JPH04502144A - ワクチン開発のための病原体におけるヒトｔリンパ球エピトープの同定 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン開発のための病原体における ヒトＴリンパ球エピトープの同定 免肚立１１ この発明はＴリンパ球（Ｔ細胞）に特異的な抗原、特に感染性のウィルス、細菌 １．真菌又は原生動物の抗原及びそれらの抗原フラグメントによるワクチンに関 係する。

泣ｊ」ど４豹 一般的に、この発明は、哺乳動物種のあるものから得られた生物試料からの抗原 すなわちその種に感染性の微生物に特異的なリンパ球の単離方法を記述する。そ の試料は抗原に非特異的なリンパ球を含み、その方法は試料中のリンパ球の抗原 との接触及び抗原に応答して増殖するリンパ球（抗原特異的なリンパ球）の選択 を含む。

“抗原特異的な”は、主要組織適合（ＭＨＣ）抗原認識構造（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ ら、アメリカ特許第４５５００で援用する）、つまり非共有結合的にＣＤ３サブ ユニツトと結合する４９ｋｄ及び４３ｋｄのサブユニットからなる可変なヘテロ ２量体蛋白質が、特異的に抗原を認識し、抗原により活性化される（抗原に応答 して増殖な始める）ということを意味する。

好ましい具体例において、微生物は哺乳動物種に感染性のウィルス、細菌、真菌 又は原生動物であり、試料は微生物に感染していない哺乳動物種のあるもの（例 えばヒト）から得られる。

一般的に、感染していない固体の血液は、真人な数の循環リンパ球を含むが、各 々は異なる抗原−ＭＨＣレセプターを持ち、それ故、異なる抗原特異性を持つ。

従って、任意の与えられた感染性微生物の抗原に特異的なリンパ球の数は非常に 少ない、これは、しかしながら、抗原と反応できる細胞の数が少ないとはいえず 、それどころか、例えば、ＡＩＤＳを引き起こすＨＩＶ−１の場合には、その完 全なエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０は大きなサブポピユレーションを持っＴリ ンパ球であるＴ４細胞の表面のＣＤ４レセプターに結合可能である。この結合は 、ｇｐ１２０がＡＩＤＳウィルスの一部として与えられた場合には、細胞増殖を 引き起こすよりも、終局的な細胞死を引き起こす。この現象の故に、すなわち、 い（つかの感染性微生物の抗原が、与えられたリンパ球ポピユレーション中の多 くの細胞が有するレセプターにより結合され取り込まれるので、この発明により 、抗原を試料中のリンパ球に、抗原−ＭＨＣレセプター複合体を介して増殖の刺 激をするが広く分布したレセプターに結合することを妨げる条件下で、接触させ ることが望ましい。リンパ球に抗原を与える好ましい方法は、従って可溶性の試 薬としてでな（、抗原を取り込んで加工した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の 加工された形態としてである。

この発明の方法の好ましい形式において、試料中のリンパ球は、抗原に接触する 前に、成長用培地、例えば、インターロイキン−２（休止リンパ球の成長よりも 活性なリンパ球の成長を促進する）を含む寒天に分散される。

好ましくは、この方法において、リンパ球を分散させる前に、リンパ球は、試料 中の抗原特異的なリンパ球を増加させるために、細胞加工された（ｃｅｌｌ−ｐ ｒｏｃｅｓｓｅｄ）形態の抗原を提供する細胞と接触されるのが良い。

一度抗原特異的なリンパ球が上記の方法により単離されると、抗原−リンパ球相 互作用を研究できる。これは例えば、抗原が蛋白質の場合、認識の原因となる蛋 白質の領域が同定できるので重要である。これは、好ましくは、蛋白質の断片化 及び認識されるフラグメントの同定により行われるのが良い、これは、好ましく は、蛋白質フラグメントのリンパ球増殖刺激能の試験によりなされるのが良い。

こうして単離された刺激性フラグメントは、実質的に純粋（９９％ｗ　／　ｗ以 上の純度）な形態で、その抗原を含む感染性微生物に対するワクチンとして用い られ得る。予防接種のために、十分量のフラグメントが、細胞溶解性のＴリンパ 球又はヘルパー下リンパ球あるいは両者を刺激するために投与される。この蛋白 質フラグメント（アルブミンなどのキャリアーに結合するなどの標準的ワクチン プロトコールに従って用いられる）は、抗原の刺激性の部分のみを含み免疫応答 を阻害し得る領域を含まないので、すべての抗原又は細胞に対するワクチンとし て優れている。更に、抗原全体では、広く分布したレセプター（例えば、ｇｐ１ ２０の場合、ＣＤ４レセプター）により取り込まれ、それ故に消耗されるが、小 さいフラグメントはそのようなレセプターによって認識されないであろうし、抗 原−ＭＨＣレセプター複合体のみを標的とするであろう。それへの結合は防御的 細胞溶解性Ｔリンパ球応答及びＴリンパ球イニシエートＢリンパ球（抗体）応答 の両方を刺激できる。更に、この発明のフラグメントを用いて作られたワクチン は抗原全体を用いて作られたものよりも毒性が低いようである。

この発明の他の特徴及び利点は下記の好ましい具体例の説明及び請求の範囲から 明らかであろう。

好ましい具体例の説明 図面がまず簡単に説明される。

図面の簡単な説明 図１は、Ｅｅｎ６９と呼ばれるＴ細胞クローンの抗原特異性およびＭＨＣ拘束性 のグラフである。ＣＤ４”　ＣＤ８−で、ｇｐ１２０特異的なりローンＥｅｎ６ ９の、自家及び異質遺伝子的な、指示された濃度のｇｐ１２０又は破傷風トキソ イド（ＴＴ）でパルスされた末梢血液単球に対する増殖応答は標準的’ＨＴｄＲ 取り込みアッセイにより測定された。自家単球＋ｇｐ１２０　（ｏ）；自家単球 ＋ＴＴ（）。ドナーのＨＬＡクラスＨタイプは下記のとうりである。自家ドナー ：ＤＲ４，７，ＤＲｗ５３　；　ＤＱｗ２，３゜異質遺伝子的ドナー：ＤＲｌ。

２；ＤＱｗｌゆ 図２は、Ｅｅｎ６９のＭＨＣ拘束特異性の、トランスフェクトされたマウス繊維 芽細胞を用いた限定的割り当てを与える結果を示す棒グラフである。クローンＥ ｅｎ６９の培地だけで又はｉｏμｇ／ｍｌのｇｐ１２０の酢酸消化物でパルスさ れた様々な抗原提示細胞に対する増殖応答は標準的”ＨＴ　ｄ　Ｒ取り込みアッ セイにより測定された。抗原提示細胞は粘着性自家末梢血液単球細胞（自家ＡＰ Ｃ）　、マウスＬ細胞又はトランスフェクトされ指示されたヒトクラス■分子を 発現しているし細胞を含んだｍ　Ｅ　ｅ　ｎ　６９はクラスＩＩ遺伝子型ＤＲ４ ，７，ＤＲｗ５３　；　ＤＱｗ２，３ドナーから得られた。

図３は、ＨＩ　Ｖ−１のｇｐ１２０内のヒトＴ細胞エピトープの同定を与える一 連のグラフである。

（Ａ）予想された及び実験的に明らかにされたＴ細胞エピトープを含むｇｐ１２ ０領域が詳しく示されている。予想されたエピトープはアンダーラインが引かれ ている。残基４２１−４３６は、両親媒性の０螺旋の性質に基づいて予想された 推定上の下細胞エピトープを表す（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、１９８７年ＨＣｅａ ｓｅら、　１９８７年）、残基４５１−４５５はＲｏｔｈｂａｒｄの分析（１９ ８６年）により多（のＴ細胞エピトープ中に見出された配列パターン（帯電して いるか又はＧｌｙ、疎水性、疎水性、疎水性、極性又はＧｌｙ）に合致する。ｇ ｐ１２０のこの領域における構造上の特徴は示された分子内ジスルフィド結合（ Ｌａ５ｋｙら、１９８７年）及び３つのＮ−結合性の糖鎖形成部位（＊）を含む 、５Ｃ２Ｅ５モノクローナル抗体カラム上のアフィニティークロマトグラフィー により単離された酢酸フラグメント４１３−４５６及びＴ細胞エピトープを実験 的にマツピングするために用いられた合成ペプチドが示されている。ｇｐ１２０ フラグメント及びペプチドは、ＨＩＶ−１の単離されたプロウィルスＨ３ＤＣＧ のｅｎｖｎ−オーブンリーディングフレーム中初のＭｅｔから始まるアミノ酸番 号方式を用いて示される（　Ｍｕｅｓｉｎｇら、　１９８５年）。

（Ｂ）ｇｐ１２０のへブチドフラグメントに対するｇｐ１２０特異的なりローン Ｅｅｎ６９の増殖。自家末梢血液単球は示された濃度の様々な抗原試料でパルス され、それから、標準的増殖反応測定法においてＥｅｎ６９の刺激に用いられた 。試験された抗原は、組換えｇｐ１２０、ｇｐ１２０の酢酸消化物、精製された 酢酸フラグメント４１３−４５６．５Ｃ２Ｅ５モノクローナル抗体カラムを通す ことによりフラグメント４１３−４５６の含まれていない酢酸消化物、単純ヘル ペスウィルスＩ型部蛋白質り及び破傷風トキソイド（ＴＴ）を含んだ。

（Ｃ）ＤＲ４拘束性クローンＥｅｎ６９及びＤＲ−２拘束性クローンＦｅｎ１０ ５の、ｇｐ１２０ペプチドの酢酸消化物、フラグメント４１３−４５６を５Ｃ２ Ｅ５アフイニテイーカラム上で除去した後の消化物及びアフィニティーカラムか らｐＨ３，０で前に述べられた様にして（Ｌａ５ｋｙら、１９８７年）溶出され た精製されたフラグメント４１３−４５６に対する増殖応答の比較。自家単球が ＡＰＣとして用いられた。抗原濃度は１０μｇ／ｍ１であった。培地のみに対す る背景応答は引かれる。

（Ｄ）ＤＲ４拘束性エピトープの合成ペプチドによるマツピング。クローンＥｅ ｎ６９の、示された濃度の完全なｇｐ１２０、精製された酢酸フラグメント４１ ３−４５６並びに合成ペプチド４１０−４２９．４１９−４４４及び４３７−４ ５６でパルスされた自家単球に対する増殖。

図４は、先端を切られたペプチドによるＤＲ４拘束性エピトープの線描写を示す 一対のグラフである。クローンＥｅｎ６９は、示された濃度の、Ｈ３ＤＣＧ４１ ０−４２９エピトープのＮ末端（図４−１）及びＣ末端切除断片（図４−２）を 表す一連の合成ペプチドでパルスされた自家単球に対する増殖応答が試験された 。ペプチド４１６−４２９は、その水への限られた溶解度のため、３ＸＩＯ−’ Ｍより大きい濃度では試験され得なかったことに注意せよ。

図５は、ＨｒＶｇｐ１２０に自然に生じた配列多様性のＴ細胞認識に対する影響 を示す１組のグラフである。

（Ａ）クローンＥｅｎ６９の、示された濃度の様々な２０残基の、Ｈ３ＤＣＧ配 列を参考にした残基４１０−４２９を表すペプチド及び３つの他の分離株中のｇ ｐｔ２０の対応する領域を表すペプチドを含む合成ペプチド（Ｈ３ＣＧ、ＨＸＢ ２及びｚ３）でパルスされた自家単球に対する増殖、これらのペプチドの配列は 表Ｈに与えられている。培地だけに対する背景応答は引かれる。

（Ｂ）ＤＲ４拘束性クローンＥｅｎ６９　（上図）及びＤＲ２拘束性クローンＦ ｅｎ１０５　（下図）の、Ｈ３ＤＣＧ及びＭＰＦ株から得られた完全なｇｐ１２ ０分子でパルスされた自家単球に対する増殖応答、培地単独での背景応答は引か れる。

図６は、クローンＥｅｎ２１７の、単球、Ｂ細胞及びＴ細胞標的に対する細胞溶 解活性を示す１組のグラフである。

（Ａ）粘着性により精製された自家末梢血液単球（上図）及びＥＢｖトランスホ ームＢリンパ芽球細胞（下図）はｇｐ１２０又は無関連抗原の破傷風トキソイド （ＴＴ）で１６時間パルスされ、それから、クローンＥｅｎ２１７を用いた標準 ”Ｃｒ遊離アッセイにおいて標的として用いられた。抗原濃度は１０μｇ　／　 ｍ　１であった。

（Ｂ）自家ＣＤ４′″ＣＤ８−　Ｔ細胞クローンＲＷ１７Ｃは培地又は１０μｇ ／ｍｌのｇｐ１２０で１６時間パルスされ、それから、標準”Ｃｒ遊離アッセイ においてクローンＥｅｎ２１７とインキュベートされた。

ＡＩＤＳへの、゛ 下記は、上記の要約された方法のヒト免疫不全ウィルス−１（ＨＩＶ−１）への 応用であるが、そのウィルスは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こす 、その方法は、一般的に、最初の、ＨＩＶに感染していない個体からのＨＩＶ− １のｇｐ１２０エンベロープ糖蛋白質に特異的なＴリンパ球の単離及び、その次 の、ｇｐｔ２０特異的なＴリンパ球への結合の原因となるｇｐ１２０中のペプチ ドの同定を含む、そのステップを詳細に述べる前に、ＡＩＤＳの紹介の討論を提 供することは有用である。

ＡＩＤＳの　の舌・ラ ヒトにおけるＨＩＶ−１ウィルス粒子の外部のエンベロープ糖蛋白質、ｇｐ１２ ０及びｇｐ’！　１に対する免疫応答の性質はＡＩＤＳにおいて非常に重要であ る。これらの蛋白質は感染細胞の粗面小胞体上で、初期には糖鎖形成された前駆 体蛋白質（ｇｐ１６０）の形態で合成される。この前駆体は、次に開裂して、非 共有結合的に小さい膜に結合性のＣ末端フラグメント（ｇｐ４１）を保持してい る大きいＮ末端糖蛋白質（ｇｐ１２０）を生じる。ｇｐ１６０の、ｇｐ１２０及 びｇｐ４１への蛋白質銀の途中での開裂はウィルスの感染性に必須である。大き いエンベロープサブユニット、ｇｐ１２０は、この病気の病態生理学において重 要ないくつかの独特の特徴を示す、第一に、Ｔ細胞表面蛋白質ＣＤ４に結合する 高いアフィニティーによって、ｇｐ１２０は組織のＨＩＶへの反射的動作を指令 し、ウィルスをＣＤ４９Ｔリンパ球へ付着及び感染させる。ＣＤ４を低レベルで 発現するヒト単核食細胞も又ＨＩＶにより感染され得て、感染した個体における 主要なウィルス貯蔵場所の役割を勤めるであろう、第二に、ｇｐ１２０内の高度 の配列不均一性が異なるＨＩＶ−１分離株を比較すると観察される。

ｇｐ１２０に応答するヒトＢ及びＴ細胞の分子レベルの分析は、宿主−ウィルス 相互作用の複雑な性質を理解するためにだけでなく、ワクチンの開発にも重要で ある。実験動物のｇｐ１２０による免疫感作は、恐ら（ｇｐ１２０−ＣＤ４相互 作用又は付着後過程をブロックすることにより、イン・ビトロでウィルスの感染 性を中和する抗血清を上昇させる。感染した個体においては、しかしながら、抗 体を中和する力価は低い。この事実は、Ｔ細胞性免疫は多くのウィルス感染の排 除において重要な役割をはたすという一般的な観察と共に、ヒトＴ細胞のｇｐ１ ２０への応答の性質に対して非常に興味をそそった。ｇｐ１２０に特異的な細胞 溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は感染した個体中に検出された。しかしながら、免 疫されていない、血清反応陰性の個体におけるｇｐｔ２０への応答についてはほ とんど知られていない。このｇｐ１２０に対する初期Ｔ細胞応答の性質は、感染 の臨界的初期相における宿主−ウィルス相互作用の理解に特に重要である。自然 の被検者におけるｇｐ１２０に対するＴ細胞の応答についての知識も又ｇｐ１２ ０に基づくワクチンの合理的なデザインに極めて重要である。

ヒト　の　１２０　・Ｔ　の 抗原特異的なヒトＴ細胞応答の、正常の免疫されていない被検者における分析は 、免疫されていない個体中の与えられた抗原に反応するＴ細胞の極度に低い頻度 のために挑戦的な実験課題を提供する。この課題を克服するために、我々は正常 ドナーの末梢血中Ｔ細胞からの稀なりローンの単離を容易にする軟寒天クローニ ング方法を開発した。その技術は下記のようにして行われた。

組換えｇｐ１２０は、ｇ・ｐ１６０エンベロープ前駆体蛋白質をコードする遺伝 子の先端切除されたものでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣 （ＣＨＯ）細胞中で作られた。これらのトランスフェクトント（ｔｒａｎｓｆｅ ｃｔａｎｔｓ）を生成するために用いられた構築物はプロウィルス形態のＨＩ　 Ｖ−１分離株であるＨ３ＤＣＧから得られ（Ｍｕｅｓｉｎｇら、（１９８５）　 Ｎａｔｕｒｅ、３１３巻、４５０−４５８頁）、詳細は別紙で述べられた（　Ｌ ａ５ｋｙら、（１９８６）　５ｃｉｅｎｃｅ　、２３３巻、　２０９−２１２頁 ＨＬａｓｋｙら、（１９８７）　Ｃｅ１ｌ、５０巻、９７５−９８５頁）。エン ベロープ遺伝子の先端切除は、膜貫通性ｇｐ４１サブユニットをコードしている 配列を除去し、分泌型のｇｐ１２０を作るためにアミノ酸５３１のコドンの後ろ に終止コドンを挿入することにより行われた。

更に、発現のレベルを増大するために、この構築物中のｇｐ１２０シグナル配列 及びＮ末端の３０アミノ酸は単純ヘルペスウィルスＩ型の糖蛋白質Ｄ　（ｇｐＤ ）の対応する領域で置き換えられた。この修飾の結果、加工された形態の成熟組 換えｇｐ１２０はｇｐＤからの２５アミノ酸をそのＮ末端に含み、天然のｇｐ１ ２０の成熟し加工された形態の最初の３０アミノ酸を欠いた（　Ｌａ５ｋｙら、 １９８６　）。この組換えｇｐ１２０は高いアフィニティーでＣＤ４に結合しく 　Ｌａ５ｋｙら、１９８７　）　、抗体の中和を導いた（Ｌａｓｋｙら、１９８ ６）。組換えｇｐ１２０は、ＣＨＯ細胞上清からｇｐ１２０特異的なモノクロー ナル抗体カラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによって前述（Ｌａ５ ｋｙら、　１９８６．１９８７）の様にして精製され、その５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動による純度は９９％以上であった。ＭＰＦｇｐ１２０は同 様の方法で発現され精製され、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におい て単一の１２０Ｋｄのバンドを示した。

末梢血中の単核細胞（１００Ｘ　１０’　）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ 不連続密度勾配中での遠心分離で単離され、ガラスベトリ皿中で２時間３７℃で １０％の熱不活化されたＡＢ型ヒトブール血清を補われたＲＰＭ１１６４０、グ ルタミン（４ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ　／　ｍ　１　）及びストレプトマイ シン（５０μｇ／ｍ　ｌ　）から成る培養培地（ＣＭ）中に置かれた。非粘着性 細胞が穏やかにすすぐことにより除去され、フローサイトメトリーによるＭＯ− １陽性細胞を９０％以上含む粘着性細胞は、２％の新生仔ウシ血清を補われたＣ 　ａ　−Ｍ　ｇフリーの冷ＨａｎｋｓＢＳＳ中でかき集められた。その単球試料 は、それから、ＣＭ中で１０’／ｍｌに調整され、ｇｐ１２０（５０μｇ　／　 ｍ　ｌ　）で４−８時間３７℃でパルスされた。Ｔ細胞を含む非粘着性画分が、 それから、再び加えられ、細胞は２４穴プレート中で２ＸｌＯ’／ｍｌで１週間 培養された。応答性のＴ細胞は集められ、放射線照Ｉｔ（４０００Ｒ）されｇｐ １２０でパルスされた自家粘着性細胞と共に５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　／　ｍ　ｌでＣ Ｍ中で１８時間３７℃でインキュベートされ、それから、６穴組織培養プレート 中の二重層軟寒天システム（Ｓｒｅｎｄｉら、　１９８３）中でクローン化され た。下層は１０％（Ｖ／Ｖ）のＩＬ２’含有上清を補われた２、５ｍｌのＣＭ　 （Ｍｅｕｅｒら、１９８２　）及び４．８６ｍｇ／ｍｌのＮｏｂｌｅ寒天から成 る。上層は２０％の血清を含む上記培地の０．８ｍｌ中の６×１０″′の応答性 Ｔ細胞（大当たり）及び３．６７ｍｇ／ｍ１の寒天から成る。稀なりローンの単 離は多数の応答性Ｔ細胞（３０Ｘ１０’）が寒天中にプレートされるという事実 により容易にされた。更に、これらの条件は、最近、活性化されたＴ細胞の成長 に有利であることがわかり、その結果、抗原特異的な細胞が大いに豊富になった 。７−１０日後、コロニーは極微操作によりピックアップされ、９６穴のＵ底プ レートに移され、５Ｘ１０’のｇｐ１２０でパルスされ放射線照射された自家Ｐ ＢＭ（４’ｌ　０％（Ｖ／Ｖ）Ｉ　Ｌ２含有上清を含むＣＭ中で再刺激された。

上記の様にして単離された末梢血中単球は、様々な濃度の抗原で４〜８時間３７ ℃でＵ底プレート中で２Ｘ１０４単球／穴でパルスされた。Ｔ細胞クローンが、 それから、最終体積０．２ｍｌのＣＭ中に加えられた（５ｘ１０４／穴）。２４ 時間後、プレートは１μＣｉ／穴の”ＨＴ　ｄ　Ｒでパルスされた。４８時間後 、プレートは収穫され、　”ＨＴ　ｄ　Ｒの取り込みがシンチレーションカウン トにより測定された。マウス繊維芽細胞を用いた増殖アッセイは下記の様に行わ れた。マウス繊維芽細胞系統は、クラス■の０及びβ鎖のｃＤＮＡの全長を用い て、Ｋｌｏｈｅら、　（１９８８）で述べられた様にしてトランスフェクトされ た０手短に言えば、マウスＬ細胞のＤａｐ、３サブクローンが、Ｏｋａｙａｍａ −Ｂｅｒｇ発現ベクター中のクラス■のＯ及びβのｃＤＮＡ各２０μｇ及びｌＬ ＬｇのｐＳＶ２−ｎｅｏプラスミツドで、りん酸カルシウム共沈法を用いてコト ランスフエクトされた。トランスフエクタントは、ネオマイシンアナログＧ４１ ８を含む培地中で、ネオマイシン耐性で選択され、ヒトクラス■分子を高レベル に発現しているトランスフエクタントはフローサイトメトリーによるソーティン グ及びクローニングによって単離された。

繊維芽細胞は、細菌用ペトリ皿中の懸濁培地中で６４１８の非存在下で２４時間 成長された。それらは、それから、放射線照射（４０００Ｒ）され、平底の穴の 中に２Ｘ　１０　’　／　ｍ　１で、培地のみ又は１０μｇ　／　ｍ　１のｇｐ １２０の酢酸消化物の存在下にプレートされた。抗原で２４時間３７℃でパルス した後、クローンＥｅｎ６９（５Ｘ１０’／穴）が加えられ、’ＨＴｄＲが上記 の様にして測定された。すべての測定は、三重に行われ、標準偏差は殆ど常に１ ０％より小さかった。一般的に、単離されたコロニーの約１−２％は抗原特異的 であることが見出された。陽性クローンは１０％（Ｖ／Ｖ）のＩＬ２含有上清を 含むＣＭ中に維持され、放射線照射されｇｐ１２０でパルスされた自家単球で弱 （再刺激さｎた。

Ｅｅｎ６９と呼ばれる代表的なｇｐ１２０特異的なりローンの増殖応答は図１に 示されている。このクローンは細胞表面表現型ＣＤ４’″ＣＤ８−を有する。そ れは、ｇｐ１２０に対する供与量依存性応答を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の源と しての自家単球の存在下で示す、それは、無関係の蛋白質抗原（破傷風トキソイ ド）でパルスされた自家ＡＰＣ又は異なるクラスｎＨＬＡ遺伝子型のドナー由来 のｇｐ１２０でパルスされたＡＰＣに応答して増殖はしない。従って、このクロ ーンは、ｇｐ１２０特異的であり、そしてＭＨＣ拘束性である。観察された増殖 は、他の無関係な抗原に特異的なＣＤ４９Ｔ細胞クローンがｇｐ１２０の存在下 で増殖しないので、単なるｇｐ１２０のＣＤ４”リンパ球に対する非特異的な分 裂促進効果の結果ではない。表Ｉは、我々がＭＨＣ拘束特異性及びｇｐ１２０エ ピトープ局在性に関して詳細に分析した４つのｇｐ１２０特異的なりローンの表 現型及び機能上の特徴を要約しである。４つのクローンはすべて表現型ＣＤ４’ ″ＣＤ８−を有した。このクローンの２つは、下記で論じられる様に、自家のｇ ｐ１２０でパルスされたＢリンパ芽球標的に対する有意の細胞溶解活性を示した 。

これらのＣＤ４ゝクローンの正確なＭＭＣ拘束特異性を明らかにするために２つ のアプローチが用いられた。

第一に、クラス■対立遺伝子特異性をタイピングするアロ抗血清がｇｐ１２０に 対する増殖応答をブロックするために用いられた。この方法で、ＤＲ２及びＤＲ ４拘束性クローンが同定された（表Ｊ）、ＤＲ４拘束性クローンの拘束性の確定 は、抗原提示細胞として、特定のヒトクラス■分子を発現しているトランスフェ クトされたマウスＬ細胞のパネルを用いることにより行われた（Ｋｌｏｈｅら、 １９８８）、このパネルは、クローンＥｅｎ６９及びＥｅｎ２１７に対する各々 の潜在的なりラス■拘束性要素を発現している系統を含んだ、繊維芽細胞中の抗 原加工経路における可能な欠点を克服するために、Ｌ細胞はｇｐ１２０の酢酸で の開裂により得られた一組のペプチドでパルスされた（Ｌａｓｋｙら、　１９８ ７）。図２に示されている様にクローンＥｅｎ６９は抗原特異的な増殖応答を自 家単球及びＤＲ４でトランスフェクトされた繊維芽細胞の存在時にのみ示すが、 これは、アロ抗血清ブロックの研究において指定されたこのクローンのＤＲ４拘 束性を確認する。同様の結果がクローンＥｅｎ２１７に対して得られた。

１２０　・なＴ　クローンによ　雲パされる工くΣ二１皿１１ 次のステップは、単離されたｇｐ１２０特異的なＴ細胞クローンが応答するｇｐ １２０内の領域の同定である。マウスの系での研究は、特定の蛋白質抗原に特異 的な個々のＴ細胞により認識される抗原部位は直鎖のアミノ酸配列の限定された 領域から成るということを示した。この発見は、蛋白質抗原のペプチドフラグメ ントのＭＨＣ拘束性要素との結合がＴ細胞認識に必要であるという事実を反映す る。

ｇｐ１２０内の直鎖のＴ細胞エピトープが各ｇｐ１２０特異的なりローンにおい て同定され得るかを決定するために我々は最初２つの推定上のＴ細胞エピトープ （一つは両親媒性の０−へワックスアルゴリズムにより予想され、二つ目は一般 的な配列パターンアルゴリズムにより予想された）を含む蛋白質のＣ末端付近の 領域に焦点を合わせた。ｇｐ１２０の酢酸消化及びフラグメント４１３−４５６ の５Ｃ２Ｅ５アフイニテイーカラム上での単離はＬａ５ｋｙら、　１９８７、同 書で述べられた様にして行われた。手短に言えば、組換えｇｐ１２０　（２００ ＩＬｇ）は０．２５Ｍ　酢酸で１８時間１００℃でアルゴン中で消化された（図 ３Ａ）。フラグメント４１３−４５６は消化物から、５Ｃ２Ｅ５モノクローナル 抗体カラムへの吸着及び続＜０．１Ｍ　酢酸ナトリウム、ｐＨ３，０での溶出に より精製された。合成ペプチドは標準的固相化学法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　 １９８３）を用いて、二ツノ方法の内ノーツにより作成された。−組のペプチド は、Ｄｕｐｏｎｔ　Ｃｏｕｐｌｅｒ２１００自動ペプチドシンセサイザーで合成 された。ペプチドの別の組は手作業でクロロメチルスチレン−ジビニルベンゼン 樹脂（０，７４ｍＭｏ　ｌ　Ｃｌ／ｇ）を用いて合成された。Ｃ末端残基は、２ 倍過剰のＢｏｃ保護されたアミノ酸及び１．８倍過剰のトリエチルアミンを用い てこの樹脂にエステル結合された。８０℃で２４時間の還流の後アミノ酸の残り が標準的固相法を用いて結合された（　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　１９８３）。

これらのペプチドに、”Ｈ−１１ｅがＩｌｅの結合の際に、濃度の測定を容易に するために取り込まれた。各合成ペプチドの試料は確認のためのアミノ酸分析又 はＡｐｐｉｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍシーケンサ−でのミクロシーケンシング にかけられた。すべてのペプチドはＨＰＬＣにより機能のアッセイに使用する前 に精製された。一般的に、条件は下記のとうりであった。ＨＦ開裂の後、０．１ ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　、ｐＨ２，３中の粗ペプチドは、０．１％ＴＦ Ａで平衡化されたＶｙａｄａｃ　Ｃ１８カラム上での逆相ＨＰＬＣにより分画さ れた。ペプチドは０−６０％のアセトニトリル勾配と０．０８％ＴＦＡで溶出さ れた。溶出された画分は乾燥されそれから、りん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐ Ｈ７，４中に溶解された。ＰＢＳ保存液中のペプチドの正確な濃度は２７８及び ２５７．４ｎｍの吸光度の測定により決定された。単一のＴｒｐ残基を含みＴｙ ｒ残基を含まないペプチドについては、２７８ｎｍにおけるＴｒｐのモル吸光係 数が用いられた。単一のＰｈｅ残基を含みＴｒｐ又はＴｙｒ残基を含まないペプ チドについては２５７．５ｎｍにおけるＰｈｅのモル吸光係数が用いられた。” Ｈ−１１ｅ残基を含むペプチドは、濃度測定はシンチレーションカウントにより 確認された。特異的活性はシンチレーションカウント及び定量的アミノ酸分析に より決定された。機能のアッセイに用いるために、ペプチドはＣＭ中で希釈され 、０．２２ｇｍ　Ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶ４　メンブレンで濾過された。

精製されたフラグメント４１３−４５６はｇｐ１２０特異的クローン及びＡＰＣ の源としての自家単球を用いた増殖アッセイで、刺激活性が試験された。クロー ンは又、これらの研究に用いられた組換えｇｐ１２０がｇｐＤのＮ末端側の２５ アミノ酸を含む（発現のレベルを増大させるためＨＬａ５ｋｙら、１９８６を見 よ）ので、単純ヘルペスウィルス１型糖蛋白質Ｄ　（ｇｐＤ）に対する増殖応答 が試験された。図３Ｂに示される様に、ＤＲ４拘束性クローンＥｅｎ６９は、ｇ ｐ１２０、ｇｐ１２０の酢酸消化物又は精製されたフラグメント４１３−４５６ でパルスされた自家ＡＰＣに応答して増殖する。しかしながら、フラグメント４ １３−４５６を５Ｃ２Ｅ５アフイニテイーカラムで無くしてからでは、同重量の その酢酸消化物に応答しての増殖はない。ｇｐＩ）又は無関係の抗原破傷風トキ ソイドを認識することもうま（行かなかった。従って、Ｅｅｎ６９はｇｐ１２０ のアミノ酸４１３−４５６の中のエピトープを認識する。

図Ｃは、ＤＲ４拘束性クローンＥｅｎ６９の応答をＤＲ２拘束性クローンＦｅｎ １０５のそれと対比させる。

両クローンはｇｐ１２０の酢酸消化物中に存在するペプチドフラグメントを認識 する。しかしながら、クローンＥｅｎ６９と異なり、クローンＦｅｎ１０５はフ ラグメント４１３−４５６を５Ｃ２Ｅ５アフイニテイーカラムで除去した後でも 、その酢酸消化物に応答して増殖する。更に、Ｆｅｎ１０５は精製されたフラグ メント４１３−４５６には応答しない。我々は、ＤＲ２及びＤＲ４拘束性クロー ンはｇｐ１２０の直鎮アミノ酸配列の異なる領域を認識すると結論する。それ故 、少な（とも２つの空間的に離れたＴ細胞エピトープがｇｐ１２０分子中に存在 する。同じ２つのドナーから単離された他のクローンはＥｅｎ６９及びＦｅｎ１ ０５で観察されたパターンを示した（表１）。

フラグメント４１３−４５６の内のとの残基がＤＲ４拘束性クローンにより認識 されるかを決定するために、我々はこのフラグメント内の２つの推定上のＴ細胞 エピトープに及ぶペプチドを含むｇ　￥１１．２０のこの領域の重複する断片を 表す合成ペプチドを試験した（図３Ａ）。

そのような実験の結果は、図３Ｄに示される。完全なｇｐ１２０、酢酸フラグメ ント４１３−４５６及び合成ペプチド４１０−４２９　（このフラグメントのＮ 末端領域に及ぶ）は活性であった。従って、ＤＲ４拘束性Ｔ細胞クローンにより 認識されるエピトープはアミノ酸４１０−４２９の中に含まれる。このエピトー プは前に両親媒性の〇−螺旋の性質に基づいてＴ細胞エピトープと予想された領 域（４２１−４３６残基）と部分的に重複する。しかしながら、この両親媒性の ｏ　−’Ｍｌ旋領域を含む合成ペプチド４１９−４４４は完全に不活性である。

Ｒｏｔｈｂａｒｄの分析（１９８６）によってＴ細胞エピトープ内に普通に見出 される配列パターンを含むペプチド４３７−４５６も又不活性である。この結果 は従って、クローン化レベルのＴ細胞エピトープの直接の実験的な決定の重要性 を示す。

ペプチド４１０−４２９内の必須残基の正確な図解は一連の先端切除されたペプ チドを用いて行われた。図４−１に示される様に、ペプチド４１０−４２９の２ つのＮ末端残基の欠如は約１０倍の活性の減少を生じる。４つのＮ末端残基な欠 くペプチド４１４−４２９は更に１０倍の活性の減少を示す。しかしながら、６ つのＮ末端残基を欠くペプチド４１６−４２９は実際にペプチド４１４−４２９ よりも活性である。８つのＮ末端残基を欠くペプチド４１８−４２８はペプチド ４１０−４２９と比較して１０００倍以上の活性の減少を示し、非常に高濃度（ ３Ｘ　］、　Ｏ−’Ｍ）でのみ認識される。これらの結果は総合してみると、ペ プチド４１０−４２９の６つのＮ末端残基は認識に貢献するが必須ではないとい うことを示すが、Ｐｒｏ４１７及び恐ら＜Ｌｅｕ４１６はより重大である（この 両者の欠如が劇的な活性の現象をもたらすから）。

非常に異なるパターンが、Ｃ末端を切除されたペプチドを用いた場合に観察され る（図４−２）。この場合、Ｃ末端からの２．４又は６残基の欠如は完全な活性 の消失を引き起こす。い（っかの実験において、ペプチド４１０−４２７の弱い 認識が約１０−’Ｍの濃度で検出された。この分析に基づいて、ＤＲ４拘束性ｇ ｐ１２０エピトープの必須残基はペプチド４１０−４２９のＣ末端に局在化され る（恐ら（、Ｌｅｕ４１６又はＰ　ｒ　ｏ　４１．７で始まり、Ｇ１ｎ４２８又 はＧ１ｎ４２８に達する）。

１２０、なＴ　】クローンの　２″性 ｇｐ１２０に特異的なＴ細胞クローンは細胞溶解活性に関しても特徴付けされた 。細胞溶解活性は標準″’Ｃｒ遊離アッセイで測定された。ＣＭ中の５Ｘ１０’ ／ｍｌの標的細胞は指示された濃度の抗原で指示された時間３７℃でパルスされ た。それらは、それから、洗われ、Ｃｒ　（１００μＣｉ／１０’細胞）で１． ５時間３７℃でラベルされた。標的は、それから、３回洗われ、■底のミクロ滴 定プレートに３０００／穴ずつＣＭ中に加えられた。エフェクター細胞が指示さ れた比で最終容積０．２ｍｌで加えられた。プレートは遠心分離（３００×Ｇ、 ５分）され、それから、３７℃で４−６．５時間インキュベートされた。冷却遠 心分離の後、アリコートが各穴からガンマ−放射能アッセイのために取り出され た。特異的溶解パーセントが式（（Ｅ−Ｃ）／　（Ｍ−Ｃ））Ｘ１００　（式中 、Ｅはｃｐｍの実験値、Ｃはコントロールの遊離値モしてＭは遊離値の最大値で ある）により計算された。Ｃはエフェクター細胞を省かれたコントロールの穴の 中の平均の遊離として測定された。Ｍはエフェクター細胞の代わりに１％　ＮＰ ４０が加えられた穴の中の平均の遊離として測定された。ＣはＭの１５−２５％ であった。すべての測定は三重に行われた。

図６Ａに示される様に、ＤＲ４拘束性ＣＤ４”　ＣＤ８−のクローンＥ　ｅ　ｎ 　２１．７はｇｐ１２０でプレパルスされた自家末梢血液単球に対する細胞溶解 活性を示す。

単球は、無関係の蛋白質抗原、破傷風トキソイドでプレパルスされたときには溶 解されず、それは観察された細胞溶解が抗原特異的であることを示している。ク ローンＥｅｎ６９も又細胞溶解性であるが、細胞当たりとしてはあまり有効でな いキラーである。このように、自家単球によるｇｐ１２０の提示は上記のような ＣＤ４”　ＣＤ８−のｇｐ１２０特異的なりローンの増殖のみでな（、ＡＰＣの 直接の溶解をも導くことができる。類似の抗原特異的な細胞溶解が、ＥＢＶでト ランスホームされた自家Ｂリンパ芽球細胞系統Ｌａｚ５０９がｇｐ１２０をクロ ーンＥｅｎ２１７に提示するために用いられた時に観察される（図６Ａ）、これ らのデータは、ある種のＣＤ４”　ＣＤ８−サブセットに属するｇｐ１２０特異 的なりローンはＩａ”の単球及びＢリンパ芽球細胞に対する有意の抗原特異的な 細胞溶解活性を有するということを示す。Ｆｅｎ　１０５及びＦｅｎ１０９など の他のＣＤ４’ＣＤ８−のｇｐ１２０特異的なりローンは、例えあるにしてもわ ずかの細胞溶解活性しか示さず（表ｒ）、ＣＤ４”　ＣＤ８−のＴ細胞間の機能 的な不均一性という概念と一致する。

上の結果を得て、我々は、活性化された自家Ｔ細胞も又ｇｐ１２０をｇｐ１２０ 特異的なりラス■拘束性ＣＴＬに提示することができるという可能性を考えた。

このことに関しては、ヒトＴ細胞の活性化はクラス■のＭＨＣ遺伝子産物の合成 と細胞表面での発現をもたらすということが知られている。それ故、ｇｐ１２０ にさらされた活性化されたＴ細胞も又クラス■拘束性のｇｐ１２０特異的なＣＴ Ｌによる溶解の標的と成るであろう。この可能性を調べるために、我々は前述の 、Ｅｅｎ６９及びＥｅｎ２１７と同じドナー由来の、そして無関係の抗原すなわ ちブタフサ抗原Ｅに特異的な、ＣＤ４”　ＣＤ８−のクローンＲＷ１７Ｃを用い た。ＲＷ１７Ｃ細胞はｇｐ１２０でパルスされ、それから、”Ｃｒでラベルされ 、そしてクローンＥｅｎ２１７と標準”Ｃｒ遊離アッセイ法でインキュベートさ れた。図６Ｂに示される様にＥｅｎ２１７はｇｐ１２０でパルスされた自家ＲＷ １７Ｃ細胞に対する有意の溶解活性を示す。これらの標的はｇｐ１２０の存在し ないときは溶解されない。従って、ｇｐ１２０特異的なＣＴＬは、ｇｐ１２０に さらされた活性化された自家ＣＤ４”　ＣＤ８−細胞を溶解させることができる 。ｇｐ１２０でパルスされた同種異形の（ＤＲ４−）ＣＤ４°のＴ細胞クローン はＥｅｎ２１７によっては溶解されないが、これはこの溶解がＭＨＣ拘束性であ ることを示している（データは示されない）。

自家Ｔ細胞のｇｐ１２０特異的な溶解は、ＨＩＶに感染したＴ細胞の破壊及びＨ ＩＶ粒子に感染した細胞から遊離したｇｐ１２０を取り込んだ非感染Ｔ細胞の溶 解の両方の潜在的な機構を提供する。このｇｐ１２０特異的な細胞溶解反応のＡ ＩＤＳの病態生理学における潜在的な重要性のため、我々はそのような機構で破 壊されるＴ細胞のタイプの詳細な分析を行った。我々はクローンＥｅｎ２１７の 、休止中の及び活性化された末梢Ｔ細胞並びにクローンＥｅｎ２１７と同じドナ ー由来のすべてのＣＤ４“ＣＤ８−及びＣＤ４−　ＣＤ８”″のＴ細胞クローン を含む様々なＴ細胞標的に対するｇｐ１２０特異的な溶解活性を試験した。これ らの標的細胞ポピユレーションは、培地のみで、完全なｇｐ１２０で、又はクロ ーンＥｅｎ２１７により認識されるエピトープを含む合成ペプチド４１０−４２ ９でパルスされた。い（つかの実験からのデータが表■に要約されている。クロ ーンＥｅｎ２１７はＴ細胞に冨む休止末梢血液リンパ球ポピユレーションを溶解 させることができない。これは、これらの休止Ｔ細胞がクラス■のＭＨＣ遺伝子 産物を発現しないので、予想されないことではない（表■）。しかしながら、ク ラス■陽性の、活性化された、ｇｐ１２０でパルスされた自家Ｔ幼若細胞（Ｔ　 ｃｅｌｌ　ｂｌａｓｔ）の有意の溶解がある。実質的により著しい溶解が、Ｔ幼 若細胞がペプチド４１０−４２９でパルスされると観察される。Ｔ幼若細胞がＣ Ｄ４”　ＣＤ８”及びＣＤ４−　ＣＤ８°サブセツトに、抗体及び補体に仲介さ れる溶解を用いて分けられる時は、ＣＤ４”　ＣＤ８−サブセットのみが完全な ｇｐ１２０をクローンＥｅｎ２１７に提示できる。しかしながら、両サブセット は、ペプチド４１０−４２９にさらされた後では溶解される。これらの結果は、 総合するとＣＤ４′″ＣＤ８−及びＣＤ４−　ＣＤ８’のＴ幼若細胞は両者とも クラス■の拘束性ＣＴＬにより認識され得る方法でペプチド抗原を提示できると いうことを示す。それにもかかわらず、ＣＤ４”　ＣＤ８−の活性化されたＴ細 胞のみが完全なｇｐ１２０を取り込んで、４１０−４２９エピトープが認識され る様に加工することができる様に見える。この考えは一連の自家Ｔ細胞クローン を用いて確認された。ＲＷ１７Ｃの様なＣＤ４”　ＣＤ８−クローンは、そして Ｅｅｎ２１７自身でさえ、ｇｐ１２０又はペプチド４１０−４２９にさらされた 後では、Ｅｅｎ２１７エフエクターにより溶解される。対照的に、ＣＤ４−　Ｃ Ｄ８°のクローンＥｐｈｌｌは、ペプチド４１０−４２９でパルスされたときに はＥｅｎ２１７により溶解されるが、完全なｇｐ１２０でパルスされたときには 溶解されない。これらの結果が、活性化されたＣＤ４−ＣＤ８”″のＴ細胞は適 当なりラスＩＩ　Ｍ　ＨＣ遺伝子産物をクラス■拘束性ＣＴＬにペプチド抗原を 提示するために産生ずるが、それらがｇｐ１２０の取り込み機構のための高いア フィニティーを欠（という事実を反映することはありそうなことである。他方、 ＣＤ４’″ＣＤ８−クローンは、容易にｇｐ１２０をそのＣＤ４に対する高いア フィニティーの相互作用によって取り込むことができる（　ＭｃＤｏｕｇａｌら 　、１９８６　）　。

ＨＩＶのＴ　による　哩・にお番る゛　−・にＸニーなＨＩＶ（１！υΔ１ 異なるＨＩＶ分離株中の著しい配列変異性がＴリンパ球によるウィルス蛋白質の 認識にどのように影響を与えるかについては現在はとんど知られていない。上述 のｇｐ１２０特異的なりローンを用いて、我々はこの問題を合成ペプチド及び完 全なｇｐ１２０試料を用いて分析した（図５）。ＤＲ４拘束性のｇｐ１２０特異 的なりローンにより認識されるエピトープを図解するために、我々は、ＨＩＶ− １の異なる分離株の、これらのクローンにより認識されるｇｐ１２０の領域内の 配列（４１０−４２９残基）を表す一連の合成ペプチドを調製した。研究された ＨＩＶ−１分離株は、ｇｐ１２０のこの２０アミノ酸断片中に、参考の８３ＤＧ Ｈ配列と比較して１〜１０のアミノ酸変化を示した（表■）。これらの変異ペプ チドがクローンＥｅｎ６９の増殖を自家単球の存在下で刺激する能力は標準増殖 アッセイにより評価された。図５Ａに示される様に、自然に生じるＨＩＶｇｐ１ ２０の変種を表すペプチドに応答する３つのタイプが観察された。一つの変異ペ プチドＨＸＢ２は、実際、同量の参考の８３ＤＣＧペプチドより以上に増殖応答 を刺激した。

変異物の多（は、Ｈ３ＣＧで代表される様に、Ｈ３ＤＣＧに比較して刺激能力に おいて有意の（３−６０倍）減少を示した。変異ペプチドの第３のグループは、 ｚ３配列で代表される様に、３×１０−Ｍでさえ、クローンＥｅｎ６９の増殖の 刺激において完全に無効であった。

合成ペプチドを用いて観察された劇的な効果が完全な蛋白質のレベルでの交差反 応性を表現するかどうかを決定するために、我々は組換λｇｐ１２０を、ＭＰＦ 分離株として知られる一つの特定のＨＩＶ株から調製し、ＤＲ２及びＤＲ４拘束 性のｇｐ１２０特異的なりローンに対する刺激能力を試験した。図５Ｂに示され る様に、完全なＭＰＦｇｐ１２０はＤＲ４拘束性のクローンＥｅｎ６９によって は弱く認識されただけであり、ＤＲ２拘束性のクローンＦｅｎ１０５によっては 全く認識されなかった。従って、ペプチド及び蛋白質の両方のレベルにおいて、 ＨＩＶに自然に生じる配列の変種はＴ細胞クローンによる認識に強（影響を与え ることができ、通例、その結果、その変種への反応性の著しい減少をもたらす。

非刺激性のペプチドを用いた阻害実験は、この配列の変異はｇｐ１２０ペプチド とＴ細胞レセプター及び拘束性のＭＨＣ遺伝子産物の両者との相互作用を変える ことができるということを示す。

多くの変異ペプチドの分析のデータは表Ｈに要約されている。投与量応答曲線の 分析は、自然に生じるｇｐｔ２０の変異は一般に少なくとも７０％の活性の減少 を、そして更にしばしば９０％以上の活性の減少を引き起こしたということを示 す。単一の保存的アミノ酸の置換はＨ３ＣＧペプチドに示される様に殆ど１０倍 の活性の減少を生じ得る（４２３位のＰｈｅのＩｌｅへの置換）。

増強された認識は１例だけであった（ＨＸＢ２単離株）。これは、この株の４２ ９位に起きるＧｌｕからＬｙｓへの置換を反映するのであろう（討論を見よ）。

重要な残基４１６−４２９にいくつかの変化のある、ＥＬ工及び２３などの変異 ペプチドは試験された最高濃度（３Ｘ１０−’Ｍ）でも認識されなかったという ことは注意されるべきである。従って、ここで同定されたＴ細胞エピトープは、 ｇｐ１２０配列のある高度に変化に富む部分と比較して、−組の相対的に保存さ ｎた残基を含むという事実にかかわらず、自然に生じるＨＩＶ−１の配列変異は しばしばＴ細胞クローンによる相互認識を完全に阻害するのに十分である。

ワクチン 上述の様に、Ｔ細胞のｇｐ１２０特異的細胞認識構造により認識されるｇｐ１２ ０誘導ペプチドはＡＩＤＳに対するワクチンとして用いられ得る。上述のＨＩＶ 配列変異のために、そのようなワクチンが株特異的であること即ち一種のワクチ ンですべての株に有効なものはないということは最もあり得ることであろう。し かしながらそのような万能の全株主のワクチンは、他のもつと不変の病原体、例 えばマラリア病原アメーバ、プラスモデイウム　ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏ ｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）などの原生動物；単純ヘルペスウィルス（Ｈ ｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ）などのウィルス及びハンセン氏病（らい病）の原 因となる因子などの細菌性病原体に対して有効であることは更にありそうである 。これらのすべてに対するワクチンは上述と類似の方法即ち病原体特異的なＴ細 胞が単離され病原性の細胞で特異的に認識されるエピトープを同定するのに用い られるという方法を用いて作成され得る。

他の具体例は下記の請求の範囲に含まれる。

（表工の注） １ドナーは健康なＨＩＶ血清反応陰性の成人であった。ＨＩＶの血清学的試験は 、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅの血液銀行によ り行われた。

”ｇｐ１２０特異的なりローンの細胞表面の表現型は関連モノクローナル抗体を 用いてＥｐｉｃｓＶセルソーターで前述（５ｉｌｉｃｉａｎｏら、　１９８６） の様にして間接免疫蛍光法により決定された。モノクローナル抗体は、ＣＤ２に 対す６３Ｔ４８Ｂ５、ＣＤ　３　ｉ、：対す６ＲＷ２８Ｃ８、ＣＤ４に対する１ 　９Ｔｈｙ５Ｄ７、ＣＤ８に対する２１Ｔｈｙ２Ｄ３、Ｉａ（単形性のクラス■ ）に対する９−４９である。

０クローンは指示された抗原に対する増殖応答が、１０μｇ　／　ｍ　ｌの抗原 で６時間３７℃でパルスされた自家単球とのインキュベーションにより試験され た。増殖は”ＨＴｄＲの取り込みにより４８時間後に測定された。

試験された抗原は、組換えｇｐ１２０、破傷風トキソイド（ＴＴ）　、単純ヘル ペスウィルス型糖蛋白質Ｄ　（ｇｐＤ）及び４１３−４５６残基を表す組換えｇ ｐ１２０（７）酢酸フラグメントを含む（本文を見よ）、＋は、刺激指数＞１０ 、−は、刺激指数〈１．５である。

６標準”Ｃｒ遊離アッセイで１０＝１のＥＡＴ比で測定された、ｇｐ１２０でパ ルスされた自家単球又はＢリンパ芽球標的に対する抗原特異的な細胞溶解活性。

＋＋＋は、特異的溶解＞４０％、＋＋は、特異的溶解＝２０−４０％、−は、特 異的溶解く５％。

６対立遺伝子特異的なアロ抗血清のタイピングによるブロック実験で明らかにさ れたＭＨＣ拘束特異性。ｇｐ１２０でパルスされた自家単球は１１５に希釈され たクラスＨの対立遺伝子特異的なアロ抗血清（Ｄａｎａ−ＦａｒｂｅｒＣａｎｃ ｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅの組織型別研究室から親切に提供された）のパネルと 反応され、それから、関連クローンの増殖刺激能力が試験された。拘束特異性は 、指示された特異性の抗血清の、正常ヒト血清コントロールに対して５０％以上 の阻害を生じる能力に基づいて容易に同定され得た。無関係の特異性の抗血清は １５％未満の阻害を生じた。クローンＥｅｎ６９及びＥｅｎ２１７の場合は、Ｄ Ｒ４拘束性は、本文で述べられた様に適当なヒトクラス■分子を発現しているト ランスフェクトされた繊維芽細胞を用いて確認された。ドナーのＨＬＡ型は、下 記のとうりである。ドナーＥ：Ａ２，２５、Ｂ１３，３８、Ｂｗ４、ＤＲ４，７ 、ＤＲｗ５３、ＤＱｗ２．３゜ドナーＦ：Ａ１，２４、Ｂ７，８．ＤＲ２，３゜ （表Ｈの注） ａ参考（７）Ｈ３ＤＣＧ（Ｄｇｐ１２０（７）４１０−４２９残基を表すペプチ ドの配列が１行目に示されている。他の単離株のｇｐ１２０の対応する領域を表 すペプチドが参考の８３ＤＣＧ配列に対する強度の順に列挙される。

−配列データは、Ｒａｔｎｅｒら、ＩＨ５、Ｍｕｅｓｉｎｇら、１９８５、Ｎ。

ｎｇ−Ｓｔａａｌら　（１９８５）、Ｂｅｎｎ　ら　（１９８５）、１ａｉｎ− ）Ｉｏｂｓｏｎら　（１９８５）　、ＲａｂｓｏｎとＭａｒｔｉｎ　（１９８５ ）、Ｈａｈｎ　ら　（１９８６）、Ｗｉｌｌｅｙ　ら　（１９８６）、　５ｔａ ｒｃｉｃｈら（１９８６）及びＭｙｅｒｓら（１９８８）による編集物からのも のである。領域４１０−４２９内の参考のＨ３ＤＣＧ配列と異なる残基が示され ている。

６相対的強度は、クローンＥｅｎ６９のペプチドでパルスされた自家単球に対す る増殖の投与量応答曲線から決定された（図５Ａに示されたとうり）、与えられ たペプチドの相対的強度は最大増殖の５０％に必要な参考のＨ３ＤＣＧペプチド の濃度と最大強度の５０％に必要な変異ペプチドの濃度の比として計算された。

先端切除されたペプチドを用いた実験で明らかにされたＤＲ４拘束性のエピトー プの重要な残基が大胆に示される。

”ＭＰＦ変異株は完全な蛋白質のレベルで試験された６図５Ｂを見よ。

（表ｍの注） １標的細胞はすべてドナーＥから得られ、休止及び活性化されたＴリンパ球、抗 体及び補体が仲介する溶解によりＣＤ４°ＣＤ８−及びＣＤ４−　ＣＤ８’″サ ブセツトに分けられるＴリンパ芽球（実験手順を見よ）及び−組のＴ細胞クロー ンを含む、クローンＥｐｈｌｌは未知の抗原特異性を持つ分裂促進因子で活性化 されたＣＤ４−ＣＤ８’″クローンである。

６細胞表面表現型は間接免疫蛍光法によりＥｐｉｃｓＶセルソーター上で前述（ Ｓｉｌｉｃｉａｎｏら、１９８６）の様にして決定された。

０標的細胞は培地のみで、完全なｇｌ）１２０　（１０μｇ　／　ｍ　ｌ、１６ 時間）で又はペプチド４１０−４２９　（１０μｇ　／　ｍ　ｌ、４時間）でパ ルスされ、それから、′１Ｃｒでラベルされ、４時間の標準”Ｃｒ遊離アッセイ でクローンＥｅｎ２１７と共にインキュベートされた。Ｅ：Ｔ＝２０：１゜ ６括弧はＣＤ４’″ＣＤ８−及びＣＤ４−　ＣＤ８°のＴ細胞の混合されたポピ ユレーションを示す。

ｆ抗ｉ７υグに〃 ＦＩＧ、　１ ＪＨ乃Ｗの取り込み　４μｍＸｌ０−ウｌ抗原ｌ／Ａ／ノ ＦＩＧ、　４−１ １抗　原　ノ（Ｍ） ＦＩＧ、６Ｂ Ｆ′ｒ比 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物種のあるものから得られる生物試料からの、上記哺乳動物種に感染 性の微生物の抗原に特異的なリンパ球の単離方法で、上記試料が上記抗原に特異 的でないリンパ球を含み、上記方法が上記試料中の上記リンパ球の上記抗原との 接触及び上記抗原に応答して増殖するリンパ球の選択を含み、上記の選択された リンパ球が抗原特異的なリンパ球である単離方法。
2. ２．上記の微生物がウィルス、細菌、真菌又は原生動物であり、上記の哺乳動物 種が上記微生物に感染されていない、請求項１の方法。
3. ３．上記の抗原が、上記の試料と接触させられる前に、上記抗原を取り込み加工 し加工された形態の上記抗原を上記試料中の上記リンパ球に提示できる細胞と接 触させられる、請求項１の方法。
4. ４．上記試料中のリンパ球が、上記抗原に接触させられる前に、休止リンパ球の 成長よりも活性化されたリンパ球の成長を促進する成長培地中に分散される、請 求項１の方法。
5. ５．上記のリンパ球を上記の培地中に分散させる上記のステップの前に、上記の リンパ球が、上記試料を抗原特異的なリンパ球を豊富にするために細胞加工され た形態の上記抗原を提示する細胞と接触させられる、請求項４の方法。
6. ６．上記培地がインターロイキン２を含む、請求項４の方法。
7. ７．上記抗原が蛋白質であり、上記方法が、更に、上記リンパ球により認識され る上記蛋白質のフラグメントを蛋白質フラグメントを作るための上記蛋白質の処 理により同定すること及び、それから、上記フラグメントが上記抗原特異的なリ ンパ球の増殖を引き起こす能力を試験することを含む、請求項１の方法。
8. ８．実質的に純粋な形態の、請求項７の蛋白質フラグメント。
9. ９．請求項８の蛋白質フラグメントを含むワクチン。
10. １０．ほ乳類の、感染性のウィルス、細菌又は原生動物に対する、上記ほ乳類へ の細胞溶解性Ｔリンパ球又はヘルパーＴリンパ球を活性化刺激する量の請求項９ のワクチンの投与を含む、予防接種の方法。