JPH08507080A - B型肝炎のウイルスに対する細胞障害性tリンパ球の応答を誘発するペプチド - Google Patents

B型肝炎のウイルスに対する細胞障害性tリンパ球の応答を誘発するペプチド

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Abstract

(57)【要約】 B型肝炎ウィルス抗原に対するHLA−制限細胞障害性Tリンパ球活性を剌激するエピトープを規定するためにペプチドを使用する。このペプチドはHBVエンベロープの領域に由来し、そしてHBV抗原に応答する慢性感染個体の免疫応答を剌激するための方法を含むHBVを処置または予防するうえで極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 B型肝炎のウイルスに対する細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発するペプチド 政府の支持 米国政府は米国健康研究所(National Institures of Health)が授与した認可に従い本発明においてある種の権利を有するこ とができる。 発明の背景 細胞障害性Tリンパ球(CTL)は、ウイルス、細胞内細菌および寄生体、お よび腫瘍細胞で感染した闘争細胞において必須の役割を演ずる。それらは直接の 細胞障害性によりおよび他の免疫細胞、例えば、マクロファージ、B細胞、およ び他のT細胞に対する特異的および非特異的助けを提供することによってそれを なす。感染した細胞または腫瘍細胞はプロテアーゼを含む細胞内事象を通して抗 原を処理する。処理された抗原は、細胞表面上でHLAクラスI分子に結合した ペプチドの形態で、CTL上のT細胞レセプターに提示される。MHCクラスI 分子は、また、外因性ペプチドに結合しそしてそれらをCTLに細胞内処理なし に提示することができる。 現在において、抗原性タンパク質の配列から、タンパク質が処理される方法お よびペプチドのどの部分がHLAクラスI分子と結合しそしてCTLに提示され るかを予測することは困難である。結合のモチーフは、いくつかのHLAクラス I分子について、これらの分子から溶離されたペプチドの配列分析に基づいて予 測された(Falkら、Nature 351:290(1991))。さらに 、処理されそしてHLAクラスIに実際に結合するペプチドのうちで、どれがC TL認識可能なエピトープを含有するかはまだ予測不可能である。 B型肝炎のウイルス(「HBV」)は、現在世界中でほぼ2.5×108人の 人々を感染している非溶解性ウイルスである。大人におけるHBV感染は、典型 的には、大部分の場合において急性疾患に導き、そして大部分の患者において慢 性疾患の状態に導く。この急性/慢性の比は、感染が出産時間に密接して起こる とき逆転する。慢性HBV感染において肝細胞癌の出現率の増加が存在する。成 人期においてHBVで感染した個体の小さい百分率は、高い死亡率で強い免疫応 答に関連する激症の肝炎を発生する。 HBV感染のために有効な処置は存在しないが、HBV感染を予防するワクチ ンが最近数年間に開発されてきている。ワクチンは慢性HBV保菌者の血漿から 精製されたHBV表面抗原(HBsAg)を使用するか、あるいは組換えDNA 技術により生産されたHBsAgを使用する。また、合成HBsAgペプチドに 基づくワクチンが提案された。参照、例えば、米国特許第4,559,230号 および米国特許第4,599,231号。しかしながら、抗HBsAgワクチン は免疫化個体のわずかに約90%において保護を与える。免疫化されないか、あ るいは免疫化されたが、保護されない個体は潜在的感染の有意な貯蔵所を提供す る。 HBV抗原に対する免疫性へのCTLの寄与は評価することは困難であった。 Chisariら(Microbial Pathogen.6:31(198 9))は、HBVエンコーデ化抗原に対するHLA−クラスI制限、CD8+細 胞障害性T細胞の応答により仲介されることができる。クラスIの主要な組織適 合性(MHC)制限細胞障害性Tリンパ球の応答は、種々の他のウイルス、例え ば、インフルエンザウイルスについて同定された。例えば、Townsendら 、Cell 44:959(1986)は、細胞障害性Tリンパ球により認識さ れるインフルエンザウイルスの核タンパク質のエピトープを合成ペプチドにより 定めることができることを報告した。HBVに対する細胞障害性Tリンパ球の応 答を定めることを試みるとき、急性および慢性HBVの患者からの末梢血液のリ ンパ球は生体外でオートロガス肝細胞を殺すことができるが、細胞溶解性の特異 性、そのHLA制限要素、および細胞の表現型は確立されなかった。参照、Mo ndelliら、J.Immunol.129:2773(1982)およびM ondelliら、Clin.Exp.Immunol.6:331(1987 )。Moriyamaら、Science 248:361−364(1990 )は、HBVの主要なエンベロープ抗原が肝細胞表面において、エンベロープ特 異的抗原によりおよびMHCクラスI制限、CD8+細胞障害性Tリンパ球によ り認識可能な形態で発現されることを報告した。 HBVで慢性的に感染した個体の大きい貯蔵所が存在するので、適当なHBV 抗原に対して応答するこれらの個体の免疫応答を刺激し、これによりそれらの感 染を排除することが望ましいであろう。また、急性期の感染に悩まされる個体に おける慢性HBV感染に対する進化を防止することが望ましいであろう。さらに 、現在承認されたHBVワクチンは免疫化個体の抗体10%において保護の免疫 性を誘発しないので、例えば、ワクチンの免疫原性を増加または多様化すること によって、いっそう有効な免疫性を誘発することが望ましいであろう。非常に驚 くべきことには、本発明はこれらおよび他の関係する要求を満足する。 発明の要約 本発明は、HBV抗原に対するMHCクラスI制限細胞障害性Tリンパ球の応 答を誘発するペプチドを提供する。問題のペプチドはHBVエンベロープから誘 導される。ある種の態様において、CTL誘発ペプチドは、配列HBenv18 3−191 Phe−Leu−Leu−Thr−Arg−Ile−Leu−Th r−Ile(配列識別番号:1);HBenv248−257 Phe−Ile −Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu(配列識 別番号:3);HBenv249−257 Ile−Leu−Leu−Leu− Cys−Leu−Ile−Phe−Leu(配列識別番号:4);HBenv2 49−258 Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−P he−Leu−Leu(配列識別番号:5);HBenv250−258 Le u−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu(配列 識別番号:6);HBenv251−259 Leu−Leu−Cys−Leu −Ile−Phe−Leu−Leu−Val(配列識別番号:7);HBenv 251−260 Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu− Leu−Val−Leu(配列識別番号:8);HBenv260−269 L eu−Leu−Asp−Tyr−Gln−Gly−Met−Leu−Pro−V al(配列識別番号:9):HBenv335−343 Trp−Leu−Se r−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val(配列識別番号:10) ;HBenv152−161 Ser−Ile−Leu−Ser−Lys−Th r−Gly−Asp−Pro−Val(配列識別番号:11);HBenv17 7−185 Val−Leu−Gln−Ala−Gly−Phe−Phe−Le u−Leu(配列識別番号:12);HBenv20 4−212 Phe−Leu−Gly−Gly−Thr−Pro−Val−Cy s−Leu(配列識別番号:13);またはHBenv370−379 Ser −Ile−Val−Ser−Pro−Phe−Ile−Pro−Leu−Leu (配列識別番号:14)を有する;か、あるいは前述の配列の1つに対して実質 的に相同の配列を有するであろう。ペプチドは必要に応じてN−末端またはC− 末端の一方または両方においてフランキングおよび/または修飾されることがで きる。その生物学的活性に実質的に悪影響を及ぼさないで、選択したペプチド内 の非決定的残基において、保存的置換、欠失および付加をなすことができる。 種々のペプチドの態様において、ペプチドを各々それ自体に対して重合してよ り大きいホモポリマーを形成するか、あるいは異なるペプチドと重合してヘテロ ポリマーを形成することができることが理解されるであろう。ある場合において 、ペプチドは組成物中で混合物として組み合わせられ、そして連鎖されないであ ろう。ペプチドは、また、Tリンパ球の応答を増強することができる脂質含有分 子に接合するか、あるいは、例えば、Tヘルパー細胞の応答を誘発する異なるペ プチドに接合することができる。 追加のペプチド、リポソーム、アジュバントおよび/または製剤学的に許容さ れうる担体と配合された本発明のペプチドからなる組成物が提供される。こうし て、医薬組成物は、とくに感染が慢性または保菌の状態に進行するのを防止する 努力において、急性HBV感染を処置する方法において使用できる。慢性HBV 感染およびHBVの保菌状態を処置する方法が、また、提供され、ここで医薬組 成物を感染した個体にHBcエピトープに対する免疫原的に有効な細胞障害性T 細胞の応答を刺激するために十分な量で投与する。これらの感染を処置するため に、HBV抗原に対するMHCクラスI 制限細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発するペプチドを他のHBV抗原、例えば 、HBVコアに対する免疫応答を誘発するその他のペプチドまたはタンパク質と 組み合わせることが望ましい。慢性または保菌状態の感染を有する個体を処置す るために、組成物を反復した投与で、必要に応じて、延長した期間にわたって投 与して、ウイルスの感染および/または脱落を解決または緩和する。 HBV感染、とくに慢性HBV感染を予防するワクチン組成物が、また、提供 される。ワクチン組成物は、免疫原的に有効量のMHCクラスI制限細胞障害性 Tリンパ球の応答を誘発する前述のHBVエンベロープペプチド、例えば、HL A−A2を含み、そして典型的にはさらにアジュバント、例えば、不完全フロイ ンドアジュバントまたは水酸化アルミニウムを含むであろう。HBVに対する高 められた防御を達成せしめるため、このワクチンはHBVエンベロープ抗原に対 する防御的抗体応答を誘発する成分を更に含んで成りうる。 なお他の態様において、本発明は診断法に関し、ここで本発明のペプチドを使 用して、個体におけるHBVエピトープ抗原に対する細胞障害性T細胞の応答が 可能であるリンパ球の存在を決定する。 このような細胞の不存在は、問題の個体が慢性HBV感染を発生することに対し て感受性であるかどうかを決定する。典型的には、リンパ球は末梢血リンパ球で あり、そして問題の個体は急性HBV感染に悩まされる。 図面の簡単な説明 第1図は、HBsAg335−343、WLSLLVPFVがCTL刺激HB sAg329−348により認識される最小最適CTLエピトープであることを 示す。HBsAg329−348の剌激 により発生した、患者A−1からのCTLクローンおよび患者A−3からのCT Lクローンド系統を、切形(上のパネル)またはHBsAg329−348をカ バーするオーバーラッピング9マーまたは10マー(下のパネル)で前パルスし たJY標的細胞に対して試験した。 第2図は、生体外CTLを誘発するのためのHBsAg329−348内の最 適エピトープがHBsAg335−343であることをさらに確証する。 第3図は、急性B型肝炎の感染、慢性B型肝炎の感染の患者、および正常の被 検者におけるHBV特異的CTLの応答を示す。急性の患者(A−1〜A−12 )、慢性の患者(C−1〜C−6)、および正常の被検者(N−1〜N−6)か らのPBMCは次の合成ペブチドを使用して剌激した:1−HBcAg18−2 7、2=HBsAg201−210、3=HBsAg251−259、4=HB sAg260−269、5−HBcAg335−343、6=HBsAg338 −347、7=HBsAg348−357、8=HBsAg378−387。 第4図は、HLA−A2.1競合結合阻害アッセイの結果を示し、4時間の5 1Cr解放アッセイにおけるHBcAg18−17特異的溶解の阻害%として表 されている。 第5図は、HBcAg335−343およびHBsAg348−357に対す るCTL応答が、それぞれ、グループ特異的およびサブタイプ特異的であること 、および合成ペプチドが、また、感染細胞内の大きい、中程度および主要なHB Vエピトープのポリペプチドの内因性処理により発生するエピトープを含有する ことを図解する。 特定の態様の説明 本発明は、HBV感染の処置、予防および診断のための組成物および方法にお いて使用するHBVエンベロープペプチドから誘導されたペプチドを提供する。 これらのペプチドはHBV感染細胞に対するMHCクラスI制限細胞障害性Tリ ンパ球の応答を刺激する。刺激された細胞障害性Tリンパ球は感染細胞を殺すか 、あるいはウイルスの複製を阻害し、こうして、慢性HBV感染を包含する感染 を妨害するか、あるいは実質的に予防することができる。細胞障害性T細胞の応 答を誘発するとき有効であるペプチドは、また、T−ヘルパーの応答を誘発でき る免疫原と組み合わせることができる。 本発明においてを使用するペプチドは、HBenv183−191(配列識別 番号:1)、HBenv248−260(配列識別番号:2)、HBenv26 0−269(配列識別番号:9)、HBenv335−343(配列識別番号: 10)、HBenv152−161(配列識別番号:11)、HBenv177 −185(配列識別番号:12)、HBenv204−212(配列識別番号: 13)、およびHBenv370−379(配列識別番号:14)の領域から誘 導され、ここで番号はGalibertら、前掲、に従う。 本発明の「ペプチド」または「オリゴペプチド」を誘発するHBV細胞障害性 Tリンパ球とは、HBc配列から誘導された、少なくとも4つのHBVアミノ酸 配列の残基、好ましくは少なくとも6、より好ましくは8または9、時には10 〜12残基、そして通常約50より少ない残基、より通常抗体35より少ない、 好ましくは25より少ない、例えば、8〜17アミノ酸残基の鎖を意味する。細 胞表面上のMHCクラスIの分子に結合した内因的に処理されたウイルスのペプ チドと大きさが釣り合った、8〜12アミノ酸残基の 長さに本発明のペプチドを最適化することが望ましいことがある。参照、一般に 、Schumacherら、Nature 350:703−706(1991 );Van Bleekら、Nature 348:213−216(1990 );Rotzschkeら、Nature 348:252−254(1990 );およびFalkら、Nature 351:290−296(1991)、 これらをここに引用によって加える。いっそう詳細に後述するように、通常ペプ チドはここにおいて識別するHBV配列の隣接する残基の対応する部分に対して 相同であり、そしてCTL誘発エピトープを含有するアミノ酸の少なくとも主要 部分を有する。 ペプチドは、後述するように、「合成的に」に、あるいは換えDNA技術によ り製造することができる。ペプチドは好ましくは他の天然に見出されるHBVタ ンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様においてペプチ ドは天然の断片またはペプチドに合成的に接合することができる。用語ペプチド はこの明細書においてポリペプチドと互換的に使用して、隣接するアミノ酸のア ルファーアミノ基とアルファーカルボキシ基との間でペプチド結合により互いに 接続した1系列のアミノ酸を表示するために使用する。ポリペプチドまたはペプ チドは、種々の長さであり、それらの中性(非帯電)の形態であるか、あるいは 塩である形態であることができ、そして修飾、例えば、グリコシル化、側鎖の酸 化、またはリン酸化を含まないか、あるいはこれらの修飾を含有することができ 、修飾がここに記載するようにポリペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に 暴露することができる。 望ましくは、ペプチドは大きいペプチドの生物学的活性の実質的にすべてをな お維持しながら、できだけ小さくされるであろう。生物学的活性とは、適当なM HC分子を結合しそしてHBV抗原また は抗原模倣体に対する細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する能力を意味する。 細胞障害性Tリンパ球の応答とは、問題のHBV抗原に対して特異的なCD8+ Tリンパ球の応答を意味し、ここでCD8+、MHCクラスI制限Tリンパ球が 活性化される。活性化されたTリンパ球は、リンホカイン(例えば、ガンマイン ターフェロン)を分泌し、細胞を殺すか、あるいは殺さないで、感染したオート ロガス細胞またはトランスフェクションされた細胞におけるウイルスの複製を阻 害する生産物(例えば、セリンエステラーゼ)を遊離する。 用語「相同」、「実質的に相同」、および「実質的な相同性」は、ここにおい て使用するとき、1つの配列がアミノ酸の参照配列と比較して少なくとも50% の同一性を有するアミノ酸の配列を意味する。配列の同一性または相同性の百分 率は、参照配列の対応する部分に対して整列させたとき、互いに比較することに よって計算される。 ヌクレオカプシド領域からの本発明のCTL誘発HBVペプチドの態様は、6 〜35アミノ酸からなり、そしてペプチド領域HBenv183−191(配列 識別番号:1)からの少なくとも1つのHLA制限CTLエピトープ部位を含有 する。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるHBenv183−1 91領域の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実 質的に相同であり、ここでHBenv183−191は配列: HBenv183−191(配列識別番号:1) Phe−Leu−Leu−Thr−Arg−Ile−Leu−Thr−Ile を有する。このHBenv183−191領域のペプチドの態様は、さらにここ に記載するように、必要に応じて、N−末端およびC −末端の一方または両方において、HBcを包含するHBV配列からのアミノ酸 、連鎖、他のN−末端およびC−末端の修飾を促進するために付加したアミノ酸 によりフランキングおよび/または修飾し、担体に連鎖することができる。ペプ チドHBenv183−191は、少なくともMHCクラスI分子HLA−A2 により仲介される細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する。 本発明の他のHBenvペブチドの態様は、HBenv248−260の領域 から製造される。この領域から誘導されたペプチドは少なくとも1つのCTL誘 発HLAC−1制限エピトープの部位を含有し、そして典型的には少なくとも7 アミノ酸、より通常9、10または11アミノ酸またはそれ以上であろう。ペプ チドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるHBenv248−260領域の 対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同 であり、ここでHBenv248−260は配列: HBenv248−260(配列識別番号:2) Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe− Leu−Leu−Val−Leu を有する。 HBenv248−260領域からのペプチドは、ここに記載するように、一 方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる 。 HBenv248−260の領域から製造される代表的なCTL誘発ペプチド は、次の9マーまたは10マーのペプチドを包含する。 HBenv248−257(配列識別番号:3) Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe− Leu; HBenv249−257(配列識別番号:4) Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu; HBenv249−258(配列識別番号:5) Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu− Leu; HBenv250−258(配列識別番号:6) Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu; HBenv251−259(配列識別番号:7) Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val; HBenv251−260(配列識別番号:8) Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val− Leu。 上のペプチドはHLA制限CTL誘発エピトープを含有し、典型的には少なく ともHLA−A2制限されており、そして上のペプチドIについて前述したよう に一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することがで きる。 他の態様において、本発明のペプチドは10マーのHBenv260−269 、および少なくとも7の隣接するアミノ酸のCTL誘発HLAC−1制限エピト ープの1または2以上の部位を含有するHBenv260−269から誘導され たペプチドからなる。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるHBe nv260−269配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそ れらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv260−269は配列: HBenv260−269(配列識別番号:9) Leu−Leu−Asp−Tyr−Gln−Met−Leu−Pro−Val を有する。 この領域から製造されたペプチドは、ここに記載するように、一方または両方 の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。ペプチドH Benv260−269(配列識別番号:4)は、少なくともMHCクラスI HLA−A2分子により仲介される細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する。 本発明のなお他のCTL誘発ペプチドはHBenv335−343(配列識別 番号:10)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1 または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBe nv335−343(配列識別番号:10)から誘導されたペプチドを含む。ペ プチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv335−343配列の 対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同 であり、ここでHBenv335−343は配列: HBenv335−343(配列識別番号:10) Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方 の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。 本発明のなお他のCTL誘発ペプチドはHBenv152−161(配列識別 番号:11)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1 または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBe nv152−161(配列 識別番号:11)から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分 は天然に見出されるHBenv152−161配列の対応する部分のアミノ酸と 同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv 152−161は配列(adwサブタイプ): HBenv152−161(配列識別番号:11) Ser−Ile−Leu−Ser−Lys−Thr−Gly−Asp−Pro− Val を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方 の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。 本発明の他のCTL誘発ペプチドはHBenv177−185(配列識別番号 :12)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1また は2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBenv 177−185(配列識別番号:12)から誘導されたペプチドを含む。ペプチ ドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv177−185配列の対応 する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であ り、ここでHBenv177−185は配列(adwサブタイプ): HBenv177−185(配列識別番号:12) Val−Leu−Gln−Ala−Gly−Phe−Phe−Leu−Leu を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方 の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。 本発明の追加のCTL誘発ペプチドはHBenv204−212 (配列識別番号:13)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するア ミノ酸の1または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有 するHBenv204−212(配列識別番号:13)から誘導されたペプチド を含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv204−2 12配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実 質的に相同であり、ここでHBenv204−212は配列(adwサブタイプ ): HBenv204−212(配列識別番号:13) Phe−Leu−Gly−Gly−Thr−Pro−Val−Cys−Leu を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方 の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。 本発明の追加のCTL誘発ペプチドはHBenv370−379(配列識別番 号:14)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1ま たは2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBen v370−379(配列識別番号:14)から誘導されたペプチドを含む。ペプ チドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv370−379配列の対 応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同で あり、ここでHBenv370−379は配列(adwサブタイプ): HBenv370−379(配列識別番号:14) Ser−Ile−Val−Ser−Pro−Phe−Ile−Pro−Leu− Leu を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一 方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる 。 前述したように、担体、支持体またはより大きいペプチドへのカップリングの ために、ここに記載する理由で、あるいはペプチドまたはオリゴペプチドの物理 的または化学的性質の変更などのために、追加のアミノ酸をオリゴペプチドまた はペプチドの末端に付加して、互いとの連鎖を容易にすることができる。アミノ 酸、例えば、チロシン、システイン、リジン、グルタミンまたはアスパラギン酸 などをペプチドまたはオリゴペプチドのC−末端またはN−末端に導入すること ができる。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチドの配列は、末端のNH2のア シル化、例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸のアミド化、末端のカル ボキシのアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどにより修飾すること によって、天然の配列と異なるようにすることができる。ある場合において、こ れらの修飾は支持体または他の分子への連鎖のための部位を提供することができ る。 理解されるように、本発明のHBVペプチドまたは細胞障害性Tリンパ球剌激 活性を有するそれらの類似体を必要に応じて修飾して、ある種の他の所望の属性 、例えば、改良された薬理学的特性を提供するすると同時に、非修飾ペプチドの 生物学的活性を増加するか、あるいは少なくとも実質的に保持することができる 。例えば、ペプチドは、例えば、ここにおいて開示する配列から誘導されたペプ チドのアミノ末端またはカルボキシ末端、または両方へのアミノ酸の付加または 欠失により、ペプチド配列中のアミノ酸の延長、減少または置換により修飾する ことができる。ペプチドを修飾してCTL誘発活性を実質的に増強し、こうして 修飾されたペプチド類似体が野生型配列のペプチドより大きいCTL活性を有す るようにする ことができる。例えば、とくにN−末端の第2残基が疎水性でありそしてHLA 制限分子への結合において関係がある場合、ペプチドのN−末端の疎水性を増加 することが望ましいことがある。N−末端における疎水性を増加することによっ て、T細胞への提示効率を増加することができる。他の疾患に関連する抗原、と くに宿主が有意のCTL活性をもたないことがあるCTL誘発エピトープを含有 するものから製造されたペプチドは、第2残基が通常疎水性であるペプチドのN −末端における疎水性残基を置換することによってCTL誘発性とすることがで きる。 本発明において使用するペプチドは、主題の化合物がHBVの4つの主要なサ ブタイプに対する細胞障害性Tリンパ球の活性を提供することができるかぎり、 HBenv183−191(配列識別番号:1)、HBenv248−257( 配列識別番号:3)、HBenv249−257(配列識別番号:4)、HBe nv249−258(配列識別番号:5)、HBenv250−258(配列識 別番号:6)、HBenv251−259(配列識別番号:7)、HBenv2 51−260(配列識別番号:8)、HBenv260−269(配列識別番号 :9)、HBenv335−343(配列識別番号:10)、HBenv152 −161(配列識別番号:11)、HBenv177−185(配列識別番号: 12)、HBenv204−212(配列識別番号:13)、またはHBenv 370−379(配列識別番号:14)と同一である必要はない。HBVの異な る株が存在するが、それらの各々は、「a」と表示される、少なくとも1つの共 通のエンベロープの決定基を共有する。各株は、また、2つのエンベロープの決 定基を有し、それらの1つは「d」または「y」であり、そして第2は「w」ま たは「r」である。こうして、ウイルスの4つの可能なサブタイプが存在する: adw、ayw、adr、およびayr。HBVのクローニング、配列決定およ び発現は英国特許(GB)第2034323号、欧州特許(EP)第13828 号、米国特許第4,935,235号に記載されており、そしてHBVエンベロ ープ領域の完全な配列は、また、Galibertら、Nature 281: 646(1979)に記載されており、それらの各々をここに引用によって加え る。アミノ酸配列は遺伝子バンク−72データベースの中に20の異なるHBV 株について記載されており、7のadwサブタイプ、5のaywサブタイプ、7 のadrサブタイプ、および1株のayrサブタイプを包含し、遺伝子バンクの 配列をまたここに引用によって加える。 したがって、ペプチドを種々の変化、例えば、挿入、欠失、および置換に、保 存的または非保存的に、付すことができ、ここでこのような変化はそれらの使用 においてある種の利点を提供する。保存的置換とは、アミノ酸残基を生物学的お よび/または化学的に類似する他のもの、例えば、他について1つの疎水性残基 、あるいは他について1つの極性残基と置換することを意味する。置換基は組み 合わせ、例えば、Gly、Ala;Val、Ile;Asp、Glu;Asn、 Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;およびPhe、Tyrを包含する。 通常、HBV細胞障害性Tリンパ球刺激エピトープを実質的に模擬することを意 図する配列の部分は、HBVの少なくとも1つのサブタイプの配列と約20%よ り多くは異ならないが、ただし例えば、連鎖またはカップリングを容易にするな どのために、ペプチドの物理的または化学的性質を変更する目的で、追加のアミ ノ酸をいずれかの末端に付加することができる。ペプチドの配列の領域がHBV のサブタイプの間で多形性であることが発見された場合、1または2以上の特定 のアミノ酸を変化させて異 なるHBV株またはサブタイプの異なる細胞障害性Tリンパ球のエピトープをい っそう効率よく模擬することが望ましいことがある。 上に列挙した代表的なペプチドを包含する、本発明により識別されたペプチド の配列内に、ペプチドがそれらの生物学的活性、すなわち、HBV感染細胞また はHBV抗原を発現する細胞に対するクラスI制限細胞障害性Tリンパ球の応答 を剌激する能力を保持させる残基(または実質的に機能的に同等なもの)が存在 する。これらの残基は単一のアミノ酸の置換、欠失、または挿入により同定する ことができる。さらに、残基の側鎖によりなされる寄与は、特定のアミノ酸(例 えば、Ala)を使用する系統的走査によりプロービングすることができる。多 数の置換に耐えるペプチドは、一般に、このような置換、例えば、小さい、比較 的中性の分子、例えば、Ala、Gly、Pro、または同様な残基を取り込ん でいる。置換、付加または減法が可能である残基の数または種類は必須のエピト ープの点の間の必要な間隔および探求するコンフォメーションおよび機能の属性 (例えば、疎水性/親水性)に依存するであろう。必要に応じて、細胞障害性T リンパ球に対して提示するためのそのMHC分子へのペプチド類似体の結合アフ ィニティーの増加は、また、このような変更により達成することができる。一般 に、エピトープおよび/またはコンフォメーション的に重要な残基の間のスペー サーの置換、付加または欠失は、結合を崩壊するであろう立体的または電荷の妨 害を回避するように選択されたアミノ酸または部分を使用するであろう。 多数の置換に耐えると同時に所望の生物学的活性を保持するペプチドは、また 、D−アミノ酸含有ペプチドとして合成することができる。このようなペプチド は「インバーソ(inverso)」または「レトロ−インバーソ(retro −inverso)」の形 態として、すなわち、配列のL−アミノ酸をD−アミノ酸と置換するか、あるい はアミノ酸の配列を逆転しそしてL−アミノ酸をD−アミノ酸と置換することに よって合成することができる。D−ペプチドはペプチダーゼに対して実質的にい っそう耐性であり、したがってそれらのL−ペプチドと比較して血清および組織 においていっそう安定であるので、生理学的条件下のD−ペプチドの安定性は対 応するL−ペプチドと比較してアフィニティーの差の補償を越えたことをするこ とができる。さらに、置換基を含むか、あるいは含まないL−アミノ酸含有ペプ チドをD−アミノ酸でキャップして、抗原性ペプチドのエキソペプチダーゼを破 壊を阻止することができる。 ここに記載する例示的ペプチドに加えて、本発明はHBVに対するMHC制限 細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発することができる前記ペプチド領域に関連す る他のエピトープ領域を同定する方法を提供する。この方法は、感染したまたは 未感染の個体から末梢血リンパ球(PBL)を獲得し、そしてHBenv183 −191(配列識別番号:1)、HBenv248−260(配列識別番号:2 )、HBenv260−269(配列識別番号:9)、HBenv335−34 3(配列識別番号:10)、HBenv152−161(配列識別番号:11) 、HBenv177−185(配列識別番号:12)、HBenv204−21 2(配列識別番号:13)、またはHBenv370−379(配列識別番号: 14)のペプチドから誘導された合成ペプチドまたはポリペプチド断片で細胞を 暴露(刺激)することからなる。各々が典型的には約8〜20残基長さ、好まし くは9〜12残基の、オーバーラップする合成ペプチドのプールをを使用して細 胞を刺激することができる。細胞障害性Tリンパ球の活性を誘発する活性残基を プールから選択することが できる。特定の細胞障害活性を誘発するペプチドの能力は、刺激したPBLをそ のHBVサブゲノムの断片で感染またはトランスフェクションしたオートロガス 標識化(例えば、51Cr)標的細胞(例えば、HLA合致マクロファージ、T 細胞、線維芽またはBリンパ芽球細胞)とインキュベーションし、こうしてター ゲッテッド抗原を細胞で内因的に合成し(あるいは細胞を問題のペプチドでパル スし)、そして標識の特定の解放を測定することによって決定する。 細胞障害性Tリンパ球の応答を剌激するエピトープ領域を有するペプチドかい ったん同定されると、応答のMHC制限要素を決定することができる。これは刺 激したPBLまたはその短期間の系統を問題のペプチドまたは適当な対照でパル スした既知のHLA型の(標識化)標的細胞のパネルとインキュベーションする ことを包含する。CTLにより溶解されるパネルにおける細胞の1または2以上 のHLAアレルを溶解しない細胞と比較し、そして問題の抗原に対する細胞障害 性Tリンパ球の応答のための1または2以上のHLA制限要素を同定する。 Carboneら、J.Exp.Med.167:1767(1988)は、 ペプチドによる刺激が対応する内因性タンパク質に対する低いアフィニティーで 細胞障害性Tリンパ球を誘発でき、こうしてそれぞれのペプチドの剌激がペプチ ドを認識するが、天然の抗原ではない細胞障害性Tリンパ球を生ずることができ ることを報告した。刺激された細胞障害性Tリンパ球が天然のHBVペプチドを 認識できないことはHBVペブチドの治療剤およびワクチン組成物の開発におい て望ましくないので、この潜在的制限を回避する方法を使用する。細胞障害性T 細胞の順次の再刺激を本発明において使用して、合成ペプチドについてより高い アフィニティーを天然に処理された抗原についてを有するT細胞を同定しそして 選択する。活 性化したPBLを再剌激することによって、短期間の細胞障害性Tリンパ球の系 統を確立する。ペプチドで刺激された細胞をペプチドおよび組換え体または天然 のHBV抗原、例えば、HBsAgで再剌激する。活性を有する細胞を、また、 適当なT細胞のマイトジェン、例えば、フィトヘムアグルチニン(PHA)で刺 激する。再刺激された細胞は、T細胞ヘルプ、およびHBV抗原の抗原非特異性 源として照射された同種異系のPBLを有する。天然のHBV抗原を認識する細 胞障害性Tリンパ球の集団を選択的に拡張しかつ長期間の系統を確立するために 、患者からのPBLをまずペプチドおよび組換え体または天然のHBV抗原で剌 激し、次いで対応するHBV抗原のポリペプチドを安定に発現するHLA合致B リンパ芽球細胞で再剌激する。オートロガスおよび同種異系のBリンパ芽球ある いは適当な抗原でトランスフェクションまたは感染させた他の細胞を使用して、 内因的に合成された抗原を認識する能力について細胞系を再確証する。 1または2以上の患者またはHLA型において細胞障害性Tリンパ球の応答を 誘発することに寄与する本発明の異なるペプチドが同定されると、ある場合にお いて組成物中で2またはそれ以上のペプチドを接合することが望ましいことがあ る。組成物中のペプチドは同一であるか、あるいは異なることができ、そして一 緒になってそれらは患者の1または2以上のペプチドと同等であるか、あるいは それらより大きい生物学的活性を提供すべきである。例えば、ここに記載する方 法を使用して、2またはそれ以上のペプチドは特定の領域、例えば、HBenv 248−257(配列識別番号:3)、HBenv249−257(配列識別番 号:4)、HBenv249−258(配列識別番号:5)、HBenv250 −258(配列識別番号:6)、HBenv251−259(配列識別番号:7 )、および/またはHBenv251−260(配列識別番号:8)ペプチドか らの異なるか、あるいはオーバーラップする細胞障害性Tリンパ球のエピトープ を定めることができ、これらのペプチドを「カクテル」で組み合わせて細胞障害 性Tリンパ球の応答について増強された免疫原性を提供することができる。その うえ、とくに第2または引き続くペプチドが最初のものと異なるMHC制限要素 を有するとき、1つの領域のペプチドを、同一であるか、あるいは異なるHBV タンパク質からの、他のHBV領域のペプチドと組み合わせることができる。他 のCTL誘発HBVペプチドは同時継続米国出願第07/935,898号に記 載されており、これをここに引用によって加える。ペプチドのこの組成物は、多 様な集団の間で本発明の治療、ワクチンまたは診断の方法および組成物により提 供される免疫学的適用範囲を効果的に広げるために使用することができる。例え ば、優勢な民族(コーカーサス人、アジア人およびアフリカの黒人)の間のHL Aアレレの異なる頻度を下表Iに示す。本発明の治療またはワクチンの組成物を 配合して、集団の出来るだけ高い百分率に可能性治療または免疫性を提供するこ とができる。 本発明のペプチドは連鎖を介して組み合わせてポリマー(マルチマー)を形成 するか、あるいは連鎖なしに、混合物として、組成物中で配合することができる 。同一ペプチドをそれ自体に連鎖し、これによりホモポリマーを形成する場合、 複数の反復するエピトープ単位が提示される。ペプチドが異なる場合、例えば、 カクテルが異なるHBVサブタイプを表す場合、あるサブタイプ内で異なるエピ トープ、異なるHLA制限特異性、Tヘルパーエピトープを含有するペプチド、 反復する単位をもつヘテロポリマーが提供される。共有結合に加えて、分子間ま たは構造内の結合を形成できる非共有結合の連鎖が含められる。 ホモポリマーまたはヘテロポリマーのための、あるいは担体へのカップリング のための連鎖は種々の方法で得ることができる。例えば、システイン残基をアミ ノ末端およびカルボキシ末端の両方に付加することができ、ここでペプチドはシ ステイン残基のコントロールされた酸化を経て共有結合される。また、一方の官 能基末端においてジサルファイド連鎖および他方においてペプチド連鎖を発生す る多数のヘテロ官能剤、例えば、N−スクシジイミジル−3−(2−ピリジルジ チオ)プロピオネート(SPDP)は有用である。この試薬は、それ自体および 一方のタンパク質中のシステイン残基および他方におけるリジン上のアミノまた は他の遊離アミノ基を通してアミド連鎖の間でジサルファイド連鎖をつくる。種 々のこのようなジサルファイド/アミド形成剤は既知である。参照、例えば、 mmunol.Rev. 62:185(1982)、これをここに引用によって 加える。他の2官能性カップリング剤はジサルファイド連鎖よりむしろチオエー テルを形成する。それらのチオエーテル形成剤の多くは商業的に入手可能であり 、そして6−マレイミドカプロン酸、2−ブロモ酢酸、2−ヨード酢酸、4−( N−マレイミ ド−メチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸の反応性エステルなどを包含する 。カルボキシル基はそれらをスクシンイミドまたは1−ヒドロキシ−2−ニトロ −4−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせることによって活性化することが できる。特定の好ましいカップリング剤は、スクシンイミジル4−(N−マレイ ミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボンカルボキシレート(SMCC)であ る。理解されるように、連鎖は記載するように、例えば、HBV細胞障害性T細 胞の決定基、ペプチド類似体,またはTヘルパー決定基として機能する連鎖した 基のいずれをも実質的に妨害すべきではない。 他の面において、本発明のペプチドはHBVT−ヘルパー細胞のエピトープ、 例えば、HBVへの細胞障害性T細胞の誘発において共同するT細胞を剌激する エピトープを提示する他のペプチドと組み合わせるか、あるいはカップリングす ることができる。T−ヘルパー細胞は、例えば、T−ヘルパー1またはT−ヘル パー2表現型であることができる。HBV配列からのT−ヘルパーのエピトープ は、配列:Met−Asp−Ile−Asp−Pro−Tyr−Lys−Glu −Phe−Gly−Ala−Thr−Val−Glu−Leu−Leu−Ser −Phe−Leu−Pro(配列識別番号:17)を有する、HBc1−20に おいて同定された。他のT−ヘルパーのエピトープは、配列Pro−His−H is−Tyr−Ala−Leu−Arg−Gln−Ala−Ile−Leu−C ys−Trp−Gly−Glu−Leu−Met−Tyr−Leu−Ala(配 列識別番号:18)を有する、領域HBc50−60から、および配列Leu− Leu−Trp−Phe−His−Ile−Ser−Cys−Leu−Thr− Phe−Gly−Arg−Glu−Thr−Val−Ile−Glu−Tyr− Leu(配列 識別番号:19)(ここでIle116はHBVのadwサブタイプにおけるLe uである)を有するHBc100−119、配列Glu−Tyr−Leu−Va l−Ser−Phe−Gly−Val−Trp−Ile−Arg−Thr−Pr o−Pro−Ala(配列識別番号:20)を有するHBc117−131、お よび配列Val−Ser−Phe−Gly−Val−Trp−Ile−Arg− Thr−Pro−Pro−Ala−Tyr−Arg−Pro−Pro−Asn− Ala−Pro−Ile(配列識別番号:21)を有するペプチドHBc120 −139を包含する、HBc100−139の領域からのペプチドにより提供さ れた。参照、Ferrariら、J.Clin.Invest.88:214− 222(1991)、および米国特許第4,882,145号、各々をここに引 用によって加える。 本発明のペプチドは広範な種類の方法で製造することができる。比較的短い長 さを有するために、ペプチドは普通の技術に従い溶液中で、あるいは固体の支持 体上で合成することができる。種々の自動合成装置は商業的に入手可能であり、 そして既知のプロトコールに従い使用することができる。参照、例えば、Ste wartおよびYoung、Solid Phase Peptide Syn thesis 、第2版、Pierce Chemical Co.(1984) ;Tamら、J.Am.Chem.Soc.105:6442(1983);M errifield、Science232:341−347(1986);お よびBaranyおよびMerrifield、The Peptides、G rossおよびMeienhofer編、Academic Press、ニュ ーヨーク、pp.1−284(1979)、それらの各々をここに引用によって 加える。 あるいは、組換えDNA技術を使用することができ、ここで問題のペプチドを エンコードするヌクレオチド配列を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主細胞 の中に形質転換またはトランスフェクションし、そして発現のために適当な条件 下に培養する。これらの手順は、例えば、一般に次の文献に記載されているよう に、一般にこの分野において知られている:Sambrookら、Molecu lar Cloning:A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor Press、コールド・スプリング・ハーバー 、ニューヨーク(1982)、およびAusubelら(編)、Current 、Protocols in Molecular Biology 、John Wiely and Sons,Inc.、ニューヨーク(1987)、およ び米国特許第4,237,224号、米国特許第4,273,875号、米国特 許第4,431,739号、米国特許第4,363,877号および米国特許第 4,428,941号、それらの開示をここに引用によって加える。こうして、 本発明の1または2以上のペプチド配列からなる融合タンパク質を使用してHB V細胞障害性Tリンパ球の決定基を提示することができる。例えば、細胞障害性 Tリンパ球の応答を剌激するためにここに記載するペプチド領域のエピトープを いっそう効果的に提示するように組換えHBenvアミノ酸配列が変更された、 本発明の組換えエピトープのタンパク質が製造される。この手段により、いくつ かのT細胞のエピトープを取り込んだポリペプチドを使用する。 ここにおける考えられる長さのペプチドのためのコーディング配列は化学技術 、例えば、Matteucciら、J.Am.Chem.Soc.103:31 85(1981)のホスホトリエステル法により合成することができるので、天 然のペプチド配列をエンコ ードするものについて1または2以上の適当な塩基を単に置換することによって 、修飾を行うことができる。次いでコーディング配列を適当なリンカーで準備し 、そして普通にこの分野において入手可能な発現ベクターの中に結合し、そして それらのベクターを使用して適当に宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を 生成することができる。ある数のこのようなベクターおよび適当に宿主系は現在 入手可能である。融合タンパク質の発現のために、コーディング配列は作用可能 に連鎖された開始コドンおよび停止コドン、プロモーターおよびターミネーター の領域および通常複製系を有して所望の細胞の宿主中の発現のための発現ベクタ ーを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列を所望のコーディ ング配列の挿入のための便利な制限部位を含有するプラスミドの中に準備する。 生ずる発現ベクターを適当な細菌宿主の中に形質転換する。酵母または哺乳動物 細胞の宿主を、また、使用することができ、適当なベクターおよびコントロール 配列を使用する。 本発明のペプチドおよびそれらの医薬組成物およびワクチン組成物は哺乳動物 、とくにヒトに投与してHBV感染を処置および/または予防するために有用で ある。ペプチドはHBV感染細胞に対する細胞障害性Tリンパ球の応答を剌激す るために使用するので、組成物は急性および/または慢性のHBV感染を処置ま たは予防するために使用することができる。 医薬組成物のために、前述の本発明のペプチドはHBVで既に感染した個体に 投与されるであろう。感染の潜伏期または急性期における個体は免疫原性ペプチ ドで別々に処置するか、あるいは適当ならば、他の処置と組み合わせて処置する ことができる。治療の適用において、組成物は患者に収獲に対する細胞障害性T リンパ球の応答を誘発しかつその症状および/または合併症を治療するか、ある いは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。これを達成する ために適切な量は「治療的に有効な投与量」として定義される。この使用に有効 な量は、例えば、ペプチドの組成、投与方法、処置する疾患の段階およびひどさ 、患者の体重および健康の一般的状態、および主治医の判断に依存するが、患者 から得られたPBL中のHBV特異的CTL活性の測定により決定して、患者の CTLの応答に依存して、70kgの患者について一般に約1μg〜約2,00 0mgのペプチドの範囲であり、約10μg〜約100mgのペプチドの投与量 をいっそう普通に使用され、次いで数週〜数カ月にわたって約1μg〜約1mg のペプチドのブースター投与量を使用する。本発明のペプチドおよび組成物は一 般に重大な疾患の状態、すなわち、生命を脅かすか、あるいは潜在的に生命を脅 かす場合において使用することができることを留意しなくてはならない。このよ うな場合において、外来の物質の最小化およびペプチドの比較的無毒の特質にか んがみて、実質的に過剰のこれらのペプチド組成物を投与することができそして 処置の医師は望ましいと感じることがある。 組成物の1回または多数回の投与は、処置の医師により選択される投与量のレ ベルおよびパターンで実施することができる。いずれの場合においても、製剤配 合物は患者を効果的に処置するために十分な量の本発明の細胞障害性Tリンパ球 剌激性ペプチドを提供すベきである。 治療の使用のために、投与はHBV感染の最初の徴候においてあるいは急性感 染の場合において診断のすぐ後に開始し、そして少なくとも症状が実質的に消滅 しそしてその後ある期間の間続けるべきである。よく確立された慢性の場合にお いて、負荷投与および引き続く維持またはブースターの投与が要求される。急性 の肝炎の処置 の間のHBVに対する有効な細胞障害性Tリンパ球の応答の誘発は、慢性肝炎、 HBV保菌の段階、および続く肝細胞の癌の引き続く発生の可能性を最小とする であろう。 本発明の組成物を使用する感染した個体の処置は、急性的に感染した個体にお ける感染の消散を速めることができ、個体の約90%は感染を自然に消散するこ とができる。発生する慢性感染に対して感受性(または病気にかかりやすくなっ た)個体について、急性から慢性の感染への進化を防止する方法においてとくに 有用である。感受性の個体が感染の前にまたはその間に同定された場合、例えば 、ここに記載するように、組成物はそれらに対してターゲッティングされ、より 大きい集団への投与の必要性を最小にすることができる。 ペプチド組成物は、また、慢性肝炎の処置のためにそして保菌者の免疫系を剌 激してウイルス感染した細胞を実質的に減少するか、あるいはなお排除するため に使用することができる。慢性肝炎を有する個体は、感染後約3〜6月にウイル スについて陽性と試験されるので、同定することができる。個体の感染の急性期 の間の不適切な(またはふそんざいの)細胞障害性Tリンパ球の応答のために、 個体が慢性HBV感染を発生することがあるので、細胞障害性T細胞の応答を効 果的に剌激するために十分な量の免疫保護ペプチドを投与の配合物およびモード においてを提供することが重要である。こうして、慢性肝炎の処置のために、代 表的な投与量は70kgの患者について約1μg〜1,000mg、好ましくは 約5μg〜100mg/投与の範囲である。少なくとも臨床的症状または実験室 のインジケーターがHBV感染が排除または実質的に消滅しめすまでそしてその 後ある期間の間、投与を続けるべきである。免疫化投与および引き続く維持およ びブースターの投与は、確立された間隔 で、例えば、1〜4週間、感染を消散させるのに必要であるように、多分延長し た期間、要求される。慢性および保菌のHBV感染の処置のために、また、CT Lペプチドを他のHBV抗原に対する免疫応答を誘発する他のペプチドまたはタ ンパク質と組み合わせることが望ましいことがある。 治療的処置のための医薬組成物は、非経口的、局所的、経口的または局所の投 与について意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈 内、皮下、皮内、または筋肉内に投与される。こうして、本発明は、許容できる 担体、好ましい水性担体の中に溶解または懸濁した細胞障害性Tリンパ球剌激ペ プチドの溶液からなる非経口的投与のための組成物を提供する。種々の水性担体 、例えば、水、緩衝化水、0.4%の生理食塩水、0.3%のグリシン、ヒアル ロン酸などを使用することができる。これらの組成物は普通の、よく知られた滅 菌技術により滅菌することができるか、あるいは滅菌濾過することができる。生 ずる水溶液はそれ自体使用のために包装するか、あるいは凍結乾燥することがで き、凍結乾燥した調製物を無菌の溶液と投与前に組み合わせる。組成物は必要に 応じて生理学的溶液に近似させるために製剤学的に許容される補助物質、例えば 、pH調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム 、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタ ンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含有することができ る。 ある態様において、医薬組成物の中にCTLを活性化する少なくとも1種の成 分含めることが望ましいことがある。生体内でウイルスの抗原に対してCTLを 活性化することができる脂質、例えば、トリパルミトイル−S−グリセリルシス テイニル−セリル−セリン(P3CSS)が同定され、これは適当なペプチドに 共有結合させ るときウイルス特異的細胞障害性Tリンパ球を効果的に活性化することができる 。参照、Deresら、Nature 342:561−564(1989)、 ここに引用によって加える。本発明のペプチドを、例えば、P3CSSにカップ リングし、そしてこのリポペプチドを個体に投与してHBVに対する細胞障害性 Tリンパ球の応答を特異的に活性化することができる。さらに、中性性抗体の誘 発を、また、適当なエピトープ、例えば、HBsAgのエピトープを表示するペ プチドに接合したP3CSSで活性化することができ、2つの組成物を組み合わ せてHBV感染に対する体液および細胞仲介の両方の応答をいっそう効果的に誘 発することができる。 製剤配合物中の本発明の細胞障害性Tリンパ球剌激ペプチドの濃度は、広く、 すなわち、約1重量%より低い、通常10重量%または少なくとも10重量%か ら20〜50重量%またはそれ以上程度に高く変化することができ、そして主と して流体体積、粘度などにより選択した投与の特定のモードに従い選択されるで あろう。 こうして、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は250mlの無菌のリン ガー溶液、および100mgのペプチドを含有するように構成することができる であろう。非経口的に投与可能な化合物を製造する実際の方法は当業者に知られ ているか、あるいは当業者にとって明らかでありそして、例えば、Reming ton’s Pharmaceutical Science 、第17版、Ma ck Publishing Company、イーストン、ペンシルベニア州 (1985)、これをここに引用によって加える。 本発明のペプチドは、また、ペプチドを特定の組織、例えば、リンパ系組織ま たはHBV感染肝細胞にターゲッティングするリポソームを介して投与すること ができる。リポソームは、また、ペプチド組成物の半減期を増加するために使用 できる。本発明において有 用なリポソームは、乳濁液、フォーム、ミセル、不溶性単層、脂質結晶、リン脂 質分散液、層状層などを包含する。これらの調製物において、送り出すべきペプ チドはリポソームの部分として、単独であるいは、例えば、リンパ系細胞の間で 優勢な、レセプターに結合する分子、例えば、CD45抗原に結合するモノクロ ーナル抗体と組み合わせるか、あるいは他の治療または免疫原性組成物と組み合 わせて組み込まれる。こうして、本発明の所望のペプチドを充填したリポソーム はリンパ系または肝細胞の部位に向けられることができ、ここでリポソームは次 いで選択した治療/免疫原性ペプチド組成物を送り出す。本発明において使用す るリポソームは標準の小胞形成脂質から形成され、脂質は一般に中性または負に 帯電したリン脂質およびステロール、例えば、コレステロールを包含する。脂質 の選択は一般に、例えば、リポソームの大きさおよび血流中のリポソームの安定 性の考察により案内される。リポソームを製造する種々の方法を利用可能であり 、例えば、次の文献に記載されている:Szokaら、Ann.Rev.Bio phys.Bioeng. 9:467(1980)、米国特許第4,235,8 71号、米国特許第4,501,728号、米国特許第4,837,028号、 および米国特許第5,019,369号、ここに引用によって加える。免疫細胞 へターゲッティングするために、リポソームの中に組み込むべきリガンドは、例 えば、所望の免疫系細胞の細胞表面の決定基に対して特異的な抗体またはその断 片を包含する。ペプチドを含有するリポソームの懸濁液は、静脈内、局所に、局 所的などに投与することができ、ここで投与量は投与のモード、送り出されるペ プチド、処置する疾患の状態などに従い変化する。 固体の組成物のために、普通の無毒の固体の担体を使用することができ、これ らは、例えば、製剤学的等級のマンニトール、ラクト ース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セル ロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを包含する。経口的投 与のために、製剤学的に許容される無毒の組成物は任意の通常使用される賦形剤 、例えば、前述の担体、および一般に10〜95%の活性成分、すなわち、本発 明の1種または2種以上のペプチド、およびより好ましくは25%〜75%の濃 度で組み込むことによって形成される。 エアゾールの投与のために、細胞障害性Tリンパ球剌激ペプチドは好ましくは 微粉砕した形態で界面活性剤および噴射剤と一緒に供給される。ペプチドの典型 的な百分率は0.01〜20重量%、好ましくは1〜10重量%である。界面活 性剤は、もちろん、無毒であり、そして好ましくは噴射剤の中に可溶性である。 このような剤の代表例は、6〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カ プロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、 オステリン酸およびオレイン酸と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物と のエステルまたは部分的エステルである。混合エステル、例えば、混合または天 然のグリセリドを使用することができる。界面活性剤は組成物の0.1〜20重 量%、好ましくは0.25〜5重量%を構成することができる。組成物の残部は 通常噴射剤である。また、担体、例えば、鼻内の送り出しのためにレシチンを必 要に応じて含むことができる。 他の面において、本発明は活性成分として免疫原的に有効量のここに記載する 細胞障害性Tリンパ球剌激ペプチドを含有するワクチンに関する。1種または2 種以上のペプチドをヒトを包含する宿主の中にその自身の担体に連鎖させて、ま たは活性ペプチド単位のホモポリマーまたはヘテロポリマーとして導入すること ができる。このようなポリマーは増加した免疫学的反応の利点を有しそして、異 なるペプチドを使用してポリマーを構成する場合、HBVの異なる抗原決定基と 反応する抗体および/または細胞障害性T細胞を誘発する能力を有する。有用な 担体はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、キーホールリンペ ットヘモシアニン、チログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン 、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸、例えば、ポリ(D−リジン:D−グルタミ ン酸)などを包含する。ワクチンは、また、生理学的に耐性の(許容できる)希 釈物、例えば、水、リン酸塩緩衝生理食塩水、または生理食塩水を含有し、そし てさらに典型的にはアジュバントを含む。アジュバント、例えば、不完全フロイ ンドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、または明礬はこ の分野においてよく知られている物質である。そして、前述したように、細胞障 害性Tリンパ球の応答は本発明のペプチドを脂質、例えば、P3CSSに接合す ることによって活性化することができる。ここに記載するように注射、エアゾー ル、経口的、経皮的または他のルートを経てペプチド組成物で免疫化すると、宿 主の免疫系はワクチンに対してHBVに対して特異的な細胞障害性Tリンパ球を 大量に生産することによって応答し、そして宿主はHBV感染に対して少なくと も部分的に免疫となるか、あるいは発生する慢性HBV感染に対して耐性となる 。 本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、HBV感染に対して感受性で あるか、あるいはそうでなければHBV感染の危険にある患者に投与して患者自 身のの免疫応答能力を増強することができる。このような量を「免疫原的に有効 量」と定義する。この場合において、正確な量は再び患者の健康状態および体重 、投与のモード、配合物の特質などに依存するが、一般に約1.0μg〜約50 0mg/70kgの患者、より普通には約50μg〜約200mg /70kgの患者の範囲である。ペプチドは適当なHLA型の個体に投与し、例 えば、HBenv183−191(配列識別番号:1)、HBenv248−2 60(配列識別番号:2)、HBenv260−269(配列識別番号:9)、 HBenv335−343(配列識別番号:10)、HBenv152−161 (配列識別番号:11)、HBenv177−185(配列識別番号:12)、 HBenv204−212(配列識別番号:12)、および/またはHBenv 370−379(配列識別番号:14)の領域からのペプチドのワクチン組成物 について、これらの少なくともHLA−A2個体に投与されるであろう。 ある場合において、本発明のペプチドのワクチンをHBV、とくにHBVエン ベロープ抗原、例えば、組換えHBVenvエンコーデッド抗原に対する中性性 抗体の応答を誘発するワクチンまたはHBV感染個体から得られた精製した血漿 調製物から製造したワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。種々の HBVワクチン調製物が記載され、そしてそれらはHBsAgおよびそのポリペ プチド断片に主として基づく。本発明のペプチドを使用して配合することができ るワクチンの例について、一般に参照、欧州特許(EP)第154,902号お よび欧州特許(EP)第291,586号、および米国特許第4,565,69 7号、米国特許第4,624,918号、米国特許第4,599,230号、米 国特許第4,803,164号、米国特許第4,882,145号、米国特許第 4,977,092号、米国特許第5,017,558号および米国特許第5, 019,386号、各々をここに引用によって加える。ワクチンを組み合わせ、 そして同時に、あるいは別々の調製物として投与することができる。 治療および免疫化の目的で、本発明のペプチドは、また、弱毒化 ウイルス宿主、例えば、ワクシニアにより発現することができる。このアプロー チは、本発明のHBVペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現するベ クターとしてワクシニアウイルスを使用することを包含する。急性的または慢性 的にHBV感染した宿主の中に、あるいは非感染宿主の中に導入するとき、組換 えワクシニアワクチンはHBVペプチドを発現し、これによりHBVに対する宿 主の細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用 なワクシニアのベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848 号(ここに引用によって加える)に記載されている。他のベクターはBCG(b acille Calmette Guerin)である。BCGベクターはS toverら(Nature 351:456−460(1991))(ここに 引用によって加える)に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または 免疫化のために有用である広範な種類の他のベクター、例えば、チフス菌Sa lmonella typhi )のベクターなどはここにおける記載から当業者 にとって明らかであろう。 請求の範囲の発明の組成物および方法は半ビボ(ex vivo)治療のため に使用することができる。半ビボ治療とは、治療および免疫原性の操作が体の外 側で実施されることを意味する。例えば、リンパ球または他の標的細胞を患者か ら取り出し、そして高い投与量の主題のペプチドで処置し、患者により達成され るか、あるいは耐えられるレベルをかなり超える剌激濃度のペプチドを細胞の媒 質の中に提供することができる。CTLを剌激する処置後、細胞を宿主に戻して HBV感染を処置する。また、宿主の細胞を、前述したように、ペプチドをエン コードする遺伝子を有するベクターに対して暴露することができる。ベクターで いったんトランスフェクションされると、細胞を生体外で増殖するか、あるいは 患者に戻すこ とができる。生体外で増殖された細胞を、前以て決定した細胞密度に到達した後 、患者に戻すことができる。 また、ペプチドは診断剤としての用途を見出すことができる。例えば、本発明 のペプチドを使用してペプチドまたは関係するペプチドを使用して処置の養生法 に対する特定の個体の感受性を決定することができ、こうして現存する処置のプ ロトコールを変更するか、あるいは影響を受けた個体について予後を決定すると き助けとなることができる。さらに、ペプチドは、また、どの個体が発生する慢 性HBV感染について実質的に危険であるかを予測するために使用することがで きる。 実施例I CTL特異的HBenvエピトープの同定 この実施例は、HBVエピトープ抗原に対して特異的なHLA制限CTL応答 を誘発したHBenvペプチドの同定を記載する。 研究に含めたすべての患者はHLA−A2陽性であった。13人の患者(A− 1〜A−13;表II)を急性肝炎のエピソードの間に研究し、6人(C−1〜 C−6)はHBVにより慢性的に感染しており、そして6人は非感染の健康なボ ランティア(N−1〜N−6)は正常の対照として働いた。患者および患者のH LAハプロタイプを、HLA型別トレー(One Lambda、シノガパーク 、カリフォルニア州)を使用する微小細胞障害性試験においてPBMCにより決 定し、表IIに示す。 急性肝炎の診断は標準の診断基準に基づいた。診断のパラメーターは肝臓の損 傷の臨床的(黄疸)および生化学的証拠(正常の上限より少なくとも20倍大き いALT活性)、ならびに肝炎デルタおよびC型肝炎のウイルスの感染の血清学 的証拠の不存在(Abbo tt Laboratories、ノースシカゴ、イリノイ州)における急性H BV感染の血清学的証拠(HBV表面抗原(HBsAg)およびIgG抗HBc 抗体の存在)を包含した。すべての患者は黄疸の発現後最初の4週の間に研究し 、そのとき患者の血清はHBsAgについて陽性でありそしてそれらのALTレ ベルは顕著に異常であった。13人の患者のうちの11人は引き続いて疾患から 回復し、血清トランスアミナーゼの正常化およびHBsAgのクリアランスは最 初の診断の4月以内であった。1人の患者(A−11、表II)は慢性の活性肝 炎を発生しそして最初の診断後13月にHBsAg陽性に止まった。1人の患者 (A−10)は最初のクリニックの訪問後追跡を失った。慢性B型肝炎の患者は 6カ月より長い間HBsAgに対して反復して血清学的に陽性であり、そして温 和ないし中程度に増大した血清ALT活性を表示した。正常の対照はHBV感染 の臨床的歴史をもたず、そしてHBVマーカーについて血清学的陰性であった。 すべての患者および正常の対照はHIVに対する抗体について血清学的に陰性で あった。 患者および正常のドナーからのPBMCをフィコール−ハイパーク(Fico ll−Hypaque)密度勾配(Sigma、ミゾリー州セントルイス)で分 離し、ハンクス(Hanks)平衡化塩溶液(HBSS)(Gibco、ニュー ヨーク州グランドアイランド)中で3回洗浄し、L−グルタミン(2mM)、ゲ ンタマイシン(10μg/ml)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマ イシン(50μg/ml)、およびHEPES(50mM)(10%の加熱不活 性化ヒトAB血清を含有する)(完全培地)を補充したRPMI 1640培地 (Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)の中に再懸濁させ、そして 24ウェルのプレート中で4×106細胞/ウェルでプレートした。特記しない 限り、合成ペプチドを細胞培養物に10μg/mlの最終濃度で添加した。第3 日に、rIL2(Hoffman−La Roche、ニューヨーク州ナトレイ )を10U/mlの最終濃度で補充した完全培地の1mlを各ウェルに添加した 。第7日に、培養物をペプチド、rIL2および照射した(3000ラド)オー トロガスまたはHLA−A2合致フィーダー細胞で再剌激し、そして培養したP BMCを第14日にCTL活性について試験した。ペプチド特異的細胞障害性活 性表示した選択した培養物を1μg/mlのペプチド、20U/mlのIL2お よび1μg/mlのフィトヘムアグルチニン(PHA)(Sigma、ミゾリー 州セントルイス)を含有する1mlの完全培地中で1×106の照射(6000 ラド)同種異系のPBMCおよび1×105の照射(18000ラド)JY細胞 (同種異系のEBV−B)形質転換細胞系、HLA−A2.1、B7、Cw7) (14)で毎週再刺激することによって拡張した。 細胞障害性アッセイのために、標的細胞はa)10μg/mlにおいて合成ペ プチドと一夜インキュベーションした同種異系PHA 剌激芽細胞または同種異系HLA合致または不一致EBV形質転換Bリンパ芽球 細胞系(B−LCL);b)前述の安定なB−LCLトランスフェクション体; またはc)組換えワクシニアウイルスで感染したB−LCL(後述する)から成 っていた。B−LCLはアメリカン・ソサイアティ・フォー・ヒストコンパティ ビリティ・アンド・イムノジェネティックス(American Societ y for Histocompatibility and Immunog enetics)(マサチュセッツ州ボストン)から購入するか、あるいは同時 継続米国出願第07/935,898号に記載するようにわれわれの自身の患者 および正常のドナーのプールから確立した。細胞をL−グルタミン(2mM)、 ゲンタマイシン(10μg/ml)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプト マイシン(50μg/ml)、HEPES(50mM)、および10%(v/v )の加熱不活性化FCS(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)を 補充したRPMI 1640中で維持した。L−グルタミン(2mM)、ゲンタ マイシン(10μg/ml)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシ ン(50μg/ml)、HEPES(50mM)、10%(v/v)の加熱不活 性化FCS、および10U/mlのrIL2を補充したRPMI1640中で中 で末梢血PBMCをPHAで1μg/mlにおいて剌激することによって、オー トロガスPBMC芽細胞の短期間の系統を生産した。室温において揺動プレート 上で50プラーク形成U/細胞において1×106細胞を感染させ、次いで1回 洗浄し、そして37℃において一夜インキュベーションすることによって、ワク シニア感染標的を調製した。 標的細胞を100μCiの51r(Amersham、イリノイ州アーリント ンハイツ)で1時間標識化し、そしてHBSSで3回 洗浄した。標準の4時間の51Cr解放アッセイにおいて5000標的細胞/ウェ ルを含有するU字形の底の96ウェルのプレートを使用して、細胞溶解活性を決 定した。細胞障害性%を次の式から決定した:100×[(実験の解放−自発的 解放)/(最大の解放−自発的解放)]。最大の解放は洗浄剤(1%のトリトン X−100、Sigma)で標的を溶解することによって決定した。自発的解放 はすべてのアッセイにおいて最大の解放の25%より低かった。 急性肝炎の2人のHLA−A2陽性患者(A−1およびA−3)をHBsAg 329−348(ASARFSWLSLLVPFVQWFVG(配列識別番号: 22)に対するCTLの応答の分析のために最初に選択し、この配列は2つのオ ーバーラップするHLA−A2.1アレレ特異的結合モチーフを含有する(W SLLVPFおよびLVPFVQWF)。これらの患者の1人(A−3) は、また、HLA−A2.1アレレ特異的結合モチーフ(FPSDFFPS )を表す10残基のHBVヌクレオカプシドのエピトープ(HBsAg18−2 7)に対するHLA−A2制限CTL応答を表示することが前の実験から知られ ていた。この患者はHBsAg329−348におけるモチーフの一方または両 方に対する潜在的レスポンダーと考えられた。他の患者(A−1)は、HBsA g18−27に対するレスポンダーでないことが知られており、比較のために研 究した。 HBsAg329−348特異的CTL系統を、両方の患者のPBMCから前 述したようにペプチドで刺激することによって発生させた。刺激の2〜3週後、 両方の患者はHBsAg329−348ペプチドで前パルスしたホモ接合体HL A−A2.1陽性EBV細胞系(JY)に対して強い細胞障害性応答を表示した 。患者A−1のHBsAg329−348特異的細胞系をクローニングのために 選択した。 CTL系統を本来96ウェルのマイクロタイタープレート中で1、10、およ び100細胞/ウェルでクローニングし、次いで0.3または1細胞/ウェルで サブクローニングした。細胞をペプチド(1μg/ml)、PHA(1μg/m l)、rIL2(20U/ml)、照射(6000ラド)同種異系PBMC(1 05細胞/ウェル)、および照射(18000ラド)JY細胞(104細胞/ウ ェル)の存在下にプレートした。HBV特異的クローンを24ウェルのプレート 中で前述したように再刺激したが、ただしペプチドを省略しそして、HBVの大 きいエンベロープ抗原の安定な発現を付与するプラスミドでトランスフェクショ ンした照射JY細胞(EBO−preS1、参照10)を105細胞/ウェルで 添加した。 患者A−1のHBsAg329−348特異的細胞系を使用して、4クローン を1細胞/ウェル(クローンB13、B16、B17)または0.3細胞/ウェ ル(クローンB3)でプレートした細胞から誘導した。クローンB3をHLAC −1アレレのレベルにおいてエフェクターと部分的に合致する同種異系標的細胞 のパネルに対して試験した。HLAC−1において患者A−1と部分的に合致す る同種異系標的細胞を使用して、クローンB3の細胞溶解活性は、ペプチド中の 2HLA−A2.1結合モチーフの存在のために、HLA−A2制限されること が発見された。患者A−3から誘導されたHBsAg329−348特異的ポリ クローナルCTL系統は、また、同一のステアリン酸マグネシウムにおいてHL A−A2制限されると決定された。患者のHLA−A2サブタイプは決定された なかったので、ペプチドに対するCTLの応答がHLA−A2アレレによっての み制限されるかどうか、あるいはそれが他のHLA−A2サブタイプに同様によ く拡張するかどうかは知られていない。 HBsAg329−348内の最小の、最適なHLA−A2制限CTLエピト ープを決定するために、HBsAg329−348を補充したから誘導されたア ミノ末端の切形およびオーバーラップする9マーおよび10マーのパネルを生成 して、2つのオーバーラップする理想的なHLA−A2.1結合モチーフを含有 する、この20残基のペプチドの中に存在する1または2以上のHLA−A2制 限CTLエピトープをマッピングした。患者A−1からのHLA−A2制限CT LクローンB17、および患者A−3からのポリクローナルCTL系統1B9を 、前述の最初の細胞系およびHBsAg329−348の反復刺激により誘導し 、エフェクター細胞として使用して、HBsAg329−348に対するCTL の応答の微細な特異性を確立した。HLA−A2.1陽性B細胞系(JY)をも との20マーと、あるいは切形ペプチドとインキュベーションすることによって 、標的細胞を生産した。 第1図の結果が示すように、2つのHLA−A2.1結合モチーフの最初のも の(HBsAg335−343)のみがCTLにより認識される。さらに、デー タが証明するように、このペプチド(WLSLLVPFV)はHBsAg329 −348剌激CTLにより認識される最小の、最適なHLA−A2制限エピトー プである。なぜなら、HBsAg335−343からの極端のアミノ末端または 極端のカルボキシ末端の残基はCTLによる認識を壊滅させるからである。 ペプチドを使用して患者A−1からのPBMCにおけるCTLの応答を剌激し たとき、エフェクターレベルにおけるHBsAg335−343の優秀性は繰り 返される。類別したHBsAg329−348サブユニットを表す合成ペプチド を10μMで使用して患者A−1のPBMCを剌激した。剌激の週後、これらの 系統の細胞障 害性を10μMの同一ペプチドで前パルスしたJY標的細胞および10μMのH BsAg335−343で前パルスしたJY標的細胞に対して60:1のE:T で試験した。第2図に示す結果は、4時間の51Cr解放アッセイにおける溶解% を表す。第2図において見ることができるように、HBsAg335−343お よびその拡張した変異型はCTLの応答を誘発できることを証明したが、極端の アミノ末端およびカルボキシ末端のアミノ酸を省略すると、CTLの応答を剌激 するペプチドの能力は完全に壊滅し、これによりHBsAg335−343がH BsAgの329−348の間の最小の、最適なHLA−A2制限エピトープで あるという結論を強化する。 実施例IIHBVenvにおける7つのHLA−A2.1結合モチーフに対するCTLの応 第2位置にロイシンおよびカルボキシ末端としてバリンを含有する長さ9〜1 0残基のペプチドとして定義された、7つの理想的なHLA−A2.1アレレ特 異的結合モチーフは、HBVエンベロープタンパク質のHBsAg領域に存在す る(表III)。実施例Iにおいて得られた結果に基づいて、これらの7つのエ ンベロープタンパク質、+既知のHLA−A2制限HBVヌクレオカプシドエピ トープ(HBsAg18−27)が、12人の急性B型肝炎のHLA−A2陽性 患者においてCTLの応答を剌激する能力を検査した。比較のために、6人の慢 性肝炎のHLA−A2陽性患者および6人の未感染の正常の対照をペプチドの同 一パネルに対する応答性について試験した。 急性患者(A−1〜A−12)、慢性患者(C−1〜C−6)、および正常の 被検者(N−1〜N−6)からのPBMCを次の合成ペプチド:1=HBcAg 18−27、2=HBsAg201−210、3=HBsAg251−259、 4=HBsAg260−269、5=HBcAg335−343、6=HBsA g338−347、7=HBsAg348−357、8=HBsAg378−3 87、で実施例1に記載するように2週間刺激し、そして同一ペプチドで一夜前 パルスしたJY標的細胞に対する4時間の51Cr解放アッセイにおいて試験した 。ペプチドで前パルスしなかったJY標的細胞による51Cr解放をペプチドで前 パルスしたJY標的細胞による51Cr解放から減ずることによって、ペプチド特 異的細胞障害性を測定した。示す結果(第3図)は4時間の51Cr解放アッセイ における特異的溶解%を表す。 第3図理解できるように、急性肝炎の12人のHLA−A2陽性 患者のうちの9人はパネルの中のペプチドの少なくとも1つに対して応答した。 対照的に、6人のHLA−A2陽性の未感染の正常の対照のいずれも同一の生体 外の剌激後にペプチドのいずれに対しても応答せず、患者によるこれらのペプチ ドに対する応答性が対応するHBV誘導エピトープによる生体内の活性化を反映 することを示唆する。 重要なことには、9人のレスポンダーのうちの8人はパネル内の多数のエピト ープを認識し、急性肝炎の間のHBVに対するCTLの応答がポリクローナルお よび多重特異性の両方であることを示す。さらに、9人のレスポンダーの間で認 識されたエピトープのスペクトルにおいて実質的な変動が存在し、ある種のエピ トープは他よりもいっそう頻繁に認識された。例えば、HBsAg18−27お よびHBsAg335−343は、それぞれ、9人のレスポンダーのうちの7人 および8人により個々に認識され、そして組み合わせたとき、それらはレスポン ダーのすべての9人により認識された。対照的に、HBsAg348−357、 HBsAg251−259およびHBsAg260−269は、それらを試験し たレスポンダーの3/9、2/5および3/6のみにより認識された。 急性的に感染した患者において循環するヴィリオンDNAのヌクレオチド配列 の分析は、生体外のCTLの拡張を剌激するために使用したプロトタイプのHB sAg335−343ペプチドの中に存在する正確なアミノ酸配列を発現するウ イルスにより、CTLの非レスポンダーを包含する、すべての患者は感染するこ とを示した。残基335−343は、伝子バンク−72のデータベース、ならび にここにおける研究した10人の患者において発表されているように、すべての 4つのサブタイプから誘導されたすべての発表されたHBV配列の中に保存され ることが知られているので、HBsAg 335−343はHBVグループ特異的CTLエピトープであると結論すること ができる。しかしながら、同一のことはHBsAg348−357について真実 ではない。なぜなら、生体外の剌激のために使用したプロトタイプの配列(GL SPTVWLSV)をエンコードするウイルスにより、10人の患者のうちの7 人のみが感染されることが発見されたからである。残りの3人の患者(A−9、 A−10、A−13)は、カルボキシ末端のバリンが位置357においてアラニ ンにより置換された変異型の配列を表示した。プロトタイプのウイルスにより感 染された患者の間で、ちょうどHBsAg335−343についてのように、C TLのレスポンダーおよびHBsAg348−357に対する非レスポンダーが 観察された。他方において、変異型ウイルスにより感染した3人の患者のいずれ もプロトタイプのペプチドに対するCTLの応答を表示しなかった。 すべての9人のレスポンダーは引き続いてHBsAg陰性となり、そしてレス ポンダーの肝臓疾患は完全に消散したことは注目に値する。対照的に、ウイルス を除去することができなかった、慢性肝炎のすべての6人の患者は、また、これ らのエピトープのいずれに対する末梢血CTLの応答を獲得することができなか った。急性的に感染した患者のうちの3人(A−10、A−11、A−12)は 、また、これらのペプチドのいずれに対しても応答することができなかった。さ らに、非レスポンダーの1人(A−11)は慢性の活性肝炎を発生し、そしてま だ彼の急性疾患後13カ月HBsAg陽性であった。これらの組み合わせたデー タはCTLの応答およびウイルスのクリアランスの間の関係を強く示唆する。し かしながら、非レスポンダーの患者A−12は疾患の発現後1〜4月の間にHB sAgに陰性的に血清変換した。 表IIおよび第3図に示すように、9人のレスポンダーのうちの4人はこの研 究において使用したJY標的細胞系(HLA−A2、B7、Cw7)とHLA A2アレレのみを共有し、ペプチドのすべてに対する応答がこれらの個体におい てHLA−A2制限されることを証明した。残りのレスポンダーは、また、A2 に加えてJY標的細胞の中に存在するHLA B7および/またはCw7アレレ を共有するので、ありそうに思われないが、これらのアレレは、また、これらの 患者におけるこれらのエピトープのための制限要素として働くことができる。 7つのHBVエピトープのペプチドの異なる免疫原性についての分子の基礎は 、それらの配列の比較から直ちに明らかではなかった。ホモ接合体HLA−A2 .1陽性B細胞系(JY)への無関係のHLA−A2制限ヌクレオカプシドのエ ピトープ(HBsAg18−27)の結合と競合する7つのエピトープのペプチ ドの能力を決定することによって、HLA−A2.1に対するペプチドの相対的 結合活性における潜在的差を検査した。 競合的結合の阻害アッセイは、エフェクター細胞源として患者A−4からのH BsAg18−27特異的CTLクローンを使用した。ブロッキングペプチド( 1、10、100μM)を51Cr標識化、HLA−A2.1陽性JY標的細胞と エフェクター細胞との混合物(E:T=40:1、3000標的細胞/ウェル) に添加し、次いで40分後に飽和より低い濃縮(0.03μM)の標的ペプチド 、HBsAg18-27を添加した。各ペプチドが4時間の51Cr解放アッセイにお いて標的細胞の溶解をブロックする程度を計算することによって、各ペプチドの 結合能力を評価した。 第4図に示すように、すべての4つの免疫原性ペプチドおよび3つの非免疫原 性ペプチドのうちの2つをHLA−A2.1分子に結 合したが、広く(100倍より大きく)変動可能な効率はそれらの相対的免疫原 性と相関関係をもたなかった。重要なことには、このアッセイにおいてHLA− A2.1に結合しなかった唯一のペプチド(HBsAg337−348)は非免 疫原性であった。しかしながら、他の2つの免疫原性ペプチドについて、HLA −A2.1の結合アフィニティーは免疫原性ペプチドのいくつかと同程度に高い か、あるいはそれより高かった。こうして、このクラスIの分子に結合するペプ チドの能力は免疫原性のために要求されるが、それはそれを保証しない。これが 示唆するように、抗原のプロセシングのレベルにおける追加の因子およびT細胞 のレパートリーは、ウイルスのタンパク質内のどのHLA−A2.1結合性ペプ チドがCTLの応答を誘発できるかの決定においてある役割を演ずることができ る。 実施例IIIペプチド特異的CTLを内因性HBenv抗原を認識する HBVのaywまたはadwサブタイプのクローニングされたHBVゲノムか ら誘導された大きい、中程度および主要なエンベロープのポリペプチドをエンコ ードする組換えワクシニアウイルスの2つのグループで感染した標的細胞を溶解 するそれらの能力について測定することによって、内因的に合成される抗原を認 識するHBsAg335-343およびHBsAg348-357特異的CTLの能力を検査し た。 HBVの大きい、中程度および主要なエンベロープのポリペプチド(adwサ ブタイプ)を発現する組換えワクシニアウイルスおよび対応する対照の野生型ワ クシニアを得た(Smithら、Nature 302:490(1983); Chengら、J.Virol.60:337(1986);Chengおよび Moss、 .Virol. 61:1286(1987)、それらの各々をここに引用によっ て加える)。HBVのaywサブタイプの同一の3つのHBVエンベロープのポ リペプチドを発現し組換えワクシニアウイルスの独立の系列を、次のようにして 誘導した。HBsAgの発現のために、HBV配列のヌクレオチド1409−2 514を含有するXhoI/SphI制限断片を、7.5Kの初期/後期のプロ モーターから下流のワクシニアウイルスの発現ベクターの中にクローニングした 。ワクシニアウイルスを発現するpreS1について、ヌクレオチド937−2 514を含有するBglII/SphI断片を使用した。preS2コーディン グ配列をクローニングするために、まず、ヌクレオチド1267(例えば、pr eS2開始コドンから6塩基対上流)に開始しそして位置1280におけるEc oRI部位をスパンする、短いアダプターのオリゴヌクレオチドを合成した。ワ クシニアウイルスの発現ベクターの中にこのオリゴヌクレオチドをクローニング した後、EcoRI/SphI HBV断片(ヌクレオチド1280−2514 )を中間の構成体の中に再クローニングすることによって、コーディング配列を 完成させた。組換えワクシニアウイルスの発生は、Smithら、前掲、に記載 されているような標準の手順に従い実施した。Guilhotoら、J.Vir ol. 66:2670(1992)(ここに引用によって加える)に記載されて いるように、対応するHBV(aywサブタイプ)コーディング領域を含有する 、EBVに基づく発現ベクターのパネルでB−LCLをトランスフェクションす ることによって、HBVエンベロープタンパク質を発現する安定なトランスフェ クション体(aywサブタイプ)を生成した。 それぞれ、ペプチド配列WLSLLVPFVおよびGLSPTVWLSVで刺 激することによって、HBsAg335-343特異的CT L系統(患者A−1)およびHBsAg348-357特異的CTL系統(患者A−4 )を発生させた。培地と、誘発ペプチドと、あるいは(HBsAg348-357の場 合において)変異型ペプチド(GLSPTVWLSA)と前インキュベーション した、51Cr標識化JY標的細胞とCTLをインキュベーションした。aywお よびadwHBVゲノムから誘導されたHBV主要な(V−HBs)、中程度( V−preS2)、および大きい(V−preS1)エンベロープポリペプチド を発現する、6つの組換えワクシニアウイルスのパネルで感染した51Cr標識化 JY標的細胞と、また、CTLをインキュベーションした。野生型ワクシニアウ イルス(V−wt)を対照として使用した。HBsAg335-343特異的CTL系 統(右のパネル)をE:T=40:1において使用した。HBsAg348-357特 異的CTL系統(左のパネル)をE:1において使用した。示す結果は4時間の 51Cr解放アッセイにおける溶解%を表す。 患者A−1およびA−4からの両方のHBsAg335-343およびHBsAg348 -357特異的CTLは、すべての3つのHBVエンベロープタンパク質を合成する 、組換えワクシニアウイルス感染標的細胞を溶解することができた(第5図)。 これが示すように、これらの合成ペプチドの両方は、感染した細胞内の大きい、 中程度および主要なHBVエンベロープポリペプチドの内因性プロセシングによ り発生するエピトープを表す。 重要なことには、HBsAg335-343特異的CTLは両方の組の組換えワクシ ニアウイルスにより感染した標的を等しい効率で溶解することができ、HBsA g348-357特異的CTLはayw感染標的細胞のパネルをadw標的よりも非常 に効率よく溶解することができた。 上の実施例に記載する結果が例示するように、ヒトにおけるHB Vに対するCTL応答は非常に多価であり、多分この重大なウイルスの感染に対 していっそう効率よい保護を与えるように思われる。さらに、データが示すよう に、ここにおいて使用するペプチドの刺激法は、多形性HLAクラスI位置によ りそのまま制限された、多価の応答の同定および分析のために、効率よくかつ有 効である。追加のHLAアレル特異的結合モチーフは同定されるので、これらの モチーフを含有するHBV誘導ペプチドはCTL手順の生体外の剌激について使 用することができる。 この明細書の中に述べたすべての刊行物、特許および特許出願をこの明細書の 中に、各個々の刊行物、特許および特許出願が特定的にかつ個々にここに引用に よって加えると示されているように、ここに引用によって加える。 以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で記載したが、 本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更を行うことができる。した がって、本発明は添付する請求の範囲による以外限定されない。 配列のリスト (1)一般的情報: (i)出願人:チサリ、フランシス V. (ii)発明の名称:B型肝炎のウイルスに対する細胞障害性Tリンパ球の 応答を誘発するペプチド (iii)配列の数:27 (iv)通信の住所: (A)受信人:タウンセンドおよびタウンセンド (B)街路:ワン・マーケット・プラザ、ステウアート・ストリート・タ ワー (C)市:サンフランシスコ (D)州:カリフォルニア州 (E)国:米国 (F)郵便番号:94105 (v)コンピューター読取り可能なフォーム: (A)媒質の型:フロッピーディスク (B)コンピューター:IBM PC コンパティブル (C)操作システム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:パテント・イン・リリース#1.0、バージョン# 1.25 (vi)現在の出願データ: (A)出願番号: (B)提出日: (C)分類: (viii)代理人の情報: (A)名前:パルメリー、ステブン W (B)登録番号:31,990 (C)参照/処理番号:14740−4 (ix)電気通信の情報: (A)TEL:206−467−9600 (B)FAX:415−543−5043 (2)配列識別番号:1についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:9アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:1 (2)配列識別番号:2についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:13アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎮 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:2 (2)配列識別番号:3についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:3 (2)配列識別番号:4についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:9アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:4 (2)配列識別番号:5についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:5 (2)配列識別番号:6についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:9アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:6 (2)配列識別番号:7についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:9アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:7 (2)配列識別番号:8についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:8 (2)配列識別番号:9についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:9 (2)配列識別番号:10についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:9アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:10 (2)配列識別番号:11についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:11 (2)配列識別番号:12についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:9アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:12 (2)配列識別番号:13についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:9アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:13 (2)配列識別番号:14についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:14 (2)配列識別番号:15についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:15 (2)配列識別番号:16についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:16 (2)配列識別番号:17についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:20ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:17 (2)配列識別番号:18についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:20ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:18 (2)配列識別番号:19についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:20ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:19 (2)配列識別番号:20についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:15ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:20 (2)配列識別番号:21についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:20ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:21 (2)配列識別番号:22についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:20ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:22 (2)配列識別番号:23についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:23 (2)配列識別番号:24についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:24 (2)配列識別番号:25についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:25 (2)配列識別番号:26についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:26 (2)配列識別番号:27についての情報: (i)配列の特性: (A)長さ:10ミノ酸 (B)型:アミノ酸 (C)鎖:一本鎖 (D)トポロジー:線状 (ii)分子の型:ペプチド (xi)配列の記載:配列識別番号:27
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI C07K 7/08 8318−4H (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AT,AU,BB,BG,BR,BY, CA,CH,CN,CZ,DE,DK,ES,FI,G B,HU,JP,KP,KR,KZ,LK,LU,LV ,MG,MN,MW,NL,NO,NZ,PL,PT, RO,RU,SD,SE,SK,UA,US,UZ,V N

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.次の配列: HBenv183−191(配列識別番号:1) Phe−Leu−Leu−Thr−Arg−Ile−Leu−Thr−Ile を含んでなるCTL誘発ペプチド。 2.ペプチドが、また、Tヘルパーエピトープを含有する、請求の範囲1のC TL誘発ペプチド。 3.免疫原性脂質キャリヤーに接合された、請求の範囲1のペプチド。 4.8〜13アミノ酸を含んでなり、ここでアミノ酸の少なくとも過半数が配 列: HBenv248−260(配列識別番号:2) Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe− Leu−Leu−Val−Leu を有するHBenvの対応する部分に対して相同性である、CTL誘発ペプチド 。 5.9〜11アミノ酸を含んでなる、請求の範囲4のCTL誘発ペプチド。 6. HBenv248−257(配列識別番号:3) Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe− Leu; HBenv249−257(配列識別番号:4) Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu; HBenv249−258(配列識別番号:5) Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu− Leu; HBenv250−258(配列識別番号:6) Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu; HBenv251−259(配列識別番号:7) Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val; または HBenv251−260(配列識別番号:8) Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val− Leu; を含んでなる、請求の範囲4のCTL誘発ペプチド。 7.9〜11アミノ酸を含んでなり、ここでアミノ酸の少なくとも過半数が配 列: HBenv334−344(配列識別番号:) Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val を有するHBenvの対応する部分に対して相同性である、CTL誘発ペプチド 。 8. HBenv335−343(配列識別番号:10) Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val; HBenv334−343(配列識別番号:15) Ser−Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe− Val;または HBenv335−344(配列識別番号:16) Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Ph e−Val−Gln; を含んでなる、請求の範囲7のCTL誘発ペプチド。 9.免疫原性リポタンパク質キャリヤーに接合された、請求の範囲8のペプチ ド。 10.リポソームを含んでなる製剤学的に許容されうる担体の中に懸濁された 、請求の範囲9のペプチド。 11.有効量のペプチドをHLA−A2ハプロタイプを有する宿主に投与する ことからなり、ここで前記ペプチドは、次の配列: HBenv183−191(配列識別番号:1) Phe−Leu−Leu−Thr−Arg−Ile−Leu−Thr−Ile を含んでなるCTL誘発ペプチドである、B型肝炎の感染を処置または予防する 方法。 12.有効量のペプチドをHLA−A2ハプロタイプを有する宿主に投与する ことを含んでなり、ここで前記ペプチドは8〜13アミノ酸からなるCTL誘発 ペプチドであり、ここでアミノ酸の少なくとも過半数が配列: HBenv248−260(配列識別番号:2) Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe− Leu−Leu−Val−Leu、または HBenv335−343(配列識別番号:10) Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val、 を有するHBenvの対応する部分に対して相同性である、B型肝炎の感染を処 置または予防する方法。 13.CTL誘発ペプチドが、 HBenv248−257(配列識別番号:3) Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe− Leu; HBenv249−257(配列識別番号:4) Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu; HBenv249−258(配列識別番号:5) Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu− Leu; HBenv250−258(配列識別番号:6) Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu; HBenv251−259(配列識別番号:7) Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val; または HBenv251−260(配列識別番号:8) Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val− Leu; を含んでなる、請求の範囲12の方法。 14.宿主が慢性B型肝炎の感染を有するか、あるいはB型肝炎の保菌者であ る、請求の範囲13の方法。 15.CTL誘発ペプチドが、 HBenv335−343(配列識別番号:10) Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val; HBenv334−343(配列識別番号:15) Ser−Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe− Val;または HBenv335−344(配列識別番号:16) Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val− Gln; である、請求の範囲12の方法。 16.宿主が急性B型肝炎の感染を有する、請求の範囲12の方法。 17.CTL誘発ペプチドを予防的に投与する、請求の範囲12の方法。 18.宿主が慢性B型肝炎の感染を有するか、あるいはB型肝炎の保菌者であ る、請求の範囲13の方法。 19.CTL誘発ペプチドをHBVに対するTヘルパーの応答を誘発する第2 ペプチドとともに宿主に投与する、請求の範囲12の方法。 20.CTL誘発ペプチドおよびTヘルパー誘発ペプチドが連鎖されている、 請求の範囲19の方法。
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