DE69736197T2

DE69736197T2 - Antikoagulierende humanisierte Antikörper gegen Faktor IX, zur Verwendung in der Behandlung von Thrombose

Info

Publication number: DE69736197T2
Application number: DE69736197T
Authority: DE
Inventors: Neal Michael Phoenixville BLACKBURN; Robert William Burlington CHURCH; Zeev Giora Wynnewood FEUERSTEIN; Stuart Mitchell Wayne GROSS; John Andrew Chester Springs NICHOLS; Agustin Eduardo Kensington PADLAN; Haribhai Arunbhai Phoenixville PATEL; Robert Daniel Phoenixville SYLVESTER
Original assignee: University of Vermont; University of Vermont and State Agricultural College; SmithKline Beecham Corp
Current assignee: University of Vermont; University of Vermont and State Agricultural College; SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1996-01-17
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2017-01-18
Also published as: CN1213312A; PL187274B1; NZ331014A; PT1007089E; HUP9900396A2; MX9805810A; US20020146411A1; AU1830897A; SI1007089T1; EP1832297A1; KR19990077329A; KR100553629B1; EP1007089B1; AU706397B2; IL125380A0; DE69736197D1; JP2000503210A; NO983284D0; DK1007089T3; JP2007325602A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft humanisierte monoclonale Antikörper (mAbs), welche an einen menschlichen Gerinnungsfaktor oder Kofaktor binden und ihre Verwendung als selbstbegrenzende Inhibitoren von Thrombosen.
Hintergrund der Erfindung
Unter normalen Umständen löst eine Verletzung von Gefäßendothelzellen die ein Blutgefäß auskleiden, sei sie nun klein oder groß, durch eine Abfolge von Ereignissen die allgemein als „Gerinnungskaskade" bezeichnet werden eine hämostatische Reaktion aus. Die Kaskade gipfelt in der Umwandlung von löslichem Fibrinogen in unlösliches Fibrin, welches zusammen mit Blutplättchen ein lokalisiertes Gerinnsel oder einen Thrombus bildet, welches/r die Extravasation von Blutbestandteilen verhindert. Dann kann die Wundheilung gefolgt von der Auflösung des Gerinnsels und der Wiederherstellung der Unversehrtheit des Blutgefäßes und des Flusses erfolgen.
Die Ereignisse, welche zwischen der Verletzung und Gerinnselbildung auftreten, sind sorgsam regulierte und verknüpfte Serien von Reaktionen. Kurzgesagt zirkulieren eine Menge von Plasmagerinnungsproteinen als inaktive Proenzymformen und Kofaktoren im Blut. Aktive Enzymkomplexe werden am Ort einer Verletzung zusammengebaut und werden sequentiell zu Serinproteasen aktiviert, wobei jede der aufeinanderfolgenden Serinproteasen die nachfolgende Aktivierung von Proenzym zu Protease katalysiert. Diese enzymatische Kaskade führt im Ergebnis dazu, dass jeder Schritt die Wirkung des nachfolgenden Schrittes verstärkt. Für einen Überblick über die Gerinnungskaskade siehe das erste Kapitel von "Thombosis and Hemorrhage", J. Loscalzo und A. Schafer, Herausgeber, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1994).
Während eine effiziente Gerinnung den Verlust von Blut am Ort einer Verletzung begrenzt, ist die unangebrachte Bildung von Thromben in Venen und Arterien eine häufige Ursache von Invalidität und Tod. Eine anormale Gerinnungsaktivität kann von Erkrankungen wie myokaridaler Infarkt, instabile Angina, Vorhofflimmern, Apoplex, Nierenschäden, perkutane transluminale coronare Angioplastie, disseminierte intravasale Koagulation, Sepsis, Lungenembolie und tiefe Venenthrombose herrühren und/oder zu deren Behandlungen führen. Die Bildung von Gerinnseln auf fremden Oberflächen von künstlichen Organen, Shunts und Prothesen wie künstlichen Herzklappen ist ebenfalls problematisch.
Zugelassene gerinnungshemmende Wirkstoffe, welche zur Zeit bei der Behandlung dieser Erkrankungen und anderer thrombotischer und embolischer Erkrankungen verwendet werden, schließen die sulfatierten Heteropolysaccharide Heparin und niedermolekulares (LMW) Heparin ein. Diese Wirkstoffe werden parenteral verabreicht und können eine schnelle und vollständige Hemmung der Gerinnung durch Aktivierung des Thrombininhibitors Antithrombin III und Inaktivierung aller Gerinnungsfaktoren bewirken.
Aufgrund ihrer Wirkstärke leiden Heparin und LMW-Heparin jedoch an Nachteilen. Eine unkontrollierte Blutung als Folge der einfachen Belastungen durch Bewegung und begleitender Kontakte mit physikalischen Objekten oder an Stellen chirurgischer Eingriffe ist die bedeutendste Komplikation und wird in 1 bis 7 % der Patienten, welche eine Dauerinfusion erhalten, und in 8 bis 14 % der Patienten, welchen intermittierende Bolusdosen verabreicht werden, beobachtet. Um dieses Risiko zu minimieren, werden kontinuierlich Proben abgenommen, um die kontinuierliche Überwachung der Gerinnungszeiten ex vivo zu ermöglichen, was wesentlich zu den Kosten der Therapie und den Unannehmlichkeiten für den Patienten beiträgt.
Des weiteren ist der therapeutische Zielbereich zur Erreichung des gewünschten Spiegels der Wirksamkeit ohne den Patienten einem Risiko für Blutungen auszusetzen eng. Der therapeutische Bereich ist annähernd 1 bis zu weniger als 3 μg Heparin/ml Plasma, was zu Testzeiten von etwa 35 bis etwa 100 Sekunden für die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) führt. Das Erhöhen der Heparinkonzentration auf 3μg/ml überschreitet den Zielbereich und bei Konzentrationen über 4 μg/ml ist eine Gerinnungsaktivität nicht nachweisbar. Also muss man große Vorsicht walten lassen, um die Plasmakonzentrationen des Patienten im therapeutischen Bereich zu halten.
Ein anderes zugelassenes Antikoagulans mit langsamerer und länger anhaltender Wirkung ist Warfarin, ein Coumarinderivat. Warfarin wirkt durch Kompetition mit der Vitamin K-abhängigen posttranslationalen Modifikation von Prothrombin und anderen Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren.
Das allgemeine Schema der Wirkung von Antikoagulantien, in welchem Blut bei Konzentrationen ungerinnbar gemacht wird, die nur leicht höher sind als der therapeutische Bereich, wird sowohl bei Warfarin als auch bei Heparin und LMW-Heparin beobachtet. Bessas et al. (Thrombosis Research) 40 (1985): 863-867, offenbaren Antikörper aus der Maus gegen Faktor IX. Einige der Antikörper haben eine begrenzte neutralisierende Aktivität gegen Faktor IX.
Klarerweise besteht ein Bedarf für einen gerinnungshemmenden Wirkstoff, welcher wirksam in der Kontrolle von thrombotischen und embolischen Erkrankungen ist und doch keine unkontrollierten Blutungen oder die Möglichkeit von solchen bedingt.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend ist die Erfindung ein humanisierter monoclonaler Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörper, welcher eine selbstbegrenzende neutralisierende Aktivität gegen den Gerinnungsfaktor hat, wobei der monoclonale Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 und SB 257732.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein neutralisierendes Fab-Fragment oder F(ab')₂-Fragment davon, welches durch die Entfernung der Fc-Region der erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper hergestellt wird.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mit Thrombose oder Embolie assoziierten Erkrankungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist ein Graph von experimentellen Ergebnissen, welcher die Titration von normalem menschlichen Plasma mit den Anti-Faktor IX-mAbs BC1 und BC2 aus der Maus zeigt.
Die 2 ist ein Graph von experimentellen Ergebnissen, welcher die Titration von normalem menschlichen Plasma mit den Anti-Faktor IX-mAbs 9E4 (2) F4 und 11G4 (1) B9 aus der Maus zeigt.
Die 3 ist ein Graph von experimentellen Ergebnissen, welcher die Titration von normalem menschlichen Plasma mit den Anti-Faktor X-mAbs HFXHC und HFXLC aus der Maus und dem Anti-Faktor X1-mAb HFXI aus der Maus zeigt.
Die 4 ist ein Histogramm von experimentellen Ergebnissen, welches die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und Faktor IX-mAbs aus der Maus auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) bei 60 Minuten in einem Carotis-Thrombosemodell in Ratten zeigt.
Die 5 ist ein Histogramm von experimentellen Ergebnissen, welches die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und Faktor IX-mAbs aus der Maus auf die Prothrombinzeit bei 60 Minuten in einem Carotis-Thrombosemodell in Ratten zeigt.
Die 6 ist ein Histogramm von experimentellen Ergebnissen, welches die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und Faktor IX-mAbs aus der Maus auf den Verschluss des arteriellen Flusses in den Carotiden in einem Carotis-Thrombosemodell in Ratten zeigt.
Die 7 ist ein Histogramm von experimentellen Ergebnissen, welches die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und Faktor IX-mAbs aus der Maus auf das Thrombusgewicht in einem Carotis-Thrombosemodell in Ratten zeigt.
Die 8 ist ein Histogramm von experimentellen Ergebnissen, welches die Wirkung von Heparin, dem Faktor IX-mAb BC2 aus der Maus, einem chimären Faktor IX-mAb und humanisierten Faktor IX-mAbs auf die aPTT bei 60 Minuten in einem Carotis-Thrombosemodell in Ratten zeigt.
Die 9 ist ein Histogramm von experimentellen Ergebnissen, welches die Wirkung von Heparin, dem Faktor IX-mAb BC2 aus der Maus, einem chimären Faktor IX-mAb und einem humanisierten Faktor IX-mAb auf das Thrombusgewicht in einem Carotis-Thrombosemodell in Ratten zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt gegen den menschlichen Faktor IX gerichtete humanisierte monoclonalen Antikörper SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 und SB 257732 bereit. Besonders bevorzugt ist der monoclonale gegen den menschlichen Faktor IX gerichtete Antikörper SB 249417.
Diese Produkte sind in therapeutischen Zusammensetzungen und Arzneimitteln für thrombotische und embolische Erkrankungen nützlich, welche mit myokardialem Infarkt, instabiler Angina, Vorhofflimmern, Apoplex, Nierenschäden, Lungenembolie, tiefer Venenthrombose, perkutaner transluminaler coronarer Angioplastie, disseminierter intravasaler Koagulation, Sepsis, künstlichen Organen, Shunts oder Prothesen assoziiert sind.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „selbstbegrenzende neutralisierende Aktivität" auf die Aktivität eines Antikörpers, welcher an den menschlichen Gerinnungsfaktor IX bindet und Thrombose in einer solchen Art hemmt, dass eine limitierte Modulation der Gerinnung erzeugt wird. Eine „limitierte Modulation der Gerinnung" ist definiert als eine Zunahme der Gerinnungszeit, wie sie durch eine Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) gemessen wird, wobei das Plasma bei einer aPTT, welche einen maximalen Wert erreicht, obwohl die Konzentrationen des monoclonalen Antikörpers erhöht werden, gerinnbar bleibt. Diese limitierte Modulation der Gerinnung steht im Kontrast zu Plasma, welches in Anwesenheit steigender Konzentrationen von Heparin ungerinnbar gemacht wird und eine unendliche aPTT zeigt. Bevorzugt ist der maximale aPTT-Wert der erfindungsgemäßen Verfahren im therapeutischen Bereich von Heparin. Am stärksten bevorzugt ist die maximale aPTT im Bereich von etwa 35 Sekunden bis zu etwa 100 Sekunden, was etwa dem 1,5-fachen bis zu etwa dem 3,5-fachen des normalen aPTT-Kontrollwerts entspricht. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die aPTT ohne eine wesentliche Verlängerung der Prothrombinzeit (PT) verlängert.
Ein „veränderter Antikörper" bezieht sich auf ein Protein, welches durch eine veränderte, ein Immunglobulin codierende Region codiert wird, welches durch Expression in einer ausgewählten Wirtszelle erhalten werden kann. Solche veränderten Antikörper sind konstruierte Antikörper (zum Beispiel chimäre oder humanisierte Antikörper) oder Antikörperfragmente, welchen die gesamte oder ein Teil einer konstanten Immunglobulinregion fehlt, zum Beispiel Fv, Fab, Fab' oder F(ab')₂ und ähnliches.
Eine „veränderte, ein Immunglobulin codierende Region" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, welche einen veränderten erfindungsgemäßen Antikörper codiert. Wenn der veränderte Antikörper einer mit transplantierten CDRs oder ein humanisierter Antikörper ist, werden die Sequenzen aus einem nicht-humanen Immunglobulin, welche die die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs) codieren, in einen ersten, humane variable Gerüstsequenzen enthaltenden Immunglobulinpartner eingefügt. Gegebenenfalls ist der erste Immunglobulinpartner operativ mit einem zweiten Immunglobulinpartner verknüpft.
„Erster Immunglobulinpartner" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, welche ein humanes Gerüst oder eine humane variable Immunglobulinregion codiert, in welcher die ursprünglichen (oder natürlich auftretenden), die CDRs codierenden Regionen durch die die CDRs codierenden Regionen eines Spenderantikörpers ersetzt werden. Die menschliche variable Region kann eine schwere Kette eines Immunglobulins, eine leichte Kette (oder beide Ketten), ein Analog oder funktionelle Fragmente davon sein. Solche in den variablen Regionen von Antikörpern (Immunglobulinen) befindlichen CDR-Regionen können durch im Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel offenbaren Kabat et al. in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) Regeln zur Lokalisierung von CDRs. Zusätzlich sind Computerprogramme bekannt, welche zur Identifizierung von CDR-Regionen/Strukturen nützlich sind.
„Zweiter Immunglobulinpartner" bezieht sich auf eine andere Nucleotidsequenz, welche ein Protein oder Peptid codiert, mit welchem der erste Immunglobulinpartner im Leserahmen oder mittels einer fakultativen üblichen Linkersequenz verbunden (das heißt funktionell verbunden) wird. Bevorzugt ist es ein Immunglobulingen. Der zweite Immunglobulinpartner kann eine Nucleinsäuresequenz enthalten, welche die gesamte konstante Region für den selben (das heißt homolog, wobei der erste und zweite veränderte Antikörper aus der gleichen Quelle abgeleitet sind) oder einen zusätzlichen (das heißt heterologen) interessierenden Antikörper codiert. Dies kann eine schwere Kette oder einen leichte Kette eines Immunglobulins (oder beide Ketten als Teil eines einzelnen Polypeptids) sein. Der zweite Immunglobulinpartner ist nicht auf eine bestimmte Immunglobulinklasse oder einen Isotyp begrenzt. Zusätzlich kann der zweite Immunglobulinpartner einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion, wie dies in einem Fab oder F(ab)₂ (das heißt ein abgegrenzter Teil einer geeigneten menschlichen konstanten Region oder Gerüstregion) gefunden wird, umfassen. Solch ein zweiter Immunglobulinpartner kann auch eine Sequenz, welche ein integrales Membranprotein codiert, welches auf der äußeren Oberfläche einer Wirtszelle, zum Beispiel als Teil einer Phagedisplay-Genbank exponiert ist oder eine ein Protein zum analytischen oder diagnostischen Nachweis, zum Beispiel Meerrettichperoxidase β-Galactosidase, etc., codierende Sequenz und so weiter umfassen.
Die Begriffe Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' oder F(ab')₂ werden mit ihrer Standardbedeutung verwendet. Siehe zum Beispiel Harlow et al. in "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).
Wie hier verwendet beschreibt ein „konstruierter Antikörper" eine Art von verändertem Antikörper, das heißt einen synthetischen Antikörper voller Länge (zum Beispiel einen chimären oder humanisierten Antikörper im Gegensatz zu einen Antikörperfragment), in welchem ein Teil der variablen Domänen der leichten und/oder schweren Ketten eins ausgewählten Empfängerantikörpers durch analoge Teile von einem oder mehreren Spenderantikörpern, welche einen Spezifität für das ausgewählte Epitop haben, ersetzt werden. Zum Beispiel können solche Moleküle durch eine humanisierte schwere Kette assoziiert mit einer unmodifizierten leichten Kette (oder chimären leichten Kette) oder umgekehrt charakterisierte Antikörper einschließen. Konstruierte Antikörper können auch durch die Veränderung der Nucleinsäuresequenz, welche die Gerüstregionen der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Empfängerantikörpers codiert, zur Erhaltung der Bindungsspezifität des Spenderantikörpers charakterisiert sein. Diese Antikörper können Austausche von einer oder mehreren CDRs (bevorzugt allen) des Empfängerantikörpers durch CDRs des hier beschriebenen Spenderantikörpers umfassen.
Ein „chimärer Antikörper" bezieht sich auf eine Art eines konstruierten Antikörpers, welcher eine natürlich vorkommende variable Region (leichte Kette und schwere Ketten) abgeleitet von einem Spenderantikörper assoziiert mit von einem Empfängerantikörper abgeleiteten konstanten Regionen schwerer und leichter Ketten enthält.
Ein „humanisierter Antikörper" bezieht sich auf eine Art eines konstruierten Antikörpers, dessen CDRs von einem nicht-menschlichen Spenderimmunglobulin abgeleitet sind und die verbleibenden von Immunglobulinen abgeleiteten Teile des Moleküls von einem oder mehreren menschlichen Immunglobulinen abgeleitet sind. Zusätzlich können das Gerüst tragende Reste verändert werden, um die Bindungsaffinität zu erhalten. Siehe zum Beispiel Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86 (1989): 10029-10032; Hodgson et al., Bio/Technology 9 (1991): 421.
Der Begriff „Spenderantikörper" bezieht sich auf einen monoclonalen oder rekombinanten Antikörper, welcher die Nucleinsäuresequenzen seiner variablen Regionen, CDRs oder anderer funktioneller Fragmente oder Analoga davon zu einem ersten Immunglobulinpartner beiträgt, um so die veränderte für ein Immunglobulin codierende Region bereitzustellen und einen exprimierten veränderten Antikörper mit der Antigenspezifität und neutralisierenden Aktivität, welche für den Spenderantikörper charakteristisch ist, zu ergeben. Ein für die Verwendung in dieser Erfindung geeigneter Spenderantikörper ist ein als BC2 bezeichneter selbstbegrenzender neutralisierender monoclonaler Antikörper aus der Maus. Andere geeignete Antikörper schließen die als BC1, 9E4 (2) F4, 11G4 (1) B9, HFXLC und HFXI bezeichneten selbstbegrenzenden neutralisierenden monoclonalen Antikörper aus der Maus ein.
Der Begriff „Empfängerantikörper" bezieht sich auf monoclonale oder rekombinante Antikörper, welche zu dem Spenderantikörper, welcher die gesamten oder einen Teil der die Frameworkregionen der schweren und/oder leichten Kette und/oder die konstanten Regionen der schweren und/oder leichten Kette codierenden Nucleinsäuresequenzen zum ersten Immunglobulinpartner beiträgt, heterolog sind. Bevorzugt ist ein menschlicher Antikörper der Empfängerantikörper.
„CDRs" sind als Aminosäuresequenzen der die Komplementarität definierenden Regionen eines Antikörpers definiert, welche die hypervariablen Regionen der schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen sind. Siehe zum Beispiel Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunolosical Interest, 4. Ausgabe, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Es gibt drei CDRs oder CDR-Regionen der schweren Kette und drei der leichten Kette im variablen Teil eines Immunglobulins. Somit bezieht sich „CDRs" wie hier verwendet auf alle drei CDRs der schweren Kette oder alle drei CDRs der leichten Kette oder zusammen auf alle CDRs der schweren und leichten Kette, wenn dies zweckdienlich ist.
CDRs stellen die Mehrheit der Kontakt-Reste für die Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Epitop bereit. In dieser Erfindung sind interessierende CDRs von den variablen Sequenzen der schweren und leichten Ketten eines Spenderantikörpers abgeleitet und schließen Analoga der natürlich vorkommenden CDRs ein, wobei die Analoga die gleiche Antigenbindungsspezifität und/oder neutralisierende Fähigkeit wie der Spenderantikörper, von dem sie abgeleitet wurden, teilen oder beibehalten.
Durch „teilen der Antigenbindungsspezifität oder neutralisierenden Fähigkeit" ist zum Beispiel gemeint, dass, obwohl der mAb BC2 durch ein bestimmtes Niveau einer selbstbegrenzenden neutralisierenden Aktivität charakterisiert ist, ein durch eine Nucleinsäuresequenz von BC2 in einer geeigneten strukturellen Umgebung codierte CDR eine niedrigere oder höhere Aktivität haben kann. Es wird erwartet, dass CDRs von BC2 in solchen Umgebungen trotzdem das gleiche (die gleichen) Epitop(e) wie BC2 erkennen werden.
Ein „funktionelles Fragment" ist ein Teil einer variablen Sequenz der schweren oder leichten Kette (zum Beispiel kleine Deletionen am Amino- oder Carboxyterminus der variablen Region des Immunglobulins), welcher die gleiche Antigenbindungsspezifität und/oder neutralisierenden Fähigkeit des Antikörpers, von welchem das Fragment abgeleitet wurde, behält.
Ein „Analog" ist eine Aminosäuresequenz, welche an wenigstens einer Aminosäure verändert worden ist, wobei die Veränderung chemisch oder einen Austausch oder eine verändere Anordnung von wenigen Aminosäuren (das heißt, nicht mehr als 10) sein kann, wobei die Veränderung es der Aminosäuresequenz erlaubt die biologischen Eigenschaften, zum Beispiel Antigenspezifität und hohe Affinität, der unveränderten Sequenz beizubehalten. Beispielhafte Analoga schließen stille Mutationen ein, welche durch Ersetzungen erzeugt werden können, um bestimmte Endonucleaserestriktionsstellen in oder um CDR codierende Regionen zu erzeugen.
Analoga können auch als allelische Variationen entstehen. Eine „allelische Variation oder Veränderung" ist eine Veränderung in der die erfindungsgemäßen Aminosäure- oder Peptidsequenzen codierenden Nucleinsäuresequenz. Solche Variationen oder Veränderungen können durch die Degeneriertheit des genetischen Codes begründet sein oder können bewusst erzeugt werden, um gewünschte Eigenschaften bereitzustellen. Diese Variationen oder Veränderung können Veränderungen in jeglicher codierten Aminosäuresequenz ergeben oder auch nicht.
Der Begriff „Effektorstoffe" bezieht sich auf nicht-proteinartige Trägermoleküle, an welche die veränderten Antikörper und/oder natürliche oder synthetische leichte oder schwere Ketten des Spenderantikörpers oder andere Fragmente des Spenderantikörpers durch übliche Mittel assoziiert werden können. Solche nicht-proteinartige Träger können übliche, im Gebiet der Diagnostik verwendete Träger, zum Beispiel Polystyrol- oder andere Plastikkügelchen, Polysaccharide, zum Beispiel wie sie im BIAcore-System (Pharmacia) verwendet werden, oder andere nicht-proteinartige Substanzen, welche im Gebiet der Medizin nützlich und für die Verabreichung an Menschen und Tiere sicher sind, einschließen. Andere Effektorstoffe können einen Makrozyklus zur Chelatierung von Schwermetallatomen oder Radioisotopen einschließen. Solche Effektorstoffe können auch zur Erhöhung der Halbwertszeit der veränderten Antikörper nützlich sein, zum Beispiel Polyethylenglycol.
Ein beispielhafter selbstbegrenzender neutralisierender mAb ist der mAb BC2, ein Antikörper aus der Maus, welcher für die Entwicklung eines chimären oder humanisierten Moleküls verwendet werden kann. Der BC2-mAb ist durch eine selbstbegrenzende hemmende Aktivität auf die Gerinnungszeit charakterisiert. Wie durch den aPTT-Test gemessen, zeigt die Wirkung des BC2-mAb auf die Gerinnungszeit einen Maximalwert von etwa 100 Sekunden. Der BC2-mAb bindet auch Faktor IXa, hemmt die Umwandlung von Faktor IX zu IXa und hemmt die Aktivität von Faktor IXa. Divalente Metall-Kofaktoren werden für die Aktivität benötigt, wobei der mAb eine stärkere Bevorzugung von Ca²⁺ gegenüber Mn²⁺ zeigt. Der beobachtete IC₅₀-Wert im aPTT-Test ist annähernd 50 nM. Der BC2-mAb zeigt eine Spezies-Kreuzreaktivität mit der Ratte und ist vom Isotyp IgG2a.
Andere erstrebenswerte Spenderantikörper sind die mAbs BC1, 9E4 (2) F4 und 11G4 (1) B9 aus der Maus. Diese mAbs sind durch eine selbstbegrenzende hemmende Aktivität auf die Gerinnungszeit charakterisiert. Wie durch den aPTT-Test gemessen, zeigt die Wirkung dieser mAbs auf die Gerinnungszeit einen Maximalwert von 90 bis 100 Sekunden für 9E4 (2) F4 und etwa 80 Sekunden für 11G4 (1) B9. Der BC1-mAb bindet auch Faktor IXa, hemmt die Aktivität von Faktor IXa, hemmt aber nicht die Umwandlung von Faktor IX zu IXa. Ein Metall-Kofaktor wird für seine Aktivität nicht benötigt. Der beobachtete IC₅₀-Wert für BC1 im aPTT-Test ist annähernd 35 nM. Der BC1-mAb ist vom Isotyp IgG1.
Noch ein anderer erstrebenswerter Spenderantikörper, welcher durch eine selbstbegrenzende hemmende Aktivität auf die Gerinnungszeit charakterisiert ist, ist der mAb HFXLC aus der Maus. Wie durch den aPTT-Test gemessen, zeigt die Wirkung des HFXLC-mAb auf die Gerinnungszeit einen Maximalwert von etwa 50 bis 60 Sekunden. Der HFXLC-mAb bindet die leichte Kette von Faktor X und hemmt die Aktivität von Faktor X/Xa. Der beobachtete IC₅₀-Wert im aPTT-Test ist annähernd 20 nM.
Noch ein anderer erstrebenswerter Spenderantikörper, welcher durch eine selbstbegrenzende hemmende Aktivität auf die Gerinnungszeit charakterisiert ist, ist der mAb HFXI aus der Maus. Wie durch den aPTT-Test gemessen, zeigt die Wirkung des HFXI-mAb auf die Gerinnungszeit einen Maximalwert von etwa 100 Sekunden. Der HFXLC-mAb bindet Faktor XI und hemmt die Aktivität von Faktor XI/XIa. Der beobachtete IC₅₀-Wert im aPTT-Test ist annähernd 30 nM.
Während es nicht beabsichtigt ist, an eine besondere Theorie bezüglich des Wirkungsmechanismus gebunden zu sein, scheinen diese mAbs die Gerinnung durch einen nicht-kompetitiven oder allosterischen Mechanismus zu regulieren, wobei nur eine teilweise Hemmung erreicht wird.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung von Fab-Fragmenten von den F(ab')₂-Fragmenten ein, die von den erfindungsgemäßen, gegen den geeigneten menschlichen Gerinnungsfaktor oder -Kofaktor gerichteten mAbs abgeleitet sind. Diese Fragmente sind als Stoffe nützlich, welche eine selbstbegrenzende neutralisierende Aktivität gegen Gerinnungsfaktor IX haben. Ein Fab-Fragment enthält die gesamte leichte Kette und den aminoterminalen Teil der schweren Kette. Ein F(ab')₂-Fragment ist das Fragment, das durch zwei Fab-Fragmente gebildet wird, welche durch Disulfidbindungen gebunden sind. Fab-Fragmente und F(ab')₂-Fragmente können durch übliche Mittel, zum Beispiel Spaltung des mAb mit den geeigneten proteolytischen Enzymen Papain und/oder Pepsin oder durch rekombinante Verfahren erhalten werden. Die Fab- und F(ab')₂-Fragmente der erfindungsgemäßen mAbs sind selbst als therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Stoffe nützlich.
Die Nucleinsäuresequenzen der erfindungsgemäßen mAbs oder Fragmente davon, welche die Peptidsequenzen der variablen leichten Kette und der schweren Kette codieren, sind auch nützlich zur mutagenen Einführung von spezifischen Änderungen in den die CDRs oder Gerüstregionen codierenden Nucleinsäuresequenzen und zum Einbau der sich ergebenden veränderten oder zusammengefügten Nucleinsäuresequenz in ein Plasmid zur Expression. Zum Beispiel können stumme Austausche in der Nucleotidsequenz der das Gerüst oder CDR codierenden Regionen verwendet werden, um Restriktionsenzymstellen zu erzeugen, welche die Einfügung von mutagenisierten CDR- und/oder Gerüstregionen erleichtern.
Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen der variablen Region der schweren Kette von BC2 sind in den SEQ ID NO: 5 und 7 aufgeführt. Die CDR-Sequenzen aus dieser Region sind in den SEQ ID NO: 8, 9 und 10 aufgeführt.
Die Nuclein- und Aminosäuresequenzen der variablen Region der leichten Kette von BC2 sind in den SEQ ID NO: 6 und 11 aufgeführt. Die CDR-Sequenzen aus dieser Region sind in den SEQ ID NO: 12, 13 und 14 aufgeführt.
Unter Berücksichtigung der Degeneriertheit des genetischen Codes können verschiedene codierende Sequenzen erzeugt werden, welche die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen der variablen schweren und leichten Kette und CDR-Sequenzen sowie funktionelle Fragmente und Analoga davon codieren, welche die Antigenspezifität des Spenderantikörpers teilen. Die isolierten erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen oder Fragmente davon, welche die Peptidsequenzen der variablen Kette oder CDRs codieren, können verwendet werden, um andere konstruierte erfindungsgemäße Antikörper zu erzeugen, wenn sie operativ mit einem zweiten Immunglobulinpartner kombiniert werden.
Es sollte beachtet werden, dass zusätzlich zu den Teile von dem/n veränderten, hier beschriebenen Antikörper und Antikörpern codierenden isolierten Nucleinsäuresequenzen, andere solche Nucleinsäuresequenzen in der vorliegenden Erfindung umfasst sind, so wie jene, welche zu den die nativen CDR codierenden Sequenzen komplementär oder zu den veränderten, die CDR codierenden Regionen umgebenden humanen Gerüstregionen komplementär sind. Nützliche DNA-Sequenzen schließen jene Sequenzen ein, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die DNA-Sequenzen hybridisieren. Siehe T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387-389. Ein Beispiel für eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist eine Hybridisierung bei 4xSSC bei 65 °C, gefolgt von Waschen in 0,1xSSC bei 65 °C über eine Stunde. Alternativ ist eine beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung 50 % Formamid, 4xSSC bei 42 °C. Bevorzugt sind diese hybridisierenden DNA-Sequenzen wenigstens etwa 18 Nucleotide lang, das heißt, etwa die Größe einer CDR.
Besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249413, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 31 aufgeführt ist besitzt und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 44 aufgeführt ist besitzt. Ebenfalls besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249415, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 52 aufgeführt ist besitzt und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 57 aufgeführt ist besitzt. Ebenfalls besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249416, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 52 aufgeführt ist besitzt und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 62 aufgeführt ist besitzt. Ebenfalls besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249417, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 52 aufgeführt ist besitzt und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 74 aufgeführt ist besitzt. Ebenfalls besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 257731, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 52 aufgeführt ist besitzt und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 78 aufgeführt ist besitzt. Ebenfalls besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 257732, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 89 aufgeführt ist besitzt und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie sie in SEQ ID NO: 99 aufgeführt ist besitzt.
Es wird vom Durchschnittsfachmann verstanden werden, dass ein konstruierter Antikörper weiter durch Änderungen in den Aminosäuren der variablen Domäne verändert werden kann, ohne notwendigerweise die Spezifität und hohe Affinität des Spenderantikörpers zu beeinträchtigen (das heißt ein Analog). Es wird erwartet, dass die Aminosäuren der schweren und leichten Kette in den Gerüsten der variablen Domäne oder der CDRs oder beider durch andere Aminosäuren ausgetauscht werden können. Diese Austausche könnten vom Spenderantikörper oder Konsensussequenzen aus einer bestimmten Untergruppe bereitgestellt werden.
Zusätzlich kann die konstante Region verändert werden, um ausgewählte Eigenschaften der erfindungsgemäßen Moleküle zu verstärken oder zu verringern. Zum Beispiel Dimerisierung, Bindung an Fc-Rezeptoren oder die Fähigkeit, Komplement zu binden und zu aktivieren (siehe zum Beispiel Angal et al., Mol. Immunol, 30 (1993): 105-108, Xu et al., J. Biol. Chem, 269 (1994): 3469-3474, Winter et al., EP307434-B).
Ein veränderter Antikörper, welcher ein chimärer Antikörper ist, unterscheidet sich von den vorstehend beschriebenen humanisierten Antikörpern durch die Bereitstellung der gesamten nicht-humanen variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Spenderantikörpers, einschließlich Gerüstregionen, in Assoziation mit konstanten Regionen humaner Immunglobuline für beide Ketten. Es wird erwartet, dass chimäre Antikörper, welche im Bezug auf erfindungsgemäße humanisierte Antikörper zusätzliche nicht-humane Sequenzen behalten, eine signifikante Immunantwort in Menschen auslösen können.
Solche Antikörper sind wie nachstehend diskutiert nützlich in der Prävention und Behandlung von thrombotischen und embolischen Erkrankungen.
Ein einen ausgewählten Spenderantikörper, Antiköper BC2 aus der Maus, produzierendes Hybridom wird üblicherweise cloniert und die DNA seiner variablen Regionen der schweren und leichten Kette durch dem Fachmann bekannte Verfahren, zum Beispiel die in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory beschriebenen Verfahren, gewonnen. Die schweren und leichten variablen Regionen von BC2, welche mindestens die die CDR codierenden Regionen und jene Teile der Frameworkregionen der leichten und/oder schweren variablen Domänen des Empfängerantikörpers, welche nötig sind, um die Bindungsspezifität des Spenderantikörpers beizubehalten, enthalten, genauso wie die verbleibenden von Immunglobulinen abgeleiteten Teile der von einem humanen Immunglobulin abgeleiteten Antikörperketten, werden unter Verwendung von Polynucleotidprimern und Reverser Transkriptase gewonnen. Die die CDR codierenden Regionen werden unter Verwendung einer bekannten Datenbank und durch Vergleich mit anderen Antikörpern identifiziert.
Ein Maus/Mensch-chimärer Antikörper kann dann hergestellt und auf Bindungsfähigkeit getestet werden. Solch ein chimärer Antikörper enthält die gesamten V_H- und V_L-Regionen des nicht-humanen Spenderantikörpers in Assoziation mit humanen konstanten Ig-Regionen für beide Ketten.
Homologe Gerüstregionen einer variablen Region der schweren Kette von einem humanen Antikörper werden unter Verwendung computergestützter Datenbanken, zum Beispiel KABAT^®, identifiziert und ein menschlicher Antikörper, welcher eine Homologie zu BC2 hat, wird als der Empfängerantikörper ausgewählt. Die Sequenzen von synthetischen variablen Regionen von schweren Ketten, welche in dem humanen Antikörperframework die die CDR codierenden Regionen von BC2 enthalten, werden mit optionalen Nucleotidaustäuschen in den Gerüstregionen zur Einfügung von Restriktionsstellen entworfen. Diese entworfene Sequenz wird dann unter Verwendung von langen synthetischen Oligomeren synthetisiert. Alternativ kann die entworfene Sequenz durch überlappende Oligonucleotide, welche durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt werden, synthetisiert werden und auf Fehler hin korrigiert werden. Eine geeignete variable Frameworkregion der leichten Kette kann in einer ähnlichen Weise entworfen werden.
Ein humanisierter Antikörper kann von dem chimären Antikörper abgeleitet werden oder bevorzugt synthetisch durch die geeignete Einfügung der die CDR codierenden Regionen des Spenderantikörpers aus den schweren und leichten Ketten in das ausgewählte Gerüst der leichten und schweren Kette hergestellt werden. Alternativ kann ein erfindungsgemäßer humanisierter Antikörper unter Verwendung von Standardmutagenesetechniken hergestellt werden. So enthält der sich ergebende humanisierte Antikörper humane Gerüstregionen und die CDR codierende Regionen des Spenderantikörpers. Es kann nachfolgende Veränderungen der Gerüstreste geben. Der sich ergebende humanisierte Antikörper kann in rekombinanten Wirtszellen, zum Beispiel COS, CHO oder Myelomzellen, exprimiert werden. Andere humanisierte Antikörper können unter Anwendung dieser Technik auf andere geeignete, für Faktor IX spezifische oder andere für Gerinnungsfaktoren spezifische, selbstbegrenzende neutralisierende, hochaffine, nicht-humane Antikörper hergestellt werden.
Ein üblicher Expressionsvektor oder rekombinantes Plasmid wird durch Einsetzung dieser für den veränderten Antikörper codierenden Sequenzen in operativer Assoziation mit üblichen regulatorischen Kontrollsequenzen, welche zur Kontrolle der Replikation und Expression in und/oder Sekretion aus einer Wirtszelle fähig sind, hergestellt. Regulatorische Sequenzen schließen Promotorsequenzen, zum Beispiel CMV-Promotor, und Signalsequenzen, welche von anderen bekannten Antikörpern abgeleitet sein können, ein. Ähnlich kann ein zweiter Expressionsvektor hergestellt werden, welcher eine DNA-Sequenz besitzt, welche eine komplementäre leichte oder schwere Kette eines Antikörpers codiert. Bevorzugt ist dieser zweite Expressionsvektor, ausgenommen im Hinblick auf die codierenden Sequenzen und die selektionierbaren Marker, identisch zu dem ersten, um soweit wie möglich sicherzustellen, dass jede Polypeptidkette funktionell exprimiert wird. Alternativ können die codierenden Sequenzen der schweren und leichten Kette des veränderten Antikörpers auf einem einzelnen Vektor vorliegen.
Eine ausgewählte Wirtszelle wird durch übliche Techniken mit sowohl den ersten als auch den zweiten Vektoren kotransfiziert (oder einfach mit einem einzelnen Vektor transfiziert), um die erfindungsgemäße transfizierte Wirtszelle zu erzeugen, umfassend sowohl die rekombinanten oder synthetischen leichten als auch schweren Ketten. Die transfizierte Zelle wird dann durch übliche Techniken gezüchtet, um den konstruierten erfindungsgemäßen Antikörper herzustellen. Der humanisierte Antikörper, welcher die Assoziation von sowohl der rekombinanten schweren Kette als auch/oder der leichten Kette einschließt wird aus der Kultur durch einen geeigneten Test wie ELISA oder RIA durchmustert. Ähnliche übliche Verfahren können verwendet werden, um andere veränderte erfindungsgemäße Antikörper und Moleküle zu erzeugen.
Geeignete Vektoren für die Clonierungs- und Subclonierungsschritte, welche in den Verfahren und der Erzeugung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden, können durch den Fachmann ausgewählt werden. Zum Beispiel kann die pUC-Serie von Clonierungsvektoren, wie pUC19, welcher kommerziell von Lieferanten wie Amersham oder Pharmacia erhältlich ist, verwendet werden. Zusätzlich kann jeder Vektor, welcher leicht zur Replikation fähig ist, eine Fülle von Clonierungsstellen und selektierbare Gene (zum Beispiel Antibiotikaresistenzen) besitzt und einfach gehandhabt werden kann, zum Clonieren verwendet werden. Somit ist die Auswahl des Clonierungsvektors kein begrenzender Faktor in dieser Erfindung.
Ähnlich können die für die Expression der konstruierten Antikörper gemäß dieser Erfindung verwendeten Vektoren durch einen Fachmann aus jedem üblichen Vektor ausgewählt werden. Die Vektoren enthalten ebenfalls ausgewählte regulatorische Sequenzen (wie CMV-Promotoren), welche die Replikation und Expression von heterologen DNA-Sequenzen in ausgewählten Wirtszellen steuern. Diese Vektoren enthalten die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, welche den konstruierten Antikörper oder die die veränderten Immunglobuline codierenden Regionen codieren. Zudem können die Vektoren die durch die Einfügung von wünschenswerten Restriktionsstellen für die einfache Handhabung veränderten ausgewählten Immunglobulinsequenzen enthalten.
Die Expressionsvektoren können auch durch für die Vermehrung der Expression der heterologen DNA-Sequenzen geeignete Gene, zum Beispiel das Säuger-Dihydrofolatreduktase-Gen (DHFR), charakterisiert sein. Andere bevorzugte Vektorsequenzen schließen eine Poly A-Signalsequenz, wie aus dem Rinder-Wachstumshormon (BGH) und die Betaglobinpromotorsequenz (betaglopro) ein. Die hier nützlichen Expressionsvektoren können durch dem Fachmann wohl bekannte Techniken synthetisiert werden.
Die Komponenten solcher Vektoren, zum Beispiel Replikons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren, Signalsequenzen und ähnliches können von kommerziellen oder natürlichen Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden, um für die Steuerung der Expression und/oder Sekretion des Produktes der rekombinanten DNA in einem ausgewählten Wirt verwendet zu werden. Andere geeignete Expressionsvektoren, von welchen eine Vielzahl von Typen für die Expression in Säugern, Bakterien, Insekten, Hefe und Pilzen im Fachgebiet bekannt ist, können auch zu diesem Zweck ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine mit einem die codierenden Sequenzen der konstruierten Antikörper oder der daraus veränderten Immunglobulinmoleküle enthaltenden rekombinanten Plasmid transfizierte Zelllinie. Wirtszellen für die Clonierung und andere Handhabungen dieser Clonierungsvektoren sind ebenfalls üblich. Es werden jedoch am stärksten bevorzugt Zellen verschiedener Stämme von E. coli für die Replikation der Clonierungsvektoren und andere Schritte in der Erzeugung von veränderten erfindungsgemäßen Antikörpern verwendet.
Geeignete Wirtszellen oder Zelllinien für die Expression des erfindungsgemäßen konstruierten Antikörpers oder veränderten Antikörpers sind bevorzugt Säugerzellen wie CHO, COS, eine Fibroblastenzelle (zum Beispiel 3T3) und myeloide Zellen, und stärker bevorzugt eine CHO- oder eine myeloide Zelle. Menschliche Zellen können verwendet werden, was so die Modifizierung des Moleküls mit menschlichen Glycosylierungsmustern ermöglicht. Alternativ können andere eukaryontische Zelllinien verwendet werden. Die Auswahl von geeigneten Säugerwirtszellen und Verfahren für die Transformation, Züchtung, Amplifikation, Durchmusterung und Produktherstellung und Reinigung sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., vorstehend.
Bakterielle Zellen können sich als für die Expression der rekombinanten erfindungsgemäßen Fabs geeignete Wirtszellen nützlich erweisen (siehe zum Beispiel Plückthun, A., Immunol. Rev., 130 (1992): 151-188). Aufgrund der Tendenz von in bakteriellen Zellen exprimierten Proteinen sich in einer ungefalteten oder nicht richtig gefalteten oder in einer nicht glycosylierten Form zu befinden, würde jedoch jedes in bakteriellen Zellen hergestellte Fab auf die Beibehaltung der Antigenbindungsfähigkeit hin durchmustert werden müssen. Wenn das durch die bakterielle Zelle exprimierte Molekül in einer korrekt gefalteten Form hergestellt würde, wäre diese bakterielle Zelle ein erstrebenswerter Wirt. Zum Beispiel sind verschiedene für die Expression verwendete Stämme von E. coli als Wirtszellen im Gebiet der Biotechnologie wohl bekannt. Verschiede Stämme von B. subtilis, Streptomyces, andere Bacillen und ähnliches können auch verwendet werden.
Wo gewünscht, sind im Fachgebiet bekannte Stämme von Hefezellen auch als Wirtszellen verfügbar, genauso wie Insektenzellen, zum Beispiel Drosophila und Lepidoptera und virale Expressionssysteme. Siehe zum Beispiel Miller et al., Genetic Engineering, 8 (1986): 277-298, Plenum Press und darin zitierte Quellen.
Die allgemeinen Verfahren, durch welche erfindungsgemäße Vektoren erzeugt werden können, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Wirtszellen benötigten Transfektionsverfahren und die zur Herstellung des erfindungsgemäßen veränderten Antikörpers aus einer solchen Wirtszelle notwendigen Züchtungsverfahren sind alles übliche Techniken. Genauso können die einmal hergestellten veränderten erfindungsgemäßen Antikörper aus den Inhalten der Zellkultur gemäß Standardverfahren des Fachgebiets, einschließlich Ammoniumsulfatfällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und ähnliches gereinigt werden. Solche Techniken liegen in den Fähigkeiten der Fachleute und begrenzen diese Erfindung nicht.
Noch ein anderes Verfahren der Expression der humanisierten Antikörpern kann die Expression in einem transgenen Tier, wie dies in U. S. Patent No. 4,873,316 beschrieben ist nutzen. Dies bezieht sich auf ein Expressionssystem, welches den Caseinpromotor des Tieres nutzt, welcher, wenn er in ein Tier eingeführt wird, es erlaubt, dass das weibliche Tier das gewünschte rekombinante Protein in seiner Milch herstellt.
Nach der Expression durch das gewünschte Verfahren wird der konstruierte Antikörper durch die Verwendung eines geeigneten Tests auf in vitro-Aktivität untersucht. Zur Zeit werden übliche ELISA-Test-Formate verwendet, um die qualitative und quantitative Bindung des konstruierten Antikörpers an Faktor IX zu bestimmen. Zusätzlich können auch andere in vitro-Tests verwendet werden, um die neutralisierende Wirksamkeit vor nachfolgenden klinischen Studien im Menschen zu bestätigen, welche durchgeführt werden, um die Persistenz des konstruierten Antikörpers im Körper trotz der üblichen Clearancemechanismen zu überprüfen.
Geringfügige Veränderungen der Gerüste der variablen Regionen können eingesetzt werden, um ohne nennenswert gesteigerte Immunogenität für den Empfänger große Zunahmen in der Antigenbindung zu bewirken. Solche konstruierten Antikörper können einen Menschen wirksam gegen durch Gerinnungsfaktoren vermittelte Erkrankungen behandeln. Solche Antikörper können auch für die Diagnose solcher Erkrankungen nützlich sein.
Alternativ kann Acetylsalicylsäure in Kombination mit dem erfindungsgemäßen monoclonalen Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörper verabreicht werden. In einigen Fällen senkt die Kombinationstherapie die therapeutisch wirksame Dosis des monoclonalen Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörpers.
Die durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle hervorgerufene therapeutische Reaktion wird durch die Bindung an den entsprechenden Gerinnungsfaktor und die folgende selbstbegrenzende Hemmung der Gerinnungskaskade erzeugt. So sind die erfindungsgemäßen Moleküle, wenn sie in zur therapeutischen Verwendung geeigneten Präparationen und Formulierungen vorliegen, im höchsten Maße erstrebenswert für Personen, welche für eine mit myokardialem Infarkt, instabiler Angina, Vorhofflimmern, Apoplex, Nierenschäden, Lungenembolie, tiefer Venenthrombose und künstlichen Organen und prothetischen Implantaten assoziierte aber nicht auf diese beschränkte abnorme Gerinnungsaktivität empfänglich sind oder diese erleben.
Die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper, Antikörper und Fragmente davon können auch in Verbindung mit anderen Antikörpern, insbesondere mit anderen Markern (Epitopen), welche für die Erkrankung verantwortlich sind, gegen welche der erfindungsgemäße Antikörper gerichtet ist, reaktiven humanen mAbs, verwendet werden.
Von den erfindungsgemäßen therapeutischen Wirkstoffen wird angenommen, dass sie für die Behandlung von abnormen Zuständen der Gerinnung für etwa 1 Tag bis zu etwa 3 Wochen oder wie benötigt wünschenswert sind. Dies stellt einen beachtenswerten Fortschritt gegenüber den derzeit verwendeten Antikoagulantien Heparin und Warfarin dar. Die Dosis und Dauer der Behandlung bezieht sich auf das relative Überdauern der erfindungsgemäßen Moleküle im menschlichen Kreislauf und kann durch den Fachmann abhängig von der behandelten Erkrankung und der allgemeinen Gesundheit des Patienten angepasst werden.
Der Verabreichungsweg des erfindungsgemäßen Wirkstoffs kann jegliche geeignete Route sein, welche den Wirkstoff an den Wirt abgibt. Die erfindungsgemäßen veränderten Antikörper, Antikörper, konstruierten Antikörper und Fragmente davon und Arzneimittel sind besonders nützlich für die parenterale Verabreichung, das heißt subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal.
Erfindungsgemäße therapeutische Wirkstoffe können als Arzneimittel hergestellt werden, welche eine wirksame Menge des konstruierten (humanisierten) erfindungsgemäßen Antikörpers als aktivem Bestandteil in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Alternativ könnten die erfindungsgemäßen Arzneimittel auch Acetylsalicylsäure enthalten. Im erfindungsgemäßen prophylaktischen Wirkstoff ist eine wässrige Suspension oder Lösung, welche den konstruierten Antikörper enthält, bevorzugt in einer für die Injektion bereiten Form auf einem physiologischen pH-Wert gepuffert. Die Arzneimittel für die parenterale Verabreichung werden üblicherweise eine Lösung des erfindungsgemäßen konstruierten Antikörpers oder eine Mischung davon aufgelöst in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, bevorzugt einem wässrigen Träger, umfassen. Eine Vielfalt von wässrigen Trägern, zum Beispiel 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycin und ähnliches, kann verwendet werden. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von korpuskulären Stoffen. Diese Lösungen können durch übliche, wohl bekannte Sterilisierungstechniken (zum Beispiel: Filtration) sterilisiert werden. Die Arzneimittel können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen wie pH-anpassende oder puffernde Stoffe und so weiter enthalten, wie diese benötigt werden, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern. Die Konzentration des erfindungsgemäßen Antikörpers in solch einer pharmazeutischen Formulierung kann weit variieren, das heißt, gewichtsmäßig von weniger als etwa 0,5 %, üblicherweise bei oder mindestens etwa 1 % bis zu soviel wie 15 oder 20 % und wird hauptsächlich basierend auf Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten und so weiter, entsprechend der besonderen ausgewählten Verabreichungsweise ausgewählt.
So kann ein erfindungsgemäßes Arzneimittel für die intramuskuläre Injektion hergestellt werden, um 1 ml steriles, gepuffertes Wasser und zwischen etwa 1 ng bis zu etwa 100 mg, zum Beispiel 50 ng bis zu etwa 30 mg oder mehr, bevorzugt etwa 5 mg bis zu etwa 25 mg eines konstruierten erfindungsgemäßen Antikörpers zu enthalten. Ähnlich kann ein erfindungsgemäßes Arzneimittel für die intravenöse Infusion hergestellt werden, um 250 ml sterile Ringerlösung und etwa 1 mg bis zu etwa 30 mg und bevorzugt 5 mg bis zu etwa 25 mg eines konstruierten erfindungsgemäßen Antikörpers zu enthalten. Gegenwärtige Verfahren für die Herstellung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind wohl bekannt oder werden für den Fachmann offensichtlich sein und sind detaillierter in zum Beispiel "Remington's Pharmaceutical Science", 15. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, beschrieben.
Es ist bevorzugt, dass der erfindungsgemäße therapeutische Wirkstoff, wenn er in einer pharmazeutischen Präparation vorliegt, in Einzeldosisformen vorliegt. Die geeignete therapeutisch wirksame Dosis kann leicht durch den Fachmann bestimmt werden. Um eine thrombotische oder embolische Störung in einem Menschen oder anderem Tier wirksam zu behandeln, sollte eine Dosis von annähernd 0,1 mg bis zu annähernd 20 mg pro kg Körpergewicht eines erfindungsgemäßen Proteins oder Antikörpers parenteral, bevorzugt i.v. oder i.m., verabreicht werden. Solch eine Dosis kann, wenn nötig, in während der thrombotischen Reaktion von einem Arzt als geeignet ausgewählten geeigneten Zeitabständen wiederholt werden.
Die Antikörper, veränderten Antikörper oder Fragmente davon, welche hier beschrieben werden, können für die Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Von dieser Technik wurde gezeigt, dass sie mit üblichen Immunglobulinen wirksam ist und im Fachgebiet bekannte Techniken der Lyophilisierung und Rekonstitution können angewandt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden spezifischen, nicht begrenzenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung und Durchmusterung von monoclonalen Anti-Faktor IX-Antikörpern
Weiblichen Balb/C-Mäusen wurde wie in Jenny, R. et al., Prep.Biochem. 16 (1986): 227-45 beschrieben gereinigter menschlicher Faktor IX injiziert. Typischerweise erhielt jede Maus eine anfängliche Injektion von 100 cg in 0,15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelösten und mit 0,15 ml kompletten Freundschen Adjuvans gemischten Proteins. Boosterimmunisierungen von 50 μg Protein in 0,15 ml PBS mit 0,15 ml inkomplettem Freundschen Adjuvans wurden annähernd alle 2 Wochen über eine Periode von 2-3 Monaten gegeben. Nach dem letzten Boost erhielt die Maus drei Tage vor den Milz/Myelom-Zellfusionen 50 μg von Faktor IX in PBS. Milzzellen wurden von einer immunisierten Maus isoliert und mit NS-1-Myelomzellen (Köhler, G. et al., Eur. J. Immunol. 6 (1976), 292-295) unter Verwendung von Polyethylenglycol wie durch Oi, V.T. et al. in "Selected Methods in Cellular Immunology," Mishell, B.B. und Shigii, S.M., Herausgeber, Freeman Press, San Francisco beschrieben, fusioniert. Nach der Fusion wurden die Zellen in RPMI 1640-Medium, welches 10 % fötales Kälberserum enthielt, resuspendiert und Teilproben wurden in jede 0,5 ml durch Zellen einer Peritoneallavage konditionierten Mediums enthaltende Vertiefung von vier Platten mit 24 Vertiefungen gesetzt. An dem nachfolgenden Tag erhielt jede Vertiefung 1,0 ml von 2 × 10^–4 M Hypoxanthin, 8 × 10^–7 M Aminopterin und 3,2 × 10^–5 M Thymidin in RPMI 1640-Medium, welches 10 % fötales Kälberserum enthielt. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage durch Entfernung des halben Mediums und seiner Ersetzung durch frisches Medium, welches 1 × 10^–4 M Hypoxanthin und 1,6 × 10^–5 M Thymidin enthielt, gefüttert.
Annähernd 2 Wochen später wurde 1 ml Hybridommedium aus jeder Vertiefung entnommen und auf Anti-Faktor IX-Antikörper unter Verwendung eines ELISA-Tests wie durch Jenny R.J. et al. in Meth. Enzymol. 222 (1993): 400-416, beschrieben getestet. Kurz gesagt wurde Faktor IX in Plastikvertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen immobilisiert. Hybridomüberstände oder Verdünnungen von aufgereinigtem Antikörper wurden dann in den Vertiefungen inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen und die Anwesenheit von Antikörper-Antigenkomplexen wurde mit einem an Meerrettichperoxidase konjugierten Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin-Zweitantikörper und dem chromogenen Substrat o-Dianisidin nachgewiesen.
Anti-Faktor IX-Antikörper enthaltende Vertiefungen wurden durch Grenzverdünnung subcloniert und in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet. Überstand von den clonierten Hybridomzellkulturen wurde durch den vorstehend beschriebenen ELISA-Test auf Antikörper gegen Faktor IX durchmustert und Zellen von positiven Hybridomen wurden vermehrt, eingefroren, in flüssigem Stickstoff gelagert und dann als Aszitestumor in Mäusen gezüchtet.
Beispiel 2
Selbstbegrenzende Wirkung von Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörpern in der Gerinnung
Die Wirkung von zunehmenden Konzentrationen von Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörpern auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) von menschlichem Plasma wurde in einem Fibrometer (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) unter Verwendung des Baxter-Referenzverfahrens LIB0293-J, Überarbeitung 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey) bestimmt.
Vor dem Beginn des Experiments wurden 2 bis 3 ml 0,02 M CaCl₂ in einem 5 ml-Röhrchen in die Heizkammer des Fibrometers platziert. Menschliche Plasmaproben wurden entweder frisch entnommen und auf Eis gehalten oder aus Hämostase-Referenzplasma nach Empfehlung des Herstellers rekonstituiert (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut).
Unfraktioniertes Heparin aus Schweinedarmmucosa (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), niedermolekulares Heparin aus Schweinedarmmucosa (Lovenox^®, Enoxaparin-Natrium, Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) oder mAb-Antikoagulantien wurden als annähernd 50 μM Stammlösungen hergestellt und in Serie direkt in das Test-Plasma verdünnt. Eine Plasma ohne Antikoagulans enthaltende Leerwertprobe wurde als Bezug eingeschlossen.
Zwei FibroTube^®-Fibrometerbecher wurden jeweils mit 100 μl Testplasma oder 100 μl Testplasma mit Antikoagulans und 125 μl Actin-aktivierten Cephalostatinreagens (Actin-Reagens, aus Cephalin aus Kaninchenhirn in Ellagsäure, erhältlich von Baxter Scientific) gefüllt und bei 37 °C in die Vertiefungen des Fibrometers platziert.
Nach einer Minute wurden 100 μl Actin-Reagens in einen Plasma enthaltenden Becher übertragen und der Inhalt mehrere Male mit einer Pipette gemischt. Nach einer Inkubationszeit über 3 Minuten wurden 100 μl bei 37 °C vorgewärmten CaCl₂ dem Gemisch aus Plasma und Actin-Reagens unter Verwendung eines automatischen Pipetten/Zeitnehmer-Auslösers (Becton-Dickinson) hinzugefügt. Die Gerinnungszeiten wurden notiert und die Ergebnisse werden in 1 als Gerinnungszeiten als Funktion der Endkonzentrationen von Antikoagulans im gesamten Testvolumen von 300 μl gezeigt. Die nominale Konzentration von Faktor IX in dem Test ist 30-40 nM.
Die in 1 gezeigten Ergebnisse zeigen die Wirkung von zunehmenden Konzentrationen der Anti-Faktor IX-mAbs BC1 und BC2 aus der Maus auf aPTT-Gerinnungszeiten. Beide mAbs hemmen die Gerinnung durch Verlängerung der aPTT und beide mAbs erreichen am Ende eine Sättigungswirkung auf die aPTT. Die IC₅₀-Werte sind bei jeweils ~35 nM und ~50 nM für BC1 und BC2 ähnlich, aber der Unterschied in der Maximalreaktion auf die beiden Antikörper ist deutlich. Sättigende Konzentrationen von BC1 erhöhen die aPTT um etwa 50 % auf 40 Sek. Andererseits steigert BC2 die aPTT um das 3,5-fache auf etwa 90 Sek. Der in der gerinnungshemmenden Therapie mit Heparin verwendete therapeutische Zielbereich ist hervorgehoben. Die Ergebnisse zeigen an, dass die zwei mAbs den therapeutischen Bereich der aPTT von Heparin umschließen.
Die Eigenschaften der mAbs BC1 und BC2 sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Jeder der BC-mAbs erkennt sowohl das Zymogen Faktor IX als auch die aktive Protease Faktor IXa, aber nur BC2 ist fähig, sowohl die Zymogenaktivierung als auch die Proteaseaktivität zu blockieren. Von BC1 und BC2 wurde herausgefunden, dass sie mit dem Faktor IX aus dem Cynomologous-Affen kreuzreagieren. Zusätzlich kreuzreagierte BC2 auch mit dem Faktor IX aus der Ratte.
Tabelle I. Zusammenfassung der in vitro-Eigenschaften von Anti-Faktor IX-mAbs
Die in 2 gezeigten Ergebnisse zeigen die Wirkung von zunehmenden Konzentrationen der Anti-Faktor IX-mAbs 9E4 (2) F4 und 11G4 (1) B9 auf die aPTT- Gerinnungszeiten. Das Plasma für den Test wurde auf die Hälfte der normalen Konzentration verdünnt, was eine anfängliche aPTT von 45 Sekunden ergab. Beide mAbs hemmen die Gerinnung durch Verlängerung der aPTT und beide mAbs erreichen am Ende eine Sättigungswirkung auf die aPTT. Sättigende Konzentrationen von 9E4 (2) F4 und 11G4 (1) B9 erhöhen die aPTT auf ~90 bis 100 Sekunden für 9E4 (2) F4 und auf ~80 Sekunden für 11G4 (1) B9. Die Ergebnisse zeigen an, dass die zwei mAbs am oberen Ende des therapeutischen Bereiches von Heparin für die aPTT sind.
Die in 3 gezeigten Ergebnisse zeigen die Wirkung von steigenden Konzentrationen der Anti-Faktor X-mAbs HFXLC (gegen das Epitop der leichten Kette), HFXHC (gegen das Epitop der schweren Kette) und des Anti-Faktor XI-mAb HFXI auf aPTT-Gerinnungszeiten. Diese mAbs wurden von Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN) erhalten. Die mAbs HFXLC und HFXI hemmen die Gerinnung durch Verlängerung der aPTT und beide mAbs erreichen am Ende eine sättigende Wirkung auf die aPTT. Der IC₅₀-Wert für HFXLC ist ~40 nM; sättigende Konzentrationen erhöhen die aPTT auf ~60 Sekunden. Der IC₅₀-Wert für HFXI ist ~20 nM; sättigende Konzentrationen erhöhen die aPTT auf 100 Sekunden. Die Ergebnisse zeigen an, dass HFXLC im therapeutischen Bereich für die aPTT von Heparin ist, während HFXI in das obere Ende des therapeutischen Bereichs von Heparin fällt. Der mAb HFXHC hatte keine Wirkung auf aPTT-Gerinnungszeiten.
Eine selbstbegrenzende Verlängerung der aPTT wurde auch mit Antikörpern gegen Faktor VIII, dem Kofaktor von Faktor IXa, beobachtet. Zum Beispiel erhöhte der von Affinity Biologicals Inc. gekaufte gegen den menschlichen Faktor VIII gerichtete Antikärper SAFBC-IG die aPTT auf ein Maximum von etwa 65 Sek. Eine halbmaximale Verlängerung der aPTT wurde mit etwa 100 nM Antikörper erreicht.
Beispiel 3
Wirksamkeit von Faktor IX-mAbs aus der Maus im Thrombusmodell in Ratten
Um die Wirksamkeit von Anti-Faktor IX-Antikörpern bei der Vorbeugung der arteriellen Thrombose zu bestimmen, wurde das von Schumacher et al. in J. Cardio. Pharm. 22 (1993): 526-533 beschriebene Carotisarterien-Thrombosemodell in Ratten angepasst. Dieses Modell besteht in einer segmentalen Verletzung des Carotisendothels durch Sauerstoffradikale, welche durch Aufbringung einer FeCl₃-Lösung auf die Oberfläche der Carotisarterie erzeugt wurden.
Kurz gesagt wurden Ratten mit Pentobarbital-Natrium betäubt, die Jugularvene für intravenöse Injektionen mit einer Kanüle versehen und die linke Femoralarterie zur Überwachung des Blutdrucks und der Herzfrequenz mit einer Kanüle versehen. Die Carotisarterie wurde durch aseptische Techniken durch einen chirurgischen Einschnitt im Hals isoliert und mit einer magnetischen Flusssonde zur Messung des Blutflusses ausgestattet. Nach einer Periode der Stabilisierung wurden Grundlinienwerte für die folgenden Variablen etabliert: Blutfluss der Carotis, arterieller Druck, Herzfrequenz, aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und Prothrombinzeit (PT). Danach wurde ein vorab abgemessenes, mit 50 % FeCl₃-Lösung getränktes Whatman-Filterpapier über 15 Minuten auf der Carotisarterie platziert, um die darunter liegenden Endothelzellen vollständig zu verletzen. Nach Entfernung des mit FeCl₃ getränkten Papiers wurde das Experiment bis zum Abschluss über 60 Minuten verfolgt. Am Ende des Experiments wurde der Thrombus der Carotis aus der Carotisarterie entnommen und gewogen.
Alle Wirkstoffe wurden 15 Minuten vor dem Beginn der Verletzung der Carotis verabreicht. Die folgenden Behandlungen wurden untersucht und mit dem Faktor IX-mAb BC2 verglichen.

1. Heparin: jeweils 15, 30, 60 oder 120 U/kg Bolus, jeweils gefolgt durch Infusion von 0,5, 1, 2 bzw. 4 U/kg/min über 60 Minuten.
2. Acetylsalicylsäure (ASA, Aspirin): 5 mg/kg Bolus
3. Anti-Faktor IX-mAb BC2: jeweils 1, 3 oder 6 mg/kg Bolus, jeweils gefolgt durch Infusion von 0,3, 1 bzw. 2 μg/kg/Min über 60 Minuten
4. Heparin: 30 U/kg Bolus + 1 U/kg/Min. + ASA mit 5 mg/kg
5. Anti-Faktor IX-mAb BC2: 1 mg/kg + 0,3 μg/kg/Min. + ASA mit 5 mg/kg

Die 4 und 5 zeigen die vergleichende Pharmakologie der antikoagulierenden/thrombotischen Schemata durch Aufzeigen der Wirkung von Heparin, ASA und Faktor IX-mAb BC2 auf die aPTT (4) und PT (5).
Der Schlüsselindex für die Blutungsbereitschaft, aPTT, wurde als Hauptkriterium für die Bewertung der Wirksamkeit gegenüber der Blutungsneigung für die in der Untersuchung verwendeten antikoagulierenden/thrombotischen Wirkstoffe verwendet. Die Ergebnisse in 4 zeigen die dosisabhängige Verlängerung der aPTT durch Heparin mit einer maximalen Verlängerung der Gerinnungszeit über die Testgrenzen bei den zwei höheren Dosen. ASA alleine erhöhte die aPTT nicht wesentlich, es wurde aber in Kombination mit Heparin eine ausgeprägt synergistische Wirkung beobachtet. Die Faktor IX-mAbs hatten eine mäßige Wirkung auf die aPTT und selbst bei den höchsten Dosen überschritt die Erhöhung der Gerinnungszeit nicht die dreifache Grenze der klinisch praktizierten Standardantikoagulation. Am bemerkenswertesten ist, dass die niedrige Dosis des Faktor IX-mAb BC2 in Kombination mit ASA die aPTT nicht veränderte.
In 5 zeigen die Daten, dass auch die PT durch Heparin bei den zwei höheren Dosen und durch die ASA + Heparin-Kombination aber nicht durch irgendeine der Faktor IX-mAb Dosen alleine oder in Kombination mit ASA wesentlich erhöht wurde.
Die Wirkung von Heparin, ASA und Faktor IX-mAb auf den Verschluss der Carotisarterie wird in 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Carotisarterien von allen mit Vehikel behandelten Tieren sich als Reaktion auf die Verletzung verschließen. Heparin hemmte dosisabhängig den Verschluss der Carotisarterie. Bei der höchsten Dosis verhinderte Heparin den Verschluss der Carotisarterie vollständig; bei dieser Dosis konnte jedoch keine Gerinnung mehr ausgelöst werden. ASA alleine hatte nur eine geringfügige Wirkung auf den Verschluss der Carotis. ASA in Kombination mit Heparin versagte ebenfalls darin, den Verschluss der Carotis vollständig zu verhindern. Der Faktor IX-mAb blockierte den Verschluss der Carotis bei den zwei höheren Dosen, welche die Gerinnung nicht über das klinisch erwünschte Ziel hinaus verlängerten, vollständig. Die niedrigere Dosis von Faktor IX-mAb, welche großteils darin versagte, alleine die Durchgängigkeit zu sichern, zeigte eine vollständige Hemmung des Verschlusses der Carotis, wenn sie zusammen mit ASA verabreicht wurde.
Die Wirkung von Heparin, ASA und Faktor IX-mAb auf das Thrombusgewicht wird in 7 gezeigt. Heparin verringerte dosisabhängig die Thrombusmasse in der Carotisarterie. Es wurde jedoch trotz der vollständigen Blockade der Gerinnung immer noch ein wenig verbleibender Thrombus in der Carotisarterie gefunden. ASA alleine oder in Kombination mit Heparin (30 U/kg-Schema) hatte nur eine teilweise Wirkung auf das Thrombusgewicht. Faktor IX-mAb reduzierte dosisabhängig die Thrombusmasse und die hohe Dosis verhinderte praktisch die Thrombusbildung. Zudem verhinderte die Kombination der niedrigen Dosis von Faktor IX-mAb und ASA, ein Schema, welches den Verschluss der Carotis vollständig verhinderte ohne die Gerinnungswerte ungünstig zu beeinflussen, die Thrombusbildung vollständig.
Die in dem Carotis-Thrombosemodell in Ratten durchgeführten Untersuchungen zeigen klar die Wirkung von Faktor IX-mAb in der Vorbeugung der Thrombose in einem hoch thrombogenen Modell der Verletzung von Arterien. Am bemerkenswertesten ist, dass die Wirksamkeit des Faktor IX-mAb innerhalb des durch die aPTT definierten, erwünschten therapeutischen Ziels der Antikoagulation gezeigt wurde. Weiterhin erreichte Heparin, das derzeitige Standardantikoagulans, eine mit dem Faktor IX-mAb vergleichbare Wirksamkeit nur bei Dosen, welche die Gerinnung in einem solchen Ausmaß beeinträchtigten, dass nicht gerinnbares Blut produziert wurde. Interessanterweise wurde die beobachtete Potenzierung und Synergie, welche durch die mit ASA verbundene Behandlung mit Heparin erhalten wurde, auch gezeigt, wenn ASA mit Anti-Faktor IX-mAb gegeben wurde. Im Unterschied zur Kombination von Heparin und ASA, welche zur Potenzierung sowohl der anti-thrombotischen als auch der anti-coagulierenden Wirkungen führte, ergab die Kombination von Faktor IX-mAb und ASA jedoch eine Potenzierung der anti-thrombotischen Wirksamkeit ohne eine durchgängige Wirkung auf die ex vivo-Gerinnungswerte des Blutes. Zusammengenommen zeigen die Daten verglichen mit Heparin, ASA oder einer Kombination von Heparin und ASA eine überlegene anti-thrombotische Kapazität des Faktor IX-mAb.
Beispiel 4
Rasterelektronenmikroskopie des Thrombosemodells in Ratten
Abschnitte der Carotisarterie der Ratte wurden von Scheinbehandlung, nur Eisenchlorid und Eisenchlorid + 6 mg/kg Faktor IX-Antikörper entnommen, 3/Gruppe, 15 Minuten nach Anwendung des Eisenchlorids. Die Arterien wurden mittels Perfusion mit Formaldehyd fixiert und über und unter dem verletzten Gebiet abgebunden. Fixierte Arterien wurden entwässert, mit Hexamethyldisilazan inkubiert und in einem Exsikkator getrocknet. Die getrockneten Arterien wurden der Länge nach geöffnet, auf Probenträgern für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) platziert und durch Sputtern mit Gold beschichtet.
Die SEM der scheinbehandelten Arterien zeigte ein im Wesentlichen normales Endothel mit wenigen, verteilten Blutplättchen. Es gab, wahrscheinlich als Ergebnis mechanischen Schadens während der Operation, einige wenige Brüche im Endothel und die darunter liegende Basalmembran war durch einen Teppich von Blutplättchen bedeckt. In den scheinbehandelten Ratten wurde kein Beleg für eine Thrombusbildung beobachtet.
Die SEM der mit Eisenchlorid behandelten Arterien offenbarte große wandständige Thromben, welche einen großen Anteil des Lumens des Gefäßes besetzten. Die Thromben waren aus zusammengelagerten Blutplättchen, roten Blutkörperchen und amorphem und fibrillärem proteinartigem Material zusammengesetzt. Das proteinartige Material stimmt mit Fibrin überein. Das Endothel der Arterien war meist durch die großen Thromben verdeckt. Wo sichtbar, war das das mit Eisenchlorid behandelte Gebiet überlagernde Endothel mit vielen anhaftenden Blutplättchen und amorphem, proteinartigem Material bedeckt.
Die SEM von mit Eisenchlorid behandelten Arterien von auch mit Faktor IX-Antikörper behandelten Ratten zeigten auf, dass das Lumen der Gefäße im Wesentlichen frei von Thrombus war. Das das mit Eisenchlorid behandelte Gebiet überlagernde Endothel zeigte ausgedehnten Schaden und einige Gebiete waren von anhaftenden Blutplättchen und Blutplättchenanhäufungen bedeckt, aber es gab wenig oder kein proteinartiges Material.
Beispiel 5
Sequenzanalyse der cDNA der leichten und schweren Kette des Anti-Faktor IX-mAb BC2
Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TriReagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) entsprechend dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Die RNA wurde mit Isopropanol gefällt und in 0,5 % SDS gelöst und auf 0,5 M NaCl eingestellt. Poly A⁺-RNA wurde mit Dynabeads Oligo (dT)₂₅ (Dynal A.S., Lake Success, NY) entsprechend dem Protokoll des Herstellers isoliert. Poly A⁺-RNA wurde von den Kügelchen eluiert und in TE-Puffer resuspendiert. Zwölf Teilproben von 100 ng RNA wurden mit einem RT-PCR-Kit nach den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim Kat. Nr.: 1483-188) unter Verwendung eines dT-Oligos zum Primen revers transkribiert. Für die schwere Kette wurden PCR-Amplifikationen von 6 RNA/DNA-Hybriden über 25 Zyklen unter Verwendung eines Hinge-Primers für IgG2a aus der Maus (SEQ ID NO: 1) und eines Primers für die Signalsequenz der schweren Kette (SEQ ID NO: 2) durchgeführt. Ähnlich wurden für die leichte Kette PCR-Amplifikationen von 6 RNA/DNA-Hybriden über 25 Zyklen unter Verwendung eines Kappa-Primers für die Maus (SEQ ID NO: 3) und eines degenerierten Primers für die Signalsequenz der leichten Kette (SEQ ID NO: 4) durchgeführt. Die PCR-Produkte von allen der 12 Amplifikationen wurden in einen Vektor pCR2000 ligiert (TA cloning Kit, Invitrogen, Kat. Nr. K2000-01). Kolonien von rekombinanten Clonen wurden zufällig ausgewählt und Minipräparationen von Plasmid-DNA wurden unter Verwendung eines alkalischen Extraktionsverfahrens, beschrieben durch Birnboim und Doly in Nucl. Acids Res. 7 (1979): 1513, hergestellt. Die isolierte Plasmid-DNA wurde mit EcoRI gespalten und auf einem 0,8%igen Agarosegel untersucht. Doppelsträngige cDNA-Insertionen der passenden Größe, das heißt ~700 Bp für die schwere Kette und ~700 Bp für die leichte Kette, wurden mittels einer Modifikation des Verfahrens nach Sanger sequenziert. Die Sequenz von allen 12 schweren und leichten Ketten wurden vergleichen, um eine Konsensussequenz für die variable Region der schweren Kette (SEQ ID NO: 5) von BC2 und eine Konsensussequenz der variablen Region der leichten Kette (SEQ ID NO: 6) von BC2 zu erzeugen.
Die Sequenzanalyse der cDNA der variablen Region der schweren Kette von BC2 offenbarte einen offenen Leserahmen über 363 Nucleotide, welcher eine Sequenz von 121 Aminosäuren codiert (SEQ ID NO: 7). Die Sequenzen der CDR1, 2 und 3 der schweren Kette sind jeweils in SEQ ID NO: 8, 9 und 10 aufgeführt.
Die Sequenzanalyse der cDNA der variablen Region der leichten Kette von BC2 offenbarte einen offenen Leserahmen über 321 Nucleotide, welcher eine Sequenz von 107 Aminosäuren codiert (SEQ ID NO: 11). Die Sequenzen der CDR1, 2 und 3 der leichten Kette sind jeweils in SEQ ID NO: 12, 13 und 14 aufgeführt.
Beispiel 6
Humanisierte Antikörper
sSechs als SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 und SB 257732 bezeichnete humanisierten Antikörper wurden so entworfen, dass sie die vorstehend beschriebenen CDRs aus der Maus in einem humanen Antikörpergerüst enthielten.
SB 249413
SB 249413 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-0 und die leichte Kette F9HZLC 1-0. Die synthetische für die variable Region humanisierte schwere Kette F9HZHC 1-0 wurde unter Verwendung der ersten drei Gerüstregionen aus der schweren Kette, welche aus dem Immunglobulin RF-TS3'CL (Capra J.D. et al., J. Clin. Invest. 86 (1990): 1320-1328; in der Kabat-Datenbank als Kabpro: Hhc10w identifiziert) erhalten wurden, und der vorher beschriebenen CDRs der schweren Kette von BC2 entworfen. Es wurden keine Austausche von Gerüstaminosäuren vorgenommen, welche die Präsentation der CDR beeinflussen könnten. Vier überlappende synthetische Oligonucleotide wurden erzeugt (SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18), welche, wenn sie aneinandergelagert und verlängert werden, die Aminosäuren codieren, welche durch CDR3 (SEQ ID NO: 19 und 20) hindurch und diese einschließend die variable Region der schweren Kette repräsentieren. Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NO: 21 und 22) amplifiziert und in den Vektor pCR2000 ligiert (TA cloning Kit, Invitrogen, Kat. Nr. K2000-01) und aus einer Restriktionsspaltung mit SpeI und KpnI isoliert. Ein zweites für die Campath-Signalsequenz einschließlich der ersten fünf Aminosäuren der variablen Region (SEQ ID NO: 23 und 24) codierendes DNA-Fragment wurde durch eine Amplifikation der entsprechenden Region eines die schwere Kette eines humanisierten Anti-Respiratory-Syncytial-Virus (SEQ ID NO: 25) codierenden Konstruktes mit zwei Primern (SEQ ID NO: 26 und 27) mittels PCR und durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SpeI hergestellt. Die zwei erzeugten Fragmente wurden in einen mit EcoRI und KpnI gespaltenen pFHZHC2-6pCD Vektor zur Säugerzellexpression ligiert, welcher den Rest eines menschlichen Konsensus-Gerüsts 4 und die konstante Region von IgG1 enthielt. Der Vektor enthielt eine einzelne Mutation einer Aminosäure des in der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung Nr. WO94/05690 beschriebenen Vektors pFHZHC2-3pCD. Der letzte Rest von Gerüst 2 (Rest 49) wurde durch Spaltung von pFHZHC2-3pCD mit XbaI und EcoR5 und Einfügung eines aus zwei synthetischen Oligonucleotiden SEQ ID NO: 28 und 29) erzeugten Linkers von Ser nach Ala mutiert. Die Sequenz der Insertion F9HZHC 1-0 wird in SEQ ID NO: 30 und 31 gezeigt.
Die synthetische für die variable Region humanisierte leichte Kette F9HZLC 1-0 wurde unter Verwendung der Gerüstregionen der humanen leichten Kette, welche von dem Immunglobulin LS8'CL erhalten wurden (Carmack et al., J. Exp. Med. 169 (1989): 1631-1643; in der Kabat-Datenbank als Kabpro:Hk1318 identifiziert) und der vorher beschriebenen CDRs der leichten Kette von BC2 entworfen. Es wurden keine Austausche von Gerüstaminosäuren vorgenommen, welche die Präsentation der CDR beeinflussen könnten. Zwei überlappende synthetische Oligonucleotide wurden erzeugt (SEQ ID NO: 32 und 33), welche, wenn sie aneinandergelagert und verlängert werden, die Aminosäuren codieren, welche die variable Region der leichten Kette repräsentieren (SEQ ID NO: 34 und 35). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NO: 36 und 37) amplifiziert und in den Vektor pCR2000 ligiert (TA cloning Kit, Invitrogen, Kat. Nr. K2000-01) und aus einer Restriktionsspaltung mit ScaI und SacII isoliert. Ein zweites für die Campath-Signalsequenz einschließlich der ersten zwei Aminosäuren der variablen Region (SEQ ID NO: 38 und 39) codierendes DNA-Fragment wurde durch eine Amplifikation der entsprechenden Region eines die schwere Kette eines humanisierten Anti-Respiratory-Syncytial-Virus (SEQ ID NO: 25) codierenden Konstruktes mit zwei Primern (SEQ ID NO: 26 und 40) mittels PCR und durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ScaI hergestellt. Die zwei erzeugten Fragmente wurden in einen mit EcoRI und SacII gespaltenen pFHzLC1-2pCN Vektor zur Säugerzellexpression ligiert, welcher den Rest eines humanen Konsensus-Gerüsts 4 und die konstante Kappa-Region enthielt. Der Vektor enthielt eine einzelne Mutation einer Aminosäure des in der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung Nr. WO94/05690 beschriebenen Vektors pFHZLC1-1pCN. Ein Rest von Gerüst 2 wurde durch Spaltung von pFHZLC1-pCN mit SmaI und KpnI und Einfügung eines aus zwei synthetischen Oligonucleotiden (SEQ ID NO: 41 und 42) erzeugten Linkers von Ser nach Pro mutiert. Die Sequenz der Insertion F9HZLC 1-0 wird in SEQ ID NO: 43 und 44 gezeigt.
SB 249415
SB 249415 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 und die leichte Kette F9HZLC 1-1. Diese Konstrukte für die leichte und schwere Kette basieren jeweils auf F9HZHC 1-0 und F9HZLC 1-0, sie haben jedoch Austausche von Gerüstaminosäuren, welche die Präsentation der CDR beeinflussen können.
F9HZHC 1-1 hat drei Austausche von Gerüstaminosäuren, welche die Präsentation der CDR beeinflussen könnten. Es wurden zwei synthetische überlappende Oligonucleotide (SEQ ID NO: 45 und 46) erzeugt, welche, wenn aneinandergelagert und verlängert, die Aminosäuren codieren, welche den veränderten Anteil der veränderten variablen Region der schweren Kette (SEQ ID NO: 47 und 48) repräsentieren. Dieses synthetische Gen wurde unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NO: 49 und 50) amplifiziert, in den Vektor pCR2000 (TA cloning Kit, Invitrogen, Kat. Nr. K2000-01) ligiert und aus einer Restriktionsspaltung mit EcoNI und KpnI isoliert. Dieses Fragment wurde in einen mit EcoNI und KpnI gespaltenen Vektor F9HZHC1-0 (SEQ ID NO: 30) ligiert. Die Sequenz der Insertion F9HZHC 1-1 wird in SEQ ID NO 51 und 52 gezeigt.
F9HZLC 1-1 hat vier Austausche von Gerüstaminosäuren des Frameworks, welche die Präsentation der CDR beeinflussen können. Es wurden zwei synthetische Oligonucleotide (SEQ ID NO: 53 und 54) erzeugt, welche, wenn aneinandergelagert kohäsive KpnI- und BamHI-Enden haben, und Aminosäuren codieren, welche den veränderten Anteil der variablen Region der leichten Kette (SEQ ID NO: 55) repräsentieren. F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI gespalten und an die synthetische DNA ligiert. Die Sequenz der Insertion F9HZLC 1-1 wird in SEQ ID NO 56 und 57 gezeigt.
SB 249416
SB 249416 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 (vorstehend beschrieben) (SEQ ID NO: 52) und die leichte Kette F9HZLC 1-2. Das Konstrukt der leichten Kette basiert auf F9HZLC 1-1, es hat jedoch einen zusätzlichen Gerüstaminosäureaustausch, welcher die Präsentation der CDR beeinflussen kann.
Zwei synthetische Oligonucleotide wurden erzeugt (SEQ ID NO: 58 und 59), welche, wenn aneinandergelagert kohäsive Enden von BamHI und XbaI besitzen, und die Aminosäuren codieren, welche den veränderten Anteil der variablen Region der leichten Kette repräsentieren (SEQ ID NO: 60). Der Vektor F9HZLC 1-1 (SEQ ID NO: 56) wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI gespalten und an die synthetische DNA ligiert. Die Sequenz der Insertion F9HZLC 1-2 wird in den SEQ ID NO: 61 und 62 gezeigt.
SB 249417
SB 249417 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 (vorstehend beschrieben) (SEQ ID NO: 52) und die leichte Kette F9HZLC 2-0. Eine synthetische für die variable Region humanisierte leichte Kette F9HZLC 2-0 wurde unter Verwendung der Gerüstregionen, welche von dem Immunglobulin REI (Palm und Hilschmann, Z. Physiol. Chem. 354 (1973): 1651-1654; in der Kabat-Datenbank als Kabpro: HKL111 identifiziert) erhalten wurden, und der vorher beschriebenen CDRs der leichten Kette von BC2 entworfen. Fünf Austausche von Aminosäuren im humanen Konsensus wurden eingeführt. Sechs Gerüstaminosäureaustausche nach Maus, welche die Präsentation der CDR beeinflussen können, wurden durchgeführt. Zwei überlappende synthetische Oligonucleotide (SEQ ID NO: 63 und 64), welche, wenn aneinandergelagert und verlängert, die die variable Region der leichten Kette repräsentierenden Aminosäuren codieren (SEQ ID NO: 65 und 66) wurden erzeugt. Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NO: 67 und 68) amplifiziert und in den Vektor pCR2000 ligiert (TA cloning Kit, Invitrogen, Kat. Nr. K2000-01) und aus einer ScaI- und SacII-Restriktionsspaltung isoliert. Ein zweites die Campath-Signalsequenz einschließlich der ersten zwei Aminosäuren der variablen Region (SEQ ID NO: 38) codierendes DNA-Fragment wurde durch Amplifikation der geeigneten Region eines die humanisierte schwere Kette eines Anti-Respiratory-Syncytial-Virus (SEQ ID NO: 25) codierenden Konstruktes mit zwei Primern (SEQ ID NO: 26 und 69) mittels PCR und durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ScaI hergestellt. Ein drittes DNA-Fragment, welches den Rest eines humanen Gerüsts 4 (SEQ ID NO: 70) codiert und kohäsive Enden von SacII und NarI besitzt, wurde durch Aneinanderlagern von zwei synthetischen Oligonucleotiden (SEQ ID NO: 71 und 72) erzeugt. F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NarI gespalten und an die drei DNA-Fragmente ligiert. Die Sequenz der Insertion F9HZLC 2-0 wird in SEQ ID NO: 73 und 74 gezeigt.
SB 257731
SB 257731 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) und die leichte Kette F9HZLC 1-3, die Mutation einer einzelnen Aminosäure von F9HZLC 1-2 (SEQ ID NO: 62). F9HZLC 1-2 wurde mittels PCR und zwei Primern (SEQ ID NO: 26 und 69) amplifiziert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ScaI gespalten. Ein Fragment von 94 Bp (SEQ ID NO: 75 und 76) wurde isoliert. Das Fragment wurde in den mit EcoRI und ScaI gespaltenen Vektor F9HZLC 1-2 ligiert, um das Konstrukt der leichten Kette F9HZLC 1-3 zu erzeugen. Die Sequenz der Insertion F9HZLC 1-3 wird in SEQ ID NO: 77 und 78 gezeigt.
SB 257732
SB 257732 enthält die synthetische für die variable Region humanisierte schwere Kette F9HZHC 3-0 und die leichte Kette F9HZLC 3-0. Vier überlappende synthetische Oligonucleotide (SEQ ID NO: 79, 80, 81 und 82) wurden erzeugt, welche, wenn aneinandergelagert und verlängert, die die veränderte variable Region der schweren Kette repräsentierenden Aminosäuren codieren (SEQ ID NO: 83 und 84). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NO: 85 und 86) amplifiziert und in den Vektor pCR2000 ligiert (TA cloning Kit, Invitrogen, Kat. Nr. K2000-01) und aus einer StuI- und KpnI-Restriktionsspaltung isoliert. Das isolierte Fragment wurde in den mit StuI und KpnI gespaltenen Vektor F9HZHC1-1 (SEQ ID NO: 52) ligiert. Dieser Vektor wurde dann mit EcoRI und SpeI gespalten, um die Signalsequenz zu entfernen. Ein für die Campath-Signalsequenz (SEQ ID NO: 23) einschließlich der ersten fünf Aminosäuren der variablen Region codierendes DNA-Fragment wurde durch Amplifikation von F9HZHC1-0 mittels PCR mit zwei Primern (SEQ ID NO: 26 und 87) und durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SpeI erzeugt. Das erzeugte Fragment wurde in den Vektor ligiert. Die Sequenz der Insertion F9HZHC 3-0 wird in SEQ ID NO: 88 und 89 gezeigt.
Vier überlappende synthetische Oligonucleotide (SEQ ID NO: 90, 91, 92 und 93) wurden erzeugt, welche, wenn aneinandergelagert und verlängert, die die variable Region der leichten Kette repräsentierenden Aminosäuren codieren (SEQ ID NO: 94 und 95). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NO: 96 und 97) amplifiziert und in den Vektor pCR2000 ligiert (TA cloning Kit, Invitrogen, Kat. Nr. K2000-01) und aus einer ScaI- und NarI- Restriktionsspaltung isoliert. Das isolierte Fragment wurde in den mit ScaI und NarI gespaltenen Vektor F9HZLC1-3 (SEQ ID NO: 77) ligiert. Die Sequenz der Insertion F9HZLC 3-0 wird in SEQ ID NO: 98 und 99 gezeigt.
Die humanisierten Anti-Faktor IX-mAbs wurden in CHO-Zellen exprimiert. Eine an das Wachstum in Suspension in serumfreien Medium angepasste Zelllinie DG-44 wurde in 100 ml proteinfreien Medium, welches 1 × Nucleoside und 0,05 % F68 enthielt, in sterilen 250 ml Einmal-Erlenmeyerkolben (Corning) auf einem Plattformschüttler Innova 2100 (New Bruswick Scientific) bei 150 UpM bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO₂ und mit auf 95 % angefeuchteter Luft gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich bei 4 × 10⁵ Zellen/ml passagiert. Jeweils 15 μg der Vektoren pCN-Lc der leichten Kette und pCD-Hc der schweren Kette wurden durch Spaltung mit NotI linearisiert, unter sterilen Bedingungen kopräzipitiert und in 50 μl 1 × TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert. Die DNA wurde unter Verwendung eines Bio-Rad-Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) in die Acc-098-Zellen unter Verwendung des Verfahrens von Hensley et al. in J.BioLChem. 269 (1994), 23949-23958 elektroporiert. 1,2 × 10⁷ Zellen wurden einmal mit 12,5 ml eiskalter PBSaccharose (PBS, 272 mM Saccharose, 7 mM Natriumphosphat pH 7,4, 1 mM MgCl₂) gewaschen, in 0,8 ml PBS resuspendiert, den 50 μl der DNA-Lösung hinzugefügt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden einem Puls mit 380 V und 25 Mikrofarad ausgesetzt, dann auf Eis 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen mit 5 × 10⁵ Zellen/Platte im Erhaltungsmedium 24 Stunden vor der Selektion ausplattiert. Die Zellen wurden auf Resistenz gegenüber 400 μg/ml G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) in Erhaltungsmedium selektioniert. 24 Stunden vor dem Test wurden die Zellen mit 150 μl des Erhaltungsmediums gefüttert.
Konditioniertes Medium von individuellen Kolonien wurde unter Verwendung eines Elektrochemolumineszenz (ECL)-Nachweisverfahrens auf einem Origen Analyzer (IGEN, Inc.) getestet. Siehe Yang et al., Biotechnology 12 (1994): 193-194.
Alle für die Durchführung der Tests (Testpuffer) und für den Betrieb des Analyzers (Zellreiniger) notwendigen Lösungen wurden von IGEN erhalten. Die Antikörper (Anti-humanes IgG (spezifisch für g-Ketten), Sigma Chemicals und F(ab')₂-Fragment gegen humanes IgG (H+L) Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) wurden mit TAG-NHS-Ester (IGEN, Inc.) mit einem Molverhältnis von 7:1 für TAG:Protein markiert, während das Protein A (Sigma) mit Biotin-LC-SuIfo-NHS-Ester (IGEN, Inc.) mit einem Molverhältnis von 20:1 für Biotin:Protein markiert wurde, beides entsprechend den Empfehlungen von IGEN. Mit Streptavidin beschichtete magnetische Kügelchen (M280) wurden von Dynal erhalten.
Immuntests wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt: pro Probe wurden 50 μl der mit Streptavidin beschichteten Kügelchen (Endkonzentration 600 μg/ml verdünnt in PBS, pH 7,8, mit 1,25 % Tween) mit 50 μl Biotin-Protein A (Endkonzentration 1 μg/verdünnt in PBS, pH 7,8, mit 1,25 % Tween) gemischt und bei Raumtemperatur über 15 Min. unter Bewegung inkubiert, 50 μl der TAG-Antikörper (ein Gemisch mit einer Endkonzentration von 1,25 μg/ml F(ab')₂-Fragment gegen humanes IgG (H+L) und 0,25 μg/ml Anti-humanes IgG (spezifisch für g-Ketten) verdünnt in PBS, pH 7,8, mit 1,25 % Tween) wurden hinzugefügt, die Lösung wurde dann zu 50 μl konditioniertem Medium hinzugefügt und mit Bewegung bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. 200 μl des Testpuffers wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und die Probe in dem Origen I Analyzer untersucht, um die ECL zu messen. Die Ergebnisse zeigen, dass annähernd 20-37 % der getesteten Kolonien über 15 ng/ml des Antikörpers, mit einer durchschnittlichen Expression von etwa 150 ng/ml, sezernieren.
Humanisierte Anti-Faktor IX-mAbs wurden aus den konditionierten Medien unter Verwendung eines Procep A-Fängerschrittes, gefolgt von einer Ionenaustauschchromatographie zur Herabsetzung der DNA-Last, gereinigt. Das Sorptionsmittel Procep A (Bioprocessing Ltd., Durham England) wurde verwendet, um eine Säule mit einem 1:1-Verhältnis von Durchmesser zu Höhe herzustellen. Geklärtes konditioniertes Medium wurde mit etwa 150 cm/h auf die Säule geladen. Die Säule wurde aufeinanderfolgend mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1 M NaCl enthaltendem PBS und schließlich mit PBS gewaschen. Das gebundene Material wurde durch Elution mit 0,1 M Essigsäurelösung wiedergewonnen. Das Eluat wurde auf pH 5,5 eingestellt und mit Wasser (1:4) verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde mit 80 cm/h auf eine S-Sepharosesäule (2,5 × 13 cm) geladen, welche mit 20 mM Natriumacetat, pH 5,5 vorher äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Acetatpuffer gewaschen, bis eine stabile Grundlinie erhalten wurde, und das gebundene Protein wurde mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4 mit 25 cm/h eluiert.
Das eluierte Material wurde mit einer 0,4 Mikron-Membran filtriert und bei 4 °C gelagert.
Beispiel 7
Maus/Mensch-chimärer Antikörper
100 ng der BC2-RNA wurden mit einem RT-PCR Kit nach den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim Kat. Nr. 1483-188) unter Verwendung eines dT-Oligos zum Primen revers transkribiert und mittels PCR mit synthetischen ScaI-(SEQ ID NO: 100) und NarI-(SEQ ID NO: 101)-Primern amplifiziert, um die variable Region der leichten Kette von BC2 mit ScaI- und NarI-Enden (SEQ ID NO: 102 und 103) herzustellen. Diese DNA wurde in den mit ScaI und NarI gespaltenen F9HZHC1-3 (SEQ ID NO: 77) ligiert und mit ScaI und NarI gespalten um einen Maus-Mensch-chimäre leichte Kette F9CHLC (SEQ ID NO: 104 und 105) herzustellen.
100 ng der BC2-RNA wurden mit einem RT-PCR Kit nach den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim Kat. Nr. 1483-188) unter Verwendung eines dT-Oligos zum Primen revers transkribiert und mittels PCR mit synthetischen SpeI-(SEQ ID NO: 106) und NheI-(SEQ ID NO: 107)-Primern amplifiziert, um die variable Region der schweren Kette von BC2 mit SpeI- und NheI-Enden (SEQ ID NO: 108 und 109) herzustellen. Die Signalsequenz von Campath wurde mittels PCR aus der schweren Kette von RSVHZ19 (SEQ ID NO: 25) mit EcoRI- (SEQ ID NO: 26) und SpeI-(SEQ ID NO: 87)-Primern amplifiziert. Diese zwei DNA-Fragmente wurden in einen mit EcoRI und NheI gespaltenen Vektor IL4CHHCpcd, beschrieben in der veröffentlichten Internationalen Patentanmeldung Nr. WO95107301 ligiert, wobei die variable Region von IL4 mit der variablen Region von BC2-Faktor IX aus der Maus ersetzt wird, um eine Maus/Mensch-chimäre schwere Kette F9CHHC (SEQ ID NO: 110 und 111) herzustellen.
Die Kotransfektion und Reinigung des Maus-Mensch-chimären Antikörpers chαFIX wurde wie vorstehend für die humanisierten Konstrukte beschrieben bewerkstelligt.
Beispiel 8
Wirksamkeit der humanisierten Faktor IX-mAbs in einem Thrombus-Modell in der Ratte
Um die Wirksamkeit der humanisierten Anti-Faktor IX-Antikörper bei der Vorbeugung der arteriellen Thrombose zu beurteilen, wurde das Carotis-Thrombosemodell in Ratten wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben verwendet. Grundlinienwerte für den Blutfluss in der Carotis, den arteriellen Druck, die Herzfrequenz, die Durchgängigkeit der Gefäße und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) wurden ermittelt. Fünfzehn Minuten danach wurde eine Verletzung der Carotiden über 10 Minuten bewirkt. Die Werte wurden 60 Minuten nach Einsetzen der Verletzung der Carotiden bestimmt. Der Carotisthrombus wurde ebenfalls aus der Carotisarterie entnommen und gewogen.
Alle Wirkstoffe wurde intravenös 15 Minuten vor dem Einsetzen der Verletzung der Carotiden verabreicht. Die folgenden Behandlungen wurden untersucht und mit dem Anti-Faktor IX-mAb BC2 verglichen.

1. Träger
2. chαFIX: 3 mg/kg Bolus
3. SB 249413: 3 mg/kg Bolus
4. SB 249415: 3 mg/kg Bolus
5. SB 249416: 3 mg/kg Bolus
6. SB 249417: 3 mg/kg Bolus
7. SB 257731: 3 mg/kg Bolus
8. Heparin: 60 Einheiten/kg Bolus + 2 Einheiten/kg/Min. Infusion

Die aPTT wurde als Hauptkriterium für die Bewertung der Wirksamkeit gegenüber der Blutungsneigung der in der Untersuchung verwendeten antikoagulierenden/-thrombotischen Wirkstoffe verwendet. Die Ergebnisse in 8 zeigen, dass die humanisierten Faktor IX-mAbs SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 und SB 257731 bei 3,0 mg/kg, was innerhalb des klinisch akzeptierten Bereichs liegt eine mäßige Wirkung auf die aPTT hatten.
Die Wirkung der Faktor IX-mAbs auf die Thrombusmasse wird in 9 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass alle humanisierten mAbs bei der Herabsetzung der Thrombusmasse gleich wirksam sind.
Die in dem Carotis-Thrombosemodell in Ratten durchgeführten Untersuchungen zeigen die Wirksamkeit der humanisierten Faktor IX-mAbs in der Vorbeugung der Thrombose in einem hochgradig thrombogenen Modell der Verletzung von Arterien. Am bemerkenswertesten ist, dass die Wirksamkeit aller humanisierter Faktor IX-mAbs innerhalb des durch die aPTT definierten gewünschten therapeutischen Zielbereichs der Gerinnungshemmung gezeigt wurde.
Beispiel 9
Biochemische und biophysikalische Eigenschaften der Antikörper
Das Molekulargewicht von SB 249417 wurde durch MALD-MS auf 148000 Da bestimmt. Eine analytische Ultrazentrifugation von SB 249417 ergab einen identischen Wert. In der Anwesenheit von Faktor IX plus Ca²⁺, sedimentierten die von BC2 abgeleiteten Antikörper mit einer Masse von 248000 Da, was der kombinierten Masse des mAb und zweier Moleküle von Faktor IX entspricht. In der Anwesenheit oder Abwesenheit von Faktor IX wurden keine Belege für Aggregate höherer Ordnung beobachtet.
Die Kinetiken der Bindung von Faktor IX an SB 249417 wurden durch eine BIAcore-Analyse mit dem an eine immobilisierte Protein A-Oberfläche gebundenen Antikörper bestimmt. Rekombinanter menschlicher Faktor IX (rhFIX, Genetics Institute) mit 49 nM wurde verwendet und Messungen wurden in der Anwesenheit von 5 mM Ca²⁺ durchgeführt. Die Interaktion war durch eine schnelle Assoziation, kass = 2,0 × 10^–5 M^–1 s^–1, und relativ langsame Dissoziationsraten, kdiss = 4,1 × 10^–4 s^–1, charakterisiert. Der berechnete K_d-Wert für die Bindung von Faktor IX war 1,9 nM.
Die Tabelle 1 fasst die biophysikalischen Eigenschaften von SB 249417 zusammen.
Tabelle 1 Zusammenfassung der biophysikalischen Eigenschaften von SB249417
Die Tabelle 2 fasst die Bindungseigenschaften der erfindungsgemäßen mAbs für Faktor IX zusammen. Die berechneten Dissoziationskonstanten waren innerhalb des experimentellen Fehlerbereichs im Wesentlichen gleich.
Tabelle 2 Kinetiken der Bindung von Faktor IX an Anti-Faktor IX-mAbs
Die Wechselwirkungen zwischen rhFIX und SB 249417, BC2 und anderen humanisierten Konstrukten wurden durch eine Titrationsmikrocalorimetrie, welche Bindungswechselwirkungen in Lösung über die intrinsische Wärme der Bindung misst, charakterisiert. Neun Injektionen von 106 μM FIX in das Calorimeter, welches 2 μM mAb SB 249417 enthielt, wurden durchgeführt. Die Bindung wurde bei den ersten 4 Injektionen als exotherme Wärme nachgewiesen. Bei den letzten 5 Injektionen waren die Bindungsstellen mit FIX gesättigt und nur Hintergrundwärme durch das Mischen wurde beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass wie erwartet der Äquivalenzpunkt bei einem molaren Bindungsverhältnis nahe 2 von FIX pro mAb eintrat. Eine Analyse der Daten mit einem nichtlinearen Kleinstquadratverfahren ergibt die Bindungsaffinität.
Die Affinitäten der mAbs für rhFIX wurden über einen Bereich der Temperatur von 34-44 °C in 10 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, pH 7,4 gemessen. Diese Daten erlauben eine direkte Bestimmung der Affinität bei 37 °C und eine Berechnung der Affinität bei 25 °C aus der van't Hoff-Gleichung. Die Daten in Tabelle 3 zeigen, dass die Affinitäten von SB 249417, BC2 und seinen anderen humanisierten Konstrukten im Fehlerbereich (ein Faktor von 2) gleich sind.
Tabelle 3 Ergebnisse der Titrationscalorimetrie für Anti-FIX-mAbs
Die mAbs SB 249413, SB 249415, SB 249417 und SB 257732 zeigen in der Differential Scanning-Calorimetrie alle sehr ähnliche thermische Stabilitäten. Ihre Tms für die Entfaltung lagen im Bereich von 70-75 °C, was eine große Stabilität gegenüber thermisch ausgelöster Denaturierung anzeigt.
Beispiel 10
Mechanismus der Antikörper-vermittelten Hemmung von Faktor IX
Eine Genbank von chimären Konstrukten, welche aus Sequenzen des Faktor IX, die in das Gerüst des homologen Proteins Faktor VII eingeführt wurden, zusammengesetzt war, wurde erzeugt und verwendet, um das Epitop des Faktor IX-mAb BC2 zu kartieren. Siehe Cheung et al., Thromb. Res. 80 (1995), 419-427. Die Bindung wurde unter Verwendung eines BiaCore 2000-Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Geräts gemessen. Der BC2-Antikörper wurde unter Verwendung der NHS/EDC-Reaktion direkt auf den Chip gekoppelt. Die Bindung wurde durch 2 Minuten Kontaktzeit bei 20 μl/Min mit 200 nM jedes gegebenen Konstrukts in 25 mM MOPS, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl₂ gemessen. Die Dissoziation wurde über 3 Minuten unter Verwendung des gleichen Puffers ohne Protein überwacht. In der Anwesenheit von 50 mM EDTA wurde keine Bindung an das Wildtyp-Konstrukt nachgewiesen. Die Daten werden in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4 Zusammenfassung der Bindung der Faktor IX-Konstrukte an den BC2-Antikörper
Diese Daten zeigen, dass die die leichte Kette des Faktor IX und die schwere Kette des Faktor VII enthaltenden Konstrukte (IX LC/VII HC); die gla- und die aromatischen Stack-Domänen des Faktor IX (IX-A/VII); die Reste 3-11 der gla-Domäne von Faktor IX in der gla-Domäne von Faktor VII (VII gla (IX 3-11)/IX); und der Faktor IX, welcher einen Austausch von Lysin nach Alanin am Rest 5 besitzt (IX K5A) eine Bindung an BC2 zeigen. Das VII gla (IX 3-11)/IX-Konstrukt zeigte eine dem Wildtyp-Faktor IX (Plasma IXa und r-IX) gleichwertige Bindung. Somit bindet der BC2-Antikörper ein Epitop, welches in den Resten 3-11 der gla-Domäne von Faktor IX enthalten ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines monoclonalen Antikörpers gegen Faktor IX ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SB249413, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 31 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 44 hat; SB249415, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 57 hat; SB249416, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 62 hat; SB249417, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 74 hat; SB257731, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 78 hat; SB257732, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 89 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 99 hat, wobei der Antikörper eine selbstbegrenzende neutralisierende Aktivität gegen Faktor IX besitzt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombose- und Embolie-assoziierten Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die assoziierte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: myokardialer Infarkt, instabile Angina, Vorhofflimmern, Apoplex, Nierenschäden, Lungenembolie, tiefe Venenthrombose, perkutane transluminale coronare Angioplastie, disseminierte intravasale Koagulation, Sepsis, künstliche Organe, Shunts oder Prothesen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper chimär oder humanisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein Fragment ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F_v, Fab, Fab', F(ab')₂.
Verwendung einer Nucleinsäure, die einen monoclonalen Antikörper codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SB249413, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 31 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 44 hat; SB249415, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 57 hat; SB249416, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 62 hat; SB249417, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 74 hat; SB257731, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 52 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 78 hat; SB257732, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 89 und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie dargestellt in SEQ ID NO: 99 hat, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombose- oder Embolie-assoziierten Erkrankungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.