PL220297B1

PL220297B1 - Epitop i jego zastosowanie

Info

Publication number: PL220297B1
Application number: PL401502A
Authority: PL
Inventors: Anna Ewelina Jarząb; Danuta Witkowska; Edmund Ziomek; Andrzej Gamian
Original assignee: Wrocławskie Ct Badań Eit & Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialności&
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2015-10-30
Also published as: US9890194B2; PL401502A1; WO2014073998A1; US20160024150A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest epitop rozpoznawany przez przeciwciała krwi pępowinowej o swoistości anty enterobakteryjnej, który może być zastosowany do wytwarzania szczepionek przeciwko Enterobacteriaceae, szczególnie oportunistycznym bakteryjnym patogenom układu pokarmowego, zwłaszcza bakteriom rodzaju Shigella.

Czerwonka zakaźna (shigelloza), salmonelloza i inne choroby wywoływane przez przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae są ciągle dużym problemem medycznym, zwłaszcza w krajach rozwijających się.

Rodzaj Shigella należy do Gram-ujemnych oportunistycznych ludzkich patogenów i jest odpowiedzialny za infekcje jelita grubego. Do symptomów infekcji należą bóle podbrzusza, gorączka i krwawa biegunka doprowadzająca do zagrażającego życiu odwodnienia organizmu. Powstała na skutek infekcji bakteryjnych i wirusowych biegunka jest stawiana w skali światowej na trzecim miejscu jako przyczyna umieralności wśród dzieci do lat pięciu. Za umieralność niemowląt i dzieci na skutek infekcji bakteryjnych głównie odpowiedzialne są niskie standardy sanitarne panujące w krajach rozwijających się. Niemniej infekcje patogennymi bakteriami jelitowymi, w tym Shigella zdarzają się również w krajach rozwiniętych ekonomicznie. Tutaj większym zagrożeniem jest pojawianie się szczepów opornych na działanie antybiotyków. Dlatego też instytucje opieki zdrowotnej zarówno w krajach rozwiniętych jak i rozwijających się stawiają na prewencję, w tym użycie szczepionek. Jak dotąd nikomu nie udało się opracować szczepionki przeciwko oportunistycznym bakteryjnym patogenom układu pokarmowego. Aby być zaakceptowaną taka szczepionka powinna spełnić szereg kryteriów, takich jak aktywność w śluzówce jelita, zapewnianie długotrwałej osłony immunologicznej, brak skutków ubocznych. Ponadto pożądane jest aby szczepionka była łatwa w podawaniu i stosunkowo tania, ponieważ głównym odbiorcą będą dzieci w krajach o niskim poziomie ekonomicznym.

Do szczepów Shigella przeciwko którym trwają próby utworzenia szczepionek należą S. flexneri 2a, 3a, S, dysenteriae 1, oraz S. sonnei.

W zgłoszeniu P.380105 ujawniono białko błony zewnętrznej ściany komórkowej z Shigella flexneri 3a o ciężarze cząsteczkowym 38 kDa wykazujące immunoreaktywność z surowicą ludzką. W zgłoszeniu sugerowano m.in. możliwość jego stosowania jako nośnika do wytwarzania szczepionek koniugatowych.

Celem wynalazku jest uzyskanie nowych składników, które mogłyby być wykorzystane do wytwarzania szczepionki przeciwko Enterobacteriaceae, szczególnie oportunistycznym bakteryjnym patogenom układu pokarmowego, zwłaszcza bakteriom rodzaju Shigella.

Przedmiotem wynalazku jest epitop o sekwencji aminokwasowej: A1-A2-A3-A4-A5-A6, gdzie:

A1 oznacza R,

A2 oznacza Y,

A3 oznacza D, R, E, N lub Q,

A4 oznacza E, D, N lub Q,

A5 oznacza R,

A6 oznacza Y, G lub F.

Korzystnie, epitop według wynalazku został wybrany z grupy obejmującej peptydy o sekwencji aminokwasowej: RYDERY, RYDDRY, RYEERY, RYQERY lub RYDQRY.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie epitopu określonego powyżej lub białka zawierającego ten epitop do wytwarzania szczepionki przeciwko Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakteriom rodzaju Shigella.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie epitopu określonego powyżej lub białka zawierającego ten epitop do wytwarzania testu diagnostycznego do wykrywania Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie epitopu określonego powyżej lub białka zawierającego ten epitop do wytwarzania krwiopochodnych, immunoglobulinowych preparatów terapeutycznych specyficznych wobec Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.

Nieoczekiwanie, dzięki peptydom według wynalazku możliwe jest zastąpienie szczepionki klasycznej opartej na użyciu termicznie unieczynnionych bakterii, szczepionką opartą na syntetycznych fragmentach reprezentujących główny antygen powierzchniowy komórek bakteryjnych wyizolowany z białka ompC. W odróżnieniu od szczepionki klasycznej, syntetyczna szczepionka jest bezpieczna, tania i może być produkowana na dużą skalę.

PL 220 297 B1

Ujawnione peptydy nadają się do konstrukcji szczepionki do indukcji ochrony przed Enterobacteriaceae, szczególnie w niedoborach odporności humoralnej. Mogą być również wykorzystane do przygotowania żelu powinowactwa do izolacji przeciwciał z surowicy dawców jako preparat terapeutyczny, i do diagnostyki swoistych niedoborów odporności humoralnej. W odróżnieniu od natywnego białka ompC, które zawiera szereg epitopów zbędnych, neutralnych lub potencjalnie negatywnych, epitop według wynalazku zawiera jedynie unikalną właściwość ochronną.

Dla ułatwienia lepszego zrozumienia istoty prezentowanego wynalazku jego opis został zilustrowany następującymi figurami:

Figura 1 prezentuje wizualizację epitopów konformacyjnych białka ompC z Shigella flexneri 3a.

Epitopy 1-3 są pętlami skierowanymi do wnętrza komórki i przez to o mniejszym znaczeniu dla oddziaływań bakterii z gospodarzem. Epitopy 4-8 odpowiadają odpowiednio extracellularnym pętlom

II-VI (wg nomenklatury ustalonej dla ompC z E. coli).

Figura 2 prezentuje obserwowaną reaktywność przeciwciał obecnych w zmieszanych surowicach 1H-9H z peptydami nr 1-6 zsyntetyzowanymi na HPM-pinach.

Figura 3 prezentuje reaktywność przeciwciał obecnych w indywidualnych surowicach 1H-6H oraz 13H-14H z peptydami nr 1-6 zsyntetyzowanymi na HPM-pinach.

Figura 4 prezentuje aminokwasy determinujące aktywność immunologiczną epitopu RYDERY z ompC.

Figura 5 prezentuje aktywność peptydów, pochodnych peptydu RYDERY, wykazujących aktywność względem przeciwciał obecnych w surowicach ludzkich krwi pępowinowych.

Figura 6 prezentuje poziom przeciwciał klasy IgG anty-OMP-38 w surowicach mysich po szczepieniu koniugatami poli-lizynowymi, białkiem OMP-38, a także myszy nie-immunizowanych określony z zastosowaniem testu ELISA.

P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie ekstraktu bakteryjnych białek błony zewnętrznej (OMP).

Świeżą masę bakteryjną z 7 godzinnej hodowli na podłożu płynnym BHl w temperaturze 37°C uzyskiwano przez odwirowanie i przemywano buforem 10 mM Tris-HCl o pH 7,6 zawierającym 10 mM MgSO₄. Bakterie zawieszano w tym samym buforze z dodatkiem 20 μg RNazy i 20 μg DNazy na ml i sonikowano za pomocą ultradźwięków przez 10 min. Rozbite bakterie wirowano przy 7000 x g w celu usunięcia nie rozbitych komórek, a następnie tak uzyskany supernatant ultrawirowano przy 150000 x g przez 1 godzinę aby pozbyć się fragmentów osłony. W celu rozpuszczenia błony cytoplazmatycznej uzyskany po ultrawirowaniu osad poddano w temperaturze pokojowej dwukrotnej ekstrakcji 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 zawierającym 10 mM MgSO4 i 2% Triton X-100. Po odwirowaniu przy 150000 x g uzyskany osad poddano dwukrotnej ekstrakcji tym samym buforem zawierającym 2% Triton X-100 i 5 mM EDTA i wirowaniu przy 160000 x g. Rozpuszczone w supernatancie białka błony zewnętrznej precypitowano dwoma objętościami 95% etanolu i charakteryzowano za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Frakcje OMP zawierały około 20 białek i zawierały nie więcej niż 5% lipopolisacharydu, który oznaczano na podstawie zawartości Kdo.

P r z y k ł a d 2. Otrzymywanie białka 38 kDa immunoreaktywnego z surowicą ludzką.

Elektroforezę preparatywną białek błony zewnętrznej przeprowadzano korzystnie przy pomocy aparatu Prep Cell 491 firmy BioRad stosując 37 mm walec, w którym przygotowywano 80 ml 10% lub 12,5% żelu rozdzielającego i 20 ml 5% żelu zagęszczającego a bufor o składzie 25 mM Tris, 0,192 mM glicynę i 1% SDS, pH 8,3 stosowano do elektroforezy i elucji. Po nałożeniu 30-40 mg ekstraktu białek na żel zagęszczający elektroforezę przeprowadzano przy napięciu 260 V i natężeniu 109 mA. Elucję rozpoczynano w momencie kiedy barwnik błękit bromofenolowy wypłynął z żelu rozdzielającego. Podczas elucji zbierano frakcje o objętości 1,4 ml, a obecność białek we frakcjach była monitorowana przy długości fali 280 nm przez detektor UV i sprawdzana w elektroforezie i immunoblotingu. Frakcje z odpowiednim białkiem korzystnie 38 kDa były dializowane do wody, łączone ze sobą i zagęszczane poprzez wirowanie pod próżnią. Frakcje OMP charakteryzowano w elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w warunkach redukujących stosując 10% lub 12,5% żele stosując standardowe metody.

P r z y k ł a d 3. Oznaczenie sekwencji białka oznaczonego roboczo jako omp38 i stwierdzenie jego homologii do białka znanego jako ompC.

Sekwencję ompC oznaczono na poziomie białka i DNA. Białko omp38 zostało wyizolowane i oczyszczone z Shigella flexneri 3a jak opisano powyżej. Oczyszczone białko poddano hydrolizie trypsyną, a powstałe fragmenty analizowano za pomocą spektrometrii mas (ESI-MS/MS). W ten sposób oznaczono 67% sekwencji ompC. Sekwencję tę potwierdzono i uzupełniono po izolacji genu

PL 220 297 B1 ompC i oznaczeniu sekwencji DNA. Stwierdzono, że ompC z Shigella flexneri 3a ma identyczną sekwencję do tej oznaczonej dla ompC z Shigella flexneri 2a (GeneBank, AE014073.1), Shigella boydii Sb227 (GeneBank CP000036.1), Shigella flexneri 5 (GeneBank CP000266.1) i Shigella flexneri 2002017 (GeneBank CP001383.1).

P r z y k ł a d 4. Zbudowanie 3-wymiarowego modelu ompC z Shigella flexneri 3a w oparciu o struktury homologicznych białek dostępnych w bazie danych PDB.

W celu zbudowania 3-wymiarowego modelu sekwencję ompC z Shigella flexneri 3a „wpleciono” (threading) w strukturę ompC z E. coli używając dostępnej w internecie (http://swissmodel.expasy.org) metody [Arnold K., Bordoli L., Kopp J., i Schwede T., The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling, Bioinformatics, 2006, 22, 195-201]. Uzyskany model antygenu poddano analizie bioinformatycznej PEPITO symulującej, które aminokwasy mogą oddziaływać z przeciwciałem [Sweredoski, M.J. i Baldi, P., Bioinformatics Application Note, 2008, 24, 12, 1459-1460]. Metoda ta jest również dostępna w Internecie (http://pepito.proteomics.ics.uci.edu).

Na figurze 1 została przedstawiona uzyskana wizualizacja epitopów konformacyjnych.

P r z y k ł a d 5. Synteza peptydów reprezentujących pięć (5) przewidywanych bioinformatycznie potencjalnych regionów epitopowych i ustalenie, że tylko jeden z nich, reprezentujący pętlę V, reaguje z surowicą pępowinową.

Na podstawie analizy bioinformatycznej zaprojektowano syntezę pięciu peptydów odpowiadających zewnątrzkomórkowym regionom epitopowym. Były to:

1. GNSAENENNSWT-pin (62-73)

2. EGEGMTNNGREALRQNGDGV-pin (157-176)

3. GLNRYDERYIGN-pin (205-216)

4. GVINGRNTDDED-pin (287-299)

5. DDNQFTRDAG-pin (327-336)

Peptydy reprezentujące przewidziane bioinformatycznie regiony epitopowe syntezowano używając zestawu NCP z 96-cioma hydroxypropylometacrylowymi (HPM) pinami (MIMOTOPES, Clayton, Victoria, Australia) wg metody zalecanej przez producenta (Carter, J.M. (1994) Epitope mapping of a protein using the Geysen (PEPSCAN) procedure. Methods Mol Biol 36: 207-223). Jako szósty syntetyzowano peptyd kontrolny (AEVYNKDGNKLD-pin) odpowiadający N-końcowej części ompC.

Po zakończonej syntezie przeprowadzono wstępne testy reaktywności poszczególnych peptydów, wykorzystując w tym celu standardowy test ELISA. Test ELISA przeprowadzono na mieszaninie 9 różnych surowic krwi pępowinowej (1H-9H) wg następującego schematu:

a. Zrównoważenie pinów w buforze TBS-T

b. Blokowanie wolnych miejsc na pinach przy użyciu 1% roztworu BSA w TBS-T

c. Inkubacja z surowicami pępowinowymi w rozc. 1:500 w roztworze 1% BSA w buforze TBS-T

d. Płukanie buforem TBS-T

e. Inkubacja z przeciwciałami II-rzędowymi, tj. koniugatem Anti-Human IgG (Fc)-AP (Promega)

f. Płukanie buforem TBS-T

g. Reakcja fosfatazy alkalicznej (AP) z substratem pNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, Sigma) i pomiar absorbcji przy 405 nm

h. Dysocjacja białek/przeciwciał od peptydów zsyntetyzowanych na HPM-pinach

Uzyskane wyniki przedstawiono na Figurze 2.

Jedynie peptyd Nr 3 reprezentujący region pętli białka ompC (pętla V) znajdujący się pomiędzy aminokwasami 205-216 (GLNRYDERYIGN) okazał się być aktywny immunologicznie.

Oznaczono także indywidualną reaktywność surowic krwi pępowinowej pochodzących od różnych pacjentek (1H-6H, 13H, 14H) z peptydami (nr 1-6) zsyntetyzowanymi na HPM-pinach. Uzyskane rezultaty (Fig. 3) potwierdziły wcześniejszy wynik (Fig. 2) stawiający peptyd Nr 3 jako najbardziej reaktywny, a także wskazują na różnice indywidualne w poziomie przeciwciał rozpoznających peptyd Nr 3 u różnych pacjentek.

P r z y k ł a d 6. Zdefiniowanie minimalnej długości immunologicznie aktywnego peptydu reprezentującego pętlę V.

Kolejnym etapem badań zmierzających do określenia sekwencji epitopu wiążącego przeciwciała obecne w surowicy krwi pępowinowej było wyznaczenie całkowitej oraz minimalnej sekwencji epitopu gwarantującej wiązanie przeciwciał. W tym celu przeprowadzono chemiczną syntezę krótkich peptydów reprezentujących sekwencję w rejonie pętli V. Zsyntetyzowano 29 różnych dwunastoaminokwasowych peptydów, nakładających się co jeden aminokwas. Zostały one przedstawione w Tabeli 1.

PL 220 297 B1

T a b e l a 1

Sekwencje peptydów reprezentujących pętlę V ompC odpowiedzialną za reakcję z krwią pępowinową.

N-koniec ..........................................................................—C-koniec(HPM-pin)

kowane jedynie resztami glicynowymi. Nie stwierdzono niespecyficznego wiązania przeciwciał do HPM-pinu.

Test ELISA przeprowadzony na mieszaninie surowic pępowinowych 1H-9H wykazał, że peptydy oznaczone przez nas numerami 12-18 (Tabela 1) są odpowiedzialne za wiązanie przeciwciał w tych surowicach. Z porównania sekwencji immunologicznie aktywnych peptydów wynika, że elementem wspólnym dla tej serii jest sekwencja RYDERY. Peptyd ten okazał się również najkrótszą częścią aktywnego epitopu.

P r z y k ł a d 7. Oznaczenie krytycznych i mniej istotnych dla aktywności immunologicznej pozycji aminokwasowych w minimalnym peptydzie RYDERY. Optymalizacja sekwencji peptydu.

Nieoczekiwanie ustalono, że na aktywność immunologiczną peptydu RYDERY nie ma wpływu usunięcie aminokwasów w pozycji P+1 i P+2, a także w pozycji P-1, P-2, P-3 i P-4. Usunięcie aminokwasów w pozycji P1 lub P6, a także kolejnych pozycjach (P2, P3 lub P5, P4) powodowało całkowitą utratę aktywności. Także utratę aktywności immunologicznej powodowała wymiana reszt w pozycjach P1, P2 i P5. Te ostatnie aminokwasy muszą pozostać niezmienione w ostatecznej formule szczepionki peptydowej. Mniej restrykcyjne są pozycje P3, P4 i P6. W tym przypadku natywne (oryginalne) aminokwasy można zastąpić szeregiem innych reszt bez istotnej utraty aktywności immunologicznej (Fig. 4). Ta właściwość epitopu pozwala na syntezę peptydu mniej podatnego na hydrolizę enzymatyczną, a także posiadającego wyższą antygenowość.

Ponadto, nieoczekiwanie ustalono, że zamiana aminokwasu D lub E na Q daje podwyższenie reaktywności z surowicą pępowinową (Fig. 5).

PL 220 297 B1

P r z y k ł a d 8. Osadzanie immunologicznie aktywnych peptydów na takich nośnikach jak polimery i białka.

Jedną z powszechnie akceptowanych metod przygotowywania sztucznego antygenu jest synteza immunologicznie aktywnych peptydów na żywicy z osadzoną, tj. wcześniej syntetyzowaną, rozgałęzioną dendrytycznie polilizyną. Taki nośnik pozwala na przyłączenie ośmiu łańcuchów peptydowych. Otrzymany syntetyczny antygen ma masę cząsteczkową ok. 9 kDa.

Przygotowano 5 różnych koniugatów, różniących się sekwencją peptydów, które zostały na nich zsyntetyzowane. Cztery z nich zawierały sekwencję RYDERYIG (reszty IG pochodzą z naturalnej sekwencji białka i zostały użyte jako łączniki umożliwiające lepszą ekspozycję peptydu poprzez jego oddalenie od nośnika poly-Lys) i były kolejno przedłużane o reszty aminokwasowe N, LN, GEN (pochodzące z naturalnej sekwencji białka ompC i wykazujące antygenowość względem przeciwciał klasy IgG z surowic krwi pępowinowej). Jeden z tych koniugatów zawierający sekwencję YDERY, która we wcześniejszych eksperymentach z przeciwciałami krwi pępowinowej nie wykazywała aktywności może stanowić kontrolę. Seria w/w sztucznych antygenów została zsyntetyzowana (Tabela 2) i użyta do szczepienia myszy.

Możliwe jest również użycie naturalnych białek jako nośników antygenów (haptenów) peptydowych. Typowymi białkami nośnikowymi są albumina surowicy wołowej (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH) i ovalbumina (OVA) (patrz; Bioconjug Chem. 1999 (3):496-501).

T a b e l a 2

Koniugat nr	Sekwencja peptydu
1	Ac-YDERYIG-polyLys
2	Ac-RYDERYIG-polyLys
3	Ac-NRYDERYIG-polyLys
4	Ac-LNRYDERYIG-polyLys
5	Ac-GLNRYDERYIG-polyLys

Nośniki zawierające immobilizowane na nich peptydy według wynalazku mogą być następnie wykorzystane do przygotowania żelu powinowactwa do izolacji przeciwciał ochronnych z krwi/surowicy dawców. Uzyskane w ten sposób przeciwciała mogą być wykorzystane do wytwarzania krwiopochodnych, immunoglobulinowych preparatów terapeutycznych specyficznych wobec enterobakterii.

Nośniki zawierające immobilizowane na nich peptydy według wynalazku mogą być również wykorzystane do diagnostyki swoistych niedoborów odporności humoralnej. Dzięki swojej specyficzności, testy diagnostyczne zawierające peptydy według wynalazku nadają się szczególnie do oznaczania poziomu przeciwciał specyficznych wobec ważnych patogenów przewodu pokarmowego, które posiadają istotne znaczenie zwłaszcza w pediatrii.

P r z y k ł a d 9. Immunogenność na modelu mysim syntetyzowanych koniugatów peptydowych.

Myszy BALB/c podzielono na 7 grup eksperymentalnych, z czego grupy 1-4 otrzymywały koniugaty poli-lizynowe (gr. 1: RYDERYlG-polyLys, gr. 2: NRYDERYIG-polyLys, gr. 3: LNRYDERYIGpolyLys i gr. 4: GLNRYDERYIG-polyLys), grupa 5 białko OMP-38, a grupy kontrolne otrzymywały sam adiuwant MPL - gr. 6 lub w ogóle nie były immunizowane - gr. 7. Myszy immunizowano dootrzewnowo, podając jednorazowo 200 μΐ szczepionki zawierającej odpowiedni antygen zawieszony w PBS z adiuwantem MPL (5:1, vol/vol). Myszy immunizowano przez 1,5 miesiąca w odstępach tygodniowych. Po 7 dniach od każdej immunizacji, skrwawiano po 1 myszy z każdej grupy, a następnie oznaczano w surowicach poziom swoistych przeciwciał, świadczący o wzbudzeniu odpowiedzi immunologicznej, oznaczano za pomocą standardowego testu ELISA, w którym oznaczano miano przeciwciał skierowanych przeciwko całemu białku OMP-38, gdzie określony został poziom wysoce specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko epitopowi RYDERY, obecnemu na powierzchni białka OMP-38. Wyniki podsumowano na figurze 6.

P r z y k ł a d 10. Test ELISA z surowicą ludzką pozwalający na wykrycie różnic w stężeniu przeciwciał anty-RYDERY w surowicach pacjentów

Peptydy o takiej samej sekwencji (RYDERY) zrównoważono w buforze TBS-T. Blokowanie wolnych przestrzeni na fazie stałej przeprowadzono przy użyciu 1% roztworu BSA w TBS-T (1 h, temperatura pokojowa, 200 μΐ/dołek). Kolejno testowano 100-krotnie rozcieńczone w buforze TBS-T z 1%

PL 220 297 B1

BSA surowice pacjentów (1 h, temperatura pokojowa, 100 μΐ/dołek). Następnie reaktywność przeciwciał obecnych w surowicach pacjentów wykryto przy pomocy przeciwciał anti-Human IgG skoniugowanych z fosfatazą alkaliczną (Sigma) w rozcieńczeniu 1:10.000 (1 h, temperatura pokojowa, 100 μΐ/dołek), używając jako substratu pNPP (p-Nitrophenyl Phosphate, AP Yellow - Sigma).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Epitop o sekwencji aminokwasowej A1-A2-A3-A4-A5-A6, gdzie:

A1 oznacza R,

A2 oznacza Y,

A3 oznacza D, R, E, N lub Q,

A4 oznacza E, D, N lub Q,

A5 oznacza R,

A6 oznacza Y, G lub F.
2. Peptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że został wybrany z grupy obejmującej peptydy o sekwencji aminokwasowej: RYDERY, RYDDRY, RYEERY, RYQERY lub RYDQRY.
3. Zastosowanie epitopu określonego w zastrz. 1-2 lub białka zawierającego ten epitop do wytwarzania szczepionki przeciwko Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakteriom rodzaju Shigella.
4. Zastosowanie epitopu określonego w zastrz. 1-2 lub białka zawierającego ten epitop do wytwarzania testu diagnostycznego do wykrywania Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.
5. Zastosowanie epitopu określonego w zastrz. 1-2 lub białka zawierającego ten epitop do wytwarzania krwiopochodnych, immunoglobulinowych preparatów terapeutycznych specyficznych wobec Enterobacteriaceae, zwłaszcza bakterii rodzaju Shigella.