JPH05500653A - リウマチ様関節炎の処置法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リウマチ様関節炎の処置法 裳人圀団 本発明は、自己免疫疾患を予防および処置するための免疫系の調節に関する。詳 細には、ヒトのリウマチ様関節炎の特徴である免疫応答を予防および処置する方 法に関する。

！ｉ茨工 ９０％を超えるリウマチ様関節炎血清陽性の患者の８９７８球およびマクロファ ージは、血清学的定義によるクラスＩＩＨＬＡタンパク質ＤＲ４あるいはＤＲＩ を発現する。ＤＲ４特異性は、いくつかの異なるハブロタイブに存在することが 知られており、そのうちの３つ、Ｄｗ４、Ｄｗｌ４およびＤｗｌ５はリウマチ様 関節炎患者の８９７８球およびマクロファージに４関与し、そのうちの２　′つ 、ＤｗｌＯおよびＤＷ１３は関与しない。従って、リウマチ様関節炎を持つ人々 の８９７８球およびマクロファージは、クラス１１ハブロタイブＤｗ４、Ｄｗ　 １４、Ｄｗｌ５あるいはＤＲＩを発現する。リウマチ様関節炎（ＲＡ）に関与す るハブロタイブは、ＤＲ−β−１鎖の第３超可変部の７０−７４位のアミノ酸配 列によって、ＲＡに関与しないハブロタイブと区別されることが既に知られてい る（Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ、Ｐ、　、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ 　ＵＳＡ　（１９８６）　８３：　２６４２−２６４６；　Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎ 、Ｐ、ら、Ａｒｃｈ　Ｒｈｅｕｍ　（１９８７）　３０：　１２０５−１２１３ ；　Ｔｏｎｎｅｌｌｅ、Ｃ，ら、Ａｎｎ　Ｉｎ５ｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ　（１９８８）　１３９：　４ｌ−５３）　ｏ　その部位の配列はＱＫＲ ＡＡ　（Ｄｗ４）か、あるいはＱＲＲＡＡ　（Ｄｗｌ４、Ｄｗｌ５およびＤＲＩ ）のいずれがである。Ｒ（アルギニン）によるＫ（リジン）の置換は保存的であ る。従って、配列Ｑ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡは、リウマチ様関節炎の発生および症状に 重要であり得る。

免疫系が自己および非自己を区別することを可能にすることにおける、主要組織 適合抗原遺伝子複合体（ＭＨＣ）にフードされるタンパク質の役割に関する最近 の考えは、ＭＨＣにコードされるクラス１１タンパク質によって、外来性抗原が 種々のクラスのＴ細胞に「提示」されることを仮定している。クラス１１タンパ ク質は、外来性抗原（あるいはその断片）に結合可能な部位およびＴ細胞レセプ ターを認識する他の部位を有する。

他の研究者による構造的な研究は、クラスＩＩＭＨＣタンパク質上のＱ　（Ｋ／ Ｒ）　ＲＡＡ配列が配置される位置は、Ｔ細胞レセプター認識部位に相当するこ とを示した。

リウマチ様関節炎は、関節液のある種のタンパク質成分が、免疫系によって異物 と認識される、自己免疫疾患と考えられている。おそらくそれらは、Ｍｌ（Ｃク ラスＩ＋　タンパク質と関連してＴ細胞に提示されると推定され、そのＭＨＣク ラス１■のキャリヤーはＴ細胞によって自己と認識される。前述に基づいて、こ の自己認識部位はＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡを含むと考えられ得る。適切なワクチンを 投与することにより、関節液関連抗原に対する１９７８球の応答を、ヘルパーＴ 細胞クラスから転換するか、あるいは防ぐことができることが、現在見い出され ている。従って、本発明のワクチンは、クラス１１認識部位Ｑ　（Ｋ／Ｒ）　Ｒ ＡＡに結合される関節液抗原に対するヘルパーＴ細胞の増殖を予防する。

及旦ヱ１１玉 本発明は、それ自身がリウマチ様関節炎症状として現れる、関節液タンパク質に 対する自己免疫応答を予防および処置するためのワクチンを提供する。本発明の ワクチンは、その認識部位にＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ配列を有するＭＨＣクラスＩＩ 組織適合性タンパク質と関連して提示される、これらのタンパク質に対スるヘル パーＴ細胞の応答を効果的に予防する。

従って、１つの観点では、本発明はリウマチ様関節炎を予防あるいは改善するた めに免疫する方法を目指している。ここで、予防接種法のプロトコールには、サ プレッサーおよび／あるいは細胞障害性Ｔ細胞の増殖を優先的に促進し、および ／あるいは、サプレッサー／細胞障害性Ｔ細胞群の増大に影響することなく、ヘ ルパーＴ細胞群の拡大を抑制する、１種あるいはそれ以上の免疫促進あるいは免 疫抑制物質の有効量と共に、ペプチドＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡの有効量を免疫原的形 態で投与することが包含される。このような免疫作用性物質には、インターロイ キン６　＜ＩＬ−５）　、サイクロスポリンＡ、　ＣＤ４抗原に対する抗体、ト ランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）およびそれらの組み合わせが含 まれる。本発明はさらに、この方法に有用なワクチンを目指している。

別の観点では、本発明は、クラスＩ組織適合性配列の不変部分に連結するＱ（Ｋ ／Ｒ）ＲＡＡアミノ酸配列配列有する、リウマチ様関節炎の予防に有用なワクチ ン、およびこのワクチンを用いるリウマチ様関節炎の予防および改善法を目指し ている。

区ｊ紹す１勇」Ｊ１咀 図１は、ＥＢＶに感染した人および、感染していない人に由来するＴ細胞のｇｌ ）１１０およびＤｗ４ペプチドによる刺激（あるいは刺激をしない）を示す。

図２は、ｇｐＨｏペプチドに対して、あるいはｇｐＨｏペプチドで免疫されたウ サギのタンパク質に対して測定された抗体価を示す。

図３は、ＨＬＡ　クラスＩＩ　Ｄｗ４およびＤｗ２タンパク質とウサギ抗Ｄｗ４ 抗血清とのイム／プロットを示す。

図４は、Ｄｗ４、Ｄｗｌ４およびＤｗｌ　Ｏβペプチドのアミノ酸配列の比較を 示す。

日を　るためのン熊 本発明のワクチンは、免疫原性形態のアミノ酸配列Ｑ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ、　ある いはこのエピトープに結合するＴ細胞のレセプターの部分を形成する免疫原性形 態のペプチド配列を、主要な成分として使用する。従って、特異的なペプチドハ プテン配列は、大きなポリペプチドあるいはその一部であり得、および／あるい は、必要に応じて、リンカ−を介して担体に連結され得る。大きなタンパク質的 にペプチドを含める場合は、都合のよい大きなタンパク質には、他のクラスＩＩ ＤＲ−β−１鎖にあるアミノ酸配列、あるいは他のエプスタイン・バーウィルス に関連する糖タンパク質ｇｐ１１０中のこのペプチドに隣接するアミノ酸残基が 含まれる；クラスｌ　ＭＨＣタンパク質定常領域と関連してＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ 配列を提示するペプチドには、これらの領域の延長上の部位もさらに使用され得 る。しかし、個々のペプチドも使用され得る。両者の場合に任意的に、妨害しな い延長路もさらに使用され得る。

ハブテンの免疫原性を増強する、あるいはそれに免疫原性を付与するのに適当な 担体には、一般に用いられるキーポールリンベットヘモ／アニン（Ｈ，）Ｉ）タ ンパク質、破傷風トキソイド、あるいはヒト血清アルブミンのような、抗原性に ついて中性である他の物質が含まれる。破傷風トキソイド、ＫＬＨあるいはＨＳ Ａのような独立した担体を用いる場合、このペプチドは、多くがＰｉｅｒｃｅ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、　から市販さ れているリンカ−の使用を含む、当該分野の標準的な方法を用いて担体に連結さ れ得る。典型的なリンカ−には、例えば、５）ＩＩＣＣおよび５ＰＤＰが含まれ る。このような結合に効果的な方法は、公知である。

前述は、本発明のＱ　（Ｋ／Ｒ）　ＲＡＡのような配列の短いペプチドに免疫原 性を付与する、認められている技術の典型である；好ましくはこの配列を反１夏 して有する、１．　Ｏ−１００個のアミノ酸のような、大きなペプチドの合成を 含む、この配列に免疫原性をイ」与するいかなる方法も使用され得る。

本発明のワクチンは、上述のハブロタイブによってリウマチ様関節炎になる恐れ がある人々に投与される。従って、Ｄｗ４、Ｄｗ　１４．０ｗ１５あるいはＤＲ Ｉに相当するハブロタイブを有する人々がワクチンの接種を受ける。

ＲＡの予防あるいは改善の１つの方法では、免疫原性形態のＱ（Ｋ／Ｒ）　ＲＡ Ａが、ヘルパーＴ細胞を減らしてサプレッサーＴ細胞および／あるいは細胞障害 性Ｔ細胞群を優先的に増大させる免疫促進剤あるいは免疫抑制剤とともに投与さ れる。従って、サプレッサー／細胞障害性細胞群を拡大させるが、ヘルパー細胞 群には影響しない促進剤が使用され得る；あるいは、ヘルパー細胞群を活性的に 抑制するが、サプレッサー／細胞障害性Ｔ細胞群には影響しない物質が使用され 得る。あるいは、これらの因子の組み合わせが使用され得る。この区別的な増大 をもたらす、ある種の物質は当該分野で知られている；しかじ、本発明には、こ の作用を有することを示し得る、あらゆる物質の使用が含まれる。インターロイ キン６は、サプレッサー／細胞障害性子細胞に対する適当な免疫促進剤である。

この刺激を増強するためにＩＬ−２も含めることは、しばしば望ましい。

サイクロスポリンＡ、　ＴＧＦ−β、および抗ＣＤ４抗体（Ｃａｒｔｅｒｏｎ。

Ｎ、　Ｌ、ら、Ｊ　１ｍｍｕｎｏｌ　（１９８８）　１４０ニア１３−７１．６ を参照）は、適当なヘルパー細胞抑制物質である。

「〜と共に」投与されるとは、同じワクチン処方（免疫原性形態のＱ（Ｋ／Ｒ） ＲＡＡおよび、免疫促進剤および／あるいは免疫抑制剤の両方を含む）での投与 、あるいは、協調したそれらの作用を得られるようにこれらの成分を別々に同じ 期間に投与することを意味する。適当な同じ期間とは、４時間から２日の期間で あり、好ましくは、４時間から１日である。免疫促進剤／免疫抑制剤および免疫 原性ペプチドは、どのような順序でも投与され得、さらに各々の、あるいは両方 の反復投与のプロトコールも使用され得る。

適当な投与経路は全身性であり、静脈内、筋肉内、腹腔内、あるいは皮下注入の ような注射による投与が含まれる。皮下あるいは筋肉的投与か好ましい。免疫原 性ペプチドおよび免疫促進性／免疫抑制性物質を、緩衝液、リノガー溶液、ある いはハンクス液のような適当な賦形剤を含み、さらに加湿剤、安定剤などを含み 得る、ペプチド投与用の標準的処方を用いて注射用に処方する。適当なアジ−バ ントもさらに含み得る。

これらの経路に適当な処方を使用する、経膜的あるいは経皮的投与のような他の 投与形態もさらに使用され得る。例えば最新版の肱１三旦肛二と二二μ立山ＩＬ 江１匹且、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏ ｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａに、広い範囲の処方が記載されている。

免疫原性ペプチドの適当量は、患者当り約１００μｇ−１００ｍｇであり、好ま しくは１０−１００ｍｇである。免疫促進剤／免疫抑制剤あるいはその組み合わ せは、選ばれた物質の効力に応する量で投与されるへきである；例えば、ＩＬ− ６の場合、適当な投与量の範囲は１〜１００μｇ／ｋｇであり、好ましくは２０ −５０μｇ／ｋｇである。

もちろん、投与量のレベルは、使用されるペプチドの特定の免疫原性形態、選択 された免疫促進剤／免疫抑制剤、選択された投与経路、製剤の性質、および投与 される人の個々の反応に依存する。適正投与量のプロトコールの確立および個人 の管理は、前述のパラメーターを考慮に入れながらルーチンに行われ、当業者に は公知である。

ワクチンの他の形態では、ペプチドＱ（Ｋ／Ｒ）ｌ？ＡＡあるいはこの配列を有 する大きなペプチドをクラスＩ組織適合性配列の不変部分に結合して１．活性の あるワクチン成分を作成する。クラスＩ組織適合性配列の不変部分は既知であり 、関連データがシーンバンクおよび当分野で一般に知られている、同等の他のデ ータベースに寄託されている。（Ｃｈｉｍｆｎｉ、　Ｇ、ら、Ｌ■Ｌ旧世（１９ ８９）ぜユニ２９７−３０２の引用文献を参照のこと）さらに、関連配列が、ア メ９力合衆国健康保健省（Ｕ、　Ｓ。

Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ）に より発行された”５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｆｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、第４版（１９８７）、と題する出 版物に記載されている。この出版物の３３７−３５８ページに、ヒト、ネズミ、 および他の動物の既知のクラスＩ　ＭＨＣ抗原の１−３Ｈ位を占める配列が列記 されている。これらのページを総置すると、ヒトＭ）ＩＣタンパク質のなかで、 不変部分は１−８位；　１３−３１位、　４６−５３位；　８４−９３位；　１ １７−１３６位；１５７−１７６位；　２００−２３８位：　２４１−２６８位 である。概して、１０−２０個、好ましくは１２−１５個程度の配列を有する、 これらの領域からのペプチドは、関連のＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ配列に、通常この配 列を囲む部分からの延長を付加して、あるいは付加しないで、上述のように連結 し得る。

上述のようにクラス１不変配列（標準法を用いて合成し得る）および抗原を結合 する方法は、当該分野で知られている。クラス１部分およびＱ（Ｋ／Ｒ）Ｉ？Ａ Ａペプチドの結合もまた融合タンパク質の組み換え技術による生産によって可能 である。投与経路および処方も上述のそれと同様である。

以下の実施例は本発明を説明することを意図し、制限することを意図しない。

１皿匹上 リウマチ　ｆ：゛　基およびエプスタイン・バーウィルス註旦１化区風主 ここに参考として引用する、Ｒｏｕｄｉｅｒ、　Ｊ、ら、５ｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ　（１９８８）　２７：３６７−３７１およびＲｏｕｄｉｅｒ、　Ｊ 、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（印刷中）に記載のよ うに、リウマチ様関節炎の発生に関連することが知られているクラスＩＩ　ＭＨ Ｃタンパク質のＱＫＲＡＡ／ＱＲＲＡＡ配列をＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＦｏｕｎｄａｔｉＯｎデータベースのタンパク質 配列および、ＨＬＡのＤｗ４配列に相同するＥＱＫＲＡＡの６個のアミノ酸配列 と、それに続くほとんど同一の２番目のコピーである、ＱＲＡＡを有する、エプ スタイン・バーウィルス糖タンパク質ｇｐＨＯの８０７−８１６位のセグメント のＤＮＡ配列のシーンバンクのデータベースと照合した。ＣｈｏｕおよびＦａｓ ｓｍａｎ　（Ａｄｖ　Ｅｎｔｈ　ｍｏｌ（１９７８）　４７：４５−１４８）の 方法によるｇｐＬｌｏの７６０−８６０位の配列の２次構造のコンピューター分 析によると、関連のＱＫＲＡＡＱＲＡＡ配列は、Ｔ細胞への結合に責任のあるエ ピトープを構成すると推定される構造型を表している、２つの疎水性部分の間の αヘワックスの一部であると予想される。

この相同性の結果、エプスタイン・バーウィルス糖タンパク質のこの配列はりウ マチ様関節炎を媒介するＴ細胞の増殖を刺激し得、それらのＴ細胞が感受性ハブ ロタイブ、Ｄｗ４／Ｄｗ１４／Ｄｗ１５／ＤＲ１のクラスＩＩＭＨｃタンパク質 に連結した関節液タンパク質抗原を認識する。

ＥＢＶに感染した人々のＲＡに対する感受性の増加が知られている；しかじ、そ の関係はわかっていない。Ｔ細胞群を刺激して、ｇｌ）１１０ペプチドおよび関 連のＤｗ４ペプチドの両方に反応するようにする、エプスタイン・バーウィルス （ＥＢＶ）感染の能力をＲＡに関連するクラスＩＩ　ＭＨＣタンパク質ハブロタ イブの関連部を提示する４つのペプチド、ｇｐＨｏペプチドおよび対照のＤｗｌ Ｏペプチドを次のアミノ酸配列のように合成した：Ｄｗ４　：　ＫＤＬＬＥＱＫ ＲＡＡＶＤＴＹＣ；Ｄｗ４°：　ＥＱＫＲＡＡＥＱＫＲＡＡ　。

Ｄｗ１４／Ｄｗ１５／ＤＲＩ：　ＫＤＬＬＥＱＲＲＡＡＶＤＴＹＣ；ｇｐＨｏ： 　ＱＥＮＱＥＱＫＲＡＡＱＲＡＡＧＣ；ＤＷＩＯ：　ＫＤＩＬＥＤＥＲＡＡＶＤ ＴＹＣ。

これらのペプチドをＴ細胞増殖用の試験用刺激ペプチドとして用い、あるいはＧ ｒｅｅｎ、　Ｎ、、　Ｃｅｌ！　（１９８２）　２８：４７７−４８７；　Ｌｉ ｕ、　Ｆ、Ｔ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９７９）　１８：６９０−６ ９７に記載のようにｍ−マレイミドベンゾイル−ｎ−ヒドロキシサクシンイミド を用いてＫＬＨに結合して用いた。

爽丘匠主 ＥＢＶ感染「ノＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ！ｌ激によるＴ細胞の感作実施例２て合成し たペプチドを、インビトロでのＴ細胞の反応を決定するのに次のように使用した ：その方法は、ここで参考文献として引用する、Ｆｏｒｄ、　Ｄ、、　Ｃｅ１ｌ 　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８３）７９：３３４−３４４；　Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌ ａｗｓｏｎ、Ｄ、Ａ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ」録（１９８ ７）　８４：５３８４−５３８８に開示されている方法の変法であった。簡単に 説明すると、末梢血単核球を、ウィルスキャブジッド抗原（ＶＣＡ）に対する抗 体の欠如により示される、ＥＢＶ感染歴のない提供者、および、ＥＢＶに以前に 感染していないことを示す高い抗ＶＣＡ抗体価を有し、そのこと以外は正常な人 の等密度遠心法で単離し、ＲＰＭ　ｌ−１６４０培地で３回洗浄した。次に細胞 を１０６細胞／ｍｌの密度でプールされた１０％のヒトＡＢ血清、１％Ｌ−グル タミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシ ンを補充した同培地中に、上述のリストから選択された刺激用ペプチドの存在下 で、懸濁した。３７°Ｃで１週間培養後、増殖的１次反応を評価するために１０ ５細胞のサンプルを培養物から取った。

２次培養では、残っている細胞を数え、試験される同ペプチドを補充した新鮮な 培地で、あるいは対照として前記ペプチドを含まない培地で、連続希釈した。次 に、９６ウエルの丸底培養プレートでの１次培養からの細胞を、ｓｏ、ｏｏｏ、 ２５．０００．１０．０００あるいはｓ、　ｏｏｏ個の生存細胞を含む１００μ ｍの分注液に分配し、放射線照射（３，０００ｒａｄ）された、同提供者からの 末梢血単核球を加えて細胞数を１０５に調整した。各々の細胞密度に対して、ペ プチドを含む１８ウエルおよびペプチドを含まない６個の対照ウェルをアッセイ した。

この２次培養４日後、ガラス繊維フィルター上で細胞を採集する前に、１μＣｉ のトリチウムラベルされたチミジンを各ウェルに加えた。各細胞希釈に対して、 ６個の対照ウェルから得たｃｐｍの（平均＋２標準偏差）より高いｃｐｍを有す るものを陽性ウェルと定義した。Ｔ前駆細胞の頻度を、Ｆｏｒｄら（上述）の記 載のように、ｌウェル当りの細胞数に対する各希釈の陰性ウェルの細胞数の割合 をプロ、＋−することにより評価した。

結果を図１に示す。パネルａおよびＣは、ＶＣＡ陽性の提供者由来の細胞の異な る希釈における反応（ｃｐｍ／ウェルで示す）を示す。パネルａおよびｂは、ｇ ｐ１１０ペプチドで処置されたもの：パネルＣおよびｄは、Ｄｗ４ペプチドで処 置されたものである。

図１の結果は、ＶＣＡ陽性提供者由来のＴ細胞に対してｇｐＨｏペプチドあるい はＤＷ４ペプチドは、増殖を刺激し得た；　ＶＣＡ陰性提供者由来の細胞に対し ては、どの希釈においても刺激は起こらなかった。これに相当する、１次刺激を 受けた培養細胞における結果を以下の表１に示す。

無刺激　３９７６＋１０２５　２６９１＋１４１ｇｐＨｏ　８７２０＋１２２７ 　１９７６＋１６２上述の結果は、以前にＥＢＶに感染していることが、次にｇ ｐＨＯペプチドの関連部分あるいはＤｗ４ペプチドの関連部分に接触するとＴ細 胞群を感作して増大することを、明かに示す。

これらの結果はさらに、ＥＢＶ感染前の被検体のＴ前駆細胞濃度が、ｇｌｌ）１ １０および０ｗ４の両方に関して約７０．０００個のＴ細胞に１個であることを 示す。

尖血王土 抗　１１０抗体ｂ　、ｋ　Ｏ’　ＦＥ　ＲＡ感受性ハブロタイブ抗体の　差【皿 型実施例２で調製され、ＫＬＨに結合されたペプチドをウサギでの抗体産生に使 用した。ニューシーラント白ウサギに、１ｍｇの結合物を完全フロインドアジュ バントに乳化させたものを皮下投与し、次いで、不完全フロインドアジュバント 中の１ｍｇの結合物を３週間の間隔をおいて３回ブースターをかけた。ウサギは 、最後の投与後４日に採血され、その血清を一２０’Ｃに保存した。

得られた血清の抗体価をＥＬＩＳＡアッセイあるいはイムノプロットを用いてテ ストした。ＥＬＩＳＡアッセイはここに参考文献として引用する、Ｌｕｋａ、　 Ｊ、ら、Ｊ　１ｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８４）　６７：１４５− １５６の方法によった。簡単に説明すると、抗原ペプチドをＥＬＩＳＡプレート をコートするのに使用し、等張のホウ酸緩衝化生理食塩水（ＢＢＳ）で希釈した 免疫前あるいは免疫後のウサギ血清の種々の溶液１００μｍをウェルに加え、４ °Ｃて一晩インキコベートした。ＢＢＳ、　０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄後 、アルカワホスファターゼ標識ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌ ｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）を用いて、結合した抗体を検出した。結果を、免疫血清 の４゜５ｎｍにおけるＯ、Ｄを免疫前血清のそれで割った、吸光度比として表に しめす。各血清に対する抗体価を、少なくとも吸光度比２を示す最高希釈倍数と した。阻害実験では、抑制ペプチドの候補を抗血清に加え、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ測測 定前に４°Ｃて一晩反応させた。

ＥＬＩＳＡ測定は、ＥＢＶ　ｇｐＨｏに対する抗体の反応性をテストする際に行 われた。ｇｌ）１１０は、Ｋ１５ｈｉｓｈｉｔａ、　Ｍら、■匡包■（１９８４ ）　１３３：３９３−３９５ノ方法により、Ｐ　３　ＨＲ１リンパ芽球からアフ ィニティークロマトグラフィーにより精製した。

このアッセイを用いて、ｇｐｉｉｏペプチドで免疫されたウサギがｇｐＨｏペプ チドおよび、上述のように単離されたｇｐｔｉｏタンパク質の両方を認識する抗 体を産生ずることを証明した。これらの結果を図２に示す。

明かに、ｇｌｌｏタンパク質上の認識されるエピトープはペプチドのそれである 。なぜならば、１００μｇ／ｍｌのｇｌ）１１０ペプチドとともに先にインキュ ベートされた血清の２０倍希釈物はもはやｇＩ）１１０タンパク質に結合できな いからである。これらの結果は、関連配列がそのタンパク質に対するＢ細胞応答 に関与するエピトープであることを示唆する。

クラスＩＩ　ＭＨＣタンパク質との抗血清の反応を、Ｍｏ１ｔ　４、Ｔ細胞（対 照）あるいは、ＨＬＡ　０ｗ４あるいはＨＬＡ　Ｄｗ２ホモ接合の提供者（各々 、ＧＭＯ３１６１およびＧＭＯ６６８２１Ａ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　 ＭｕｔａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、　Ｃａｍｄｅｎ、　ＮＪより取 得）から確立したリンパ芽球様細胞から抽出した膜タンパク質に対するイム／プ ロットによってテストした。タンパク質は、Ｂｏｒｄｆｅｒ、Ｃ，、Ｊ　Ｂｉｏ Ｉ　Ｃｈｅｍ　（１９８１）　２５６：１６０４−１６０の方法によって、Ｔｒ ｉｔｏｎ−Ｘｌ１４て抽出した。

２Ｘ］、０６細胞からの膜抽出物を、０．１％のドデシル硫化ナトリウムおよび １ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１０％のポリアクリルアミドゲルの各 レーンに負荷した。Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ，ラ、ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓ ｃｉ　ＵＳＡ　（１９７９）ユニ４３５０−４３５４：　ＢｉＢｌｌｌｉｎ、　 Ｐ、Ｂ。

ら、１ｂｉｄ　（１９８３）　８０ニア１０４−７１０８ニ記載のように、電気 泳動後、還元され変性した膜ポリペプチドを電気泳動的にニトロセルロース紙に 移した。次に、フィルターを、０．０５Ｍホウ酸塩、０１５Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ ３、および３％の粉ミルクを含む溶液中で１時間ブレインキュベートし、続いて 同希釈比の抗血清と４°Ｃで一晩インキユベートした。（阻害測定用には、ニト ロセルロース紙とともにインキュベートする前に、候補のペプチドを抗体溶液に 加えた。）ニトロセルロース紙をホウ酸緩衝液でよく洗浄後、結合した抗体を１ ２５１−プロティンＡ　（ｌ　ｍＣｉ／ｍｌ　ＩＣＮ、１ｒｖｉｎｅ、　ＣＡ） を用いて検出した。ニトロセルロース紙を検出用試薬で１時間、インキュベート し、ＢＢＳで洗浄し、乾燥して、増感用スクリーンを用いてＫｏｄａｋ　ＸＡＲ フィルムに一７０°Ｃで露光した。

また、Ｄｗ４ペプチドの特異抗体を引き起こす能力を、上述のイムノプロットに よりウサギ抗血清をアッセイすることによっても示した。このアッセイの結果を 図３に示す。パネルＡのイムノプロットは、１　：　１０００に希釈された抗Ｄ Ｒ−βモノクローナル抗体の、Ｍｏ１ｔ　４　（Ｍ４）細胞、ＨＬＡ　Ｄｗ４ホ モ接合リンパ芽球様細胞（Ｄ４）、あるいはＨＬＡ　Ｄｗ２ホモ接合リンパ芽球 様細胞（Ｄ２）の抽出物との反応をテストする、対、唄である。両方のＤＲβタ ンパク質は反応するが、Ｍ４はしない。

パネルＢでは、ゲルをＤｗ４ペプチドで免疫したウサギの抗血清とともにインキ ュベートした。

レーンセット１は、膜抽出物のみを使用して電気泳動を行ったときの結果を表す 。Ｄ４抽出物のみが抗体に免疫反応し、抗血清の特異性が確認される。

レーンセット２は、抗血清を１０μｇ／ｍｌのＤｗ４ペプチドとともにブレイン キュベートしたときの結果を示す。ゲル中の膜由来Ｄ４ペプチドへの結合は完全 に除かれる。

レーンセット３は、抗血清を１００μｇ／ｍｌの対照ペプチドＤｗｌＯとともに ブレインキュベートしたときの結果を示す。抗体のＤ４抽出物への結合には影響 しないことかわかった。

レーンセット４は、１０μｇ／ｍｌの関連ペプチドＤｗ１４とのブレインキュベ ーションがＤ４への結合を除くのに部分的に有効であったことを示す。ＤＷ１４ の濃度を１００μｇ／ｍ　ｌに上げると、結合はほとんど除かれた（レーンセッ ト５）。

０ｗ４、Ｄｗ２、Ｄｗ１４およびＤｗｌＯの配列の比較（図４）は、６７．７０ 、及び７１位の残基の存在か、Ｄｗ４抗体の２　Ｓａに重要であることを示す。

ＤＷ４で免疫された、同ウサギの血清が表２に示される抗体価でＤｗ４ペプチド 、ｇｌ）１１０ペプチドおよびｇＩ）１１０タンパク質を認識することをＥＬＩ ＳＡによって示した。

表主 ＤｗＡ血゛の抗体価 ｇｐ支１０ペプチド　１０３ ｇｐＨｏタンパク質　１０３ ｇｌ）１１０タンパク質の認識は、１００　μｇ／ｍｌのｇｌ）１１０ペプチド あるいは１００μｇ／ｍ　１のＤｗ４ペプチドのいずれかかとともに、１００倍 希釈の血清をブレインキュベートすることにより阻害された。

ｇｐＨｏペプチドの認識は、Ｄｗ４あるいはＤｗ４°ペプチドのいずれか１０μ ｇ／ｍｌとともに、ブレインキュベートすることにより阻害された（実施例２） 。

上述の結果は、ｇｐｌｌｏおよびＨＬＡ　ＤＷ４に共有されるＥＱＫＲＡＡ配列 が血清学的交差反応の基であることを示す。

爽呂皿立 クラスｌＸパ。　への　Ａ ヒトのクラスＩ　Ｍ）ＩＣ糖タンパク質の不変部分を表す、次のペプチドを構築 する： Ａ−Ｙ−Ｄ−Ｇ−に−Ｄ−Ｙ−Ｉ　−Ａ−Ｌ−（Ｋ／　Ｎ　）　−Ｅ−Ｄ−Ｌ− （Ｒ／Ｓ　）　−５−Ｗ−Ｔ−Ａ−Ａ−（Ｄ　／Ｎ　）　−（Ｍ／Ｔ）−Ａ−Ａ −Ｑ は、ヒトＨＬＡクラス！タンパク質の１１７−１４１位を表し：そしてＥ−Ａ− Ｔ−Ｌ−Ｒ−Ｃ−Ｗ−Ａ−Ｌ−（Ｇ／　Ｓ　ｌ　−Ｆ−Ｙ−Ｐ−Ａ−Ｅ−Ｉ−Ｔ −Ｌ−Ｔ−Ｗ−Ｑ−Ｒ−Ｄ−Ｇ−Ｅ−Ｄ−Ｑ−Ｔ−Ｑ−Ｄ−Ｔ−Ｅ−Ｌ−Ｖ−Ｅ −Ｔ−Ｒ−Ｐ−Ａ−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｔ−Ｆは、１９８−２４１位を表す。

示された配列の１２−１５残基を有する、これらのペプチドの断片もまた、調製 する。

これらのペプチドを、ジサイクロへキシルカルボジイミドを用いてＱ（Ｋ／Ｒ） ＲＡＡ配列のペプチドに結合し、ワクチンにｇ合する。

一方では、上記のペプチドの所望の部分をコードする、Ｑ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ配列 の延長部を有する遺伝子（ペンタペプチドの多量体をコードするコドンを有する 構築物を含む）を構築し、融合タンパク質の生産のための標準的な組み換え発現 系に挿入する。得られる融合物を次に、上述のようにワクチンに調合する。

ＰＭ ＰＭ ＰＭ ＰＭ ＦＩＧ、　２ 　ＩＩ ＨＬＡ　０ｗ４　Ｋ　Ｄ　Ｌ　Ｌ　Ｅ　Ｑ　Ｋ　ＲＡ　Ａ　Ｖ　Ｄ　Ｔ　Ｙ　Ｃ ＨＬＡ　０ｗ２　ａ　Ｋ　Ｄ　Ｆ　Ｌ　Ｅ　Ｄ　ＲＲＡ　Ａ　Ｖ　Ｄ　Ｔ　Ｙ　 ＣＨＬＡ　０ｗ２　ｂ　にＤＩＬＥＱＡＲＡＡＶＤＴＹＣＦＩＧ、　４ 国際調査報告 ＰＯＴ１０５９０１０３０３Ｂ 工ＸＸ、ＤＯＣＯＭＥＮＴＳ　Ｃ０Ｎ５ＸＤ’ＥＲＸＤ　Ｔｏ　ＢＥ　ＲＥＩＪ ＶＡＮ’Ｔ（ＣＱＮＴ工ＮＵＥＤＩＩＩＩ＋＋＋ｌｌＩｌ１ｍｎａｌ　Ａｍ＠ｋ ａｌ＋６Ｎ　Ｈａｙ叩納ｍ１０’＋０ＷＰＣＴ１０５９０１０３０３８ ＲＰ Ｐｅｒ１０５９０１０：１０３８ ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅｓ。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．リウマチ様関節炎に対して被検体を免疫する方法であって、そのような免疫 化を必要とする該被検体に、Ｔ免疫系を刺激するのに有効な量の、免疫原性形態 のＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ配列を有するペプチドを、 ヘルパーＴ細胞に比較して、サプレッサーおよび／あるいは細胞障害性Ｔ細胞群 を優先的に増大させ得る、少なくとも１つの免疫促進剤および／あるいは免疫抑 制剤とともに、投与することを包含する、方法。
2. ２．免疫促進剤が，ＩＬ−２を含むか、あるいは含まない、インターロイキン６ （ＩＬ−６）である、請求項１に記載の方法。
3. ３．免疫抑制剤が、サイクロスポリンＡ、ＴＧＦ−β、および、ＣＤ４表面抗原 に対して免疫反応性である抗体から選択される、請求項１に記載の方法。
4. ４．免疫原性形態のＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ配列を有するペプチドと、ヘルパーＴ細 胞に比較して、サプレッサーおよび／あるいは細胞障害性Ｔ細胞群を優先的に増 大させ得る、免疫促進剤および／あるいは免疫抑制剤とを混合して含有する、薬 学的組成物。
5. ５．免疫促進剤がＩＬ−２を含むか、あるいは含まない、インターロイキン６（ ＩＬ−６）である、請求項４に記載の組成物。
6. ６．免疫抑制剤が、サイクロスポリンＡ、ＴＧＦ−β、および、ＣＤ４表面抗原 に対して免疫反応性である抗体から選択される、請求項４に記載の組成物。
7. ７．リウマチ様関節炎に対して被検体を免疫する方法であって、そのような免疫 化を必要とする該被検体に、特異的なサプレッサーおよび／あるいは細胞障害性 Ｔ細胞の生産を刺激するのに有効な童の、クラスＩ組織適合性配列の不変部分に 結合したＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡＡ配列を有するペプチドを、投与することを包含する 、方法。
8. ８．クラスＩ組織適合性配列の不変部分に結合されたアミノ酸配列Ｑ（Ｋ／Ｒ） ＲＡＡを有するペプチドを活性要素として含有する、リウマチ様関節炎に対して 被検体を免疫するのに有用なワクチン。
9. ９．本質的にクラスＩ組織適合性配列の不変部分に結合されたＱ（Ｋ／Ｒ）ＲＡ Ａ配列を含有するペプチドからなる、組成物。