DE60035356T2 - Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper - Google Patents

Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper Download PDF

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Description

  • Blutgerinnsel (Thromben) werden durch eine Reihe von Zymogenaktivierungen gebildet, welche als Koagulationskaskade bezeichnet werden. Im Verlauf dieser enzymatischen Kaskade katalysiert die aktivierte Form von jedem solcher Zymogene (als Faktoren bezeichnet) die Aktivierung des nächsten. Thromben stellen Ablagerungen von Blutbestandteilen auf der Oberfläche einer Blutgefäßwand dar und bestehen hauptsächlich aus aggregierten Blutplättchen und unlöslichem vernetzten Fibrin. Eine Fibrinbildung wird mit Hilfe von Thrombin durch eine begrenzte Proteolyse von Fibrinogen bewirkt. Thrombin stellt das Endprodukt der Koagulationskaskade dar, (K.G. Mann, Blond, 1990, Band 76, S. 1-16).
  • Eine Aktivierung von Faktor X durch den Komplex aus aktiviertem Faktor IX (FIXa) und aktiviertem Faktor VIII (FVIIIa) stellt einen Schlüsselschritt in der Koagulation dar. Die Abwesenheit der Bestandteile dieses Komplexes oder eine Störung ihrer Funktion ist mit der Hämophilie genannten Blutgerinnungsstörung verbunden (J.E. Sadler & E.W. Davie: Hemophilia A, Hemophilia B and von Willebrand's disease, in G. Stamatoyannopoulos et al. (Hrsg.): The molecular basis of blond diseases. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1987, S. 576-602). Hämophilie A bezeichnet eine (funktionelle) Abwesenheit der Faktor VIII-Aktivität, während Hämophilie B durch die Abwesenheit der Faktor IX-Aktivität charakterisiert wird. Zur Zeit wird eine Behandlung von Hämophilie A über eine Substitutionstherapie durch Verabreichen von Faktor VIII-Konzentraten bewirkt. Ungefähr 20-30% der Hämophilie A Patienten entwickeln jedoch Faktor VIII-Inhibitoren (d.h. Antikörper gegen Faktor VIII), wodurch die Wirkung von verabreichten Faktor VIII-Präparationen bzw. Zusammensetzungen inhibiert wird. Eine Behandlung von Faktor VIII-Inhibitor-Patienten erweist sich als sehr schwierig und beinhaltet Risiken, und es gibt bisher nur eine begrenzte Anzahl von Behandlungen für diese Patienten.
  • Im Fall von Patienten, welche einen niedrigen FVIII-Inhibitorspiegel aufweisen, ist es möglich, aber teuer, hohe Dosen von Faktor VIII an solche Patienten zu verabreichen und so die Antikörper gegen Faktor VIII zu neutralisieren. Die Menge an Faktor VIII über jener, welche zum Neutralisieren der Inhibitorantikörper benötigt wird, weist dann eine hämostatische Wirkung auf. In vielen Fällen kann eine Desensibilisierung bewirkt werden, wonach es anschließend wieder möglich ist, Standard Faktor VIII-Behandlungen anzuwenden. Solche Hochdosis Faktor VIII-Behandlungen benötigen jedoch große Mengen an Faktor VIII, sind zeitaufwändig und können schwere anaphylaktische Nebenreaktionen beinhalten. Alternativ kann die Behandlung mit Faktor VIII-Molekülen vom Schwein durchgeführt werden.
  • Ein weiteres kostenintensives Verfahren beinhaltet ein Entfernen der Faktor VIII-Inhibitoren durch eine extrakorporale Immunadsorption an Lectine, welche an Immunglobuline (Protein A, Protein G) binden oder an immobilisierten Faktor VIII. Da der Patient während dieser Behandlung mit einem Apherese-Apparat verbunden sein muss, stellt die Behandlung auch eine große Belastung für den Patienten dar. Es ist auch nicht möglich, eine akute Blutung auf diese Weise zu behandeln.
  • Zur Zeit ist die Therapie der Wahl, aktivierte Prothrombinkomplex Konzentrate (APCC für engl.: activated prothrombin complex concentrates), wie FEIBA® und AUTOPLEX®, zu verabreichen, welche für die Behandlung von akuten Blutungen sogar für Patienten, welche einen hohen Inhibitortiter aufweisen, geeignet sind ( DE 31 27 318 ).
  • Im intravaskulären System der Blutgerinnung stellt die Aktivierung von Faktor X den letzten Schritt dar. Diese Reaktion wird durch das Binden von Faktor Villa an Faktor IXa und das Bilden eines "Tenase"-Komplexes, bestehend aus den Faktoren IXa, Villa, X und Phospholipid, stimuliert. Ohne das Binden von FVIIIa, weist FIXa keine oder nur eine sehr geringe enzymatische Aktivität in Bezug auf FX auf.
  • In den vergangenen Jahren wurde eine Anzahl von möglichen Bindungsstellen für Faktor Villa an Faktor IXa charakterisiert, und es wurde gezeigt, dass Antikörper oder Peptide, welche an diese Regionen binden, die Aktivität von FIXa inhibieren (Fay et al., J. Biol. Chem., 1994, Band 269, S. 20522-20527, Lenting et al., J. Biol. Chem., 1996, Band 271, S. 1935-1940, Jorquera et al., Circulation, 1992, Band 86, Abstract 2725). Die Inhibition von Gerinnungsfaktoren, wie Faktor IX, wurde auch durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern erreicht, mit dem Zweck, eine Thrombosebildung zu verhindern ( WO 97/26010 ).
  • Die gegenteilige Wirkung, d.h. ein Anstieg in der Faktor IXa vermittelten Aktivierung von Faktor X durch das Binden eines Faktor VIII-Peptids (Aminosäuren 698-712) an Faktor IX, wurde von Liles D.K. et al., (Blond, 1997, Band 90, Suppl. 1, 2054) beschrieben. Diese Wirkung tritt jedoch nur in der Abwesenheit von Faktor Villa auf, während in der Anwesenheit von Faktor Villa die Faktor IXa/Faktor Villa vermittelte Spaltung von Faktor X durch dieses Peptid inhibiert wird.
  • Weiterhin beschreibt die WO 86/06101 eine Reihe von Proteinen, welche prokoagulierende Eigenschaften aufweisen.
  • Mit einem Blick auf die möglichen Risiken und Nebenwirkungen, welche bei der Behandlung von Hämophilie-Patienten auftreten können, gibt es einen Bedarf für eine Therapie, welche die wirksame Behandlung von FVIII-Inhibitor-Patienten erlaubt. Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Präparation für die Behandlung von Blutgerinnungsstörungen bereitzustellen, welche besondere Vorteile für Faktor VIII-Inhibitor-Patienten aufweist. Erfindungsgemäß wird dieses Ziel durch die Verwendung von Antikörpern gegen Faktor IX/Faktor IXa erreicht, welche eine Faktor VIIIa-Kofaktor-Aktivität aufweisen und zu einem Anstieg der prokoagulierenden Aktivität von FIXa führen. Überraschenderweise wird die Wirkung dieser erfindungsgemäßen Faktor IX/Faktor IXa aktivierenden Antikörper nicht negativ durch die Anwesenheit von Inhibitoren, wie Inhibitoren gegen Faktor VIII/Faktor Villa, beeinflusst, sondern die prokoagulierende Aktivität von Faktor IXa steigt stattdessen in diesem Fall auch an.
  • Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung liegt darin, dass die Verabreichung der erfindungsgemäßen Präparation eine schnelle Blutgerinnung erlaubt, selbst in der Abwesenheit von Faktor VIII oder Faktor Villa, selbst im Fall von FVIII-Inhibitor-Patienten. Überraschenderweise sind diese Mittel auch in der Anwesenheit von Faktor Villa wirksam.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper weisen daher eine FVIII-Kofaktor ähnliche Aktivität auf, welche in einem FVIII-Assay (z.B. ein COATEST® Assay oder ein Immunochrom Test) nach 2 Stunden Inkubation ein Verhältnis von Hintergrund (Basisrauschen) zum gemessenen Wert von mindestens 3 aufweist. Eine Berechnung dieses Verhältnisses kann z.B. gemäß dem folgenden Schema erreicht werden:
    Figure 00040001
    nach zwei Stunden Inkubation.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper weisen eine in vivo Halbwertszeit von mindestens 5 Tagen, weiter bevorzugt mindestens 10 Tagen auf, obwohl es weiter bevorzugt ist, dass sie eine Halbwertszeit von mindestens 20 Tagen aufweisen.
  • Einen weiteren Aspekt dieser Erfindung stellt eine Präparation dar, welche Antikörper gegen Faktor IX/Faktor IXa und eine pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanz umfasst. Weiterhin kann die erfindungsgemäße Präparation zusätzlich Faktor IX und/oder Faktor IXa umfassen.
  • Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung der Antikörper dar, um die amidolytische Aktivität von Faktor IXa zu steigern.
  • 1 zeigt die Ergebnisse eines Screenings von Überständen von Hybridomazellkulturen auf FVIII ähnliche Aktivität. Präselektierte Klone aus Fusionsexperimenten, #193, #195 und #196, wurden in einem chromogenen Assay getestet.
  • 2 zeigt die Ergebnisse eines Screenings auf IgG vermittelte Faktor VIII ähnliche Aktivität in Überständen einer Hybridomazellkultur einer Masterplatte.
  • 3 zeigt die Subklonierung von Klon 194/C0, nämlich die Ergebnisse der ersten Klonierungsrunde.
  • 4 zeigt einen Vergleich der chromogenen FVIII ähnlichen Aktivität und der Faktor IX ELISA-Reaktivität von Hybridomakulturen, welche vom Ausgangsklon 193/C0 abgeleitet wurden.
  • 5 zeigt die Ergebnisse der Messung der chromogenen Aktivität einiger Masterklone und Subklone.
  • 6A zeigt die FVIII ähnliche Aktivität der Anti-FIX/FIXa-Antikörper 193/AD3 und 196/AF2, verglichen mit menschlichem FVIII, TBS-Puffer und Zellkulturmedium. Nach einer Latenzphase bzw. lag-Phase führten beide Antikörper zu einer chromogenen Substratspaltung, wie durch die ansteigende optische Dichte belegt ist.
  • 6B zeigt einen Vergleich der chromogenen Aktivität von Faktor VIII, 196/AF1, 198/AC1/1 und Maus-IgG.
  • 7A zeigt einen Vergleich der Kinetik der Faktor Xa-Erzeugung durch Faktor VIII und 196/AF2 mit und ohne Hinzufügen eines Faktor Xa spezifischen Inhibitors.
  • 7B zeigt einen Vergleich der Kinetik der Faktor Xa-Erzeugung durch Faktor VIII, Maus-IgG und Anti-Faktor IX/IXa-Antikörper 198/AM1 mit und ohne Hinzufügen eines Faktor Xa spezifischen Inhibitors, Pefabloc Xa®.
  • 8A zeigt eine Messung der Abhängigkeit der Faktor VIII ähnlichen Aktivität von gereinigtem Anti-Faktor IX/IXa-Antikörper 198/AC1/1 in der Anwesenheit und Abwesenheit von Phosphoplipiden, FIXa/FX und Calciumionen.
  • 8B zeigt eine Messung der Abhängigkeit der FXa-Erzeugung durch Anti-FIXa-Antikörper 196/AF1 in der Anwesenheit von Phospholipiden, Ca2+ und FIXa/FX.
  • 8c zeigt die Erzeugung von FXa durch unspezifischen Maus-IgG-Antikörper.
  • 9 zeigt eine graphische Darstellung der Gerinnungszeiten von Faktor VIII-Mangelplasma in einem APTT-Asssay unter Verwendung verschiedener Konzentrationen des Anti-Faktor IX/IXa-Antikörpers 193/AD3.
  • 10A zeigt, dass Antikörper 193/AD3 in der Anwesenheit von Faktor IXa zu einer Reduktion der Gerinnungszeit von Faktor VIII-Mangelplasma führt.
  • 10B zeigt eine dosisabhängige Reduktion der Gerinnungszeit durch Antikörper 193/AD3 in der Anwesenheit von Faktor IXa- und Faktor VIII-Inhibitoren.
  • 11 zeigt die chromogene Aktivität der Antikörper 198/A1, 198/B1 und 198/AP1 in der Anwesenheit und Abwesenheit von menschlichem FIXaβ.
  • 12 zeigt die Primersequenzen für die Amplifikation der Gene der variablen schweren Kette des Maus-Antikörpers.
  • 13 zeigt die Primersequenzen für die Amplifikation der Gene der variablen leichten (kappa) Kette des Maus-Antikörpers.
  • 14 zeigt die DNA- und davon abgeleitete Proteinsequenz des scFv von der Hybridomazelllinie 193/AD3 (SEQ. ID. NR. 81 und 82).
  • 15 zeigt die DNA- und davon abgeleitete Proteinsequenz des scFv von der Hybridomazelllinie 193/K2 (SEQ. ID. NR. 83 und 84).
  • 16 zeigt die DNA- und davon abgeleitete Proteinsequenz des scFv von der Hybridomazelllinie 198/AB2 (Subklon von 198/B1) (SEQ. ID. NR. 85 und 86).
  • 17 zeigt die DNA- und davon abgeleitete Proteinsequenz des scFv, welcher von der Zelllinie 198/A1 abgeleitet wurde (SEQ. ID. NR. 87 und 88).
  • 18 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität von Peptid A1/3 in der Anwesenheit von 2,9 nM menschlichem FIXa. Die vermischte Version von Peptid A1/3, Peptid A1/5 führte zu keiner FXa-Erzeugung.
  • 19 zeigt die Abhängigkeit der chromogenen FVIII ähnlichen Aktivität von Peptid A1/3 von der Anwesenheit von menschlichem FIXa. In der Abwesenheit von menschlichem FIXa führt Peptid A1/3 zu keiner FXa-Erzeugung. Die Pufferkontrolle, reiner Imidazol-Puffer wird als IZ bezeichnet.
  • 20 zeigt, dass die Chiralität der Arg-Reste keine wesentliche Rolle für die chromogene Aktivität der Peptide A1/3-rd und A1/3-Rd-srmb spielt.
  • 21 zeigt, dass das Hinzufügen von 2,4 μM Peptid B1/7 zu dem Reaktionsgemisch zu einer messbaren Erzeugung von FXa führte.
  • 22 zeigt, dass das Hinzufügen eines FX spezifischen Inhibitors zu einer wesentlichen Reduktion der Reaktion führt. Wenn kein FIXa vorlag und FX zum Reaktionsgemisch hinzugefügt wurde, wurde kein FXa synthetisiert.
  • 23 zeigt den Vektor pBax-IgG1.
  • 24 zeigt den Anstieg der amidolytischen Aktivität von FIXa in der Anwesenheit von Antikörper 198/B1 (24A) und IgM-Antikörper 198/AF1 (24B).
  • 25 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität des Antikörper 198/A1 Fab-Fragments in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle wurden der intakte Antikörper 198/A1, sowie 7,5 pM FVIII verwendet. Die Pufferkontrolle (IZ) wurde als eine Negativkontrolle verwendet.
  • 26 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des 198/AB2 scFv-alkalische Phosphatase Fusionsproteins (OLR des Expressionsvektors pDAP2-198AB2#100, SEQ. ID. NR. 89 und 90).
  • Die Gene für die VL- und die VH-Domänen von Antikörper 198/AB2 (198/AB2 ist ein identischer Subklon von 198/B1) wurden wie in Beispiel 10 beschrieben von den entsprechenden Hybridomazellen abgeleitet. Das PCR-Produkt des VH-Gens wurde mit SfiI-AscI gespalten, und das PCR-Produkt des VL-Gens wurde mit AscI und NotI gespalten. Die VH- und VL-Gene wurden über die AscI-Stelle verbunden und in den mit SfiI-NotI gespaltenen Vektor pDAP2 eingefügt (Kerschbaumer R.J. et al., Immunotechnology 2, 145-150, 1996; GenBank Zugangsnr.: U35316). PelB Leader: Leader-Sequenz von Erwinia carotovora Pectat-Lyase B, His-tag: Histidin-Tag für eine Metallionenchromatographie.
  • 27 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität von zwei Antikörper 198/B1 (Subklon AB2) scFv Fragment-alkalische Phosphtase Fusionsproteinen (198AB2#1 und 198AB2#100) in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle wurde 7,5 pM FVIII verwendet.
  • 28 zeigt die Aminosäure- und Nukleotidsequenz von pZip198AB2#102 (SEQ. ID. Nr. 91 und 92).
  • 29 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des mAB#8860 scFv-alkalische Phosphtase Fusionsproteins (Vektor pDAP2-8860scFv#11, SEQ. ID. NR. 93 und 94). Die Gene für die VL- und die VH-Domänen des Antikörpers #8860 wurden wie in Beispiel 10 beschrieben von den entsprechenden Hybrid omazellen abgeleitet. Das PCR-Produkt des VH-Gens wurde mit SfiI-AscI gespalten, und das PCR-Produkt des VL-Gens wurde mit AscI und NotI gespalten. Die VH- und VL-Gene wurden über die AscI-Stellen verbunden und in den mit SfiI-NotI gespaltenen Vektor pDAP2 eingefügt (Kerschbaumer R.J. et al., Immunotechnology 2, 145-150, 1996; GenBank Zugangsnr.: U35316).
  • 30 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des mAB #8860 scFv-Leucin Zipper Fusionsproteins (Miniantikörper, Vektor p8860-Zip#1.2), (SEQ. ID. Nr. 95 und 96). Das Gen des scFv-Fragments wurde von mAB #8860 abgeleitet und wurde aus dem Vektor pDAP2-8860scFv#11 in ein mit SfiI-NotI gespaltenes Plasmid pZip1 umgelagert (Kerschbaumer R.J. et al., Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997; GenBank, Zugangsnr.: U94951).
  • 31 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität des 198/B1 (Subklon AB2) Miniantikörpers 198AB-Zip#102 in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle wurden 4,8 pM FVIII verwendet, während ein nicht verwandter Miniantikörper (8860-Zip#1.2) und reiner Reaktionspuffer (IZ) als Negativkontrollen dienten.
  • 32 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids pMycHis6.
  • 33 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des Teils des Plasmids pMycHis6, welches sich von Vektor pCOCK unterscheidet (SEQ. ID. NR. 97 und 98). Der Vektor pMycHis6 wurde durch Spalten von Vektor pCOCK (Engelhardt et al., 1994, Biotechniques, 17: 44-46) mit NotI und EcoRI und durch Einfügen der Oligonukleotide: mychis6-co: 5' ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3' (SEQ. ID. NR. 79) und mycchis-ic: 5' aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgagatgagtttttgttctgc (SEQ. ID. NR. 80) konstruiert.
  • 34 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von 198AB2 scFv (verbunden mit dem c-myc-Tag und dem His6-Tag): OLR des Expressionsvektors pMy cHis6-198AB2#102. Der Vektor pMycHis6 wurde durch Spalten des Vektors pCOCK (Engelhardt O. et al., BioTechniques 17, 44-46, 1994) mit NotI-EcoRI und durch Einfügen der folgenden angelagerten Oligonukleotide: (5'-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG-3' (SEQ. ID. NR. 103) und 5'-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC-3' (SEQ. ID. Nr. 104)) konstruiert. Der sich ergebende Vektor, pMycHis6 genannt, wurde mit SfiI-NotI gespalten, und das Gen von scFv 198AB2 wurde aus dem Vektor pDAP2-198AB2#100 in diesen Vektor umgelagert.
  • 35 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des mAB #8860 scFv, welcher mit dem c-myc-Tag und dem His6-Tag verbunden ist (Vektor p8860-M/H#4c, SEQ. ID. NR. 101 und 102). Das Plasmid pMycHis6 wurde mit SfiI und NotI gespalten, und die für das scFv 8860#11 Protein kodierende DNA-Sequenz wurde aus pDAP2-8860scFv#11 (siehe 29) eingefügt, was das Plasmid p8860-M/H#4c ergab.
  • 36 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität des 198/B1 (Subklon AB2) scFv-Fragments (MycHis-198AB2#102) in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle wurden 4,8 pM FVIII verwendet, während ein nicht verwandter scFv (8860-M/H#4c) und reiner Reaktionspuffer (IZ) als Negativkontrollen dienten.
  • Antikörper
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Nukleinsäuren, welche die erfindungsgemäßen Antikörper kodieren, Expressionsvektoren, Hybridomazelllinien und Verfahren zum Herstellen derselben.
  • Antikörper sind Immunglobulinmoleküle, welche eine spezifische Aminosäuresequenz aufweisen, die nur an Antigene bindet, welche ihre Synthese induzieren (oder entsprechend ihr Immunogen), oder an Antigene (oder Immunogene), wel che den ersteren sehr ähnlich sind. Jedes Immunglobulinmolekül besteht aus zwei Typen von Polypeptidketten. Jedes Molekül besteht aus großen, identischen schweren Ketten (H-Ketten, für engl.: heavy chains) und aus zwei leichten, auch identischen Ketten (L-Ketten, für engl.: light chains). Die Polypeptide sind durch Disulfidbrücken und nicht kovalente Bindungen verbunden. In vivo werden die schweren und leichten Ketten an verschiedenen Ribosomen gebildet, in der Zelle zusammengesetzt und als intakte Immunglobuline sezerniert (Roitt I. et al., in: Immunology, zweite Aufl., 1989).
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper und organischen Verbindungen, welche von diesen abgeleitet werden, umfassen menschliche und tierische monoklonale Antikörper oder Fragmente davon, Einzelkettenantikörper und Fragmente davon und Miniantikörper, bispezifische Antikörper, Diabodies, Triabodies oder Di-, Oligo- oder Multimere davon. Peptidmimetika oder Peptide, welche von den erfindungsgemäßen Antikörpern abgeleitet werden, sind auch eingeschlossen, z.B. umfassen sie eine oder mehrere CDR-Regionen, vorzugsweise die CDR3-Region.
  • Weiterhin sind menschliche monoklonale Antikörper und Peptidsequenzen eingeschlossen, welche, basierend auf einer Struktur-Aktivitäts-Beziehung, durch ein künstliches Modellierungsverfahren hergestellt werden (Greer J. et al., J. Med. Chem., 1994, Band 37, S. 1035-1054).
  • Der Begriff "Faktor IX/IXa aktivierende Antikörper" kann auch Proteine einschließen, welche durch Expression einer veränderten Immunglobulin kodierenden Region in einer Wirtszelle hergestellt werden, z.B. "technisch veränderte Antikörper", wie synthetische Antikörper, chimäre oder humanisierte Antikörper oder Gemische davon oder Antikörperfragmente, welchen teilweise oder vollständig die konstante Region fehlt, z.B. Fv, Fab, Fab' oder F(ab)'2 usw. In diesen technisch modifizierten Antikörpern kann z.B. ein Teil oder können Teile der leichten und/oder schweren Kette substituiert sein. Solche Moleküle können z.B. Antikörper umfassen, welche aus einer humanisierten schweren Kette und einer unmodifizierten leichten Kette (oder chimären leichten Kette) oder umgekehrt, bestehen. Die Begriffe "Fv, Fc, Fd, Fab, Fab oder F(ab)2" werden wie im Stand der Technik beschrieben, verwendet (Harlow E. und Lane D., in "Antibodies, A Laborstory Manual", Cold Spring Harbor Laborstory, 1988).
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Fab-Fragmenten oder F(ab)2-Fragmenten, welche von monoklonalen Antikörpern (mAb, für engl.: monoclonal antibody) abgeleitet wurden, welche gegen Faktor IX/Faktor IXa gerichtet sind und einen Anstieg der prokoagulierenden Aktivität von Faktor IXa verursachen.
  • Vorzugsweise werden die heterologen Gerüstregionen und die konstanten Regionen aus den menschlichen Immunglobulinklassen und Isotypen, wie IgG (Subtypen 1 bis 4), IgM, IgA und IgE ausgewählt. Im Verlauf der Immunantwort kann ein Klassenwechsel bzw. -switch der Immunglobuline auftreten, z.B. ein Wechel von IgM zu IgG; dabei werden die konstanten Regionen ausgetauscht, z.B. von μ zu γ. Ein Klassenwechsel kann auch in gerichteter Weise mit Hilfe von gentechnischen Verfahren verursacht werden ("gerichtete Klassen-Switch-Rekombination"), wie sie im Stand der Technik bekannt sind (Esser C. und Radbruch A., Annu. Rev. Immunol., 1990, Band 8, S. 717-735). Die erfindungsgemäßen Antikörper brauchen jedoch nicht ausschließlich menschliche Sequenzen der Immunglobulinproteine zu umfassen.
  • In einer besonderen Ausführungsform umfasst ein humanisierter Antikörper komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs, für engl.: complement determining region) aus monoklonalen Maus-Antikörpern, welche in die Gerüstregionen von ausgewählten menschlichen Antikörpersequenzen eingefügt werden. Es können jedoch auch menschliche CDR-Regionen verwendet werden. Vorzugsweise sind die variablen Regionen in den menschlichen leichten und schweren Ketten durch einen oder mehrere CDR-Austausche technisch verändert. Es ist auch möglich, alle sechs CDRs oder verschiedene Kombinationen von weniger als sechs CDRs zu verwenden.
  • Der erfindungsgemäße humanisierte Antikörper weist vorzugsweise die Struktur eines menschlichen Antikörpers oder eines Fragments davon auf und umfasst die Kombination der Eigenschaften, welche für eine therapeutische Anwendung, z.B. die Behandlung von Blutgerinnungsstörungen bei Patienten, vorzugsweise Faktor VIII-Inibitor-Patienten, nötig sind.
  • Ein chimärer Antikörper unterscheidet sich von einem humanisierten Antikörper darin, dass er die gesamten variablen Regionen, einschließlich der Gerüstregionen der schweren und leichten Ketten des nicht menschlichen Ursprungs in Kombination mit den konstanten Regionen von beiden Ketten des menschlichen Immunglobulins umfasst. Es kann zum Beispiel ein chimärer Antikörper, bestehend aus Maus- und menschlichen Sequenzen hergestellt werden.
  • Erfindungsgemäß können die Antikörper auch als Einzelkettenantikörper oder Miniantikörper (scFv-Fragmente, welche z.B. mit Prolin reichen Sequenzen und Oligomerisationsdomänen verbunden sind, z.B. Plunckthun A. und Pack P., Immunotechnology, 1997, Band 3, S. 83-105) oder Einzelketten-Fv (sFv), welche die gesamte Antikörperbindungsregion in einer einzelnen Polypeptidkette beinhalten, vorliegen. Zum Beispiel können Einzelkettenantikörper durch Verbinden der V-Gene mit einem Oligonukleotid gebildet werden, welches als eine Linker-Sequenz konstruiert wurde und den C-Terminus der ersten V-Region mit dem N-Terminus der zweiten V-Region verbindet, z.B. in der Anordnung VH-Linker-VL oder VL-Linker-VH; beide, VH und VL können daher die N-terminale Domäne darstellen (Huston JS et al., Int. Rev. Immunol., 1993, Band 10, S. 195-217; Raag, R. und Whitlow M., FASER J., 1995, Band 9, S. 73-80). Das Protein, welches als Linker-Sequenz verwendet werden kann, kann z.B. eine Länge von bis zu 150 Å, vorzugsweise bis zu 80 Å und weiter bevorzugt bis zu 40 Å aufweisen. Linker-Sequenzen, welche Glycin und Serin enthalten, sind insbesondere für ihre Flexibilität bevorzugt, oder welche Glutamin und Lysin enthalten entsprechend für ihre Löslichkeit. Die Wahl der Aminosäure wird gemäß den Kriterien der Immunogenität und Stabilität beeinflusst, und auch davon abhängen, ob oder ob nicht diese Einzelkettenantikörper für physiologische oder industrielle Anwendungen (z.B. Immunaffinitätschromatographie) geeignet sein sollen. Die Einzelkettenantikörper können auch als Aggregate, z.B. als Trimere, Oligomere oder Multimere anwesend sein. Die Linker-Sequenz kann jedoch auch fehlen, und die Verbindung der VH- und VL-Ketten kann direkt stattfinden.
  • Bispezifische Antikörper sind makromolekulare, heterobifunktionale Vernetzer, welche zwei verschiedene Bindungsspezifitäten innerhalb eines einzelnen Moleküls aufweisen. Zu dieser Gruppe gehören z.B. bispezifische (bs), IgGs, bs IgM-IgAs, bs IgA-Dimere, bs (Fab')2, bs(scFv)2, Diabodies und bs bis Fab Fc (Cao Y. und Suresh M.R., Bionconjugate Chem., 1998, Band 9, S. 635-644).
  • Unter Peptidmimetika werden Proteinbestandteile mit niedrigem Molekulargewicht verstanden, welche die Struktur eines natürlichen Peptidbestandteils oder von Matrizen imitieren, welche eine spezifische Strukturbildung in einer benachbarten Peptidsequenz induzieren (Kemp DS, Trends Biotechnol., 1990, S. 249-255). Die Peptidmimetika können z.B. von den CDR3-Domänen abgeleitet werden. Eine systematische Mutationsanalyse einer bestimmten Peptidsequenz, d.h. durch eine Alanin oder Glutaminsäure Scanning-Mutationsanalyse, erlaubt das Identifizieren von Peptidresten, welche für eine prokoagulierende Aktivität entscheidend sind. Eine andere Möglichkeit, um die Aktivität einer bestimmten Peptidsequenz zu verbessern, stellt die Verwendung von Peptidbibliotheken, kombiniert mit einem High-Throughput-Screening dar.
  • Der Begriff "Antikörper" kann auch Mittel umfassen, welche durch eine Analyse von Daten erhalten wurden, welche sich auf Struktur-Aktivitäts-Beziehungen beziehen. Diese Verbindungen können auch als Peptidmimetika verwendet werden (Grassy G. et al., Nature Biotechnol., 1998, Band 16, S. 748-752; Greer J. et al., J. Med. Chem., 1994, Band 37, S. 1035-1054).
  • Beispiele für Hybridomazellen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper exprimieren, wurden am 09. September 1999 unter den Nummern 99090924 (#198/A1), 99090925 (#198/B1) und 99090926 (#198/BB1) und am 16. Dezember 1999 unter den Nummern 99121614 (#193/A0), 99121615 (#196/C4), 99121616 (#198/D1), 99121617 (#198/T2), 99121618 (#198/G2), 99121619 (#198/AC1) und 99121620 (#198/U2) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
  • Verfahren der Herstellung:
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, z.B. durch gängige Hybridomatechniken oder mit Hilfe von Phagen-Display Genbibliotheken, Immunglobulinketten-Shuffling oder humanisierenden Techniken (Harlow E. und Lane D., in: Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, 1988). Die Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper und Antikörperderivate kann zum Beispiel durch gängige Hybridomatechniken vorgenommen werden (Antibodies, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, 1988, Hrsg. Harlow und Lane, S. 148-242). Erfindungsgemäß können nicht menschliche Arten dafür verwendet werden, wie Rinder, Schweine, Affen, Hühner und Nagetiere (Mäuse, Ratten). Z.B können normale immunkompetente Balb/c-Mäuse oder FIX defiziente Mäuse. verwendet werden (Faktor IX defiziente Mäuse können von Dr. Darrel Stafford von der University of North Carolina, Chapel Hill, erhalten werden). Eine Immunisierung kann z.B. mit Faktor IX, Faktor IXaα oder vollständig aktiviertem Faktor IXaβ oder mit Fragmenten davon erreicht werden.
  • Die Hybridome werden mit Blick auf die Tatsache ausgewählt, dass die Antikörper in den Überständen der Hybridomazellen an Faktor IX/Faktor IXa binden und einen Anstieg der prokoagulierenden Aktivität von Faktor IXa verursachen. Der Anstieg in der prokoagulierenden Aktivität kann z.B. durch Assay-Verfahren, wie sie im Stand der Technik für die Messung von Faktor VIII ähnlicher Aktivität bekannt sind, z.B. chromogene Assays, nachgewiesen werden.
  • Alternativ können die erfindungsgemäßen Antikörper auch durch rekombinante Herstellungsverfahren hergestellt werden. Auf diese Weise kann die DNA-Sequenz der erfindungsgemäßen Antikörper mit bekannten Techniken bestimmt werden, und die gesamte Antikörper-DNA oder Teile davon können in geeigneten Systemen exprimiert werden. Rekombinante Herstellungsverfahren wie jene, welche Phagendisplay, synthetische und natürliche Bibliotheken, Expression der Antikörper-Proteine in bekannten Expressionssystemen oder Expression in transgenen Tieren beinhalten, können verwendet werden (Jones et al., Nature, 1986, Band 321, S. 552-525; Phage Display of Peptides and Proteins, A Laborstory Manual, 1996, Hrsg., Kay et al., S. 127-139; US 4,873,316 ; Vaughan T.J. et al., Nature Biotechnology, 1998, S. 535-539; Persic L. et al., Gene, 1997, S. 9-18; Ames R.S. et al., J. Immunol. Methods, 1995, S. 177-186).
  • Die Expression rekombinant hergestellter Antikörper kann mit Hilfe von gängigen Expressionsvektoren, wie bakteriellen Vektoren, wie pBr322 und seinen Derivaten, pSKF oder eukaryotischen Vektoren, wie pMSG und SV40 Vektoren erreicht werden. Jene Sequenzen, welche den Antikörper kodieren, können mit regulatorischen Sequenzen bereitgestellt werden, welche die Replikation, die Expression und die Sekretion aus der Wirtszelle regulieren. Diese regulatorischen Sequenzen umfassen Promotoren, z.B. CMV oder SV40 und Signalsequenzen.
  • Die Expressionsvektoren können auch Selektions- und Amplifikationsmarker, wie das Dihydrofolat-Reduktase-Gen (DHFR), Hygromycin-B-Phosphotransferase, Thymidin-Kinase usw., umfassen.
  • Die Bestandteile der verwendeten Vektoren, wie Selektionsmarker, Replikons, Enhancer usw., können entweder kommerziell erhalten werden oder mit Hilfe von gängigen Verfahren hergestellt werden. Die Vektoren können für die Expression in verschiedenen Zellkulturen konstruiert werden, z.B. für Säugetierzellen, wie CHO, COS, Fibroblasten, Insektenzellen, Hefe oder Bakterien, wie E. coli. Vorzugsweise werden jene Zellen verwendet, welche eine optimale Glykosylierung des exprimierten Proteins erlauben. Insbesondere bevorzugt ist der Vektor pBax (cf. 17), welcher in CHO-Zellen oder in SK-Hep exprimiert wird.
  • Die Herstellung von Fab-Fragmenten oder F(ab)2-Fragmenten kann gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren, z.B. durch Spalten eines mAb mit proteolytischen Enzymen, wie Papain und/oder Pepsin, oder durch rekombinante Verfahren erreicht werden. Diese Fab- und F(ab)2-Fragmente können auch mit Hilfe von einer Phagen-Display Genbibliothek hergestellt werden (Winter et al., 1994, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455).
  • Die Aufreinigung der erfindungsgemäßen Antikörper kann auch durch Verfahren, welche im Stand der Technik beschrieben sind, z.B. durch Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätsaufreinigung (Protein G-Sepharose), Ionenaustauschchromatographie oder Gelchromatographie, durchgeführt werden. Die folgenden Verfahren können als die Testverfahren verwendet werden, um zu zeigen, dass die erfindungsgemäßen Antikörper an Faktor IX/Faktor IXa binden, die prokoagulierende Aktivität von Faktor IXa verstärken oder eine Faktor VIII ähnliche Aktivität aufweisen: der Einschritt-Koagulationstest (Mikaelsson und Oswaldson, Scand. J. Haematol., Suppl., 33, S. 79-86, 1984) oder die chromogenen Tests, wie COATEST VIII:C® (Chromogenix) oder Immunochrom (IMMUNO). Grundsätzlich können alle die Verfahren verwendet werden, welche für die Bestimmung einer Faktor VIII Aktivität verwendet werden. Als Kontroll-Blindwert für die Messungen kann z.B. ein unspezifischer Maus-IgG-Antikörper verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper sind für eine therapeutische Verwendung bei der Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, z.B. im Fall von Hämophilie A, für Faktor VIII-Inhibitor-Patienten usw. geeignet. Eine Verabreichung kann durch irgendein Verfahren erreicht werden, welches geeignet ist, um das therapeutische Mittel dem Patienten wirksam zu verabreichen, z.B. durch orale, subkutane, intramuskuläre, intravenöse oder intranasale Verabreichung.
  • Erfindungsgemäße therapeutische Mittel können als Präparationen hergestellt werden, welche eine ausreichende Menge der Antikörper als aktives Mittel in einer pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanz umfassen. Diese Mittel können entweder in flüssiger oder in pulverisierter Form vorliegen. Außerdem können die erfindungsgemäßen Präparationen auch Gemische aus verschiedenen Antikörpern, den Derivaten davon und/oder von diesen abgeleiteten organischen Verbindungen, sowie Gemische, bestehend aus Antikörpern und Faktor IX und/oder Faktor IXa, umfassen. Faktor IXa kann als Faktor IXaα und/oder Faktor IXaβ vorliegen. Ein Beispiel für eine wässrige Trägersubstanz stellt z.B. Salzlösung dar. Die Lösungen sind steril, wobei die Sterilisation mit gängigen Verfahren erreicht wird.
  • Die erfindungsgemäßen Antikörper können in lyophilisierter Form für eine Lagerung vorliegen und vor einer Verabreichung in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert werden. Dieses Verfahren hat sich als allgemein vorteilhaft für gängige Immunglobuline erwiesen, und bekannte Lyophilisations- und Rekonstitutionsverfahren können in diesem Fall angewendet werden.
  • Außerdem können die erfindungsgemäßen Antikörper auch für industrielle Anwendungen, z.B. für die Aufreinigung von Faktor IX/Faktor IXa mit Hilfe einer Affinitätschromatographie oder als Bestandteil von Nachweisverfahren (z.B. ELISA-Assays) oder als ein Mittel für die Identifikation einer Interaktion mit funktionellen Domänen eines Zielproteins verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird detaillierter durch die folgenden Beispiele und gezeichneten Figuren beschrieben werden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Immunisierung von immunkompetenten Mäusen und Erzeugung von Anti-FIX/IXa-Antikörper sezernierenden Hybridomazellen
  • Gruppen von 1-3 normalen immunkompetenten 5-8 Wochen alten Balb/c-Mäusen wurden mit 100 μg Antigen (100 μl Dosen) über den intraperitonealen (i.p.) Weg immunisiert. In einem typischen Experiment wurden Mäuse entweder mit rekombinantem menschlichen Koagulationsfaktor (F) IX (BenefixTM), menschlichem aktivierten FIXaα (Enzyme Research Laborstories, Charge: FIXaα 1190L) oder mit menschlichem FIXaβ (Enzyme Research Laborstories, Charge: HFIXAaβ 1332 AL), adjuviert mit Al(OH)3 oder KFA inokuliert.
  • Einzelne Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten mit 100 μg Antigen (100 μl Dosen, i.p.) aufgefrischt und zwei Tage später getötet. Die Milzzellen wurden entfernt und mit P3 X63-Ag8 6.5.3 Myelomazellen fusioniert, im Wesentlichen wie von Lane et al., 1985 (J. Immunol. Methods, Band 81, S. 223-228) beschrieben. Jedes Fusionsexperiment wurde einzeln nummeriert, d.h. #193, 195, 196 oder 198.
  • Hybridomazellen wurden in 96-Vertiefungsplatten auf einem Makrophagen-Feeder-Lager (ungefähr 105 Zellen/ml) gezogen und in HAT-Medium selektiert (RPMI-1640 Medium, ergänzt mit Antibiotika, 10% FCS, Na-Pyruvat, L-Glutamin, 2-Mercaptoethanol und HAT (HAT 100×: 1,0 × 10–2 M Hypoxanthin in H2O (136,1 mg/100 ml H2O), 4,0 × 10–5 M Aminopterin in H2O (1,76 mg/100 ml H2O) und 1,6 × 10–3 M Thymidin in H2O (38,7 mg/100 ml H2O))). Das Medium wurde zuerst nach 6 Tagen gewechselt und danach zweimal die Woche. Nach 2-3 Wochen wurde das HAT-Medium durch HT-Medium (RPMI-1640, ergänzt mit Antibiotika, 10% FCS, Na-Pyruvat, L-Glutamin, 2-Mercaptoethanol und HT) ersetzt und später (nach zusätzlichen 1-2 Wochen) durch normales Wachstumsmedium (RPMI-1640 Medium, ergänzt mit 10% FCS, Na-Pyruvat, L-Glutamin und 2-Mercaptoethanol) (siehe: HYBRIDOMA TECHNIQUES, EMBO, SKMB Course 1980, Basel).
  • In einem anderen Satz von Experimenten wurden FIX defiziente C57B16 Mäuse (Lin et al., 1997, Blood, 90: 3962) für eine Immunisierung und nachfolgende Hybridomaherstellung verwendet. Da FIX Knockout (k.o.)-Mäuse keinen endogenen FIX exprimieren, wird angenommen, dass das Anti-(a)-FIX-Antikörperspektrum, welches erreichbar ist, verglichen zu normalen Balb/c-Mäusen (aufgrund des Fehlens der Toleranz) unterschiedlich ist.
  • Beispiel 2: Untersuchen auf FVIII ähnliche Aktivität in Überständen von Anti-FIX/FIXa-Antikörper sezernierenden Hybridomazellen
  • Um die FVIII ähnliche Aktivität von Anti-FIXa-Antikörpern, welche von Hybridomazellen sezerniert werden, zu untersuchen, wurde das kommerziell verfügbare Test-Kit COATEST VIII: C/4® (Chromogenix) verwendet. Der Assay wurde im Wesentlichen wie durch den Hersteller beschrieben durchgeführt, mit den folgenden Modifikationen:
    Um ein High-Throughput-Screening zu erlauben, wurde der Assay auf Mikrotiterplatten-Format heruntergerechnet. In Kürze, 25 μl Aliquots von Hybridomaüberständen wurden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten (Costar, #3598) transferiert und auf 37°C erwärmt. Chromogenes Substrat (S-2222), synthetischer Thrombin Inhibitor (I-2581), Faktor (F) IXa und FX wurden in sterilem Wasser rekonstituiert, und FIXa/FX wurde gemäß dem Anbieterprotokoll mit Phospholipiden gemischt. Pro Reaktion wurden 50 μl der Phospholipid/FIXa/FX-Lösung mit 25 μl CaCl2 (25 mM) und 50 μl des Substrat/Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion zu starten, wurden 125 μl der Vormischung zu dem Hybridomaüberstand in den Mikrotiterplatten hinzugefügt und bei 37°C inkubiert. Die Absorption der Proben wurde bei 405 nm und 490 nm zu verschiedenen Zeiten (30 min bis 12 h) gegen ein Blindreagens (MLW, Zellkulturmedium anstelle von Hybridomaüberstand) in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät abgelesen. Die FVIII ähnliche Aktivität der Proben wurde durch Vergleichen der Absorption der Proben mit der Absorption eines verdünnten FVIII-Referenzstandards (IMMUNO AG # 5T4AR00) unter Verwendung der GENESISTM-Software berechnet.
  • Die Ergebnisse eines Screenings auf FVIII ähnliche Aktivität in Hybridomazellkultur-Überständen sind in 1 gezeigt. Präselektierte Klone, welche von den Fusionsexperimenten #193, #195 und #196 (siehe oben) abgeleitet wurden, wurden wie beschrieben in einem chromogenen FVIII-Assay untersucht. Die Klone 193/M1, 193/N1 und 193/P1 stellen Subklone dar, welche vom Masterklon 193/C0 (siehe unten) abgeleitet wurden. Der Masterklon 195/10 wurde vom Fusionsexperiment #195 abgeleitet, und die Klone 196/A0, 196/B0 und 196/C0 wurden vom Fusionsexperiment #196 abgeleitet. In einem typischen Screening-Experiment wurden ungefähr 1000 Klone (in 96 Vertiefungen) aus einem einzigen Fusionsex periment auf FVIII ähnliche Aktivität vorgescreent. Nachfolgend wurden die selektierten Klone in einem größeren Maßstab (3-5 ml Überstand) gezogen und in einem chromogenen Assay nochmals analysiert. Als Negativkontrolle wurde auf jeder Platte Zellkulturmedium untersucht (MLW).
  • Vertiefungen, welche entweder eine hohe FVIII ähnliche Aktivität oder eine wesentliche FVIII ähnliche Aktivität aufwiesen, wurden Subklonierungsverfahren unterzogen. Das Selektions- und Subklonierungsverfahren wird beispielhaft für das Screenen und Subklonieren einer IgG herstellenden Zelllinie (d.h. 193/C0) erläutert, aber wurde in exakt derselben Weise für einen IgM (d.h. 196/C0, siehe unten, 5) herstellenden Klon durchgeführt.
  • Das Selektionsverfahren wurde durch anfängliches Ausplattieren aller Hybridomazellklone, welche von einem einzelnen Fusionsexperiment abgeleitet wurden, auf zehn 96-Vertiefungsplatten durchgeführt, wobei die sogenannten "Masterplatten" erzeugt wurden. Einzelne Positionen (Vertiefungen) auf einer Masterplatte enthielten üblicherweise mehr als einen Hybridomazellklon (üblicherweise 3 bis 15 verschiedene Klone). Nachfolgend wurde der Antikörper, welcher nur von mehreren tausend Zellen sezerniert wurde, getestet. Diese Zellen wuchsen unter Bedingungen, welche für eine Antikörperherstellung suboptimal sind, was in sterbenden Zellen am besten funktioniert. So kann die erwartete spezifische Anti-FIX-Antikörperkonzentration im Überstand im Bereich von 10–12 bis 10–14 M liegen. Dies erklärt, warum die Inkubationszeiträume verglichen mit Standard FVIII-Assays verlängert werden mussten.
  • Die Ergebnisse eines Screenings auf eine IgG vermittelte FVIII ähnliche Aktivität in Hybridomazellkultur-Überständen einer Masterplatte sind in 2 gezeigt. Die Überstände wurden in einem chromogenen FVIII-Assay untersucht. Gezeigt sind die Ergebnisse, welche von der fünften Masterplatte des Fusionsexperiments Nummer #193 (Balb/c-Mäuse, immunisiert mit FIXaα) abgeleitet wurden. Die Absorption wurde nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C abgelesen. Die Position ES wurde identifiziert, eine FVIII ähnliche Aktivität aufzuweisen, welche erheblich hö her als die Blindprobe (MLW) war. Dieser Zellpool wurde als 193/C0 bezeichnet und wurde weiter subkloniert (3). Da jede Vertiefung der Masterplatte mehr als einen Hybridomazellklon enthält, wurden die Zellen einer einzelnen positiven Vertiefung expandiert und mit einer berechneten Zelldichte von 2-0,2 Zellen/Vertiefung auf einer 96-Vertiefungsplatte ausplattiert. Die Überstände wurden wiederum auf eine FVIII ähnliche Aktivität getestet, und positive Positionen wurden einem anderen Durchgang des Subklonierens unterzogen. Typischerweise wurden drei bis vier Durchgänge des Subklonierens mit jedem Klon, der eine FVIII ähnliche Aktivität aufwies, durchgeführt, um homogene Zellpopulationen zu erhalten. Hier sind die Ergebnisse des chromogenen Assays der 193/C0 Subklone gezeigt. Die Absorption wurde nach einem 4-stündigen Inkubationszeitraum bei 37°C abgelesen. Die Positionen A6 und D5 wiesen eine wesentliche FVIII ähnliche Aktivität auf und wurden jeweils 193/M1 und 193/P1 genannt. Diese zwei Klone wurden einem anderen Durchgang des Subklonierens unterzogen. Als eine Negativkontrolle wurde auf jeder Platte reines Zellkulturmedium untersucht (MLW(H1)).
  • Ein Vergleich der chromogenen FVIII ähnlichen Aktivität und der FIX-ELISA Reaktivität von Hybridomakulturen in kleinem Maßstab (3 ml) ist in 4 gezeigt. Bevor eine Entscheidung getroffen wurde, ob ein Masterklon (oder Subklon) weiter subkloniert werden sollte, wurden die Klone in einem 3-5 ml Maßstab gezogen, und die Überstände wurden wiederum überprüft. Diese Graphik zeigt die FIX spezifischen ELISA-Ergebnisse und die FVIII ähnliche chromogene Aktivität des Masterklons 193/C0 und aller seiner Subklone, welche als Positive identifiziert und wiederum überprüft wurden. Blindwerte (Absorption des chromogenen Reagens selbst) wurden im Fall der ELISA-, sowie der chromogenen Assay-Messwerte, welche hier dargestellt sind, subtrahiert. Klon 193/M1 wurde subkloniert und ergab die Klone 193/V2, 193/M2 und 193/U2. Die anderen Klone des 2. Durchgangs kamen von 193/P1, 193/AB2 und 193/P2 wurden subkloniert. 193/AF3, 193/AB3 und 193/AE3 stellen Subklone von 193/AB2 dar. Die anderen Klone des 3. Durchgangs kamen von 193/P2. Abschließend wurden 193/AF3 (→ 193/AF4), AE3 (→ 193/AE4, 193/AL4, 193/AN4 und 193/AO4) und 193/AD3 (→ 193/AG4, 193/AH4, 193/AD4, 193/AI4, 193/AK4) subkloniert.
  • Von jedem Fusionsexperiment wurden mehrere (5-15) Masterklone (ausgewählt aus der Masterplatte) identifiziert und einer Subklonierung unterzogen. Nach 3 Durchgängen des Subklonierens erwiesen sich die meisten der Zelllinien als homogen, wie durch einen ELISA und eine chromogene Aktivitätsanalyse (siehe 4), sowie durch eine cDNA-Sequenzanalyse gezeigt wurde. Ein spezifischer Masterklon und alle seine Subklone stellen denselben FIX/FIXa bindenden Antikörper her. Es liegen jedoch große Unterschiede in den Antikörper-Proteinsequenzen der Klone vor, welche von verschiedenen Masterklonen abgeleitet wurden (siehe Beispiel 11). Die meisten Hybridomazelllinien exprimieren Antikörper der IgG-Subklasse (d.h. die Klone #193, #198, wie 198/A1, 198/B1, 198/BB1). Wir waren jedoch auch in der Lage, einige Klone, welche IgM-Antikörper exprimieren, zu selektieren.
  • Die chromogene Aktivität des Hybridomaüberstands einiger wichtiger Masterklone und Subklone wurde bestimmt. Die Absorption wurde nach einem 1 h 30 min und 3 h 30 min Inkubationszeitraum bei 37°C gemessen (5). Im Gegensatz zu allen Klonen der 193. Fusion, stellten Klon 196/C0 und sein Subklon 196/AP2 einen FIX/FIXa spezifischen IgM-Antikörper her, welcher selbst nach einem kurzen Inkubationszeitraum eine starke chromogene Aktivität ergab.
  • Die folgenden Zelllinien wurden in der europäischen Sammlung für Zellkulturen (ECACC für engl.: European Collection of Cell Cultures) in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt: 98/B1 (ECACC Nr. 99090925); 198/A1 (ECACC Nr. 99090924), 198/BB1 (ECACC Nr. 99090926); 193/A0 (ECACC Nr. 99121614); 196/C4 (ECACC Nr. 99121615); 198/D1 (ECACC Nr. 99121616); 198/T2 (ECACC Nr. 99121617); 198/G2 (ECACC Nr. 99121618); 198/AC1 (ECACC Nr. 99121619) und 198/U2 (ECACC Nr. 99121620).
  • Um eine tiefergehende Analyse der biochemischen Eigenschaften bestimmter Antikörper durchzuführen, wurden homogene Hybridomazelllinien, welche verschiedene Antikörper mit FVIII ähnlicher Aktivität exprimierten, expandiert und verwen det, um den fraglichen Antikörper in einem größeren Maßstab (100-1000 ml) zu exprimieren. Diese Antikörper wurden vor ihrer Verwendung in weiteren Experimenten affinitätsaufgereinigt (siehe Beispiel 3).
  • Beispiel 3: Faktor IX/FIXa(α,β|-Bindungseigenschaften der Antikörper, welche eine FIX/FIXa aktivierende Aktivität aufweisen
  • Faktor IX und die zwei aktivierten Formen von FIX, FIXaα und FIXaβ (FIX/FIXa(α,β)) wurden in TBS (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH-Wert 7,5) auf eine Endkonzentration von 2 μg/ml verdünnt. Nunc Maxisorb ELISA-Platten wurden mit 100 μl FIX/FIXa(α,β)-Lösung gemäß Standardverfahren (4°C, über Nacht) beschichtet und mehrere Male mit TEST (TBS, 0,1 Vol.-% Tween 20) gewaschen. 50 μl Hybridomaüberstand wurde 1:1 mit 50 μl TBST/2% BSA verdünnt und zu der beschichteten ELISA-Platte hinzugefügt. Nach einem Inkubationszeitraum von 2 h bei Raumtemperatur (RT) wurden die Platten 4-mal mit TBST gewaschen und mit 100 μl/Vertiefung einer 1:25000 Verdünnung (in TBST/1% BSA) eines Anti-Maus-IgG (Fc-spezifisch) Peroxidase konjugierten Antikörpers (Sigma, #A-0168) inkubiert (2 h, RT). Die Vertiefungen wurden 5-mal mit TBST gewaschen und abschließend mit 100 μl frisch hergestellter Färbelösung (10 ml 50 mM Natriumcitrat, pH-Wert 5, ergänzt mit 100 μl OPD (60 mg OPD/ml) und 10 μl 30% H2O2) gefärbt. Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von 50 ml H2SO4 abgestoppt, und die optische Dichte wurde bei 492 nm und 620 nm in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät unter Verwendung der GENESISTM-Software aufgenommen.
  • In bestimmten Fällen wurde anstelle eines Anit-Maus-IgG ELISA ein Anti-Maus-IgM ELISA durchgeführt.
  • Aufreinigung von Maus-IgG aus Hybridomazellkultur-Überständen
  • Der Hybridomaüberstand (100-500 ml) wurde mit 200 mM Tris/HCl Puffer (pH-Wert 7,0) und festem NaCl ergänzt, um jeweils Endkonzentrationen von 20 mM Tris und 3 M NaCl zu ergeben. Der Überstand wurde anschließend durch Zentrifugieren bei 5500 × g für 10 Minuten geklärt. Eine 1 ml Protein G-Affinitätschromatographiesäule (Protein G-Sepharose Fast Flow, Amersham-Pharmacia) wurde mit 15 ml 20 mM Tris/Cl, pH-Wert 7,0, gewaschen und danach mit 10 ml 20 mM Tris/Cl-Puffer, pH-Wert 7,0, welcher 3 M NaCl enthielt, äquilibriert. Der Hybridomaüberstand, welcher 3 M NaCl enthielt, wurde anschließend durch die Schwerkraft auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 15 ml 20 mM Tris/Cl-Puffer, pH-Wert 7,0, welcher 3 M NaCl enthielt, gewaschen. Gebundenes IgG wurde weiterhin mit 12 ml Glycin/HCl-Puffer, pH-Wert 2,8, eluiert, und es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Zum Neutralisieren wurden zu jeder Fraktion 100 μl 1 M Tris, pH-Wert 9,0, hinzugefügt. Fraktionen, welche das IgG enthielten, wurden durch Mischen von 50 μl mit 150 μl einer Färbelösung (BioRad Konzentrat, 1:5 verdünnt mit Wasser) in Vertiefungen einer Mikroplatte identifiziert. Positive Fraktionen wurden vereinigt und in einem Ultrafiltrationskonzentratorgerät (Centricon Plus 20, Amicon) gemäß den Herstellerangaben auf 1 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 19 ml TBS (20 mM Tris/Cl-Puffer, pH-Wert 7,0, welcher 150 mM NaCl enthielt) verdünnt und wiederum auf 1 ml konzentriert. Der Verdünnungs-Konzentrierungsschritt wurde noch zweimal wiederholt, um das IgG in TBS zu bringen.
  • Aufreinigung von Maus-IgM aus Hybridomazellüberständen
  • 100-500 ml Hybridomazellkultur-Überstand wurden entweder mit einem Ultafiltrationskonzentratorgerät (Centricon Plus 20, Amicon) gemäß den Herstellerangaben oder durch Ammoniumsulfatpräzipitation (40% Sättigung, 0°C) und erneut Lösen des Präzipitats mit 5-10 ml TBS auf 5-10 ml konzentriert. In beiden Fällen wurde das Konzentrat gegen 20 mM Tris/Cl-Puffer, pH-Wert 7,4, welcher 1,25 M NaCl enthielt, dialysiert und weiterhin auf 1 ml in einem Centricon Plus 20 (Amicon) Ultrafiltrationsgerät konzentriert. Das IgM wurde aus diesem Konzentrat mit dem ImmunoPure IgM Aufreinigungskit (Pierce) gemäß den Herstellerangaben aufgereinigt. Fraktionen, welche während der Elution von der Maltose bindenden Protein säule gesammelt wurden, wurden auf IgM getestet, vereinigt, konzentriert und wie für IgG beschrieben, in TBS gebracht.
  • Bestimmung der IgG-Konzentrationen in aufgereinigten Präparationen
  • Die 280 nm Extinktion des Gesamt-IgG-Gehalts geeigneter Verdünnungen wurde gemessen. E280 = 1,4 entspricht 1 mg/ml Protein.
  • Faktor IXa spezifisches IgG (quantitativer ELISA)
  • Die Vertiefungen einer Mikroplatte (Nunc Maxisorp) wurden mit 2 μg/ml Faktor IXa, verdünnt in TBS (25 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, welcher 150 mM NaCl enthielt) über Nach bei 4°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden viermal mit TEST (25 mM Tris/HCl, pH-Wert 7,5, welcher 150 mM NaCl und 0,1 Vol.-% Tween 20 enthielt) gewaschen. Als ein Standard monoklonaler AB wurde der HIX1 Anti-FIX (akkurat) verwendet. Standard und Proben wurden in TEST, welches 2% (Gew./Vol.) BSA enthielt, verdünnt. Die Standardverdünnungsreihe und geeignete Verdünnungen der Proben wurden auf der ELISA-Platte für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit TEST gewaschen und mit 100 μl/Vertiefung einer 1:25000 Verdünnung (in TEST/1% BSA) eines Anti-Maus-IgG (Fc-spezifisch) Peroxidase konjugierten Antikörpers (Sigma, A#-0168) FIXa inkubiert (2 h, RT). Die Vertiefungen wurden 5-mal mit TEST gewaschen und abschließend mit 100 μl frisch hergestellter Färbelösung (10 ml 50 mM Natriumcitrat, pH-Wert 5, ergänzt mit 100 μl OPD (60 mg OPD/ml) und 10 μl 30% H2O2) gefärbt. Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von 50 ml H2SO4 abgestoppt, und nach 30 Minuten wurde die optische Dichte bei 492 nm und 620 nm in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät unter Verwendung der GENESISTM-Software aufgenommen.
  • Beispiel 4: Anti-FIX/FIXa-Antikörper, welche eine FVIII ähnliche Aktivität in einem chromogenen FVIII-Assay aufweisen
  • Mehrere Anti-FIX/FIXa-Antikörper herstellende Hybridomaklone wurden bis zu viermal subkloniert, und die sich ergebende monoklonale Hybridomazelllinie wurde verwendet, um monoklonalen Antikörper enthaltenden Überstand herzustellen. IgG-Isotyp Antikörper, welche von diesen Überständen abgeleitet wurden, wurden über Affinitätssäulen aufgereinigt und gegen TBS (siehe oben) dialysiert. IgM-Antikörper wurden als nicht aufgereinigte Überstandsfraktionen verwendet. Die folgenden Experimente wurden mit zwei Sätzen repräsentativer Antikörper durchgeführt: 193/AD3 und 198/AC1/1 (IgG-Isotyp, der Antikörper 198/AC1/1 stellt eine Präparation des 198/AC1 Ausgangs-Hybridomaklons dar, d.h., dass ein (gefrorenes) Gefäß, welches 198/AC1 Zellen enthält, kultiviert wird und Antikörper hergestellt werden. Der Überstand wird anschließend für diese Experimente verwendet) und 196/AF2 und 196/AF1 (IgM-Isotyp) (6A und 6B). In Kürze, 25 μl Aliquots der monoklonalen Antikörper enthaltenden Probe (nicht aufgereinigter Hybridomaüberstand oder, wenn angegeben, eine bestimmte Menge des FIX spezifischen Antikörpers) wurden in Mikrotiterplattenvertiefungen transferiert und auf 37°C erwärmt. Chromogenes Substrat (S-2222), synthetischer Thrombin Inhibitor (I-2581), Faktor (F) IXa und FX wurden in sterilem Wasser rekonstituiert, und FIXa/FX wurde gemäß dem Protokoll des Anbieters mit Phospholipiden gemischt. Pro Reaktion wurden 50 μl der Phospholipid/FIXa/FX-Lösung mit 25 μl CaCl2 (25 mM) und 50 μl des Substrat/Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion zu starten, wurden 125 μl der Vormischung zu der monoklonalen Antikörperlösung in die Mikrotiterplatten hinzugefügt und bei 37°C inkubiert. Die Absorption der Proben bei 405 nm und 490 nm wurde zu verschiedenen Zeiten (5 min bis 6 h) gegen einen Reagens Blindwert (Zellkulturmedium anstelle von Hybridomaüberstand) in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät unter Verwendung der GENESISTM-Software abgelesen.
  • Der Zeitverlauf der FVIII ähnlichen Aktivität, welche die monoklonalen Antikörper 193/AD3 (IgG-Isotyp) und 196/AF2 (IgM-Isotyp) aufwiesen, verglichen mit menschlichem FVIII (12 und 16 mU/ml), TBS und mit Zellkulturmedium ist in 6A gezeigt. Nach einer lag-Phase führten beide Antikörper zu einer Spaltung des chromogenen Substrats, wie durch die ansteigende optische Dichte belegt ist, welche bei einer Wellenlänge von 405 nm messbar ist.
  • Der Zeitverlauf der FVIII ähnlichen Aktivität, welche die monoklonalen Antikörper 198/AC1/1 (IgG-Isotyp, 10 μg/ml) und 196/AF1 (IgM-Isotyp, nicht aufgereinigter Überstand) aufwiesen, verglichen mit menschlichem FVIII (16 mU/ml) und 10 μg/ml Maus-IgG ist in 6B gezeigt. Nach einer lag-Phase führten beide Antikörper zu einer Spaltung des chromogenen Substrats, wie durch den Anstieg der optischen Dichte belegt ist, welche bei einer Wellenlänge von 405 nm messbar ist.
  • Beispiel 5: FVIII ähnliche Aktivität, welche Anti-FIX/FIXa-Antikörper aufweisen, erzeugt Faktor Xa und ist Phospholipid, FIXa/FX und Ca2+ abhängig.
  • Eine Faktor VIII-Aktivität wird üblicherweise mit einem chromogenen Assay und/oder einem APTT basierten Gerinnungsassay bestimmt. Beide Assay-Typen beruhen auf einer FVIIIa/FIXa vermittelten Faktor Xa Erzeugung. Im Fall eines chromogenen FVIII-Assays wird der hergestellte Faktor Xa nachfolgend mit einem chromogenen Substrat reagieren, welches spektroskopisch überwacht werden kann, z.B. in einem ELISA-Lesegerät. In einem APTT basierten Gerinnungsassay wird sich freier Faktor Xe mit FVa auf einer Phospholipidoberfläche in dem sogenannten Prothrombinase-Komplex zusammenlagern und Prothrombin zu Thrombin aktivieren. Thrombin wiederum führt zu einer Fibrin Erzeugung und abschließend zu einer Gerinnselbildung. Im Mittelpunkt der zwei Assay-Systeme steht die Erzeugung von Faktor Xa durch den FVIIIa/FIXa-Komplex.
  • Um zu zeigen, dass die FVIII ähnliche Aktivität, welche die Anti-FIX/FIXa-Antikörper aufweisen in der Tat Faktor Xa erzeugt, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Mehrere 25 μl Aliquots von nicht aufgereinigtem Hybridomaüberstand 196/AF2 (IgM-Isotyp) wurden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten transferiert und auf 37°C erwärmt. Als eine Positivkontrolle wurden 16 mU RecombinateTM in Hybridomamedium (196 HM 007/99) verdünnt und genauso wie der Hybridomaüberstand behandelt. Als eine Negativkontrolle wurde reines Hyb ridomamedium verwendet. Chromogenes Substrat (S-2222), synthetischer Thrombin Inhibitor (I-2581), Faktor IXa und FX wurden in sterilem Wasser rekonstituiert, und FIXa/FX wurde gemäß dem Protokoll des Anbieters mit Phospholipiden gemischt. Pefabloc Xa®, ein Faktor Xa spezifischer Proteinase Inhibitor (Pentapharm, LTD) wurde mit Wasser auf eine Endkonzentration von 1 mM/l rekonstituiert. Pro Reaktion wurden 50 μl der Phospholipid/FIXa/FX-Lösung mit 25 μl CaCl2 (25 mM) und 50 μl des Substrat/Thrombin-Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion zu starten, wurden 125 μl der Vormischung zu den Proben in den Mikrotiterplatten hinzugefügt und bei 37°C inkubiert. Wo es angegeben wird, wurden 35 μM Pefabloc Xa® hinzugefügt. Die Absorption bei 405 nm und 490 nm wurde zu verschiedenen Zeiten (alle 5 Minuten bis 6 h) gegen einen Reagens Blindwert (Zellkulturmedium) in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät unter Verwendung der GENESISTM-Software abgelesen.
  • Die Ergebnisse der Faktor IXa-Stimulation durch die FVIII ähnliche Aktivität, welche der IgM-Anti-FIX/FIXa-Antikörper 196/AF2 beim Erzeugen von Faktor Xa aufweist, wie durch die leicht messbare Spaltung des chromogenen Substrats S-2222 belegt ist (vergleiche "16 mU FVIII" und "196/AF2"), ist in 7A gezeigt. Die Faktor Xa-Aktivität wird wirksam durch den FXa spezifischen Inhibitor "Pefabloc Xa®" blockiert (vergleiche "196/AF2" gegenüber "196/AF2 35 μM Pefabloc Xa®"), was darauf hinweist, dass in der Tat FXa erzeugt wurde.
  • Dasselbe Experiment wurde unter Verwendung von aufgereinigten IgG-Präparationen von Klon 198/AM1 durchgeführt (7B). Aufgereinigtes IgG wurde in TBS auf eine Endkonzentration von 0,4 mg/ml verdünnt, und 25 μl (d.h. insgesamt 10 μg) wurden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten transferiert und auf 37°C erwärmt. Als eine Positivkontrolle wurden 6 mU aus Plasma abgeleiteter FVIII verwendet. 10 μg unspezifischer Maus-IgG (Sigma, I-5381) dienten als eine Negativkontrolle. Der Assay wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
  • Weitere Experimente zeigen, dass die Faktor IXa-Stimulation durch die FVIII ähnliche Aktivität, welche der IgG-Anti-FIX/FIXa-Antikörper 198/AM1 aufweist, Faktor Xa erzeugt, wie durch die leicht messbare Spaltung des chromogenen Substrats S-2222 belegt ist (7B). Wiederum erzeugen Faktor VIII und Antikörper 198/AM1 FXa, welcher wirksam durch den FXa spezifischen Inhibitor "Pefabloc Xa®" blockiert wird. Als eine Negativkontrolle wurde unspezifischer Maus-IgG (Sigma, I-5381) untersucht.
  • In einem anderen Satz von Experimenten wurde die Abhängigkeit der FVIII ähnlichen Aktivität der entweder aufgereinigten Anti-FIX/FIXa-Antikörper (IgM, 8A) oder der nicht aufgereinigten Antikörper, welche aus Zellkulturüberständen abgeleitet wurden (IgG, 8B), von der Anwesenheit von Phospholipiden (PL), FIXa/FX und Ca2+ gezeigt. Maus-IgG wurde als eine Kontrolle verwendet (8C). Die Faktor VIII ähnliche Aktivität wurde im Wesentlichen wie oben beschrieben untersucht. Wenn es angegeben wird, wurde entweder das FIXa/FX-Gemisch, die PL oder Ca2+ in der Reaktion weggelassen. Die Absorption der Proben bei 405 nm und 490 nm wurde zu verschiedenen Zeiten gegen einen Reagens Blindwert (Puffer anstelle von aufgereinigtem Antikörper) in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät abgelesen. Die Ergebnisse sind in 8A, 8B und 8C gezeigt.
  • Die Abhängigkeit der FVIII ähnlichen Aktivität des aufgereinigten Anti-FIXa-Antikörpers 198/AC1/1 (IgG-Isotyp, die während des gesamten Assays verwendete Konzentration betrug 10 μg/ml) von der Anwesenheit von Phospholipiden (PL), FIXa/FX und Ca2+ ist weiterhin in 8A gezeigt. Wie einfach erkennbar ist, führt nur der vollständige Assay, welcher Antikörper, PL, Ca2+ und FIXa/FX einschließt, zu einer angemessenen FXa-Erzeugung. Die Abhängigkeit der FVIII ähnlichen Aktivität des Zellkulturüberstands, welcher den nicht aufgereinigten IgM-Isotyp Anti-FIX/FIXa-Antikörper (196/AF1) enthielt, von der Anwesenheit von Phosphoplipiden, FIXa/FX und Ca2+ ist in 8B gezeigt.
  • Wie bereits für die aufgereinigte IgG-Präparation (8A), Antikörper 198/AC1/1 gezeigt wurde, wird wiederum nur der vollständige Assay, welcher PL, Ca2+, FIXa/FX einschließt, eine angemessene Menge FXa-Erzeugung ergeben. Um die Spezifität der Reaktion zu zeigen, wurde Gesamt-IgG, welches aus normalem Mausplasma hergestellt wurde, unter denselben Bedingungen wie oben untersucht. Die Ergebnisse sind in 8C gezeigt. Es konnte keine FVIII ähnliche Aktivität nachgewiesen werden. Wie erwartet liegt keine nachweisbare Aktivität in der Abwesenheit von Phospholipiden, FIXa/FX und Ca2+ vor. Alle Experimente wurden in einer Mikrotiterplatte durchgeführt, und die OD405 wurde für 6 h alle 5 Minuten gescannt.
  • Beispiel 6: Bestimmte Anti-FIX/FIXa-Antikörper wirken in der Anwesenheit von FIXa prokoagulierend
  • Während einer normalen Hämostase wird FIX anfänglich entweder durch den Gewebefaktor (TF für engl.: tissue factor)/Faktor VIIa-Weg oder später durch den aktivierten Faktor XI (FXIa) aktiviert. Seiner Aktivierung folgend, verbindet sich FIXa auf der Blutplättchenoberfläche in einem Membran gebundenen Komplex mit aktiviertem FVIII. Faktor IXa selber weist wenig oder keine enzymatische Aktivität in Richtung auf FX auf, aber wird in der Anwesenheit von FVIIIa hochaktiv. Um zu zeigen, dass bestimmte Anti-FIX/FIXa-Antikörper eine FVIII ähnliche Aktivität aufweisen und daher in einem menschlichen FVIII-Mangelplasma prokoagulierend wirken, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Verschiedene Mengen des Antikörpers 193/AD3 oder Maus-IgG (als eine Kontrolle) wurden in einem Standard aPTT basierten Einstufen-Gerinnungsassay verwendet. In Kürze, 100 μl der Antikörper enthaltenden Proben wurden mit 100 μl FVIII-Mangelplasma (DP für engl.: deficient plasma) und mit 100 μl DAPTTIN-Reagens (PTT-Reagans zur Bestimmung der aktivierten Thromboplastinzeit; IMMUNO AG) in einem KC10A Gerinnungsanalysegerät inkubiert. Wo es angegeben wird, wurde eine Gesamtmenge von 50 ng aktiviertem FIX in das Reaktionsgemisch eingeschlossen. Nach einer 4-minütigen Inkubation wurde die Reaktion durch das Hinzufügen von 100 μl CaCl2 (25 mM) gestartet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 9 gezeigt.
    Gerinnungszeit (sek)
    μg AB 193/AD3 Maus-IgG
    50 ng FIXa 50 ng FIXa
    9 101,6 102,5
    4,5 95,6 103,2
    2,25 93,1 103,2
    1,8 93,7 101,9
    1,35 91,4 103,4
    0,9 94,4 102,2
    0,45 98,1 101,9
    0,34 97,1 103,9
    0,23 99,3 103,7
    Tabelle 1: Gerinnungszeiten von FVIII-Mangelplasma in einem APTT basierten Gerinnungsassay unter Verwendung verschiedener Mengen von prokoagulierendem (193/AD3) und Kontroll-Antikörper (Maus-IgG) in der Anwesenheit von 50 ng aktiviertem FIX (0,01 U FIX).
  • Das molare Verhältnis von Antikörper in der Reaktion und aktiviertem FIX beträgt 10:1. Das molare Verhältnis zwischen Antikörper und Gesamt-FIX (FIX und FIXa, unter der Annahme, dass menschliches FVIII-Mangelplasma 1 U (5 μg) FIX enthält) variiert zwischen 6:1 (9 μg Antikörper in der Reaktion) und 1:6 (0,23 μg Antikörper in der Reaktion). Bei der optimalen Verkürzung der Gerinnungszeit beträgt das molare Verhältnis zwischen Antikörper und Gesamt-FIX 1:1. Die Gerinnungszeit ohne das Hinzufügen von FIXa liegt im Bereich von 120 Sekunden.
  • 9 stellt eine graphische Darstellung der Gerinnungszeiten von FVIII-Mangelplasma in einem aPTT basierten Gerinnungsassay unter Verwendung verschiedener Mengen von prokoagulierendem (193/AD3) und Kontroll- (Maus-IgG) Antikörper in der Anwesenheit von 50 ng aktiviertem FIX dar. Es liegt eine deutliche dosisabhängige Reduktion der Gerinnungszeit in den mit Antikörper 193/AD3 ergänzten Proben vor. Diese Ergebnisse implizieren, dass der Antikörper 193/AD3 in der Anwesenheit von FIXa prokoagulierend wirkt.
  • Beispiel 7: Anti-FIX/FIXa-Antikörper wirken in der Anwesenheit von FVIII-Inhibitoren und FIXa prokoagulierend
  • Eine schwere Komplikation der Standard FVIII-Substitutionstherapie stellt die Entwicklung von gegen FVIII gerichteten Alloantikörpern dar, welche zu einer FVIII-Neutralisation führt und zu einem Zustand, in dem das Blut des Patienten nicht gerinnen wird.
  • Um zu zeigen, dass bestimmte Anti-FIXa-Antikörper selbst in der Anwesenheit von FVIII-Inhibitoren eine FVIII ähnliche Aktivität aufweisen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Verschiedene Mengen des Antikörpers 193/AD3 oder, als eine Kontrolle, Maus-IgG, wurden in einem Standard APTT basierten Einstufen-Gerinnungsassay verwendet. In Kürze, 100 μl Antikörperproben wurden entweder mit 100 μl FVIII-Mangelplasma (10A) oder FVIII-Inhibitorplasma (Inhibitorwirkung 400 BU/ml) (10B), sowie mit 100 μl DAPTTIN-Reagens in einem KC10A Gerinnungsanalysegerät inkubiert. Zusätzlich wurde eine Gesamtmenge von 50 ng aktiviertem FIXa in das Reaktionsgemisch eingeschlossen. Nach einer 4-minütigen Inkubation wurde die Reaktion durch das Hinzufügen von 100 μl CaCl2 (25 mM) gestartet. Um gleiche Bedingungen sicherzustellen, wurden die Experimente, welche FVIII-Mangelplasma und FVIII-Inhibitorplasma verwendeten, Seite an Seite durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 10A und 10B gezeigt. Wie bereits in Beispiel 6 gezeigt, liegt eine deutliche dosisabhängige Reduktion der Gerinnungszeit in mit Antikörper 193/AD3 ergänzten Proben in der Anwesenheit von FVIII-Inhibitoren vor.
  • Beispiel 8. Anti-FIX/FIXa-Antikörper wirken in der Anwesenheit von defekten FVIII und FIXa prokoagulierend
  • Um zu zeigen, dass bestimmte Anti-FIXa-Antikörper in der Anwesenheit von defektem FVIII eine FVIII ähnliche Aktivität aufweisen, kann das folgende Experiment durchgeführt werden. Ansteigende Mengen des Antikörpers 193/AD3 oder, als eine Kontrolle, Maus-IgG werden in einem Standard aPTT basierten Einstufen-Gerinnungsassay verwendet. In diesem Gerinnungsassay wird ein Plasma eines Hämophilie A Patienten verwendet, welches aufgrund der Anwesenheit von defektem FVIII (DF8) eine sehr geringe Gerinnungsaktivität aufweist. In Kürze, 100 μl Antikörperproben werden entweder mit 100 μl DF8-Plasma oder FVIII-Mangelplasma, sowie mit 100 μl DAPTTIN-Reagens in einem KC10A Gerinnungsanalysegerät inkubiert. Zusätzlich wird eine Gesamtmenge von 50 ng aktiviertem FIXa in das Reaktionsgemisch eingeschlossen. Nach einer kurzen Inkubation wird die Reaktion durch das Hinzufügen von 100 μl CaCl2 (25 mM) gestartet werden. Um gleiche Bedingungen sicherzustellen, werden die Experimente, welche FVIII-Mangelplasma und DF8-Plasma verwenden, Seite an Seite durchgeführt.
  • Beispiel 9: Anti-FIX/FIXa-Antikörper mit prokoagulierender Aktivität unterscheiden in der Anwesenheit von FIXa zwischen menschlichem und Rinder-FIXa
  • FIX/FIXa spezifische monoklonale Antikörper, welche aus dem 198. Fusionsexperiment ausgewählt wurden, wurden aus dem entsprechenden Hybridomaüberstand aufgereinigt und wie in Beispiel 3 beschrieben, quantifiziert. Diese Antikörper wurden in einem modifizierten Einstufen-Gerinnungsassay analysiert (wie in Beispiel 6 beschrieben), und einige zeigten eine prokoagulierende Aktivität.
  • Die chromogene Aktivität dieser Antikörperpräparationen wurde in dem folgenden Kinetikassay der FXa-Erzeugung gemessen: 10 μg des monoklonalen Antikörpers (in 25 μl) wurden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten transferiert und auf 37°C erwärmt. Chromogenes Substrat (S-2222), synthetischer Thrombin Inhibitor (I-2581), Faktor IXa und FX wurden in sterilem Wasser rekonstitutiert, und FIXa/FX (beide vom Rind) wurden gemäß dem Protokoll des Anbieters mit Phospholipiden gemischt. Pro Reaktion wurden 50 μl der Phospholipid/FIXa/FX-Lösung mit 25 μl CaCl2 (25 mM) und 50 μl des Substrat-Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion zu starten, wurden 125 μl der Vormischung zu der monoklonalen Antikörper lösung in den Mikrotiterplatten hinzugefügt und bei 37°C inkubiert. Die Absorption der Proben bei 405 nm und 490 nm wurde zu verschiedenen Zeiten (5 min bis 2 h) gegen eine Reagens Blindprobe (25 ml TBS anstelle von monoklonalem Antikörper) in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät unter Verwendung der GENESISTM-Software abgelesen. Parallel wurden dieselben Reaktionen durchgeführt, außer dass 50 ng menschlicher FIXa pro Reaktion hinzugefügt wurden. Jene Antikörper, welche eine prokoagulierende Aktivität zeigten, wiesen im Fall des Rinder-FIX keine chromogene Aktivität auf, aber zeigten eine hohe Aktivität, wenn menschlicher FIXa anwesend war.
  • 11 zeigt den Zeitverlauf der FVIII ähnlichen Aktivität, welche die monoklonalen Antikörper 198/A1, 198/B1 und 198/AP1 mit (+) und ohne (–) Hinzufügen von 50 ng menschlichem FIXaβ aufwiesen. Unspezifisches polyklonales Maus-IgG wurde als eine Kontrolle verwendet. 198/A1 und 198/B1 zeigen eine prokoagulierende Aktivität (ähnlich wie 193/AD3 in Beispiel 6), während 198/AP1 dies nicht tut. Antikörper 198/BB1 wies dasselbe Aktivitätsmuster auf (Daten nicht gezeigt).
  • Weitere monoklonale Antikörper, welche aus dem 198. Fusionsexperiment ausgewählt wurden, schließen 198/D1 (ECACC Nr. 99121616), 198/T2 (ECACC Nr. 9912617), 198/G2 (ECACC Nr. 9912118), 198/U2 (ECACC Nr. 99121620) ein.
  • Beispiel 10: Struktur und prokoagulierende Aktivität der Antikörperderivate, welche von Anti-FIX/FIXa-Antikörpern abgeleitet wurden; Subklonieren der variablen Antikörperdomänen aus den Hybridomazelllinien 193/AD3, 193/K2, 198/A1 und 198/B1 (Klon AB2)
  • Klonierungsverfahren: Boten- bzw. Messenger-RNA wurde aus 1 × 106 Hybridomazellen der jeweiligen Zelllinie (entweder 193/AD3, 193/K2, 198/A1 der 198/B1 (Klon AB2)) unter Verwendung des "QickPrep® Micro mRNA Purification Kit" (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Die entsprechende cDNA wurde durch Retrotranskription der mRNA unter Verwendung des "Ready-To-Go-You-Prime-First-Strand Beads Kit" (Pharmacia) gemäß den Anwei sungen des Herstellers hergestellt. Schwere und leichte Kette kodierende Sequenzen wurden unter Verwendung eines Satzes von Primern in die entsprechende cDNA umgewandelt. Um schwere Ketten spezifische mRNA (VH) revers zu transkribieren, wurde ein äquimolares Gemisch der Oligonukleotide MOCG1-2FOR (5' CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGT GC 3'), (SEQ. ID. NR. 1), MOCG3FOR (5' CTC GAT TCT CTT GAT CAA CTC AGT CT 3') (SEQ. ID. NR. 2) und MOCMFOR (5' TGG AAT GGG CAC ATG CAG ATC TCT 3') (SEQ. ID. NR. 3) verwendet (RTmix1). Im selben Reaktionsröhrchen wurde leichte Ketten spezifische cDNA (VL) unter Verwendung des Primers MOCKFOR -(5' CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT GAC 3') (SEQ. ID. NR. 4) synthetisiert.
  • Die kodierenden Sequenzen für VH wurden durch eine PCR unter Verwendung des Primersatzes, welcher in 12 dargestellt ist, und der spezifischen cDNA, welche aus dem oben beschriebenen Gemisch für die reverse Transkription (RTmix1) abgeleitet wurde, als Matrize, amplifiziert. VK-Kettengene wurden unter Verwendung des in 13 dargestellten Primersatzes amplifiziert und verwendeten auch RTmix1 als eine Matrize. Das VH-PCR-Produkt wurde mit SfiI-AscI gespalten und in mit SfiI-AscI gespaltenen Vektor pDAP2 (GenBank Zugangsnr.: U35316) eingefügt. Die dadurch erhaltenen pDAP2-VH-Konstrukte wurden jeweils pDAP2-193AD3/VH, pDAP2-198A1/VH, pDAP2-198AB2/VH (abgeleitet von Antikörper 198/B1) und pDAP2-193/K2/VH genannt. Die Plasmide wurden nachfolgend mit AscI-NotI gespalten, und das entsprechende mit AscI-NotI gespaltene VK-Gen-PCR-Produkt wurde eingefügt. Die sich ergebenden Vektoren wurden als pDAP2-193/AD3scFV, pDAP2-198/A1scFv, pDAP2-198/AB2scFv (abgeleitet von Antikörper 198/B1) und pDAP2-193/K2scFV bezeichnet und kodieren für das VH-Gen und das VL-Gen der monoklonalen Antikörper 193/AD3, 198/A1, 198/AB2 (abgeleitet von Antikörper 198/B1) und 193/K2. Schwere und leichte Ketten werden durch die kodierende Sequenz für einen künstlichen flexiblen Linker (G4SGGRASG4S; Engelhardt et al., 1994) verbunden und ermöglichen eine Expression der scFv-Variante des jeweiligen Antikörpers.
  • In 14 werden die DNA- und die abgeleitete Proteinsequenz des scFv, welches von der Hybridomazelllinie 193/AD3 abgeleitet wurde, dargestellt. Die Nukleotide 1 bis 357 kodieren für die variable Domäne der schweren Kette, die Nukleotide 358 bis 402 kodieren für den künstlichen flexiblen Linker, und die Nukleotide 403 bis 726 kodieren für die variable Region der leichten Kette. Die Proteinsequenz der CDR3-Region der schweren Kette weist die Sequenz YGNSPKGFAY (SEQ. ID. NR. 5) auf und wird in fettgedruckten Buchstaben angegeben. Die künstliche Linkersequenz (G4SGGRASG4S) ist gezeigt.
  • In 15 sind die DNA- und die abgeleitete Proteinsequenz des scFv, welches von der Hybridomazelllinie 193/K2 abgeleitet wurde, gezeigt. Die Nukleotide 1 bis 363 kodieren für die variable Domäne der schweren Kette, die Nukleotide 364 bis 408 kodieren für den künstlichen flexiblen Linker, und die Nukleotide 409 bis 747 kodieren für die variable Region der leichten Kette. Die Proteinsequenz der CDR3 der schweren Kette weist die Sequenz DGGHGYGSSFDY (SEQ. ID. NR. 6) auf und wird in fettgedruckten Buchstaben angegeben. Die künstliche Linkersequenz (G4SGGRASG4S) ist gezeigt.
  • In 16 werden die DNA- und die abgeleitete Proteinsequenz des scFv, welches von der Hybridomazelllinie 198/AB2 (abgeleitet vom Antikörper 198/B1) abgeleitet wurde, dargestellt. Die Nukleotide 1 bis 366 kodieren für die variable Domäne der schweren Kette, die Nukleotide 367 bis 411 kodieren für den künstlichen flexiblen Linker, und die Nukleotide 412-747 kodieren für die variable Region der leichten Kette. Die Proteinsequenz der CDR3-Region der schweren Kette weist die Sequenz EGGGFTVNWYFDV (SEQ. ID. Nr. 7) auf und wird in fettgedruckten Buchstaben angegeben. Die künstliche Linkersequenz (G4SGGRASG4S) ist auch gezeigt.
  • In 17 werden die DNA- und die abgeleitete Proteinsequenz des scFv, welches von der Hybridomazelllinie 198/A1 abgeleitet wurde, dargestellt. Die Nukleotide 1 bis 366 kodieren für die variable Domäne der schweren Kette, die Nukleotide 367 bis 411 kodieren für einen künstlichen flexiblen Linker, und die Nukleotide 412- 747 kodieren für die variable Region der leichten Kette. Die Proteinsequenz der CDR3-Region der schweren Kette weist die Sequenz EGGGYYVNWYFDV (SEQ. ID. NR. 8) auf und ist in fettgedruckten Buchstaben angegeben. Die künstliche Linkersequenz (G4SGGRASG4S) ist auch gezeigt.
  • Beispiel 11: Prokoagulierende Aktivität der Peptide, welche von den CD3-Regionen der Anti-FIX/FIXa-Antikörper abgeleitet wurden
  • Grundsätzlich kann das Antikörpermolekül als ein biologisches Hilfsmittel für die Präsentation eines kombinatorischen Arrays von Peptidelementen im dreidimensionalen Raum angesehen werden (siehe Gao et al., 1999, PNAS, 96: 6025). Daher kann ein Antikörper (oder ein Antikörperderivat, z.B. scFv, Fab, usw.) entweder als ein Werkzeug für den Nachweis von funktionell wichtigen Domänen eines bestimmten Zielproteins verwendet werden oder auf der anderen Seite für die Beschreibung von Aminosäuresequenzen, welche spezifisch bestimmte Interaktionen vermitteln, d.h. die Aktivität von FIXa in Richtung auf das physiologische Substrat FX aktivieren oder verstärken. Das letztere Verfahren hat zur Ermittlung einer Anzahl von Peptidsequenzen, welche von der CD3-Region der schweren Kette (CDR3H) abgeleitet waren, als FIXa verstärkende Mittel geführt.
  • Ein Verstärken der prokoagulierenden Aktivität von Peptiden, welche eine solche Aktivität aufweisen, kann durch eine Sequenzvariation innerhalb der Peptidregionen erreicht werden, welche für eine Vermittlung der FIXa-Aktivitätsverstärkung entscheidend sind. Als ein möglicher Schritt in Richtung auf Peptidsequenzen mit einer verstärkten prokoagulierenden Aktivität wird die Bindungsstelle eines Antikörpers, d.h. 198/A1 oder 198/B1, auf dem FIXa-Molekül durch Verwenden von Sequenz-Vergleichsanalysen, kompetitiven Bindungsassays, Western Blot Analysen und kompetitiven ELISA-Analysen kartiert. Da die Kristallstruktur von FIX bekannt ist, wird nachfolgend eine molekulare Modellierung verwendet, um die Passung von z.B. von 198/B1 abgeleiteten Peptiden in die 198/B1-Bindungsstelle von menschlichem FIXa zu verbessern.
  • Auf der anderen Seite erlaubt eine systematische Mutationsanalyse einer bestimmten Peptidsequenz, wie von 198/A1 oder 198/B1 CDR3H abgeleitete Peptidsequenzen, durch z.B. eine "Alanin-Scanning-Mutationsanalyse" die Identifikation von Peptidresten, welche entscheidend für die prokoagulierende Aktivität sind. Ein anderer Weg, um die Aktivität einer bestimmten Peptidsequenz zu verbessern, stellt die Verwendung von Peptidbibliotheken in Verbindung mit einem High-Throughput-Screening dar.
  • Die Antigen Bindungsstelle eines Antikörpers ist von der nebeneinander liegenden Anordnung der sechs "komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs)" am N-terminalen Ende des VL-HL-Dimers (oder der Fv-Region) abgeleitet. Der Beitrag einer einzelnen CDR für die Antikörperspezifität für ein bestimmtes Antigen kann beträchtlich variieren, aber im Allgemeinen wird angenommen, dass die CDR3-Region der schweren Kette (CDR3H) einen besonderen Einfluss hat, d.h. die besondere Proteinsequenz der CDR3H-Region kann sehr wichtig für eine Antigenerkennung sein. Für die Länge der CDR3H-Regionen wurde berichtet, dass sie beträchtlich variieren und im Bereich von 4-25 Aminosäuren liegen (Borrebaeck, S. 16).
  • Ein Beispiel für eine systematische Mutationsanalyse von Peptidsequenzen wird unten dargestellt. Um die Löslichkeit/prokoagulierende Wirksamkeit von Peptiden, welche von der CD3-Region von Anti-FIX/FIXa-Antikörpern abgeleitet wurden, zu verbessern, wurden die N-terminalen, sowie die C-terminalen Aminosäuresequenzen ausgewechselt. Zusätzlich wurde eine Reihe von mutierten Peptiden konstruiert und analysiert.
  • Das Prinzip einer solchen Studie wird durch eine Reihe von Peptiden, welche von der CDR3H-Region der Antikörper 198/A1 und 198/B1 abgeleitet wurden, beispielhaft gezeigt. Das ursprüngliche Peptid A1 (siehe Tabelle 2) ist von der CDR3H-Region des Antikörpers 198/A1 abgeleitet, und das Peptid B1 ist entsprechend von der CDR3H-Region des Antikörpers 198/B1 abgeleitet (siehe Beispiel 10, 16 und 17). Der Begriff "vermischte Version" bedeutet, dass ein Peptid dieselben Aminosäuren aufweist, aber in einer Zufallsanordnung.
    Peptid Sequenz Aminosäuren MW (D) pl Bemerkung
    A1 EGGGYYVNWYFDV (SEQ. ID. NR. 9) (13AS) 1569 7,2 verminderte Löslichkeit
    A1/1 VYGFGWGYEVNDY (SEQ. ID. NR. 10) (13AS) 1569 7,1 vermischte Version von A1
    A1/2 EEEEGGGYYVNWYFDEEE (SEQ. ID. NR. 11) (18AS) 2244 5,8 saurer pl, löslich
    A1/3 RRREGGGYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 12) (18AS) 2407 9,9 basischer pl, löslich
    A1/4 EYGEGYGEVNEYDEFEWE (SEQ. ID. NR. 13) (18AS) 2244 5,8 vermischte Version von A1/2
    A1/5 VRYRNRYRWGYRGRFGDE (SEQ. ID. NR. 14) (18AS) 2407 9,9 vermischte Version von A1/3
    A1/3-scr3 RRRGEYGVYWNGDFYRRR (SEQ. ID. NR. 15) (18AS) 2407 9,9 vermischte Version von A1/3
    A1/3-Rd RdRdRdEGGGYYVNWYFDRdRdRd (SEQ. ID. NR. 16) (18AS) 2407 9,9 Peptid A1/3, aber L-Arg durch D-Arg substituiert
    A1/3-Rd-srmb RdRdRdGEYGVYWNGDFYRdRdRd (SEQ. ID. NR. 17) (18AS) 2407 9,9 vermischte Version von A1/3-Rd
    Tabelle 2
  • Liste einer Reihe von vom Antikörper 198/A1 abgeleiteten Peptiden. Aufgeführt sind die Länge des Peptids (AS, Aminosäuren #), das berechnete Molekularge wicht (MW, in Dalton (D)) und der statistische isoelektrische Punkt (pl). D-Arg ist als Rd abgekürzt.
  • In einer ersten Reihe von Experimenten verbesserten wir die Löslichkeit der ursprünglichen CDR3H-Peptidsequenz (A1; EGGGYYVNWYFDV) durch Entfernen des C-terminalen Val-Restes und Hinzufügen mehrerer geladener Reste am N-, sowie am C-terminalen Ende des Peptids. Die sich ergebenden Peptide, A1/2 (saurer pl), A1/3 (basischer pl) und ihre jeweiligen vermischten Versionen A1/4, A1/5 und A1/3scr3 waren in einer Vielzahl von Puffersystemen bei physiologischem pH-Wert leicht löslich.
  • Um die FVIII ähnliche (FIXa aktivierende) Aktivität der Peptide zu analysieren, wurde ein Assaysystem, basierend auf einem kommerziell verfügbaren FVIII-Assay entwickelt (siehe Beispiele 2 und 4). Das zugrunde liegende Prinzip liegt darin, dass FIXa ohne einen Kofaktor eine sehr begrenzte Aktivität in Richtung auf sein natürliches Substrat FX aufweisen wird. Nur in der Anwesenheit einer Substanz, welche FIXa-Aktivierungseigenschaften aufweist, d.h. FVIII oder eine Substanz, welche FVIII ähnliche Aktivität aufweist, wird eine wesentliche Menge FXa durch Spaltung von FX durch den FIXa/Aktivierungskomplex hergestellt. Die Menge von erzeugtem FXa wird durch Spaltung eines chromogenen Substrats überwacht. Das Prinzip des geänderten chromogenen Assays wird für zwei repräsentative Peptide beschrieben: A1/3 und A1/5 (Tabelle 2). In Kürze, 25 μl Aliquots der Peptid Stammlösung (in Imidazol-Puffer (IZ) 50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,2) wurden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten transferiert und auf 37°C erwärmt. Chromogenes FXa-Substrat (S-2222), synthetischer Thrombin Inhibitor (I-2581), Rinder-FIXa und Rinder-FX wurden in sterilem Wasser reskonstituiert, und FIXa/FX wurde gemäß dem Protokoll des Anbieters mit Phospholipiden gemischt. Da die Peptide nicht mit Rinder-FIXa reagieren (welches als ein Gemisch mit Rinder-FX im Testkit geliefert wird), wurden 2,9 nM (in den meisten Fällen 2,3 nM) menschlicher FIXa (ERL) hinzugefügt (siehe Beispiel 11, 19). Pro Reaktion wurden 50 μl der Phosphoplipid/FIXa/FX-Lösung mit 25 μl CaCl2 (25 mM) und 50 μl des Substrat/Inhibitor-Cocktails vereinigt. Um die Reaktion zu starten, wur den 125 μl der Vormischung zu der Peptidlösung in der Mikrotiterplatte hinzugefügt und bei 37°C inkubiert. Die Absorption der Proben bei 405 nm und 490 nm wurde zu verschiedenen Zeiten (5 min bis 2 h) gegen einen Reagens Blindwert in einem Labsystems iEMS Reader MFTM Mikrotiterplatten Lesegerät unter Verwendung der GENESISTM-Software abgelesen. Das Ergebnis dieses Experiments ist in Beispiel 11, 18 gezeigt. Peptid A1/3 induzierte eine leicht messbare FXa-Erzeugung in der Anwesenheit von 2,9 nM menschlichem FIXa, während die vermischte Version A1/5 inaktiv war. Zusätzlich ergaben das saure Peptid A1/2, sowie die vermischten Versionen A1/4 und A1/3-scr3 keine erhebliche chromogene Aktivität, wenn sie unter vergleichbaren Bedingungen getestet wurden (Daten sind nicht gezeigt). Um nachzuweisen, dass das Peptid A1/3, wie der Ausgangs-Antikörper 198/A1, nicht mit Rinder-FIXa und FX reagiert, wurde das in 19 gezeigte Experiment durchgeführt. Das Peptid A1/3 wurde wie oben beschrieben mit (A1/3 (24 μM), +hFIXa) und ohne (A1/3 (24 μM), ohne hFIXa) 2,3 nM menschlichem FIXa (hFIXa) inkubiert. In einem Kontrollexperiment fügten wir reinen Verdünnungspuffer (IZ), ergänzt mit 2,3 nM hFIXa zu dem Reaktionsgemisch hinzu. Wie in 19 gezeigt, findet die Reaktion nur in der Anwesenheit von menschlichem FIXa statt.
  • 18 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität von Peptid A1/3 in der Anwesenheit von 2,9 nM menschlichem FIXa (hFIXa). Die vermischte Version von Peptid A1/3, Peptid A1/5 führt zu keiner FXa-Erzeugung. 19 zeigt die Abhängigkeit der chromogenen FVIII ähnlichen Aktivität des Peptids A1/3 von der Anwesenheit von menschlichem FIXa (hFIXa). In der Abwesenheit von menschlichem FIXa führt Peptid A1/3 zu keiner FXa-Erzeugung. Die Pufferkontrolle, reiner Imidazol-Puffer, ist als IZ bezeichnet.
  • Die Peptide wurden auch auf ihre Fähigkeit analysiert, die Gerinnungszeit in einem FVIII-Mangelplasma zu reduzieren. Der aPTT basierte Einstufen-Gerinnungsassay wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (siehe Beispiel 6). Die Gerinnungszeiten (die Zeit vom Starten der Reaktion bis zur "Gerinnsel"-Bildung) wurden entweder mit FVIII, einer Pufferkontrolle (IZ) oder einem Kontrollpeptid (vermischte Version) verglichen. Die Ergebnisse von zwei typischen Gerinnungsexperimenten, welche mit zwei verschiedenen aPTT-Reagenzien (DAPTTIN und Pathromtin SL) durchgeführt wurden, sind in Tabelle 3A und Tabelle 3B gezeigt.
    Exp. 1 Peptidkonz. ohne FIXa sek ohne FIXa sek Mittelwert (sek) 2,2 nM FIXa sek 2,2 nM FIXa sek Mittelwert (sek)
    IZ 0 107,7 106,8 107 93,1 94,5 94
    A1/3 15 μM 78,2 77,1 78 59,3 59,9 60
    12,5 μM 80,2 80,6 80 60,2 58,9 60
    7,5 μM 97,8 97,9 98 73,1 72,7 73
    2,5 μM 105,2 104,8 105 91,1 91 91
    A1/3-scr3 15 μM 122,5 122 122 106,1 105,5 106
    12,5 μM 116 117,6 117 103,1 104,5 104
    7,5 μM 114,2 113,9 114 100,8 100,6 101
    2,5 μM 107,8 107,4 108 96,3 95,2 96
    Exp. 2 Peptidkonz. ohne FIXa sek ohne FIXa sek Mittelwert (sek) 2,2 nM FIXa sek 2,2 nM FIXa sek Mittelwert (sek)
    IZ 0 111 109,7 110 94,7 95,5 95
    A1/3 12,5 μM 83,6 85,5 85 56,7 56,7 57
    10 μM 79,1 78,5 79 63,1 62,5 63
    7,5 μM 100,1 100,5 100 71,6 73,9 73
    5 μM 103,4 104,8 104 77 76 77
    2,5 μM 110,1 108,9 110 88 88,8 88
    1,25 μM 108,7 109,3 109 90,7 90,8 91
    Tabelle 3A. Gerinnungsaktivität der Peptide A1/3 und A1/3-scr (vermischte Version von A1/3) in FVIII-Mangelplasma in entweder der Anwesenheit oder in der Abwesenheit (ohne) von 2,2 nM menschlichem FIXa.
  • Gezeigt sind zwei unabhängige repräsentative Experimente (Exp. 1 und Exp. 2). Alle Gerinnungsexperimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt. Angegeben sind die Gerinnungszeiten für die einzelnen Experimente und die mittlere Gerinnungszeit in Sekunden (sek). Die in Tabelle 3A gezeigten Experimente wurden unter Verwendung des aPTT-Reagens DAPTTIN (Baxter Hyland Immuno) durchgeführt. Verglichen mit der Pufferkontrolle (IZ, Imidazol-Puffer) führte das Peptid A1/3 zu einer dosisabhängigen Reduktion der Gerinnungszeit. Die Reduktion der Gerinnungszeit wurde durch das Hinzufügen von 2,2 nM aktiviertem menschlichem FIX zum Reaktionsgemisch sehr viel deutlicher. Die vermischte Version von Peptid A1/3, A1/3-scr3, zeigte keine Reduktion der Gerinnungszeit. In der Tat wirkte das vermischte Peptid bei Konzentrationen über 2,5 μM inhibierend und verlängerte daher die Gerinnungszeit. Die Peptide A1/1, A1/2, A1/4 und A1/5 ergaben keine Reduktion der Gerinnungszeit, was darauf hinweist, dass ihnen eine prokoagulierende Aktivität fehlt (Daten sind nicht gezeigt).
    Endkonz. ohne FIXa sek ohne FIXa sek Mittelwert sek 2,2 nM FIXa sek 2,2 nM FIXa sek Mittelwert sek
    IZ 0 131,8 132,1 132 107,9 108,7 108
    FVIII 12,5 mU/ml 68,9 69 69 52,9 53,6 53
    6,25 mU/ml 77,8 77,9 78 58,6 58,9 59
    A1/3
    15 μM 152,8 149,3 151 75,4 75,2 75
    10 μM 135,7 134,6 135 76,2 79,8 78
    5 μM 152,6 155,6 154 86,6 90,2 88
    1 μM 138,3 138,8 139 103,7 105,9 105
    Tabelle 3B. Gerinnungsaktivität von Peptid A1/3 in FVIII-Mangelplasma, wenn Pathromtin SL (DADE Behring) als aPTT-Reagens verwendet wird.
  • Die Experimente wurden in doppelter Ausführung, entweder in der Anwesenheit oder in der Abwesenheit (ohne) von 2,2 nM menschlichem FIXa durchgeführt. Angegeben sind die Gerinnungszeiten für die einzelnen Experimente und die mittlere Gerinnungszeit in Sekunden (sek). Faktor VIII und Imidazol-Puffer (IZ) wurden jeweils als Positiv- und Negativkontrolle eingeschlossen.
  • Im Gegensatz zu den in Tabelle 3A gezeigten Experimenten, wurden die in Tabelle 3B gezeigten Experimente unter Verwendung des aPTT-Reagens Pathromtin SL durchgeführt. In der Anwesenheit von FIXa führte das Peptid A1/3 zu einer do sisabhängigen Reduktion der Gerinnungszeit, während in der Abwesenheit von FIXa keine Reduktion der Gerinnungszeit nachweisbar war.
  • In einer anderen Reihe von Experimenten wollten wir die Plasmastabilität (Schutz vor z.B. proteolytischem Abbau) von Peptid A1/3 verbessern. Ein Ansatz war, die N- und C-terminalen L-Arg Reste mit D-Arg Resten zu substituieren (beispielhaft durch die Peptide A1/3-rd und A1/3-Rd-srmb gezeigt). Die Peptide A1/3-rd und A1/3-Rd-srmb (vermischte Version des Peptids) wurden anschließend sowohl in einem chromogenen, als auch in dem aPTT basierten Gerinnungsassay analysiert. Diese Experimente zeigten, dass ein Austauschen der terminalen L-Arg-Reste gegen D-Arg-Reste die FVIII ähnliche Aktivität, wie im chromogenen Assay gemessen, nicht änderte, was darauf hinweist, dass die Chiralität der Arg-Reste keinen große Rolle in der chromogenen Aktivität spielt (20). Zusätzlich war die aPTT basierte Einstufen-Gerinnungsaktivität, obwohl etwas reduziert, noch leicht nachweisbar (Tabelle 4).
    Peptidkonz. ohne FIXa sek ohne FIXa sek Mittelwert sek 2,2 nM FIXa sek 2,2 nM FIXa sek Mittelwert sek
    IZ 0 110 109,1 110 96 96 96
    A1/3 15 μM 77,8 78 78 56,1 55,5 56
    12,5 μM 99,4 100,5 100 65 68 67
    10 μM 104,4 104,5 104 72 73,2 73
    7,5 μM 105,2 105,2 105 80,7 80,5 81
    5 μM 108,4 107,7 108 89,7 88,3 89
    2,5 μM 107,9 107,6 108 93,6 93,3 93
    1,25 μM 106,7 107 107 94,4 95 95
    A1/3-Rd 15 μM 96,4 95,4 96 76,1 74,4 75
    12,5 μM 98 98,6 98 72,3 73,7 73
    10 μM 93,5 95,8 95 74,2 77,2 76
    7,5 μM 97,6 98,1 98 80,9 82,2 82
    5 μM 99,2 99,1 99 86 85,1 86
    2,5 μM 102,7 103,4 103 94,4 94,7 95
    1,25 μM 107,5 107,7 108 96,6 96 96
    A1/3-Rd-srmb 15 μM 121,9 121,3 122 112,7 112,4 113
    12,5 μM 117,2 118 118 108,1 107,8 108
    10 μM 115,8 115,3 116 107,2 107,8 108
    7,5 μM 114,6 113,6 114 107,6 106,6 107
    5 μM 113,1 112,4 113 108,5 108,2 108
    2,5 μM 111,9 111,9 112 105 104,2 105
    1,25 μM 107,2 107,1 107 101,1 105,3 103
    Tabelle 4. Einstufen-Gerinnungsaktivität der Peptide A1/3, A1/3-Rd und A1/3-Rd-srmb (Sequenzen siehe Tabelle 2). IZ, Pufferkontrolle.
  • 20 zeigt die unveränderte chromogene Aktivität von Peptid A1/3-Rd. Die Peptide bei einer Endkonzentration von 12 μM oder die Pufferkontrolle (IZ) wurden in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa (+) inkubiert. Es wurde gefunden, dass die chromogene Aktivität von Peptid A1/3 und A1/3-Rd nahezu unverändert blieb und im chromogenen Assay fast identische Ergebnisse ergab. Die vermischte Version von Peptid A1/3, A1/5 sowie der Puffer, ergaben keine erhebliche FXa-Erzeugung.
  • In der nächsten Reihe von Experimenten wollten wir die einzelne Rolle von jeder Aminosäure der Peptid-Kernsequenz durch Substituieren von jedem Rest mit der Aminosäure Alanin (Tabelle 5) bestimmen.
    Peptid Sequenz Amino-Säure # MW (D) pl Bemerkung
    A1/3 RRREGGGYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 18) (18AS) 2407 9,9 basischer pl, löslich
    A1/3-13 RRRAGGGYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 19) (18AS) 2349 10,4 E1-A1
    A1/3-1 RRREAGGYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 20) (18AS) 2421 9,9 G2-A2
    A1/3-2 RRREGAGYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 21) (18AS) 2421 9,9 G3-A3
    A1/3-3 RRREGGAYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 22) (18AS) 2421 9,9 G4-A4
    A1/3-4 RRREGGGAYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 23) (18AS) 2315 9,9 Y5-A5
    A1/3-5 RRREGGGYAVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 24) (18AS) 2315 9,9 Y6-A6
    A1/3-6 RRREGGGYYANWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 25) (18AS) 2379 9,9 V7-A7
    A1/3-7 RRREGGGYYVAWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 26) (18AS) 2364 9,9 N8-A8
    A1/3-8 RRREGGGYYVNAYFDRRR (SEQ. ID. NR. 27) (18AS) 2292 9,9 W9-A9
    A1/3-9 RRREGGGYYVNWAFDRRR (SEQ. ID. NR. 28) (18AS) 2315 9,9 Y10-A10
    A1/3-10 RRREGGGYYVNWYADRRR (SEQ. ID. NR. 29) (18AS) 2331 9,9 F11-A11
    A1-311 RRREGGGYYVNWYFARRR (SEQ. ID. NR. 30) (18AS) 2363 10,5 D12-A12
    A1/3-12-srmb RRRYVYNGWGYFEGARRR (SEQ. ID. NR. 31) (18AS) 2363 10,4 vermischte Version
    Tabelle 5.
  • Aufgeführt sind die Peptide, welche entworfen wurden, um die Rolle von jeder einzelnen Aminosäure innerhalb der Peptid-Kernsequenz (E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12) aufzuklären. Die tiefgestellten Ziffern beschreiben die Position der Aminosäure innerhalb des Peptids. Jede Aminosäure wurde mit Alanin, einer ungeladenen kleinen Aminosäure, substituiert ("Alanin-Scan"). Auch aufgelistet sind die Längen der Peptide (Aminosäuren #), die berechneten Molekulargewichte (MW, in Dalton (D)) und die statistischen isoelektrischen Punkte (pl).
  • Jedes der Peptide wurde einzeln in Imidazol-Puffer (50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,2) gelöst und nachfolgend in Gerinnungspuffer (50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, 1% menschliches Albumin, pH-Wert 7,4) auf die gewünschte Endkonzentration verdünnt. Die Peptide wurden auf ihre chromogene Aktivität, sowie auf ihre Fähigkeit, die Gerinnungszeit in einem FVIII-Mangelplasma zu reduzieren, analysiert. Der Einstufen-Gerinnungsassay wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (siehe Beispiel 6). Die Gerinnungszeiten (die Zeit vom Starten der Reaktion bis zur "Gerinnsel"-Bildung) wurden entweder mit einer Pufferkontrolle oder einem Kontrollpeptid (vermischte Version) verglichen.
  • Einige der Ergebnisse des "Alanin-Scans" sind für die Peptide A1/3-2 und A1/3-3 angegeben. Der Wechsel von G3-A3, wie beispielhaft in dem Peptid A1/3-2 gezeigt, ergibt eine hohe chromogene Aktivität und eine starke Reduktion der Einstufen-Gerinnungszeit (34 Sekunden bei einer Konzentration von 12,5 μM) in der Anwesenheit von 2,2 nM menschlichem FIXa. Peptide A1/3-3 (G4-A4) weist ein Optimum der chromogenen Aktivität bei einer Endkonzentration von ungefähr 12 μM mit abnehmender Aktivität bei entweder höheren oder niedrigeren Konzentrationen auf. Das Peptid wirkt in einem Einstufen-Gerinnungsassay bei höheren Konzentrationen (12,5 μM) in der Abwesenheit von FIXa etwas inhibierend, aber wird sehr aktiv in der Anwesenheit von 2,2 nM FIXa (31 Sekunden, 12,5 μM).
  • In der nächsten Reihe von Experimenten wollten wir die einzelne Rolle jeder Aminosäure der Peptid-Kernsequenz durch Substituieren jedes Kernrestes mit der Aminosäure Glutaminsäure (E) bestimmen (siehe Tabelle 6).
    Peptid Sequenz Aminosäuren MW (D) pl Bemerkung
    A1/3 RRREGGGYYVNWYFDRRR (18AS) 2407 9,9 basischer pl, löslich
    A1/3-22 RRREEGGYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 32) (18AS) 2479 9,5 G2-E2
    A1/3-23 RRREGEGYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 33) (18AS) 2479 9,5 G3-E3
    A1/3-24 RRREGGEYYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 34) (18AS) 2479 9,5 G4-E4
    A1/3-26 RRREGGGEYVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 35) (18AS) 2373 9,4 Y5-E5
    A1/3-27 RRREGGGYEVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 36) (18AS) 2373 9,4 Y6-E6
    A1/3-28 RRREGGGYYENWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 37) (18AS) 2437 9,5 V7-E7
    A1/3-29 RRREGGGYYVEWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 38) (18AS) 2422 9,5 N8-E8
    A1/3-30 RRREGGGYYVNEYFDRRR (SEQ. ID. NR. 39) (18AS) 2350 9,5 W9-E9
    A1/3-31 RRREGGGYYVNWEFDRRR (SEQ. ID. NR. 40) (18AS) 2373 9,4 Y10-E10
    A1/3-32 RRREGGGYYVNWYEDRRR (SEQ. ID. NR. 41) (18AS) 2389 9,5 F11-E11
    A1/3-33 RRREGGGYYVNWYFERRR (SEQ. ID. NR. 42) (18AS) 2421 9,9 D12-E12
    A1/3-34srmb RRRGEYGEYWNGDFYRRR (SEQ. ID. NR. 43) (18AS) 2437 9,5 vermischte Version
    Tabelle 6.
  • Aufgeführt sind die Peptide, welche entworfen wurden, um die Rolle jeder einzelnen Aminosäure innerhalb der Peptid-Kernsequenz (E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12) aufzuklären. Die tiefgestellten Ziffern beschreiben die Position der Aminosäure innerhalb des Peptids. Jede Aminosäure der Kernsequenz wurde mit Glutaminsäure, eine negativ geladene große Aminosäure, substituiert ("Glutaminsäure-Scan"). Auch aufgeführt sind die Längen des Peptids (Aminosäuren #), die berechneten Molekulargewichte (MW, in Dalton (D)) und die statistischen isoelektrischen Punkte (pl).
  • Jedes der Peptide wurde einzeln in Imidazol-Puffer (50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,2) gelöst und nachfolgend in Gerinnungspuffer (50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, 1% menschliches Albumin, pH-Wert 7,4) auf die gewünschte End konzentration verdünnt. Die aus der "Glutaminsäure-Scan"-Reihe abgeleiteten Peptide wurden sowohl auf ihre chromogene FVIII ähnliche Aktivität, als auch auf ihre Fähigkeit, die Gerinnungszeit in einem FVIII-Mangelplasma zu reduzieren, analysiert. Der Einstufen-Gerinnungsassay wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (siehe Beispiel 6).
  • Das Peptid A1/3-24 zeigte einige interessante Eigenschaften. Das Molekül wies eine hohe chromogene FVIII ähnliche Aktivität bei Konzentrationen zwischen 6,5 μM-12 μM auf, aber verlor an Aktivität bei höheren Konzentrationen (bis zu 24 μM). Das Peptid wies keine prokoagulierende Aktivität in der Abwesenheit von menschlichem FVIIIa auf, aber war sehr aktiv in der Anwesenheit von 2,2 nM hFIXa.
  • In einer zweiten Reihe von Experimenten wollten wir die prokoagulierende Aktivität von der vom Antikörper 198/B1 CDR3H abgeleiteten Peptidsequenz B1 verbessern. In einem ersten Schritt verbesserten wir die Löslichkeit der ursprünglichen Peptidsequenz (B1; EGGGFTVNWYFDV) durch Entfernen des C-terminalen Val-Restes und durch Hinzufügen mehrerer geladener Reste sowohl am N- als auch am C-terminalen Ende des Peptids. Die sich ergebenden Peptide B1/4, B1/6 (saurer pl), B1/7 (basischer pl) und ihre vermischten Versionen B1/5, B1/7scr3 sind in einer Vielzahl von Puffersystemen bei physiologischem pH-Wert leicht löslich.
    Peptid Sequenz Aminosäuren MW (D) pl Bemerkung
    B1 EGGGFTVNWYFDV (SEQ. ID. NR. 44) (13AS) 1491 6,0 verminderte Löslichkeit
    B1/4 REGGGFTVNWYFDR (SEQ. ID. NR. 45) (14AS) 1704 7,9 löslich
    B1/5 FGVGYRGETRNFDW (SEQ. ID. NR. 46) (14AS) 1704 8,0 vermischte Version, löslich
    B1/6 EEEEGGGFTVNWYFDEEE (SEQ. ID. NR. 47) (18AS) 2166 5,0 saurer pl, löslich
    B1/7 RRREGGGFTVNWYFDRRR (SEQ. ID. NR. 48) (18AS) 2329 9,9 basischer pl, löslich
    B1/7scr3 RRRFGVGYGETNFDWRRR (SEQ. ID. NR. 49) (18AS) 2329 9,9 basischer pl, löslich, vermischte Version
  • Tabelle 7 stellt eine Auflistung einer Reihe von vom Antikörper 198/B1 abgeleiteten Peptiden dar. Aufgeführt sind die Länge des Peptids (AS, Aminosäuren #), das berechnete Molekulargewicht (MW, in Dalton (D)) und der statistische isoelektrische Punkt (pl).
  • Die Peptide B1/4 und B1/5 waren in 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH-Wert 6,5, löslich. Beide Peptide wurden in einem chromogenen FVIII-Assay analysiert. Für Peptid B1/4, aber nicht für die vermischte Version B1/5, wurde gefunden, dass es etwas chromogene Aktivität aufwies (Daten sind nicht gezeigt).
  • Nachfolgend wurden die Peptide B1/6, B1/7 und B1/7scr3 analysiert. Jedes der Peptide wurde einzeln in 50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,2, gelöst und nachfolgend entweder in Gerinnungspuffer (50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, 1% menschliches Albumin, pH-Wert 7,4) oder in Imidazol-Puffer auf die gewünschte Endkonzentration verdünnt. Die Peptide wurden sowohl auf ihre chromogene Aktivität, als auch auf ihre Fähigkeit, die Gerinnungszeit in einem FVIII-Mangelplasma zu reduzieren, analysiert (Tabelle 8 & 9). Der Einstufen-Gerinnungsassay wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (siehe Beispiel 6). Die Gerinnungszeiten (die Zeit vom Starten der Reaktion bis zur "Gerinnsel"-Bildung) wurden entweder mit einer Pufferkontrolle oder einem Kontrollpeptid (vermischte Version) verglichen.
  • Die FIXa aktivierende Aktivität (FVIII-Kofaktor ähnliche Aktivität) von Peptid B1/7 wurde zuerst in dem oben beschriebenen chromogenen Assay gemessen.
  • Wie in 21 gezeigt, führte das Hinzufügen von 2,4 μM Peptid B1/7 zum Reaktionsgemisch zu einer gut messbaren Erzeugung von FXa. Im Gegensatz dazu ergab das Hinzufügen von 35 μM Pefabloc Xa, einem spezifischen Inhibitor der FXa-Proteaseaktivität, eine erhebliche Reduktion der chromogenen Substratspaltungsreaktion (22), wodurch nachgewiesen wurde, dass dort in der Tat eine Peptid-FIXa vermittelte FXa-Erzeugung vorlag. Wenn kein FIXa und FX zum Reaktionsgemisch hinzugefügt wurden, wurde kein FXa synthetisiert (22). Peptide B1/6 und die Kontrollpeptide B1/5 und B1/7scr3 wiesen keine Aktivität auf (Daten sind nicht gezeigt).
  • 21 zeigt die chromogene Aktivität von Peptid B1/7. Das Peptid bei einer Endkonzentration von 2,4 μM oder die Pufferkontrolle (IZ) wurden in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa inkubiert.
  • In 22 wurden Peptid B1/7 bei einer Endkonzentration von 2,4 μM oder die Pufferkontrolle (IZ) in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa inkubiert (wie entweder durch "+2,3 nM hFIXa" oder "+" dargestellt). Für die chromogene Aktivität von Peptid B1/7 wurde gefunden, dass sie abhängig von der Anwesenheit von FIXa und FX ist, da keine Reaktion nachweisbar ist, wenn FIXa und FX aus der Reaktion weggelassen werden (ohne FIXa/FX). Um nachzuweisen, dass das Peptid B1/7 in der Tat eine FXa-Erzeugung vermittelt, wurde der FXa spezifische Proteaseinhibitor Pefabloc Xa zum Reaktionsgemisch hinzugefügt (35 μM Pefabloc Xa).
  • In einem zweiten Satz von Experimenten wurde die prokoagulierende Wirkung der Peptide B1/6, B1/7 und B1/7scr3 in einem aPTT basierten Einstufen-Koagulationsassay getestet. Die Experimente wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 6 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 8 und 9 gezeigt.
    Peptid 12,5 μM (–) 1,25 μM (–) 0,125 μM (–) 12,5 nM (–) Puffer (–) Bemerkungen
    B1/6 115 110 111 111 110
    B1/7 157 112 109 110 110
    B1/7scr3 115 105 106 105 107
    Tabelle 8.
  • FVIII-Mangelplasma wurde entweder mit Peptid B1/6, B1/7scr3 oder B1/7 in der Abwesenheit von aktiviertem menschlichen FIX inkubiert. Als eine Negativkontrolle wurde reiner Puffer zum Mangelplasma hinzugefügt. Die Gerin nungszeiten für die verschiedenen Kombinationen sind angegeben. Unter diesen Bedingungen wirkt Peptid B1/7 bei seiner höchsten Konzentration (12,5 μM) inhibierend auf den Koagulationsprozess, wie durch die verlängerte Gerinnungszeit von 157 Sekunden gezeigt wird.
    Peptid 12,5 μM (+) 1,25 μM (+) 0,125 μM (+) 12,5 nM (+) Puffer (+) Bemerkungen
    B1/6 103 100 101 100 100
    B1/7 83 92 99 99 100
    B1/7scr3 102 94 94 94 94
    Tabelle 9.
  • FVIII-Mangelplasma wurde entweder mit Peptid B1/6, B1/7scr3 oder B1/7 in der Anwesenheit von aktiviertem menschlichen FIXa inkubiert. Als eine Negativkontrolle wurde reiner Puffer zum Mangelplasma hinzugefügt. Die Gerinnungszeiten für die verschiedenen Kombinationen sind angegeben. In der Anwesenheit von FIXa wirkt Peptid B1/7 prokoagulierend, wie durch die reduzierte Gerinnungszeit (83 Sekunden verglichen mit 102 Sekunden für das vermischte Peptid und 100 Sekunden für die Pufferkontrolle) gezeigt wird.
  • Beispiel 12: Prokoagulierende Aktivität der Peptidderivate, welche aus den CDR3-Regionen der Anti-FIX/FIXa-Antikörper erhalten wurden, in FVIII-Inhibitorplasma
  • Um die prokoagulierende Aktivität von Peptid A1/3 in FVIII-Inhibitorplasma zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Wir führten einen Standard aPTT basierten Einstufen-Gerinnungsassay durch, verwendeten aber anstelle von FVIII-Mangelplasma FVIII-Inhibitorplasma. Die inhibierende Wirkung des Plasmas betrug 8,1 Bethesda Einheiten pro ml.
    ohne FIXa ohne FIXa FIXa FIXa
    Peptidkonz. sek sek Mittelwert sek sek sek Mittelwert sek
    IZ 0 104,8 103,6 104 94,2 94,1 94
    A1/3 12,5 μM 85,8 85,3 86 61 60,2 61
    10 μM 88,4 87,9 88 61,3 61,8 62
    7,5 μM 93,7 92,7 93 68,8 70,9 70
    5 μM 101,5 101,1 101 81 82 82
    2,5 μM 106,1 105,3 106 90,2 90,5 90
    1,25 μM 104,5 104,3 104 91,3 91,4 91
    Tabelle 10.
  • Verschiedene Mengen Peptid A1/3 (12,5 μM-1,25 μM) wurden zu FVIII-Inhibitorplasma hinzugefügt (entweder in der Anwesenheit (FIXa) von 2,2 nM FIXa oder in der Abwesenheit (ohne FIXa)). Als eine Negativkontrolle wurde reiner Puffer zu dem Plasma hinzugefügt (IZ). Die Experimente wurden in doppelter Ausführung durchgeführt, und der Mittelwert (Mittelw.) wurde berechnet. Die Gerinnungszeiten (in Sekunden) für die verschiedenen Kombinationen sind angegeben. Es ist leicht zu erkennen, dass das Peptid A1/3 (in einer dosisabhängigen Weise) die Gerinnungszeit von FVIII-Inhibitorplasma in der Anwesenheit von FIXa reduziert, aber, wenn auch in einem viel geringeren Ausmaß, auch in der Abwesenheit von FIXa.
  • Beispiel 13: Umwandeln des 196/C4 IgM in IgG1
  • Da einige IgM-Antikörper eine hohe FVIII ähnliche Aktivität in chromogenen Assays zeigen, wurden Versuche unternommen, solche IgM-Antikörper in IgG-Antikörper umzuwandeln (Antikörperderivate, wie Fab, F(ab)2, scFv, usw. können jedoch auch hergestellt werden). Die Wiederherstellung bzw. der Rescue der Gene der IgM variablen Region wird unten im Detail beschrieben. Der Expressionsvektor pBax-IgG1 (23) wurde zuerst aus den Vektoren pSI (Promega) und pEF/Bsd (Invitrogen) durch mehrfache Klonierungsschritte konstruiert. B-Lymphozyten eines Spenders wurden aus Blut aufgereinigt, und reife mRNA wurde aus diesen Zellen unter Verwendung des "micro-mRNA purification-kit" (Phar macia) aufgereinigt. Die cDNA einer menschlichen Kappa-Kette und einer menschlichen Gamma-1-Kette wurde unter Verwendung des "you-primefirststrand-cDNA-kit" (Pharmacia) unter Verwendung spezifischer Primer hergestellt.
  • Die kodierende Sequenz einer konstanten Domäne der menschlichen leichten Kappa-Kette wird aus der cDNA durch eine PCR unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert.
  • Das Gen einer konstanten Region der menschlichen Gamma-1-Kette (CH1-Gelenk bzw. Hinge-CH2-CH3) wird aus der cDNA durch eine PCR unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert.
  • Das PCR-Produkt der konstanten Domäne der leichten Kette wird mit XbaI und NheI gespalten und in gespaltenen pSI eingefügt. Der sich ergebende Vektor wird mit EcoRI und XbaI gespalten, und die gebundenen Oligonukleotide werden eingefügt, was zum Vektor pSI-Ckappa führt. Die gebundenen Oligonukleotide stellen die Leader- und die SacI-XbaI-Stellen für das Einfügen der variablen Region der Kappa-Kette bereit. Das PCR-Produkt der konstanten Region der menschlichen Gamma-1-Kette wird mit SpeI und BamHI gespalten und in gespaltenen pSI eingefügt. Der sich ergebende Vektor wird mit SpeI und NotI gespalten und die gebundenen Oligonukleotide werden eingefügt, was zum Vektor pSI-Cgamma führt. Die gebundenen Oligonukleotide stellen die Leader- und die XhoI-BstEI-Stellen für das Einfügen der variablen Region der schweren Kette bereit. Der Vektor pEF/Bsd wird mit NheI und SfiI gespalten, durch eine Klenow-Behandlung werden glatte Enden erzeugt, und die gesamte Expressionskassette von pSI-Ckappa, mit BglII und BamHI ausgeschnitten, wird eingefügt (nach der Klenow-Behandlung). Der sich ergebende Vektor wird mit EcoRI und HindIII gespalten und mit Klenow behandelt. Die gesamte Expressionskassette von pSI-Cgamma wird mit BglII und BamHI ausgeschnitten und eingefügt (nach der Klenow Behandlung). Der sich ergebende Vektor wird pBax-IgG1 genannt.
  • Die variable Region der leichten Kette kann zwischen die SacI-XbaI-Stellen eingefügt werden, was die vollständige kodierende Sequenz einer leichten Kappa-Kette ergibt. Die variable Region der schweren Kette kann zwischen die XhoI-BstEI-Stellen kloniert werden, was zu einem vollständigen IgG1 schwere Ketten-Gen führt. Beide offene Leserahmen werden unter der Kontrolle des SV40-Promotors exprimiert und beinhalten die kodierende Sequenz eines Signalpeptids am 5'-Ende der Gene für die Sekretion der schweren und leichten Ketten in das endoplasmatische Retikulum. Eine Transfektion in COS-Zellen erlaubt die Expression eines IgG1 mit denselben Bindungseigenschaften wie das Ausgangs-IgM.
  • Die Konstruktion des Plasmids pBax-196/C4 wird weiterhin durch Amplifizieren der VH des 196/C4 scFv (subkloniert wie in Experiment 10 beschrieben) durch eine PCR unter Verwendung spezifischer Primer erreicht. Das PCR-Produkt wird mit XhoI und BstEII gespalten und in pBax-IgG1, welcher mit XhoI und BstEII gespalten wurde, eingefügt. Die VL des 196/C4 scFv wird durch eine PCR unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit SacI und XbaI gespalten und in pBax IgG1-VH, welcher mit SacI und XbaI gespalten wurde, eingefügt. Der sich ergebende Vektor (pBax-196/C4) wird durch Elektroporation in COS-Zellen transfiziert, und IgG1-Hybridmoleküle (variable Region der Maus und menschliche konstante Region) mit derselben Spezifität wie das Ausgangs-IgM werden exprimiert.
  • Beispiel 14: Aktivierung der amidolytischen Aktivität von FIXa durch Anti-FIXa-Antikörper
  • In Kürze, 20 μl Faktor IXa (200 mU FIXa enthaltend (Stago)) wurden bei 37°C mit 200 μl Reaktionspuffer (500 mM TrisHCl, pH-Wert 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2 und 40% Ethylenglykol), 25 μl FIXa-Substrat (CH3SO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA, AcOH, 10 μM/ml, Pentapharm LTD) in der Abwesenheit oder Anwesenheit von verschiedenen Mengen der Anti-FIX-Antikörper 198/B1 (IgG-Isotyp) oder 196/AF1 (IgM-Isotyp) inkubiert. Eine spezifische Spaltung des FIXa-Substrats wurde bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät überwacht.
  • Die Anwesenheit der Anti-FIX-Antikörper verstärkte die amidolytische Aktivität von FIXa mindestens 2-fach.
  • 24 zeigt den Anstieg der amidolytischen Aktivität von FIXa in der Anwesenheit von Antikörper 198/B1 (24A) und Antikörper 198/AF1 (24B).
  • Beispiel 15: FVIII ähnliche Aktivität, welche Fab-Fragmente aufweisen, die von Anti-FIX/FIXa-Antikörpern abgeleitet wurden
  • Fab-Fragmente von Anti-FIX/FIXa-Antikörpern wurden hergestellt und gemäß Standardprotokollen aufgereinigt. In Kürze, 1 ml Antikörper 198/A1 (4 mg/ml in 50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,4) wurde über Nacht mit 87 μl Fragmentationspuffer (1 M Na-Acetat, 10 mM EDTA, 67,5 mg/ml L-Cystein) und 0,25 mg Papain (auf Agarosekügelchen immobilisiert) bei 37°C inkubiert. Die Präparation wurde gefiltert, um das Papain zu entfernen. L-Histidin wurde hinzugefügt (Endkonzentration 50 mM) und danach wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Abschließend wurde festes NaCl hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 M zu ergeben.
  • Nachfolgend wurde das 198/A1-Fab-Fragment durch Binden an Protein L aufgereinigt: Wir verwendeten ImmunoPure Immobilized PROTEIN L Plus (Pierce) in einer PHARMACIA XK 16/20 Säule (Gelvolumen: 2 ml). Puffer für die Chromatographie waren: 1) Äquilibrierungspuffer: 50 mM L-Histidin, pH-Wert 7,0, 1 M NaCl, 0,1% (Gew./Vol.) NaN3; 2) Waschpuffer: 50 mM L-Histidin, pH-Wert 7,0; 0,1% (Gew./Vol.) NaN3; 3) Elutionspuffer: 100 mM Glycin, pH-Wert 2,5, 0,1% (Gew./Vol.) NaN3 und 4) Neutralisationspuffer: 2 M Tris/Cl pH-Wert 8,0.
  • Die Chromatographie wurde im Wesentlichen durch Befolgen der in Tabelle 11 beschriebenen Schritte 1 bis 7 durchgeführt. Um den niedrigen pH-Wert des Elutionspuffers zu neutralisieren, wurden die "Fraktionsröhrchen" vorher mit 0,2 ml 2 M Tris, pH-Wert 8,0, beladen.
    SCHRITT PUFFER Fließgeschwindigkeit Vol. CV Fraktionen
    1. Säulenwaschschritt Elutionspuffer 2,0 ml/min 10 ml 5 Abfall
    2. Äquilibrierung Äqui.-Puffer 2,0 ml/min 10 ml 5 Abfall
    3. Probenbeladung Probe 1,0 ml/min x ml x Durchfluss
    4. Waschschritt 1 Äqui.-Puffer 1,0 ml/min 20 ml 10 Durchfluss
    5. Waschschritt 2 Waschpuffer 1,0 ml/min 10 ml 5 Durchfluss
    6. Elution Elutionspuffer 1,0 ml/min 15 ml 7,5 1,0 ml Fraktionen
    7. Neutralisation Waschpuffer 2,0 ml/min 10 ml 5 Abfall
    Tabelle 11.
  • Die endgültige 198/A1-Fab-Präparation wurde gegen 50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,4, dialysiert und in einem wie oben beschriebenen chromogenen FVIII-Assay analysiert (25). Verglichen mit einem intakten Antikörper weist das 198/A1-Fab-Fragment eine etwas geringere Aktivität auf, das Fab-Fragment führt jedoch noch zu einer FIXa abhängigen FXa-Erzeugung.
  • 25 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität des Antikörper 198/A1-Fab-Fragments in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle verwendeten wir sowohl den intakten Antikörper 198/A1, als auch 7,5 pM FVIII. Eine Pufferkontrolle (IZ) anstelle von 198/A1-Fab-Fragment oder FVIII wurden als eine Negativkontrolle verwendet.
  • Beispiel 16: FVIII ähnliche Aktivität, welche Fusionsproteine aus scFv-Fragmenten von Anti-FIX/FIXa-Antikörpern und E. coli alkalischer Phosphatase aufweisen
  • Das Einzelketten-Fv-Fragment (siehe Beispiel 10) von Antikörper 198/B1 (Subklon AB2) wurde an den N-Terminus von E. coli alkalischer Phosphatase unter Verwendung des pDAP2 Vektorsystems fusioniert (Kerschbaumer et al., 1996). Zwei identische Klone wurden isoliert und als pDAP2-198AB2#1 und pDAP2-198AB2#100 bezeichnet (26). Die sich ergebenden Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, mit einer Metallaffinitätschromatographie (Kerschbaumer et al., 1997) aufgereinigt und in einem Standard chromogenen Assay analysiert (27).
  • 27 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität von zwei Antikörper 198/B1 (Subklon AB2) scFv-Fragment-alkalische Phosphatase Fusionsproteinen (198AB2#1 und 198AB2#100) in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle verwendeten wir 7,5 pM FVIII.
  • Beispiel 17: FVIII ähnliche Aktivität, welche ein bivalenter Miniantikörper aufweist
  • Um einen bivalenten Miniantikörper zu erhalten, wurde das scFv-Fragment von Antikörper 198/B1 (Subklon AB2) an eine amphipathisch helikale Struktur unter Verwendung des pZip1 Vektorsystems (Kerschbaumer et al. (Analytical Biochemistry 249, 219-227, 1997)) fusioniert. In Kürze, das Gen des 198/B1 scFv-Fragments wurde aus dem Plasmid pDAP-198AB2#100 (Beispiel 16) durch Spaltung mit SfiI und NotI isoliert. Das DNA-Fragment wurde über ein Gel aufgereinigt und in den mit SfiI/NotI gespaltenen Vektor pZip1 eingefügt. Das sich ergebende Plasmid wurde sequenziert und als pZip-198AB2#102 bezeichnet (28). Parallel dazu konstruierten wir eine Miniantikörperversion aus einem nicht zur Sache gehörigen monoklonalen Antikörper, welcher #8860 genannt wurde. In einem ersten Schritt wurde das Einzelketten-Fv-Fragment des Antikörpers #8860 im Vektor pDAP2 zusammengefügt. Das Klonieren wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt. Das Konstrukt wurde pDAP2-8860scFv#11 genannt (29). Subklonieren des scFv-Fragments, welches in pDAP2-8860scFv#11 enthalten war, in Plasmid pZip1 (siehe oben) ergab das Miniantikörperkonstrukt p8860-Zip#1.2 (30). Da der Antikörper #8860 nicht mit FIX/FIXa reagiert (wie durch einen Western Blot und eine ELISA-Analyse belegt wurde), stellt er eine geeignete Negativkontrolle dar. Nachfolgend wurden die Miniantikörperproteine in E. coli exprimiert und aus Bakterienüberständen durch Binden an Protein L gemäß dem folgenden Protokoll aufgereinigt: Für eine Affinitätschromatographie verwendeten wird ImmunoPure Immobilized PROTEIN L Plus (Pierce) in einer PHARMACIA XK 16/20 Säule, welche ein Gelvolumen von 4 ml aufwies. Verwendete Puffer waren: 1) Aquilibrierungspuffer: 50 mM L-Histidin, pH-Wert 7,0, 1 M NaCl, 0,1% (Gew./Vol.) NaN3; Waschpuffer: 50 mM L-Histidin, pH-Wert 7,0, 0,1% (Gew./Vol.) NaN3; Elutionspuffer: 100 mM Glycin, pH-Wert 2,5, 0,1% (Gew./Vol.) NaN3 und Neutralisationspuffer: 2 M Tris/Cl, pH-Wert 8,0.
  • Die Proben wurden wie folgt hergestellt: Der Überstand der Bakterienkultur wurde durch Zentrifugieren der Bakterienexpressionskultur (11.000 × g, 4°C, 10 Minuten) erhalten. 470 g Ammoniumsulfat wurden zu 1 Liter Überstand hinzugefügt, und die Lösung wurde für 1 Stunde auf Eis gerührt, um das Protein zu präzipitieren. Das Präzipitat wurde bei 14.000 × g für 35 Minuten bei 2°C pelletiert und in 100 ml 20 mM Tris, pH-Wert 7,0, wieder gelöst. Nachfolgend wurde das Konzentrat gegen 20 mM Tris, pH-Wert 7,0, dialysiert, L-Histidin wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mM hinzugefügt, und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Abschließend wurde festes NaCl hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 1 M zu ergeben. Vor der Beladung auf die Säule wurde eine Probe erst bei 16.000 × g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend durch einen sterilen 0,45 μm Filter gefiltert.
  • Die Chromatographie wurde im Wesentlichen durch Befolgen der in Tabelle 12 beschriebenen Schritte 1 bis 7 durchgeführt. Um den niedrigen pH-Wert des Elutionspuffers zu neutralisieren, wurden die "Fraktionsröhrchen" vorher mit 0,2 ml 2 M Tris, pH-Wert 8,0, beladen.
    SCHRITT PUFFER Fließgeschwindigkeit Vol. CV Fraktionen
    1. Säulenwaschschritt Elutionspuffer 2,0 ml/min 20 ml 5 Abfall
    2. Äquilibrierung Äqui.-Puffer 2,0 ml/min 20 ml 5 Abfall
    3. Probenbeladung Probe 1,0 ml/min x ml x Durchfluss
    4. Waschschritt 1 Äqui.-Puffer 1,0 ml/min 40 ml 10 Durchfluss
    5. Waschschritt 2 Waschpuffer 1,0 ml/min 20 ml 5 Durchfluss
    6. Elution Elutionspuffer 1,0 ml/min 30 ml 7,5 1,0 ml Fraktionen
    7. Neutralisation Waschpuffer 2,0 ml/min 20 ml 5 Abfall
    Tabelle 12.
  • Die endgültige 198/B1 (Subklon AB2) Miniantikörperpräparation (als 198AB-Zip#102 bezeichnet) und die Negativkontrolle 8860-Zip#1.2 wurden gegen 50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,4, dialysiert und in einem wie oben beschriebenen chromogenen FVIII-Assay analysiert (31).
  • Wie in 31 erkannt werden kann, führt das Miniantikörperkonstrukt 198AB-Zip#102 zu einer wesentlichen FXa-Erzeugung (vergleiche mit FVIII), während der Negativkontrollen-Miniantikörper 8860-Zip#1.2 dies nicht tut.
  • 31 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität des 198/B1 (Subklon AB2) Miniantikörpers 198AB-Zip#102 in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle verwendeten wir 4,8 pM FVIII, während ein nicht zur Sache gehöriger Miniantikörper (8860-Zip#1.2) und reiner Reaktionspuffer (IZ) als Negativkontrollen dienten.
  • Beispiel 18: FVIII ähnliche Aktivität, welche Anti-FIXa/FIX-Antikörper scFv-Fragmente aufweisen
  • Das Einzelketten-Fv-Fragment von Antikörper 198/B1 (Subklon AB2), sowie das scFv-Fragment von Antikörper #8860 wurden unter Verwendung des pMycHis6-Vektorsystems exprimiert. Der Vektor pMycHis6 (32 & 33) wurde durch Spal ten des Vektors pCOCK (Engelhardt et al., 1994, Biotechniques, 17: 44-46) mit NotI und EcoRI und durch Einfügen der folgenden Oligonukleotide konstruiert: mychis6-co: 5' ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3' (SEQ. ID. NR. 79) und mycchis-ic: 5' aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttctgagatgagtttttgttctgc 3' (SEQ. ID. NR. 80).
  • 32 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids pMycHis6. Die c-myc-Tag-Sequenz wird verwendet, um das scFv-Fragment in einer ELISA oder einer Western Blot Analyse nachzuweisen (Evan et al., Mol. Cell. Biol., 1985, 5(12), S. 3610-6). Die His6-Tag-Sequenz wurde eingeschlossen, um die Aufreinigung der scFv-Fragmente durch eine Metallionenchromatographie zu erleichtern (Hochuli et al., 1998, Biotechnology, 6: 1321-1325). Das Plasmid enthält den Promotor des lacZ-Gens (PlacZ), die PelB-Leader-Sequenz (siehe Legende 26), einen E. coli Replikationsursprung (colE1ori) und einen M13 Phagen Replikationsursprung (M13ori). Um eine spezifische Selektion zu erlauben, trägt das Plasmid auch das Gen für das Enzym β-Lactamase (AmpR), was eine Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin vermittelt.
  • Das Gen des 198/B1 (Klon AB2)-scFv wurde aus Plasmid pDAP2-198AB2#100 (Beispiel 16) durch Spaltung mit SfiI und NotI wiederhergestellt und in einen mit SfiI/NotI gespaltenen pMycHis6 eingefügt. Das sich ergebende Plasmid wurde als pMycHis-198AB2#102 bezeichnet. 34 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von 198AB2-scFv (verbunden mit dem c-myc-Tag und dem His6-Tag): Der sich ergebende OLR des Expressionsvektors wird pMycHis6-198AB2#102 genannt. Der Vektor pMycHis6 wurde durch Spalten des Vektors pCOCK (Engelhardt O. et al., BioTechniques 17, 44-46, 1994) mit NotI-EcoRI und Einfügen der folgenden gebundenen Oligonukleotide konstruiert: (5'-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG-3' (SEQ. ID. NR. 103) und 5'-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC-3' (SEQ. ID. NR. 104)). Der sich ergebende Vektor, pMycHis6 genant, wurde mit SfiI-NotI gespalten, und das Gen des scFv-198AB2 wurde aus Vektor pDAP2-198AB2#100 in diesen Vektor umgelagert.
  • In Analogie zu dem 198AB2-Konstrukt wurde das #8860-scFv-Fragment aus einem Plasmid, welches als pDAP2-8860scFv Klon 11 bezeichnet wurde, kloniert. Das reine scFv-Protein von #8860 wurde als 8860-M/H#4c bezeichnet (Plasmid p8860-M/H#4c, 35). Die scFv-Proteine wurden in E. coli exprimiert und aus Bakterienüberständen auf Protein L Säulen affinitätsaufgereinigt (siehe Beispiel 17). Die endgültigen MycHis-198AB2#102 und 8860-M/H#4c Präparationen wurden gegen 50 mM Imidazol, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,4, dialysiert und in einem wie oben beschriebenen chromogenen FVIII-Assay analysiert (36).
  • Wie in 36 gesehen werden kann, führte das scFv-Konstrukt MycHis-198AB2#102 zu einer wesentlichen FXa-Erzeugung, während die Negativkontrollen 8860-M/H#4c und reiner Reaktionspuffer (IZ) dies nicht taten.
  • 36 zeigt die chromogene FVIII ähnliche Aktivität des 198/B1 (Subklon AB2) scFv-Fragments (MycHis-198AB2#102) in der Anwesenheit von 2,3 nM menschlichem FIXa. Als eine Positivkontrolle verwendeten wir 4,8 pM FVIII, während ein nicht zur Sache gehöriges scFv (8860-M/H#4c) und reiner Reaktionspuffer (IZ) als Negativkontrollen dienten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (21)

  1. Antikörper gegen Faktor IX/Faktor IXa, der eine Faktor VIIIa-Kofaktor-Aktivität aufweist und die prokoagulierende Aktivität von FIXa erhöht.
  2. Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper die prokoagulierende Aktivität von FIXa in der Anwesenheit von FVIII-Inhibitoren erhöht.
  3. Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus IgG-, IgM-, IgA- und IgE-Antikörpern.
  4. Antikörper nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus monoklonalen Antikörpern, chimären Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Einzelkettenantikörpern, bispezifischen Antikörpern, Diabodies, scFv, Fab, F(ab)2, und Di-, Oligo- oder Multimeren davon.
  5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das komplementäritätsbestimmende Region (CDR)-Peptid ein CDR3-Peptid ist, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr und Asp-Gly-Gly-His-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Phe-Asp-Tyr.
  6. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleotidsequenz, welche die variable Region des Antikörpers kodiert, die Nukleotide 1 bis 357 und die Nukleotide 403 bis 726 nach 14 umfaßt.
  7. Antikörper nach Anspruch 6, wobei der Antikörper zusätzlich eine künstliche Verbindungs (Linker)-Sequenz umfaßt.
  8. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleotidsequenz, welche die variable Region des Antikörpers kodiert, die Nukleotide 1 bis 363 und die Nukleotide 409 bis 747 nach 15 umfaßt.
  9. Antikörper nach Anspruch 8, wobei der Antikörper zusätzlich eine künstliche Verbindungs (Linker)-Sequenz umfaßt.
  10. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleotidsequenz, welche die variable Region des Antikörpers kodiert, die Nukleotide 1 bis 366 und die Nukleotide 412 bis 747 nach 16 umfaßt.
  11. Antikörper nach Anspruch 10, wobei der Antikörper zusätzlich eine künstliche Verbindungs (Linker)-Sequenz umfaßt.
  12. Hybridomazelllinie, welche einen Antikörper gegen Faktor IX/Faktor IXa nach einem der Ansprüche 1 bis 11 exprimiert.
  13. Hybridomazelllinie nach Anspruch 12, wobei die Zelllinie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 198/B1 ECACC Nr. 99090925; 198/A1 ECACC Nr. 99090924; 198/BB1 ECACC Nr. 99090926; 193/A0 ECACC Nr. 99121614; 196/C4 ECACC Nr. 99121615; 198/D1 ECACC Nr. 99121616; 198/T2 ECACC Nr. 99121617; 198/G2 ECACC Nr. 99121618; 198/AC1 ECACC Nr. 99121619; 198/U2 ECACC Nr. 99121620.
  14. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der von einer Hybridomazelllinie nach Anspruch 12 oder 13 exprimiert ist.
  15. DNA-Molekül, wobei das DNA-Molekül einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, zusätzlich umfassend Faktor IXaα und/oder Faktor IXaβ.
  18. Verfahren zum Erhalten eines Antikörpers nach Anspruch 1, umfassend die Schritte: – Immunisieren eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Antigen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Faktor IX, Faktor IXaα, Faktor IXaβ oder Fragmenten davon; – Isolieren von Milzzellen des immunisierten Säugetiers; – Herstellen von Hybridomaklonen; – Screenen der Hybridomazellüberstände nach einem Anstieg der prokoagulierenden Aktivität von Faktor IXa; – Isolieren der Hybridomaklone, welche die Antikörper exprimieren; und – Isolieren der Antikörper.
  19. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 und 2 in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Blutgerinnungsstörung in einem Patienten.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Blutgerinnungsstörung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hämophilie A und hämorrhagischer Diathese.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei die Patienten Hämophilie-Inhibitor-Patienten sind.
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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7563874B2 (en) 1998-08-31 2009-07-21 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
IT1306704B1 (it) * 1999-05-26 2001-10-02 Sirs Societa Italiana Per La R Anticorpi monoclonali e suoi derivati sintetici o biotecnologici ingrado di agire come molecole antagoniste per il ngf.
AT411997B (de) * 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
US7297336B2 (en) * 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
JP5438880B2 (ja) * 2003-10-10 2014-03-12 中外製薬株式会社 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
JP5490734B2 (ja) * 2003-10-10 2014-05-14 中外製薬株式会社 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
AU2003271186A1 (en) 2003-10-14 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
US20100003254A1 (en) * 2005-04-08 2010-01-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody Substituting for Function of Blood Coagulation Factor VIII
EP1760092A1 (de) * 2005-08-26 2007-03-07 Applied Research Systems ARS Holding N.V. System für Screening von Zellen mit hoher Expression von einem interessierenden Protein
EP4342995A3 (de) 2006-03-31 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Verfahren zur kontrolle der blut-pharmazeutizität von antikörpern
EP4218801A3 (de) 2006-03-31 2023-08-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antikörpermodifizierungsverfahren zur reinigung eines bispezifischen antikörpers
ES2435437T3 (es) 2006-12-07 2013-12-19 Novartis Ag Anticuerpos antagonistas contra Ephb3
US8598321B2 (en) 2007-03-22 2013-12-03 The Regents Of The University Of California Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
WO2009041643A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cdrのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
CN102559644B (zh) * 2007-09-28 2015-03-25 普托拉制药有限公司 用于因子xa抑制剂的解毒剂和其使用方法
AR071478A1 (es) * 2008-04-17 2010-06-23 Baxter Healthcare Sa Peptidos de bajo peso molecular con actividad procoagulante para el tratamiento de pacientes con deficiencia de factor v (fv), fvii, fviii, fx y/o fxi
WO2010014854A2 (en) 2008-07-31 2010-02-04 The Regents Of The University Of California Antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
JP2009292822A (ja) * 2009-07-23 2009-12-17 Chugai Pharmaceut Co Ltd 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
WO2011080322A1 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method of prognosing the outcome of acquired hemophilia and of treatment of hemophilia
WO2012047427A2 (en) 2010-08-31 2012-04-12 The Regents Of The University Of California Antibodies for botulinum neurotoxins
PT2644698T (pt) * 2010-11-17 2018-01-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula multiespecífica de ligação ao antigénio com uma função alternativa à função do fator viii de coagulação do sangue
EP2717898B1 (de) 2011-06-10 2018-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Gerinnungsfördernde verbindungen und anwendungsverfahren dafür
PL220297B1 (pl) * 2012-11-07 2015-10-30 Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności& Epitop i jego zastosowanie
AU2014325063B2 (en) 2013-09-27 2019-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
EP3071515A2 (de) 2013-11-18 2016-09-28 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetische membran-empfänger-komplexe
TWI700300B (zh) 2014-09-26 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 中和具有第ｖｉｉｉ凝血因子（ｆｖｉｉｉ）機能替代活性的物質之抗體
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TWI701435B (zh) 2014-09-26 2020-08-11 日商中外製藥股份有限公司 測定ｆｖｉｉｉ的反應性之方法
JP2018518152A (ja) 2015-03-27 2018-07-12 ユニバーシティ オブ サザン カリフォルニア 充実性腫瘍を処置するためのｌｈｒに指向されたｃａｒ ｔ細胞治療
US20190119385A1 (en) * 2015-03-27 2019-04-25 University Of Southern California Hla-g as a novel target for car t-cell immunotherapy
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
EP3398965A4 (de) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Verfahren zur förderung der effizienz der reinigung von polypeptid mit fc-region
SG11201809642TA (en) 2016-05-16 2018-11-29 Baxalta Inc Anti-factor ix padua antibodies
SG11201901961SA (en) 2016-09-06 2019-04-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Methods of using a bispecific antibody that recognizes coagulation factor ix and/or activated coagulation factor ix and coagulation factor x and/or activated coagulation factor x
CN110023339A (zh) * 2016-09-23 2019-07-16 Csl有限公司 凝血因子结合蛋白及其应用
WO2018098363A2 (en) * 2016-11-23 2018-05-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Bispecific antibodies binding to coagulation factor ix and coagulation factor x
JP7139332B2 (ja) 2016-12-23 2022-09-20 ノバルティス アーゲー 第ｘｉ因子抗体および使用方法
EP3848396A1 (de) 2017-02-01 2021-07-14 Novo Nordisk A/S Antikörper gegen faktor ix und faktor x zur förderung der blutgerinnung
GB201709970D0 (en) 2017-06-22 2017-08-09 Kymab Ltd Bispecific antigen-binding molecules
MA50667A (fr) 2017-09-29 2020-08-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécule multispécifique de liaison à l'antigène ayant une activité de substitution de la fonction de cofacteur du facteur viii de coagulation sanguine (fviii), et formulation pharmaceutique contenant ladite molécule en tant que principe actif
CA3083210A1 (en) * 2017-11-22 2018-11-20 Novartis Ag Reversal binding agents for anti-factor xi/xia antibodies and uses thereof
CN109837303A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种敲除pd1的靶向cd317的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836496A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd317的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
US11220554B2 (en) 2018-09-07 2022-01-11 Novo Nordisk A/S Procoagulant antibodies
EP3830135A1 (de) * 2018-08-01 2021-06-09 Novo Nordisk A/S Verbesserte prokoagulatorische antikörper
CA3123177A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Kymab Limited Fixaxfx bispecific antibody with common light chain
CN115052898A (zh) 2020-01-30 2022-09-13 诺和诺德股份有限公司 双特异性因子viii模拟抗体
CN116333145B (zh) * 2023-04-14 2023-11-07 北京基科晟斯医药科技有限公司 结合活化凝血因子ix的抗体

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT368883B (de) 1980-07-22 1982-11-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung einer neuen blutgerinnungsfoerdernden praeparation auf basis von humanproteinen
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU678987B2 (en) * 1992-08-27 1997-06-19 Stichting Centraal Laboratorium Van De Bloedtransfusiedienst Van Het Nederlandse Rode Kruis Antibodies specific for a haemostatic protein, their use for isolating intact protein, haemostatic compositions devoid of proteolytic cleavage products of the protein
DK128093D0 (da) * 1993-11-12 1993-11-12 Novo Nordisk As Hidtil ukendte forbindelser
MA24512A1 (fr) 1996-01-17 1998-12-31 Univ Vermont And State Agrienl Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose
WO1999001476A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 Smithkline Beecham Corporation CRYSTAL STRUCTURES OF ANTI-FACTOR IX Fab FRAGMENTS AND METHODS OF USE FOR PEPTIDOMIMETIC DESIGN
DE69901569T2 (de) * 1998-08-28 2002-12-19 Genentech Inc Humane antikörper gegen faktor ix/ixa
AT411997B (de) * 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
US7297336B2 (en) * 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity

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Publication number Publication date
PL354976A1 (en) 2004-03-22
US7033590B1 (en) 2006-04-25
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ES2288873T3 (es) 2008-02-01
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US7279161B2 (en) 2007-10-09
CN1390258A (zh) 2003-01-08
AU7775900A (en) 2001-04-17
DE60035356D1 (de) 2007-08-09
JP2003509049A (ja) 2003-03-11
CA2384660A1 (en) 2001-03-22
US20050196397A1 (en) 2005-09-08
CZ2002935A3 (cs) 2002-08-14
AT411997B (de) 2004-08-26
AU780775B2 (en) 2005-04-14
WO2001019992A3 (en) 2001-09-27
EP1220923B1 (de) 2007-06-27
WO2001019992A2 (en) 2001-03-22
EP1220923A2 (de) 2002-07-10
SK3662002A3 (en) 2002-07-02
HUP0203750A2 (hu) 2003-02-28
JP2006111638A (ja) 2006-04-27
HUP0203750A3 (en) 2005-01-28

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