper, einschließlich monoklonaler, rekombinanter und synthetischer Antikörper (und Fragmente davon), die reaktiv gegenüber dem humanen Vitronektin-αvβ3-Rezeptor sind, isolierte Nukleinsäuren, die diese codieren, und verschiedene Mittel zu ihrer rekombinanten Herstellung sowie therapeutische, prophylaktische und diagnostische Verwendungen solcher Antikörper und Fragmente davon bereit.
  • Die Antikörper dieser Erfindung hemmen die Bindung von Vitronektin und anderen Liganden an den Vitronektin-(αvβ3)-Rezeptor. Diese Antikörper können selektiv das Integrin αvβ3 blockieren und zeigen eine lange Serumhalbwertszeit in vivo in Tiermodellen (z.B. ca. 21 Tage). Sie zeigen zusätzliche Funktionen, wie eine Komplementfixierung. Spezifisch sind die Antikörper, die das murine monoklonale D12 und den humanisierten Antikörper HuD12 einschließen, die spezifisch αvβ3 neutralisieren, wünschenswert zur Verwendung als akute und subakute therapeutische Reagenzien zur Behandlung der durch den Vitronektinrezeptor vermittelten Störungen. Die Inhibierung des Vitronektinrezeptors durch die Antikörper dieser Erfindung erlaubt die therapeutische Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten wie Restenose und Angiogenese.
  • I. Sequenz-ID-Nummern
  • Sequenz-ID-Nrn. 1 und 2 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der variablen Region der schweren Kette des murinen mAb D12. Die CDRs befinden sich an den Aminosäureresten 31-35, Nukleotiden 91-105; Aminosäuren 50-66, Nukleotiden 148-198; und Aminosäuren 99-106, Nukleotiden 295-318 von SEQ ID NOS:1 und 1.
  • Sequenz-ID-Nrn. 6 und 7 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der leichten Kette des murinen mAb D12. Die CDRs befinden sich an den Aminosäuren 24-34, Nukleotiden 70-102; Aminosäuren 50-56, Nukleotiden 148-68; und Aminosäuren 89-97, Nukleotiden 265-291 von SEQ ID NOS:6 und 7.
  • Sequenz-ID-Nr. 3 ist die Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette der humanen VH-Untergruppe I Consensus-Sequenz, worin sich die CDRs an den Aminosäuren 31-35; Aminosäuren 49-64; und Aminosäuren 97-104 befinden. SEQ ID NO:8 ist die Aminosäuresequenz der leichten Kette der humanen V-kappa-Untergruppe III Consensus-Sequenz, worin sich die CDRs an den Aminosäuren 24-35, Aminosäuren 51-57 und Aminosäuren 90-99 befinden.
  • Sequenz-ID-Nrn. 4 und 5 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der variablen Region der synthetischen schweren Kette der humanisierten schweren Consensus-Kette D12HZHC1-0. Die CDRs befinden sich bei Aminosäuren 31-35, Nukleotiden 91-115; Aminosäuren 50-66, Nukleotiden 148-198; und Aminosäuren 99-106, Nukleotiden 295-318. Bevorzugte murine Gerüstreste, die in der synthetischen schweren Kette beibehalten werden, sind die Aminosäurereste 28, 48, 67, 68, 70, 72 und 74.
  • Sequenz-ID-Nrn. 9 und 10 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der synthetischen leichten Kette der synthetischen humanisierten leichten Consensus-Kette D12HZLC-1-0. Die CDRs befinden sich bei den Aminosäuren 24-34, Nukleotiden 70-102; Aminosäuren 50-56, Nukleotiden 148-168; und Aminosäuren 89-97, Nukleotiden 265-291. Bevorzugte murine Gerüstreste sind die Aminosäurereste 1, 49 und 60.
  • Sequenz-ID-Nrn. 11 und 12 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der Region der murinen D12 variablen Region der schweren Kette, die verändert ist. Sequenz-ID-Nrn. 13 und 14 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der Region der murinen D12 variablen Region der leichten Kette, die verändert ist, einschließlich der ersten 5 Aminosäuren der humanen konstanten kappa-Region.
  • Sequenz-ID-Nr. 15 ist die Aminosäuresequenz des modifizierten humanen Gerüsts der REI-kappa-Kette.
  • Sequenz-ID-Nrn. 16 und 17 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen des Jk-Gens und seines Genprodukts.
  • Sequenz-ID-Nrn. 18 und 19 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der CAMPATH-Signalsequenz.
  • Sequenze-ID-Nrn. 20 und 21 sind die DNA- bzw. Aminosäuresequenzen der synthetischen humanisierten kappa-Kette auf Basis eines modifizierten humanen Gerüsts der REI-kappa-Kette.
  • Sequenz-ID-Nrn. 22-25, 30-31, 36-39 und 44-45 sind in den Beispielen 13 und 14 verwendete Primer-Sequenzen.
  • Sequenz-ID-Nrn. 26-29, 32-35 und 40-43 sind in den Beispielen 13 und 14 verwendete synthetische Oligonukleotide.
  • II. Definitionen
  • Wie in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, sind die folgenden Begriffe wie folgt definiert:
    Der Ausdruck "durch den αvβ3-Rezeptor vermittelte Störungen" schließt ein, aber ist nicht beschränkt auf kardiovaskuläre Störungen oder angiogenbezogene Störungen, wie Angiogenese, die mit diabetischer Retinopathie, Atherosklerose und Restenose assoziiert ist, chronische inflammatorische Störungen, Makuladegeneration, diabetische Retinopathie und Krebs, zum Beispiel feste Tumormetastase, und Krankheiten, worin die Knochenresorption mit Pathologie assoziiert ist, wie Osteoporose. Die Antikörper dieser Erfindung sind auch nützlich als antimetastatische und Antitumormittel.
  • "Veränderter Antikörper" bezeichnet ein durch eine aus ihrer natürlichen Form veränderte Immunglobulin-codierende Region codiertes Protein, der durch Expression in einer ausgewählten Wirtszelle erhalten werden kann. Solche veränderten Antikörper sind manipulierte Antikörper (z.B. chimäre, humanisierte oder umgeformte oder immunologisch editierte humane Antikörper) oder Fragmente davon, denen die gesamte oder ein Teil einer konstanten Region des Immunglobulins fehlt, z.B. Fv, Fab oder F(ab')2 und dgl.
  • "Veränderte Immunglobulin-codierende Region" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die einen veränderten Antikörper der Erfindung oder ein Fragment davon codiert.
  • "Umgeformter humaner Antikörper" bezeichnet einen veränderten Antikörper, in dem minimal zumindest ein CDR aus einem ersten humanen monoklonalen Donorantikörper gegen ein CDR in einem zweiten humanen Akzeptorantikörper substituiert ist. Bevorzugt sind alle sechs CDRs ausgetauscht. Besonders bevorzugt ist eine gesamte Antigen-kombinierende Region, zum Beispiel ein Fv, Fab oder F(ab')2, aus einem ersten humanen monoklonalen Donorantikörper gegen die entsprechende Region in einem zweiten humanen monoklonalen Akzeptorantikörper substituiert. Am meisten bevorzugt ist die Fab-Region aus einem ersten humanen Donor operativ mit den geeigneten konstanten Regionen eines zweiten humanen Akzeptorantikörpers verbunden, um einen monoklonalen Antikörper voller Länge zu bilden.
  • "Erster Immunglobulinpartner" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die eine variable Region eines humanen Gerüsts oder eines humanen Immunglobulins codiert, worin die nativen (oder natürlich vorkommenden) CDR-codierenden Regionen durch die CDR-codierenden Regionen eines humanen Donorantikörpers ausgetauscht sind. Die humane variable Region kann eine schwere Kette, eine leichte Kette (oder beide Ketten), ein Analogon oder ein funktionelles Fragment davon eines Immunglobulins sein. Solche CDR-Regionen, die sich innerhalb der variablen Region von Antikörpern (Immunglobulinen) befinden, können durch fachbekannte Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel offenbaren Kabat et al. Regeln zur Lokalisierung von CDRs, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Zusätzlich sind Computerprogramme bekannt, die nützlich zur Identifizierung von CDR-Regionen/-Strukturen sind.
  • "Zweiter Fusionspartner" bezeichnet eine andere Nukleotidsequenz, die ein Protein oder Peptid codiert, an das der erste Immunglobulinpartner im Raster oder mittels einer optionalen herkömmlichen Linkersequenz fusioniert ist (d.h. operativ verknüpft). Bevorzugt ist der Fusionspartner ein Immunglobulingen und wird dann als ein "zweiter Immunglobulinpartner" bezeichnet. Der zweite Immunglobulinpartner kann eine Nukleinsäuresequenz einschließen, die die gesamte konstante Region für den gleichen (d.h. homologen – die ersten und zweiten veränderten Antikörper stammen aus der gleichen Quelle) oder einen zusätzlichen (d.h. heterologen) Antikörper von Interesse codiert. Er kann eine schwere Kette oder leichte Kette eines Immunglobulins (oder beide Ketten als Teil eines einzelnen Polypeptids) sein. Der zweite Immunglobulinpartner ist nicht auf eine besondere Immunglobulinklasse oder einen besonderen Immunglobulinisotyp beschränkt.
  • Zusätzlich kann der zweite Immunglobulinpartner einen Teil einer konstanten Region eines Immunglobulins umfassen, wie in einem Fab oder F(ab')2 gefunden (d.h. einen diskreten Teil einer angemessenen humanen konstanten Region oder Gerüstregion). Ein zweiter Fusionspartner kann ebenfalls eine Sequenz umfassen, die ein integrales Membranprotein codiert, das auf der äußeren Oberfläche einer Wirtszelle freiliegt, zum Beispiel als Teil einer Phagen-Display-Bibliothek, oder eine Sequenz, die ein Protein zum analytischen oder diagnostischen Nachweis codiert, zum Beispiel Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase, etc.
  • Die Begriffe Fv, Fc, Fd, Fab oder F(ab')2 werden mit ihren Standardbedeutungen verwendet [siehe z.B. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • Wie hier verwendet beschreibt ein "manipulierter Antikörper" einen Typ von verändertem Antikörper, d.h, einen synthetischen Antikörper voller Länge (z.B. chimären, humanisierten, umgeformten oder immunologisch editierten humanen Antikörper im Gegensatz zu einem Antikörperfragment), worin ein Teil der variablen Domänen der leichten und/oder schweren Kette eines ausgewählten Akzeptorantikörpers durch die analogen Teile aus einem oder mehreren Donorantikörpern ausgetauscht ist, die Spezifität für das ausgewählte Epitop haben. Zum Beispiel können solche Moleküle Antikörper einschließen, die durch eine humanisierte schwere Kette gekennzeichnet sind, die mit einer unmodifizierten leichten Kette (oder chimären leichten Kette) assoziiert ist, oder umgekehrt. Manipulierte Antikörper können ebenfalls durch Veränderung der Nukleinsäuresequenzen gekennzeichnet sein, die die Gerüstregionen der variablen Domäne der leichten und/oder schweren Kette des Akzeptorantikörpers codieren, um die Bindungsspezifität des Donorantikörpers beizubehalten. Diese Antikörper können einen Austausch eines oder mehrerer CDRs (bevorzugt aller) aus dem Akzeptorantikörper gegen CDRs aus einem hier beschriebenen Donorantikörper umfassen.
  • Ein "chimärer Antikörper" bezeichnet einen Typ von manipuliertem Antikörper, der eine natürlich vorkommende variable Region (leichte Kette und schwere Kette) enthält, die aus einem Donorantikörper stammt, in Verbindung mit den konstanten Regionen der leichten und schweren Kette, die aus einem Akzeptorantikörper aus einer heterologen Art stammen.
  • Ein "humanisierter Antikörper" bezeichnet einen Typ von manipuliertem Antikörper mit seinen aus einem nicht-humanen Donorimmunoglobulin stammenden CDRs, wobei die verbleibenden, aus Immunglobulin stammenden Teile des Moleküls aus einem (oder mehreren) humanen Immunglobulinen stammen. Zusätzlich können Gerüstträgerreste verändert sein, um die Bindungsaffinität zu bewahren [siehe z.B. Queen et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032 und Hodgson et al., 1991, Bio/Technology, 9:421].
  • Ein "immunologisch editierter Antikörper" bezeichnet einen Typ von manipuliertem Antikörper, in dem Veränderungen an Donor- und/oder Akzeptorsequenzen vorgenommen werden, um Regionen zu editieren, die Klonierungsartefakte, Keimlinienverstärkungen etc. beinhalten, gerichtet auf die Reduzierung der Wahrscheinlichkeit einer immunologischen Reaktion gegen den Antikörper auf Seiten eines Patienten, der mit dem editierten Antikörper behandelt wird.
  • Der Begriff "Donorantikörper" bezeichnet einen Antikörper (monoklonal oder rekombinant), der die Nukleinsäuresequenzen seiner variablen Regionen, CDRs oder anderer funktioneller Fragmente oder Analoga davon für einen ersten Immunglobulinpartner beiträgt, um die veränderte Immunglobulincodierende Region und den resultierenden exprimierten veränderten Antikörper mit der antigenen Spezifität und Charakteristik der neutralisierenden Aktivität des Donorantikörpers zu versehen. Ein zur Verwendung in dieser Erfindung geeigneter Donorantikörper ist ein neutralisierender muriner monoklonaler Anti-αvβ3-Antikörper, der als D12 bezeichnet wird. D12 wird als mit den in SEQ ID NOS:2 bzw. 7 gezeigten Aminosäuresequenzen der variablen schweren Kette und variablen leichten Kette definiert.
  • Der Begriff "Akzeptorantikörper" bezeichnet einen Antikörper (monoklonal oder rekombinant) aus einer mit dem Donorantikörper genetisch nicht verwandten Quelle, der alle (oder einen Teil, aber bevorzugt alle) der Nukleinsäuresequenzen, die seine Gerüstregionen der schweren und/oder leichten Kette und/oder seine konstanten Regionen der schweren und/oder leichten Kette codieren, für den ersten Immunglobulinpartner beiträgt. Bevorzugt ist ein humaner Antikörper der Akzeptorantikörper.
  • "Consensus-VH"- oder "Consensus-VK"-Regionen bezeichnen Aminosäuresequenzen, die in einer den Gerüstregionen des Akzeptorantikörpers ähnlichen Weise funktionieren können, aber durch herkömmliche Computertechniken ausgewählt werden. Kurz gesagt, ausgehend von einer gegebenen VH- oder VK-Aminosäuresequenz, werden die der gegebenen Sequenz am nächsten humanen VH- und VK-Sequenzen zusammengesetzt, um die am nächsten kommende Antikörperuntergruppe zu identifizieren. Sobald die Untergruppe ausgewählt ist, werden alle humanen Antikörper aus dieser Untergruppe verglichen, und eine Consensus-Sequenz der VH- und VK-Ketten wird hergestellt. Die Consensus-Sequenzen werden zur Erzeugung einer wünschenswerten synthetischen Gerüstregion für den humanisierten Antikörper verwendet.
  • "CDRs" sind die Aminosäuresequenzen der komplimentaritätsbestimmenden Region eines Antikörpers. CDRs sind die hypervariablen Regionen der schweren und leichten Ketten eines Immunglobulins. Siehe z.B. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Es gibt drei CDRs in der schweren Kette und drei CDRs in der leichten Kette (oder CDR-Regionen) in den variablen Teilen eines Immunglobulins. Daher bezeichnen "CDRs" wie hier verwendet alle drei CDRs der schweren Kette oder alle drei CDRs der leichten Kette (oder alle CDRs sowohl in der schweren als auch in der leichten Kette, falls angemessen). CDRs liefern die Mehrzahl der Kontaktreste zur Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Epitop. CDRs von Interesse in dieser Erfindung stammen aus Sequenzen der variablen schweren und leichten Kette des Donorantikörpers und schließen Analoga der natürlich vorkommenden CDRs ein, wobei die Analoga ebenfalls die gleiche Antigenbindungsspezifität und/oder neutralisierende Fähigkeit wie der Donorantikörper teilen oder beibehalten, aus dem sie abgeleitet wurden.
  • Mit "Teilen der Antigenbindungsspezifität oder neutralisierenden Fähigkeit" ist zum Beispiel gemeint, daß, obwohl mAb D12 durch einen gewissen Grad an Antigenaffinität gekennzeichnet werden kann, ein durch eine Nukleinsäuresequenz von mAb D12 in einer angemessenen strukturellen Umgebung codiertes CDR eine niedrigere oder höhere Affinität haben kann. Es wird erwartet, daß CDRs von mAb D12 in solchen Umgebungen dennoch das gleiche Epitop (die gleichen Epitope) erkennen werden, wie es der intakte mAb D12 tut.
  • Ein "funktionelles Fragment" ist eine partielle variable Sequenz der schweren oder leichten Kette (z.B. geringfügige Deletionen am Amino- oder Carboxyterminus der variablen Region des Immunglobulins), die die gleiche Antigenbindungsspezifität und/oder neutralisierende Fähigkeit wie der Antikörper beibehält, aus dem das Fragment abgeleitet wurde.
  • Ein "Analogon" ist eine durch wenigstens eine Aminosäure modifizierte Aminosäuresequenz, worin die Modifikation eine chemische Modifikation oder Substitution an einer Aminosäure oder eine Substitution oder eine Umlagerung einiger Aminosäuren (d.h. nicht mehr als 10) sein kann, wobei die Modifikation der Aminosäuresequenz die Beibehaltung der biologischen Eigenschaften, z.B. Antigenspezifität und hohe Affinität, der unmodifizierten Sequenz erlaubt. Zum Beispiel können (stumme) Mutationen über Substitutionen konstruiert werden, wenn bestimmte Endonuklease-Restriktionsorte innerhalb CDR-codierender Regionen oder diese umgebend geschaffen werden.
  • Wenn in diesem Text Protein- und/oder DNA-Sequenzen durch ihre prozentualen Homologien oder Identitäten mit identifizierten Sequenzen definiert werden, schließen die zur Berechnung der prozentualen Homologien oder prozentualen Identitäten verwendeten Algorithmen die folgenden ein: der Smith-Waterman-Algorithmus [J.F. Collins et al., 1988, Comput. Appl. Biosci., 4: 67-72; J.F. Collins et al., Molecular Sequence Comparison and Alignment (M.J. Bishop et al, Hrsg.) in Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK (1987) S. 417] und die BLAST- und FASTA-Programme [E. G. Shpaer et al., 1996, Genomics 38: 179-191]. Diese Literaturstellen werden hier durch Verweis eingeführt.
  • Analoga können ebenfalls als allelische Variationen auftreten. Eine "allelische Variation oder Modifikation" ist eine Veränderung in der Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäure- oder Peptidsequenzen der Erfindung codiert. Solche Variationen oder Modifikationen können aufgrund der Entartung des genetischen Codes bestehen oder können absichtlich manipuliert werden, um gewünschte Eigenschaften bereitzustellen. Diese Variationen oder Modifikationen können zu Veränderungen in einer beliebigen codierten Aminosäuresequenz führen oder nicht.
  • Der Begriff "Effektormittel" bezeichnet Nichtprotein-Trägermoleküle, an die die veränderten Antikörper und/oder natürliche oder synthetische leichte oder schwere Ketten des Donorantikörpers oder andere Fragmente des Donorantikörpers durch herkömmliche Mittel assoziiert werden können. Solche Nichtprotein-Träger können herkömmliche Träger einschließen, die auf dem diagnostischen Gebiet verwendet werden, z.B. Polystyrol- oder andere Kunststoffkügelchen, Polysaccharide, wie sie z.B. im BIAcore-System (Pharmacia) verwendet werden, oder andere Nichtprotein-Substanzen, die auf dem medizinischen Gebiet nützlich und sicher zur Verabreichung an Menschen und Tiere sind. Andere Effektormittel können einen Makrozyklus zum Komplexieren eines Schwermetallatoms oder Radioisotope einschließen. Solche Effektormittel können ebenfalls nützlich zur Erhöhung der Halbwertszeit der veränderten Antikörper sein, z.B. Polyethylenglykol.
  • III. Murine monoklonale Anti-αvβ3-Antikörper
  • Zur Verwendung in der Konstruktion der humanisierten Antikörper, Fragmente und Fusionsproteine dieser Erfindung kann eine nicht-humane Art eingesetzt werden, um ein wünschenswertes Immunglobulin bei Darstellung mit dem humanen plazentalen αvβ3-Rezeptor als Antigen zu erzeugen. Herkömmliche Hybridomtechniken werden eingesetzt, um eine Hybridom-Zellinie bereitzustellen, die einen nicht-humanen monoklonalen Antikörper (mAb) gegen den αvβ3-Rezeptor sezerniert. Als ein Beispiel wird die Herstellung des murinem mAb D12 und anderer muriner Anti-αvβ3-mAbs im Detail im nachfolgenden Beispiel 2 beschrieben. Zur Vereinfachung der nachfolgenden Diskussion kann der Begriff D12 den D12-mAb oder jeden der anderen mAbs aus Beispiel 2 bezeichnen.
  • D12 ist ein wünschenswerter Donorantikörper zur Verwendung in der Entwicklung eines chimären oder humanisierten Antikörpers dieser Erfindung. Die Eigenschaften des neutralisierenden murinen mAb D12, erhalten wie in Beispiel 2 beschrieben, schließen eine Antigen-Bindungsspezifität für humanes αvβ3 und die in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführten Eigenschaften ein. Der Isotyp des mAb D12 aus Beispiel 2 ist IgG1, und er hat eine Affinität zwischen ca. 1 und 3 nM, abhängig vom eingesetzten Test. Der Antikörper erkennt das heterodimere α- und β-Epitop von αvβ3 und erkennt weder die α- noch die β-Untereinheiten individuell. Die Bindung wird durch die Bindung und funktionelle Aktivität (Neutralisation) in den In-vitro-Tests der nachfolgenden Beispiele 3-12 veranschaulicht.
  • Ausgehend von den bereitgestellten Sequenzen, d.h. der variablen Region der leichten Kette von D12 [SEQ ID NOS:6 und 7] und der variablen Region der schweren Kette von D12 [SEQ ID NOS:1 und 2], könnte ein Fachmann die verbleibenden Teile der schweren Kette unter Verwendung von z.B. Polymerasekettenreaktion erhalten und somit ein vollständiges mAb-Molekül erhalten. Alternativ könnte ein D12-Molekül unter Verwendung von Techniken konstruiert werden, die analog zu denjenigen sind, die nachfolgend für die synthetischen und rekombinanten mAbs der Erfindung beschrieben werden, und unter Einsatz anderer muriner schwerer Ketten des IgG-Untertyps.
  • Andere Anti-αvβ3-Antikörper können durch Durchmustern von Hybridomen oder kombinatorischen Bibliotheken oder Antikörper-Phagen-Displays [W.D. Huse et al., 1988, Science, 246: 1275-1281] unter Verwendung des hier beschriebenen murinen mAb und seines αvβ3-Epitops entwickelt werden. Eine Sammlung von Antikörpern, einschließlich Hybridomprodukten oder Antikörpern, die aus dem Immunglobulinrepertoire einer beliebigen Art stammen, können in einem herkömmlichen kompetitiven Test, wie in den nachfolgenden Beispielen 5, 8 und 9 beschrieben, mit einem oder mehreren der hier beschriebenen Epitope durchmustert werden. So kann die Erfindung einen von D12 verschiedenen Antikörper bereitstellen, der an den αvβ3-Rezeptor binden und ihn neutralisieren kann. Andere, gegen ein gewünschtes αvβ3-Epitop und durch herkömmliche Techniken erzeugte mAbs schließen ohne Beschränkung jene ein, die murine mAbs, humane mAbs und kombinatorische Antikörper codieren.
  • Diese Erfindung ist nicht auf die Verwendung des D12-mAb oder seiner hypervariablen Sequenzen beschränkt. Es wird vorhergesehen, daß beliebige geeignete αvβ3-neutralisierende Antikörper und entsprechende Anti-αvβ3-CDRs, die auf diesem Gebiet beschrieben werden, dafür substituiert werden können. Wann immer in der folgenden Beschreibung der Donorantikörper als D12 identifiziert wird, wird diese Bezeichnung allein zur Veranschaulichung und Vereinfachung der Beschreibung vorgenommen.
  • IV. Kombinatorische Klonierung zum Erhalt humaner Antikörper
  • Wie oben erwähnt wurde, haben eine Anzahl von Problemen die direkte Anwendung der Hybridomtechnik von G. Kohler und C. Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497 auf die Erzeugung und Isolierung humaner monoklonaler Antikörper erschwert. Darunter befinden sich ein Mangel an geeigneten Fusionspartner-Myelomzellinien, die zur Bildung von Hybridomzellinien verwendet werden, sowie die schlechte Stabilität solcher Hybridome sogar bei Bildung. Deshalb ist der molekularbiologische Ansatz der kombinatorischen Klonierung bevorzugt.
  • Die kombinatorische Klonierung wird allgemein in WO 90/14430 offenbart. Einfach gesagt besteht das Ziel der kombinatorischen Klonierung darin, auf eine Population von bakteriellen Zellen die immunologische genetische Kapazität einer humanen Zelle, eines humanen Gewebes oder eines humanen Organs zu übertragen. Es ist bevorzugt, Zellen, Gewebe oder Organe einzusetzen, die immunkompetent sind. Besonders nützliche Quellen schließen ohne Beschränkung Milz, Thymus, Lymphknoten, Knochenmark, Mandel und periphere Blutlymphozyten ein. Die Zellen können optional mit dem humanen αvβ3-Rezeptor in vitro stimuliert oder aus Spendern selektiert werden, von denen bekannt ist, daß sie eine Immunreaktion erzeugt haben, oder von Spendern, die HIV-positiv, aber asymtomatisch sind.
  • Die aus den Donorzellen isolierte genetische Information (d.h. die in den Geweben als Reaktion auf Stimulation durch αvβ3 als Antigen erzeugten humanen Antikörper) kann in Form von DNA oder RNA sein und wird zweckmäßig durch PCR oder ähnliche Techniken amplifiziert. Bei Isolation als RNA wird die genetische Information bevorzugt zu cDNA durch reverse Transkription vor der Amplifikation umgewandelt. Die Amplifikation kann verallgemeinert oder besonders spezifisch maßgeschneidert werden. Zum Beispiel kann durch eine sorgfältige Auswahl von PCR-Primersequenzen eine selektive Amplifikation von Immunglobulingenen oder Untergruppen innerhalb dieser Klasse von Genen erreicht werden.
  • Sobald die kompetenten Sequenzen des Genbestandteils erhalten sind, in diesem Falle der Gene, die die variablen Regionen der verschiedenen schweren und leichten Antikörperketten codieren, werden die Gene der leichten und schweren Kette in zufälligen Kombinationen zur Bildung einer statistischen kombinatorischen Bibliothek assoziiert. Verschiedene rekombinante DNA-Vektorsysteme wurde zur Erleichterung der kombinatorischen Klonierung beschrieben [siehe z.B. WO 90/14430 s.o., Scott und Smith, 1990, Science, 249:386-406 oder US-PS 5 223 409 ]. Nach Erzeugung der kombinatorischen Bibliothek können die Produkte nach der Expression zweckmäßig durch "Biopanning" (Affinitätsauswahl) mit dem humanen αvβ3-Rezeptor oder, falls notwendig, durch Epitop-geblocktes Biopanning wie nachfolgend im größeren Detail beschrieben durchmustert werden.
  • Anfänglich ist es allgemein bevorzugt, Fab-Fragmente von mAbs wie D12 zur kombinatorischen Klonierung und Durchmusterung zu verwenden, und dann die Fabs zu mAbs voller Länger nach Selektion der gewünschten Testmoleküle umzuwandeln. Jedoch können einkettige Antikörper ebenfalls zur Klonierung und Durchmusterung verwendet werden.
  • V. Antikörperfragmente
  • Die vorliegende Erfindung erwägt die Verwendung von Fab-Fragmenten oder F(ab')2-Fragmenten zu Abgeleitung von mAbs voller Länge, die gegen den humanen αvβ3-Rezeptor gerichtet sind. Obwohl diese Fragmente unabhängig nützlich als schützende und therapeutische Mittel in vivo gegen Zustände sein können, die durch den humanen αvβ3-Rezeptor vermittelt werden, oder in vitro als Teil eines Diagnostikums für eine durch den humanen αvβ3-Rezeptor vermittelte Krankheit, werden sie hier als Komponente eines umgeformten humanen Antikörpers eingesetzt. Ein Fab-Fragment enthält die gesamte leichte Kette und den aminoterminalen Teil der schweren Kette; und ein F(ab')2-Fragment ist das durch zwei Fab-Fragmente gebildete Fragment, die durch zusätzliche Disulfidbindungen gebunden sind. Die humanen αvβ3-Rezeptor-bindende monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung liefern Quellen für Fab-Fragmente und F(ab')2-Fragmente, wobei die letzteren Fragmente aus einer kombinatorischen Phagenbibliothek erhalten werden können [siehe z.B. Winter et al., 1994, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 oder Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10164-10168, die hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt werden]. Diese Fab- und F(ab')2-Fragmente sind selbst als therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Mittel und als Donoren für Sequenzen nützlich, die die variablen Regionen und CDR-Sequenzen einschließen, die nützlich in der Bildung von rekombinanten oder humanisierten Antikörpern wie hier beschrieben sind.
  • VI. Interessierende Aminosäure- und Nukleotidsequenzen des Antihumanes αvβ3-Antikörpers
  • Der mAb D12 oder andere hier beschriebene Antikörper können Sequenzen beitragen, wie Peptidsequenzen der variablen schweren und/oder leichten Kette, Gerüstsequenzen, CDR-Sequenzen, funktionelle Fragment und Analoga davon, und die sie codierenden Nukleinsäuresequenzen, die nützlich bei der Konstruktion und beim Erhalt verschiedener veränderter Antikörper sind, die durch die Antigenbindungsspezifität des Donorantikörpers gekennzeichnet sind.
  • Als ein Beispiel stellt die vorliegende Erfindung daher Sequenzen der variablen leichten Kette (SEQ ID NOS:6 und 7] und der variablen schweren Kette [SEQ ID NOS:1 und 2] aus dem Anti-humanes αvβ3-mAb D12 und daraus abgeleitete Sequenzen bereit.
  • Die Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die Peptidsequenzen der variablen leichten Kette und schwere Kette codieren, sind ebenfalls nützlich zur mutagenen Einführung spezifischer Veränderungen in die Nukleinsäuresequenzen, die die CDRs oder Gerüstregionen codieren, und zum Einfügen der resultierenden modifizierten oder Fusions-Nukleinsäuresequenz in ein Plasmid zur Expression. Zum Beispiel können stumme Substitutionen in der Nukleotidsequenz der Gerüst- und CDR-codierenden Regionen zur Schaffung von Restriktionsenzymorten verwendet werden, die die Insertion von mutagenisierten CDR- (und/oder Gerüst-) Regionen erleichtern würden. Diese CDR-codierenden Regionen können in der Konstruktion von umgeformten humanen Antikörpern dieser Erfindung verwendet werden.
  • Unter Berücksichtigung der Entartung des genetischen Codes können verschiedene codierende Sequenzen konstruiert werden, die die Aminosäuresequenzen der variablen schweren und leichten Kette und die CDR-Sequenzen der Erfindung sowie funktionelle Fragmente und Analoga davon codieren, die die Antigenspezifität des Donorantikörpers teilen. Die isolierten Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die Peptidsequenzen der variablen Kette oder CDRs codieren, können zur Erzeugung veränderter Antikörper, zum Beispiel chimärer oder humanisierter Antikörper, oder anderer manipulierter Antikörper dieser Erfindung verwendet werden, wenn sie operativ mit einem zweiten Immunglobulinpartner kombiniert werden.
  • Es sollte festgestellt werden, daß zusätzlich zu isolierten Nukleinsäuresequenzen, die Teile des hier beschriebenen veränderten Antikörpers und der Antikörper codieren, andere solche Nukleinsäuresequenzen von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind, wie diejenigen, die komplementär zu den nativen CDR-codierenden Sequenzen oder komplementär zu den modifizierten humanen Gerüstregionen sind, die die CDR-codierenden Regionen umgeben. Solche Sequenzen schließen alle Nukleinsäuresequenzen ein, die aufgrund der Entartung des genetischen Codes die gleichen Aminosäuresequenzen codieren können, wie sie in SEQ ID NOS:2 und 7 bereitgestellt sind. Eine exemplarische variable DNA-Sequenz der humanisierten leichten Kette ist in SEQ ID NO:9 dargestellt. Eine exemplarische variable DNA-Sequenz der humanisierten schweren Kette ist in SEQ ID NO:4 dargestellt. Diese variablen Regionen der schweren Kette und der leichten Kette haben drei CDR-Sequenzen, die im Detail in den murinen Sequenzen von SEQ ID NOS:1, 2, 6 und 7 beschrieben werden.
  • Andere nützliche DNA-Sequenzen, die von dieser Erfindung umfaßt werden, schließen diejenigen Sequenzen ein, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [siehe z.B. T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, S. 387-389] mit den DNA-Sequenzen hybridisieren, die die variablen Regionen der leichten und schweren Kette von SEQ ID NOS: 1 und 6 codieren (die ebenfalls SEQ ID NOS:4 und 9 für die synthetischen humanen Sequenzen einschließen), und die die Antigenbindungseigenschaften dieser Antikörper beibehalten. Ein Beispiel für eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist eine Hybridisierung mit 4XSSC bei 65°C, gefolgt von einer Waschung in 0,1XSSC bei 65°C für eine Stunde. Alternativ ist eine exemplarische stringente Hybridisierungsbedingung in 50 % Formamid, 4XSSC bei 42°C. Bevorzugt sind diese hybridisierenden DNA-Sequenzen zumindest ca. 18 Nukleotide lang, d.h. etwa die Größe eines CDR. Noch andere nützliche Sequenzen sind diejenigen DNA-Sequenzen, die ca. 80 bis ca. 99 % homolog oder identisch mit den DNA-Sequenzen von SEQ ID NOS:1, 4, 6, 9, 11, 13 und 20 sind, gemäß einem der oben aufgeführten Algorithmen, und die Sequenzen codieren, die die bio logischen Aktivitäten oder Funktionen von SEQ ID NOS:2, 5, 7, 10, 12, 14 und 21 teilen.
  • VII. Veränderte Immunglobulin-codierende Regionen und veränderte Antikörper
  • Veränderte Immunglobulin-codierende Regionen codieren veränderte Antikörper, die manipulierte Antikörper einschließen, wie chimäre Antikörper, humanisierte, umgeformte und immunologisch editierte humane Antikörper. Eine gewünschte veränderte Immunglobulin-codierende Region enthält CDR-codierende Regionen in Form von Fab-Regionen, die Peptide mit der Antigenspezifität des Anti-humanes αvβ3-Antikörpers codieren, bevorzugt ein hochaffiner Antikörper, wie er von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, inseriert in einen Akzeptor-Immunglobulinpartner.
  • Wenn der Akzeptor ein Immunglobulinpartner wie oben definiert ist, schließt er eine Sequenz ein, die eine zweite Antikörperregion von Interesse codiert, z.B. eine Fc-Region. Immunglobulinpartner können ebenfalls Sequenzen einschließen, die ein anderes Immunglobulin codieren, an das die konstante Region der leichten oder schweren Kette im Raster oder mittels einer Linkersequenz fusioniert ist. Manipulierte Antikörper, die gegen funktionelle Fragmente oder Analoga des humanen αvβ3-Proteins gerichtet sind, können geschaffen werden, um eine gesteigerte Bindung mit dem gleichen Antikörper auszuüben.
  • Der Immunglobulinpartner kann ebenfalls mit Effektormitteln wie oben definiert assoziiert sein, einschließlich Nichtprotein-Trägermolekülen, an die der Immunglobulinpartner operativ durch herkömmliche Mittel gebunden sein kann.
  • Eine Fusion oder Bindung zwischen den Immunglobulinpartner, z.B. Antikörpersequenzen, und dem Effektormittel kann durch jedes geeignete Mittel erfolgen, zum Beispiel durch herkömmliche kovalente oder ionische Bindungen, Proteinfusionen oder heterobifunktionelle Vernetzer, z.B. Carbodiimid, Glutaraldehyd und dgl. Solche Techniken sind fachbekannt und werden einfach in herkömmlichen Chemie- und Biochemizitaten beschrieben.
  • Zusätzlich können ebenfalls herkömmliche Linkersequenzen, die einfach eine gewünschte Raummenge zwischen dem zweiten Immunglobulinpartner und dem Effektormittel vorsehen, in die veränderte Immunglobulin-codierende Region konstruiert werden. Die Schaffung solcher Linker ist allgemein bekannt für die Fachleute.
  • Zusätzlich können Signalsequenzen für die Moleküle der Erfindung zur Steigerung der Expression modifiziert werden. Zum Beispiel kann der umge formte humane Antikörper mit der aus der Sequenz der schweren Kette von mAb D12 abgeleiteten Signalsequenz und den daraus abgeleiteten CDRs das ursprüngliche Signalpeptid durch eine andere Signalsequenz ersetzt aufweisen, wie die Campath-Leitsequenz [Page, M. J. et al., 1991, BioTechnology, 9.64-68; SEQ ID NOS: 18 und 19].
  • Ein exemplarisch veränderte Antikörper, ein umgeformter humaner Antikörper, enthält eine Peptid- oder Proteinsequenz der variablen schweren und der gesamten leichten Kette mit Antigenspezifität von mAb D12, fusioniert an die aus einem zweiten humanen Antikörper stammenden konstanten schweren Regionen CH-1-CH-3.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform kann der manipulierte Antikörper der Erfindung ein an ihn gebundenes zusätzliches Mittel aufweisen. Zum Beispiel kann das Verfahren der rekombinanten DNA-Technik zur Erzeugung eines manipulierten Antikörpers der Erfindung verwendet werden, worin das Fc-Fragment oder die CH2 CH3-Domäne eines vollständigen Antikörpermoleküls durch ein Enzym oder ein anderes detektierbares Molekül ausgetauscht wurde (d.h. ein Polypeptideffektor oder ein Reportermolekül).
  • Ein anderes wünschenswertes Protein dieser Erfindung kann ein vollständiges Antikörpermolekül mit schweren und leichten Ketten voller Länge oder jedes diskrete Fragment davon, wie die Fab- oder F(ab')2-Fragmente, ein Dimer der schweren Kette oder beliebige minimale rekombinante Fragmente davon, wie ein Fv oder einen einkettigen Antikörper (SCA), oder jedes andere Molekül mit der gleichen Spezifität wie der ausgewählte Donor-mAb D12 umfassen. Ein solches Protein kann in Form eines veränderten Antikörpers verwendet werden oder kann in seiner unfusionierten Form verwendet werden.
  • Wann immer der Immunglobulinpartner aus einem vom Donorantikörper unterschiedlichen Antikörper stammt, z.B. jeder Isotyp oder jede Klasse von Immunglobulingerüst- oder konstanten Regionen, oder durch ein Computerprogramm als Consensus-Sequenz wie oben definiert ausgewählt wird, resultiert ein manipulierter Antikörper. Manipulierte Antikörper können konstante Regionen von Immunglobulin (Ig) und variable Gerüstregionen aus einer Quelle, z.B. die Akzeptorantikörper- oder Consensus-Sequenzen, und ein oder mehrere (bevorzugt alle) CDRs aus dem Donorantikörper, z.B. aus dem hier beschriebenen Anti-humanes αvβ3-Antikörper, umfassen. Zusätzlich können Veränderungen, z.B. Deletionen, Substitutionen oder Additionen, der Gerüstregion der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Akzeptor-mAb auf der Nukleinsäure- oder Aminosäureebene oder der Donor-CDR-Regionen vorgenommen werden, um die Antigen-Bindungsspezifität des Donorantikörpers beizubehalten oder die potentielle Immunogenität zu reduzieren.
  • Solche manipulierten Antikörper werden geschaffen, um eine (oder beide) der variablen schweren und/oder leichten Ketten des humanen αvβ3-mAb (gegebenenfalls modifiziert wie beschrieben) oder eine oder mehrere der nachfolgend identifizierten CDRs der schweren oder leichten Kette einzusetzen. Die manipulierten Antikörper der Erfindung sind neutralisierend, d.h. sie inhibieren wünschenswert die Ligandenbindung an den Vitronektinrezeptor in vitro und in vivo in Tiermodellen von Krankheiten, die durch den αvβ3-Rezeptor vermittelt werden, z.B. Restenose.
  • Solche manipulierten Antikörper können einen umgeformten humanen Antikörper einschließen, der die an die funktionellen Fragmente des humanen αvβ3-Antikörpers fusionierten humanen konstanten Regionen der schweren und leichten Kette enthält. Ein geeigneter humaner (oder anderer tierischer) Akzeptorantikörper kann ein solcher sein, der aus einer herkömmlichen Datenbank, z.B. der KABAT®-Datenbank, Los Alamos-Datenbank und Swiss Protein-Datenbank, durch Homologie mit den Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des Donorantikörpers ausgewählt wird. Alternativ kann eine Consensus-Sequenz, die durch alle bekannten humanen Sequenzen in der Datenbank einer Untergruppe gebildet wird, die am nächsten derjenigen des Donorantikörpers ist, zur Bereitstellung der Gerüstregionen verwendet werden. Ein humaner Antikörper, der durch eine Homologie mit den Gerüstregionen des Donorantikörpers gekennzeichnet ist (auf Aminosäurebasis), kann geeignet sein, um eine konstante Region der schweren Kette und/oder eine variable Gerüstregion der schweren Kette zur Insertion der Donor-CDRs bereitzustellen. Ein geeigneter Akzeptorantikörper, der konstante oder variable Gerüstregionen der leichten Kette spenden kann, kann in einer ähnlichen Weise ausgewählt werden. Es sollte bemerkt werden, daß die schweren und leichten Ketten des Akzeptorantikörpers nicht aus dem gleichen Akzeptorantikörper stammen müssen.
  • Wünschenswert werden die heterologen Gerüst- und konstanten Regionen aus humanen Immunglobulinklassen und -isotypen ausgewählt, wie IgG (Untertypen 1 bis 4), IgM, IgA und IgE. Die Fc-Domänen sind nicht auf native Sequenzen beschränkt, sondern schließen mutierte Varianten ein, die auf dem Gebiet bekannt sind, die die Funktion verändern. Zum Beispiel wurden Mutationen in den Fc-Domänen bestimmter IgG-Antikörper beschrieben, die die Fc-vermittelte Komplement- und Fc-Rezeptorbindung reduzieren [siehe z.B. A.R. Duncan et al., 1988, Nature, 332:563-564; A.R. Duncan und G. Winter, 1988, Nature, 332:738-740; M.-L. Alegre et al., 1992, J. Immunol., 148:3461-3468; M.-H. Tao et al., 1993, J. Exp. Med., 178:661-667; V. Xu et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 3469-2374] und die Klärungsrate verändern [J.-K. Kim et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24: 542-548] und die strukturelle Heterogenität reduzieren [S. Angal et al., 1993, Mol. Immunol., 30:105-108]. Ebenfalls sind andere Modifikationen möglich, wie eine Oligomerisation des Antikörpers durch Addition des Schwanzstücksegments von IgM und andere Mutationen [R.I.F. Smith und S.L. Morrison, 1994, Biotechnology, 12:683-688; R.I.F. Smith et al., 1995, J. Immunol., 154: 2226-2236] oder Addition des Schwanzstücksegments von IgA [I. Kariv et al., 1996, J. Immunol., 157: 29-38]. Jedoch braucht der Akzeptorantikörper nicht nur humane Immunglobulin-Proteinsequenzen umfassen. Zum Beispiel kann ein Gen konstruiert werden, in dem eine DNA-Sequenz, die einen Teil einer humanen Immunglobulinkette codiert, an eine DNA-Sequenz fusioniert ist, die eine Nicht-Immunglobulin-Aminosäuresequenz codiert, wie ein Polypeptideffektor oder Reportermolekül.
  • Ein Beispiel für einen besonders wünschenswerten veränderten Antikörper ist ein humanisierter Antikörper, der die gesamten oder einen Teil der Aminosäuresequenzen der variablen Domäne von D12 und einige Teile der Gerüstregionen des Donorantikörpers oder CDRs daraus, inseriert in die Gerüstregionen eines ausgewählten humanen Antikörpers, enthält. Dieser humanisierte Antikörper ist gegen den humanen αvβ3-Rezeptor gerichtet. In geeigneter Weise sind in diesen humanisierten Antikörpern ein, zwei oder bevorzugt drei CDRs aus den variablen Regionen der schweren Kette und/oder leichten Kette des D12-Antikörpers in die Gerüstregionen eines ausgewählten humanen Antikörpers oder einer Consensus-Sequenz inseriert, wobei die nativen CDRs des letzteren Antikörpers oder der letzteren Consensus-Sequenz ausgetauscht sind.
  • Bevorzugt wurden in einem humanisierten Antikörper die variablen Domänen in beiden humanen schweren und leichten Ketten durch eine oder mehrere CDR-Austauschungen manipuliert. Es ist möglich, alle sechs CDRs oder verschiedene Kombinationen aus weniger als den sechs CDRs zu verwenden. Zum Beispiel ist es möglich, die CDRs nur in der humanen schweren Kette auszutauschen, wobei als leichte Kette die unmodifizierte leichte Kette aus dem humanen Akzeptorantikörper verwendet wird. Weiterhin alternativ kann eine kompatible leichte Kette aus einem anderen humanen Antikörper durch Rückgriff auf die herkömmlichen Antikörperdatenbanken ausgewählt werden. Der Rest des manipulierten Antikörpers kann aus jedem geeigneten humanen Akzeptorimmunglobulin stammen.
  • Der veränderte Antikörper hat somit bevorzugt die Struktur eines natürlichen humanen Antikörpers oder eines Fragments davon und besitzt die Kombination von Eigenschaften, die für eine effektive therapeutische Verwendung, z.B. Behandlung von durch den humanen αvβ3-Rezeptor vermittelten Krankheiten im Menschen, oder zur diagnostischen Verwendung erforderlich sind.
  • Es versteht sich für die Fachleute, daß ein veränderter Antikörper durch Veränderungen in den Aminosäuren der variablen Domäne weiter modifiziert werden kann, ohne notwendigerweise die Spezifität und hohe Affinität des Donorantikörpers zu beeinflussen (d.h. ein Analogon). Es wird vorhergesehen, daß die Aminosäuren der schweren und leichten Kette durch andere Aminosäuren entweder in den Gerüsten der variablen Domäne oder CDRs oder beiden substituiert werden können. Besonders bevorzugt ist das immunologische Editieren solcher rekonstruierten Sequenzen, wie es hier in den Beispielen veranschaulicht wird.
  • Zusätzlich kann die variable oder konstante Region verändert werden, um selektive Eigenschaften der Moleküle der vorliegenden Erfindung zu steigern oder zu verringern. Solche Eigenschaften können zum Beispiel Dimerisierung, Bindung an Fc-Rezeptoren oder die Fähigkeit zur Bindung und Aktivierung von Komplement einschließen [siehe z.B. Angal et al., 1993, Mol. Immunol., 30:105-108; Xu et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:3469-3474; Winter et al., EP 307, 434-B].
  • Solche Antikörper sind nützlich in der Prävention und Behandlung von durch humanen αvβ3-Rezeptor vermittelten Störungen, wie nachfolgend erörtert.
  • VIII. Herstellung von veränderten Antikörpern und manipulierten Antikörpern
  • Die resultierenden umgeformten und manipulierten humanen, humanisierten und chimären Antikörper dieser Erfindung können in rekombinanten Wirtszellen, z.B. COS-, CHO- oder Myelomzellen, durch Rückgriff auf rekombinante DNA-Technik unter Verwendung von Genmanipulationstechniken exprimiert werden. Die gleichen oder ähnlichen Techniken können ebenfalls eingesetzt werden, um andere Ausführungsformen dieser Erfindung zu erzeugen.
  • Kurz gesagt wird ein herkömmlicher Expressionsvektor oder ein rekombinantes Plasmid hergestellt, indem diese codierenden Sequenzen für den veränderten Antikörper in funktionsfähige Verbindung mit herkömmlichen regulatorischen Kontrollsequenzen gestellt werden, die die Vermehrung und Expression in und/oder Sezernierung aus einer Wirtszelle steuern können. Regulatorische Sequenzen schließen Promotorsequenzen, z.B. den CMV-Promotor, und Signalsequenzen ein, die aus anderen bekannten Antikörpern abgeleitet werden können. In ähnlicher Weise kann ein zweiter Expressionsvektor mit einer DNA-Sequenz erzeugt werden, die eine leichte oder schwere Kette eines komplementären Antikörpers codiert. Bevorzugt ist dieser zweite Expressionsvektor identisch mit dem ersten, ausgenommen soweit die codierenden Sequenzen und selektierbare Marker betroffen sind, um so weit wie möglich sicherzustellen, daß jede Polypeptidkette funktionell exprimiert wird. Alternativ können sich die codierenden Sequenzen der schweren und leichten Kette für den veränderten Antikörper auf einem einzelnen Vektor befinden.
  • Eine ausgewählte Wirtszelle wird durch herkömmliche Techniken mit sowohl dem ersten als auch dem zweiten Vektor cotransfiziert (oder einfach mit einem einzelnen Vektor transfiziert), um die transfizierte Wirtszelle der Erfindung zu erzeugen, die beide rekombinanten oder synthetischen leichten und schweren Ketten umfaßt. Die transfizierte Zelle wird dann durch herkömmliche Techniken kultiviert, um den manipulierten Antikörper der Erfindung zu erzeugen. Die Erzeugung des Antikörpers, der die Assoziation aus sowohl der rekombinanten schweren Kette als auch leichten Kette einschließt, wird in der Kultur durch einen geeigneten Test gemessen, wie ELISA oder RIA. Ähnliche herkömmliche Techniken können eingesetzt werden, um andere veränderte Antikörper und Moleküle dieser Erfindung zu konstruieren.
  • Geeignete Vektoren für die Klonierungs- und Subklonierungsschritte, die in den Verfahren und in der Konstruktion der Zusammensetzungen dieser Erfindung eingesetzt werden, können durch einen Fachmann ausgewählt werden. Zum Beispiel kann die herkömmliche pUC-Reihe von Klonierungsvektoren verwendet werden. Ein verwendeter Vektor ist pUC19, der kommerziell von Firmen für den Laborbedarf erhältlich ist, wie Amersham (Buckinghamshire, Vereinigtes Königreich) oder Pharmacia (Uppsala, Schweden). Zusätzlich kann jeder Vektor zur Klonierung verwendet werden, der leicht vervielfältigt werden kann, eine Vielzahl von Klonierungsorten und selektierbaren Genen (z.B. Antibiotikaresistenz) hat und leicht manipuliert wird. Daher ist die Auswahl des Klonierungsvektors kein beschränkender Faktor in dieser Erfindung.
  • In ähnlicher Weise können die Vektoren, die zur Expression der manipulierten Antikörper gemäß dieser Erfindung eingesetzt werden, durch einen Fachmann aus beliebigen herkömmlichen Vektoren ausgewählt werden. Bevorzugte Vektoren schließen zum Beispiel die Plasmide pCD oder pCN ein. Die Vektoren enthalten ebenfalls ausgewählte regulatorische Sequenzen (wie die CMV-Promotoren), die die Vervielfältigung und Expression heterologer DNA-Sequenzen in ausgewählten Wirtszellen ausrichten. Diese Vektoren enthalten die oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die für den manipulierten Antikörper codieren, oder veränderte Immunglobulin-codierende Regionen. Zusätzlich können die Vektoren die ausgewählten Immunglobulinsequenzen beinhalten, die durch Insertion erwünschter Restriktionsorte zur leichten Manipulation modifiziert sind.
  • Die Expressionsvektoren können ebenfalls durch Gene gekennzeichnet sein, die geeignet zur Verstärkung der Expression der heterologen DNA-Sequenzen sind, zum Beispiel das Säugetier-Dihydrofolatreduktasegen (DHFR). Andere bevorzugte Vektorsequenzen schließen eine Polyadenylierungs-(Poly A)-Signalsequenz, wie aus dem Rinderwachstumshormon (BGH), und die Betaglobin-Promotorsequenz (betaglopro) ein. Die hier nützlichen Expressionsvektoren können durch den Fachleuten allgemein bekannte Techniken synthetisiert werden.
  • Die Komponenten solcher Vektoren, z.B. Replikons, Selektionsgene, Verstärker, Promotoren, Signalsequenzen und dgl., können aus gewerblichen oder natürlichen Quellen erhalten oder durch bekannte Verfahren zur Verwendung in der Ausrichtung der Expression und/oder Sezernierung des Produkts der rekombinanten DNA in einem ausgewählten Wirt synthetisiert werden. Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen zahlreiche Typen auf diesem Gebiet zur Säugetier-, bakteriellen-, Insekten-, Hefe- und pilzlichen Expression bekannt sind, können für diesen Zweck ebenfalls ausgewählt werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls eine Zelle, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert ist, das die codierenden Sequenzen für die manipulierten Antikörper oder veränderten Immunglobulinmoleküle davon enthält. Für die Klonierung und andere Manipulationen dieser Klonierungsvektoren nützliche Wirtszellen sind ebenfalls herkömmlich. Jedoch werden höchst wünschenswert Zellen aus verschiedenen Stämmen von E. coli zur Vervielfältigung der Klonierungsvektoren und für die anderen Schritte in der Konstruktion von veränderten Antikörpern dieser Erfindung verwendet.
  • Geeignete Wirtszellen oder Zellinien zur Expression des manipulierten Antikörpers oder veränderten Antikörpers der Erfindung sind bevorzugt Säugetierzellen, wie CHO-, COS-, Fibroblasten- (z.B. 3T3) und Myeloid zellen, und besonders bevorzugt eine CHO- oder eine Myeloidzelle. Humane Zellen können verwendet werden, wodurch die Modifikation des Moleküls mit humanen Glycosylierungsmustern ermöglicht wird. Alternativ können andere eukaryontische Zellinien eingesetzt werden. Die Auswahl geeigneter Säugetierwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, Durchmusterung und Produktherstellung und -aufreinigung sind fachbekannt. Siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory (New York).
  • Bakterielle Zellen können sich als Wirtszellen nützlich erweisen, die geeignet zur Expression der rekombinanten Fabs der vorliegenden Erfindung sind [siehe z.B. Plückthun, A., 1992, Immunol. Rev. 130: 151-188]. Die Tendenz von in bakteriellen Zellen exprimierten Proteinen, in einer ungefalteten oder ungeeignet gefalteten Form oder in einer nicht-glycosylierten Form zu sein, stellt keine großen Bedenken dar, da Fabs normalerweise nicht glycosyliert sind und zur exportierten Expression manipuliert werden können, wodurch die hohe Konzentration reduziert wird, die die Fehlfaltung erleichtert. Dennoch müßte jedes in einer bakteriellen Zelle erzeugte rekombinante Fab auf Beibehaltung von Antigenbindungsfähigkeit durchmustert werden. Falls das durch die bakterielle Zelle exprimierte Molekül in einer angemessen gefalteten Form erzeugt und exportiert würde, dann würde die bakterielle Zelle ein wünschenswerter Wirt sein. Zum Beispiel sind verschiedene Stämme von E. coli, die zur Expression verwendet werden, allgemein bekannt als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Streptomyces, anderen Bacilli und dgl. können ebenfalls in diesem Verfahren eingesetzt werden.
  • Nach Wunsch sind ebenfalls Stämme von Hefezellen, die den Fachleuten bekannt sind, als Wirtszellen verfügbar, sowie Insektenzellen, z.B. Drosophila und Lepidoptera, und virale Expressionssysteme. Siehe z.B. Miller et al., 1986, Genetic Engineering, 8:277-298 und darin zitierte Literaturstellen.
  • Die allgemeinen Verfahren, durch die die Vektoren der Erfindung konstruiert werden können, die Transfektionsverfahren, die zur Erzeugung der Wirtszellen der Erfindung erforderlich sind, und die zur Erzeugung des veränderten Antikörpers der Erfindung aus solchen Wirtszellen notwendigen Kulturverfahren sind allesamt herkömmliche Techniken. Gleichsam können die veränderten Antikörper der Erfindung, sobald sie erzeugt sind, aus den Zellkulturinhalten gemäß Standardverfahren auf diesem Gebiet gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfatpräzipitation, Affnitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dgl. Solche Techniken gehören zum Fachkönnen und beschränken diese Erfindung nicht.
  • Noch ein anderes Verfahren der Expression von umgeformten Antikörpern kann die Expression in einem transgenen Tier verwenden, wie beschrieben in US-PS 4 873 316 , das hier durch Verweis eingeführt wird.
  • Sobald er durch das gewünschte Verfahren exprimiert ist, wird der manipulierte Antikörper dann auf In-vitro-Aktivität durch Verwendung eines geeigneten Tests untersucht. Derzeit herkömmliche ELISA-Testformate werden eingesetzt, um die qualitative und quantitative Bindung des veränderten Antikörpers an den humanen αvβ3-Rezeptor zu bewerten. Siehe nachfolgendes Beispiel 3. Zusätzlich können ebenfalls andere In-vitro-Tests (wie Beispiel 12) und In-vivo-Tiermodelle (wie Beispiel 15) verwendet werden, um die neutralisierende Wirksamkeit zu verifizieren, bevor anschließende humane klinische Studien durchgeführt werden, um die Fortdauer des veränderten Antikörpers im Körper trotz der gewöhnlichen Clearance-Mechanismen auszuwerten.
  • Als ein spezifisches Beispiel für die oben beschriebenen Herstellungsverfahren wird ein humanisierter D12-Antikörper erzeugt und exprimiert, wie im Detail im nachfolgenden Beispiel 13 beschrieben.
  • IX. Therapeutische/prophylaktische Verwendungen
  • Diese Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung von Menschen, die mit einer humanen αvβ3-Rezeptor-vermittelten Krankheit bezogene Symptome erfahren, welches das Verabreichen einer wirksamen Dosis von Antikörpern umfaßt, die einen oder mehrere der hier beschriebenen veränderten Antikörper oder Fragmente davon einschließen. Die Antikörper dieser Erfindung sind nützlich zur Behandlung von Krankheiten, worin die zugrundeliegende Pathologie einem Liganden zuordbar ist, der mit dem Vitronektinrezeptor wechselwirkt. Zum Beispiel sind diese Antikörper nützlich als Antitumor-, antiangiogene, antiinflammatorische und antimetastatische Mittel und sind besonders nützlich in der Behandlung von Atherosklerose, Restenose, Krebsmetastase, rheumatoider Arthritis, diabtischer Retinopathie und Makuladegeneration.
  • In ähnlicher Weise sind diese Antikörper nützlich zur Behandlung von Zuständen, worin ein Verlust der Knochenmatrix eine Pathologie schafft. Daher sind die vorliegenden Antikörper nützlich zur Behandlung von Osteoporose, Hyperparathyroidimus, Paget-Krankheit, Hyperkalzämie von Malignität, osteolytischen Läsionen, die durch Knochenmetastase erzeugt werden, Knochenverlust aufgrund von Unbeweglichkeit oder Geschlechtshormondefizienz.
  • Die veränderten Antikörper und mAbs dieser Erfindung, die spezifisch gegen den αvβ3-Integrinrezeptor sind, sind nützliche Therapeutika aufgrund ihrer "langen Halbwertszeit" (ca. 21 Tage) und zusätzlichen Effektorfunktionen (z.B. Komplementfixierung). Der an Blutgefäßen exprimierte αvβ3-Rezeptor liefert einen leichten Zugang mit mAbs. Zusätzlich sind diese Antikörper der vorliegenden Erfindung nützlich in der gezielten Wirkstoffübertragung, wobei sie in diesem Fall die Wirkstoffübertragung (d.h. als Immunkonjugate oder Immunliposomen) steigern könnten. Restenose kann entweder durch Blockierung der Neointimabildung oder durch Förderung der Umgestaltung blockiert werden. Die Wanderung von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMC) wird über den αvβ3-Rezeptor vermittelt, der im Anschluß an eine vaskuläre Verletzung aufgeregelt wird (dokumentiert durch Immunhistologie), und Osteopontin, ein Ligand von αvβ3, wird ebenfalls im Anschluß an eine vaskuläre Verletzung aufreguliert. Deshalb können die Antagonisten des αvβ3-Rezeptors, d.h. die hier beschriebenen Antikörper und veränderten Antikörper, die Neointimabildung blockieren und eine vorteilhafte Umbildung des Gefäßes steigern.
  • Angiogenese ist der Prozeß der neuen Blutgefäßbildung aus einem vorher bestehenden Blutgefäß als Reaktion auf angiogene Reize. Die Antikörper und Zusammensetzungen dieser Erfindung können ebenfalls zur Behandlung von Krankheiten mit angiogenen Komponenten verwendet werden, was ohne Beschränkung feste Tumore, Krebsmetastase, rheumatoide Arthritis, chronische inflammatorische Krankheiten, Atherosklerose, diabetische Retinopathie und Makuladegeneration einschließt. Bei Krebs stellt die Behandlung der Angiogenese das Targeting (Behandeln) des Wirtes selbst dar, was unabhängig vom Krebszell-Phänotyp ist. Die Zusammensetzungen dieser Erfindung, die Antagonisten des αvβ3-Rezeptors sind, besitzen Wirksamkeit gegen Krankheiten mit angiogenen Komponenten, weil αvβ3 in der Neovaskularisation während der Angiogenes aufreguliert wird. Ein Anti-αvβ3-mAb hemmt die Angiogenese in der Hühner-Chorion-Allantois-Membran (CAM), fördert die Apoptose in Endothelzellen und hemmt das Tumorwachstum im Mausmodell von humanem SCID. Die Inhibierung von αvβ3 verhindert das Wachstum der Neovaskularisation (keine Wirkung auf reife Gefäße).
  • Daher wird die therapeutische Reaktion, die durch die Verwendung der Moleküle dieser Erfindung induziert wird, durch die Bindung an den Vitronektinrezeptor αvβ3 und somit die anschließende Blockierung des Krank heitsfortschritts erzeugt. Daher sind die Moleküle der vorliegenden Erfindung, wenn sie in Zubereitungen und Formulierungen sind, die zur therapeutischen Verwendung geeignet sind, hoch wünschenswert für diejenigen Personen, die durch den humanen αvβ3-Rezeptor vermittelte Störungen erfahren. Zum Beispiel können längere Behandlungen wünschenswert sein, wenn chronische Krankheiten oder dgl. behandelt werden. Die Dosis und Dauer der Behandlung steht mit der relativen Dauer der Moleküle der vorliegenden Erfindung im menschlichen Kreislauf im Zusammenhang und kann durch einen Fachmann in Abhängigkeit vom behandelten Zustand und der allgemeinen Gesundheit des Patienten eingestellt werden.
  • Die veränderten Antikörper, Antikörper und Fragmente davon von dieser Erfindung können auch allein oder in Verbindung mit anderen Antikörpern verwendet werden, insbesondere mit humanen oder humanisierten oder gegenüber anderen Epitopen am Vitronektinrezeptor reaktiven humanen Antikörpern als Prophylaktika.
  • Der Verabreichungsmodus der therapeutischen und prophylaktischen Mittel der Erfindung kann jeder geeignete Weg sein, der das Mittel auf den Wirt überträgt. Die veränderten Antikörper, Antikörper, manipulierten Antikörper und Fragmente davon und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sind besonders nützlich zur parenteralen Verabreichung, d.h. subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal.
  • Therapeutische und prophylaktische Mittel der Erfindung können als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die eine wirksame Menge des veränderten Antikörpers in der Erfindung als aktiven Bestandteil in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Eine wäßrige Suspension oder Lösung, die den Antikörper enthält, bevorzugt gepuffert auf einen physiologischen pH in einer injektionsfertigen Form, ist bevorzugt. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden üblicherweise eine Lösung des manipulierten Antikörpers der Erfindung oder einen Cocktail daraus umfassen, gelöst in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, bevorzugt einem wäßrigen Träger. Eine Vielzahl wäßriger Träger kann eingesetzt werden, zum Beispiel 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycin und dgl. Diese Lösungen sind steril und allgemein frei von teilchenförmigem Material. Diese Lösungen können durch herkömmliche, allgemein bekannte Sterilisationstechniken (z.B. Filtration) sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe nach Bedarf auf ungefähre physiologische Bedingungen enthalten, wie pH-Einstellungs- und Puffermittel etc.
  • Die Konzentration des Antikörpers der Erfindung in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann weithin variieren, d.h. von weniger als ca. 0,5 %, gewöhnlich mit oder zumindest ca. 1 %, bis so viel wie 15 oder 20 Gew.%, und wird primär auf Basis von Fluidvolumina, Viskositäten etc. gemäß dem besonderen, ausgewählten Verabreichungsmodus ausgewählt werden.
  • So könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intramuskulären Injektion hergestellt werden, um 1 ml steriles gepuffertes Wasser und ca. 1 ng bis ca. 100 mg eines manipulierten Antikörpers der Erfindung zu enthalten. Wünschenswert können die Zusammensetzungen ca. 50 ng bis 80 mg Antikörper oder besonders bevorzugt ca. 5 mg bis ca. 75 mg Antikörper gemäß dieser Erfindung enthalten. In ähnlicher weise könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intravenösen Infusion hergestellt werden, um ca. 250 ml sterile Ringer-Lösung und ca. 1 bis ca. 75 und bevorzugt 5 bis ca. 50 mg/ml eines manipulierten Antikörpers der Erfindung zu enthalten. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind allgemein bekannt oder werden den Fachleuten offensichtlich sein und werden im größeren Detail zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
  • Es ist bevorzugt, daß die therapeutischen und prophylaktischen Mittel der Erfindung, wenn sie in einer pharmazeutischen Zubereitung sind, in Einheitsdosisformen vorliegen. Die angemessene therapeutische wirksame Dosis kann leicht durch die Fachleute bestimmt werden. Zur wirksamen Behandlung einer inflammatorischen Störung in einem Menschen oder anderen Tier sollte eine Dosis von etwa 0,1 mg bis etwa 20 mg pro 70 kg Körpergewicht von einem Protein oder einem Antikörper dieser Erfindung parenteral verabreicht werden, bevorzugt i.v. oder i.m. (intramuskulär). Eine solche Dosis kann, falls erforderlich, in geeigneten Zeitintervallen wiederholt werden, die nach Bedarf durch einen Arzt ausgewählt werden.
  • Die hier beschriebenen Antikörper, veränderten Antikörper oder Fragmente davon können zur Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich als wirksam mit herkömmlichen Immunglobulinen erwiesen, und fachbekannte Lyophilisierungs- und Rekonstituierungstechniken können eingesetzt werden.
  • In noch einem alternativen therapeutischen Schema können die veränderten Antikörper und monoklonalen Antikörper dieser Erfindung in einer kombinierten Therapie für die oben beschriebenen Krankheiten mit kleinen Molekülen als Nicht-Peptid-Antagonisten des Vitronektinrezeptors verwendet werden. Solche kleinen Moleküle als Antagonisten, die Dosierungen und Verabreichungsschemata werden z.B. in WO 96/00730, veröffentlicht am 11. Januar 1996, und WO 96/00574, veröffentlicht am 11. Januar 1996, beschrieben, die beide hier durch Verweis eingeführt werden. Eine solche Kombinationstherapie kann die Verabreichung eines Antikörpers dieser Erfindung an einen Patienten für einen kurzen Zeitraum, d.h. einige Monate bis 6 Monate, gefolgt von der chronischen therapeutischen Behandlung mit den kleinen Molekülen als Antagonisten für einen längeren Zeitraum beinhalten. In einer anderen Ausführungsform kann diese Ausführungsform eines Behandlungsverfahrens alternierende Behandlungszeiträume der Verabreichung von Immuntherapie mit den Antikörpern dieser Erfindung, gefolgt von Behandlungen mit kleinen Nicht-Peptid-Antagonisten beinhalten. Solche kombinierten therapeutischen Verfahren würden die gleichen Dosierungen, wie sie oben für die Immuntherapie beschrieben wurden, und die in den oben genannten Anmeldungen für die Nicht-Peptidtherapien angegebenen Dosierungen einsetzen.
  • X. Diagnostische Verwendungen
  • Die veränderten Antikörper und manipulierten Antikörper dieser Erfindung können ebenfalls in diagnostischen Schemata verwendet werden, wie zur Bestimmung von humanen αvβ3-Rezeptor-vermittelten Störungen oder der Verfolgung des Fortschritts der Behandlung von solchen Störungen. Als diagnostische Reagenzien können diese veränderten Antikörper zweckmäßig zur Verwendung in ELISAs und anderen herkömmlichen Testformaten zur Messung von humanen αvβ3-Rezeptorspiegeln im Serum, Plasma oder einem anderen geeigneten Gewebe oder der Freisetzung durch humane Zellen in Kultur markiert werden. Die Natur des Tests, in dem die veränderten Antikörper verwendet werden, ist herkömmlich und beschränkt nicht diese Offenbarung.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen verschiedene Aspekte dieser Erfindung, einschließlich der Konstruktion exemplarischer manipulierter Antikörper und deren Expression in geeigneten Vektoren und Wirtszellen, und sollen nicht als Beschränkung des Umfangs dieser Erfindung aufgefaßt werden. Alle Aminosäuren werden durch herkömmliche Dreibuchstaben- oder Einbuchstaben-Codes identifiziert. Alle notwendigen Restriktionsenzyme, Plasmide und anderen Reagenzien und Materialien wurden aus gewerblichen Quellen erhalten, wenn nichts anderes angegeben ist. Die gesamte Klonierungs, Liegierungs- und andere rekombinante DNA-Methodik wurde wie in T. Maniatis et al. oder Sambrook et al. durchgeführt, beide oben zitiert.
  • Beispiel 1: Reinigung von αvβ3-, αvβ5- und αvβ1-Rezeptoren
  • Der humane αvβ3-Proteinrezeptor und andere Proteinrezeptoren wurden aus humaner Plazenta wie folgt gereinigt. Plazenten wurden unmittelbar nach der Geburt eingefroren, dann partiell aufgetaut und in kleine Brocken geschnitten, die zu feinen Stücken unter Verwendung eines gewerblichen Fleischwolfs gemahlen wurden. Gewöhnlich 5 bis 10 Plazenten wurden auf einmal gemahlen; die Stücke wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen (6 Röhrchen pro Plazenta) gegeben und bei -20°C bis zur Verwendung gefroren gelagert.
  • Eine Immunoaffinitätssäule für jedes Integrin wurde unter Verwendung individueller monoklonaler Antikörper hergestellt. Anti-αvβ3-mAb (LM609) wurde aus Maus-Aszites gereinigt, erworben von Chemicon International, Inc. (Temecula, CA). Monoklonale Antikörper 23C6 oder D12 wurden aus Hybridommedium gereinigt. Anti-αvβ5-mAb (P1F6) und Anti-αvβ1-mAb (mAb16) wurden von Becton Dickinson erworben. LM609 oder 23C6 oder D12 (50 mg), P1F6 (25 mg) und mAb16 (25 mg) wurden an AffiGel 10 (BioRad) mit 5 mg mAb/ml Harz unter Befolgen der Herstelleranweisungen immobilisiert. Zur Entfernung der nicht-spezifisch bindenden Proteine wurden ca. 20 ml AffiGel 10 mit 1 M Tris HCl pH 7,5 behandelt und in einer EconoColumn gepackt. Die immobilisierten mAbs würden in EconoColumn (BioRad) gepackt, 10 ml-Säule für LM609 oder 23C6 oder D12, 0,5 ml-Säule für P1F6 und 5 ml-Säule für mAb16. Die Säulen wurden in Tandemanordnung verbunden: die erste Säule, die AffiGel 10 für die nichtspezifische Bindung enthielt, die zweite Säule, die αvβ3-mAb enthielt, die dritte Säule, die α5β1-mAb enthielt, und die vierte Säule, die αvβ5-mAb enthielt. Die Säulen wurden mit Puffer T (50 mM Tris HCl, pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM CaCl, 1 % Octylglucosid) in der Kältekammer äquilibriert.
  • Die gemahlene Plazenta (9 Röhrchen) wurde partiell aufgetaut und sorgfältig unter Verwendung eines Spatels in Puffer T + 6 % Octylglucosid (die Endkonzentration von OG betrug 3 %) dispergiert. Die Mischung wurde für 5 Stunden oder über Nacht bei 4°C gelagert. Die voluminöse Lösung wurde in 250 ml-Zentrifugenfläschchen überführt und für 1 Stunde mit 13 000 U/min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und für 1 Stunde mit 20 000 U/min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde vereinigt und mit einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h auf die Säulen geladen, die wie oben beschrieben im Tandemmodus angeordnet und in Puffer T voräquilibriert wurden. Am Ende der Beladung wurden die Säulen mit >250 ml Puffer T gespült. Individuelle Säulen wurden dann getrennt, und die gebundenen Integrine wurden mit 0,2 M Essigsäure eluiert, bis der pH des Eluats <3,0 erreichte. Die eluierten Integrinlösungen wurden schnell mit 1 M Trizma-Base auf >pH 7,0 neutralisiert. Die Säule wurde ebenfalls durch Spülen mit Puffer T neutralisiert.
  • Die eluierten Integrinlösungen (ca. 25 ml) wurden unter Verwendung von Aquaside III (Calbiochem) in einem Dialysebeutel mit Grenzwert 5000 auf ca. 1 ml aufkonzentriert. Die konzentrierten Integrine wurden über Nacht gegen Puffer T dialysiert. Die Endausbeute betrug ca. 1 mg für jedes Integrin pro Plazenta.
  • Beispiel 2: Erzeugung von murinen monoklonalen Antikörpern
  • Murine mAbs mit Anti-αvβ3-Aktivität wurden durch die klassische Hybridomtechnologie gemäß Lane et al. erzeugt, 1986, Methods in Enzymol., 121: 183. Allgemein wurden 20-50 μg αvβ3-Rezeptor i.p., s.c. und i.v. an zwei Balb/c-Mäuse verabreicht. Seren aus den immunisierten Tieren wurden auf ihre anti-αvβ3-bindende und neutralisierende Aktivität in den Tests der nachfolgenden Beispiele 3, 4 und 5 untersucht. Mausmilz aus Mäusen, die positive Seren zeigten, wurde mit einer Mausmyelomzelle SP2 gemäß den Verfahren von Lane et al., oben zitiert, verschmolzen. 17 resultierende Hybridomzellinien, die potentielle Anti-humanes αvβ3-Protein-Antikörper sezernieren, wurden erhalten. Die Anti-αvβ3-mAbs wurden aus Kultur durch herkömmliche Verfahren erzeugt und isoliert und in den Tests der folgenden Beispiele untersucht.
  • Tabelle I ist eine Zusammenfassung eines großen Teils der frühen Daten, die aus den nachfolgenden Beispielen 3 bis 12 am murinen mAb LM609 des Standes der Technik und an murinen mAbs dieser Erfindung gesammelt wurden. Die Daten zeigten, daß mAb D12 ein mAb mit vorteilhaftem Aktivitätsprofil war. Der mAb D12, der adäquat in diesen Untersuchungen funktionierte, wurde dann zur Humanisierung wie in Beispiel 13 beschrieben ausgewählt und weiter in Tiermodellen der Beispiele 16 und 17 untersucht. Der D12-mAb kreuzreagiert mit Kaninchen, und deshalb sind nur Kaninchenmodelle der Restenose, Angiogenese oder Atherosklerose für die Untersuchung der Wirksamkeit einsetzbar.
  • Tabelle I
    Figure 00330001
  • Beispiel 3: ELISA-Bindungstest mit αvβ3
  • Die Bindung der verschiedenen Antikörperkonstrukte gegenüber gereinigtem humanem Plazenta-αvβ3-Rezeptorprotein als Antigen (Rezeptor entweder gebunden an die Platte oder an die Perlen über Biotin-Avidin) wurde in einem standardmäßigen Festphasen-ELISA gemessen.
  • In 0,1 M CO3 pH 9,2 verdünntes Antigen wurde an Rundboden-Mikroplatten aus Polystyrol (Dynatech, Immunolon II) für 18 Stunden adsorbiert. Die Vertiefungen wurden dann einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, die 0,05 % Tween 20 enthielt. Antikörper (50 μl/Vertiefung) wurden auf unterschiedliche Konzentrationen in PBS/0,05 % Tween 20 verdünnt und zu Antigen-beschichteten Vertiefungen für 2 Stunden bei Raumtemperatur gegeben. Die Platten wurden viermal mit PBS, das 0,05 % Tween 20 enthielt, unter Verwendung eines Titertek 320-Mikroplattenspülers gespült, gefolgt von Zugabe von 1:10 000 verdünntem HRP-Anti-Maus-IgG (100 μl/Vertiefung).
  • Nach 5-maligem Spülen wurde o-Phenylendiamindihydrochlorid (ODP) (1 mg/ml) hinzugegeben, und die Platten wurden weitere 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,1 M NaF beendet und die Extinktion bei 450 nm unter Verwendung eines Dynatech MR 7000 ELISA-Auslesers ausgelesen.
  • Beispiel 4: ELISA-Bindungstests mit αvβ5, α5β1 und αIIbβ3
  • Im Test von Beispiel 3 positive mAbs wurden unter Verwendung der gleichen Protokolle durchmustert, außer daß das Antigen ein anderer humaner Rezeptor war, αvβ5, α5β1 oder αIIbβ3. Diese Tests wurden durchgeführt, um die Selektivität für das heterodimere Antigen αvβ3 zu bestimmen, im Gegensatz zur Selektivität auf nur eine α- oder β-Untereinheit. Die Ergebnisse dieser Tests sind in der nachfolgenden Tabelle I für alle mAbs aus Beispiel 2 und für LM609 angegeben.
  • Beispiel 5: Neutralisations-ELISA-Test
  • Der Vitronektinrezeptor αvβ3 (0,2 μg/Vertiefung), gereinigt aus humaner Plazenta, wurde zu ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Corning, New York, NY) gegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C inkubiert. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Vertiefungen abgesaugt und in 0,1 ml Puffer A (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, pH 7,4), der 3 % Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, um die nichtspezifische Bindung zu blockieren. Nach Absaugen der Blockierungslösung wurden verschiedene Konzentrationen von mAbs zu den Vertiefungen hinzugegeben, gefolgt von Zugabe von 5 nM biotinyliertem Fibrinogen in 0,1 ml Puffer A, der 0,1 % BSA enthielt. Die Platten wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Im Anschluß an die Inkubation wurden die Vertiefungen vollständig abgesaugt und zweimal mit 100 μl Bindungspuffer gespült. Gebundenes Fibrinogen wurde durch Zugabe von 0,1 ml eines an alkalische Phosphatase konjugierten Anti-Biotin-Antikörpers quantifiziert (Verdünnung 1:2000, Sigma), gefolgt von zweimaligen Spülen mit Bindungspuffer und Zugabe von 100 μl des Substrats p-Nitrophenylphosphat, täglich hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers (Substrat-Kit alkalische Phosphatase, Bio-Rad). Die Kinetik der Farbentwicklung wurde unter Verwendung eines Mikroplattenauslesers verfolgt.
  • Dieser Test detektiert die Inhibierung der Bindung zwischen gereinigtem αvβ3-Rezeptor und seinem Liganden, Fibronectin. Die Ergebnisse dieser Tests sind in der obigen Tabelle I für alle mAbs aus Beispiel 2 und für LM609 angegeben.
  • Beispiel 6: Durchflußcytometrie
  • A. Charakterisierung der murinen mAbs
  • Zur Charakterisierung mehrerer der murinen mAbs, die wie oben beschrieben mit dem bekannten murinen mAb LM609 erhalten wurden, wurde dieser Test zur Detektion der Bindung an den nativen Zelloberflächenrezeptor und der Art-Kreuzreaktivität durchgeführt.
  • Kurz gesagt wurden die Zellen in 10 ml kaltem PBS gewaschen und in kaltem PBS resuspendiert, um 1 × 107 bis 2 × 107 Zellen/ml zu ergeben. Teilmengen von 0,1 ml/Vertiefung werden zu einer Platte mit "V"-Boden mit 96 Vertiefungen gegeben. Dann werden 25 μl primärer Antikörper hinzugegeben. Die Platten werden für 5 Minuten geschüttelt und dann für 25 Minuten auf Eis inkubiert. Die Platten werden für 5 Minuten zentrifugiert und umgedreht. Danach wird der Inhalt jeder Vertiefung in 50 μl kaltem PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert und umgedreht. Die Spülung wird wiederholt, und der Inhalt wird in 50 μl kaltem PBS resuspendiert. Fluoresceinisothiocyanat-(FITC)-markierter sekundärer Antikörper (50 μl) wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Die Platten werden für 5 Minuten geschüttelt und auf Eis im Dunkeln für 20 Minuten inkubiert. 1 μl Propidiumiodid (PI) (1 mg/ml)/PBS wird auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml (1 μg in 0,1 ml) hinzugegeben. Die Inkubation wird 5 Minuten fortgesetzt, gefolgt von zweimaligem Zentrifugieren und Waschen in kaltem PBS.
  • Die Zellen werden in 0,1 ml kaltem PBS resuspendiert und in 12 × 75 klare Falcoln-Röhrchen überführt. Das Volumen wird auf 1 ml eingestellt, und die Zellen werden kalt im Dunkeln gehalten, bis sie durch Durchflußcytometrie (FLOW) ausgelesen werden.
  • Der sekundäre Antikörper Ziege-Anti-Maus-IgG,M,A wird mit FITC 1:25/PBS – 0,2 % BSA – 0,1 % NaN3 (Sigma F1010 Charge #045H8822) markiert und kalt im Dunkeln gehalten, bis er durch Durchflußcytometrie ausgelesen wird.
  • Die Ergebnisse dieser Tests sind in der obigen Tabelle I für alle mAbs aus Beispiel 2 und für LM609 angegeben. Durchflußcytometrie unter Verwendung von glatten Muskelzellen (SMC) von Mensch und Kaninchen zeigte, daß beide mAbs LM609 und D12 eine große Fähigkeit zur Bindung an einen nativen Rezeptor auf der Zelloberfläche besitzen.
  • B. Charakterisierung der murinen und humanisierten Antikörper
  • Die murinen und humanisierten mAbs aus Beispiel 13 wurden durch Durchflußcytometrie unter Verwendung der im wesentlichen wie oben aufgeführten Verfahren auf ihre Fähigkeit zur Detektion von αvβ3-Rezeptor an lebensfähigen humanen Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC), humanen Embryo-Nierenzellen (HEK 293) und glatten Kaninchenmuskelzellen (RSMC) getestet. 8 zeigt, daß die Affinitäten des murinen D12-mAb und der humanisierten HZ-D12 IgG1 und HZ-D12 IgG4 (siehe Beispiel 13) vergleichbar an den humanen Zellen (HUVEC und HEK293) sind. Die humanisierten mAbs verloren etwas ihrer Affinität, wenn sie an den Kaninchen-SMC getestet wurden. Dieses Ergebnis wird erwartet, da D12-mAbs eine 10-fach höhere Affinität gegenüber dem humanen αvβ3- als gegenüber dem Kaninchenrezeptor haben.
  • Beispiel 7: Immunohistologie
    • A. Immunohistologie wurde an Geweben durchgeführt, die hohe Mengen von Rezeptoren exprimieren, wie humane Osteoklastomen. Daten aus der Immunohistologie (humane Osteoklastomen) zeigten, daß D12 eine geringfügig bessere Detektionsfähigkeit für LM609 haben kann. Siehe Tabelle I.
    • B. Target-Validierung Eine anschließende Immunohistologie an anderem humanem Tumorgewebe wie in Tabelle II angegeben zeigte, daß humane Tumoren αvβ3-Rezeptor exprimieren und deshalb gute Ziele für die Immuntherapie mit den humanisierten Antikörpern und anderen Zusammensetzungen dieser Erfindung darstellen. Die D12-mAbs, einschließlich der humanisierten mAbs aus Beispiel 13, erwiesen sich ebenfalls als positiv an einem humanen Blutgefäß. In der nachfolgenden Tabelle II zeigt (+) die Detektion eines Liganden an, zum Beispiel des αvβ3-Rezeptors für den mAb im Gewebe; (-) zeigt die Abwesenheit eines solchen Liganden an.
  • Tabelle II
    Figure 00360001
  • Beispiel 8: BIAcore zur Bestimmung von Affinität zum Rezeptor
  • A. Affinitätsmessungen für D12 und LM609
  • Eine BIAcore-Analyse (Pharmacia) wurde zur Messung der Bindungsaffinität der mAbs D12 und Lm609 (6 nM) mit immobilisiertem αvβ3 durchgeführt. Die Wechselwirkungen von αvβ3 mit D12 und LM609 wurden unter Verwendung der BIAcore-Technologie durch Immobilisierung des Rezeptors an der Sensoroberfläche und Leiten von Lösungen der mAbs über diese Oberfläche untersucht. Beschreibungen der Instrumentierung und Sensoroberflächen werden in Brigham-Burke, Edwards und O'Shannessy, 1992, Analytical Biochem., 205:125-131 beschrieben. Das αvβ3 wurde durch Einfügen des αvβ3 in ein Phospholipidvesikel und Erzeugen einer Hybriddoppelschichtmembran auf einer hydrophoben Sensoroberfläche immobilisiert. Eine vollständigere Beschreibung der Erzeugung von Hybriddoppelschichtmembranen auf BIAcore-Sensoroberflächen wird in Plant et al., 1995, Analyt. Biochem., 226:342-348 bereitgestellt. Proben der mAbs wurden über diese Oberfläche geleitet, und die Geschwindigkeiten, mit der sie banden und dann von der Oberfläche dissoziierten, wurden unter Verwendung der mit dem Instrument gelieferten Software analysiert.
  • 3 ist ein diese Daten darstellendes Diagramm. Kinetische Geschwindigkeitskonstanten und die berechnete Affinitätskonstante (KD) wurden aus der Analyse von drei mAb-Konzentrationen (100, 25, 6 nM) in dreifacher Ausführung abgeleitet. Die BIAcore-Daten zeigten, daß die Bindungsaffinität (KD) von D12 530 pM ist, was vergleichbar mit 460 pM für LM609 ist.
  • B. Affinitätsmessungen von murinen und humanisierten mAbs
  • Der murine D12-mAb wurde wie im Detail in den nachfolgenden Beispielen 13 und 14 beschrieben humanisiert. Humanisierte IgG1- und IgG4-HZ-D12-Antikörper wurden wie in diesen Beispielen beschrieben erzeugt.
  • Affinitätsmessungen von murinem D12 und den humanisierten mAbs wurden durch BIAcore wie im obigen Teil A beschrieben bestimmt. Die in Tabelle III angegebenen Ergebnisse zeigen, daß der Klassenwechsel der humanisierten D12-mAbs keine meßbare Wirkung hatte. Die Daten zeigen, daß die Affinität des D12 bei Humanisierung nicht verändert wurde.
  • Tabelle III
    Figure 00370001
  • Beispiel 9: Bindung und Konkurrenz mit LM609 und Backup-mAbs (Unterstützungs-mAbs)
    • A. LM609 wurde markiert (ORIGEN-TAG-markiert). ORIGEN ist eine elektrolumineszente Einheit, die durch die allgemein bekannte ORIGEN-Analyse detektiert und quantifiziert werden kann. Die Anti-αvβ3-Bindung von LM609 konkurrierte mit anderen Anti-αvβ3-mAbs aus Beispiel 2. Dieser Test untersucht Antikörper auf die Fähigkeit zur Verhinderung der Bindung von 1 μg/ml von LM609 an 1 μg/ml Biotin-markiertes αvβ3 in ORIGEN. Die untersuchten Antikörper sind D12 und die in Tabelle 1 aufgeführten Backup-Antikörper. Die in 2 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen die Bindung von mAbs an den αvβ3-Rezeptor durch Origen für D12 und LM609 mit Mu19 (ein IgG2a) als Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigten, daß 1 μg/ml von Tagmarkiertem LM609 90 % Inhibierung zeigt bei Konkurrenz mit 10 μg/ml, und 70 Inhibierung bei Konkurrenz mit 1 μg/ml von D12-mAbs. Diese Ergebnisse legen nahe, daß D12-mAb an ein ähnliches Epitop wie LM609 am Rezeptor bindet. Diese Daten zeigen, daß D12 eine höhere Bindungsaktivität als LM609 hat.
    • B. Die Ergebnisse von 4 veranschaulichen eine vergleichsweise Bindung der D12- und anderen mAbs aus Beispiel 12 in Konkurrenz mit LM609 für μg/ml αvβ3 in ORIGEN. Die in Tabelle I aufgeführten Antikörper zeigten, daß das Bindungsepitop am αvβ3-Rezeptor sich von LM609 und D12 unterscheidet. Zum Beispiel inhibierte mAb 346 SMC und zeigte gute Durchfluß- und Immunohistologieprofile (Tabelle I), aber konkurriert nicht mit LM609.
    • C. 6 zeigt ebenfalls die Bindungsaffinitäten dieser Antikörper. 25 μl von αvβ3-Biotin und 25 μl von unmarkiertem LM609 oder D12 wurden für 30 Minuten vermischt. 25 μl von Tag-LM609 würden für 30 Minuten hinzugegeben, gefolgt von 50 μl von 0,6 ng/ml magnetischen Streptavidin-Perlen für 15 Minuten. Die Mischung wurde dann an einem ORIGEN-Analysator ausgelesen. Die Ergebnisse sind im Balkendiagramm von 6 dargestellt. D12 zeigte eine durchgehend höhere Bindungsaffinität für den Rezeptor als LM609.
    • D. 7 veranschaulicht einen anderen Test, in dem die Inhibierung der Bindung von 1 μg/ml D12 an 1 μg/ml αvβ3-Rezeptor durch Vorinkubation mit LM609 oder D12 bestimmt wurde. Erneut wurde gezeigt, daß D12 eine höhere Bindungsaffinität als LM609 hat.
  • Beispiel 10: Migrationstest von vaskulären glatten Muskelzellen (sMC)
  • Die Migration von glatten Muskelzellen (SMC) aus dem Medium in das Wundgebiet zum Start des Wachstums der Neointima ist eine wesentliche Umbaureaktion im Anschluß an eine vaskuläre Verletzung. Die Inhibierung der SMC-Wanderung schwächt die Neointimabildung ab. Die vaskuläre SMC-Wanderung wird durch den humanen αvβ3-Rezeptor vermittelt, der in VSMC exprimiert und im Anschluß an vaskuläre Verletzung auf reguliert wird. Osteopontin, ein Ligand des humanen αvβ3-Rezeptors, wird im Anschluß an Angioplastie aufreguliert und fördert die VSMC-Wanderung über das Integrin. Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Fähigkeit eines Antikörpers gegen humanes αvβ3 zur Inhibierung der VSMC-Wanderung in vitro zu zeigen.
  • Glatte Muskelzellen aus Aorta von Mensch oder Kaninchen wurden verwendet. Die Zellwanderung wurde in einer Transwell-Zellkulturkammer unter Verwendung einer Polycarbonatmembran mit Poren von 8 μm (Costar) überwacht. Die untere Oberfläche des Filters war mit Vitronektin oder Osteopontin beschichtet. Die Zellen wurden "Difco's minimal essential medium" (DMEM), ergänzt mit 0,2 % BSA, mit einer Konzentration von 2,5-5,0 × 106 Zellen/ml suspendiert und mit Testantikörper in verschiedenen Konzentrationen für 20 Minuten bei 20°C vorbehandelt. Das Lösungsmittel allein wurde als Kontrolle verwendet. 0,2 ml der Zellsuspension wurden in das obere Kompartiment der Kammer gegeben. Das untere Kompartiment enthielt 0,6 ml DMEM, ergänzt mit 0,2 % BSA. Die Inkubation wurde bei 37°C in einer Atmosphäre aus 95 % Luft/5 % CO2 für 24 Stunden durchgeführt.
  • Nach der Inkubation wurden die nicht-gewanderten Zellen auf der oberen Oberfläche des Filters durch vorsichtiges Schaben entfernt. Das Filter wurde dann in Methanol fixiert und mit 10 % Giemsa-Färbung angefärbt. Die Wanderung wurde gemessen entweder durch a) Zählen der Anzahl von Zellen, die zur unteren Oberfläche des Filters gewandert waren, oder durch b) Extrahieren der angefärbten Zellen mit 10 % Essigsäure, gefolgt von Bestimmung der Extinktion bei 600 nm.
  • Die Inhibierung der SMC-Wanderung (Mensch und Kaninchen) zeigte, daß LM609 wirksamer als D12 ist. Siehe Tabelle I.
  • In einem anschließenden Test und vor dem Testen der Wirksamkeit des murinen mAb D12 und des humanisierten HZ-D12 (IgG1) aus Beispiel 13 im Kaninchenmodell der Restenose wurden diese mAbs erneut auf Inhibierung der Kaninchen-SMC-Wanderung getestet. Die in 9 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das murine D12 eine höhere Wirksamkeit im Vergleich mit seiner humanisierten HZ-D12 (IgG1)-Version hat.
  • Beispiel 11: HEK293-Zelladhäsion zur Bestimmung der Inhibierung der Adhäsion
  • Humane Embryo-Nierenzellen (HEK293-Zellen) wurden von ATCC erhalten (Katalognummer CRL 1573). Die Zellen wurden in "Earl's minimal essential medium" (EMEM) gezüchtet, das Earl-Salze, 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin enthielt.
  • Ein 3,2 kb EcoRI-KpnI-Fragment der αv-Untereinheit und ein 2,4 kb XbaI-XhoI-Fragment der β3-Untereinheit wurden in die EcoRI-EcoRV-Klonierungsorte des pCDN-Vektors, der einen CMV-Promotor und einen selektierbaren G418-Marker enthält, durch stumpfendige Ligation inseriert. Zur stabilen Expression wurden 80 × 106 HEK293-Zellen mit αvβ3-Konstrukten (20 μg DNA von jeder Untereinheit) unter Verwendung eines Gene Pulser [P. Hensley et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:23949-23958] elektrotransformiert und in 100 mm-Platten ausplattiert (5 × 105 Zellen/Platte). Nach 48 Stunden wurde das Wachstumsmedium mit 450 μg/ml Geneticin (G418-Sulfat, GIBCO-BRL, Bethesda, MD) ergänzt. Die Zellen wurden in Selektionsmedium gehalten, bis die Kolonien groß genug zur Untersuchung waren.
  • ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen von Corning wurden über Nacht bei 4°C mit 0,1 ml von humanem Vitronektin (0,2 μg/ml in RPMI-Medium) vorbeschichtet. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden die Platten einmal mit RPMI-Medium gespült und mit 3,5 % BSA in RPMI-Medium für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt. Transfizierte 293-Zellen wurden in RPMI-Medium resuspendiert, ergänzt mit 20 mM HEPES, pH 7,4 und 0,1 % BSA, mit einer Dichte von 0,5 × 106 Zellen/ml. 0,1 ml Zellsuspension wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben und für 1 Stunde bei 37°C in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener αvβ3-Antagonisten inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden 0,025 ml einer 10%igen Formaldehyd-Lösung, pH 7,4, hinzugegeben, und die Zellen wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixiert. Die Platten wurden dreimal gespült, und 0,2 ml RPMI-Medium und die anhaftenden Zellen wurden mit 0,1 ml von 0,5 %igem Toluidinblau für 20 Minuten bei Raumtemperatur angefärbt.
  • Überschüssiger Farbstoff wurde durch umfassendes Spülen mit entionisiertem Wasser entfernt. Das in die Zellen aufgenommene Toluidinblau wurde durch Zugabe von 0,1 ml von 50%igem Ethanol, das 50 mM HCl enthielt, eluiert. Die Zelladhäsion wurde bei einer optischen Dichte von 600 nm an einem Mikrotiterplattenleser (Titertek Multiskan MC, Sterling, VA) quantifiziert.
  • Die Neutralisation der Rezeptorinhibierung der Zelladhäsion zeigte, daß D12, andere Backup-mAbs aus Beispiel 2 und LM609 die Zelladhäsion inhibieren (siehe Tabelle I und 5).
  • Beispiel 12: In-vivo-Test mit Hühnerembryo-Chorion-Rllantois-Membran (CAM) auf Angiogenese
  • Der Hühnerembryo-Chorion-Allantois-Membran-(CAM)-Test wurde zur Bewertung der Rolle von αvβ3-Antagonisten in der Angiogenese verwendet. Das humane αvβ3-Protein wird in der Vaskularisation während der Angiogenese exprimiert und aufreguliert. Die Blockade des humanen αvβ3-Rezeptors würde die Endothelzell-(EC)-Wanderung inhibieren, ein Schlüsselschritt im angiogenen Prozeß, und fördert die EC-Apoptose in Neugefäßen ohne Beeinflussung reifer Blutgefäße. LM609 oder D12 inhibiert die durch β-Fibroblastenwachstumsfaktor (β-FGF) oder spontan auf der CAM des wachsenden Embryos induzierte Angiogenese. Die Schlüsselmerkmale im Verfahren für den CAM-Test werden nachfolgend beschrieben:
    Der CAM-Test wird mit der CAM von 10 Tage alten befruchteten Hühnereiern durchgeführt. Whatman #1-Filter mit 5 mm Durchmesser werden in 3 mg/ml Cortisonlösung (hergestellt in 95%igem Ethanol) getränkt und luftgetrocknet. Cortison wird zur Verringerung der inflammatorischen Reaktion auf die Filter verwendet Die Filter werden in 1-6 μg/ml Lösung von β-FGF gesättigt, um die Angiogenese zu stimulieren (Hepes-gepufferte Kochsalzlösung (HBSS) wird als Pufferkontrolle verwendet), und auf eine gefäßfreie Zone in der CAM gegeben.
  • LM609 oder D12 (ca. 100 μg) werden in einem Volumen von <20 μl auf die Filterscheiben an den Tagen 0, 1, 2 und 3 nach der β-FGF-Stimulation aufgetragen. Am Tag 4 werden die CAMs herausseziert, und die Angiogenese wird durch Zählen der Anzahl der Gefäßteilungen unter dem Filter unter Verwendung eines Stereomikroskops quantifiziert.
  • Dieser Test zeigt eine positive Korrelation zwischen der Bindungsaffinität an den Rezeptor und der Inhibierung der EC-Wanderung. Obwohl dieser Test relativ schwierig durchzuführen ist, zeigte er, daß der humane αvβ3-Rezeptor eine Rolle in der Angiogenese spielt. Es wird gezeigt, daß die Anti-αvβ3-Antikörper dieser Erfindung die β-FGF-induzierte Angiogenese in diesem Test inhibieren. Siehe Tabelle I.
  • Beispiel 13: Erzeugung von humanisiertem D12
  • A. Erzeugung variabler Regionen der schweren und leichten Kette
  • Eine Humanisierungsstrategie wurde übernommen, um einen maximal humanisierten mAb zu erhalten, der das vollständige Antigenbindungsstreben beibehielt. Die cDNA der variablen schweren Kette (VH) und variablen leichten Kette (VK) des murinen mAb D12 wurden kloniert und sequenziert. Die Sequenz von VHD12 ist den SEQ ID NOS:1 und 2 gezeigt, wobei die CDRs wie beschrieben identifiziert sind, und die Sequenz von VKD12 ist den SEQ ID NOS:6 und 7 mit den identifizierten CDRs gezeigt.
  • Im Anschluß an die cDNA-Klonierung und Sequenzanalyse wurde festgestellt, daß VH D12 und VK D12 höchst ähnlich der Kabat VH-Untergruppe I [SEQ ID NO:3] bzw. Kabat VK-Untergruppe III [SEQ ID NO:8] sind. Humanisierte VH- und VL-Regionen wurden durch Kombinieren der Gerüstregionen der Consensus-Sequenzen der humanen V-Region zusammen mit den CDR-Regionen von D12 synthetisiert.
  • Die molekulare Modellierung von D12 unter Verwendung bekannter Kristallstrukturen zeigt bestimmte VH- und VL-Gerüstreste, die einen Kontakt mit CDR-Schleifen herstellen können und dadurch ihre Konformation beeinflussen. Solche Gerüstreste können deshalb direkt zur Bildung einer besonderen Antigenspezifität beitragen. Sieben solche murinen VH-Gerüstreste und drei murine VK-Gerüstreste wurden in die humanen Consensus-Gerüstregionen eingeführt, was zu D12HZHC 1-0 [SEQ ID NO:4 und 5] und D12HZLC 1-0 [SEQ ID NO:9 und 10] führte.
  • B. cDNA-Sequenzanalyse der schweren und leichten Kette von αvβ3-D12-mAb
  • Vollständige RNA wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagens (Life Technologies Katalognummer 15596-026) gemäß dem Herstellerprotokoll gereinigt. RNA wurde mit Isopropanol ausgefällt und in mit Wasser behandeltem Diethylpyraocarbonat (DEPC) gelöst. Poly A+-RNA wurde unter Verwendung des Poly-A Quik-mRNA-Isolationskits (Stratagene Katalognummer 200349) gemäß dem Herstellerprotokoll isoliert.
  • 10 Teilmengen von 100 ng RNA wurden mit einem RT-PCR-Kit gemäß Herstelleranweisungen (Boehringer Mannheim, Katalognummer 1483-188) unter Verwendung eines dT-Oligonukleotids zum Primen revers transkribiert. Für die schwere Kette wurden PCR-Amplifikationen von 5 RNA/DNA-Hybriden für 25 Zyklen unter Verwendung eines Maus-IgG1-Gelenkprimers 5' TCT-TGT-CCA-CCT-TGG-TGC-TGC-TG 3' [SEQ ID NO:22] und eines degenerierten Primers der schweren Kette auf Basis der N-terminalen Proteinsequenz 5' (G/C)(A/T)(G/A)-GT(C/T)-CA(G/A)-CT(G/T/C)-CA(A/G)-CA 3' [SEQ ID NO:23] durchgeführt.
  • In ähnlicher Weise wurden für die leichte Kette PCR-Amplifikationen von fünf RNA/DNA-Hybriden für 25 Zyklen unter Verwendung eines Maus-kappa-Primers 5' GCA-CCT-CCA-GAT-GTT-ACC-TGC 3' [SEQ ID NO:24] und eines Primers auf Basis der N-terminalen Proteinsequenz 5' GAC-ATT-GTG-CTG-ACT-CAG-TCT-CCA-GCC-A 3' [SEQ ID NO:25] durchgeführt. Die PCR-DNA würde an einem 0,8%igen Agarosegel analysiert. PCR-Inserte der geeigneten Größe, d.h. ca. 700 bp für die schwere Kette und ca. 700 bp für die leichte Kette, wurden durch eine Modifikation des Sanger-Verfahrens sequenziert.
  • Die Sequenz von allen 10 Mitgliedern der schweren und leichten Ketten wurden verglichen, um eine Consensus-Sequenz der variablen Region der schweren Kette von D12 zu erzeugen, veranschaulicht in SEQ ID NOS:4 und 5, und eine Consensus-Sequenz der variablen Region der leichten Kette von D12, veranschaulicht in den SEQ ID NOS:9 und 10. In den SEQ ID NOS:4, 5, 9 und 10 sind die CDRs identifiziert; und die ersten 17 Basen der DNA-Sequenz sowohl für die schweren als auch leichten Ketten sind durch PCR-Primer erzeugt. Jedoch ist die translatierte Proteinsequenz genau.
  • C. Humanisierung von D12
  • Der humanisierte D12-Antikörper wie hier beschrieben besteht aus dem synthetischen Consensus-D12HZHC 1-0 der schweren Kette [SEQ ID NOS:4 und 5] und dem synthetischen Consensus-D12HZLC 1-0 der leichten Kette [SEQ ID NOS:9 und 10]. Der Antikörper wurde wie folgt konstruiert.
  • i. Konstruktion von D12HZHC 1-0
  • Eine humanisierte schwere Kette der synthetischen variablen Region wurde unter Verwendung eines Consensus-Gerüsts der humanen Untergruppe I wie von Kabat definiert und der zuvor beschriebenen CDRs der murinen schweren Kette von D12 geschaffen. Sieben murine Gerüst-Aminosäuresubstitutionen, die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden bei den Aminosäuren 28, 48, 67, 68, 70, 72 und 74 von SEQ ID NO:5 eingeführt. Vier überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt, die die folgenden Sequenzen codieren:
    Figure 00440001
  • Bei Wiederverschmelzen und Verlängerung codieren die Oligonukleotidsequenzen für Aminosäuren, die die Region der variablen Region der humanisierten schweren Kette darstellen, die verändert wird. SEQ ID NOS:11 bzw. 12 sind die DNA- und Aminosäuresequenzen der Zwischenstufe der synthetischen schweren Kette, d.h. sie stellen die Region der variablen Region der schweren Kette von D12 dar, die verändert wird. Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung der PCR-Primer SBA883: TGCAACTAGT GCAGTCTGGA GCTGAGGT [SEQ ID NO:30] und SBA884: CCAGGGTACC TTGGCCCCAG [SEQ ID NO:31] amplifiziert und in den pCR2000-Vektor (TA-Klonierungskit, Invitrogen, Katalognummer K2000-01) ligiert und nach einem SpeI-KpnI-Restriktionsverdau isoliert.
  • Dieses DNA-Fragment wurde in den mit SpeI und KpnI restriktionsverdauten Vektor F9HZHC1-1 ligiert. F9HZHC1-1 ist eine Variante der Plasmide pCDN [A. Nambi et al., 1994, Mol. Cell. Biochem., 131: 75-85] und pPHZHC2-3pcd [WO 94/05690]. Diese varianten pCD-Plasmidvektoren enthalten allgemein ein beta-Lactamasegen, einen SV40 Replikationsursprung, eine Cytomegalovirus-Promotorsequenz, eine ausgewählte humanisierte schwere Kette, ein PolyA-Signal für das Rinderwachstumshormon, einen Betaglobinpromotor, ein Dihydrofolatreduktasegen und ein anderes BGH-Sequenz-polyA-Signal in einem pUC19-Hintergrund. F9HZHC1-1 enthält ferner die Campath-Signalsequenz, die die ersten 3 Aminosäuren der reifen schweren Kette einschließt, den Rest eines humanen Consensus-Gerüsts 4 und die konstante Region von humanem IgG1. Der F9HZHC1-1-Vektor enthält eine einzelne Aminosäuremutation des pFHZHC2-3pcd-Vektors, worin der Endrest von Gerüst 2 (die in der internationalen Anmeldung angegebene Aminosäure 49) von Ser zu Ala mutiert war. Bei Transfektion und Kultivierung in einer Wirtszelle erzeugt der resultierende Vektor pD12HZHC1-0pcd die in SEQ ID NOS:4 und 5 gezeigte humanisierte schwere Kette D12HZHC1-0.
  • ii. Konstruktion von D12HZLC1-0
  • Eine humanisierte leichte Kette der synthetischen variablen Region wurde unter Verwendung eines Consensus-kappa-Gerüsts der humanen Untergruppe III wie von Kabat definiert und der zuvor beschriebenen CDRs der murinen leichten Kette von D12 geschaffen. Drei Gerüst-Aminosäuresubstitutionen, die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten, wurden an den Aminosäureresten 1, 49 und 60 vorgenommen [SEQ ID NOS:9 und 10]. Vier überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt:
    Figure 00450001
  • Bei Wiederverschmelzung und Verlängerung codieren diese Sequenzen für die Aminosäuren, die den Teil der variablen Region der leichten Kette darstellen, der verändert ist, einschließlich der ersten fünf Aminosäuren der humanen konstanten kappa-Region. SEQ ID NOS:13 bzw. 14 sind die DNA- und Aminosäuresequenzen der Zwischenstufe der synthetischen leichten Kette, d.h. sie stellen den Teil der variablen Region der leichten Kette von D12 dar, der verändert ist, einschließlich der ersten fünf Aminosäuren der humanen konstanten kappa-Region. Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung der PCR-Primer SBA1277: GACATAGTAC TGACTCAGTC TCCAGGC [SEQ ID NO:36] und SBA1278: GGCGCCGCCA CAGTACG [SEQ ID NO:37] amplifiziert und in den oben beschriebenen pCR2000-Vektor ligiert und nach einem ScaI-NarI-Restriktionsverdau isoliert.
  • Das DNA-Fragment, das für die Campath-Signalsequenz codiert [SEQ ID NOS: 18 und 19], einschließlich der drei ersten Aminosäuren der variablen Region, wurde durch PCR des Vektors F9HZLC1-1 mit bestimmten Primern hergestellt. Der Vektor F9HZLC1-1 ist eine andere Variante der pCDN-Vektoren [Nambi et al., oben zitiert] und pFHZLCL-1-pcn [WO 94/05690]. Diese varianten pCN-Plasmidvektoren enthalten allgemein ein beta-Lactamasegen, einen SV40-Replikationsursprung, eine Cytomegalovirus-Promotorsequenz, eine ausgewählte humanisierte leichte Kette, ein polyA-Signal für das Rinderwachstumshormon, einen Betaglobin-Promotor, ein Neomycinresistenzgen und ein anderes BGH-Sequenz-polyA-Signal in einem pUC19-Hintergrund. F9HZLC1-1 enthält ferner den Rest eines humanen Gerüsts 4 und eine konstante kappa-Region und eine einzelne Aminosäuremutation des pFHZLCL-1-pcn-Vektors in Gerüst 2 (von Ser zu Pro). Die verwendeten PCR-Primer waren SB8694: GGAGACGCCA TCGAATTCTG A [SEQ ID NO:38] und SBA1224: AGACTGTGTC AGTACTATGT CGGAGTGGAC ACC [SEQ ID NO:39], und F9HZLC1-1 wurde mit EcoRI und ScaI restriktionsverdaut. Diese zwei Fragmente wurden in den Vektor pFHZLCL-1-pcn ligiert, mit EcoRI und NarI restriktionsverdaut. Der resultierende Vektor pD12HZLC1-1-pcn erzeugt bei Kultivierung in einer Wirtszelle humanisiertes D12HZLC1-0 [SEQ ID NOS:9 und 10].
  • D. Expression von humanisiertem Antikörper in Säugetierzellen
  • Der Vektor der schweren Kette pD12HZHC-1-Opcd und der Vektor der leichten Kette pD12HZLC1-1-pcn, oben beschrieben, wurden zur Erzeugung von Antikörper HuD12 in COS-Zellen und CHO-Zellen verwendet.
  • Zur anfänglichen Charakterisierung wurden die schweren und leichten Ketten von humanisiertem HuD12 in COS-Zellen exprimiert, im wesentlichen wie beschrieben in "Current Protocols in Molecular Biology" (herausgegeben von F.M. Ausubel et al. 1988, John Wiley & Sons, Bd. 1, Abschnitt 9.1). Kurz gesagt wurden die COS-Zellen mit 10 μg von jedem Plasmid cotransfiziert. Am Tag 1 nach der Transfektion wurde das Kulturwachstumsmedium gegen ein serumfreies Medium ausgetauscht, das am Tag 3 gewechselt wurde. Das serumfreie Medium war eine Eigenformulierung, aber zufriedenstellende Ergebnisse werden unter Verwendung von DMEM erhalten, ergänzt mit ITSTM-Vormischung (Insulin, Transferrin, Selen-Mischung – Collaborative Research, Bedford, MA) und 1 mg/ml BSA. Der mAb wurde aus dem konditionierten Medium von Tag 3 und Tag 5 durch standardmäßige Protein A-Affinitätschromatographieverfahren isoliert und präpariert (z.B. wie beschrieben in "Protocols in Molecular Biology"), wobei zum Beispiel ein Prosep A-Affinitätsharz (Bioprocessing Ltd., UK) verwendet wurden.
  • Das humanisierte D12 wurde als ein γ1,kappa-Molekül in transient transfizierten COS-Zellen exprimiert. Es wurde festgestellt, daß die Überstände dieser Kultur an den αvβ3-Rezeptor sowohl im oben beschriebenen ELISA- als auch im BIAcore-Test binden.
  • Zur Erzeugung größerer Mengen der HuD12-mAbs (100-200 mg) wurden die Plasmide in ein eigenes CHO-Zellsystem eingeführt, die CHO-E1a-Zellinie. Diese Zellinie liefert größere Mengen von mAbs (jeweils ca. 10 mg) und ermöglicht die Untersuchung des Aktivitätsprofils von sowohl chimären als auch humanisierten Antikörpern. Jedoch werden ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von dhfr--CHO-Zellen wie zuvor beschrieben erhalten werden [P. Hensly et al., oben zitiert]. Kurz gesagt werden insgesamt 30 μg von linearisierter Plasmid-DNA (jeweils 15 μg der Plasmide der schweren oder leichten Kette) in 1 × 107 Zellen elektroporiert. Die Zellen werden zunächst in nukleosidfreiem Medium in Platten mit 96 Vertiefungen selektiert. Nach 3 bis 4 Wochen wird Medium aus wachtumspositiven Vertiefungen auf humanes Immunglobulin unter Verwendung des ELISA-Tests aus Beispiel 3 durchmustert. Die am höchsten exprimierenden Kolonien werden erweitert und in zunehmenden Konzentrationen von Methotrexat zur Amplifikation der transfizierten Vektoren selektiert. Der Antikörper wird aus konditioniertem Medium durch Standardverfahren unter Verwendung von Protein A-Affinitätschromatographie (Protein A-Sepharose, Pharmacia) gefolgt von Größenausschlußchromatographie (Superdex 200, Pharmacia) gereinigt.
  • Die Konzentration und die Antigenbindungsaktivität des eluierten Antikörpers werden durch die ELISA-Tests aus Beispielen 3 und 4 gemessen. Die Antikörper enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und weiter durch Größenausschlußchromatographie gereinigt.
  • Zwei solche humanisierten D12-Antikörper wurden erzeugt, der oben beschriebene IgG1-Antikörper und eine IgG4-Version (hergestellt analog wie oben beschrieben, aber unter Verwendung einer konstanten Region von IgG4). Das HZ-D12 (IgG1) wird in einer -stabilen CHO-Expressionszellinie erzeugt. Eine 50 nM MTX-Linie wurde erzeugt, die akzeptabel zur Herstellung der Phase I ist (300 mg/l). Zusätzliche Linien, d.h. eine 150 nM MTX-Linie (400 mg/l) und 450 nM MTX-Linie, werden derzeit ausgewertet. Murines und humanisiertes D12 kreuzreagiert mit VSMC aus Pavian und inhibiert SMC. Murines und humanisiertes D12 inhibiert die humane EC-Wanderung.
  • Beispiel 14: Konstruktion von D12HZREI
  • Ein zweites Konstrukt hat eine leichte Kette auf der Basis des REI-Consensus-Gerüsts, um eine alternative leichte Kette für den Fall einer instabilen Expression in Erzeugungszellinien für humanisiertes D12 bereitzustellen. Die primäre Variante führt fünf murine Gerüstreste ein, von denen vorhergesagt wird, daß sie Kontakt mit unterschiedlichen VD CDR-Resten machen.
  • Kurz gesagt wurde eine synthetische humanisierte kappa-Kette auf Basis eines modifizierten Gerüsts von humaner REI-kappa-Kette und der zuvor beschriebenen D12-CDRs geschaffen. SEQ ID NO: 15 ist die Aminosäuresequenz des modifizierten Gerüsts der humanen REI-kappa-Kette. Fünf Donor- (murines D12) Gerüstreste wurden an den in Modellierungsexperiment identifizierten Positionen eingeführt, die die CDR-Darstellung beeinflussen könnten. Vier überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt:
    Figure 00480001
  • Wenn diese synthetischen Oligonukleotidsequenzen wiederverschmolzen und verlängert wurden, codieren sie für Aminosäuren, die den veränderten Teil der variablen Region der leichten Kette darstellen, einschließlich des hochkonservieren KpnI-Orts, der im Jk-Gensegment gefunden wird. SEQ ID NO:16 veranschaulicht die DNA-Sequenz des Jk-Gensegments, und SEQ ID NO:17 ist die Aminosäuresequenz seines Genprodukts.
  • Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung der zwei PCR-Primer SBA 3170: 5' gac atA GTA CTG ACT CAG TCT CCA AGC 3' [SEQ ID NO:44] und SBA 3171: 5' ttc cac ctt GGT ACC CTG GCC GAA CGT GAA AGG 3' [SEQ ID NO:45] amplifiziert und in den oben beschriebenen pCR200-Vektor ligiert und nach ScaI-KpnI-Verdau isoliert.
  • Ein der CAMPATH-Signalsequenz entsprechendes DNA-Fragment, veranschaulicht in SEQ ID NOS:18 und 19, wurde im Anschluß an EcoRI-ScaI-Verdau des Vektors der leichten Kette pD12HZLC1-1-pcn, oben beschrieben, isoliert. Diese zwei Fragmente wurden zusammenligiert mit dem großen Fragment, das aus dem gleichen Vektor isoliert wurde, verdaut mit EcoRI und KpnI, der die konstante kappa-Region enthält. Die resultierende Sequenz war diejenige der synthetischen leichten Kette D12HZREI. SEQ ID NOS:20 und 21 sind die DNA-Sequenz bzw. Aminosäuresequenz der synthetischen humanisierten kappa-Kette auf Basis eines modifizierten Gerüsts der humanen REI-kappa-Kette, D12HZLCREI. Restriktionsenzym-Endonuklease-Spaltorte befinden sich in den Sequenzen wie folgt: ScaI (AGTACT; Nukleotide 6-11); AvrII (CCTAGG; Nukleotide 130-135); EcoRI (GAATTC; Nukleotide 273-278) und KpnI (GGTACC; Nukleotide 310-306).
  • Beispiel 15: In-vivo-Kaninchen-Restenosetest
  • Wie in Beispiel 10 beschrieben wird Osteopontin, ein Ligand des humanen αvβ3-Rezeptors, im Anschluß an Angioplastie aufreguliert und fördert die VSMC-Wanderung über das Integrin. Antikörper gegen den humanen αvβ3-Rezeptor sollten die Neointimabildung in vivo verhindern.
  • Das Kaninchenmodell funktioniert wie folgt. Am Tag 0 werden Plasmaproben aus normalen Kaninchen mit 3 kg Gewicht entnommen. Die Kaninchen werden dann ruhiggestellt, und die Tiere erhalten eine Verletzung (d.h. endotheliale Freilegung der Hüftarterie). Die Freilegung des Endothels wird mit drei Passagen eines 3fr Embolektomie-Ballonkatheters erreicht. Pilotstudien zeigen, daß das Läsionsauftreten 100 % ist und 10 bis 12 Kaninchen in jeder Gruppe benötigt werden, um eine 35%ige Reduktion der neointimalen Fläche nachzuweisen.
  • Der murine D12-mAb wurde an die Kaninchen an den Tagen 1, 2 und 3 verabreicht. Die Dosis betrug 9 oder 3 mg/kg, intravenös verabreicht. Plasmaproben wurden für die mAb-Bestimmungen an den Tagen 0, 1, 2 und 21 entnommen, und eine morphometrische Analyse wird an aus jeder Arterie präparierten histologischen Schnitten durchgeführt. Die neointimale Bildung und Gefäßumformung wird dann für 21 Tage nach der Verletzung quantifiziert.
  • Die Zunahme der Lumenfläche und die gesamte Gefäßfläche sind indikativ für eine Umformung nach Verletzung.
  • 10A–10D veranschaulichen die Ergebnisse von zwei getrennten Studien. 10A und 10C messen die Lumenfläche, behandelt mit der Kontrolle oder dem D12-mAb am Tag 21 in zwei Studien (2 Dosen). 10B und 10D messen die gesamte Gefäßfläche, behandelt mit der Kontrolle oder dem D12-mAb in zwei Studien (2 Dosen). Diese Daten zeigen, daß murine D12-mAbs Wirksamkeit im Kaninchenmodell der Restenose zeigen, was zu einer positiven Umformung des verletzten Gefäßes (Lumenvergrößerung) führt.
  • Beispiel 16: SCID-Modell von Krebs/Angiogenese
  • Das schwere kombinierte immundefiziente Maus-(SCID)-Modell, in dem humane Haut transplantiert und nicht abgestoßen wird [siehe z.B. P.W. Soballe et al., 1996, Cancer Res., 56:757-764], kann als Quelle für angiogene Neovaskularisation dienen und kann anschließend humanen Tumor akzeptieren. Dieses Modell wird zur Wirkungsuntersuchung der D12-mAbs und HuD12-Antikörper verwendet.
  • Kurz gesagt wurde in diesem Modell humane Haut auf die Maus transplantiert. Humane Tumorzellen werden in das humane Hauttransplantat injiziert und das Wachstum des Tumors gemessen. Das humane Hauttransplantat liefert die für das Tumorwachstum erforderliche humane Neovaskularisation. Die Tiere wurden mit murinem D12 oder humanisiertem D12 behandelt, und die Verzögerung im Tumorwachstum im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen wurde beobachtet.
  • Die Inhibierung des Tumorwachstums zeigte, daß D12-mAbs (human anti-αvβ3-positiv, murin anti-αvβ3-negativ) eine Rolle in der Inhibierung von αvβ3-abhängiger Angiogenese spielen. Vorläufige Daten zeigten, daß das Tumorwachstum in den mit den D12-mAbs behandelten Tieren verzögert wurde. Diese Daten stützen die Hypothese, daß die Behandlung von "Angiogenese" Tumorwachstum verhindern wird.
  • Die nachfolgende Tabelle IV zeigt, daß die humane Haut gemäß Immunohistologie keine positive Anti-αvβ3-Anfärbung hat. Wenn jedoch der Tumor in die Haut wächst, zeigt die Neovaskularisation positives D12, was anzeigt, daß αvβ3 in dieser Tumorschädigung exprimiert wird.
  • Tabelle IV
    Figure 00510001
  • Die Ergebnisse der Beispiele 3 bis 16 belegen, daß die D12- und HuD12-Antikörper eine wirksame Anti-Rezeptoraktivität in vitro haben und prophylaktische und therapeutische Wirksamkeit in vivo in Tiermodellen zeigen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
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  • Figure 00620001
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  • Figure 00660001
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  • Figure 00680001
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  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001

Claims (2)

  1. Humanisierter Antikörper, der spezifisch reaktiv gegenüber dem humanen αvβ3-Proteinrezeptor ist und den Rezeptor neutralisieren kann, umfassend eine schwere Kette mit SEQ ID NO:5 und eine leichte Kette mit SEQ ID NO:10.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper gemäß Anspruch 1 umfaßt.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004059357A1 (de) * 2004-12-03 2006-06-14 Universität Leipzig Antikörper, welcher die Interaktion von humanem Thy-1 und dessen Liganden blockiert, sowie dessen Verwendung

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69828154T2 (de) * 1997-03-12 2005-06-23 Smithkline Beecham Corp. Anti-alphavbeta3 humanizierte monoklonale antikörper
GB9823071D0 (en) * 1998-10-21 1998-12-16 Affibody Technology Ab A method
US6160099A (en) * 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US7306925B2 (en) 2001-11-09 2007-12-11 Vanderbilt University Phage antibodies to radiation-inducible neoantigens
US7906102B2 (en) 2001-10-03 2011-03-15 Vanderbilt University Ligands to radiation-induced molecules
AR045563A1 (es) 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
US7674884B2 (en) * 2003-12-10 2010-03-09 Novimmune S.A. Neutralizing antibodies and methods of use thereof
US7351739B2 (en) 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
CA2611519A1 (en) 2005-06-17 2006-12-28 Tolerx, Inc. Ilt3 binding molecules and uses therefor
CA2655903A1 (en) * 2006-06-19 2008-08-07 Tolerx, Inc. Ilt3 binding molecules and uses therefor
EP2043603A4 (de) 2006-07-11 2010-10-27 Arubor Corp Prävention und therapie von rhinosinusitis mit proinflammatorischen zytokinhemmern
HUE048024T2 (hu) 2006-08-10 2020-05-28 Roy C Levitt Anakinra bronchiolitis obliterans szindróma kezelésében való alkalmazásra
WO2010002862A2 (en) * 2008-07-01 2010-01-07 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins
WO2013019730A1 (en) * 2011-07-29 2013-02-07 The Washington University Antibodies to tip-1 and grp78
WO2016014939A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Washington University Compositions targeting radiation-induced molecules and methods of use thereof
WO2018148595A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Washington University Antibodies to tip1 and methods of use thereof
CA3172092A1 (en) * 2020-04-23 2021-10-28 David Cheresh Compositions and methods for treating cancer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989005155A1 (en) * 1987-11-19 1989-06-15 Scripps Clinic And Research Foundation Monoclonal antibody against the rgd-directed adhesion receptor of endothelial cells
US5578704A (en) * 1992-04-03 1996-11-26 Genentech, Inc. Antibody to osteoclast alphavbeta3 ntegrin
RU2126395C1 (ru) * 1994-03-08 1999-02-20 Американ Хоум Продактс Корпорейшн Производные тиазолидиндиона или их фармацевтически приемлемые соли, способ лечения гипергликемии у млекопитающего, фармацевтическая композиция
US5753230A (en) * 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
DE69828154T2 (de) * 1997-03-12 2005-06-23 Smithkline Beecham Corp. Anti-alphavbeta3 humanizierte monoklonale antikörper
US6160099A (en) * 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004059357A1 (de) * 2004-12-03 2006-06-14 Universität Leipzig Antikörper, welcher die Interaktion von humanem Thy-1 und dessen Liganden blockiert, sowie dessen Verwendung
DE102004059357B4 (de) * 2004-12-03 2009-02-12 Universität Leipzig Antikörper, welcher die Interaktion von humanem Thy-1 und dessen Liganden blockiert, sowie dessen Verwendung
DE102004059357B8 (de) * 2004-12-03 2009-12-03 Universität Leipzig Antikörper, welcher die Interaktion von humanem Thy-1 und dessen Liganden blockiert, sowie dessen Verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
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US7504102B2 (en) 2009-03-17
CA2284518A1 (en) 1998-09-17
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AU6702998A (en) 1998-09-29
US20080160576A1 (en) 2008-07-03
EP1491632A2 (de) 2004-12-29
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JP2002508656A (ja) 2002-03-19
DE69828154D1 (de) 2005-01-20
US20070053902A1 (en) 2007-03-08
WO1998040488A1 (en) 1998-09-17
US20030152571A1 (en) 2003-08-14

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