JPH07506810A

JPH07506810A - 自己抗原である病原性のｔ細胞エピトープおよびｂ細胞エピトープに対する寛容性を誘導するための合成ペプチドの使用

Info

Publication number: JPH07506810A
Application number: JP5514277A
Authority: JP
Inventors: ハイネス、バートン・エフ
Original assignee: デューク・ユニバーシティ
Priority date: 1992-02-10
Filing date: 1993-02-10
Publication date: 1995-07-27
Also published as: ATE193208T1; WO1993015750A1; EP0652764B1; EP0652764A4; DE69328726D1; AU679439B2; CA2129351A1; AU3662993A; EP0652764A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】自己抗原である病原性のＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープに対する寛容性を誘導するための合成ペプチドの使用〔発明の背景〕この出願は、１９９２年２月１０日に出願された米国特許出願第０７／８３３．４２９号の一部継続出願であり、該親出願は１９９０年１０月１日に出願された米国特許出願第０７１５９１．１（１９号の一部継続出願である。更に、この先の親出願は１９８７年９月８日に出願された米国特許出願第９３．８５４号（現在は米国特許第５．０１９．３８７号）の一部継続出願である。これら出願の全内容は、参照として本明細書に組み込まれる。

〔発明の分野〕

本発明は、一般には免疫原性ペプチドに対する寛容性を誘導するための合成ペプチドの使用に関する。より具体的に言えば、本発明は、哺乳類において免疫原性ペプチドまたは免疫原性蛋白に対する寛容性を誘導する方法であって：免疫原性ペプチド若しくは免疫原性蛋白のＮ末端もしくはＣ末端に結合した２〜２０疎水性アミノ酸ペプチドを有する合成寛容原を、寛容性が誘導されるような条件下で、哺乳類に投与することを具備した方法に関する。

〔発明の背景〕

動物およびヒトにおける多くの自己免疫疾患は、自己抗原上の病原性エピトープに対するＴ細胞応答およびＢ細胞応答により特徴づけられる（１ｍＩＩｌｕｏｏｌｈｅｒｇｐ７　ｏｆ　Ｄｉｓｂｅｊｅｓ　ｕｄ　５ｔｌｓｃｊｅｄ　Ａｕｌｏｉｍｍｕｎｅ　Ｄｉｓｕｓｅｓ、　Ｇ、　Ｓ、　Ｅｉｕｎｔｎｒｊｈ　（ＥＤ）　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　ＢＯＣＩ　Ｒａ１ｏｏ、１９８９　；　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｈｅｒｓｐ７　ｉｎ　Ａｌｌ５ｔ１７゜１ｍｍｕｎｏｌｏｇ７．　ｘｎｄ　Ｒｈｅｕｍｔｊｏｌｏｇ２−３゜Ｌ、　Ｍ、　Ｌｉｃｈｌｅｎｔｌｅｎ　ｅｌａｌ、、　Ｂ、Ｃ，Ｄｅｃｋｅｔ、Ｉｎｃ、、　Ｔｏｒｏｎｔｏ　、１９８８）　ｏ自己反応性Ｂ細胞応答により引き起こされる自己免疫疾患および疾病モデルの例を表１に列挙した。自己反応性Ｔ細胞応答により引き起こされる自己免疫疾患および疾病モデルの例を表２に列挙した。自己抗原である病原性のＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープに応答しないようにヒトリンパ球を寛容化する方法は、自己免疫疾患の治療における著しい進歩を意味する。さもなければ、組織損傷の原因となる免疫応答が誘導されるからである。自己免疫疾患の外にも、Ｂ細胞またはＴ細胞の応答が有害であり、従って該応答を停止または減少させることが有利であるような同様の臨床事例が数多く存在する。

病原性の非自己免疫抗体応答の例として、ＡＢＯ不適合赤血球に対する抗体応答がある。このタイプの免疫原に対する寛容性を誘導する方法は、多くの同様な症状を治療するための有力な手段となるであろう。

最近、ある感染性疾病における組織破壊は、感染性病原体に誘導される正常な組織に対する免疫応答によって引き起こされることが明らかになった。例えば、ヒトＴ細胞白血病ウィルス−１（ＨＴＬＶ−Ｉ）感染では、を髄障害（ＩＦξＩｏｐｇｔｂＦ）（ＲＡＭ）をともなうＨＴＬＶ−１の臨床的症候群が、ＨＴｌ、Ｖ −１−ｇｐ４６エンベローブ糖蛋白の特異的領域（ＳＰ４Ａ１）に反応する細胞毒性１９２８球の誘導と関連していることが示された（Ｓ、ＪｓｃｏｂＩｏｍ　ｅｌ　ｔｌ、、Ｊ、＋１１１１！＋０１．　１４６：１１５５−１１６２．　１９９１　）　、同様に、ＨＩＶ感染時ノリンパ性ノ肺炎は、ＨＩＶ感染細胞に特異的な細胞毒性１９２８球（ＣＴＬ）が肺リンパ球中に存在することと関連があることが示された（ＡＩＤＳ、Ｂ、Ｄ、　Ｗｓｌｋｅｒら、４：１７７、　１９９０）　、　ＨＩ　ＶおよびＨＴＬＶ−１の感染においては、疾病の成る種の症状発現は、正常なヒト宿主抗原と交差反応する抗ウイルス性免疫応答の誘導によって引き起こされると考えられている（Ｇ、　Ｗ、　ｌ１ｏｆｆ＋ｕｎ　ｅｊ　ａｌ、、！’ｒｏｅ、Ｎｘ１１．ＡＣｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８：３０６０− ３０６４．　１９９１；　Ｂ、Ｗｉｇｘｅｌｌ　ら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ、ｐ、２４０６−２４１０．　１９９１；　Ｉｌ、Ｇｏｌｄｉｎｇら、５．　Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓ１．　８３：１４３０−１４３５　）。

ロビンソン等は、ＨＩＶエンベロープｇｐ４１エピトープに対する抗体応答によって、ＨＩＶ伝染性が高められることを証明した（Ｗ、Ｅ、　Ｒｏｂｉｏｓｏｎ　ａｌ　＊１．、Ｐｒｏｃ、　Ｎ１ｆ１．　ＡＣｘｄ、Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　８６：４７１０．１９Ｂ９）　、最近、エイズの症状発現の全部ではないにしても、その多くが、正常な宿主ヒトＨＬＡ分子との相同配列を有するＨＩＶウィルス蛋白に誘導されるＨＬＡ抗原に対する、自己免疫応答によって引き起こされるかもしれないとの証拠が示された（Ｇ、　Ｗ、Ｂｏｌｆｉｔｎ　ｅｔ　１１．、　Ｐｒｏｃ、Ｎｘｊｌ、ＡＣｘｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：３０６０−３０６４．　１９９１　；　Ｈ，ＷｉｇｕｌＩ　ｔｌ　ｊｌ、、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　ｐ、２４０６−２４１０．　１９９１　；　１１．　ＧｏｉｄｉＢ　ｅｊ　ｇｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓ１．８３：］４３０−１４３５　）　、従って、病原性のＨＩＶまたはＨＴＬＶ−１の蛋白エピトープ（または自己反応性免疫応答を誘導する他の感染性病原体のエピトープ）に対する寛容性（非応答性）を誘導する方法は重要であり、感染した組織の損傷を妨ぐ新規な形式になるであろう。

組織の破壊を防ぐために、感染性病原体により誘導される免疫応答の寛容性を誘導する能力が、ヘルペスシンプレックスウィルス（ＨＳＶ−１）性角膜炎の治療法として提案されている（Ｒ，Ｌ、　Ｂｅｎｄｒｉｃｋｓ　ｓｌ　ｇｌ、、　Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、、１４２：　２６３−２６９、　１９８９　）。

抗原の形は、蛋白抗原が免疫原であるか寛容原であるかを決定するために重要であることが示唆されている（ｂマ１ｅｖｔｄｉｎ　Ｗｓｉｇｌｅ　（１９８９）、　”Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｔｔｈｅ　ｐｈ７ｓｉｃｓｌ　５ｌｓｌｔ　ｏｌｈｕｍａｎ　ｇａｍｍａ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｗｏ　ｅｎｄ　ｉｎ　ｙ目ｒｏ　１ａｄａｅｌｉｏｎ　ｏｌ　ｉ＋ａｍ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃｘｌ　Ｉｏｌｅｒｉｎｃｅ　”　、　Ｃｈｓｐｔｅｔ　５Ｇ、　Ｍｏｌ、　Ｉｌ、　ｐ、５１−５７　）。高分子量の凝集ガンマグロブリンは強力な免疫原であるのに対して、低分子量のガンマグロブリンは寛容原である（Ｗ、　Ｏ，Ｗｅｉｇｌｅ、　Ｃｈｐｌ、　５Ｇ、　Ｖｏｌ、Ｉｌ、　ｐ、５１−５７．　１９８９）。この場合、凝集ガンマグロブリンの内因性インターロイキン１　（ＩＬ− １）を誘導する能力が、凝集ガンマグロブリンの免疫原性モードとして示唆されている（Ｌ、Ｃ，Ｇｚｈｔｉｓｇ＋ｊ　ａｔ、、Ｊ、Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．、　１４５：１３１ｇ−１３２３，１９９０）。

他の研究者は、幾つかのＴ細胞エピトープは本質的に免疫原性であり、幾つかのＴ細胞エピトープは寛容原性であることを示唆している（Ｄ、　Ｒ，Ｍｉｌｉｃｈら、１、ｌｍ５ａｎＯｆ、１４３：３１４８−３１５６．　１９８９　）。ミルヒは、Ｔ細胞エピトープの１つのアミノ酸を置換することにより、Ｂ型肝炎のコア抗原の寛容原性エピトープを免疫原性エピトープに変換した（Ｄ、　Ｒ，Ｍｉｌｉｃｈｅｔ　ｘｉ、、１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３：３１４８−３１５６．　１９８９）　。ベナセラフは、自由に拡散できる抗原は寛容原性であるのに対して、細網内皮系の細胞内で濃縮される粒子状抗原は免疫原性であることを示唆した（Ｂｅｎｘｃｕｒｘｆ、Ｂ、、ＰｒｏｐＣｒｌｉｓｓ　ｏｌ　８ｎ目ｇｅｌｌｌｉｎ　１ｅｌｘｊｉｏｎ　ｔｏ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｔｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｔｓｓ。

ｉｎ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ！ｌ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ、　Ｍ、ｔｘｎｄｙ、　Ｗ、　Ｂｒｔｕｎ、　Ｅｄ＊。

ＡｃｘｄｆｆｍｉｃＰｒｅｓｓ、　ＮＹ、　ＮＹ　１９６９　）　ｏこれとは対照的に、ノッサルは、粒子状のポリマー抗原であるフラジェリンが強力な寛容原であり、これを生後−カ月以内の新生児ラットに注射すると、サルモネラ・フラジエラ（ｕｌｍａｎｔｌｌｓ　ｌｌ＊（ｅｌｆｓ）への抗体応答に対して寛容性が誘導されると報告した（Ｎｏｓｓ＋Ｉ、Ｇ、、Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｄｏｓｘｇ＊　ｉｎ　Ｒｅｌ＞目Ｏｎ　ｔｏ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｉｖｅｕｕ　ｕｄＮｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｔｓｓ、ｉｎ　１ｍｍｕ＋＋ｏｌｏｇｉｃｇｌ　ＴｏｌＣｒｘｎｃｓ、　Ｍ、　Ｌｔｎｄ７．　Ｗ、　Ｂｒｘｕｎ、　Ｅｄｓ、　Ａｃｘｄｔｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ、　ＮＹ　１９６９　）　ｏ　最後に、抗原が免疫原性であるか寛容原性であるかは、ＭＨＣおよびＴＣＲ分子に対するその結合親和性によるものであることが提案された（ｒｅｖ、５ｐｅｎｔ　ｅｔ　Ｉｌ、、　５ｃｉｅｎｃ＜　２４８：１３５７−２３６３、　１９９０）。

本発明は、ペプチド免疫原の修飾方法であって、これによって強力な免疫原を強力な寛容原に変える方法を提供する。

本発明は、ＨＩＶ−１◆ｇｐ４１のＦドメインが抗原に対して寛容原としての能力を与えるという予期せぬ観察に基づいている。より詳しくいうと、ＨＩＶの未感染細胞への融合を媒介するｇｐ４１エンベロープ蛋白における疎水性Ｎ末端の１２アミノ酸、即ちフッジェニック（Ｆ）　ドメイン（Ｍ、　Ｌ。

Ｂｏｓｃｈ　ｔ＋　１１．、５ｅｉｅｎｃｒ、　２４４：６９４−６９７．１９８９）が、免疫原性の高いＴｌ−３ＰＩＯペプチド及びＴｌ−５ＰＩＯ（Ａ）ペプチド（表３）のＣ末端に付加された（Ｔ、１．　Ｐｒ１ｋｅｔ　ｅｌ　ｓｌ、、ｊ、Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．１４２：３６１２−３６１９；　Ｍ、　Ｋ、　Ｈｓｒｌ　ｅｌ　ｔｌ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４５：２６７？−２６８５，１９９０；　Ｍ、　Ｘ、　Ｂｘｒｌ　ｅｔ　５１１Ｐｒｏｃ、Ｎ１１１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８：９４４８−９４５２．　１９９１　）　、チンパンジーに対して免疫源として用いたとき、Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ及びＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）ペプチドは強力な免疫原であった。これに対して、Ｆ−ＴＩ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）ペプチド（Ｍ、　Ｌ　Ｉ！ｉｒｊ　ｅＩ　ｒｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃｘｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：９４４ｇ−９４５２，１９９１）は、低投与量（０，１ｍｇ／Ｋｇ）または高投与量（０，５ｍｇ／Ｉｇ）　（Ｄ投与ニオイテも免疫原として働かなかった。更に、免疫感作スケジュールの第１６月において、高濃度の免疫原性Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａｌペプチドを動物に作用させたところ、Ｆ−ＴＩ−３ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）に対する免疫を獲得した動物は、丁１−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（幻ＢＩＶ　ｇＰ１２０　ｕｙの決定基に対して寛容性であることが証明された。

〔発明の概要〕

本発明の一般的な目的は、哺乳類において、免疫原性のペプチドもしくは蛋白に対する寛容性を誘導する方法を提供することである。

本発明のより具体的な目的は、哺乳類において免疫原性ペプチドまたは免疫原性蛋白に対する寛容性を誘導する方法であって：免疫原性ペプチド若しくは免疫原性蛋白のＮ末端もしくはＣ末端に結合した２〜２０疎水性アミノ酸ペプチドを有する合成寛容原を、寛容性が誘導されるような条件下において、哺乳類に投与することを具備した方法を提供することである。

本発明の更なる目的および利点は、以下の詳細から明かになるであろう。

〔図の簡単な説明〕

図１は、ＨＩｖ−Ｅｎｖ合成ペプチドで免疫化されたチンバジーにおいて、エライザ分析により行った免疫化ペプチドに対する経時的抗体力価試験を示す図である。

図２は、７日間のトリチウム化チミジン取り込み試験における、Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）ペプチドに対する末梢血液単核細胞の増殖応答を示す図である。

図３は、Ｔｌ−５ＰＩＯペプチド及びＦ−Ｔｌ−ＳＰＩＯペプチドで免疫化されたチンパンジーの、ＰＨＡに対する末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）増殖応答を示す図である。

図４は、Ｇ−７５セフアデツクスカラムに通したＳＰＩＯＭＮ　（Ａ）の溶出プロファイルを示す図である。

図５は、Ｇ−７５セフアデツクスカラムに通したＴｌ−３Ｐ　１０ＭＮ　（Ａ）の溶出プロフィールを示す図である。

図６は、Ｇ−７５セフアデツクスカラムに通したＦ−ＴＩ−３ＰＩＯＭＮ　（Ａ）の溶出プロフィールを示す図である。

図７は、Ｇ−７５セフアデツクスカラムに通したＦ−ＳＰｌｏＭＮ（Ａ）の溶出プロフィールを示す図である。

図８は、Ｆ−Ｔｌ−ＳＰＩＯＩ　Ｉ　ＩＢ　（Ａ）ペプチドを用いたＤＳＰ架橋分析の結果を示す写真である。

図９は、水溶液中でのＦ−ＴＩ−３ＰＩＯＩ　Ｉ　ＩＢ　（Ａ）の仮想モデルを示す図である。

図１０は、ＨＩ　Ｖ　＠ＭＮおよびＩＩＩＢエンベロープ配列に由来するＴｌ− ５ＰＩＯペプチドの変種を示すを図である。

図１１は、ＨＩＶエンベロープ合成ペプチドで免疫化されタチノパンツーにおける、ＩＩＩＶ・Ｔｈ−Ｂペプチド（７）ＴＩ−３ＰＩＩＩＢ（Ａ）に対する末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の経時的なトリチウム化チミジン取り込み反応を示す図である。動物８８４（図ＩＡ）および動物１０２８（図ＩＢ）は、初めにＴｈ −８ペプチドのＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢが投与され（第１−５月）、次にＴｈ− ８ペプチドのＴ−５Ｐ１０１１１８（Ａ）が投与された（第６−８月）。第１４月の時点において、Ｔｈ−ＢペプチドのＴ−３ＰＩＯＩＩＩＢ（Ａ）で追加免疫した後、動物８８４および動物１０２８（７）両者を、ＩＩＩＶＭＮ　Ｔｋ−ＢペプチドのＴ−５ＰＩＯＭＮ　（Ａ）で免疫化した。パネルＣおよびパネルＤは、動物１０４５（パネルＣ）および動物１０７０（パネルＤ）における、ＩＩＩＶＩＩＩＢ　Ｆ−Ｔｈ−Ｂペプチド（第１４月）、ＨＩＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−８ヘブチド（第１６月）、およびＢＩＶＭＮ　Ｔｈ−Ｂペプチド（第１７−１９月）に対する応答を示している。ＰＢＳ中のペプチドを用いた第４月以降の動物１０２８に対する免疫化を除くと、全ての免疫化は、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中の上記ペプチドを用いて行った。図中の実線は、１１１ＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−Ｂペプチドの広範囲の投与量に対するピーク増殖反応（Δｃｐｍ　）のデータを示す。点線は、ＩＩＩＶＭＮ　Ｔｈ−Ｂペプチドの広範囲の投与量に対するピーク増殖応答（Δｃｐ１１）を示す。

図１２は、ＨＩＶエンベロープ配列由来の合成ペプチドで免疫化されたチンパンジーにおける、ＰＨＡに対する末梢血液単核細胞の経時的トリチウム化チミジン取り込み応答を示す図である。免疫化およびチンパンジーは、図１１と同様である。

図１３は、ＨＩＶエンベロープ配列由来の合成ペプチドで免疫化されたチンパンジーにおける、キャンディダ抗原に対する末梢血液単核細胞の経時的トリチウム化チミジン取り込み応答を示す図である。免疫化およびチンパンジーは図１１と同様である。。

図１４は、ＨＩＶエンベロープ配列由来の合成ペプチドで免疫化されたチンパンジーにおける、リンパ球およびリンパ球サブセットの絶対数の経過変化を示す図である。免疫化およびチンパンジーは図１１と同様である。各プロットは、末梢血液リンパ球とリンパ球のサブセットの細胞数／ｌ１１１１３を示す。動物１０２８における第４月で細胞数の増大は、注入部位での膿瘍の出現と一致した。

図１５は、ＨＩＶエンベロープハイブリッド合成ペプチドが、ヤギにおいて、抗ＨＩＶ中和抗体を誘導することを示す図である。ヤギ１０２Ａは、Ｆ−Ｔｈ−８ペプチドのＦ−Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ（＾）３ＩＩ１ｇテ免疫化サレ、ヤギ１０４　Ａ４；Ｌ　ＨＩＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−ＢペプチドのＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢで免疫化された。免疫化は、完全フロインドアジュバント（初発投与）および不完全フロインドアジュバント（投与量２−４月）の存在下で行った。中和力価は、逆転写酵素産物が９０％以上阻害される力価である。

〔発明の詳細な説明〕

本発明は、霊長類（より好ましくはヒト）のような哺乳類に投与されたときに免疫原蛋白に対する寛容性を誘導することができる免疫原を生じさせるために、免疫原性の蛋白および蛋白フラグメントのＮ末端に、長さ２−２０アミノ酸の疎水性アミノ酸配列を合成するか、或いは免疫原性の蛋白および蛋白フラグメントのＮ末端に、長さ２−２０アミノ酸の疎水性ペプチドフラグメントを共有結合的に結合させることにより、免疫原蛋白に修飾を加える方法に関する。

一つの好ましい態様においては、疎水性ペプチドの長さは５−１５アミノ酸である。他の好ましい態様において、疎水性ペプチドの長さは７−１３アミノ酸である。更に別の態様において、疎水性ペプチドの長さは７，８，９，１０，１１゜１２または１３アミノ酸である。また他の例においては、疎水性ペプチドの長さは少なくとも５アミノ酸（より好ましくは少なくとも１０アミノ酸）である。

或いは、自己抗体もしくは自己Ｔ細胞応答の標的として知られている免疫原性蛋白は、上述のような疎水性Ｎ末端領域を含む新しい寛容原を作るための組換えＤＮＡ技術を用いて構築され得る。本発明の有利な構築は、疎水性配列がＢ細胞およびＴ細胞のエピトープに対してそのＮ末端となるものであるが、所定の環境下においては、Ｂ細胞およびＴ細胞のエピトープのＣ末端に疎水性配列を有するほうが有利かも知れない。

この疎水性領域は、ＨＩＶもしくはＨＩＶ関連ウィルス（表５参照）由来の融合蛋白であることができ、或いはランダムに選択された、又は非ＨＩＶ関連蛋白に由来する疎水性アミノ酸配列とすることができる。

自己抗原に対する抗体に寛容性を誘導する本発明の具体例は、重症筋無力症の治療に関するものである。この場合には、アセチルコリン受容体の主要免疫原領域、即ち、ＷＮＰＡＤＹＧＧ　Ｉ　Ｋもしく！１ＷＮＰＤＤＹＧＧＶＫ　（１，Ｐｘｐｄｏｕｌｉ　ｅＩｘｉ、、　Ｂｉｏｃｈｕ＋、　Ｊ、　２６９：２３９−２４５．１９９０　）のＮ末端にＦ配列が合成される。こうして得られる免疫原は、ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＷＮＰＡＤＹＧＧＩＫ、又はＡＶＧ　ＩＧＡＬＦＬＧＦＬＷＮＰＤＤＹＧＧＶＫである。

Ｂ細胞寛容原のもう１つの例は、ＨＩＶ融合ドメインを有するハイブリッド蛋白である。該ＨＩＶ融合ドメインは、インシュリン分子のＢ細胞ペプチドエピトープのＮ末端に線形的に合成され、若しくは全インシュリン分子に共有結合される。或いは、ＤＮＡ組換え技術を用いて、ペプチドインシュリンフラグメント若しくは全インシュリン分子に共有結合され若しくは構築される。結果として得られる免疫原は、ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ−インシュリンまたはＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ−インシュリンペプチドフラグメントである。これらのタイプの寛容原は、若年性真性糖尿病の発現を防止するために（１，ｆ’、Ｐ＊ｌ＋ａｅｙ　ｅｔ　ｓｌ、、　Ｓｃｉｅｍｔｅ２２２：　１３３７−１３３９．１９８３　；　Ｂ、　Ｍ、　Ｄｅｎ　ｓｌ　１１．、　ＤｉｓｂｅｔｏｌｏＨｉｘ２３：３３９ −３４２．　１９８６　）　、またインシュリン耐性がもたらされた状況下において、インシュリン抗体をもつ患者を治療するために（Ｊ、　Ｄ、５ｅｈｎａｌｘ、　Ｄｏｌｏｖｉｃｈ　＋ｌ　ｔｌ、、Ｊ、＾ｌ１ｅｒＢ、　４６：１２７− １１３７．　１９７０　”）に用いることができる。

Ｂ細胞寛容原のもう１つの例は、ＴＳＨ受容体分子のＢ細胞ペプチドエピトープのＮ末端に線形的に合成され、又はＴＳＨ受容体分子全体に共有結合させ、或いはＤＮＡ組換え技術を用いてペプチドＴＳＨ受容体フラグメント若しくは全ＴＳＨ受容体分子に共有結合させ叉は構築されたＨＩＶ融合ドメインを有するハイブリッド蛋白である。その結果として得られた免疫原は、ＡＶＧ　ＩＧＡＬＦＬＧＦＬ−ＴＳＨ受容体、もしくはＡＶＧ　Ｉ　ＧＡＬＦＬＧＦＬ−ＴＳＨ受容体ペプチドフラグメントである。これらのタイプの寛容原は、自己免疫甲状腺疾患（バセドウ病）の治療に用いることができる（Ｔ、　Ｍｏｒｉ　ｃｌａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈ７．　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ１１．　１７８：１６５−１７２．　１９９１　；Ｍ、　Ｍｕｒａｋｘｍｉ　ｅｔ　ｘｉ、、　Ｂｉｏｃｈｓｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈ７．Ｒｌｓ、　Ｃｏｍａ＋、１７１；５１２−５１８．　１９９０）。バセドウ病患者の血清が結合するチロシン（Ｔ　Ｓ　Ｈ）受容体上のＢ細胞エピトープを表６にまとめた（Ｔ、　Ｍａｒｔ　ｅｔ　１１．、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　＆　Ｂｉｏｐｈ７．　Ｒｅｓ、　ＣｏｗＩｌｌ、１７８：１６５−１７２．１９９１　；　Ｍ、　Ｍｕｒａｋｘｍｉ　ｔｌ　ｘｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆Ｂｉｏｐｈ７゜Ｒｅｓ、　Ｃ０ＩＯＩＱ、１７１：５１２−５１８．　１９９０；　０．Ｔｓｋ＠ｉ　ｅｌ　ｔｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈ７．　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、１７９：３１９−３２６．　１９９１　；　Ｔ、　Ｐｉｒｓｐｈｘｆｄ口ｅｔ　Ｉｌ、、Ｂｉｏｃｂｅｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈ７．　Ｒｔｓ、Ｃｏｍｅ、１７２：５２９−５３６．１９９０　＞。興味深いのは、２つの研究によって同定された、自己抗体のＴＳＨ活性を阻害する配列ＹＹＶＦＦＥＥＱＥＤＥ　Ｉ　Ｉ　ＧＦである（Ｔ９Ｍｏｒｉ　ｒｌ　１１．。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、＆　Ｂｉｏｐｈ７．　Ｒｅｓ、Ｃｏ＋ｕ、１７８：１６５−１７２．　１９９１　：　Ｏ。

Ｔａｋａｉ　ｔｌ　１１．、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆　Ｂｉｏｐｈ７．　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｎ、１７９：３１９−３２６、　１９９１　）。バセドウ病において、抗ＴＳＨ抗体に寛容性を誘導するための構成は以下の通りである。

−ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＹＶＦＦＥＥＱＥＤＥ　Ｉ　。

−ＡＶＧＩ　ＧＡＬＦＬＧＦＬＨＱＥＥＤＦＲＶＴＣＫＤＩＱＲＩＰＳＬＰＰＳＴＱＴ。

−ＡＶＧ　ＩＧＡＬＦＬＧＦＬＬＲＱＲＫＳＶＮＡＬＮＳＰＬＨＱＥＹＥＥＮＬＧＤＳ　ＩＶＧＹ　。

−ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＹＹＶＦＦＥＥＱＥＤＥ　Ｉ　ＩＧＦ。

−ＡＶＧ　ＩＧＡＬＦＬＧＦＬＹＫＥＬＰＬＬＫＦＬ　。

自己免疫Ｔ細胞抗原に対する寛容性の誘導に本発明を使用する例は、ミニリン塩基性蛋白分子のＴ細胞ベブチドエピトープのＮ末端に線形的に合成され、叉はＤＮＡ組換え技術を用いてミニリン蛋白分子に共有結合され若しくは構築されたたＨＩＶ融合ドメインを有するハイブリッド蛋白である。その結果として得られた免疫原は、ＡＶＧ　ＩＧＡＬＦＬＧＦＬ−ミニリン塩基性蛋白またはＡＶＧ　Ｉ　ＧＡＬＦＬＧＦＬ−４ニリン塩基性蛋白ペプチドフラグメントである。ミニリン塩基性ペプチド蛋白フラグメントの場合には、脳炎誘発性のＴ細胞エピトープが知られており、その１はウシミニリン塩基性蛋白のアミノ酸配列６９−８９に含まれている（Ｈ，０１ｆｎｅｒ　＋ｔ　ｔｌ、、Ｊ、ｌ＋ｎ＋ｒａｏ１．　１４１：３８２８−３８３２．　１９８８　）　。コ（７）場合、寛容原の１つの構成は、ＡＶＧＩ　ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＳＬＰＱＫＳＱＲ３ＱＤＥＮＰＶＶＨＦである。これらタイプの寛容原は、実験的な自己免疫脳を髄炎の治療に用いることができる。この実験的モデルは、ヒト多発性硬化症の優れたモデルであると考えられている（ＬＷ、　Ｗｕｃｈｚｒｐ［ｅｎｎｉｎｇ　ｔｌ　ｔｌ、、Ｉｅｍｕｎｏｌ、　Ｔｏｄｓ７．　１２：２７？−２８Ｌ１９９１）。多発性硬化症におけるＴ細胞の標的である特異的エピトープが同定されれば、該配列は上記ペプチドで置換されて、多発性硬化症に関与することが判明している全ての抗原蛋白の病原性Ｔ細胞エピトープに対してＴ細胞を寛容化するために用いることができる。

自己免疫Ｔ細胞抗原への寛容性の誘導に関する本発明のもう１つの例は、レチナールＳ蛋白分子のＴ細胞ペプチドエピトープのＮ末端に線形的に合成され、叉は全レチナールＳ蛋白分子に共有結合され、或いはＤＮＡ組換え技術を用いてレチナールＳ抗原フラグメント若しくはレチナールＳ抗原分子全体に共有結合され叉は構築された、ＨＩＶ融合ドメインを有するハイブリッド蛋白である。こうして得られた免疫原は、ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬ−レチナールＳ蛋白、もしくはＡＶＧ　ＩＧＡＬＦＬＧＦＬ−レチナールＳ蛋白ペプチドフラグメントである。このレチナールＳ蛋白ペプチドフラグメントの場合、幾つかの病原性Ｔ細胞エピトープが知られている。

その一つは、レチナールＳ蛋白のアミノ酸配列＋１６９−１１９１に存在する（Ｈ，５ｘｎｕｉ　ｅｔ　１１．、　Ｅｘｐ、　ＩＪ！ｄ、、１６９：１９４７− １９６０．　１９８９）。この場合の一つの寛容原の構成は、ＡＶＧ　Ｉ　Ｃ；ＡＬＦＬＧＦＬＰＴＡＲＳＶＧＡＡＤＧＳＳＷＥＧＶＧＶＶである。これらタイプの寛容原は、実験的に発病させた自己免疫レチノベイティス（ｒ＋１ｉｎｏｕマｅ目ｉｓ）の治療に用いることができ、ベーチェット１Ｂｓｃｈｅｊ’　ｓ）症候群や突発性レチノベイティス（ｒｚｔｉｎｏｕマ５ｉｔｉｓ）のようなヒト炎症性眼疾患の優れたモデルであると考えられている（Ｈ，５５ｍｗ１　ｅｔ　ｔｌ、、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１６９：１９４７−１９６０．　１９８９　）　、ヒト炎症性眼疾患におけるＴ細胞標的である特異的エピトープが発見されれば、それらの配列は上記のペプチドで置換されて、ヒトレチノベイティスであることが判明した如何なる抗原蛋白であっても、病原性Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞を寛容化するために用いることができる。

感染性病原体により誘導された病原性免疫応答の治療に関する本発明の例は、熱帯地方特有の痙傘性不全対麻痺に見られるＨＴＬＶ−Ｉ関連のを髄障害症候群の治療である（ｔｅマ。

ｊａｃｏｂｓｏｎ　ｔｌ　ｔｌ、、　Ｊ、ｌａ＋ａ＋ｕｎｏ１．　１４６：１１５５−１１６２．　１９９１　）。

この疾患においては、中枢神経系において、ＨＴＬＶ−１感染細胞に対する細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導されることによって、神経性疾患が引き起こされるとの強力な証拠がある（Ｓ、　Ｊｘｃｏｂｓｏｎ　ｅｊ　ａｔ、、　１．　ＩｍＩＩ＋ｕｎｏ１．１４６：１１５５−１１６２．１９９１）。ヤコブソン等は、熱帯地方特有の痙傘性不全対麻痺（ＴＳＰ）においてＣＴＬを誘導するＨＴＬＶ −１＊　ｅｎｖ・ｇｐ４６の主要領域は、ペプチド５Ｐ４ａｌにより定義されるｇｐ４６のアミノ酸配列１９６−２０９の部分であることを示した（Ｓ、Ｊｓｃｏｂｓｏｎ　！ｌ　！ｌ、、Ｊ、Ｉｅｍｕｎｏｌ、１４６：１１５５−１１６２．　１９９１　；　Ｔ、　Ｊ、　Ｐａ１ｋｅｒ　ｅｊ　Ｉｌ、、Ｊ、ｌａａ＋ｕｎｏ１．、　１４２：９７１−９７８゜１９８９；　Ａ、ｋｕｒｘｌｓ　ｅｔ　１１．、Ｊ、Ｉａｕａｕｎｏｌ、１４３；２０２４−２０３０．　１９８９）。

従って、本発明はＴＳＰを治療するために、ハイブリッドペプチド：　ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＬＤＨＩ　ＬＥＰＳＩＰＷＫＳＫＫとして実施することができる。ＨＴＬＶ−１の新しい病原性ＣＴＬのエピトープが発見されれば、治療用ペプチドの構成はＦ−Ｘとすることができる。ここで、Ｆは疎水性の配列を示し、Ｘは感染性抗原のＣＴＬエピトープを示す。

ＨＩＶの臨床症状は、ヒトＭＨＣクラスｌおよびクラス１１分子との相同性を有する配列をもったＨＩＶ構成要素に誘導される、自己免疫応答によるものであることが想定されている　（Ｇ、Ｌ　Ｅｏｌｌｎａｎ　！ｔ　ａｌ、、Ｆｌｏｅ、Ｎｒｔｌ、Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：３０６０−３０６４．　１９９１　；　１１．　Ｗｉｇｘｅｌｌ　ｅｌ　ｇｌ、、　ＦＡＳＥＢ　１．　Ｐ、２４０６−２４１０、　１９９１；　Ｂ、　ＧｏｌｄｉＢ　＊ｆ　Ｉｌ、、１．　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　８３：１４３０−１４３５　；　Ｆ、　Ｇｒｍｓｓｉ　ｔｌ　！ｌ５．　Ｊ、ＥｘｏＭｔｄ、、１７４；５３−６２．　１９９１　；　Ｊ、　Ａ、　Ｔ、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３３：２１５．　１９８８；　１１．　Ｇｏｌｄｉｎｇ　ｅｌ　！＋、、１．　ＥＸＩＴ、　Ｍａｄ、、１６７：９１４−９２３．　１９８８　）　、　ＨＩ　Ｖ感染を治療するために、本発明では、一連のハイブリッド蛋白を構成することができる。その各々のペプチドは、ＨＩｖ・ｇｐ４１融合ドメイン（表５参照）のようなＮ末端疎水性ペプチドと、ＭＨＣクラス■およびクラス１１分子との相同性配列を有するＨＩＶ−ｅｎｖ蛋白の各領域由来のＣ末端ペプチドとを含んでいる（Ｇ、　Ｗ、　Ｈｏｆｆ＋＋＋ｇｎ　ｅｌ　ｔｌ、、Ｐｒｇｃ、　Ｎ８０９＾ｃｘｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８：３０６０−３０６４．　１９９１　；　１１．　Ｗｉｌｕｌｌ　＊ｔ　ｔｌ。

、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、ｐ、２４０６−２４１０，１９９１　；　Ｈ，Ｇｏｌｄｉｎｇ　ｚｌ　ｘｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ。８３：１４３０−１４３５；　Ｆ、Ｇｒａｓｓｉ　！ｌ　１１．、Ｊ、Ｅｘ。

Ｍｓｄｌ、１７４：５３−６２．　１９９１　；　Ｊ、Ａ、Ｔ、Ｙｏｕｎ（、ＮＡｌｕｒｅ、３３３：２１５、　１９８８；Ｂ、Ｇｏｌｄｉｎｇ　ｅｌ　ｘｌ、、１．　Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６７：９１４−９２３゜１９８Ｂ）Ｃ表７参照）。或いは、ＨＩＶ感染者をＦ−Ｘペプチドで治療することが有利であるかもしれない。ここで、ＦはＨＩＶのフッジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）　ドメインのような疎水性ペプチドであり、ＸはＴ細胞およびＢ細胞に対して免疫原性のＨＩＶペプチドフラグメントである。この状況下での混合ペプチドは、ＨＩＶに感染した抗原提示宿主細胞を損傷させる破壊的抗ＨＩＶ免疫応答を阻害するために用いられるであろう。このタイプのペプチドの例は、表３および図１０に示されている。これらのペプチドは、図１および図２に示したチンパンジーを、Ｔｌ− ５Ｐ　（Ａ）抗原決定因子およびｇｐ１２０総蛋白に対し寛容化するのために用いられたペプチドである（表４）。

以下、非限定的な実施例に従って、本発明を更に詳細に説明する。

例　ＩＨＩＶφｅｎｖ合成ペプチドで免疫化されたチンパンジーにおいて、免疫化に用いられたペプチドに対する抗体価を、経時的にエライザ分析でＭ１定した結果を図１に示した。動物８８４および動物１０２８について、エライザ分析に用いたペプチドはＨ−５Ｐ１０１１１Ｂであった。一方、動物１ｏ４５および動物１０７０に関しては、エライザ分析で用いられたペプチドはＦ−ＴＩ−５Ｐ１０１１１Ｂ　（Ａ）であった。全ての免疫化は、不完全７ｏインド°γシユバンド（ＩＦＡ）＋ＰＢＳ　（１：　１）（７）存在下で行わわた。但し、動物１０２８は例外で、第３月の免疫化以降に筋肉内（ＩＭ）に腫瘍ができ、１つの免疫が維持されてしまったため、その後の免疫化は全てＰＢＳのみの存在下で行った。図１かられかるように、Ｔｌ−５ＰＩＯペプチドは動物８８４および動物１０２８において優れた免疫原であるが、Ｔｌ−５ＰＩＯペプチドのＮ末端に結合さセｔ＝　ＨＩＶ　ｇｐ４１融合（Ｆ）ドメインをもつＴｌ−５ＰＩＯペプチドは、Ｆドメインをもたないペプチドで誘導されたと同程度に高いか、若しくは長時間持続する抗体価を誘導しなかった。

注目すべき重要な点は、第１６月に、動物１ｏ４５および動物１０７０に対して、動物８８４および動物１０２８で上記のような良好な抗体価を誘導した免疫原Ｔｌ−３ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）を作用させたことである。動物１０４５および動物１０２８は、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ　）存在下においてＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　ＦＡ）に応答しなかった。これは、動物１０４５および動物１０２８が、Ｆ−ＴＩ−ＳＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）ペプチドによる先の免疫化に起因して、Ｔｌ−５ＰＩＯ（Ａ）に対して寛容性であったことを示している。また、第１４週において、動物８８４への追加免疫によってＴｌ−５ＰＩＯＩＩ！Ｂ　（Ａ）ペプチドに対する抗体価の上昇がもたされたのに対して、これと同時に行った動物１０２８への追加免疫ではそれが見られなかったことにも・注目することが重要である。動物８８４の追加免疫は、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）と共に行なわれたが、動物１０２８の追加免疫はアジュバントなしで、ＰＢＳのみの存在下で行われた。

７日間に亘って行われたリチウム化チミジン取り込み分析における、Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ（＾）ペプチドに対する末梢血液単核細胞の増殖反応を図２に示す。ペプチドＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ及びペプチドＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）は、動物８８４および動物１０２８において、循環している末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のハイレベルな増殖を誘導した。そのレベルは６力月の休止後（第１４月において）検出できないところまで落ちたが、動物８８４および動物１０２８では再び増加した。６力月の休止後にアジュバント無添加のＰＢＳのみで免疫化したにも関わらず、動物１０２８での増殖応答は各回の追加免疫により増加した。Ｂ細胞応答でのように、Ｆｌ−ＴＩ−５ＰＩ−１１１８（＾）ペプチドで免疫化された動物１０４５および動物１０７０は、ペプチドＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　ｆ＾）に対して増殖を示さなかった。これらの動物１０４５および動物１０７０は、動物８８４および動物１０２８では良好な免疫原であったＴｌ−５ＰＩαＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドで免疫化されたときにも、何れもＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）ペプチドに対する増殖応答は起こさなかった。こうして、ＦドメインのＮ末端をＴｌ−３ＰＩＯペプチドに添加することにより、ｇ　ｐ　１．２０のＴ１領域および５ＰＩＯ領域に対して動物１０４５および動物１０７０を寛容化させ得る寛容原が作り出されることが証明された。表４で示すように、動物８８４および動物１０２８の両者はネイティブなｇｐ１２０に対する増殖試験では反応したが、動物１０４５と動物１０７０は、それらの免疫化に用いたペプチドに対してと同様に、ネイティブなｇｐ１２０に対しても寛容性であった。

ペプチドＴｌ−５ＰＩＯ及びペプチドＦ−ＴＩ−５ＰＩＯで免疫化されたチンパンジーの、受動血液凝集（ＰＨＡ）に対するＰ　８ＭＣ増殖応答を図３に示す。

このデータは、動物１０４５および動物１０７０がＨＩ　Ｖφｇｐ１２０のＴ１領域と５ＰＩＯ領域に対しては寛容性であるが、免疫期間中、これら動物におけるＰＭＢＣのＰＨＡ応答は正常であったことを示している。

同様の結果が、ｉｎ　ｖｉｌｒｏでの７日間の刺激テストにおける、キャンディダ抗原に対する末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の応答でも得られた（データは示さない）。従って、これらの動物１０２９および動物１０４５は、ＨＩＶ・ｅｎｖの決定因子であるＴ１及び５ＰＩＯ（Ａ）に対して特異的に寛容性ではあるが、全般的に免疫反応を抑制されているわけではなく、ｉｎ　ｖｉｌｒｏでのＰＨＡ刺激およびキャンディダに対して応答可能であった。

Ｔ細胞および／またはＢ細胞の決定因子に疎水性配列をもったＮ末端を負荷することによる、ペプチド四次構造に及ぼす影響が試験された。水溶性緩衝液と、ヘテロ二機能性薬剤のジチオビス（スクシンイミジルプロピオネ−））（ＤＳＰ）で架橋結合されたモノマーペプチドとの存在下において、Ｇ−７５クロマトグラフイーを用いて、ＨＩＶまたはＨＩＶ様レトロウィルスの融合（Ｆ）　ドメインのような疎水性配列を負荷することにより、Ｔｌ−５ＰＩＯ（Ａ）若しくはＳＦ ’ｌ０（Ａ）ペプチドに高分子量凝集体を形成する能力が与えられ、該凝集体は蛋白のミセルの形状を示すらしいことが判明した。

Ｇ−７５セフアデツクスカラムを通したＳＰＩＯＭＮ　（Ａ）の溶出プロフィールを図４に示す。１００　＋ｏＭ　ＫＣＩ及び５％グリセロールを含む２１の５０　ｍＭ　Ｔｔｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）中の、４脂１の各ペプチドが直接に、５０ｍＭ丁ｔｉｓ−ＢＣＩ　（ｐＨ７，５）で平衡化された９０Ｘ１．６ＣＩＩｌのＧ−７５セフアデツクスカラムに掛けられた。該サイジングカラム（分子量測定カラム）について、ブルーデキストラン（２００，０００）　、ウシ血清アルブミン（６６、０００）、ウシ赤血球炭酸脱水素酵素（２９，０００）、ウマ心臓チトクロム（１２，４００）、ウシ肺アプロチニン（６，５００）を用いて検量線が作成された。各々のペプチドの溶出位置は、０Ｄ２８０ＩＩ１１で溶離液の吸光度を連続的に測定することにより決められた。各ペプチドのピークに相当する分子量は、カラムの検量線から計算された。各々のペプチドはまた、Ｃｌ２Ｅ９　［ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル］を０．１％含む同様の緩衝液で平衡化されたカラムに掛けられた。ＳＰＩＯＭＮ　（Ａ）ペプチド（推定Ｍｒ・２８７８）は、６５　ＤＩ以下の低分子量形として移動した。同様に、ＴＩＴｌ−５ＰＩＯ（＾）ペプチド（推定Ｍｒ曹４７７１）もまた、１２．０００　ＤＩから６，５００ＤＩまでの範囲の低分子量体として移動した（図５参照）。これとは対照的に、Ｆ−５ＰＩＯＭＮ　（Ａ）ペプチド（Ｍｒ・４０３８）およびＦ−ＴＩ−５ＰＩＯＭＮ　（Ａ）ペプチド（Ｍｔ・５９３０）は、両者共に〜６６、０００　Ｄａで移動する高分子量体を含んでいた（図６，７）。

図５１図６および図７で用いた方法は、図４で用いたのと同様であった。

Ｆ−ＴＩ−５ＰＩＯＩＩＩＢ（Ａ）ペプチドを用いたＤＳＰ架橋分析の結果を図８に示す。レーンＣは、非還元性条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で泳動させた際の、ＤＳＰ無添加ＰＢＳ中のペプチドの形態を示す。レーンＤ、Ｅ、Ｆ及びＧは、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけるに先立って、６．２５μｇ（Ｄ）、１２．５μｇ（Ｅ）、２５μｇ　（Ｆ）、５０Ｍｇ　（Ｇ）のＤＳＰでペプチドを架橋したときの、ペプチド分子量に対する影響を示す。レーンＨは、５０ＭｇのＤＳＰで架橋したペプチドに２−ＭＥを添加し、次いで還元状況下に５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で泳動させた結果を示す。その結果は、レーンＨで見られる全ての架橋体と、レーンＣで非還元非架橋下で見られる多くの形態の全てが、今や７０００　ＸＤｓの２つのバンドにまで減少したことを示している。現時点では、還元条件下における二つのペプチドバンドの性質は知られていない；これらの２つのバンドは、調製ゲルから該バンドを切り出すことにより精製することができ、またマススペクトロスコピーによる解析および配列決定を行うことができる。レーンＡおよびレーンＢは、１％のトライトン−Ｘ　１００存在下でＦｌ−Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢｆ＾）ペプチドを架橋し、還元条件（Ａ）および非還元条件（Ｂ）の下で泳動させた結果を示している。これらデータは、高分子量複合体を互いに凝集させている明らかな疎水性相互作用が、この界面活性剤による崩壊作用に対して耐性であることを示している。

水溶液中におけるＦ−ＴＩ−３ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）の仮想モデルを図９に示す。このモデルは、外向きに親水性ｖ３領域を突出させ。

ミセルのコア内に、ペプチドの疎水性融合ドメイン（Ｆ）領域が存在するような蛋白ミセルが形成されることを示している。

例２−８下記の実験の詳細およびプロトコールが、例２−８で参照される。

くペプチド〉二　以下の例２−８で用いられたペプチドは、表８に記載された通りである。ペプチド合成は、ペプチド合成機（Ａ４３１；＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｊｅｍｓ、Ｉｎｃ、Ｆｏｔｌｓｔ　ＣＮ７．　ＣＡ）を用い、１−ｂｏｃ化学またはＩ−ｗｏｅ化学を用いて行われた。ペプチドはＨＰＬＣを用いて精製された。また、その分子量はダブルフォーカス質量分析計（ＢＸＩＩＯＩＩＦ；　１ｏｔｌ　Ｌｉｄ、、　Ｔｏｋ７ｏ。

Ｊａｐｇｎ）を用いた、高速原子ボンバードメント（ＦＡＢ）ｉｔ量量分性法Ｒ，Ｂ、　Ｖｌｌｌ　Ｂｒｅｅ＋ａａｎ、　Ｎｏｒｔｋ　Ｃ＊ｒｏｌｉ＋＋ｓ　５Ｉｘｔ！Ｕｎｉｔｅｒｓｉｔ７．　Ｒｘ！ｅｉ（ｈ、　ＮＣ）により決定された。Ｔｈ−Ｂペプチド及びＦ−Ｔｈ−Ｂペプチド（表８）に関して、Ｆ−Ｔｈ−８ペプチドであるＦ−ＴＩ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）は、予想分子量は５９０８であったが実測値は５９０７であった。　Ｔｈ−８ペプチドであるＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢの予想分子量は４０６１であったが、実測された値は４０６２であった；Ｔｈ−ＢペプチドであるＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（１）の予想および実測分子量は４．７４９であった。　Ｔｈ−８ペプチドであるＴｌＴｌ−５ＰＩＯ（Ａ）の予想および実測分子量は４，７７１であった。以下の例で用いられたペプチド（表８）に関して、ペプチド量は総重量である。各ペプチドのカールフィッシャー試験（Ｇ＊１ｂｒｔｉｌｈ　Ｌｘｂ。

＋５ｌｏｒｉ？ｓ、Ｉｎｃ、　）［ｎｏｘｖｉｌｌｅ、　７Ｎ）による水分含量（％）は、Ｆ−ＴＩ−３ＰＩＯＩＩＩＢ　ｆ＾）で６％；　Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ（Ａ）で８％；Ｔｌ−５ＰＩＩＩＢで６％、ＴＩＴｌ−５ＰＩＯ（Ａ）で８％であった。

く動物〉：　チンパンジーは、ニューメキシコ州アラモゴルド（＾Ｉａｍｏｇｏｒｄｏ）のニューメキシコ州立大学附属動物施設で飼育された。チンパンジーＮｏ、８８４　（１５齢）とＮｏ、　１０２８　（１２齢）は同じ父を持ち；動物Ｎｏ、　１０４５　（ＩＱ齢）とＮｏ、　１０７０　（１１齢）は互いに血縁関係がなく、またＮｏ、　８８４及びＮｏ、　１０２８の動物とも血縁関係関係がなかった。異系交配されたヤギはデューク大学附属動物施設で飼育された。

く免疫化〉：　ヤギに対しては、３　ｍｇのペプチドを完全フロインドアジュバントｆＣＦ＾）存在下（１回目投与）、また不完全フロインドアジュバント（ｌ　ＦＡ）存在下（２回目の投与）で、各々臀部の筋肉内に注射した。チンパンジーの免疫化については、ペプチドの投与量を違えて左右の上腕および腿にｌｃｃずつ、総量４ｃｃがＩＦＡ存在下で筋肉内に注射された。

くエライザ分析＞：　Ｔｈ−ＢペプチドであるＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ。

もしくはｒｇｐ１２０１１１Ｂ　（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃａｒｐ、、　Ｃｘｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＤ　）の２μｇがＣＢＣ緩衝液（１５ｍＭ　Ｎ！２ＣＯ３，３５ｍＭ　Ｎａ１ｌＣＯ３、ｐＨ９，６）中に溶解され、９６穴平底プレート（Ｃｏｓｔｅｒ　３５９０　）で−晩インキユベートされた。ウェルは少なくとも２時間、３％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＣＢＣ緩衝液でブロックされ、次いでＴＷ！ｅｎ　２０を０．０５％含むＰＢＳで３度洗浄された。血清希釈液（９５ｉＩ　ＰＢＳ、　０．０５％Ｔｖｔｅｎ２０、二次抗体と同じ種に由来する正常血清２ｍｌ中の５ｇＢＳＡを補充した）中の、濃度の異なる一次抗体が２０℃で９０分間インキュベートされた。３回洗浄した後、アルカリフォスファターゼを結合させた２次抗体が各のウェルに添加され（ＲＴで６０分）、プレートが洗浄された。０．０５Ｍ　ＣＢＣ−０，０２ＭＭｇＣＩ２中の基質（１ｍｇ／ｍｌ　ｐ−二トロフェニルリン酸塩、　Ｓｉｇｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、５１．　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を各ウェルに添加し、プレートを暗所で現像しく２０℃で６０分間）、エライザリーダー（Ａｎｌｈｒｏｓ；　Ｄ！ｎ１Ｃ７１ｎｓｊｒｕｍｔｎｔｓ　Ｃｏ、、Ｄｕｒｂｓｍ、　ＮＣ）を用いて４０５　ｎｍでの吸光度を読んだ。終点のエライザ抗体価が、実験値／コントロール値（Ｅ／Ｃ）　００値≧３．０となる血清力価として定義された。

＜ＨＩＶ中和分析〉：　チンパンジーもしくはヤギ血清抗体がＨＩＶを中和する能力は、シンシチウム阻害分析と以前に既述された逆転写酵素阻害分析で測定された（Ｐｒｌｋ＊ｒ　ｅｌａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２：３６１２　（１９８９）　；　Ｐｌｌｋｅｒ　ＣＩ　ＩＩ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：１９３２　（１９８８）　）　、血清は、各分析の前に熱で不活化された（５６℃で３０分間）。

く末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離およびＩｎ　ＶＮｒｏでの３Ｈ−チミジン取り込み分析〉：チノパンツー及びヤギのＰＢＭＣを、標準的な密度遠心分離法を用いて単離した（Ｐｇｌｋｅｒ　ｅｌ　１１．、Ｊ、１ｍａ＋ｕｎｏ１．　１４２：３６１２　（１９８９）　；　ＢＢ＋＋ｅｓ　ｅｌ　ｉｆｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１５：２９８　（１９８２））　。

Ｉｎ　Ｍ山ｏでの３Ｈ−チミジンの取り込みについての分析は、既に参考文献に記載されている方法により行った（Ｐｘｌｋｔｔ　ｔｌ　ａｔ、、　１．　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．　１４２：３６１２　（１９８９）；ｌ１ｉｒｊ　ら、　Ｊ、ｌａ＋ｍｕｎｏｌ、１４５・２６９７　（＋９９０）　）。チンパンジーのＰＢＭＣ分析に関しては、１０％の正常なチンパンジー血清を用いてＩｎ　Ｖ口「０での培養が行イつれた。Ｐ　Ｂ　Ｍ　Ｃの増殖で用いた抗原は、ペプチドＴｈ−ＢであるＴｌ５Ｉ’１０１１１Ｂ　（Ａ）及びＴｌ−５ｆ’ｌＯＭＮ　（Ａ）　（表８）、並びにカンジダ・アルビカンス抗原（Ｇｒ！ｅｔ　ＬＩｂｏｒｉｌｏｒｉｅｓ。

Ｉｎｅ、Ｌｅｎｏｉ＋、ＮＣ）であった。３日間のＰＢＭＣ−３Ｈ−チミジン取り込み分析において、ＰＨＡは有糸分裂促進物質として広範な投り童で用いられた（Ｐａｌｋｕ　ｅｆ　ｓｌ、、Ｊ、ｌ１ａａｏｏｌ。

１４２：３６１２　（１９８９）　；　Ｂａｔｌ　ｅｔ　Ｉｌ、、　Ｊ、１ｍａ＋ｕｎｏ１．　１４５：２６９７（１９９０））　、Δｃｐｍ−実験ＣｐｌＩｌ値−コントロールＣｐｌ値く免疫化スケジュール〉：　ヤギ及びアカゲザルにおいてＴｈ−８ペプチドの免疫原性を示した以前の研究があるので（ｌｌａｒｔ　ｅｊ　ｓｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４５：２６９７　（１９９０））　、この研究が１９８９年に始められたとき、初期のペプチドデザインの比較は、ペプチドＴｈ−Ｂ対Ｆ−Ｔｈ−Ｂ　（表８）を約０．Ｉ　Ｂ／Ｋｇ　（６ｍｇ／動物）の投与量で月毎に注射することによって行われた。

何れのペプチドデザインも抗−〇ＩＶＩＩＩＢ抗体の中和を誘導しないときに、ペプチドの投与は約０．５　ｍｇ／ｋｇ　（３ｈｇ／動物）まで増加された。そこで、Ｔｈ−８ペプチドの抗−ＨＩＶＩＩＩＢ中和抗体を誘導する能力を増強するために、ＢＩＶＩＩＩＢ　ｇｐ１２０　Ｖ３ループの右側中和配列（ｌｈｅ（Ａ）領域）　（Ｉｌｉｒｔら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目。

ＡｃＪｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：９４４８；　Ｒｕ５ｃｈｅ　ｅｌ　ｔｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎｔｌｌ、Ａｔ１ｄ、Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　８５：３１９８）　（表８）がＴｈ−Ｂペプチドに添加された。０．５　ｍｇ／ｋｇ　（３０ｍｇ）まで丁ｈ−ＢまたはＦ−Ｔｈ−８ペプチドを月毎に３回注射した後、これら動物を６カ月間休ませた。

次イテ、ＩＩＩＶＩＩＩＢ由来の配列をもツＦ−Ｔｈ−Ｂ若しく　４ｉ　Ｔｋ− Ｂ　。

又は単離された１１１ＶＭＮ由来のＲＩＶ　ｔｎｖ　１ｐ１２０　Ｖ３配列を含む丁ｂ−Ｂペプチドで再免疫化された。

くフローサイトメトリー〉：　チンパンジーＰＢ単核細胞が、フローサイトメーターを用いた標準フローサイトメトリーにより研究された（７５１；　Ｃｏｕｌｔｕ　ＥＩｅｃｌｒｏ＋＋ｉｃｓ、Ｉｎｃ、、旧ｒｌｅｓｈ、　ＦＬ　）。ＰＢリンパ球は、以下のマーカーにより同定された。即ち、全Ｔ細胞はＣＤ３．　７細胞サブユニツトはＣＤ４とＣＤ８．　Ｂ細胞はＣＤ１９．　ＮＫ細胞はＣＤ５６とＣＤ１６である。

例２チノパンツー及びヤギにおける、ペプチドＴｈ−Ｂ及びペプチドＦ−Ｔｈ−８（７）、抗ペプチド又は抗−ＢＩＶ　ｇｐ　１２０抗体応答に関する免疫原性ＢＩＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−８ペプチドで免疫化されたチンパンジー（チノパンツ一番号は８８４と１０２８）に関して、免疫化ペプチドに対する抗体は、初期の免疫化期間中に増加した（表９）。免疫化部位に膿瘍を発生したチンパンジー（番号１０２１１１）は、第５月には免疫化を受けなかった。そして第５月以後、この動物（番号１０２８）での免疫化は全てＰＢＳのみの中で行つた。第４月において、動物番号１０２８でのエライザのピークの終点、即ち抗ペプチド抗体価はｌ：　８１９，２００であったが、この動物番号１０２８での抗体価は、免疫原からＩＦＡが取り除かれた後に減少し、その後の残りの免疫期間中ずっと低い値をを示した（表９）。チノパンツ一番号８８４では、ペプチドＴｈ−８による５回の免疫化の後に、抗体値は第７月でｌ：　２０４：８００まで上昇した。動物番号８８４に対し、ペプチドＴｈ−８の高投与量ＤＯｍｇ／１回の投与）で引き続き免疫化しても、抗体価の一層の増加はみられなかった（表９）。

対照的に、動物番号１０４５及び動物番号１０７０において、ペプチド旧ＶＩＺＩＲＦ−Ｔｈ−Ｂを用いた第１〜１０月の免疫化では抗ペプチド抗体のレベルはかなり低く、動物番号１０２８および動物番号１０７０の免疫化抗体に対する第７月のピーク抗体レベルは、夫々　ｌ：　２５，６００及びｌ：　１２，８００であった（表９）。４頭全ての動物について６力月の休止期間を置いた後に、動物番号８８４及び動物番号１０２８は、第１４月に６ｅｇのＴｈ−Ｂペプチドで免疫化された。チノパンツ一番号８８４において、第１４月にＩＦＡ存在下でのＴｈ−Ｂペプチドによる追加免疫を行ったところ、抗ペプチド抗体価はｌ：　１０２，４００まで上昇した。

一方、ＩＦＡ無添加のＰＢＳ中ペジペプチド物番号１０２８を免疫化しても、抗体上昇は生じなかった（表９）。

これとは対照的に、動物番号１０４５および動物番号１０７０については、ペプチドＦ−Ｔｈ−８の先の投与量が過剰であり、ハイゾーンの寛容性が誘導されていないかどうかを判定するために、またＦ由来の少量のペプチドがより強い免疫原性をもつか否かを判定するために、第１４月の時点において、１ａＩｇ（〜０．０１６　ａ＋ｇ／Ｊ　）のＦ−Ｔｈ−Ｂで免疫化した。６力月の休止期間の後、動物番号１０４５及び動物番号１０７０のチンパンジーに対して、１ｍｇのペプチドＦ−Ｔｈ−Ｂによる免疫化を行っても、抗ペプチド抗体の血清価は、ｌ：　８００までの最小限の上昇を生じたにすぎなかった（表９）。

チノパンツ一番号１０４５および番号１０７０の両者は、これら動物がペプチドＴｈ−８に対して寛容性であるかどうかを決定するために、第１６月において、ペプチドＩＩＩＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−ＢであるＴｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（＾）で免疫された。動物番号１０４５および動物番号１０７０は両者共、ペプチドＴｈ −Ｂでの追加免疫に対して、夫々ｌ：　１６００及びｌ：　３２００の抗ペプチド抗体応答で最小限に応答を示した。このことは、動物１０４５および動物１０７０が、第１６月でＴｈ−Ｂ　ＲＩＭ　ｔｎマエピトープに対して低反応性であることを示している（表９）。

例３抗ペプチド抗体をハイレベルで誘導するペブ−ｙ−Ｆ　ＩＩＩＶＭＮ　Ｔｈ−ａを用いた動物番号１０４５および動物番号１０７０の免疫化衣に、動物番号１０４５及び動物番号１０７０は、寛容原とは異なるが構造的にこれと関連のある免疫原での免疫化による以前記述されたＢ細胞寛容性破壊の手法（Ｗｅｉｇｌｅ、　Ｎａｔｕｒａｌ　ｕｄＡｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｕｎｒ＋５ｐｏｎｓｉｖｅｉｅｓｓ　（１９６７）＋　Ｃｈ＊ｐｌ＊ｒ４　、ｐｐ、５７ −１５１　）を用いて、ＩＩＩＶｉＪＮ由来（７）　Ｔｈ−Ｂ　ヘブチトテ免疫化された。ＩＩＩＶＮＭＮ由来のペプチドＴトＢは、ＩＩＩＶＩＩＩＢ由来のＴｈ−Ｂペプチドと同様のＴｈ（Ｔｌ）　１ｐ１２０配列を含んでいルカ、ＩＩＩＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−Ｂペプチドのそれとは異なるＢ細胞ｇｐ１２０Ｖ３　Ｂ細胞エピトープの配列を含んでいた（表８）。第１７月に始められた、ＢＩＶ　ＭＮ由来のＴｈ−Ｂによる２回の免疫化の後、チノパンツ一番号１０４５および番号１０７（ｌテＧ！、ＩＩＩＶＩＩＩＢ（表９）およびＩＩＩＮＭＮ　Ｔｈ−８ペプチド（データの記載なし）に対する抗体価が迅速に上昇した。その抗体レベルは、それ以前の第１８月までの研究期間で得られた（レベル）よりも高かった。

第２０月における１！ＩＶＭＮ　Ｔｈ−８ペプチドに対する終点エライザ価は、動物１０４５ではｌ：　１０２，４００であり、また動物１０７０では１：　２０４．８００であった。

２０力月免疫化期間中の、組換えＨＩＶＩＩＩＢ　ｇｐ１２０に対するチンパンジーＢ細胞抗体応答第４−７月および第１６−２０月からの血清について、組換えＩＩＩＶＩＩＩＢ　ｇｐ１２０　に対する終点エライザ抗体価が測定され、ピーク抗ペプチド抗体レベルと抗ｇｐ１２０　ＥＩＶエンベロープ抗体レベルとの相関性がめられた。

第４−７月の間、チノパンツ一番号８８４および番号１０２８の抗ｇｐ１２０ピーク抗体レベルは、両者共にｌ＋　２５，６００となった。一方、同じ期間において、チノパンツ一番号１０４５および番号１０７０でのｇｌ１１２０に対するピーク価は、夫々ｌ＋　６，４００および０であることがわかった。抗ペプチド抗体レベルの場合と同様に、６力月の休止期間の後に、チノパンツ一番号１０２８においてＰＢＳ中でのペプチドを用いた追加免疫によっては、抗ｇｐ−１２０抗体の産生は増強されなかった。

動物１０７０及び動物１０４５では、第１４月でのＦ−Ｔｈ−Ｂペプチドによる追加免疫、並びに第１６月でのＩＩＩＶＩＩＩ　ＴトＢによる追加免疫によって、第１７月までに、抗−ｇｐ１２０抗体価の最小限の上昇がもたらされた（１：　１２．８００まで）。対照的に、チノパンツ一番号１０４５および番号１０７０について、第１７月に行ったＩＩＩＶＭＮ　Ｔｈ−８ペプチドでの追加免疫によって、第２０月までに、両動物においてハイレベルな抗−〇Ｐ１２０１１１Ｂ　抗体（夫々ｌ：　１０２，４００とｌ：　５１．２００）が誘導サレタ。ツルベルは、抗ペプチド抗体レベルの上昇と一致した。

例５旧Ｖ　Ｅｎｖペプチドによる、抗ペプチドおよび抗ｇｐ１２０　ＰＢＭＣ増殖応答の誘導ＨＩＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−Ｂペプチドは、第１−８月の間に、ＰＢＭＣのハイレベル（＞　１００．０００ΔＣ１１ｌ１１　／１０６細胞）ノ３１（−チミジンの取り込み（動物番号８８４および番号１０２８）を誘導した（図１１Ａと１１Ｂ）。しかし、同じ期間内に、Ｆ−Ｔｈ−８ペプチドによっては、１００．０００Δｃｐｓ／１０６細胞を上回るようなＰＢＭＣの３Ｈ−チミジン取り込みレベルは誘導されなかった（図１１Ｃおよび図１１Ｄ）。第１６月において、動物１０４５および動物１０７０にＴｈ−Ｂペプチドによる免疫化を行っても、ｉｎｖ目ｒｏにおいてＴｈ−Ｂペプチドに対して増殖できる能力をもった循環ＰＭＢＣの出現は誘導されなかった（図１１０および図１１Ｄ）。

興味深いことに、Ｔｈ−８ペプチドは、第１４−１８月において動物１０２８でのＰＢＭＣ増殖応答を増強したが、同じ期間において、動物１０２８の抗ペプチド抗体応答は増強しなかった（図１１Ｂおよび表８）。

次に、組換えｇｐ１２０１１ＩＢ若しくは天然ｇｐ１２０１１１Ｂに応答した、チンパンジーＰＢＭＣによる３Ｈ−チミジン取り込みが調べられた。表４には、各動物について、第１−１３月の間における、ＨＩＹＩＩＩＢ　ｇｐ１２０　ｉ、：応答したチンパンジーＰ　ＢＭＣによる３Ｈ−チミジン取り込みのピークが示されている。この表では、チノパンツ一番号１０７０でも番号１０４５でも、最初の１３月の研究をとおして、ｇＰ１２０に応答したＥ／Ｃ＞２より大きなＰＢＭＣ増殖応答はないことが示されている。対照的に、動物８８４および動物１０２８　（Ｔｈ−Ｂ投与）では、同じ期間内に、抗ｇｐ１２０に対する増殖応答を生じた（表４）。

この２０力月にわたる研究の間、Ｆ−Ｔｈ−８で免疫化されたチンパンジーにおいて、ＨＩＶ免疫原以外の細胞分裂促進性もしくは抗原性の刺激に対するＰＢＭＣ増殖応答が正常であったか否かを判定するために、我々はまた、ＰＨＡ　（図１２）およびカンジダ（図１３）に対するＰＢＭＣ増殖応答をも測定した。ＰＨＡに対するＰＢＭＣ増殖応答のピークは４頭のチンパンジーでほぼ一定であったが、カンディダ（Ｃｉｎｄｉｄｘ）に対するＰＢＭＣ増殖応答は、動物間でも、調査片によってもさ種々に変化した。しかし、動物１０４５および動物１０７０でのカンディダ（Ｃｘｎｄｉｄｇ）に対する応答は、Ｆ−Ｔｈ−８ペプチドによる免疫化の間も、免疫化が始まる以前のレベルと同レベルで断続的に存在することがわかった（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）。

例６ＢＩＶ　Ｅｎｖペプチドでのチンパンジーの免疫期間中におけるＰＢリンパ球サブセットの特徴付は何れかのＩＩＩＩＶ　ｅｎｖペプチドタイプによる免疫化が、チンパンジーの循環Ｔ細胞、循環Ｂ細胞もしくは循環ＮＫ細胞ポピユレーションの数に影響を与えるか否かを判定するために、これらのタイプの細胞の絶対数が免疫化期間を通して測定された（図１４、表１０）。動物８８４および動物１０２８における免疫化前（ｂｚｌｏｒｅ）と免疫後（ｄｕｒｉＢ）では、リンパ球レベルに有意な違いはなかった（表１０）。しかし、動物１０４５は、Ｆ−Ｔｈ−Ｂペプチドでの免疫化の期間中に比較的リンパ発生的（１７ｍｐｈｏｇｅｎｉｃ）となり（ｐ　＜　０．００１　）　、第１月および第２月のリンパ球数は夫々２８１５／ｍ−および２５９７／ｌｌｌ−あったのと比較して、第１２週ではリンパ球数が６５０／ｍｍ３であった（図１４）。チノパンツ一番号１０４５および番号１０７０でのＴ細胞のレベルは、免疫化期間中に夫々平均５９％および４４％と顕著に低下した（番号１０４５でｐ＞Ｑ、　００１；番号１０７０でｐ＞Ｑ、０２）。

しかし、動物８８４および動物１０２８では、同じ期間内にＴ細胞レベルの顕著な変化はなかった（ｐ＞０．１）　（表１０）。Ｂ細胞およびＮＫ細胞のレベルは、動物１０４５では顕著に低下したが、動物１０７０、動物８８４および動物１０２８では変化がなかった（表１０）。これらデータを総合することによって、以下のことが示された。即ち、Ｆ誘導されたｌ１ｌＩＶ　ｅｎマペプチドでの免疫化は、動物１０４５および動物１０７０の両者における循環Ｔ細胞の絶対数レベルの減少を誘導し、また動物１０４５におけるＢ細胞およびＮＫ細胞のレベルの減少を誘導する。これに対して、Ｆドメインを欠失したＢＩＶ　Ｔｈ−Ｂ　ｎマペプチドによるチノパンツ一番号８８４および番号１０２８の免疫化は、循環しているリンパ球のレベルに顕著な影響は与えない。

例７ヤギにおいて抗１１１ＶＩＩＩＢ中和抗体を誘導するペプチドＨＩＶＩＩＩＢ　Ｆ−Ｔｈ−Ｂ及びＴｈ−Ｂ　（７）能力チンパンジーの免疫化プロトコールの初期段階で用いられたＦ−Ｔｈ−８ペプチドが、別の種において免疫原性であるか否か判定するために、３ｍｇのＦ−Ｔｈ−ＢもしくはＴｈ−Ｂペプチドが、ヤギを免疫化するために２力月間に３回用いられ、更に、８力月の休止期間の後、ヤギを追加免疫するために用いられた（図１５）。これらのペプチドは両者共に、４回目の免疫化の後、抗ＢＩＶＩＩＩＢ中和抗体血清を誘導でき（図１５）、またｉｎ　ｖｉｌｒｏでＴｈ−Ｂ若しくはＦ−Ｔｈ−８ペプチドに対するＰＢＭＣの３Ｈ−チミジン取り込みをハイレベルに誘導しうる（≧５００．０００△ＣＰｆｉｌ／１２０６　細胞）ことがわかった。更に、免疫化ペプチドに対する抗体の血清終点エライザ価は、Ｔｈ−Ｂ及びＦ−Ｔｈ−８ペプチドで免疫化されたヤギにおいて夫々同じであった。従って、チンパンジーでＦ−Ｔｈ−Ｂペプチドが抗ペプチド抗体とＰＢＭＣの増殖応答をハイレベルに誘導できなかったことは、ＩＩＩＶＩＩＩＢ　Ｆ−Ｔｈ−８ペプチドの本質的な免疫原性の欠如によるものではなく、むしろチンパンジーにおけるＦ修飾ペプチドの特異的な影響によるものである。

例８チンパンジーにおいて抗ＨＩＶ中和抗体を誘導した旧ＶＭＮ　Ｔｈ−Ｂ　Ｅｎｖペプチド免疫化試験の最初の１７力月の間、ＨＩＶＩＩＩＢに対する血清中和抗体は、シンシチウム阻害試験では常に検出不能であり、逆転写酵素阻害試験では≦ｌ；４５であった。しかし、第１７月において、動物１０４５オｌ’動物１０７０１．：対しテＩＩＩＶＭＮ　Ｔｈ−Ｂ　／＜プチドによる後続の免疫化を行ったところ、シンシチウム阻害分析でも抗ＨＩＶ中和抗体が検出された（表１１）。

何故、ＨＩＶＩＩＩＢ　Ｔｈ−８ペプチドに対する抗体が免疫化の最初の１７力月間、ｉｎｖ目ｒｏで［ＩＩＶｌｌｌＢを中和しないのかを判定するために、抗１１１ＶＩＩＩＢペプチド抗体応答の初期ピーク（第６月）からの血清が、Ｔｈ −Ｂペプチドの個々のエピトープに対する反応性に関して試験された。抗Ｔｈ− Ｂペプチド応答の初期値の時点において、動物８８４および動物１０２ｇから得た血清中における抗体反応性の殆どは、実際には、ペプチド（ＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＧＲ）ｉ、：Ｊ、り定義される中和ｖ３ループ領域のアミノ酸−次配列に向けられていたとことがわかった（表１２）。これらのデータは次のことを示している。

即ち、動物は旧ＶＩＩＩＢ　ｇｐ１２０の中和Ｖ３　Ｂ細胞決定因子の正しいアミノ酸１次配列に対して抗体応答を行うが、ＩＩＩＶＩＩＩＢＴｈ−Ｂ　ＲＩＭ　ｅｎマペプチドでの免疫化の７力月後にチノパンツ一番号８８４および番号１０２８により産生された抗体は、ＢＩＶＩＩＩＢを中和するために必要な適切な２次Ｖ３ループ構造を認識できなかったということである。

例９寛容性の誘導に関し、他の免疫原性抗原のＮ末端もしくはＣ末端に合成された融合ドメイン（Ｆドメイン）または融合ドメイン様ペプチドを用いて治療可能な臨床症候群の更なる例としては、ミツバチもしくはスズメバチ毒（ｖ■ｐ　ｖｃｎｏｍ）抗原に対する過敏症や、植物もしくは動物のアレルゲンに対する過敏症が挙げられる。多くのアレルゲンのヌクレオチド配列やアミノ酸配列が現在合成されつつあり、これらのアレルゲンタンパクにおいて、ＩｇＥ抗体を誘導し或いはＩｇＥ応答誘導の補助となるヘルパーＴ細胞応答を誘導する領域がマツプされている。その例として、草の花粉の一次構造（Ｓｉｌｖｘｎｏｖｉｅｈ　ｅｌ　ｓｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ！ａｐ、２６６：１２０４−１２２０．　１９９１；Ｇ＋１Ｈｉｔｈ　ｅｊ　ｓｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｉｔｅｒｓ　２７９：２１０−２１５．　１９９１　；　Ｐｅｒｕ　ｔｌ　ａ、、Ｊ、Ｂｉａｌ、Ｃｈａｏｓ、２６５：１６２１０−１６２１５．　１９９０；　ＳｉＩＩｇｈｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　＾ｃｓｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８：１３８４− １３８８．　１９９１）、ダニアレルゲンの一次構造（Ｔｏｙｓｙｅｌｓｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

１７０：１４５７−１４６２．　１９８９；　Ｙｘｓｅｌ　ｔｌ　ａｔ、、ｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８；７３８−７４５１９９２　；　Ｃｈｕａ　ｅｌ　Ｉｌ、、Ｊ、ＥＩＰ、　Ｍａｄ、１６７：１７５−１８２゜１９８８；　Ｃｈｕｘ　ｓｌ　ｓｌ、、ｌｎｆ、　Ａｒｃｈ、　＾Ｉｌｓｒｇ７　Ａｐｐｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

９１１１８−１２３．　１９９０）　、スズメバチ毒の一次構造（Ｆｏｇ　ｅｔ　ｔｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎ！Ｉ１．　Ａｃ！ｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８５：８９５−８９９．　１９８８　）　、木の花粉の一次構造（Ｅｂｎｅ＋　ａｔ　１１．、ｌ、１ｍａ＋ｕｎｏ１１５０：１０４７−１０５４、　１９９３；　Ｊｓｒｏｌｉｍ　ｒｌ　！＋、、Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　ＡＩｌｔｒｇ７　Ａｐｐｌ、Ｉａ＋ｍｕｎｏｌ、９０；５４−６０．　１９８９　；　Ｖａｌ＊ｎｆａ　ｅｆ　ｘｉ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２５３：５５７−５６０．　１９９１）が挙げられる。これらアレルゲン蛋白の幾つかに関してはＴ細胞エピトープがマツプされており（Ｅｂｎｕｅｌ　ｓｌ、、ｌ。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ７１５０：１０４７ −１０４５．　１９９３　）る。一方、他のアレルゲンに関しては、Ｔ細胞部位および疎水性Ｂ細胞エピトープと考えられる領域を、コンピューターアルゴリズムを用いて予想することができるしくｋ７ｔｅ　ｇｏｄ　Ｄｏｏｌ…ｌｅ。

１、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１５７：１０５−１３２．　１９８２：　Ｒｏｌｈｂ＊ｒｄ　ｕｄ　Ｔｘ７１ｏｒ。

ＥＭＢＯＬ　７：９３．１９８８；　Ｍｘ＋ｇｘｌ目！ｌ　１１．、　Ｊ、ＩＩｌｍｕｎｏｌ、　１３８：２２１３、　１９８７）　、これらペプチドを合成し、これを動物へ注射するか、或いは患者の血清抗体もしくは抹消血液Ｔ細胞と合成ペプチドとをｉｎ　ｖｉｌｒｏ分析で反応させることによって試験することができる。ミツバチ、スズメバチまたは他のアレルゲンのＴ細胞エピトープおよびＢ細胞エピトープが同定されれば、これらエピトープは、Ｆドメイン若しくはＦ −ドメイン様ペプチドを、当該アレルゲンのＴ細胞もしくはＢ細胞ペプチドに対してＮ末端的もしくはＣ末端的に結合させた状態で合成することができ、このＦ −アレルゲンエピトープ混成ペプチドは、当該アレルゲンエピトープに感受性の患者に対する注射に用いることができる。この方法によれば、チンパンジーがＦ −ＴＩ−５ＰＩＯ（Ａ）ペプチドで免疫されることにより、Ｔｌ−５ＰＩＯＨＩＭ　ｚｎｖペプチドに対する寛容性を獲得したのと同様に、患者はアレルゲンエピトープに対する寛容性を獲得することができる（Ｈａ７ｎｅｓ　＋ｆ　！＋、、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、ｉｎ　ｐｒｅｓｓ。

１９９３　’）。こうして、自己免疫疾患の治療に加え、Ｆ修飾アレルゲンのＴ若しくはＢ細胞免疫原性ペプチドによって、アレルギー性疾病を治療するための寛容原性ペプチドを製造できるであろう。

新しい技術、即ち、強力なプロモーターを有し且つ免疫原性ペプチドまたは蛋白をコードするｃＤＮＡのｉｉ　ｖｉマ０注入により、宿主細胞内におけるｅＤＮＡの内在化および発現が促進させる技術が開発されている（Ｗｏ目ｆ　ｔｌ　ｓｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ２４７：１４６５．　１９９０　＞。従って、上記の戦略は、ペプチド自体のかわりに、自己免疫原および／またはアレルゲンのＦ修飾ペプチドをコードするｃＤＮＡを注射する方法として実現することができるであろうし、これによってペプチド自体で免疫するのと同じ効果が得られるであろう。更に、Ｆ修飾されたペプチド及び蛋白は、ペプチド合成の代わりに組換えＤＮＡ技術によって製造できるであろうし、これによって同じタイプの寛容化免疫原が得られるであろう。

ペプチド及び蛋白のＦドメイン又はＦ様ドメイン修飾の別の利用法は、修飾されたペプチドや蛋白に対して、細胞膜に結合したり細胞内に侵入する能力を与えることである。この融合（Ｆ）　ドメインまたは融合（Ｆ）様ドメインは、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子並びにタンパクと結合して、細胞内への侵入を促進し得るであろう。分子が細胞に侵入する能力は、多くの分子が治療上作用するために重要であり、これは細胞内に導入したい分子に対してＦドメイン若しくはＦ様ドメインを付加することによって達成できる。例えば、細胞活性化の強力な阻害剤は、細胞の活性化に必要な細胞内の分子に対して拮抗的に結合するペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡの分子種であろう。しかし、このペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡの分子自体は、生理学的リガンドに似せてデザインされたものでも、当該生理的リガンドの正常な機能を活性化したり、正常に作用したりはしなかった。細胞活性化を阻害し得るペプチド分子、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の例は、細胞内のチロシンキナーゼ、チロシンフォスファターゼ、プロティンキナーゼＣ酵素またはＧ蛋白に対して結合する分子であり、まさに数例しかない。しかしながら、ペプチド、ＲＮＡもしくはＤＮＡの阻害的リガンドが、治療薬剤とし゛Ｃ投与された際に細胞調節剤として機能するためには、それらは細胞を殺すことなく容易に細胞に結合し、細胞に侵入して細胞内で機能できなければならない。旧ｖ　ｇｐ４１のＦドメインを用いてペプチド月−５ＰＩＯＩ！ＩＢｆ＾）をＦ修飾することによって、この修飾されたＴｌ２−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）ペプチドは、ヒトＢ細胞に対する結合および侵入の増強が促進されることが示された（表１４）。

このように、細胞内への侵入を促進させ得るという修飾分子の能力によって、所望の治療効果を得るために、実質的には如何なるタイプの分子（ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白）をも細胞内に運搬する潜在的用途をもった、新規な薬剤運搬システムが提示される。例えば、ＨＩ　Ｖ５ｉ節蛋白（ウィルスＲＮＡに結合するがＲＮＡの転写を促進せず、ＨＩＶ転写因子の正常なパインディングを妨げ得るもの）のＦ修飾蛋白は、ｉｌ　ｖｉｖ。

でのＨＩＶ感染の治療に使用し得る。

＊＊＊＊＊上記で言及した全ての出版物は、それらの全体が、参考文献として本明細書に組み込まれる。

以上の説明では、明瞭な理解を目的として本発明を幾つかの具体的例に沿って記述したが、当業者は、この明細書の開示を読むことによって、本発明の真の範囲および後述の請求範囲を逸脱することなく、形式および具体例に種々の変更を加え得ることを理解するであろう。

表１自己反応性のＢ細胞応答により引き起こされる自己免疫疾患および疾病モデルの例疾患　病原性抗体の特異性重症筋無力症（ＭＧ）　ＭＧの弱体化を引き起こす抗アセチルコリン受容体抗体若年性発症真性糖尿病　島細胞破壊を媒介する抗インシュリン抗体と（タイプ１糖尿病）　抗島細胞抗体バセドウ病　疾病を媒介する抗甲状腺刺激ホルモン受容体抗体真性糖尿病　インシュリンによる糖尿病の治療を妨げる抗インシュリン抗体表２自己反応性のＴ細胞応答により引き起こされる自己免疫疾患及び疾病モデルの例実験的な自己免疫　眼の損傷を引き起こすレチナールＳ抗原ブドウ網膜炎（ＥＤＵ）　に対するＴ細胞応答実験的な自己免疫　神経の損傷を引き起こす随索塩基性蛋白脳を髄炎（ＥＡＥ）　に対するＴ細胞応答表　６患者の抗ＴＳＨ受容体自己抗体が結合するＴＳＨ受容体の領域３５２−３６６　Ｙゴ〜１１コ＝シコを口ｚｚ：ｃｙ　コア１０３−１上１　Ｙ通＝−ニュＪアＬ　２ｍアミノ酸数およびＵりは、リストに挙げた参考文献による。

表　７エイズにおける抗ＨＬＡ免疫応答の治療に用いられる可能性のある混成ペプチドの構成例ＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＥＧＴＤＲＶＩＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬＮＧＴＥＲＶＲＨＬＡクラスＩＩと相同なＨＩＶ−ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、参考文献２５および参考文献２６による。

表１１Ｔｌ−３ＰＩＯペプチドで免疫化されたチンパンジーでのシンシチウム阻害分析における、ＨＩＶ−Ｌｌ／Ｉ　Ｉ　ＩＢおよびＨＩＶφＭＮの中和動物　第１８月　第１９月　第２０月シンシチウム阻害分析での中和の有無１０４５　−（２３１＋／−（２３）　−（２３）　−（２２）　−（２４）１０７０　＋／−（９２１−（２２＋　＋（１００１＋（９６１１＋／−（８６）　＋４（３５０＞−、＜４８％シンジチアの阻害十／−；　≧４９％およびく８０％シンンシチアの阻害＋　；　５８０％シンジチア阻害、　力価１：１０＋＋；　≧８０％スンシスジ阻害、　力価１：２０表１２Ｔｈ−Ｂペプチド（ＴｉＳＰｌｏｌ　１１Ｂ）”の短縮型とのチンパンジー血清の反応性チノパンツ一番号　エライザ結合分析で用いたペプチド（採血口）　Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　Ｔｌ−ｆｌｕ　５ＰＩＯＣ５ＰＩＯＤ　ＳＰＩ東エチェライザ分析終点価（＞３．ＯＥ／Ｃ）８８４（第７月）　２０４．８００　８００　＞１０２．４００　５１，２００　３．２００１０２８　（第７月）　＋０２，４００　８０（１１０２，４００５１，２００３，２ＱＱ＃工リザ分析て用いたペプチドは以下のものである。

エリザ分析は、方法の項で説明したようにして行った。

Ｆｌｕ配列（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶＴＧ）は、インフルエンザ核蛋白。

菌株Ａ−ＰＲ／８／３４由来のらのであり、出典は、Ｄｅｒｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　３４２：５６１　（１９８９）である”ｌ：１０２．．１００・６．０　てのＥ／Ｃ表１３Ｔｌ−３ＰＩＯＩ　Ｉ　ＩＢ　（Ａ）ペプチドを）ｔｌＶφｇｐ４１フッジェニック（Ｆ）　ドメインで修飾することの、該ペプチドが細胞に結合する能力に対する影響抗ｇｐ１２０のモノクローナル抗体は、ＮＩＡＩＤエイズ研究および参照試薬プログラム（Ｍｘｌ＋ｕ＋ｈ山ｅｌ　！＋、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２：２１０？、　１９８８）から採った０、５βであった。使用した細胞は、４ ℃で１時間もしくは３７℃で２１時間インキュベートし、次いで飽和量の抗ｇｐ１２０１１１Ｂ　ｍｉｂ、　０．５β、続いてＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ試薬と反応させたヒトＪＹ−Ｂ細胞であった。蛍光量はフローサイトメトリーで測定され、蛍光輝度（ｂｒｉｇｈｌ＋＋ｔｓｓ）はＭＦＣ−平均チャンネル蛍光で示した。

表は次のことを示している。即ち、Ｔｌ−８ＰＩＯＩＩＩＢ（ＡｌペプチドにＦドメインが結合することにより、Ｔｌ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａｌペプチドのみの場合よりも良好な、ＪＹ−Ｂ細胞への結合能が与えられる。また、３７℃でインキュベーションした後は、細胞表面におけるＦ−ＴＩ−５ＰＩＯＩＩＩＢ　（Ａ）ペプチドは減少する。

表１４Ｆ−ＴＩ−５ＰＩＯＩ　Ｉ　ＩＢ　（Ａ）ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で２１時間インキュベートされたアセトン固定ＪＹ・Ｂ細胞に対する、抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体の反応性細胞は、表１３で説明したようにしてインキュベートされた。３７℃で２１時間インキュベートした後、細胞の細胞遠心分離標本を調製し、アセトンで固定し、コントロールｍａｂＰ３ｘ６３・Ａｇ８もしくは抗ｇｐ１２０・ｍａｂ・０．５βと反応させた。スライドは、蛍光顕微鏡上において、微弱光もしくは明光での細胞質内蛍光が読まれた。データは次のことを示している。即ち、１０μｇ／ｍｌのペプチドと共に３７℃で２１時間インキュベートした後に、ＪＹ−Ｂ細胞内において、Ｆ−Ｔｌ−５ＰＩＯＩ　Ｉ　ＩＢ　（Ａ）ペプチドは検出されたが、Ｔｌ−３ＰＴｌ−３ＰＩＯペプチドは検出されなかった。

ＦＩＧ、６カラム画分ＦＩＧ、　１５月

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳類において、免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白に対する免疫寛容性を誘導する方法であって、前記免疫寛容性が誘導される条件下において、前記哺乳類に対し、前記免疫原ペプチドまたは免疫原タンパクのＮ末端若しくはＣ末端に結合した２〜２０アミノ酸の疎水性ペプチドを有する合成の免疫系寛容原を投与することを具備した方法。
２．前記哺乳類が霊長類である請求項１に記載の方法。
３．前記霊長類がヒトである請求項２に記載の方法。
４．前記疎水性ペプチドが５〜１５のアミノ酸からなる請求項１に記載の方法。
５．前記疎水性ペプチドが７〜１３のアミノ酸からなる請求項２に記載の方法。
６．前記疎水性ペプチドがＨＩＶもしくはＨＩＶ関連ウィルス蛋白由来のセグメントである請求項１に記載の方法。
７．前記疎水性ペプチドがＡＶＧＩＧＡＬＦＬＧＦＬである請求項１に記載の方法。
８．前記免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白がアセチルコリン受容体蛋白である、請求項１に記載の方法。
９．前記免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白がアセチルコリ受容体蛋白もしくはそのフラグメントである請求項１に記載の方法。
１０．前記免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白がインシュリン着しくはそのフラグメントである請求項１に記載の方法。
１１．前記免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白がＴＳＨ受容体蛋白若しくはそのフラグメントである請求項１に記載の方法。
１２．前記免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白が自己免疫Ｔ細胞抗原もしくはそのフラグメントである請求項１に記載の方法。
１３．前記免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白がレチナールＳ蛋白着しくはそのフラグメントである請求項１に記載の方法。
１４．前記免疫原ペプチドまたは免疫原蛋白が、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患において病原性のＢ細胞抗体産生を誘導するＢ細胞の決定因子もしくは蛋白である、請求項１に記載の方法。
１５．前記寛容原の前記疎水性部分が、トランスメンブレン蛋白のトランスメンブレン領域に由来する疎水性ペプチドであるか、もしくは疎水性アミノ酸のランダムミックスである請求項１に記載の方法。