JP2002508656A

JP2002508656A - 抗−アルファベータ３ヒト化モノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2002508656A
Application number: JP53986098A
Authority: JP
Inventors: ジョナック，ジェンカ・エル; ジョハンソン，キュン・オー; テイラー，アレキサンダー・エイチ
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2002-03-19
Also published as: DE69828154T2; ES2234099T3; US7504102B2; EP0968290B1; EP1491632A3; DE69828154D1; EP0968290A1; US7230083B2; AU6702998A; WO1998040488A1; CA2284518A1; US20030152571A1; US20080160576A1; EP1491632A2; US20070053902A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ビトロネクチンα_vβ₃受容体に対する新規ヒト化および他の組換えまたは遺伝子操作された抗体またはモノクローナル抗体、ならびに、それをコードする遺伝子に関する。かかる抗体は、ヒト患者における、再狭窄などのα_vβ₃媒介障害の治療的および／または予防的処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】抗−アルファベータ３ヒト化モノクローナル抗体発明の分野本発明は、新規ヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）およびこれをコードする遺伝子に関する。さらに詳しくは、本発明は、ヒトビトロネクチン受容体である、α_vβ₃のエピトープと特異的に反応するヒトモノクローナル抗体に関する。かかる抗体は、他の障害の中でも、再狭窄、脈管形成関連疾患（例えば、癌、癌転移、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症）の治療的および／または予防的処置に有用である。発明の背景インテグリンは、細胞接着受容体のスーパーファミリーであり、種々の細胞上で発現するヘテロダイマートランスメンブラン糖タンパク質である。これらの細胞表面接着受容体は、ビトロネクチン受容体α_vβ₃を含む。ビトロネクチン受容体α_vβ₃は、内皮細胞、平滑筋細胞、破骨細胞および腫瘍細胞を含む多くの細胞上で発現し、したがって、種々の機能を持っている。例えば、破骨細胞の膜上で発現するα_vβ₃受容体は、骨吸収プロセスを媒介し、骨粗鬆症の進行の一因となると仮定されている［Rossら，J．Biol．Chem.，19 87，262:7703］。別の例として、ヒト大動脈平滑筋細胞上で発現するα_vβ₃受容体は、それらの新内膜への移動を刺激し、これにより、アテローム性動脈硬化症、および、血管形成術後の再狭窄を形成すると仮定されている［Brownら，Cardi ovascular Res.，1994，28:1815］。ビトロネクチン受容体の拮抗作用と血管処置後の再狭窄との関係が、Choiらにより、J．Vasc．Surg.，1994，19:125-34において言及された。1995年3月9日に公開されたＰＣＴ出願公開WO95/25543には、ビトロネクチン受容体のアンタゴニストを投与することによる脈管形成の阻害方法が開示されている。さらに、最近の研究では、α_vβ₃アンタゴニストが脈管形成性血管のアポトーシスを誘発することにより腫瘍の退縮を促進することが開示された［P．C． Brooksら，Cell，1994，79:1157-1164］。同様に、1995年6月15日に公開されたＰＣＴ出願公開WO89/05155において開示されたビトロネクチン受容体に対して発生するネズミモノクローナル抗体ＬＭ６０９が腫瘍増殖の阻害に有用であることが開示された。D．A．Chereshら，Cell，1989，57:59-69もまた参照。異種（例えば、ネズミ）からのモノクローナル抗体を用いる受身免疫療法は、種々の疾患または障害の治療または予防についての有用なメカニズムとして示唆されているが、外来抗体に拮抗する患者の方で望ましくない免疫応答の危険性を減少させるための別法は、「ヒト化」抗体を利用することである。これらの抗体は、実質的には、ヒト起源のものであり、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびＣＤＲコンホメーションに影響を及ぼすある種のフレームワーク残基だけが非ヒト起源のものである。いくつかの障害の治療方法の特に有用な例示がＰＣＴ出願PCT/ GB91/01554（公開WO92/04381）およびＰＣＴ出願PCT/GB93/00725（公開WO93/202 10）に開示されている。別のより好ましい方法は、完全なヒトｍＡｂを利用することである。残念ながら、古典的なハイブリドーマ技法を介してヒトモノクローナル抗体を産生することはほとんど成功していない。実際、許容されるヒト融合パートナーは同定されておらず、ネズミ骨髄腫融合パートナーはヒト細胞と十分に作用せず、不安定な低産生能ハイブリドーマ株を生産する。新規ヒトｍＡｂまたはヒト化抗体は、単独で、または、免疫療法用組成物を形成するために存在する分子と組み合わせて、特に有用である。当該技術分野では、ビトロネクチン受容体α_vβ₃に対する完全なヒトｍＡｂ、または、インテグリンα_vβ₃を選択的に遮断することができ、長い血清半減期を示すヒト化抗体が依然として必要とされている。発明の概要１つの態様では、本発明は、α_vβ₃に拮抗する新規ヒト化モノクローナル抗体およびその機能的フラグメントに関する。このヒト化抗体は、ヒトα_vβ₃（ビトロネクチン受容体）と特異的に反応し、その機能を中和することができる。関連する態様において、本発明は、ヒト抗体配列をランダムなコンビナトリアルクローニングにより産生され、線状ファージＦａｂ表示ライブラリーより単離されたヒトα_vβ₃受容体に特異的なＦａｂフラグメントまたはＦ(ａｂ')₂フラグメントを中和する変法を提供する。さらに別の態様において、第１のヒトドナーからのヒト重鎖および軽鎖定常領域ならびに第２のヒトドナーから由来のヒトα_vβ₃受容体に対するモノクローナル抗体を中和するヒトより誘導された重鎖および軽鎖可変領域またはそのＣＤＲを含有する再形成ヒト抗体が提供される。さらに別の態様において、本発明は、１（またはそれ以上の）改変抗体および医薬上許容される担体を含有してなる医薬組成物を提供する。さらなる態様において、本発明は、とりわけ、ヒトにおいて、再狭窄、癌転移、慢性関節リウマチまたはアテローム性動脈硬化症などのα_vβ₃受容体により媒介される障害の受身免疫療法であって、そのヒトに該障害の予防または治療処理のために本発明の医薬組成物の有効量を投与することからなる方法を提供する。さらに別の態様において、本発明は、ヒトにおけるビトロネクチン受容体により媒介される疾患の治療方法であって、本発明の抗体の免疫療法上有効量をヒトに投与し、次いで、該受容体のアンタゴニストである小さな化学分子の治療上有効量を該ヒトに投与することからなる方法を提供する。さらに別の態様において、本発明は、ヒトα_vβ₃受容体に対する中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）より誘導されるヒト化および改変抗体（例えば、遺伝子操作された抗体、ＣＤＲ、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')₂フラグメントまたはそのアナログ）の組換え産生の方法およびその産生に有用な成分を提供する。これらの成分は、同じ物をコードする単離された核酸配列、組換えプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）中でその発現の定方向能を有する選択された調節配列の制御下にある該核酸配列を含有する組換えプラスミドを包含する。この産生方法は、トランスフェクトされた本発明の宿主細胞ラインをヒトまたは改変抗体が当該細胞にて発現するような条件下で培養し、その発現した産物を単離することからなる。さらに別の態様において、本発明は、生検試料を抗体および本発明の改変抗体と接触させ、その抗体（または改変抗体）とヒトα_vβ₃受容体との間の結合の発生について検定することからなる、ヒトにおけるヒトα_vβ₃受容体過剰発現の存在を診断する方法を提供する。本発明のさらに別の具体例において、少なくとも１回の用量の、本発明の抗体の免疫療法上有功量を、少なくとも１回の別のモノクローナル抗体または改変抗体と組み合わせてなる医薬組成物が提供される。特に望ましい組成物は、別のモノクローナル抗体としてヒトα_vβ₃受容体の異なるエピトープとの反応性を有することで目的とする抗体と区別される抗−ヒトα_vβ₃受容体抗体を含有する。本発明の他の態様および有利な点は、さらに、詳細な記載およびその好ましい具体例において記載されている。図面の簡単な説明図１は、Ｄ１２およびＬＭ６０９について実施例３に記載するＥＬＩＳＡによるｍＡｂのヒトα_vβ₃受容体への結合を示すグラフである。図２は、Ｄ１２およびＬＭ６０９ならびに対照としてＭＵ１９についてOrigen 標識によりｍＡｂのα_vβ₃受容体への結合を示すグラフである（実施例９を参照）。図３は、実施例８に記載する、固定化α_vβ₃と結合するＤ１２およびＬＭ６０９（６ｎＭ）のＢＩＡｃｏｒｅデータを示すグラフである。図４は、ＯＲＩＧＥＮ標識実験において１μｇ／ｍｌのＬＭ６０９が１μｇ／ｍｌのα_vβ₃を結合するのを妨げる能力についての抗体（Ｄ１２および表１に記載するバックアップ抗体）の特徴を示すグラフである。実施例９を参照。図５は、ＨＥＫ２９３細胞接着アッセイにおけるヒト化Ｄ１２濃度の効果を示すグラフである。図６は、ＬＭ６０９またはＤ１２と一緒にプレインキュベートすることによる１μｇ／ｍｌのＬＭ６０９の１μｇ／ｍｌのα_vβ₃への結合の阻害を示す棒グラフを示す。図７は、ＬＭ６０９またはＤ１２と一緒にプレインキュベートすることによる１μｇ／ｍｌのＤ１２の１μｇ／ｍｌのα_vβ₃への結合の阻害を示す棒グラフを示す。図８は、２種類のヒト細胞タイプおよび１種類のウサギ細胞タイプに対するネズミおよびヒト化Ｄ１２抗体のフローサイトメトリー結果を示す棒グラフである。実施例６を参照。図９は、ネズミＤ１２ｍＡｂ（黒い棒）およびヒト化ＨＺＤ１２ＩｇＧ₁（白い棒）による実施例１０のアッセイにおけるウサギ平滑筋細胞の阻害を示す棒グラフである。図１０Ａは、対照による処置または用量３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）で投与したネズミＤ１２による処置の、損傷した血管の内腔領域に対する影響を測定する、実施例１５のウサギ再狭窄アッセイの結果を示す棒グラフである。Ｎは、処置動物の数である。図１０Ｂは、図１０Ａにおけると同様に処置した損傷した血管の全血管領域に対する影響を測定する、ウサギ再狭窄アッセイの結果を示す棒グラフである。図１０Ｃは、ネズミＤ１２を用量９ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）で投与した以外は、図１０Ａのものと同様の棒グラフである。図１０Ｄは、ネズミＤ１２を用量９ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｖ．）で投与した以外は、図１０Ｂのものと同様の棒グラフである。発明の詳細な説明本発明は、ヒトα_vβ₃受容体と反応する、モノクローナル抗体、組換え抗体および合成抗体を含む有用な抗体（ならびにそのフラグメント）、該抗体をコードする単離核酸、および、それらの組換え体の種々の生産方法、ならびに、かかる抗体およびそのフラグメントの治療的、予防的および診断的使用を提供する。本発明の抗体は、ビトロネクチンおよび他のリガンドのビトロネクチン（α_v β₃）受容体への結合を阻害する。これらの抗体は、インテグリンα_vβ₃を選択的に遮断でき、動物モデルにおいてインビボで長い血清半減期（例えば、約２１日）を示すことができる。それらは、補体結合などの付加的機能を示す。特に、ネズミモノクローナルＤ１２およびヒト化抗体ＨｕＤ１２を含む、特にα_vβ₃受容体を中和する抗体は、ビトロネクチン受容体により媒介される障害の治療のための急性および亜急性治療薬としての使用に望ましい。本発明の抗体によるビトロネクチン受容体の阻害は、再狭窄および脈管形成などの疾患の治療的処置または予防を可能にする。Ｉ．配列番号配列番号４および２は、各々、ネズミｍＡｂＤ１２の重鎖可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列である。ＣＤＲは、配列番号１および２のアミノ酸残基３１− ３５、ヌクレオチド９１−１０５；アミノ酸５０−６６、ヌクレオチド１４８− １９８；およびアミノ酸９９−１０６、ヌクレオチド２９５−３１８に位置する。配列番号６および７は、各々、ネズミｍＡｂＤ１２の軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列である。ＣＤＲは、配列番号６および７のアミノ酸２４−３４、ヌクレオチド７０−１０２：アミノ酸５０−５６、ヌクレオチド１４８−１６８；およびアミノ酸８９−９７、ヌクレオチド２６５−２９１に位置する。配列番号３は、ヒトＶＨサブグループＩコンセンサス配列の重鎖可変領域アミノ酸配列であり、ここで、ＣＤＲは、アミノ酸３１−３５；アミノ酸４９−６４；およびアミノ酸９７−１０４に位置する。配列番号８は、ヒトＶカッパサブグループＩＩＩコンセンサス配列の軽鎖アミノ酸配列であり、ここで、ＣＤＲは、アミノ酸２４−３５、アミノ酸５１−５７およびアミノ酸９０−９９に位置する。配列番号４および５は、各々、コンセンサスヒト化重鎖Ｄ１２ＨＺＨＣ１−０の合成重鎖可変領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列である。ＣＤＲは、アミノ酸３１ −３５、ヌクレオチド９１−１１５；アミノ酸５０−６６、ヌクレオチド１４８ −１９８；およびアミノ酸９９−１０６、ヌクレオチド２９５−３１８に位置する。合成重鎖において保持される好ましいネズミフレームワーク残基は、アミノ酸残基２８、４８、６７、６８、７０、７２および７４である。配列番号９および１０は、各々、コンセンサス合成ヒト化軽鎖Ｄ１２ＨＺＬＣ −１−０の合成軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列である。ＣＤＲは、アミノ酸２４ −３４、ヌクレオチド７０−１０２；アミノ酸５０−５６、ヌクレオチド１４８ −１６８；およびアミノ酸８９−９７、ヌクレオチド２６５−２９１に位置する。好ましいネズミフレームワーク残基は、アミノ酸残基１、４９および６０である。配列番号１１および１２は、各々、ネズミＤ１２重鎖可変領域の改変されている領域ＤＮＡおよびアミノ酸配列である。配列番号１３および１４は、ヒトカッパ定常領域の最初の５個のアミノ酸を含む、ネズミＤ１２軽鎖可変領域の改変されている領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列である。配列番号１５は、修飾ヒトＲＥＩカッパ鎖フレームワークのアミノ酸配列である。配列番号１６および１７は、各々、Ｊｋ遺伝子およびその遺伝子産物のＤＮＡおよびアミノ酸配列である。配列番号１８および１９は、各々、ＣＡＭＰＡＴＨシグナル配列のＤＮＡおよびアミノ酸配列である。配列番号２０および２１は、各々、修飾ヒトＲＥＩカッパ鎖フレームワークをベースとする合成ヒト化カッパ鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列である。配列番号２２−２５、３０−３１、３６−３９、および、４４−４５は、実施例１３および１４で用いたプライマー配列である。配列番号２６−２９、３２−３５、および、４０−４３は、実施例１３および１４で用いた合成オリゴである。ＩＩ．定義本明細書および請求の範囲で用いる下記用語を次のように定義する：「α_vβ₃受容体により媒介される障害」なる語句は、限定するものではないが、心臓血管障害または脈管形成関連障害、例えば、糖尿病性網膜症に伴う脈管形成、アテローム性動脈硬化症および再狭窄、慢性炎症性障害、黄斑変性、糖尿病性網膜症、および、癌、例えば、充実性腫瘍、ならびに、骨粗鬆症などの骨吸収が病変を伴う疾患を包含する。本発明の抗体は、また、抗転移および抗腫瘍薬として有用である。「改変抗体」は、天然形態から改変された免疫グロブリンコード化領域によりコードされるタンパク質をいい、選択宿主細胞における発現により得ることができる。かかる改変抗体は、遺伝子操作された抗体（例えば、キメラ、ヒト化、または再形成された、あるいは免疫学的に編集されたヒト抗体）あるいは免疫グロブリン定常領域の全部または一部を欠くそれらのフラグメント、例えば、Ｆ_v、Ｆａｂ、またはＦ(ａｂ')₂等である。「改変免疫グロブリンコード化領域」は、本発明の改変抗体またはそのフラグメントをコードする核酸配列をいう。「再形成ヒト抗体」は、第１のヒトモノクローナルドナー抗体由来の最小でも１つのＣＤＲが、第２のヒトアクセプター抗体中のＣＤＲと置換されている改変抗体をいう。好ましくは、６つのＣＤＲ全てが置換されている。より好ましくは、第１のヒトドナーモノクローナル抗体由来の抗原結合領域（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ(ａｂ')₂）全体が、第２のヒトアクセプターモノクローナル抗体中の対応領域と置換されている。最も好ましくは、第１のヒトドナー由来のＦａｂ領域が第２のアクセプター抗体に作動可能に連結されて、全長モノクローナル抗体が形成される。「第１免疫グロブリンパートナー」は、ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列をいい、その中においてネイティブな（または本来的に存在する）ＣＤＲコード化領域がドナーヒト抗体のＣＤＲコード化領域と置換されている。ヒト可変領域は、免疫グロブリン重鎖、軽鎖（または両方）、それらのアナログまたは機能的フラグメント）であってよい。抗体（免疫グロブリン）の可変領域に存在するかかるＣＤＲ領域を、当該分野において知られた方法により決定することができる。例えば、Kabatら，Sequences of Prot eins of Immunological Interest，第4版，U．S．Department of Health and Hu man Services，National Institutes of Health（1987）には、ＣＤＲの配置に関する規則が開示されている。さらに、ＣＤＲ領域／構造の同定に有用なコンピュータープログラムが知られている。「第２融合パートナー」は、第１免疫グロブリンパートナーがフレーム中で（ in frame）、または、所望により慣用的なリンカー配列を用いて融合されている（すなわち、作動可能に連結された）、タンパク質またはペプチドをコードする別の核酸配列をいう。好ましくは、融合パートナーは免疫グロブリン遺伝子であり、その場合、「第２免疫グロブリンパートナー」という。第２免疫グロブリンパートナーは、その定常領域全体をコードする核酸配列（すなわち、相同的− 第１および第２の改変抗体が同じ源に由来する）または目的とするさらなる（すなわち、異種性）抗体をコードする核酸配列を含んでいてもよい。それは免疫グロブリン重鎖または軽鎖（または１つのポリペプチドの部分としての両鎖）であってもよい。第２免疫グロブリンパートナーは、特定の免疫グロブリンクラスまたはイソタイプに限定されない。さらに、第２免疫グロブリンパートナーは、免疫グロブリン定常領域の一部分（すなわち、適当なヒト定常領域またはフレームワーク領域の別個の部分）、例えばＦａｂまたはＦ(ａｂ')₂中に見出されるものを含んでいてもよい。また、第２融合パートナーは、宿主細胞の外表面に露出される内在性膜タンパク質（例えば、ファージディスプレイライブラリーの一部としての）をコードする配列、または分析もしくは診断用タンパク質、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどをコードする配列を含んでいてもよい。用語Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、またはＦ(ａｂ')₂は、それらの標準的な意味とともに使用する［例えば、Harlowら，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，（1988）を参照］。本明細書の用語「遺伝子操作された抗体」は、改変抗体の１つのタイプ、すなわち、全長合成抗体（例えば、抗体フラグメントとは異なって、キメラ、ヒト化、再形成された、または、免疫学的に編集されたヒト抗体）をいい、その中において選択アクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインの一部が、選択エピトープに対して特異性を有する１またはそれ以上のドナー抗体の類似部分により置換されている。例えば、かかる分子は、未修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）に結合したヒト化重鎖により特徴づけられる抗体（あるいはその逆のもの）を包含しうる。遺伝子操作された抗体は、ドナー抗体結合特異性を保持するための、アクセプター抗体軽鎖および／または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列の変更により特徴づけられてもよい。これらの抗体は、アクセプター抗体由来の１またはそれ以上の（好ましくは、全部の）ＣＤＲの本明細書記載のドナー抗体由来のＣＤＲとの置換を含みうる。「キメラ抗体」は、遺伝子操作された抗体の１つのタイプをいい、異種由来のアクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域に結合したドナー抗体由来の本来的な可変領域（軽鎖および重鎖）を含む。「ヒト化抗体」は、遺伝子操作された抗体の１つのタイプをいい、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が１（またはそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来するものである。さらに、フレームワーク支持残基を改変して結合アフィニティーを保存させてもよい［例えば、Queenら，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:10029-10032およびHod gsonら，1991，Bio/Technology，9:421を参照］。「免疫学的に編集された抗体」は、遺伝子操作された抗体の１つのタイプをいい、編集された抗体で治療される患者に関して抗体に対する免疫学的応答の可能性を減じることを目的として、ドナーおよび／またはアクセプター配列において変化があり、人工物のクローニング、生殖系の増強等の観点から、領域において編集が行われているものをいう。用語「ドナー抗体」は、その可変領域、ＣＤＲまたは他の機能的フラグメントまたはアナログの核酸配列を第１免疫グロブリンパートナーに提供して、改変免疫グロブリンコード化領域を生じさせ、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する改変抗体を生じさせる抗体（モノクローナルまたは組換え抗体）をいう。本発明における使用に適する１つのドナー抗体は、Ｄ１２と命名された中和ネズミモノクローナル抗α_vβ₃抗体である。Ｄ１２は、各々、配列番号２および７に示す、可変重鎖および可変軽鎖アミノ酸配列を有するものと定義される。用語「アクセプター抗体」は、ドナー抗体に対して遺伝学的に無関係な源由来の抗体（モノクローナルまたは組換え抗体）をいい、その重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域および／またはその重鎖および／または軽鎖の定常領域をコードする核酸配列の全て（または、いずれかの部分、好ましくは、全て）を第１免疫グロブリンパートナーに提供するものをいう。好ましくは、ヒト抗体がアクセプター抗体である。「コンセンサスＶＨ」または「コンセンサイＶＫ」領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と同様に機能できるアミノ酸配列をいい、慣用的なコンピューター技法により選択される。すなわち、所定のＶＨまたはＶＫアミノ酸配列の場合、この所定の配列に最も近いヒトＶＨおよびＶＫ配列を集めて、最も近い抗体サブグループを同定する。このサブグループを選択すると、このサブグループからの全てのヒト抗体を比較し、ＶＨおよびＶＫ鎖のコンセンサス配列を調製する。このコンセンサス配列を用いて、ヒト化抗体の所望の合成フレームワーク領域を発生させる。「ＣＤＲ」は、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。ＣＤＲは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。例えば、Kabatら，Sequenc es of Proteins of Immunological Interest，第4版，U．S．Department of Hea lth and Human Services，National Institutes of Health（1987）を参照。免疫グロブリン可変部分には３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）がある。かくして、本明細書の「ＣＤＲ」は、３つの重鎖ＣＤＲ全てまたは３つの軽鎖ＣＤＲ全て（または、適宜、全ての重鎖および全ての軽鎖の両方のＣＤＲ）をいう。ＣＤＲは、抗原またはエピトープに対する抗体の結合のための接触残基の大部分を提供する。本発明の目的ＣＤＲは、ドナー抗体の可変重鎖および軽鎖配列に由来するものであり、本来的なＣＤＲのアナログを包含し、該アナログは、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を共有または保持している。「抗原結合特異性または中和能を共有」とは、例えば、ｍＡｂＤ１２は、一定レベルの抗原アフィニティーにより特徴づけられてもよいが、適当な構造上の環境においてｍＡｂＤ１２の核酸配列によりコードされるＣＤＲは、より低いまたは高いアフィニティーを有してもよいことを意味する。それにもかかわらず、かかる環境下のｍＡｂＤ１２のＣＤＲは、無処理のｍＡｂＤ１２が認識するのと同じエピトープを認識するであろう。「機能的フラグメント」は、部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端において少し欠失したもの）であり、当該フラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和能を保持している。「アナログ」は、少なくとも１つのアミノ酸において修飾されたアミノ酸配列であり、該修飾はアミノ酸の化学的な修飾もしくは置換、または、少数のアミノ酸（すなわち１０個未満）の置換または転位であってよく、該修飾は、アミノ酸配列が未修飾配列の生物学的特徴（例えば、抗原特異性および高いアフィニティー）を保持することを可能にするものである。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限部位がＣＤＲコード化領域中またはその周辺に作成された場合に、置換により、（サイレント）変異を構築することができる。これに関して、タンパク質および／またはＤＮＡ配列が同定された配列に対するそれらの相同性率または同一性率により定義される場合、相同性率または同一性率を計算するために用いるアルゴリズムとしては、以下のものが挙げられる：スミス−ウォーターマン・アルゴリズム（Smith-Waterman algorithm）［J．F． Collinsら，1988，Comput．Appl．Biosci.，4:67-72;J．F．Collinsら，Molecul ar Sequence Comparison and Alignment，（M.J.Bishopら編）in Practical App roach Series:Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII，IRL Press :Oxford，England，UK（1987）pp.417］ならびにＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラム［E．G．Shpaerら，1996，Genomics，38:179-191］。これらは、引用により本明細書の記載とする。アナログは、対立遺伝子の変化を生じさせるかもしれない。「対立遺伝子の変化または修飾」は、本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列における変化である。かかる変化または修飾は、遺伝暗号の縮重によるものであってもよく、または、所望の特徴を得るために故意に遺伝子操作したものであってもよい。これらの変化または修飾は、コードされるアミノ酸配列の変化を生じさせるものであっても、なくてもよい。用語「エフェクター剤」は、改変抗体、および／または、ドナー抗体の天然または合成軽鎖または重鎖またはドナー抗体の他のフラグメントが慣用的手段により結合されていてもよい非タンパク質キャリヤ分子をいう。かかる非タンパク質キャリヤは、診断分野で使用される慣用的キャリヤ、例えば、ポリスチレンもしくは他のプラスチックビーズ、多糖類、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（ファルマシア（Pharmacia））系に使用される多糖類、または、医学分野で有用でヒトおよび動物への投与が安全な他の非タンパク質物質を包含しうる。他のエフェクター剤は、重金属原子をキレートするためのマクロサイクル（macrocycle）、または、放射性同位元素を包含しうる。かかるエフェクター剤、例えば、ポリエチレングリコールは、改変抗体の半減期の延長にも有用でありうる。ＩＩＩ．抗α_vβ₃ネズミモノクローナル抗体本発明のヒト化抗体、フラグメントおよび融合タンパク質の構築において用いるために、非ヒト種を用いて、抗原としてのヒト胎盤α_vβ₃受容体とのプレゼントメントにより所望の免疫グロブリンを生じてもよい。慣用的なハイブリドーマ技法を用いて、α_vβ₃受容体に対する非ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマ細胞系を提供する。一例として、下記実施例２には、ネズミｍＡｂＤ１２および他のネズミ抗α_vβ₃ｍＡｂの産生を詳細に記載する。以下、検討の容易さのために、用語Ｄ１２は、実施例２のＤ１２ｍＡｂまたは他のｍＡｂのいずれかを示すことができる。Ｄ１２、本発明のキメラまたはヒト化抗体を発生させるのに用いる所望のドナー抗体である。実施例２の記載に従って得た中和ネズミｍＡｂＤ１２の特徴としては、下記表Ｉに記載したヒトα_vβ₃に対する抗原結合特異性および特徴が挙げられる。実施例２のｍＡｂＤ１２のイソタイプは、ＩｇＧ₁であり、これは、用いるアッセイに依存して、約１〜３ｎＭのアフィニティーを有する。該抗体は、α_vβ₃のヘテロダイマーαおよびβエピトープを認識し、個々にαまたはβサブユニットのいずれも認識しない。該結合は、下記実施例３−１２のインビトロアッセイにおいて結合および機能的活性（中和）により説明される。得られた配列、すなわち、Ｄ１２の軽鎖可変領域［配列番号６および７］およびＤ１２の重鎖可変領域［配列番号１および２］の場合、当業者は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、重鎖の残部を得ることができ、完全なｍＡｂ分子を得ることができる。別法としては、Ｄ１２分子は、本発明の合成および組換えｍＡｂについて以下に記載の方法と類似の技法を用い、他のネズミＩｇＧサブタイプ重鎖を用いて構築できる。他の抗α_vβ₃抗体は、本明細書に記載されるネズミｍＡｂおよびそのα_vβ₃エピトープを用いて、ハイブリドーマもしくはコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング、または、抗体ファージ表示［W.D.Huseら，1988，Science， 246:1275-1281］により得ることができる。ハイブリドーマ生産物またはいずれもの種の免疫グロブリンレパートリー由来の抗体を包含する抗体のコレクションは、本明細書に記載した１またはそれ以上のエピトープを用いる、下記実施例５、８および９に記載したような慣用的な競合アッセイでスクリーンしてもよい。かくして、本発明は、α_vβ₃受容体へ結合する能力およびこれを中和する能力を有するＤ１２以外の抗体を提供してもよい。所望のα_vβ₃エピトープに対して生じ、慣用的な技法により生産された他のｍＡｂとしては、限定されないが、ネズミｍＡｂ、ヒトｍＡｂ、および、コンビナトリアル抗体をコードする遺伝子を包含する。本発明は、Ｄ１２ｍＡｂまたはその超可変配列の使用に限定されない。したがって、当該技術分野で開示されている適当なα_vβ₃中和抗体および対応する抗 α_vβ₃ＣＤＲが代用できると思われる。以下の記載において、ドナー抗体がＤ１２と定義される場合はいつでも、この命名は、唯一記載の説明および簡素化に役立つ。ＩＶ．ヒト抗体を得るためのコンビナトリアルクローニング：上記のように、多くの問題が、G．KohlerおよびC．Milstein，1975，Nature， 256:495-497のハイブリドーマ法の、ヒトモノクローナル抗体の生成および単離への直接的な適用を妨げてきた。これらの問題としては、ハイブリドーマ細胞系を形成するのに使用される適当な融合パートナーミエローマ細胞系を欠いていたこと、および、生成されたとしてもかかるハイブリドーマの安定性が乏しいことなどが挙られる。したがって、コンビナトリアルクローニングの分子生物学的研究が好ましい。一般的には、コンビナトリアルクローニングは、ＰＣＴ出願公開WO90/144302 に開示されている。簡単に説明すると、コンビナトリアルクローニングの目的は、ヒト細胞、組織または器官の免疫学的遺伝学的能力を細菌細胞集団に移行させることである。免疫適格な細胞、組織または器官を用いることが好ましい。特に有用な源は、限定しないが、脾臓、胸腺、リンパ節、骨髄、扁桃腺および末梢血リンパ球を包含する。所望により、該細胞は、インビトロでヒトα_vβ₃受容体で刺激してもよく、または、免疫応答を生じたことが知られているドナーまたはＨＩＶ⁺であるが無症候性であるドナーから選択してもよい。ドナー細胞から単離された遺伝情報（すなわち、抗原としてのα_vβ₃による刺激に応答して組織中で生産されるヒト抗体）は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよく、便利には、ＰＣＲまたは類似の方法により増幅される。ＲＮＡとして単離した場合、好ましくは、増幅前に逆転写により遺伝情報をｃＤＮＡに変換する。増幅は、一般化できるか、または、より特異的に調整できる。例えば、ＰＣＲプライマー配列を注意深く選択することにより、免疫グロブリン遺伝子または当該遺伝子クラス中のサブセットの選択的増幅を行うことができる。成分遺伝子配列（この場合、種々の重鎖および軽鎖抗体鎖の可変領域をコードする遺伝子）を得たならば、軽鎖および重鎖遺伝子をランダムに組み合わせてランダムなコンビナトリアルライブラリーを形成する。コンビナトリアルクローニングを容易にするための種々の組換えＤＮＡベクター系が記載されている［上記ＰＣＴ出願WO90/14430、ScottおよびSmith，Science 249:386-406（1990）または、米国特許第5,223,409号を参照）。コンビナトリアルラィブラリーを得て、便利には、発現後に、ヒトα_vβ₃受容体でのバイオパンニング（biopanning）により、または、必要ならば、以下に詳細に説明するエピトープ遮断バイオパンニングにより生成物をスクリーニングすることができる。まず、コンビナトリアルクローニングおよびスクリーニングにＤ１２などのｍＡｂのＦａｂフラグメントを用い、次いで、所望候補分子の選択後にＦａｂを全長ｍＡｂに変換することが一般的に好ましい。しかしながら、一本鎖抗体をクローニングおよびスクリーニングに使用することもできる。Ｖ．抗体フラグメント本発明は、ヒトα_vβ₃受容体に対して指向された全長ｍＡｂを誘導するためのＦａｂフラグメントまたはＦ(ａｂ')₂フラグメントの使用を企図する。これらのフラグメントは、個々に、インビボにおいてヒトα_vβ₃受容体により媒介される症状に対する防御剤および治療剤として、または、インビトロにおいてヒトα_v β₃受容体により媒介される疾患の診断の一部として有用であるが、本発明ではそれらを再形成ヒト抗体の成分として使用する。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖全体および重鎖のアミノ末端部分を含んでおり、Ｆ(ａｂ')₂フラグメントは、さらなるジスルフィド結合により結合した２個のＦａｂフラグメントにより形成されるフラグメントである。本発明のヒトα_vβ₃受容体結合モノクローナル抗体は、ＦａｂフラグメントおよびＦ(ａｂ')₂フラグメントの源を提供するものであり、後者のフラグメントは、コンビナトリアルファージライブラリーにより得ることができる［例えば、Winterら，1994，Ann．Rev．Immunol.，12:433-455またはBarbesら，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89，10164-10168を参照、これらは、引用により本明細書の記載とする］。これらのＦａｂおよびＦ(ａｂ' )₂フラグメントは、それ自体、治療薬、予防薬または診断薬として、ならびに、本明細書に記載の組換えまたはヒト化抗体の形成に有用な可変領域およびＣＤＲ配列を包含する配列のドナーとして有用である。ＶＩ．目的の抗−ヒトα_vβ₃抗体アミノ酸およびヌクレオチド配列本明細書記載のｍＡｂＤ１２または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により特徴づけられる種々の改変抗体の設計および取得において有用な可変重鎖および／または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメント、および、それらのアナログ、ならびに、それらをコードする核酸配列などの配列を提供しうる。かくして、一例として、本発明は、抗ヒトα_vβ₃ｍＡｂＤ１２由来の可変軽鎖配列［配列番号６および７］および可変重鎖配列［配列番号１および２］、ならびに、それらに由来する配列を提供する。可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする本発明核酸配列またはそれらのフラグメントも、ＣＤＲまたはフレームワーク領域をコードする核酸配列内の特異的な変化を有する突然変異の導入、および、得られた修飾または融合核酸配列の、発現のためのプラスミド中への導入に有用である。例えば、フレームワークおよびＣＤＲコード化領域のヌクレオチド配列中のサイレント置換を用いて、突然変異誘発したＣＤＲ（および／またはフレームワーク）領域の導入を容易ならしめる制限酵素部位を作成することができる。これらのＣＤＲコード化領域を本発明の再形成ヒト抗体の構築に使用してもよい。遺伝暗号の縮重を考慮して、本発明の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列ならびにそれらの機能的フラグメントおよびアナログをコードする種々のコード化配列（ドナー抗体の抗原特異性を共有している）を構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする本発明の単離核酸配列またはそれらのフラグメントを用いて、改変抗体、例えば、キメラもしくはヒト化抗体を、または、第２免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される場合には本発明の他の遺伝子操作された抗体を得ることができる。本明細書に記載の改変抗体の部分をコードする単離核酸配列のほかに、他のかかる核酸配列、例えば、ネイティブ（native）なＣＤＲコード化配列に相捕的な配列またはＣＤＲコード化領域周辺の修飾ヒトフレームワーク領域に相捕的な配列も本発明により包含されることに注意すべきである。かかる配列は、遺伝暗号の縮重により配列番号２および７に示すのと同じアミノ酸配列をコードし得る全ての核酸配列を包含する。ヒト化軽鎖可変ＤＮＡ配列の一例を配列番号９に示す。ヒト化重鎖可変ＤＮＡ配列の一例を配列番号４に示す。これらの重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号１、２、６および７のネズミ配列において詳細に示される３つのＣＤＲ配列を有する。本発明に包含される他の有用なＤＮＡ配列としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下［T．Maniatisら，1982，Molecular Cloning(A Laborat ory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，第387-389頁］、配列番号１および６の軽鎖および重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、それらの抗体の抗原結合特性を保持している配列が挙げられる。かかるストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃の４ＸＳＳＣでのハイブリダイゼーション、次いで、６５℃の０.１ＸＳＳＣで１時間の洗浄である。別法としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド中、４２℃の４ＸＳＳＣである。好ましくは、これらのハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列は、少なくとも１８ヌクレオチドの長さ、すなわち、ほぼＣＤＲのサイズである。他の有用な配列は、上記アルゴリズムのいずれかに従って、本明細書の配列番号１、４、６、９、１１、１３および２０のＤＮＡ配列と約８０％〜約９９％相同または同一であり、配列番号２、５、７、１０、１２、１４および２１の生物活性または機能を共有する配列をコードするこれらのＤＮＡ配列である。ＶＩＩ．改変免疫グロブリンコード化領域および改変抗体改変免疫グロブリンコード化領域は、キメラ抗体、ヒト化、再形成および免疫学的に編集されたヒト抗体などの遺伝子操作された抗体を含む改変抗体をコードする。所望の改変免疫グロブリンコード化領域は、抗ヒトα_vβ₃抗体の抗原特異性、好ましくは、アクセプター免疫グロブリンパートナー中に挿入された、本発明により提供されるような高アフィニティー抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードするＦａｂ領域の形態にてＣＤＲコード化領域を含む。上記したように、アクセプターが免疫グロブリンパートナーである場合、これは、目的の第２抗体領域、例えば、Ｆｃ領域をコードする配列を含む。免疫グロブリンパートナーはまた、軽鎖または重鎖定常領域がフレーム中でまたはリンカー配列により融合される他の免疫グロブリンをコードする配列を含んでもよい。ヒトα_vβ₃タンパク質の機能的フラグメントまたはアナログに対して指向する遺伝子操作された抗体は、同じ抗体との結合の増強を誘発するように設計されてもよい。免疫グロブリンパートナーはまた、非タンパク質キャリヤ分子を含む、免疫グロブリンパートナーが慣用手段により作動可能に連結していてもよい、上記したようなエフェクター剤と結合していてもよい。免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列と、エフェクター剤との間の融合または連結は、いずれもの適当な手段、例えば、慣用の共有またはイオン結合、タンパク質融合、または、ヘテロ二官能価架橋剤、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであってもよい。かかる技術は、当該分野で公知であり、慣用の化学および生物化学の教科書に簡単に記載されている。加えて、第２の免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に所望量のスペースを簡単に提供する慣用のリンカー配列もまた、改変免疫グロブリンコード化領域中に構築してもよい。かかるリンカーの設計は、当業者に周知である。さらに、本発明の分子のシグナルペプチドを修飾して発現を増強させてもよい。例えば、シグナル配列とｍＡｂＤ１２重鎖配列由来のＣＤＲを有する再形成ヒト抗体は、キャンパス（Campath）リーダー配列［Page，M．J．ら，1991，Bio Technology，9:64-68;配列番号１８および１９］などの他のシグナル配列で置き換えた元々のシグナルペプチドを有していてもよい。典型的な改変抗体、再形成ヒト抗体は、第２のヒト抗体由来の定常重領域Ｃ_H- ₁ −Ｃ_H-3に融合した、ｍＡｂＤ１２の抗原特異性を有する可変の重鎖および完全な軽鎖ペプチドまたはタンパク質を含む。さらなる具体例において、本発明の遺伝子操作された抗体は、別の物質に結合していてもよい。例えば、組換えＤＮＡ技術の方法を用いて、完全抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはリポーター分子）により置き換えられている本発明の遺伝子操作された抗体を製造してもよい。本発明の他の望ましいタンパク質は、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子、または、ＦａｂもしくはＦ(ａｂ')₂フラグメントなどのそのいずれかの別々のフラグメント、重鎖二量体、または、Ｆｖもしくは一本鎖抗体（ＳＣＡ）などそのいずれかの最小組換えフラグメント、または、選択されたドナーｍＡｂＤ１２と同じ特異性を有する他の分子を含んでいてもよい。かかるタンパク質は、改変抗体の形態で用いてもよいか、または、その融合した形態で用いてもよい。免疫グロブリンパートナーが、免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域のイソタイプまたはクラスなどのドナー抗体と異なる抗体由来であるか、または、上記で定義したコンセンサス配列としてコンピュータープログラムにより選択される場合にはいつでも、遺伝子操作された抗体が得られる。遺伝子操作された抗体は、１つの源（例えば、アクセプター抗体もしくはコンセンサス配列）由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域およびＣＤＲ可変フレームワーク領域、ならびに、ドナー抗体（例えば、本明細書に記載する抗−ヒトα_vβ₃）由来の１またはそれ以上（好ましくは全て）のＣＤＲを含むことができる。加えて、核酸またはアミノ酸レベルでのアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメインフレームワーク領域、または、ドナーＣＤＲ領域の改変、例えば、欠失、置換または付加を、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するため、または、潜在的な免疫原性を減少させるために、作成してもよい。かかる遺伝子操作された抗体を、ヒトα_vβ₃ｍＡｂの可変重鎖および／または軽鎖の１つ（または両方）（所望により記載したように修飾されていてもよい）、または、以下に示す重鎖または軽鎖ＣＤＲの１つまたはそれ以上を用いるように設計する。本発明の遺伝子操作された抗体は、中和する、すなわち、それらは、望ましくは、インビトロでおよびα_vβ₃受容体により媒介される疾患、例えば、再狭窄の動物モデルにおいてインビボでビトロネクチン受容体に結合するリガンドを阻害する。かかる遺伝子操作された抗体には、ヒトα_vβ₃抗体機能的フラグメントに融合したヒト重鎖および軽鎖定常領域を含む再形成ヒト抗体が含まれてもよい。適タベース、Los Alamosデータベース、およびSwiss Proteinデータベースなどの慣用のデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の相同性により、選択されたものでもよい。別法としては、ドナー抗体のものと最も近いサブグループのデータベースにおいて全て公知のヒト配列により形成されたコンセンサス配列を用いて、フレームワーク領域を供給してもよい。ドナー抗体のフレームワーク領域への相同性（アミノ酸ベースで）により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適当であってもよい。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を提供可能な適当なアクセプター抗体を、同様の方法で選択してもよい。アクセプター抗体重鎖および軽鎖は、同じアクセプター抗体起源である必要のないことに注意しなければならない。望ましくは、異種フレームワークおよび定常領域を、ＩｇＧ（サブタイプ１〜４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥなどのヒト免疫グロブリンクラスおよびイソタイプから選択する。Ｆｃドメインは、ネイティブな配列に限定されず、機能を改変する当該分野で公知の変異体を包含する。例えば、変異は、あるＩｇＧ抗体のＦｃドメインについて記載され、これは、Ｆｃ−媒介補体およびＦｃ受容体結合を減少させ［例えば、A．R．Duncanら，1988，Nature 332:563-564;A．R． DuncanおよびG．Winter，1988，Nature，332:738-740;M．-L．Alegreら，1992， J．Immunol.，148:3461-3468;M．-H．Taoら，1993，J．Exp．Med．178:661-667; V．Xuら，1994，J．Biol．Chem.，269:3469-2374を参照］、クリアランス速度を改変し［J．-K．Kimら，1994，Eur．J．Immunol.，24:542-548]、構造異種性を減少させる［S．Angalら，1993，Mol．Immunol.，30:105-108］。また、ＩｇＭのテイル部分セグメントの付加および他の変異［R．I．F．SmithおよびS．L．Mo rrison，1994，Biotechnology，12:683-688;R．I．F．Smithら，1995，J．Immun ol．154:2226-2236］、またはＩｇＡのテイル部分セグメントの付加［I．Kariv ら，1996，J．Immunol．157:29-38］による、抗体のオリゴマー化などの他の修飾が可能である。しかしながら、アクセプター抗体は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含むことを必要としない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の部分をコードするＤＮＡ配列がポリペプチドエフェクターまたはリポーター分子などの非−免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合する遺伝子を構築してもよい。特に望ましい改変抗体の一例は、Ｄ１２の可変ドメインアミノ酸配列の全てまたは一部およびドナー抗体フレームワーク領域のいくつかの部分、または、選択されたヒト抗体のフレームワーク領域に挿入されたそれらからのＣＤＲを含有するヒト化抗体である。このヒト化抗体は、ヒトα_vβ₃受容体に対して指向される。好適には、これらのヒト化抗体において、Ｄ１２抗体重鎖および／または軽鎖可変領域からの１つ、２つ、または、好ましくは、３つのＣＤＲは、選択されたヒト抗体またはコンセンサス配列のネイティブなＣＤＲと置き換えて、該抗体またはコンセンサス配列フレームワークに挿入される。好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインは、１つ以上のＣＤＲ置換により遺伝子操作された。６つのＣＤＲ全てまたは５つ以下のＣＤＲの種々の組み合わせを用いることが可能である。例えば、軽鎖としてヒトアクセプター抗体からの非修飾軽鎖を用いて、ヒト重鎖におけるＣＤＲのみを置き換えることが可能である。別法としては、適合する軽鎖は、慣用的な抗体データベースにより別のヒト抗体から選択してもよい。遺伝子操作された抗体の残りは、いずれもの適当なアクセプターヒト免疫グロブリンから誘導されてもよい。かくして、改変抗体は、好ましくは、天然ヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、例えば、ヒトにおけるヒトα_vβ₃受容体媒介疾患の治療などの有効な治療的使用、または、診断的使用に必要な特性の組み合わせを有する。改変抗体を、ドナー抗体の特異性および高いアフィニティーに必ずしも影響を及ぼすわけではない可変ドメインアミノ酸の変化によりさらに修飾してもよいことが当業者に理解されるであろう（すなわち、アナログ）。重鎖および軽鎖アミノ酸が可変ドメインフレームワークもしくはＣＤＲのいずれかまたはその両方において他のアミノ酸により置換されていてもよいことが理解される。本明細書の実施例において説明するようなかかる再構築配列の免疫原性編集が特に好ましい。加えて、可変または定常領域を改変して、本発明の分子の選択的特性を増強または減少させてもよい。かかる特性には、例えば、二量体化、Ｆｃ受容体への結合、または、成分を結合および活性化する能力［例えば、Angalら，1993，Mol． Immunol，30:105-108;Xuら，1994，J．Biol．Chem.，269:3469-3474;Winterら，ヨーロッパ特許第307,434号を参照］を含むことができる。かかる抗体は、以下に記載するように、ヒトα_vβ₃受容体媒介障害の予防および治療において有用である。ＶＩＩＩ．改変抗体および遺伝子操作された抗体の製造得られた本発明の再形成および遺伝子操作されたヒト、ヒト化およびキメラ抗体は、遺伝子操作技術を用いて組換えＤＮＡ技術により、組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞において発現できる。同一または同様の技術を用いて、本発明の他の具体例を生成してもよい。すなわち、慣用の発現ベクターまたは組換えプラスミドを、宿主細胞中での複製および発現および／または宿主細胞からの分泌を制御可能な慣用の調節制御配列に作動可能に結合させて改変抗体のこれらのコード化配列を配置することにより製造する。調節配列には、プロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、および、他の公知の抗体由来であり得るシグナル配列が含まれる。同様に、相補的な抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第２の発現ベクターを製造できる。好ましくは、この第２の発現ベクターは、各ポリペプチド鎖が機能的に発現することをできる限り確実にするように、コード化配列および選択マーカーが関係する限りにおける以外は、第１の発現ベクターに同一である。別に、改変抗体の重鎖および軽鎖コード化配列は、単一ベクター上に存在してもよい。選択された宿主細胞を、第１および第２のベクターの両方で慣用技術によりコトランスフェクトして（または、単純に単一のベクターでトランスフェクトして）、組換えまたは合成軽鎖および重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作成する。次いで、トランスフェクトされた細胞を、慣用技術により培養して、本発明の遺伝子操作された抗体を製造する。組換え重鎖および軽鎖の両方の結合を含む抗体の製造を、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの適当なアッセイにより培養物中で測定する。同様な慣用技術を用いて、本発明の他の改変抗体および分子を構築してもよい。本発明の方法および組成物の構築において用いるクローニングおよびサブクローニングエ程に適当なベクターは、当業者により選択できる。例えば、クローニングベクターの慣用のｐＵＣシリーズを用いてもよい。用いた１つのベクターは、アマシャム（Amersham）（英国バッキンガムシャー）またはファルマシア（Ph armacia）（スウェーデン国ウプサラ）などの供給会社から市販される、ｐＵＣ１９である。加えて、容易に複製可能であり、多数のクローニング部位および選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に扱うことのできるベクターをクローニングに用いてもよい。このように、クローニングベクターの選択は、本発明の限定要因ではない。同様に、本発明の遺伝子操作された抗体の発現に用いるベクターは、いずれもの慣用のベクターから当業者が選択できる。好ましいベクターには、例えば、プラスミドｐＣＤまたはｐＣＮが包含される。ベクターは、また、選択された宿主細胞において異種ＤＮＡ配列の複製および発現を導く選択された調節配列（ＣＭＶプロモーターなど）を含む。これらのベクターは、遺伝子操作された抗体または改変免疫グロブリンコード化領域をコードする上記したＤＮＡ配列を含む。加えて、ベクターは、容易に操作するために、所望の制限部位の挿入により修飾された選択された免疫グロブリン配列を組み込んでもよい。発現ベクターは、また、例えば、哺乳動物ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）などの異種ＤＮＡ配列の発現を増幅するのに適した遺伝子により特徴付けられてもよい。他の好ましいベクター配列には、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）およびベータグロビンプロモーター配列（ベータグロプロ）などのポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列が含まれる。本発明に有用な発現ベクターは、当業者に周知の技術により合成されてもよい。例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などのかかるベクターの成分は、選択された宿主において組換えＤＮＡの産物の発現および／または分泌を導くのに用いるために、市販のまたは天然の源から入手するか、または、公知の方法により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌発現用に当該分野で多数のタイプが公知である他の適当な発現ベクターもまた、本発明の目的のために選択してもよい。本発明はまた、遺伝子操作された抗体またはその改変免疫グロブリン分子のコード化配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系を包含する。クローニングおよび他のこれらのクローニングベクターの操作に有用な宿主細胞もまた慣用である。しかしながら、最も望ましくは、イー・コリ（Ｅ．coli）の種々の株由来の細胞を、クローニングベクターの複製および本発明の改変抗体の構築における他の工程に用いる。本発明の遺伝子操作された抗体または改変抗体の発現に適した宿主細胞または細胞系は、好ましくは、ＣＨＯ、ＣＯＳ、線維芽細胞（例えば、３Ｔ３）、および、骨髄細胞などの哺乳動物細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯまたは骨髄細胞である。このようにヒトグリコシル化パターンで分子を修飾できるヒト細胞を用いてもよい。別に、他の真核細胞系を用いてもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに、トランスフォーメーション、培養、増幅、スクリーニング、および、産物の製造および精製のための方法は、当該分野で公知である。例えば、Sambrookら，1989，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory（New York）を参照。細菌細胞は、本発明の組換えＦａｂの発現に適した宿主細胞として有用である 188を参照］。Ｆａｂが一般にグリコシル化されず、輸出された（exported）発現用に遺伝子操作でき、それにより誤った折りたたみを促進する高い濃度を減少させるので、細菌細胞中で発現されるタンパク質の、折りたたまれないかもしくは不適当に折りたたまれた形態、または、非グリコシル化形態となる傾向は、大きな問題とはならない。それにもかかわらず、細菌細胞中で産生されるいずれもの組換えＦａｂは、抗原結合能の保持についてスクリーニングすべきである。細菌細胞により発現された分子が、適当な折りたたみ形態で産生され、輸出されている場合、その細菌細胞は望ましい宿主である。例えば、発現用に用いられる種々のイー・コリ株は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。バシラス・サチリス（B．subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyce s）、他のバシラスなどの種々の株もまた、本方法において用いてもよい。所望の場合、当業者に公知の酵母細胞株、ならびに、ドロソフィラ（Drosophi la）およびレピドプテラ（Lepidoptera）などの昆虫細胞およびウイルス発現系もまた、宿主細胞として利用可能である。例えば、Millerら，1986，Genetic En gineering，8:277-298およびそこで引用された参考文献を参照のこと。本発明のベクターを構築する一般法、本発明の宿主細胞を産生するのに必要なトランスフェクション法、および、本発明の改変抗体をかかる宿主細胞から製造するのに必要な培養法は、全て慣用技術である。同様に、産生後、本発明の改変抗体は、硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該分野の標準的な方法により、細胞培養内容物から精製してもよい。かかる技術は、当業者の範囲内であり、本発明を限定するものではない。さらに別の再形成抗体の発現方法は、米国特許第4,873,316号に記載されるものなどのトランスジェニック動物における発現を用いてもよい。所望の方法により発現されると、遺伝子操作された抗体を、次いで、適当なアッセイを用いてインビトロ活性について試験する。現行の慣用的なＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて、改変抗体のヒトα_vβ₃受容体への結合を定性的および定量的に評価する。下記実施例３を参照。加えて、他のインビトロアッセイ（例えば、実施例１２）およびインビボ動物モデル（例えば、実施例１５）を用いて、通常のクリアランスメカニズムにもかかわらず生体中での改変抗体の残留を評価するために行われるその後のヒト臨床試験の前に、中和効力を調べてもよい。上記産生プロセスの１つの特異的な例として、ヒト化Ｄ１２抗体は、下記実施例１３に詳細に記載するように生成され、発現される。ＩＸ．治療的／予防的使用本発明は、また、ヒトα_vβ₃受容体媒介疾患に関連する症状を患うヒトを治療する方法であって、本明細書に記載する改変抗体の１もしくはそれ以上またはそのフラグメントを含む抗体の有効量を投与することを特徴とする方法に関する。本発明の抗体は、基本的な病状がビトロネクチン受容体と相互に作用し合うリガンドに起因する疾患の治療に有用である。例えば、これらの抗体は、抗腫瘍剤、抗脈管形成剤、抗炎症剤および抗転移剤として有用であり、特に、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、癌転移、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症および黄斑変性の治療に有用である。同様に、これらの抗体は、骨マトリックスの欠損が病状を生じる症状の治療に有用である。かくして、本抗体は、骨粗鬆症、上皮小体機能亢進症、パジェット病、悪性疾患の高カルシウム血症、骨転移により生じる骨溶解性病変、不動化による骨損失、または、性ホルモン欠乏症の治療に有用である。 α_vβ₃インテグリン受容体に対して特異的である本発明の改変抗体ｍＡｂは、「長い半減期」（〜２１日）およびさらなるエフェクター機能（例えば、補体結合）による有用な療法である。血管上で発現したα_vβ₃受容体は、ｍＡｂと容易に接近する。さらに、本発明のこれらの抗体は、それらが薬物デリバリーを増強する場合（すなわち、イムノコンジュゲート、または、イムノリポソームとして）、ターゲットされる薬物デリバリーにおいて有用である。再狭窄は、新内膜形成を遮断することまたはリモデリングを促進することのいずれかにより遮断してもよい。血管平滑筋細胞（ＶＳＭＡＣ）移動は、血管損傷後にアップレギュレートされる（免疫組織学により証明される）α_vβ₃受容体を介して媒介され、 α_vβ₃のリガンドであるオステオポンチンもまた、血管損傷後にアップレギュレートされる。したがって、α_vβ₃受容体のアンタゴニスト、すなわち、本明細書に記載の抗体および改変抗体は、新内膜形成を遮断し、血管の望ましいリモデリングを増強することができる。脈管形成は、脈管形成刺激に応答して予め存在する血管から新しい血管を形成するプロセスである。本発明の抗体および組成物は、また、限定するものではないが、充実性腫瘍、癌転移、慢性関節リウマチ、慢性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症および黄斑変性を含む脈管形成成分を有する疾患を治療するために用いてもよい。癌においては、脈管形成を処置することは、癌細胞表現型とは無関係である宿主自体をターゲットとする（処置する）を意味する。α_vβ₃は、脈管形成の間に新脈管構造においてアップレギュレートされるので、α_vβ₃受容体のアンタゴニストである本発明の組成物は、脈管形成成分を有する疾患に対して効力を有する。抗α_vβ₃ｍＡｂは、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）における脈管形成を阻害し、内皮細胞におけるアポトーシスを促進し、ヒト−ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害する。α_vβ₃の阻害は、新脈管構造の成長を防止する（成熟血管に対しては影響がない）。かくして、本発明の分子の使用により誘導される治療的応答は、ビトロネクチン受容体α_vβ₃への結合、その後の病状進行の遮断により産生される。このように、本発明の分子は、治療的使用に適した調製物および処方における場合、ヒト α_vβ₃により媒介される障害を患う患者にきわめて望ましい。例えば、慢性疾患などを治療する場合、長期治療が望ましい。治療の用量および期間は、ヒト循環における本発明の分子の相対的持続時間に関連し、治療される状態および患者の一般的健康状態に応じて当業者により調整できる。本発明の改変抗体、抗体およびそのフラグメントは、予防剤として、単独で、または、ビトロネクチン受容体上の他のエピトープと反応する他の抗体、特に、ヒトまたはヒト化抗体と組み合わせて用いてもよい。本発明の治療および予防剤の投与方法は、薬剤を宿主にデリバーするいずれもの適当な経路でもよい。本発明の改変抗体、抗体、遺伝子操作された抗体およびそのフラグメント、ならびに、医薬組成物は、特に、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内、または、鼻腔内投与に有用である。本発明の治療および予防剤は、医薬上許容される担体中に、有効成分として本発明の改変抗体を有効量含む医薬組成物として調製してもよい。好ましくは、生理学的ｐＨに緩衝化された、注射用形態の、抗体を含む水性懸濁液または溶液が好ましい。非経口投与用組成物は、一般に、医薬上許容される担体、好ましくは、水性担体中に溶解された、本発明の遺伝子操作された抗体の溶液またはそのカクテルを含む。種々の水性担体を用いることができ、例えば、０.４％生理食塩水、０.３％グリシンなどである。これらの溶液は、無菌であり、一般に粒子物質を含まない。これらの溶液を、慣用の、周知の滅菌技術（例えば、濾過）により滅菌してもよい。組成物は、ｐＨ調整および緩衝化剤などの適当な生理学的条件に必要な医薬上許容される補助剤を含んでいてもよい。かかる医薬組成物中の本発明の抗体の濃度は、広範に変化でき、すなわち、約０.５重量％以下から、一般に約１重量％または少なくとも１重量％から、１５または２０重量％までであり、主に、液体容量、粘性等に基づき、選択される特定の投与方法にしたがって選択される。したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、無菌緩衝水１ｍＬ、および、本発明の遺伝子操作された抗体約１ｎｇ〜約１００ｍｇを含むように調製できる。望ましくは、該組成物は、本発明の抗体約５０ｎｇ〜約８０ｍｇ、より好ましくは、約５ｍｇ〜約７５ｍｇを含有してよい。同様に、静脈注入用の本発明の医薬組成物は、無菌リンゲル溶液約２５０ｍｌまで、および本発明の遺伝子操作された抗体約１〜約７５、好ましくは、５〜約５０ｍｇ／ｍｌを含むように作成できる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、周知であるか、または、当業者に明らかであり、より詳細には、例えば、Remington's Phar maceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvani aに記載される。本発明の治療および予防剤は、医薬調製物である場合、単位投与形態であるのが好ましい。適当な治療上有効用量は、当業者により容易に決定できる。ヒトまたは他の動物における炎症性障害を効果的に治療するには、体重７０ｋｇ当たり約０.１ｍｇ〜約２０ｍｇの本発明のタンパク質または抗体の一投与を非経口で、好ましくは、静脈内または筋肉内投与すべきである。必要ならば、かかる投与を、医師により適宜選択される適当な時間間隔で繰り返してもよい。本明細書で記載する抗体、改変抗体またはそのフラグメントは、保存用に凍結乾燥し、使用前に適当な担体中に復元できる。この方法は、慣用の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当該分野で公知の凍結乾燥および復元技術を用いることができる。別の治療方針では、本発明の改変抗体およびモノクローナル抗体は、ビトロネクチン受容体の小分子非ペプチドアンタゴニストとの上記疾患の併用治療において用いることができる。かかる小分子アンタゴニスト、用量および投与方針は、例えば、1996年1月11日に公開されたＰＣＴ出願公開WO96/00730および1996年1月 11日に公開されたＰＣＴ出願公開WO96/00574に開示されている（共に、引用して本明細書の記載とする）。かかる併用治療は、短期間、すなわち、数ヶ月〜６ヶ月間、患者に本発明の抗体を投与し、次いで、長期間、小分子アンタゴニストで長期治療的処置することを含んでもよい。別の具体例において、治療方法の具体例は、本発明の抗体による免疫療法と小さな非ペプチドアンタゴニスト治療との投与治療期間を交換することを伴ってよい。かかる併用治療方法は、免疫療法については上記の同一用量および非ペプチド治療については上記出願において特定された用量を用いる。Ｘ．診断的使用本発明の改変抗体および遺伝子操作された抗体は、また、ヒトα_vβ₃受容体媒介疾患の決定などの診断法において、または、かかる疾患の治療のトラッキングプログレスにおいて用いてもよい。診断試薬として、これらの改変抗体を、ＥＬＩＳＡ、および、血清、血漿もしくは他の適当な組織中のヒトα_vβ₃受容体レベルまたは培養物におけるヒト細胞による放出の測定のための他の慣用アッセイフォーマットにおいて用いるために慣用的に標識してもよい。改変抗体を用いるアッセイの性質は、慣用であり、本開示を限定するものではない。以下の実施例は、典型的な遺伝子操作された抗体の構築および適当なベクターおよび宿主細胞中でのその発現を含む本発明の種々の態様を示し、本発明の範囲を限定として示すものではない。全てのアミノ酸は、慣用の三文字略号または一文字略号で示す。全ての必要な制限酵素、プラスミド、ならびに、他の試薬および材料は、特記しない限り、市販されるものから入手した。全ての一般的なクローニングライゲーション、および、他の組換えＤＮＡ手法は、T．ManiatisらまたはSambrookら（共に上掲した）に記載されるように行った。実施例１：α_vβ₃、α_vβ₅、および、α_vβ₁受容体の精製以下のとおり、ヒト胎盤からヒトα_vβ₃タンパク質受容体および他のタンパク質受容体を精製した。胎盤は、出生直後に冷凍し、次いで、部分解凍し、小さなチャンクに切断し、市販の肉挽き器を用いて微細片に砕いた。通常、胎盤５〜１０個を一度に砕いた；該微細片を５０ｍｌの遠心分離管（胎盤当たり６管）に入れ、使用するまで−２０℃で冷凍保存した。個々のモノクローナル抗体を用いて、各インテグリンのイムノアフィニティーカラムを調製した。ケミコン・インターナショナル・インコーポレイテッド（Ch emicon International，Inc.）（カリフォルニア州テメキュラ）から購入したマウス腹水から抗α_vβ₃ｍＡｂ（ＬＭ６０９）を精製した。ハイブリドーマ媒体からモノクローナル抗体２３Ｃ６またはＤ１２を精製した。抗−α_vβ₅ｍＡｂ（Ｐ１Ｆ６）および抗−α_vβ₁ｍＡｂ（ｍＡｂ１６）は、ベクトン．ディッキンソン（Becton Dickinson）から購入した。Ｌ６０９または２３Ｃ６もしくはＤ１２（５０ｍｇ）、Ｐ１Ｆ６（２５ｍｇ）およびｍＡｂ１６（２５ｍｇ）をＡｆｆｉＧｅｌ１０（バイオラッド（BioRad））上に、製造者の使用説明書に従って樹脂１ｍｌ当たりｍＡｂ５ｍｇで固定した。非特異的結合タンパク質を除去するために、ＡｆｆｉＧｅｌ１０（〜２０ｍｌ）を１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.５）で処理し、エコノカラム（Econo Column）に充填した。固定化ｍＡｂを、エコノカラム（バイオラッド）、ＬＭ６０９または２３Ｃ６もしくはＤ１２では１０ｍｌのカラム、Ｐ１Ｆ６では５ｍｌのカラム、および、ｍＡｂ１６では５ｍｌのカラムに充填した。カラムを直列に連結した：第１のカラムは、非特異的結合についてのＡｆｆｉＧｅｌ１０を含有し、第２のカラムは、α_vβ₃ｍＡｂを含有し、第３のカラムは、α₅β₁ｍＡｂを含有し、第４のカラムは、α_vβ₅ｍＡｂを含有する。該カラムを冷所において緩衝液Ｔ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７.５、０.１ＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ、１％オクチルグルコシド）で平衡化した。砕いた胎盤（９管）を部分解凍し、緩衝液Ｔ＋６％オクチルグルコシド（ＯＧの最終濃度は、３％であった）中でスパチュラを用いて完全に分散させた。混合物を４℃で５時間または一夜貯蔵した。嵩高い溶液を２５０ｍｌの遠心分離用瓶に移し、１３，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。透明な上清を５０ｍｌの遠心分離管に移し、２０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。透明な上清を合わせ、上記したように直列形態で緩衝液Ｔ中で配置し予備平衡化したカラムに流速３０ｍｌ／時で負荷した。負荷の最後に、カラムを緩衝液Ｔ＞２５０ｍｌで洗浄した。次いで、個々のカラムを分離し、結合したインテグリンを０.２Ｍ酢酸で、溶出液のｐＨが＜３.０になるまで溶離した。溶出したインテグリン溶液を１Ｍトリズマ（Trizma）塩基で＞ｐＨ７.０に素早く中和した。カラムもまた、緩衝液Ｔで洗浄することにより中和した。溶出したインテグリン溶液（〜２５ｍｌ）を、５０００カットオフの透析バッグ中、アクアシド（Aquaside）ＩＩＩ（カルビオケム（Clbiochem））を用いて〜１ｍｇに濃縮した。濃縮インテグリンを緩衝液Ｔに対して一夜透析した。最終収量は、胎盤当たり各インテグリン約１ｍｇであった。実施例２：ネズミモノクローナル抗体の生成抗α_vβ₃活性を有するネズミｍＡｂは、Laneら，1986，Methods in Enzymol． 121:183にしたがって古典的なハイブリドーマ技術により生成した。一般に、α_v β₃受容体２０−５μｇをＢａｌｂ／ｃマウス２匹に、腹腔内、皮下、および、静脈内投与した。下記実施例３、４および５のアッセイにおいて、免疫化動物からの血清をそれらの抗−α_vβ₃結合および中和活性について試験した。正の血清を示すマウスからのマウス脾臓を、Laneらの方法（上掲）に従ってマウス骨髄腫細胞ＳＰ２と融合させた。その結果、抗ヒトα_vβ₃タンパク質抗体を分泌する可能性のあるハイブリドーマ細胞系１７個を得た。これらの抗α_vβ₃ｍＡｂは、慣用方法により生成および単離し、以下の実施例のアッセイで試験した。表Ｉは、従来技術のネズミｍＡｂＬＭ６０９および本発明のネズミｍＡｂについて下記実施例３−１２から回収した多数の初期データの要約である。このデータは、ｍＡｂＤ１２が好ましい活性プロフィルを有するｍＡｂであることを示した。次いで、これらの試験において適当に機能したｍＡｂＤ１２を、実施例１３に記載するヒト化のために選択し、次いで、実施例１６および１７の動物実験において試験した。Ｄ１２ｍＡｂはウサギと交差反応するため、再狭窄、脈管形成またはアテローム性動脈硬化症のウサギ実験のみが効力を試験するのに適している。実施例３：α_vβ₃とのＥＬＩＳＡ結合アッセイ種々の抗体構築物の、抗原としての精製ヒト胎盤α_vβ₃受容体タンパク質（ビオチン−アビジンを介してプレートまたはビースのいずれかに結合した受容体）への結合を標準的な固相ＥＬＩＳＡで測定した。０.１ＭＣＯ₃（ｐＨ９.２）で希釈した抗原をポリスチレン製丸底マイクロプレート（ダイナテック（Dynatech）、イムノロン（Immunolon）ＩＩ）に１８時間吸着させた。次いで、ウエルを、０.０５％トゥィーン２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。抗体（５０μｌ／ウェル）をＰＢＳ／０.０５％トゥィーン２０で希釈して様々な濃度にし、室温で２時間、抗原被覆ウエルに添加した。プレートを、Titertek ３２０マイクロプレート洗浄器を用いて、０.０５％トゥィーン２０を含有するＰＢＳで４回洗浄し、次いで、１：１０，０００に希釈したＨＲＰ−抗−マウスＩｇＧ（１００μｌ／ウエル）を添加した。５回洗浄した後、ｏ−フェニレンジアミン・二塩酸塩（ＯＰＤ）（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、プレートをさらに１０分間インキュベートした。０.１ＭＮａＦの添加により反応を停止し、ダイナテック（Dynatech）ＭＲ７０００ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。実施例４：α_vβ₃、α₅β₁およびαＩＩｂβ３とのＥＬＩＳＡ結合アッセイ抗原が別のヒト受容体α_vβ₅、α₅β₁またはα_IIbβ₃である以外は同一のプロトコールを用いて、実施例３のアッセイにおいてポジティブなｍＡｂをスクリーニングした。これらのアッセイを行って、αまたはβサブユニットのみに対する特異性とは対照的に、ヘテロダイマー抗原α_vβ₃に対する選択性を測定した。これらのアッセイの結果を実施例２の全てのｍＡｂおよびＬＭ６０９について下記表Ｉに示す。実施例５：中和化ＥＬＩＳＡアッセイヒト胎盤から精製したビトロネクチン受容体α_vβ₃（０.２μｇ／ウエル）を９６ウエルElisaプレート（コーニング（Corning）、ニューヨーク州ニューヨーク）に添加した。プレートを４℃で一夜インキュベートした。実験時、ウエルをアスピレーターにかけ、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭトリス、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ₂、１ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭＭｎＣｌ₂、ｐＨ７.４）０.１ｍｌ中、室温で１時間インキュベートして、非特異的結合を遮断した。遮断溶液をアスピレーターにかけた後、種々の濃度のｍＡｂをウエルに添加し、次いで、０.１％ＢＳＡを含有する緩衝液Ａ０.１ｍｌ中５ｎＭビオチニル化フィブリノーゲンを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートしたインキュベーション後、ウエルを充分にアスピレーターにかけ、結合緩衝液１００μｌで２回洗浄した。アルカリホスファターゼ（１：２０００希釈、シグマ（Sigma））に結合した抗ビオチン抗体０.１ｍｌを添加し、次いで、結合緩衝液で２回洗浄し、製造者の指示書に従って毎日製造した基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（アルカリホスフェート基質キット、バイオラッド（Bio−Rad）１００μｌを添加することにより、結合したフィブリノーゲンを定量化した。発色の測度は、マイクロプレートリーダーを用いて行った。このアッセイは、精製したα_vβ₃受容体とそのリガンドであるフィブロネクチンとの間の結合の阻害を検出した。これらのアッセイの結果は、実施例２の全てのｍＡｂおよびＬＭ６０９について上記表Ｉに示す。実施例６：フローサイトメトリーＡ．ネズミｍＡｂの特徴付け公知のネズミｍＡｂＬＭ６０９を用いて上記に従って得たネズミｍＡｂのいくつかを特徴付けするために、このアッセイを行って、ネイティブな細胞表面受容体への結合および種交差反応を検出した。すなわち、細胞を冷ＰＢＳ１０ｍｌで洗浄し、冷ＰＢＳに再懸濁して、細胞１×１０⁷〜２×１０⁷個／ｍｌを得る。０.１ｍｌ／ウエルのアリコートを９６ウエル「Ｖ」底プレートに添加する。次いで、第１抗体２５μｌを添加する。プレートを５分間振盪し、次いで、氷上で２５分間インキュベートする。プレートを５分間遠心分離し、フリックする。次いで、各ウエルの内容物を冷ＰＢＳ５０μｌに再懸濁し、再度、遠心分離し、フリックする。洗浄を繰り返し、内容物を冷ＰＢＳ５０μｌに再懸濁する。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識第２抗体（５０μｌ）を各ウエルに添加する。プレートを５分間振盪し、暗所で、氷上で２０分間インキュベートする。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（１ｍｇ／ｍｌ）／ＰＢＳ１μｌを添力旺て最終濃度１０μｇ／ｍｌ（０.１ｍｌ中１μｇ）にする。インキュベーションを５分間続け、次いで、遠心分離し、冷ＰＢＳで２回洗浄する。細胞を冷ＰＢＳ０.１ｍｌに再懸濁し、１２×７５の透明なFalcoln管に移した。容量を１ｍｌに調整し、フローにより測定するまで、細胞を暗所で冷たくしておく。第２抗体：ヤギ抗−マウスＩｇＧ,Ｍ,ＡをＦＩＴＣ１：２５／ＰＢＳ−０.２％ＢＳＡ−０.１％ＮａＮ₃（シグマ（Sigma）Ｆ１０１０ロット＃０４５Ｈ８８２２）で標識し、フローにより測定するまで、暗所で冷たくしておく。これらのアッセイの結果は、実施例２の全てのｍＡｂおよびＬＭ６０９について上記表Ｉに示す。ヒトおよびウサギ平滑筋細胞（ＳＭＣ）を用いるフローサイトメトリーは、ｍＡｂＬＭ６０９およびＤ１２の両方が細胞表面上のネイティブな受容体に結合する大きな能力を有することを示した。Ｂ．ネズミおよびヒト化抗体の特徴付け生育可能なヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胎芽腎細胞（ＨＥＫ２９３）およびウサギ平滑筋細胞（ＲＳＭＣ）上のα_vβ₃受容体を検出するそれらの能力について、実質的に上記した方法を用いて、フローサイトメトリーにより、実施例１３のネズミおよびヒト化ｍＡｂを試験した。図８は、ネズミＤ１２ｍＡｂ、ならびに、ヒト化ＨＺ−Ｄ１２ＩｇＧ₁およびＨＺ−Ｄ１２ＩｇＧ₄（実施例１３を参照）のアフィニティーがヒト細胞（ＨＵＶＥＣおよびＨＥＫ２９３）上で似ていることを示す。ウサギＳＭＣについて試験した場合、ヒト化ｍＡｂは、それらのアフィニティーを多少損なった。この結果から、Ｄ１２ｍＡｂが、ウサギ受容体に対するよりもヒトα_vβ₃に対する方が１０倍高いアフィニティーを有することが予想される。実施例７：免疫組織学Ａ．ヒト破骨細胞腫などの高レベルの受容体を発現する組織について免疫組織学を行った。免疫組織学（ヒト破骨細胞腫）からのデータは、Ｄ１２がＬ６０９よりもわずかに良好な検出能を有することを示した。表Ｉを参照。Ｂ．ターゲット確認表ＩＩに示す別のヒト腫瘍組織についての次なる免疫組織学は、ヒト腫瘍が α_vβ₃受容体を発現し、従って、ヒト化抗体および本発明の他の組成物を用いて免疫療法についての良好なターゲットであることを示した。実施例１３のヒト化ｍＡｂを含むＤ１２ｍＡｂもまた、ヒト血管に対してポジティブであることを試験した。下記表ＩＩにおいて、（＋）は、リガンド、例えば、組織におけるｍＡｂに対するα_vβ₃受容体の検出を示し；（−）は、かかるリガンドが存在しないことを示す。実施例８：受容体に対するアフィニティーを測定するためのＢＩＡｃｏｒｅＢＩＡｃｏｒｅ分析（ファルマシア（Pharmacia））を行って、ｍＡｂＤ１２およびＬＭ６０９（６ｎＭ）の固定したα_vβ₃との結合アフィニティーを測定した。センサー表面への受容体の固定化によりＢＩＡｃｏｒｅ技術を用い、ｍＡｂの溶液にこの表面を横切らせて、α_vβ₃とＤ１２およびＬＭ６０９との相互作用を研究した。計測およびセンサー表面の説明は、文献に開示されている［Brigha m-Burke，Edwards and O'Shannessy，1992，Analytical Biochem.，205:125-131 ］。リン脂質小胞中にα_vβ₃を挿入し、疎水性センサー表面でハイブリッド二層膜を生成することにより、αｖβ３を固定した。ＢＩＡｃｏｒｅセンサー表面でのハイブリッド二層膜の生成は、Plantら，1995，Analyt．Biochem.，226:342-3 48においてより完全に説明されている。ｍＡｂの試料にこの表面を横切らせ、それらが結合した測度、および、次に表面から解離した測度を測定し、装置と共にソフトウエアを用いて分析した。図３は、このデータを示すグラフである。測度定数および計算したアフィニティー定数(Ｋ_D）は、３重に行った３種類のｍＡｂ濃度（１００、２５、６ｎＭ）の分析から得た。ＢＩＡｃｏｒｅデータは、Ｄ１２の結合アフィニティー（Ｋ_D ）が５３０ｐＭであり、ＬＭ６０９については４６０ｐＭであることを示した。Ｂ．ネズミおよびヒト化ｍＡｂのアフィニティー測定値下記実施例１３および１４に詳述したようにネズミＤ１２ｍＡｂをヒト化した。これらの実施例における記載に従ってヒト化ＩｇＧ₁およびＩｇＧ₄ＨＺ−Ｄ１２抗体を作成した。上記Ａにおける記載に従ってＢＩＡｃｏｒｅによりネズミＤ１２およびヒト化ｍＡｂのアフィニティー測定値を測定した。表ＩＩＩに示した結果は、ヒト化Ｄ１２ｍＡｂのクラス交換が測定可能な影響を及ぼさなかったことを示す。データは、ヒト化により、Ｄ１２のアフィニティーが改変されなかったことを示す。実施例１０：血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）移動アッセイ新内膜の増殖を開始するための媒体から創傷部位への平滑筋細胞（ＳＭＣ）移動は、血管損傷後の必須のリモデリング応答である。血管ＳＭＣ移動は、ヒトα_v β₃受容体を介して媒介され、これは、ＶＳＭＣにおいて発現し、血管損傷の値にアップレギュレートする。ヒトα_vβ₃受容体のリガンドであるオステオポンチンは、血管形成術後にアップレギュレートされ、インテグリンを介してＶＳＭＣ移動を促進する。この実験を行って、インビトロでヒトα_vβ₃に対する抗体のＶＳＭＣ移動を阻害する能力を示した。ヒトまたはウサギ大動脈平滑筋細胞を用いた。８ｕｍの細孔を有するポリカーボネート膜（コースター（Costar））を用いることにより、トランスウエル細胞培養チャンバー中で細胞移動をモニターした。フィルターの株表面をビトロネクチンまたはオステオポンチンで被覆した。細胞を、細胞２.５−５.０×１０⁶個／ｍＬの濃度で０.２％ＢＳＡで補足したディフコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、２０℃で２０分間、種々の濃度の試験抗体で前処理した。対照として溶媒のみを用いた。細胞懸濁液０.２ｍＬをチャンバーの上部コンパートメントに置いた。下部コンパートメントハ、０.２％ＢＳＡで補足したＤＭＥＭ０.６ｍＬを含んだ。９５％空気／５％ＣＯ₂の雰囲気下、３７℃で２４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、フィルターの上部表面上の非移動細胞を穏やかにこすり落とすことにより除去した。次いで、フィルターをメタノール中に固定し、１０％ギームザ染色液で染色した。ａ）フィルターの下部表面に移動した細胞の数を計数すること、またはｂ）染色した細胞を１０％酢酸で抽出し、次いで、６００ｎＭで吸光度を測定することのいずれかにより移動を測定した。ＳＭＣ移動（ヒトおよびウサギ）の阻害は、ＬＭ６０９がＤ１２よりも強力であることを示した。表Ｉを参照。次のアッセイにおいて、再狭窄のウサギモデルにおいてネズミｍＡｂＤ１２および実施例１３のヒト化ＨＺ−Ｄ１２（ＩｇＧ₁）の効力を試験する前に、これらのｍＡｂを再度、ウサギＳＭＣ移動の阻害について試験した。図９に示した結果は、ネズミＤ１２がそのヒト化ＨＺ−Ｄ１２（ＩｇＧ₁）バージョンと比較して高い効力を有することを示す。実施例１１：接着の阻害を測定するためのＨＥＫ２９３細胞接着ヒト胎芽腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）は、ＡＴＣＣから入手した（カタログ番号ＣＲＬ１５７３）。イーグル塩、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するイーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）中で細胞を増殖した。 α_vサブユニットの３.２ｋｂＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩフラグメントおよびβ₃ サブユニットの２.４ｋｂＸｂａｌ−ＸｈｏＩフラグメントを、平滑末端ライゲーションによりＣＭＶプロモーターおよびＧ４１８選択マーカーを含有するｐＣＤＮベクターのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶクローニング部位に挿入した。安定な発現のために、ＨＥＫ２９３細胞８０×１０⁶個を、ジーン・パルサー（Gene Pul ser）［P．Hensleyら，1994，J．Biol．Chem.，269:23949-23958］を用いてα_v β₃構築物を用いてエレクトロトランスフォームし、１００ｍｍのプレートで平板培養した（細胞５×１０⁵個／プレート）。４８時間後、増殖培地を４５０μ ｇ／ｍｌのジェネチシン（Geneticin）（Ｇ４１８スルフェート、ＧＩＢＣＯ− ＢＲＬ、ミズーリ州ベテスダ）で補足した。コロニーがアッセイするのに充分に大きくなるまで、細胞を選択培地中に維持した。クローニング９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをヒトビトロネクチン（ＲＰＭＩ培地中０.２μｇ／ｍｌ）で、４℃で一夜予備被覆した。実験時、プレートをＲＰＭＩ培地で１回洗浄し、室温で１時間、ＲＰＭＩ培地中３.５％ＢＳＡでブロックした。トランスフェクトした２９３細胞を、細胞０.５×１０⁶個／ｍｌの密度で、２０ｍＭ Hepes、ｐＨ７.４および０.１％ＢＳＡで補足したＲＰＭＩ培地に再懸濁した。細胞懸濁液０.１ｍｌを各ウエルに添加し、種々のα_vβ₃アンタゴニストの存在下または不在下、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、１０％ホルムアルデヒド溶液（ｐＨ７.４）０.０２５ｍｌを添加し、細胞を室温で１０分間固定した。プレートをＲＰＭＩ培地０.２ｍｌで３回洗浄し、接着細胞を、室温で２０分間、０.５％トルイジンブルー０.１ｍｌで染色した。脱イオン水で大量に洗浄することにより過剰の染料を除去した。５０ｍＭＨＣｌを含有する５０％エタノール０.１ｍｌの添加により、細胞に取り込まれたトルイジンブルーを溶離した。マイクロタイタープレートリーダー（Titertek M ultiskan MC、バージニア州スターリング）で６００ｎｍの光学密度で細胞接着を定量化した。細胞接着の受容体阻害の中和は、Ｄ１２、実施例２の他のバックアップＭＡＢＳ、および、ＬＭ６０９が細胞接着を阻害することを示した（表Ｉおよび図５を参照）。実施例１２：脈管形成についてのインビボ・ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイを用いて、脈管形成に対するα_vβ₃アンタゴニストの役割を評価した。ヒトα_vβ₃タンパクは、脈管形成の間に脈管構造において発現しアップレギュレートする。ヒトα_vβ₃受容体の遮断は、脈管形成プロセスにおいて重要な工程である内皮細胞（ＥＣ）移動を阻害し、成熟血管に影響を及ぼさずに新血管においてＥＣアポトーシスを促進する。ＬＭ６０９またはＤ１２は、β−線維芽細胞増殖因子（β−ＦＧＦ）、または、自発的には、成長している肺のＣＡＭにより誘発される脈管形成を阻害する。ＣＡＭアッセイ方法における重要な特徴を以下に記載する。１０日齢のニワトリの受精卵のＣＡＭを用いてＣａｍアッセイを行う。直径５ｍｍのワットマン（Whatman）＃１フィルターを３ｍｇ／ｍｌのコルチゾン溶液（９５％エタノールで調製した）中に浸漬し、風乾した。コルチゾンを用いて、フィルターに対する炎症応答を低下させる。フィルターを、脈管形成を刺激するためにβ−ＦＧＦの１−６ｕｇ／ｍｌ溶液中で飽和させ、（緩衝液対照としてHe pes緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）を用いる）、ＣＡＭ中の無血管域に置いた。 β−ＦＧＦ刺激後、０、１、２および３日目に、フィルターディスクにＬＭ６０９またはＤ１２（〜１００ｕｇ）を＜２０μｌの容量で適用する。４日目、ＣＡＭを分析し、立体顕微鏡を用いてフィルターの下の血管分岐点の数を計数することにより、脈管形成を定量化する。このアッセイは、受容体の結合アフィニティーとＥＣ移動の阻害とのポジティブな関係を示す。このアッセイは、実施が非常に困難であるが、ヒトα_vβ₃受容体が脈管形成において役割を果たすことを示した。本発明の抗−α_vβ₃抗体は、このアッセイにおいてβ−ＦＧＦ誘発脈管形成を阻害することを示す。表Ｉを参照。実施例１３：ヒト化Ｄ１２の作成Ａ．重鎖および軽鎖可変領域の作成ヒト化ストラテジーを適用して、抗原結合親和力を充分に保持した最大にヒト化したｍＡｂを得た。ネズミｍＡｂＤ１２の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＫ）のｃＤＮＡをクローン化し、配列決定した。ＶＨＤ１２の配列は、上記のように定義したＣＤＲと一緒に配列番号１および２に示し、ＶＫＤ１２の配列は、同定したＣＤＲと一緒に配列番号６および７に示す。ｃＤＮＡクローニングおよび配列分析後、ＶＨＤ１２およびＶＫＤ１２は、各々、ＫａｂａｔＶＨサブグループＩ［配列番号３］およびＫａｂａｔＶＫサブグループＩＩＩ［配列番号８］と最も似ていることが判明した。Ｄ１２のＣＤＲ領域と一緒にヒトＶ領域コンセンサス配列のフレームワーク領域を組み合わせることにより、ヒト化ＶＨおよびＶＬ領域を分析した。公知の結晶構造を用いるＤ１２の分子リモデリングにより、ＣＤＲループと接触でき、これによりそれらのコンフォメーションに影響を及ぼすある種のＶＨおよびＶＬフレームワークが明かになる。したがって、かかるフレームワーク残基は、特定の抗原特異性の形成に直接寄与することができる。７つのかかるネズミＶＨフレームワーク残基および３つのネズミＶＫフレームワーク残基をヒトコンセンサスフレームワーク領域に導入し、Ｄ１２ＨＺＨＣ１−０［配列番号４および５］およびＤ１２ＨＺＬＣ１−０［配列番号９および１０］を得た。Ｂ．α_vβ₃Ｄ１２ｍＡｂ重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ配列分析製造者のプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（ライフ・テクノロジズ（Li fe Technologies）カタログ番号１５５９６−０２６）を用いて、ＲＮＡ全体を精製した。ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、水で処理したジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）に溶解した。製造者のプロトコールに従ってPoly-A Qui k ｍＲＮＡ単離キット（ストラータジーン（Stratagene）カタログ番号２００３４９）を用いて、ポリＡ⁺ＲＮＡを単離した。プライミング用ｄＴオリゴを用いて、製造者の指示書に従ってＲＴ−ＰＣＲキット（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、カタログ番号１４８３−１８８）を用いて、ＲＮＡの１００ｎｇアリコートを逆転写した。重鎖については、５つのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＰＣＲ増幅を、マウスＩｇＧ₁ ヒンジプライマー5'TCT-TGT-CCA-CCT-TGG-TGC-TGC-TG3'［配列番号２２］およびＮ−末端タンパク質配列をベースとした重鎖分解プライマー5'(G/C)(A/T) (G/A)-GT(C/T)-CA(G/A)-CT(G/T/C)-CA(A/G)-CA3'［配列番号２３］を用いて２５サイクル行った。同様に、軽鎖については、５つのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＰＣＲ増幅を、マウスカッパプライマー5'GCA-CCT-CCA-GAT-GTT-AAC-TGC3'［配列番号２４］およびＮ−末端タンパク質配列をベースとしたプライマー5'GAC-ATT-GTG-CTG-AC T-CAG-TCT-CCA-GCC-A3'［配列番号２５］を用いて２５サイクル行った。ＰＣＲＤＮＡを０.８％アガロースゲル上で分析した。適当な大きさ、すなわち、重鎖について〜７００ｂｐおよび軽鎖について〜７００ｂｐのＰＣＲ挿入体をサンガー法の変形法により配列決定した。全部で１０個の重鎖および軽鎖の配列を比較して、配列番号４および５に示すコンセンサスＤ１２重鎖可変領域配列ならびに配列番号９および１０に示すコンセンサスＤ１２軽鎖可変領域配列を作成した。配列番号４、５、９および１０において、ＣＤＲを同定する；重鎖および軽鎖の両方についてＤＮＡ配列の最初の１７個の塩基は、作成したＰＣＲプライマーである。しかしながら、翻訳したタンパク質配列は正確である。Ｃ．Ｄ１２のヒト化本明細書に記載のヒト化Ｄ１２抗体は、合成コンセンサス重鎖Ｄ１２ＨＺＨＣ１−０［配列番号４および５］および合成コンセンサス軽鎖Ｄ１２ＨＺＬＣ１ −０［配列番号９および１０］からなる。抗体を以下のとおり構築した。ｉ．Ｄ１２ＨＺＨＣ１−０の構築合成可変領域ヒト化重鎖を、Ｋａｂａｔにより定義されたコンセンサスヒトサブグループＩフレームワークおよび従前に記載されたＤ１２ネズミ重鎖ＣＤＲを用いて設計した。ＣＤＲ表示に影響を及ぼす７つのネズミフレームワークアミノ酸置換を、配列番号５のアミノ酸２８、４８、６７、６８、７０、７２および７４で行った。以下の配列をコードする４つの重複する合成オリゴヌクレオチドを作成した：アニール化および伸長した後、オリゴヌクレオチド配列は、改変されるヒト化重鎖可変領域を表すアミノ酸をコードする。各々、配列番号１１および１２は、合成重鎖の中間体のＤＮＡおよびアミノ酸配列であり、すなわち、改変されるＤ１２重鎖可変領域を表す。次いで、この合成遺伝子を、ＰＣＲプライマーSBA883 :TGCAACTAGT GCAGTCTGGA GCTGAGGT［配列番号３０］およびSBA884:CCAGGGTACC T TGGCCCCAG［配列番号３１］を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ＴＡクローニングキット、インビトロゲン（Invitrogen）、カタログ番号Ｋ２０００− ０１）にライゲートし、ＳｐｅＩ、ＫｐｎＩ制限消化後に単離した。このＤＮＡフラグメントを、ＳｐｅＩおよびＫｐｎＩで制限消化したベクターＦ９ＨＺＨＣ１−１にライゲートした。Ｆ９ＨＺＨＣ１−１は、プラスミドｐＣＤＮ［A．Nambiら，1994，Mol．Cell．Biochem.，131:75-85］およびｐＰＨＺＨＣ２−３ｐｃｄ［ＰＣＴ出願公開番号WO94/05690］の変異体である。これらのｐＣＤ変異体プラスミドベクターは、一般に、ｐＵＣ１９バックグラウンドにおいて、ベータラクタマーゼ遺伝子、ＳＶ４０複製起点、サイトメガロウイルスプコモーター配列、選択されたヒト重鎖、ウシ成長ホルモンのポリＡシグナル、ベータグロビンプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および別のＢＧＨ配列ポリＡシグナルを含有する。Ｆ９ＨＺＨＣ１−１は、さらに、成熟重鎖の最初の３つのアミノ酸を含むキャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ）シグナル配列、ヒトコンセンサスフレームワーク４の残部、および、ヒトＩｇＧ₁定常領域を含有する。Ｆ９ＨＺＨＣ１−１ベクターは、フレームワーク２の最後の残基（上記国際出願に開示されているアミノ酸４９）がＳｅｒからＡｌａに変異するｐＦＨＺＨＣ２−３ｐｃｄベクターの単一のアミノ酸突然変異を含有する。宿主細胞においてトランスフェクトし培養した後、得られたベクターｐＤ１２ＨＺＨＣ１−０ｐｃｄは、配列番号４および５に示すヒト化重鎖Ｄ１２ＨＺＨＣ１−０を生産する。ｉｉ．Ｄ１２ＨＺＬＣ１−０の構築Ｋａｂａｔにより定義されたコンセンサスヒトサブグループＩＩＩカッパフレームワークおよび従前に記載されたＤ１２ネズミ軽鎖ＣＤＲを用いて合成可変領域ヒト化軽鎖を設計した。ＣＤＲ表示に影響を及ぼす３つのフレームワークアミノ酸置換は、アミノ酸残基１、４９および６０で行った［配列番号９および１０］。４つの重複する合成オリゴヌクレオチドを作成した：アニール化および伸長した後、これらの配列は、ヒトカッパ定常領域の最初の５つのアミノ酸を含む改変される軽鎖可変領域の部分を表すアミノ酸をコードする。配列番号１３および１４は、各々、合成軽鎖の中間体のＤＮＡおよびアミノ酸配列であり、すなわち、ヒトカッパ定常領域の最初の５つのアミノ酸を含む改変されるＤ１２軽鎖可変領域の部分を表す。次いで、この合成遺伝子を、ＰＣＲプライマーSBA1277:GACATAGTAC TGACTCAGTC TCCAGGC［配列番号３６］およびSBA 1278:GGCGCCGCCA CAGTACG［配列番号３７］を用いて増幅し、上記ｐＣＲ２０００ベクターにライゲートし、ＳｃａＩ、ＮａｒＩ制限消化後に単離した。可変領域の最初の３つのアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列をコードするＤＮＡフラグメント［配列番号１８および１９］を、ある種のプライマーを用いてベクターＦ９ＨＺＬＣ１−１をＰＣＲ処理することにより作成した。ベクターＦ９ＨＺＬＣ１−１は、ｐＣＤＮベクター［Nambiら，上掲］およびｐＦＨＺＬＣＬ−１−ｐｃｎ［ＰＣＴ出願公開番号WO94/05690］の別の変異体である。これらのｐＣＮ変異体プラスミドベクターは、一般に、ｐＵＣ１９バックグラウンドにおいて、ベータラクタマーゼ遺伝子、ＳＶ４０複製起点、サイトメガロウイルスプロモーター配列、選択されたヒト化軽鎖、ウシ成長ホルモンのポリＡシグナル、ベータグロビンプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子および別のＢＧＨ配列ポリＡシグナルを含有する。Ｆ９ＨＺＬＣ１−１は、さらに、ヒトフレームワーク４の残部、および、カッパ定常領域、ならびに、フレームワーク２におけるｐＦＨＺＬＣＬ−１−ｐｃｎベクターの単一アミノ酸突然変異（ＳｅｒからＰｒｏへ）を含有する。用いたＰＣＲは、SB8694:GGAGACGCCA TCGAATTCTG A［配列番号３８］およびSBA1224:AGACTGTGTC AGTACTATGT CGGAGTGGAC ACC［配列番号３９］であり、Ｆ９ＨＺＬＣ１−１は、ＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩで制限消化した。これらの２つのフラグメントをベクターｐＦＨＺＬＣＬ−１−ｐｃｎにライゲートし、ＥｃｏＲＩおよびＮａｒＩで制限消化した。得られたベクターｐＤ１２ＨＺＬＣ１−１−ｐｃｎは、宿主細胞中で培養した後、ヒト化Ｄ１２ＨＺＬＣ１ −０［配列番号９および１０］を生産する。Ｄ．哺乳動物細胞におけるヒト化抗体の発現上記重鎖ベクターｐＤ１２ＨＺＨＣ１−０ｐｃｄおよび軽鎖ベクターｐＤ１２ＨＺＬＣ１−１−ｐｃｎを用いて、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞中で抗体ＨｕＤ１２を生産した。最初の特徴付けのために、実質的にCurrent Protocols in Molecular Biology （F.M.Ausubelらにより編集された、1988，John Wiley & Sons，vol.，section 9.1）における記載に従って、ヒト化ＨｕＤ１２重鎖および軽鎖をＣＯＳ細胞中で発現させた。すなわち、ＣＯＳ細胞を書くプラスミド１０μｇでコトランスフェクトした。トランスフェクション後、１日目に、培養増殖培地を無血清培地と交換し、これは、３日目に変化した。無血清培地は、専売処方であるが、ＩＴＳ^TMプレミックス（インスリン、トランスフェリン、セレニウム混合物− コラボレイティブ・リサーチ（Collaborative Research）、マサチューセッツ州ベッドフォード）および１ｍｇ／ｍｌＢＳＡで補足したＤＭＥＭを用いて充分な結果が得られる。例えば、Prosep Aアフィニティー樹値（バイオプロセシング・リミテッド（Bioprocessing Ltd.）、英国）を用いて、標準的なタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィ法（例えば、Protocols in Molecular Biology に記載されている）により３日＋５日調整培地からｍＡｂを単離し調製した。ヒト化Ｄ１２は、一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞においてカッパ分子をγ１として発現した。この培養物の上清は、上記ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅアッセイの両方においてα_vβ₃受容体に結合することが判明した。多量のＨｕＤ１２ｍＡｂ（１００−２００ｍｇ）を生産するために、専売ＣＨＯ細胞系であるＣＨＯ−Ｅｌａ細胞系にプラスミドを導入した。この細胞系は、多量のｍＡｂ（各々、役１０ｍｇ）を供給し、キメラおよびヒト化抗体の両方の活性プロフィルを試験することができる。しかしながら、従前に開示された［ P．Hensleyら、上掲］ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を用いて同様の結果が得られるであろう。すなわち、合計３０μｇの線状プラスミドＤＮＡ（重鎖または軽鎖プラスミド各１５ｕｇ）を細胞１×１０⁷個にエレクトロポレートする。細胞は、まず、９６ウエルプレート中、無ヌクレオチド培地中で選択される。３〜４週間後、増殖ポジティブウエルからの培地を、実施例３のＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒト免疫グロブリンについてスクリーニングする。最も高く発現するコロニーを増殖し、トランスフェクトしたベクターの増幅のためにメトトレキセートの濃度を増加させて選択する。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー（タンパク質Ａセファロース、ファルマシア）、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス（Superdex）２００、ファルマシア）を用いて標準的な方法により抗体を調整培地から精製する。溶出した抗体の濃度および抗原結合活性は、実施例３および４のＥＬＩＳＡアッセイにより測定する。抗体含有フラクションをプールし、さらに、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。２つのかかるヒト化Ｄ１２抗体、上記ＩｇＧ₁抗体およびＩｇＧ₄バージョン（ＩｇＧ₄定常領域を用いた以外は、上記と同様に調製した）を作成した。ＨＺ− Ｄ１２（ＩｇＧ₁）は、安定なＣＨＯ発現細胞系において生産される。フェーズＩ生産のために許容される５０ｎＭＭＴＸ系を作成した（３００ｍｇ／リットル）。さらなる系、すなわち、１５０ｎＭＭＴＸ系（４００ｍｇ／リットル）および４５０ｎＭＭＴＸ系を評価する。ネズミおよびヒト化Ｄ１２は、ヒヒからのＶＳＭＣと交差反応し、ＳＭＣを阻害する。ネズミおよびヒト化Ｄ１２は、ヒトＥＣ移動を阻害する。実施例１４：Ｄ１２ＨＺＲＥＩの構築第２の構築物は、ＲＥＩコンセンサスフレームワークをベースとする軽鎖を有しており、ヒト化Ｄ１２産生細胞系において不安定な発現の場合には別の軽鎖を提供する。第１の変異体は、種々のＶＫＣＤＲ残基と接触すると予想される５つのネズミフレームワーク残基を導入する。すなわち、修飾ヒトＲＥＩカッパ鎖フレームワークおよび従前に開示されたＤ１２ＣＤＲをベースとして合成ヒト化カッパ鎖を設計した。配列番号１５は、修飾ヒトＲＥＩカッパ鎖フレームワークのアミノ酸配列である。５つのドナー（ネズミＤ１２）フレームワーク残基を、ＣＤＲ表示に影響を及ぼす、モデリング実験で定義した位置で導入した。４つの重複合成オリゴヌクレオチドを作成した：これらの合成オリゴヌクレオチド配列をアニール化し、伸長した後、それらは、Ｊｋ遺伝子セグメントにおいて見出される非常に高く保存されたＫｐｎＩ部位を含む、改変される軽鎖可変領域の部分を表すアミノ酸をコードする。配列番号１６は、Ｊｋ遺伝子セグメントのＤＮＡ配列を示し、配列番号１７は、その遺伝子産物のアミノ酸配列である。次いで、この合成遺伝子を、２つのＰＣＲプライマーSBA 3170:5'gac atA GTA CTG ACT CAG TCT CCA AGC 3'[配列番号４４];およびSBA 3171:5'ttc cac ctt G GT ACC CTG GCC GAA CGT GAA AGG 3'[配列番号４５］を用いて増幅し、上記ｐＣＲ２００ベクターにライゲートし、ＳｃａＩ、ＫｐｎＩ消化後に単離した。配列番号１８および１９に示すＣＡＭＰＡＴＨシグナル配列に対応するＤＮＡフラグメントは、上記軽鎖ベクターｐＤ１２HＺＬＣ１−１−ｐｃｎのＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ消化後に単離した。これらの２つのフラグメントは、ｋ定常領域を含有するＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した同一ベクターから単離した大きいフラグメントと一緒にライゲートした。得られた配列は、合成軽鎖Ｄ１２ＨＺＲＥＩのものであった。配列番号２０および２１は、各々、修飾ヒトＲＥＩカッパ鎖フレームワークをベースとする合成ヒト化カッパ鎖Ｄ１２ＨＺＬＣＲＥＩのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。制限酵素エンドヌクレアーゼ切断部位は、以下の配列の位置にある：ＳｃａＩ（AGTACT；ヌクレオチド６−１１）；ＡｖｒＩＩ（CCTAGG；ヌクレオチド１３０−１３５）；ＥｃｏＲＩ（GAATTC；ヌクレオチド２７３−２７８）およびＫｐｎＩ（GGTACC；ヌクレオチド３１０−３０６）。実施例１５：インビボ・ウサギ再狭窄アッセイ実施例１０の記載に従って、ヒトα_vβ₃受容体のリガンドであるオステオポンチンは、血管形成術後にアップレギュレートし、インテグリンを介してＶＳＭＣ移動を促進する。ヒトα_vβ₃受容体に対する抗体は、インビボで新内膜形成を防御する。ウサギモデルは、以下のとおり機能する。０日目に、正常な３ｋｇのウサギから血漿試料を採取する。次いで、ウサギを鎮静させ、該動物に損傷（すなわち、腸骨動脈の内皮露出）を与える。内皮の露出は、３ｆｒ塞栓切除バルーン付カテーテルを３回通過させて行う。予備実験は、病変発生が１００％であり、新内膜領域の３５％減少を検出するために、各グループにおいてウサギ１０−１２匹が必要であることを示す。１、２および３日目に、該ウサギにネズミＤ１２ｍＡｂを投与した。投与量は、９ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇを静脈内デリバーした。０、１、２および２１日目に、ｍＡｂ測定のために血漿試料を回収し、各動脈から作成した組織片に対して形態計測分析を行う。次いで、損傷後、２１日目に新内膜形成および血管リモデリングを定量化する。内腔面積および全血管面積の増加は、損傷後のリモデリングを示す。図１０Ａ−１０Ｄは、２つの別々の研究の結果を示す。図１０Ａおよび１０Ｃは、２つの研究（２種類の投与量）において、２１日目の対照またはＤ１２ｍＡｂにより処理した内腔面積を測定する。図１０Ｂおよび１０Ｄは、２つの研究（２種類の投与量）における対照またはＤ１２ｍＡｂにより処理した全血管面積を測定する。このデータは、ネズミＤ１２ｍＡｂが再狭窄のウサギモデルにおいて効力を示し、損傷した血管のポジティブなリモデリング（内腔増大）を生じたことを示すことを示す。実施例１６：癌／脈管形成のＳＣＩＤモデルヒト皮膚を移植し、拒絶反応しなかった［例えば、P．W．Soballeら，1996，C ancer Res.，56:757-764を参照］、重症複合型免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）モデルは、脈管形成性新血管形成の供給源として供することができ、次いで、ヒト腫瘍を受けることができる。このモデルを、Ｄ１２ｍＡｂおよびＨｕＤ１２抗体の効力試験のために用いる。すなわち、このモデルにおいて、ヒト皮膚をマウスに移植した。ヒト腫瘍細胞をヒト皮膚移植片に注入し、腫瘍の増殖を測定する。ヒト皮膚移植片は、腫瘍増殖に必要なヒト新血管構造を供給する。該動物をネズミＤ１２またはヒト化Ｄ１２で処理し、その未処理対照と比較して腫瘍増殖の遅延が観察された。腫瘍増殖の阻害は、Ｄ１２ｍＡｂ（ヒト抗−α_vβ₃ポジティブ、ネズミ抗− α_vβ₃ネガティブ）がα_vβ₃依存性脈管形成の阻害において役割を果たすことを示した。予備試験データは、主用増殖がＤ１２ｍＡｂで処理した動物において遅延したことを示した。これらのデータは、「脈管形成」を治療することが腫瘍増殖を予防するという仮説を支持する。下記表ＩＶは、免疫組織学により、ヒト皮膚がポジティブな抗−α_vβ₃染着を示さないことを示す。しかしながら、腫瘍が皮膚において増殖した場合、新血管構造は、ポジティブなＤ１２を示し、α_vβ₃がこの腫瘍病変において発現することを示す。実施例３〜１６の結果は、Ｄ１２およびＨｕＤ１２抗体がインビトロで有効な抗−受容体活性を有しており、動物モデルにおいてインビボで予防的および治療的効力を示すことを立証する。本発明は、前記説明および実施例に特に記載したもの以外について実施してもよいことは、明らかである。本明細書で引用した全ての刊行物は、引用により本明細書の記載とする。本発明の多くの変更および変形は、上記教示の権利範囲内であり、したがって、請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 27/02 27/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 35/04 35/04 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者テイラー，アレキサンダー・エイチアメリカ合衆国19073ペンシルベニア州ニュータウン・スクエア、デルチェスター・ロード978番

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号４および５の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含有する重鎖を含む、ヒトα_vβ₃タンパク質受容体と特異的に反応し、該受容体を中和する能力を有する改変抗体およびその抗体の機能的フラグメント。２．配列番号９および１０の少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含有する軽鎖を有する請求項１記載の抗体。３．重鎖が配列番号４および５の３つのＣＤＲを含有する請求項１記載の抗体。４．軽鎖が配列番号９および１０の３つのＣＤＲを含有する請求項３記載の抗体。５．配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列および配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含有する請求項１記載の抗体。６．配列番号１５の軽鎖アミノ酸配列および配列番号５の重鎖アミノ酸配列を含有する請求項１記載の抗体。７．配列番号５の重鎖アミノ酸配列およびヒト抗体の軽鎖を含有する請求項１記載の抗体。８．フラグメントがＦｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')₂からなる群から選択される請求項１記載の抗体。９．（ａ）請求項１−８のいずれか１項記載の抗体およびフラグメントのいずれかをコードする核酸配列；（ｂ）（ａ）の配列のいずれかと相補的な核酸；および（ｃ）ストリンジェント条件下、（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズする能力を有する１８またはそれ以上のヌクレオチドからなる核酸配列からなる群から選択される単離核酸分子。１０．請求項９の核酸配列を含有する組換えプラスミド。１１．請求項１０のプラスミドを含有する宿主細胞。１２．時間、温度およびｐＨの適当な条件下、培地中で請求項１１記載の宿主細胞を培養し、そうして生産された抗体を回収することを特徴とする、ヒトα_v β₃受容体に対して特異的なヒト抗体の生産方法。１３．過剰発現したヒトα_vβ₃受容体を含有すると思われる源を請求項１記載の抗体の診断上有効量と接触させ、抗体の該源への結合を測定することを特徴とする、ヒトα_vβ₃受容体の過剰発現により特徴付けられる障害の検出方法。１４．医薬上許容される担体中、請求項１記載の抗体の免疫療法上有効量を少なくとも１回用量含有する医薬組成物。１５．少なくとも１つの別のモノクローナル抗体と組み合わせて、請求項１記載の抗体の免疫療法上有効量を少なくとも１回用量含有する医薬組成物。１６．別のモノクローナル抗体が、ヒトα_vβ₃タンパク質の異なるエピトープと反応することにより請求項１記載の抗体とは異なるヒトα_vβ₃抗体である請求項１５記載の医薬組成物。１７．ヒトα_vβ₃受容体と特異的に反応し、該受容体を中和し、配列番号１および２の少なくとも１つのＣＤＲ配列を含有する重鎖を有することを特徴とする、ネズミモノクローナル抗体およびその機能的フラグメント。１８．配列番号６または７の少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含有する軽鎖を有する請求項１７記載の抗体。１９．重鎖が配列番号１または２の３つのＣＤＲを含有する請求項１７記載の抗体。２０．軽鎖が配列番号６または７の３つのＣＤＲを含有する請求項１７記載の抗体。２１．配列番号７の軽鎖アミノ酸配列および配列番号２の重鎖アミノ酸配列を含有する請求項１７記載のモノクローナル抗体。２２．フラグメントがＦｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ')₂からなる群から選択される請求項１７記載のモノクローナル抗体。２３．請求項１記載の抗体の免疫療法上有効量をヒトに投与することからなることを特徴とする、ヒトにおいてビトロネクチン受容体により媒介される疾患に受動免疫療法を与える方法。２４．受動免疫療法が予防的に与えられる請求項２３記載の方法。２５．疾患が再狭窄である請求項２３記載の方法。２６．疾患が脈管形成関連疾患である請求項２３記載の方法。２７．疾患が、癌転移、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症および黄斑変性からなる群から選択される請求項２６記載の方法。２８．ヒトにおいてビトロネクチン受容体により媒介される疾患に受動免疫療法を与えるための薬物の製造における請求項１記載の抗体の使用。２９．請求項１記載の抗体の免疫療法上有効量をヒトに投与し、該受容体のアンタゴニストである小型化学分子の治療上有効量をかかるヒトに投与することからなることを特徴とする、ヒトにおけるビトロネクチン受容体により媒介される疾患の治療方法。３０．抗体が小型分子の投与前にヒトに投与される請求項２９記載の方法。