JP3616390B2 - B型肝炎のウイルスに対する細胞障害性tリンパ球の応答を誘発するペプチド - Google Patents

B型肝炎のウイルスに対する細胞障害性tリンパ球の応答を誘発するペプチド Download PDF

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Description

政府の支持
米国政府は米国健康研究所(National Institures of Health)が授与した認可に従い本発明においてある種の権利を有することができる。
細胞障害性Tリンパ球(CTL)は、ウイルス、細胞内細菌および寄生体、および腫瘍細胞で感染した闘争細胞において必須の役割を演ずる。それらは直接の細胞障害性によりおよび他の免疫細胞、例えば、マクロファージ、B細胞、および他のT細胞に対する特異的および非特異的助けを提供することによってそれをなす。感染した細胞または腫瘍細胞はプロテアーゼを含む細胞内事象を通して抗原を処理する。処理された抗原は、細胞表面上でHLAクラスI分子に結合したペプチドの形態で、CTL上のT細胞レセプターに提示される。MHCクラスI分子は、また、外因性ペプチドに結合しそしてそれらをCTLに細胞内処理なしに提示することができる。
現在において、抗原性タンパク質の配列から、タンパク質が処理される方法およびペプチドのどの部分がHLAクラスI分子と結合しそしてCTLに提示されるかを予測することは困難である。結合のモチーフは、いくつかのHLAクラスI分子について、これらの分子から溶離されたペプチドの配列分析に基づいて予測された(Falkら、Nature 351:290(1991))。さらに、処理されそしてHLAクラスIに実際に結合するペプチドのうちで、どれがCTL認識可能なエピトープを含有するかはまだ予測不可能である。
B型肝炎のウイルス(「HBV」)は、現在世界中でほぼ2.5×108人の人々を感染している非溶解性ウイルスである。大人におけるHBV感染は、典型的には、大部分の場合において急性疾患に導き、そして大部分の患者において慢性疾患の状態に導く。この急性/慢性の比は、感染が出産時間に密接して起こるとき逆転する。慢性HBV感染において肝細胞癌の出現率の増加が存在する。成人期においてHBVで感染した個体の小さい百分率は、高い死亡率で強い免疫応答に関連する激症の肝炎を発生する。
HBV感染のために有効な処置は存在しないが、HBV感染を予防するワクチンが最近数年間に開発されてきている。ワクチンは慢性HBV保菌者の血漿から精製されたHBV表面抗原(HBsAg)を使用するか、あるいは組換えDNA技術により生産されたHBsAgを使用する。また、合成HBsAgペプチドに基づくワクチンが提案された。参照、例えば、米国特許第4,559,230号および米国特許第4,599,231号。しかしながら、抗HBsAgワクチンは免疫化個体のわずかに約90%において保護を与える。免疫化されないか、あるいは免疫化されたが、保護されない個体は潜在的感染の有意な貯蔵所を提供する。
HBV抗原に対する免疫性へのCTLの寄与は評価することは困難であった。Chisariら(Microbial Pathogen.6:31(1989))は、HBVエンコーデ化抗原に対するHLA−クラスI制限、CD8+細胞障害性T細胞の応答により仲介されることができる。クラスIの主要な組織適合性(MHC)制限細胞障害性Tリンパ球の応答は、種々の他のウイルス、例えば、インフルエンザウイルスについて同定された。例えば、Townsendら、Cell 44:959(1986)は、細胞障害性Tリンパ球により認識されるインフルエンザウイルスの核タンパク質のエピトープを合成ペプチドにより定めることができることを報告した。HBVに対する細胞障害性Tリンパ球の応答を定めることを試みるとき、急性および慢性HBVの患者からの末梢血液のリンパ球は生体外でオートロガス肝細胞を殺すことができるが、細胞溶解性の特異性、そのHLA制限要素、および細胞の表現型は確立されなかった。参照、Mondelliら、J.Immunol.129:2773(1982)およびMondelliら、Clin.Exp.Immunol.6:331(1987)。Moriyamaら、Science 248:361−364(1990)は、HBVの主要なエンベロープ抗原が肝細胞表面において、エンベロープ特異的抗原によりおよびMHCクラスI制限、CD8+細胞障害性Tリンパ球により認識可能な形態で発現されることを報告した。
HBVで慢性的に感染した個体の大きい貯蔵所が存在するので、適当なHBV抗原に対して応答するこれらの個体の免疫応答を刺激し、これによりそれらの感染を排除することが望ましいであろう。また、急性期の感染に悩まされる個体における慢性HBV感染に対する進化を防止することが望ましいであろう。さらに、現在承認されたHBVワクチンは免疫化個体の抗体10%において保護の免疫性を誘発しないので、例えば、ワクチンの免疫原性を増加または多様化することによって、いっそう有効な免疫性を誘発することが望ましいであろう。非常に驚くべきことには、本発明はこれらおよび他の関係する要求を満足する。
本発明は、HBV抗原に対するMHCクラスI制限細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発するペプチドを提供する。問題のペプチドはHBVエンベロープから誘導される。ある種の態様において、CTL誘発ペプチドは、配列HBenv183−191 Phe−Leu−Leu−Thr−Arg−Ile−Leu−Thr−Ile(配列識別番号:1);HBenv248−257 Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu(配列識別番号:3);HBenv249−257 Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu(配列識別番号:4);HBenv249−258 Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu(配列識別番号:5);HBenv250−258 Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu(配列識別番号:6);HBenv251−259 Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val(配列識別番号:7);HBenv251−260 Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val−Leu(配列識別番号:8);HBenv260−269 Leu−Leu−Asp−Tyr−Gln−Gly−Met−Leu−Pro−Val(配列識別番号:9);HBenv335−343 Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val(配列識別番号:10);HBenv152−161 Ser−Ile−Leu−Ser−Lys−Thr−Gly−Asp−Pro−Val(配列識別番号:11);HBenv177−185 Val−Leu−Gln−Ala−Gly−Phe−Phe−Leu−Leu(配列識別番号:12);HBenv204−212 Phe−Leu−Gly−Gly−Thr−Pro−Val−Cys−Leu(配列識別番号:13);またはHBenv370−379 Ser−Ile−Val−Ser−Pro−Phe−Ile−Pro−Leu−Leu(配列識別番号:14)を有する;か、あるいは前述の配列の1つに対して実質的に相同の配列を有するであろう。ペプチドは必要に応じてN−末端またはC−末端の一方または両方においてフランキングおよび/または修飾されることができる。その生物学的活性に実質的に悪影響を及ぼさないで、選択したペプチド内の非決定的残基において、保存的置換、欠失および付加をなすことができる。
種々のペプチドの態様において、ペプチドを各々それ自体に対して重合してより大きいホモポリマーを形成するか、あるいは異なるペプチドと重合してヘテロポリマーを形成することができることが理解されるであろう。ある場合において、ペプチドは組成物中で混合物として組み合わせられ、そして連鎖されないであろう。ペプチドは、また、Tリンパ球の応答を増強することができる脂質含有分子に接合するか、あるいは、例えば、Tヘルパー細胞の応答を誘発する異なるペプチドに接合することができる。
追加のペプチド、リポソーム、アジュバントおよび/または製剤学的に許容されうる担体と配合された本発明のペプチドからなる組成物が提供される。こうして、医薬組成物は、とくに感染が慢性または保菌の状態に進行するのを防止する努力において、急性HBV感染を処置する方法において使用できる。慢性HBV感染およびHBVの保菌状態を処置する方法が、また、提供され、ここで医薬組成物を感染した個体にHBcエピトープに対する免疫原的に有効な細胞障害性T細胞の応答を刺激するために十分な量で投与する。これらの感染を処置するために、HBV抗原に対するMHCクラスI制限細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発するペプチドを他のHBV抗原、例えば、HBVコアに対する免疫応答を誘発するその他のペプチドまたはタンパク質と組み合わせることが望ましい。慢性または保菌状態の感染を有する個体を処置するために、組成物を反復した投与で、必要に応じて、延長した期間にわたって投与して、ウイルスの感染および/または脱落を解決または緩和する。
HBV感染、とくに慢性HBV感染を予防するワクチン組成物が、また、提供される。ワクチン組成物は、免疫原的に有効量のMHCクラスI制限細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する前述のHBVエンベロープペプチド、例えば、HLA−A2を含み、そして典型的にはさらにアジュバント、例えば、不完全フロインドアジュバントまたは水酸化アルミニウムを含むであろう。HBVに対する高められた防御を達成せしめるため、このワクチンはHBVエンベロープ抗原に対する防御的抗体応答を誘発する成分を更に含んで成りうる。
なお他の態様において、本発明は診断法に関し、ここで本発明のペプチドを使用して、個体におけるHBVエピトープ抗原に対する細胞障害性T細胞の応答が可能であるリンパ球の存在を決定する。このような細胞の不存在は、問題の個体が慢性HBV感染を発生することに対して感受性であるかどうかを決定する。典型的には、リンパ球は末梢血リンパ球であり、そして問題の個体は急性HBV感染に悩まされる。
特定の態様の説明
本発明は、HBV感染の処置、予防および診断のための組成物および方法において使用するHBVエンベロープペプチドから誘導されたペプチドを提供する。これらのペプチドはHBV感染細胞に対するMHCクラスI制限細胞障害性Tリンパ球の応答を刺激する。刺激された細胞障害性Tリンパ球は感染細胞を殺すか、あるいはウイルスの複製を阻害し、こうして、慢性HBV感染を包含する感染を妨害するか、あるいは実質的に予防することができる。細胞障害性T細胞の応答を誘発するとき有効であるペプチドは、また、T−ヘルパーの応答を誘発できる免疫原と組み合わせることができる。
本発明においてを使用するペプチドは、HBenv183−191(配列識別番号:1)、HBenv248−260(配列識別番号:2)、HBenv260−269(配列識別番号:9)、HBenv335−343(配列識別番号:10)、HBenv152−161(配列識別番号:11)、HBenv177−185(配列識別番号:12)、HBenv204−212(配列識別番号:13)、およびHBenv370−379(配列識別番号:14)の領域から誘導され、ここで番号はGalibertら、前掲、に従う。
本発明の「ペプチド」または「オリゴペプチド」を誘発するHBV細胞障害性Tリンパ球とは、HBc配列から誘導された、少なくとも4つのHBVアミノ酸配列の残基、好ましくは少なくとも6、より好ましくは8または9、時には10〜12残基、そして通常約50より少ない残基、より通常抗体35より少ない、好ましくは25より少ない、例えば、8〜17アミノ酸残基の鎖を意味する。細胞表面上のMHCクラスIの分子に結合した内因的に処理されたウイルスのペプチドと大きさが釣り合った、8〜12アミノ酸残基の長さに本発明のペプチドを最適化することが望ましいことがある。参照、一般に、Schumacherら、Nature 350:703−706(1991);Van Bleekら、Nature 348:213−216(1990);Rotzschkeら、Nature 348:252−254(1990);およびFalkら、Nature 351:290−296(1991)、これらをここに引用によって加える。いっそう詳細に後述するように、通常ペプチドはここにおいて識別するHBV配列の隣接する残基の対応する部分に対して相同であり、そしてCTL誘発エピトープを含有するアミノ酸の少なくとも主要部分を有する。
ペプチドは、後述するように、「合成的に」に、あるいは換えDNA技術により製造することができる。ペプチドは好ましくは他の天然に見出されるHBVタンパク質およびそれらの断片を実質的に含有しないが、ある態様においてペプチドは天然の断片またはペプチドに合成的に接合することができる。用語ペプチドはこの明細書においてポリペプチドと互換的に使用して、隣接するアミノ酸のアルファ−アミノ基とアルファ−カルボキシ基との間でペプチド結合により互いに接続した1系列のアミノ酸を表示するために使用する。ポリペプチドまたはペプチドは、種々の長さであり、それらの中性(非帯電)の形態であるか、あるいは塩である形態であることができ、そして修飾、例えば、グリコシル化、側鎖の酸化、またはリン酸化を含まないか、あるいはこれらの修飾を含有することができ、修飾がここに記載するようにポリペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に暴露することができる。
望ましくは、ペプチドは大きいペプチドの生物学的活性の実質的にすべてをなお維持しながら、できだけ小さくされるであろう。生物学的活性とは、適当なMHC分子を結合しそしてHBV抗原または抗原模倣体に対する細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する能力を意味する。細胞障害性Tリンパ球の応答とは、問題のHBV抗原に対して特異的なCD8+Tリンパ球の応答を意味し、ここでCD8+、MHCクラスI制限Tリンパ球が活性化される。活性化されたTリンパ球は、リンホカイン(例えば、ガンマインターフェロン)を分泌し、細胞を殺すか、あるいは殺さないで、感染したオートロガス細胞またはトランスフェクションされた細胞におけるウイルスの複製を阻害する生産物(例えば、セリンエステラーゼ)を遊離する。
用語「相同」、「実質的に相同」、および「実質的な相同性」は、ここにおいて使用するとき、1つの配列がアミノ酸の参照配列と比較して少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸の配列を意味する。配列の同一性または相同性の百分率は、参照配列の対応する部分に対して整列させたとき、互いに比較することによって計算される。
ヌクレオカプシド領域からの本発明のCTL誘発HBVペプチドの態様は、6〜35アミノ酸からなり、そしてペプチド領域HBenv183−191(配列識別番号:1)からの少なくとも1つのHLA制限CTLエピトープ部位を含有する。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるHBenv183−191領域の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv183−191は配列:
HBenv183−191(配列識別番号:1)
Phe−Leu−Leu−Thr−Arg−Ile−Leu−Thr−Ile
を有する。このHBenv183−191領域のペプチドの態様は、さらにここに記載するように、必要に応じて、N−末端およびC−末端の一方または両方において、HBcを包含するHBV配列からのアミノ酸、連鎖、他のN−末端およびC−末端の修飾を促進するために付加したアミノ酸によりフランキングおよび/または修飾し、担体に連鎖することができる。ペプチドHBenv183−191は、少なくともMHCクラスI分子HLA−A2により仲介される細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する。
本発明の他のHBenvペプチドの態様は、HBenv248−260の領域から製造される。この領域から誘導されたペプチドは少なくとも1つのCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有し、そして典型的には少なくとも7アミノ酸、より通常9、10または11アミノ酸またはそれ以上であろう。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるHBenv248−260領域の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv248−260は配列:
HBenv248−260(配列識別番号:2)
Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val−Leu
を有する。
HBenv248−260領域からのペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。
HBenv248−260の領域から製造される代表的なCTL誘発ペプチドは、次の9マーまたは10マーのペプチドを包含する。
HBenv248−257(配列識別番号:3)
Phe−Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu;
HBenv249−257(配列識別番号:4)
Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu;
HBenv249−258(配列識別番号:5)
Ile−Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu;
HBenv250−258(配列識別番号:6)
Leu−Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu;
HBenv251−259(配列識別番号:7)
Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val;
HBenv251−260(配列識別番号:8)
Leu−Leu−Cys−Leu−Ile−Phe−Leu−Leu−Val−Leu。
上のペプチドはHLA制限CTL誘発エピトープを含有し、典型的には少なくともHLA−A2制限されており、そして上のペプチドIについて前述したように一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。
他の態様において、本発明のペプチドは10マーのHBenv260−269、および少なくとも7の隣接するアミノ酸のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの1または2以上の部位を含有するHBenv260−269から誘導されたペプチドからなる。ペプチドのアミノ酸の大部分は、天然に見出されるHBenv260−269配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv260−269は配列:
HBenv260−269(配列識別番号:9)
Leu−Leu−Asp−Tyr−Gln−Met−Leu−Pro−Val
を有する。
この領域から製造されたペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。ペプチドHBenv260−269(配列識別番号:4)は、少なくともMHCクラスI HLA−A2分子により仲介される細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する。
本発明のなお他のCTL誘発ペプチドはHBenv335−343(配列識別番号:10)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBenv335−343(配列識別番号:10)から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv335−343配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv335−343は配列:
HBenv335−343(配列識別番号:10)
Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。
本発明のなお他のCTL誘発ペプチドはHBenv152−161(配列識別番号:11)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBenv152−161(配列識別番号:11)から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv152−161配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv152−161は配列(adwサブタイプ):
HBenv152−161(配列識別番号:11)
Ser−Ile−Leu−Ser−Lys−Thr−Gly−Asp−Pro−Val
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。
本発明の他のCTL誘発ペプチドはHBenv177−185(配列識別番号:12)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBenv177−185(配列識別番号:12)から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv177−185配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv177−185は配列(adwサブタイプ):
HBenv177−185(配列識別番号:12)
Val−Leu−Gln−Ala−Gly−Phe−Phe−Leu−Leu
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。
本発明の追加のCTL誘発ペプチドはHBenv204−212(配列識別番号:13)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBenv204−212(配列識別番号:13)から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv204−212配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv204−212は配列(adwサブタイプ):
HBenv204−212(配列識別番号:13)
Phe−Leu−Gly−Gly−Thr−Pro−Val−Cys−Leu
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。
本発明の追加のCTL誘発ペプチドはHBenv370−379(配列識別番号:14)の領域からであり、そして少なくとも7つの隣接するアミノ酸の1または2以上のCTL誘発HLAC−1制限エピトープの部位を含有するHBenv370−379(配列識別番号:14)から誘導されたペプチドを含む。ペプチドのアミノ酸の大部分は天然に見出されるHBenv370−379配列の対応する部分のアミノ酸と同一であるか、あるいはそれらに対して実質的に相同であり、ここでHBenv370−379は配列(adwサブタイプ):
HBenv370−379(配列識別番号:14)
Ser−Ile−Val−Ser−Pro−Phe−Ile−Pro−Leu−Leu
を有する。ここで選択したペプチドは、ここに記載するように、一方または両方の末端においてフランキングおよび/または修飾することができる。
前述したように、担体、支持体またはより大きいペプチドへのカップリングのために、ここに記載する理由で、あるいはペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的性質の変更などのために、追加のアミノ酸をオリゴペプチドまたはペプチドの末端に付加して、互いとの連鎖を容易にすることができる。アミノ酸、例えば、チロシン、システイン、リジン、グルタミンまたはアスパラギン酸などをペプチドまたはオリゴペプチドのC−末端またはN−末端に導入することができる。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチドの配列は、末端のNH2のアシル化、例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸のアミド化、末端のカルボキシのアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどにより修飾することによって、天然の配列と異なるようにすることができる。ある場合において、これらの修飾は支持体または他の分子への連鎖のための部位を提供することができる。
理解されるように、本発明のHBVペプチドまたは細胞障害性Tリンパ球刺激活性を有するそれらの類似体を必要に応じて修飾して、ある種の他の所望の属性、例えば、改良された薬理学的特性を提供するすると同時に、非修飾ペプチドの生物学的活性を増加するか、あるいは少なくとも実質的に保持することができる。例えば、ペプチドは、例えば、ここにおいて開示する配列から誘導されたペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端、または両方へのアミノ酸の付加または欠失により、ペプチド配列中のアミノ酸の延長、減少または置換により修飾することができる。ペプチドを修飾してCTL誘発活性を実質的に増強し、こうして修飾されたペプチド類似体が野生型配列のペプチドより大きいCTL活性を有するようにすることができる。例えば、とくにN−末端の第2残基が疎水性でありそしてHLA制限分子への結合において関係がある場合、ペプチドのN−末端の疎水性を増加することが望ましいことがある。N−末端における疎水性を増加することによって、T細胞への提示効率を増加することができる。他の疾患に関連する抗原、とくに宿主が有意のCTL活性をもたないことがあるCTL誘発エピトープを含有するものから製造されたペプチドは、第2残基が通常疎水性であるペプチドのN−末端における疎水性残基を置換することによってCTL誘発性とすることができる。
本発明において使用するペプチドは、主題の化合物がHBVの4つの主要なサブタイプに対する細胞障害性Tリンパ球の活性を提供することができるかぎり、HBenv183−191(配列識別番号:1)、HBenv248−257(配列識別番号:3)、HBenv249−257(配列識別番号:4)、HBenv249−258(配列識別番号:5)、HBenv250−258(配列識別番号:6)、HBenv251−259(配列識別番号:7)、HBenv251−260(配列識別番号:8)、HBenv260−269(配列識別番号:9)、HBenv335−343(配列識別番号:10)、HBenv152−161(配列識別番号:11)、HBenv177−185(配列識別番号:12)、HBenv204−212(配列識別番号:13)、またはHBenv370−379(配列識別番号:14)と同一である必要はない。HBVの異なる株が存在するが、それらの各々は、「a」と表示される、少なくとも1つの共通のエンベロープの決定基を共有する。各株は、また、2つのエンベロープの決定基を有し、それらの1つは「d」または「y」であり、そして第2は「w」または「r」である。こうして、ウイルスの4つの可能なサブタイプが存在する:adw、ayw、adr、およびayr。HBVのクローニング、配列決定および発現は英国特許(GB)第2034323号、欧州特許(EP)第13828号、米国特許第4,935,235号に記載されており、そしてHBVエンベロープ領域の完全な配列は、また、Galibertら、Nature 281:646(1979)に記載されており、それらの各々をここに引用によって加える。アミノ酸配列は遺伝子バンク−72データベースの中に20の異なるHBV株について記載されており、7のadwサブタイプ、5のaywサブタイプ、7のadrサブタイプ、および1株のayrサブタイプを包含し、遺伝子バンクの配列をまたここに引用によって加える。
したがって、ペプチドを種々の変化、例えば、挿入、欠失、および置換に、保存的または非保存的に、付すことができ、ここでこのような変化はそれらの使用においてある種の利点を提供する。保存的置換とは、アミノ酸残基を生物学的および/または化学的に類似する他のもの、例えば、他について1つの疎水性残基、あるいは他について1つの極性残基と置換することを意味する。置換基は組み合わせ、例えば、Gly、Ala;Val、Ile;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;およびPhe、Tyrを包含する。通常、HBV細胞障害性Tリンパ球刺激エピトープを実質的に模擬することを意図する配列の部分は、HBVの少なくとも1つのサブタイプの配列と約20%より多くは異ならないが、ただし例えば、連鎖またはカップリングを容易にするなどのために、ペプチドの物理的または化学的性質を変更する目的で、追加のアミノ酸をいずれかの末端に付加することができる。ペプチドの配列の領域がHBVのサブタイプの間で多形性であることが発見された場合、1または2以上の特定のアミノ酸を変化させて異なるHBV株またはサブタイプの異なる細胞障害性Tリンパ球のエピトープをいっそう効率よく模擬することが望ましいことがある。
上に列挙した代表的なペプチドを包含する、本発明により識別されたペプチドの配列内に、ペプチドがそれらの生物学的活性、すなわち、HBV感染細胞またはHBV抗原を発現する細胞に対するクラスI制限細胞障害性Tリンパ球の応答を刺激する能力を保持させる残基(または実質的に機能的に同等なもの)が存在する。これらの残基は単一のアミノ酸の置換、欠失、または挿入により同定することができる。さらに、残基の側鎖によりなされる寄与は、特定のアミノ酸(例えば、Ala)を使用する系統的走査によりプロービングすることができる。多数の置換に耐えるペプチドは、一般に、このような置換、例えば、小さい、比較的中性の分子、例えば、Ala、Gly、Pro、または同様な残基を取り込んでいる。置換、付加または減法が可能である残基の数または種類は必須のエピトープの点の間の必要な間隔および探求するコンフォメーションおよび機能の属性(例えば、疎水性/親水性)に依存するであろう。必要に応じて、細胞障害性Tリンパ球に対して提示するためのそのMHC分子へのペプチド類似体の結合アフィニティーの増加は、また、このような変更により達成することができる。一般に、エピトープおよび/またはコンフォメーション的に重要な残基の間のスペーサーの置換、付加または欠失は、結合を崩壊するであろう立体的または電荷の妨害を回避するように選択されたアミノ酸または部分を使用するであろう。
多数の置換に耐えると同時に所望の生物学的活性を保持するペプチドは、また、D−アミノ酸含有ペプチドとして合成することができる。このようなペプチドは「インバーソ(inverso)」または「レトロ−インバーソ(retro−inverso)」の形態として、すなわち、配列のL−アミノ酸をD−アミノ酸と置換するか、あるいはアミノ酸の配列を逆転しそしてL−アミノ酸をD−アミノ酸と置換することによって合成することができる。D−ペプチドはペプチダーゼに対して実質的にいっそう耐性であり、したがってそれらのL−ペプチドと比較して血清および組織においていっそう安定であるので、生理学的条件下のD−ペプチドの安定性は対応するL−ペプチドと比較してアフィニティーの差の補償を越えたことをすることができる。さらに、置換基を含むか、あるいは含まないL−アミノ酸含有ペプチドをD−アミノ酸でキャップして、抗原性ペプチドのエキソペプチダーゼを破壊を阻止することができる。
ここに記載する例示的ペプチドに加えて、本発明はHBVに対するMHC制限細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発することができる前記ペプチド領域に関連する他のエピトープ領域を同定する方法を提供する。この方法は、感染したまたは未感染の個体から末梢血リンパ球(PBL)を獲得し、そしてHBenv183−191(配列識別番号:1)、HBenv248−260(配列識別番号:2)、HBenv260−269(配列識別番号:9)、HBenv335−343(配列識別番号:10)、HBenv152−161(配列識別番号:11)、HBenv177−185(配列識別番号:12)、HBenv204−212(配列識別番号:13)、またはHBenv370−379(配列識別番号:14)のペプチドから誘導された合成ペプチドまたはポリペプチド断片で細胞を暴露(刺激)することからなる。各々が典型的には約8〜20残基長さ、好ましくは9〜12残基の、オーバーラップする合成ペプチドのプールをを使用して細胞を刺激することができる。細胞障害性Tリンパ球の活性を誘発する活性残基をプールから選択することができる。特定の細胞障害活性を誘発するペプチドの能力は、刺激したPBLをそのHBVサブゲノムの断片で感染またはトランスフェクションしたオートロガス標識化(例えば、51Cr)標的細胞(例えば、HLA合致マクロファージ、T細胞、線維芽またはBリンパ芽球細胞)とインキュベーションし、こうしてターゲッテッド抗原を細胞で内因的に合成し(あるいは細胞を問題のペプチドでパルスし)、そして標識の特定の解放を測定することによって決定する。
細胞障害性Tリンパ球の応答を刺激するエピトープ領域を有するペプチドがいったん同定されると、応答のMHC制限要素を決定することができる。これは刺激したPBLまたはその短期間の系統を問題のペプチドまたは適当な対照でパルスした既知のHLA型の(標識化)標的細胞のパネルとインキュベーションすることを包含する。CTLにより溶解されるパネルにおける細胞の1または2以上のHLAアレルを溶解しない細胞と比較し、そして問題の抗原に対する細胞障害性Tリンパ球の応答のための1または2以上のHLA制限要素を同定する。
Carboneら、J.Exp.Med.167:1767(1988)は、ペプチドによる刺激が対応する内因性タンパク質に対する低いアフィニティーで細胞障害性Tリンパ球を誘発でき、こうしてそれぞれのペプチドの刺激がペプチドを認識するが、天然の抗原ではない細胞障害性Tリンパ球を生ずることができることを報告した。刺激された細胞障害性Tリンパ球が天然のHBVペプチドを認識できないことはHBVペプチドの治療剤およびワクチン組成物の開発において望ましくないので、この潜在的制限を回避する方法を使用する。細胞障害性T細胞の順次の再刺激を本発明において使用して、合成ペプチドについてより高いアフィニティーを天然に処理された抗原についてを有するT細胞を同定しそして選択する。活性化したPBLを再刺激することによって、短期間の細胞障害性Tリンパ球の系統を確立する。ペプチドで刺激された細胞をペプチドおよび組換え体または天然のHBV抗原、例えば、HBsAgで再刺激する。活性を有する細胞を、また、適当なT細胞のマイトジェン、例えば、フィトヘムアグルチニン(PHA)で刺激する。再刺激された細胞は、T細胞ヘルプ、およびHBV抗原の抗原非特異性源として照射された同種異系のPBLを有する。天然のHBV抗原を認識する細胞障害性Tリンパ球の集団を選択的に拡張しかつ長期間の系統を確立するために、患者からのPBLをまずペプチドおよび組換え体または天然のHBV抗原で刺激し、次いで対応するHBV抗原のポリペプチドを安定に発現するHLA合致Bリンパ芽球細胞で再刺激する。オートロガスおよび同種異系のBリンパ芽球あるいは適当な抗原でトランスフェクションまたは感染させた他の細胞を使用して、内因的に合成された抗原を認識する能力について細胞系を再確証する。
1または2以上の患者またはHLA型において細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発することに寄与する本発明の異なるペプチドが同定されると、ある場合において組成物中で2またはそれ以上のペプチドを接合することが望ましいことがある。組成物中のペプチドは同一であるか、あるいは異なることができ、そして一緒になってそれらは患者の1または2以上のペプチドと同等であるか、あるいはそれらより大きい生物学的活性を提供すべきである。例えば、ここに記載する方法を使用して、2またはそれ以上のペプチドは特定の領域、例えば、HBenv248−257(配列識別番号:3)、HBenv249−257(配列識別番号:4)、HBenv249−258(配列識別番号:5)、HBenv250−258(配列識別番号:6)、HBenv251−259(配列識別番号:7)、および/またはHBenv251−260(配列識別番号:8)ペプチドからの異なるか、あるいはオーバーラップする細胞障害性Tリンパ球のエピトープを定めることができ、これらのペプチドを「カクテル」で組み合わせて細胞障害性Tリンパ球の応答について増強された免疫原性を提供することができる。そのうえ、とくに第2または引き続くペプチドが最初のものと異なるMHC制限要素を有するとき、1つの領域のペプチドを、同一であるか、あるいは異なるHBVタンパク質からの、他のHBV領域のペプチドと組み合わせることができる。他のCTL誘発HBVペプチドは同時継続米国出願第07/935,898号に記載されており、これをここに引用によって加える。ペプチドのこの組成物は、多様な集団の間で本発明の治療、ワクチンまたは診断の方法および組成物により提供される免疫学的適用範囲を効果的に広げるために使用することができる。例えば、優勢な民族(コーカーサス人、アジア人およびアフリカの黒人)の間のHLAアレレの異なる頻度を下表Iに示す。本発明の治療またはワクチンの組成物を配合して、集団の出来るだけ高い百分率に可能性治療または免疫性を提供することができる。
Figure 0003616390
略語:EUC、ヨーロッパ人のコーカーサス人;NAC、北アフリカのコーカーサス人; AFR、アフリカの黒人;JPN、日本人。
*A28は2つのアレルAw68及びAw69を表す。
本発明のペプチドは連鎖を介して組み合わせてポリマー(マルチマー)を形成するか、あるいは連鎖なしに、混合物として、組成物中で配合することができる。同一ペプチドをそれ自体に連鎖し、これによりホモポリマーを形成する場合、複数の反復するエピトープ単位が提示される。ペプチドが異なる場合、例えば、カクテルが異なるHBVサブタイプを表す場合、あるサブタイプ内で異なるエピトープ、異なるHLA制限特異性、Tヘルパーエピトープを含有するペプチド、反復する単位をもつヘテロポリマーが提供される。共有結合に加えて、分子間または構造内の結合を形成できる非共有結合の連鎖が含められる。
ホモポリマーまたはヘテロポリマーのための、あるいは担体へのカップリングのための連鎖は種々の方法で得ることができる。例えば、システイン残基をアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に付加することができ、ここでペプチドはシステイン残基のコントロールされた酸化を経て共有結合される。また、一方の官能基末端においてジサルファイド連鎖および他方においてペプチド連鎖を発生する多数のヘテロ官能剤、例えば、N−スクシジイミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)は有用である。この試薬は、それ自体および一方のタンパク質中のシステイン残基および他方におけるリジン上のアミノまたは他の遊離アミノ基を通してアミド連鎖の間でジサルファイド連鎖をつくる。種々のこのようなジサルファイド/アミド形成剤は既知である。参照、例えば、Immunol.Rev.62:185(1982)、これをここに引用によって加える。他の2官能性カップリング剤はジサルファイド連鎖よりむしろチオエーテルを形成する。それらのチオエーテル形成剤の多くは商業的に入手可能であり、そして6−マレイミドカプロン酸、2−ブロモ酢酸、2−ヨード酢酸、4−(N−マレイミド−メチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸の反応性エステルなどを包含する。カルボキシル基はそれらをスクシンイミドまたは1−ヒドロキシ−2−ニトロ−4−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせることによって活性化することができる。特定の好ましいカップリング剤は、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボンカルボキシレート(SMCC)である。理解されるように、連鎖は記載するように、例えば、HBV細胞障害性T細胞の決定基、ペプチド類似体,またはTヘルパー決定基として機能する連鎖した基のいずれをも実質的に妨害すべきではない。
他の面において、本発明のペプチドはHBVT−ヘルパー細胞のエピトープ、例えば、HBVへの細胞障害性T細胞の誘発において共同するT細胞を刺激するエピトープを提示する他のペプチドと組み合わせるか、あるいはカップリングすることができる。T−ヘルパー細胞は、例えば、T−ヘルパー1またはT−ヘルパー2表現型であることができる。HBV配列からのT−ヘルパーのエピトープは、配列:Met−Asp−Ile−Asp−Pro−Tyr−Lys−Glu−Phe−Gly−Ala−Thr−Val−Glu−Leu−Leu−Ser−Phe−Leu−Pro(配列識別番号:17)を有する、HBc1−20において同定された。他のT−ヘルパーのエピトープは、配列Pro−His−His−Tyr−Ala−Leu−Arg−Gln−Ala−Ile−Leu−Cys−Trp−Gly−Glu−Leu−Met−Tyr−Leu−Ala(配列識別番号:18)を有する、領域HBc50−60から、および配列Leu−Leu−Trp−Phe−His−Ile−Ser−Cys−Leu−Thr−Phe−Gly−Arg−Glu−Thr−Val−Ile−Glu−Tyr−Leu(配列識別番号:19)(ここでIle116 はHBVのadwサブタイプにおけるLeuである)を有するHBc100−119、配列Glu−Tyr−Leu−Val−Ser−Phe−Gly−Val−Trp−Ile−Arg−Thr−Pro−Pro−Ala(配列識別番号:20)を有するHBc117−131、および配列Val−Ser−Phe−Gly−Val−Trp−Ile−Arg−Thr−Pro−Pro−Ala−Tyr−Arg−Pro−Pro−Asn−Ala−Pro−Ile(配列識別番号:21)を有するペプチドHBc120−139を包含する、HBc100−139の領域からのペプチドにより提供された。参照、Ferrariら、J.Clin.Invest.88:214−222(1991)、および米国特許第4,882,145号、各々をここに引用によって加える。
本発明のペプチドは広範な種類の方法で製造することができる。比較的短い長さを有するために、ペプチドは普通の技術に従い溶液中で、あるいは固体の支持体上で合成することができる。種々の自動合成装置は商業的に入手可能であり、そして既知のプロトコールに従い使用することができる。参照、例えば、StewartおよびYoung、Solid Phase Peptide Synthesis、第2版、Pierce Chemical Co.(1984);Tamら、J.Am.Chem.Soc.105:6442(1983);Merrifield、Science232:341−347(1986);およびBaranyおよびMerrifield、The Peptides、GrossおよびMeienhofer編、Academic Press、ニューヨーク、pp.1−284(1979)、それらの各々をここに引用によって加える。
あるいは、組換えDNA技術を使用することができ、ここで問題のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主細胞の中に形質転換またはトランスフェクションし、そして発現のために適当な条件下に培養する。これらの手順は、例えば、一般に次の文献に記載されているように、一般にこの分野において知られている:Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1982)、およびAusubelら(編)、Current、Protocols in Molecular Biology、John Wiely and Sons,Inc.、ニューヨーク(1987)、および米国特許第4,237,224号、米国特許第4,273,875号、米国特許第4,431,739号、米国特許第4,363,877号および米国特許第4,428,941号、それらの開示をここに引用によって加える。こうして、本発明の1または2以上のペプチド配列からなる融合タンパク質を使用してHBV細胞障害性Tリンパ球の決定基を提示することができる。例えば、細胞障害性Tリンパ球の応答を刺激するためにここに記載するペプチド領域のエピトープをいっそう効果的に提示するように組換えHBenvアミノ酸配列が変更された、本発明の組換えエピトープのタンパク質が製造される。この手段により、いくつかのT細胞のエピトープを取り込んだポリペプチドを使用する。
ここにおける考えられる長さのペプチドのためのコーディング配列は化学技術、例えば、Matteucciら、J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)のホスホトリエステル法により合成することができるので、天然のペプチド配列をエンコードするものについて1または2以上の適当な塩基を単に置換することによって、修飾を行うことができる。次いでコーディング配列を適当なリンカーで準備し、そして普通にこの分野において入手可能な発現ベクターの中に結合し、そしてそれらのベクターを使用して適当に宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を生成することができる。ある数のこのようなベクターおよび適当に宿主系は現在入手可能である。融合タンパク質の発現のために、コーディング配列は作用可能に連鎖された開始コドンおよび停止コドン、プロモーターおよびターミネーターの領域および通常複製系を有して所望の細胞の宿主中の発現のための発現ベクターを提供する。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列を所望のコーディング配列の挿入のための便利な制限部位を含有するプラスミドの中に準備する。生ずる発現ベクターを適当な細菌宿主の中に形質転換する。酵母または哺乳動物細胞の宿主を、また、使用することができ、適当なベクターおよびコントロール配列を使用する。
本発明のペプチドおよびそれらの医薬組成物およびワクチン組成物は哺乳動物、とくにヒトに投与してHBV感染を処置および/または予防するために有用である。ペプチドはHBV感染細胞に対する細胞障害性Tリンパ球の応答を刺激するために使用するので、組成物は急性および/または慢性のHBV感染を処置または予防するために使用することができる。
医薬組成物のために、前述の本発明のペプチドはHBVで既に感染した個体に投与されるであろう。感染の潜伏期または急性期における個体は免疫原性ペプチドで別々に処置するか、あるいは適当ならば、他の処置と組み合わせて処置することができる。治療の適用において、組成物は患者に収獲に対する細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発しかつその症状および/または合併症を治療するか、あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は「治療的に有効な投与量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、ペプチドの組成、投与方法、処置する疾患の段階およびひどさ、患者の体重および健康の一般的状態、および主治医の判断に依存するが、患者から得られたPBL中のHBV特異的CTL活性の測定により決定して、患者のCTLの応答に依存して、70kgの患者について一般に約1μg〜約2,000mgのペプチドの範囲であり、約10μg〜約100mgのペプチドの投与量をいっそう普通に使用され、次いで数週〜数カ月にわたって約1μg〜約1mgのペプチドのブースター投与量を使用する。本発明のペプチドおよび組成物は一般に重大な疾患の状態、すなわち、生命を脅かすか、あるいは潜在的に生命を脅かす場合において使用することができることを留意しなくてはならない。このような場合において、外来の物質の最小化およびペプチドの比較的無毒の特質にかんがみて、実質的に過剰のこれらのペプチド組成物を投与することができそして処置の医師は望ましいと感じることがある。
組成物の1回または多数回の投与は、処置の医師により選択される投与量のレベルおよびパターンで実施することができる。いずれの場合においても、製剤配合物は患者を効果的に処置するために十分な量の本発明の細胞障害性Tリンパ球刺激性ペプチドを提供すべきである。
治療の使用のために、投与はHBV感染の最初の徴候においてあるいは急性感染の場合において診断のすぐ後に開始し、そして少なくとも症状が実質的に消滅しそしてその後ある期間の間続けるべきである。よく確立された慢性の場合において、負荷投与および引き続く維持またはブースターの投与が要求される。急性の肝炎の処置の間のHBVに対する有効な細胞障害性Tリンパ球の応答の誘発は、慢性肝炎、HBV保菌の段階、および続く肝細胞の癌の引き続く発生の可能性を最小とするであろう。
本発明の組成物を使用する感染した個体の処置は、急性的に感染した個体における感染の消散を速めることができ、個体の約90%は感染を自然に消散することができる。発生する慢性感染に対して感受性(または病気にかかりやすくなった)個体について、急性から慢性の感染への進化を防止する方法においてとくに有用である。感受性の個体が感染の前にまたはその間に同定された場合、例えば、ここに記載するように、組成物はそれらに対してターゲッティングされ、より大きい集団への投与の必要性を最小にすることができる。
ペプチド組成物は、また、慢性肝炎の処置のためにそして保菌者の免疫系を刺激してウイルス感染した細胞を実質的に減少するか、あるいはなお排除するために使用することができる。慢性肝炎を有する個体は、感染後約3〜6月にウイルスについて陽性と試験されるので、同定することができる。個体の感染の急性期の間の不適切な(またはふそんざいの)細胞障害性Tリンパ球の応答のために、個体が慢性HBV感染を発生することがあるので、細胞障害性T細胞の応答を効果的に刺激するために十分な量の免疫保護ペプチドを投与の配合物およびモードにおいてを提供することが重要である。こうして、慢性肝炎の処置のために、代表的な投与量は70kgの患者について約1μg〜1,000mg、好ましくは約5μg〜100mg/投与の範囲である。少なくとも臨床的症状または実験室のインジケーターがHBV感染が排除または実質的に消滅しめすまでそしてその後ある期間の間、投与を続けるべきである。免疫化投与および引き続く維持およびブースターの投与は、確立された間隔で、例えば、1〜4週間、感染を消散させるのに必要であるように、多分延長した期間、要求される。慢性および保菌のHBV感染の処置のために、また、CTLペプチドを他のHBV抗原に対する免疫応答を誘発する他のペプチドまたはタンパク質と組み合わせることが望ましいことがある。
治療的処置のための医薬組成物は、非経口的、局所的、経口的または局所の投与について意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に投与される。こうして、本発明は、許容できる担体、好ましい水性担体の中に溶解または懸濁した細胞障害性Tリンパ球刺激ペプチドの溶液からなる非経口的投与のための組成物を提供する。種々の水性担体、例えば、水、緩衝化水、0.4%の生理食塩水、0.3%のグリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。これらの組成物は普通の、よく知られた滅菌技術により滅菌することができるか、あるいは滅菌濾過することができる。生ずる水溶液はそれ自体使用のために包装するか、あるいは凍結乾燥することができ、凍結乾燥した調製物を無菌の溶液と投与前に組み合わせる。組成物は必要に応じて生理学的溶液に近似させるために製剤学的に許容される補助物質、例えば、pH調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含有することができる。
ある態様において、医薬組成物の中にCTLを活性化する少なくとも1種の成分含めることが望ましいことがある。生体内でウイルスの抗原に対してCTLを活性化することができる脂質、例えば、トリパルミトイル−S−グリセリルシステイニル−セリル−セリン(P3CSS)が同定され、これは適当なペプチドに共有結合させるときウイルス特異的細胞障害性Tリンパ球を効果的に活性化することができる。参照、Deresら、Nature 342:561−564(1989)、ここに引用によって加える。本発明のペプチドを、例えば、P3CSSにカップリングし、そしてこのリポペプチドを個体に投与してHBVに対する細胞障害性Tリンパ球の応答を特異的に活性化することができる。さらに、中性性抗体の誘発を、また、適当なエピトープ、例えば、HBsAgのエピトープを表示するペプチドに接合したP3CSSで活性化することができ、2つの組成物を組み合わせてHBV感染に対する体液および細胞仲介の両方の応答をいっそう効果的に誘発することができる。
製剤配合物中の本発明の細胞障害性Tリンパ球刺激ペプチドの濃度は、広く、すなわち、約1重量%より低い、通常10重量%または少なくとも10重量%から20〜50重量%またはそれ以上程度に高く変化することができ、そして主として流体体積、粘度などにより選択した投与の特定のモードに従い選択されるであろう。
こうして、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は250mlの無菌のリンガー溶液、および100mgのペプチドを含有するように構成することができるであろう。非経口的に投与可能な化合物を製造する実際の方法は当業者に知られているか、あるいは当業者にとって明らかでありそして、例えば、Remington’s Pharmaceutical Science、第17版、Mack Publishing Company、イーストン、ペンシルベニア州(1985)、これをここに引用によって加える。
本発明のペプチドは、また、ペプチドを特定の組織、例えば、リンパ系組織またはHBV感染肝細胞にターゲッティングするリポソームを介して投与することができる。リポソームは、また、ペプチド組成物の半減期を増加するために使用できる。本発明において有用なリポソームは、乳濁液、フォーム、ミセル、不溶性単層、脂質結晶、リン脂質分散液、層状層などを包含する。これらの調製物において、送り出すべきペプチドはリポソームの部分として、単独であるいは、例えば、リンパ系細胞の間で優勢な、レセプターに結合する分子、例えば、CD45抗原に結合するモノクローナル抗体と組み合わせるか、あるいは他の治療または免疫原性組成物と組み合わせて組み込まれる。こうして、本発明の所望のペプチドを充填したリポソームはリンパ系または肝細胞の部位に向けられることができ、ここでリポソームは次いで選択した治療/免疫原性ペプチド組成物を送り出す。本発明において使用するリポソームは標準の小胞形成脂質から形成され、脂質は一般に中性または負に帯電したリン脂質およびステロール、例えば、コレステロールを包含する。脂質の選択は一般に、例えば、リポソームの大きさおよび血流中のリポソームの安定性の考察により案内される。リポソームを製造する種々の方法を利用可能であり、例えば、次の文献に記載されている:Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)、米国特許第4,235,871号、米国特許第4,501,728号、米国特許第4,837,028号、および米国特許第5,019,369号、ここに引用によって加える。免疫細胞へターゲッティングするために、リポソームの中に組み込むべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面の決定基に対して特異的な抗体またはその断片を包含する。ペプチドを含有するリポソームの懸濁液は、静脈内、局所に、局所的などに投与することができ、ここで投与量は投与のモード、送り出されるペプチド、処置する疾患の状態などに従い変化する。
固体の組成物のために、普通の無毒の固体の担体を使用することができ、これらは、例えば、製剤学的等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを包含する。経口的投与のために、製剤学的に許容される無毒の組成物は任意の通常使用される賦形剤、例えば、前述の担体、および一般に10〜95%の活性成分、すなわち、本発明の1種または2種以上のペプチド、およびより好ましくは25%〜75%の濃度で組み込むことによって形成される。
エアゾールの投与のために、細胞障害性Tリンパ球刺激ペプチドは好ましくは微粉砕した形態で界面活性剤および噴射剤と一緒に供給される。ペプチドの典型的な百分率は0.01〜20重量%、好ましくは1〜10重量%である。界面活性剤は、もちろん、無毒であり、そして好ましくは噴射剤の中に可溶性である。このような剤の代表例は、6〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、オステリン酸およびオレイン酸と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分的エステルである。混合エステル、例えば、混合または天然のグリセリドを使用することができる。界面活性剤は組成物の0.1〜20重量%、好ましくは0.25〜5重量%を構成することができる。組成物の残部は通常噴射剤である。また、担体、例えば、鼻内の送り出しのためにレシチンを必要に応じて含むことができる。
他の面において、本発明は活性成分として免疫原的に有効量のここに記載する細胞障害性Tリンパ球刺激ペプチドを含有するワクチンに関する。1種または2種以上のペプチドをヒトを包含する宿主の中にその自身の担体に連鎖させて、または活性ペプチド単位のホモポリマーまたはヘテロポリマーとして導入することができる。このようなポリマーは増加した免疫学的反応の利点を有しそして、異なるペプチドを使用してポリマーを構成する場合、HBVの異なる抗原決定基と反応する抗体および/または細胞障害性T細胞を誘発する能力を有する。有用な担体はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、チログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸、例えば、ポリ(D−リジン:D−グルタミン酸)などを包含する。ワクチンは、また、生理学的に耐性の(許容できる)希釈物、例えば、水、リン酸塩緩衝生理食塩水、または生理食塩水を含有し、そしてさらに典型的にはアジュバントを含む。アジュバント、例えば、不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、または明礬はこの分野においてよく知られている物質である。そして、前述したように、細胞障害性Tリンパ球の応答は本発明のペプチドを脂質、例えば、P3CSSに接合することによって活性化することができる。ここに記載するように注射、エアゾール、経口的、経皮的または他のルートを経てペプチド組成物で免疫化すると、宿主の免疫系はワクチンに対してHBVに対して特異的な細胞障害性Tリンパ球を大量に生産することによって応答し、そして宿主はHBV感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、あるいは発生する慢性HBV感染に対して耐性となる。
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、HBV感染に対して感受性であるか、あるいはそうでなければHBV感染の危険にある患者に投与して患者自身のの免疫応答能力を増強することができる。このような量を「免疫原的に有効量」と定義する。この場合において、正確な量は再び患者の健康状態および体重、投与のモード、配合物の特質などに依存するが、一般に約1.0μg〜約500mg/70kgの患者、より普通には約50μg〜約200mg/70kgの患者の範囲である。ペプチドは適当なHLA型の個体に投与し、例えば、HBenv183−191(配列識別番号:1)、HBenv248−260(配列識別番号:2)、HBenv260−269(配列識別番号:9)、HBenv335−343(配列識別番号:10)、HBenv152−161(配列識別番号:11)、HBenv177−185(配列識別番号:12)、HBenv204−212(配列識別番号:12)、および/またはHBenv370−379(配列識別番号:14)の領域からのペプチドのワクチン組成物について、これらの少なくともHLA−A2個体に投与されるであろう。
ある場合において、本発明のペプチドのワクチンをHBV、とくにHBVエンベロープ抗原、例えば、組換えHBVenvエンコーデッド抗原に対する中性性抗体の応答を誘発するワクチンまたはHBV感染個体から得られた精製した血漿調製物から製造したワクチンと組み合わせることが望ましいことがある。種々のHBVワクチン調製物が記載され、そしてそれらはHBsAgおよびそのポリペプチド断片に主として基づく。本発明のペプチドを使用して配合することができるワクチンの例について、一般に参照、欧州特許(EP)第154,902号および欧州特許(EP)第291,586号、および米国特許第4,565,697号、米国特許第4,624,918号、米国特許第4,599,230号、米国特許第4,803,164号、米国特許第4,882,145号、米国特許第4,977,092号、米国特許第5,017,558号および米国特許第5,019,386号、各々をここに引用によって加える。ワクチンを組み合わせ、そして同時に、あるいは別々の調製物として投与することができる。
治療および免疫化の目的で、本発明のペプチドは、また、弱毒化ウイルス宿主、例えば、ワクシニアにより発現することができる。このアプローチは、本発明のHBVペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてワクシニアウイルスを使用することを包含する。急性的または慢性的にHBV感染した宿主の中に、あるいは非感染宿主の中に導入するとき、組換えワクシニアワクチンはHBVペプチドを発現し、これによりHBVに対する宿主の細胞障害性Tリンパ球の応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアのベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号(ここに引用によって加える)に記載されている。他のベクターはBCG(bacille Calmette Guerin)である。BCGベクターはStoverら(Nature 351:456−460(1991))(ここに引用によって加える)に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化のために有用である広範な種類の他のベクター、例えば、チフス菌Salmonella typhi)のベクターなどはここにおける記載から当業者にとって明らかであろう。
請求の範囲の発明の組成物および方法は半ビボ(ex vivo)治療のために使用することができる。半ビボ治療とは、治療および免疫原性の操作が体の外側で実施されることを意味する。例えば、リンパ球または他の標的細胞を患者から取り出し、そして高い投与量の主題のペプチドで処置し、患者により達成されるか、あるいは耐えられるレベルをかなり超える刺激濃度のペプチドを細胞の媒質の中に提供することができる。CTLを刺激する処置後、細胞を宿主に戻してHBV感染を処置する。また、宿主の細胞を、前述したように、ペプチドをエンコードする遺伝子を有するベクターに対して暴露することができる。ベクターでいったんトランスフェクションされると、細胞を生体外で増殖するか、あるいは患者に戻すことができる。生体外で増殖された細胞を、前以て決定した細胞密度に到達した後、患者に戻すことができる。
また、ペプチドは診断剤としての用途を見出すことができる。例えば、本発明のペプチドを使用してペプチドまたは関係するペプチドを使用して処置の養生法に対する特定の個体の感受性を決定することができ、こうして現存する処置のプロトコールを変更するか、あるいは影響を受けた個体について予後を決定するとき助けとなることができる。さらに、ペプチドは、また、どの個体が発生する慢性HBV感染について実質的に危険であるかを予測するために使用することができる。
実施例I
CTL特異的HBenvエピトープの同定
この実施例は、HBVエピトープ抗原に対して特異的なHLA制限CTL応答を誘発したHBenvペプチドの同定を記載する。
研究に含めたすべての患者はHLA−A2陽性であった。13人の患者(A−1〜A−13;表II)を急性肝炎のエピソードの間に研究し、6人(C−1〜C−6)はHBVにより慢性的に感染しており、そして6人は非感染の健康なボランティア(N−1〜N−6)は正常の対照として働いた。患者および患者のHLAハプロタイプを、HLA型別トレー(One Lambda、シノガパーク、カリフォルニア州)を使用する微小細胞障害性試験においてPBMCにより決定し、表IIに示す。
急性肝炎の診断は標準の診断基準に基づいた。診断のパラメーターは肝臓の損傷の臨床的(黄疸)および生化学的証拠(正常の上限より少なくとも20倍大きいALT活性)、ならびに肝炎デルタおよびC型肝炎のウイルスの感染の血清学的証拠の不存在(Abbott Laboratories、ノースシカゴ、イリノイ州)における急性HBV感染の血清学的証拠(HBV表面抗原(HBsAg)およびIgG抗HBc抗体の存在)を包含した。すべての患者は黄疸の発現後最初の4週の間に研究し、そのとき患者の血清はHBsAgについて陽性でありそしてそれらのALTレベルは顕著に異常であった。13人の患者のうちの11人は引き続いて疾患から回復し、血清トランスアミナーゼの正常化およびHBsAgのクリアランスは最初の診断の4月以内であった。1人の患者(A−11、表II)は慢性の活性肝炎を発生しそして最初の診断後13月にHBsAg陽性に止まった。1人の患者(A−10)は最初のクリニックの訪問後追跡を失った。慢性B型肝炎の患者は6カ月より長い間HBsAgに対して反復して血清学的に陽性であり、そして温和ないし中程度に増大した血清ALT活性を表示した。正常の対照はHBV感染の臨床的歴史をもたず、そしてHBVマーカーについて血清学的陰性であった。すべての患者および正常の対照はHIVに対する抗体について血清学的に陰性であった。
Figure 0003616390
患者および正常のドナーからのPBMCをフィコール−ハイパーク(Ficoll−Hypaque)密度勾配(Sigma、ミゾリー州セントルイス)で分離し、ハンクス(Hanks)平衡化塩溶液(HBSS)(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)中で3回洗浄し、L−グルタミン(2mM)、ゲンタマイシン(10μg/ml)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、およびHEPES(50mM)(10%の加熱不活性化ヒトAB血清を含有する)(完全培地)を補充したRPMI 1640培地(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)の中に再懸濁させ、そして24ウェルのプレート中で4×106細胞/ウェルでプレートした。特記しない限り、合成ペプチドを細胞培養物に10μg/mlの最終濃度で添加した。第3日に、rIL2(Hoffman−La Roche、ニューヨーク州ナトレイ)を10U/mlの最終濃度で補充した完全培地の1mlを各ウェルに添加した。第7日に、培養物をペプチド、rIL2および照射した(3000ラド)オートロガスまたはHLA−A2合致フィーダー細胞で再刺激し、そして培養したPBMCを第14日にCTL活性について試験した。ペプチド特異的細胞障害性活性表示した選択した培養物を1μg/mlのペプチド、20U/mlのIL2および1μg/mlのフィトヘムアグルチニン(PHA)(Sigma、ミゾリー州セントルイス)を含有する1mlの完全培地中で1×106の照射(6000ラド)同種異系のPBMCおよび1×105の照射(18000ラド)JY細胞(同種異系のEBV−B)形質転換細胞系、HLA−A2.1、B7、Cw7)(14)で毎週再刺激することによって拡張した。
細胞障害性アッセイのために、標的細胞はa)10μg/mlにおいて合成ペプチドと一夜インキュベーションした同種異系PHA刺激芽細胞または同種異系HLA合致または不一致EBV形質転換Bリンパ芽球細胞系(B−LCL);b)前述の安定なB−LCLトランスフェクション体;またはc)組換えワクシニアウイルスで感染したB−LCL(後述する)から成っていた。B−LCLはアメリカン・ソサイアティ・フォー・ヒストコンパティビリティ・アンド・イムノジェネティックス(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics)(マサチュセッツ州ボストン)から購入するか、あるいは同時継続米国出願第07/935,898号に記載するようにわれわれの自身の患者および正常のドナーのプールから確立した。細胞をL−グルタミン(2mM)、ゲンタマイシン(10μg/ml)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、HEPES(50mM)、および10%(v/v)の加熱不活性化FCS(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)を補充したRPMI 1640中で維持した。L−グルタミン(2mM)、ゲンタマイシン(10μg/ml)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、HEPES(50mM)、10%(v/v)の加熱不活性化FCS、および10U/mlのrIL2を補充したRPMI1640中で中で末梢血PBMCをPHAで1μg/mlにおいて刺激することによって、オートロガスPBMC芽細胞の短期間の系統を生産した。室温において揺動プレート上で50プラーク形成U/細胞において1×106細胞を感染させ、次いで1回洗浄し、そして37℃において一夜インキュベーションすることによって、ワクシニア感染標的を調製した。
標的細胞を100μCiの51Cr(Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ)で1時間標識化し、そしてHBSSで3回洗浄した。標準の4時間の51Cr解放アッセイにおいて5000標的細胞/ウェルを含有するU字形の底の96ウェルのプレートを使用して、細胞溶解活性を決定した。細胞障害性%を次の式から決定した:100×[(実験の解放−自発的解放)/(最大の解放−自発的解放)]。最大の解放は洗浄剤(1%のトリトンX−100、Sigma)で標的を溶解することによって決定した。自発的解放はすべてのアッセイにおいて最大の解放の25%より低かった。
急性肝炎の2人のHLA−A2陽性患者(A−1およびA−3)をHBsAg329−348(ASARFSWLSLLVPFVQWFVG(配列識別番号:22)に対するCTLの応答の分析のために最初に選択し、この配列は2つのオーバーラップするHLA−A2.1アレレ特異的結合モチーフを含有する(WSLLVPFおよびLVPFVQWF)。これらの患者の1人(A−3)は、また、HLA−A2.1アレレ特異的結合モチーフ(FPSDFFPS)を表す10残基のHBVヌクレオカプシドのエピトープ(HBsAg18−27)に対するHLA−A2制限CTL応答を表示することが前の実験から知られていた。この患者はHBsAg329−348におけるモチーフの一方または両方に対する潜在的レスポンダーと考えられた。他の患者(A−1)は、HBsAg18−27に対するレスポンダーでないことが知られており、比較のために研究した。
HBsAg329−348特異的CTL系統を、両方の患者のPBMCから前述したようにペプチドで刺激することによって発生させた。刺激の2〜3週後、両方の患者はHBsAg329−348ペプチドで前パルスしたホモ接合体HLA−A2.1陽性EBV細胞系(JY)に対して強い細胞障害性応答を表示した。患者A−1のHBsAg329−348特異的細胞系をクローニングのために選択した。
CTL系統を本来96ウェルのマイクロタイタープレート中で1、10、および100細胞/ウェルでクローニングし、次いで0.3または1細胞/ウェルでサブクローニングした。細胞をペプチド(1μg/ml)、PHA(1μg/ml)、rIL2(20U/ml)、照射(6000ラド)同種異系PBMC(105細胞/ウェル)、および照射(18000ラド)JY細胞(104細胞/ウェル)の存在下にプレートした。HBV特異的クローンを24ウェルのプレート中で前述したように再刺激したが、ただしペプチドを省略しそして、HBVの大きいエンベロープ抗原の安定な発現を付与するプラスミドでトランスフェクションした照射JY細胞(EBO−preS1、参照10)を105細胞/ウェルで添加した。
患者A−1のHBsAg329−348特異的細胞系を使用して、4クローンを1細胞/ウェル(クローンB13、B16、B17)または0.3細胞/ウェル(クローンB3)でプレートした細胞から誘導した。クローンB3をHLAC−1アレレのレベルにおいてエフェクターと部分的に合致する同種異系標的細胞のパネルに対して試験した。HLAC−1において患者A−1と部分的に合致する同種異系標的細胞を使用して、クローンB3の細胞溶解活性は、ペプチド中の2HLA−A2.1結合モチーフの存在のために、HLA−A2制限されることが発見された。患者A−3から誘導されたHBsAg329−348特異的ポリクローナルCTL系統は、また、同一のステアリン酸マグネシウムにおいてHLA−A2制限されると決定された。患者のHLA−A2サブタイプは決定されたなかったので、ペプチドに対するCTLの応答がHLA−A2アレレによってのみ制限されるかどうか、あるいはそれが他のHLA−A2サブタイプに同様によく拡張するかどうかは知られていない。
HBsAg329−348内の最小の、最適なHLA−A2制限CTLエピトープを決定するために、HBsAg329−348を補充したから誘導されたアミノ末端の切形およびオーバーラップする9マーおよび10マーのパネルを生成して、2つのオーバーラップする理想的なHLA−A2.1結合モチーフを含有する、この20残基のペプチドの中に存在する1または2以上のHLA−A2制限CTLエピトープをマッピングした。患者A−1からのHLA−A2制限CTLクローンB17、および患者A−3からのポリクローナルCTL系統1B9を、前述の最初の細胞系およびHBsAg329−348の反復刺激により誘導し、エフェクター細胞として使用して、HBsAg329−348に対するCTLの応答の微細な特異性を確立した。HLA−A2.1陽性B細胞系(JY)をもとの20マーと、あるいは切形ペプチドとインキュベーションすることによって、標的細胞を生産した。
第1図の結果が示すように、2つのHLA−A2.1結合モチーフの最初のもの(HBsAg335−343)のみがCTLにより認識される。さらに、データが証明するように、このペプチド(WLSLLVPFV)はHBsAg329−348刺激CTLにより認識される最小の、最適なHLA−A2制限エピトープである。なぜなら、HBsAg335−343からの極端のアミノ末端または極端のカルボキシ末端の残基はCTLによる認識を壊滅させるからである。
ペプチドを使用して患者A−1からのPBMCにおけるCTLの応答を刺激したとき、エフェクターレベルにおけるHBsAg335−343の優秀性は繰り返される。類別したHBsAg329−348サブユニットを表す合成ペプチドを10μMで使用して患者A−1のPBMCを刺激した。刺激の週後、これらの系統の細胞障害性を10μMの同一ペプチドで前パルスしたJY標的細胞および10μMのHBsAg335−343で前パルスしたJY標的細胞に対して60:1のE:Tで試験した。第2図に示す結果は、4時間の51Cr解放アッセイにおける溶解%を表す。第2図において見ることができるように、HBsAg335−343およびその拡張した変異型はCTLの応答を誘発できることを証明したが、極端のアミノ末端およびカルボキシ末端のアミノ酸を省略すると、CTLの応答を刺激するペプチドの能力は完全に壊滅し、これによりHBsAg335−343がHBsAgの329−348の間の最小の、最適なHLA−A2制限エピトープであるという結論を強化する。
実施例II
HBVenvにおける7つのHLA−A2.1結合モチーフに対するCTLの応答
第2位置にロイシンおよびカルボキシ末端としてバリンを含有する長さ9〜10残基のペプチドとして定義された、7つの理想的なHLA−A2.1アレレ特異的結合モチーフは、HBVエンベロープタンパク質のHBsAg領域に存在する(表III)。実施例Iにおいて得られた結果に基づいて、これらの7つのエンベロープタンパク質、+既知のHLA−A2制限HBVヌクレオカプシドエピトープ(HBsAg18−27)が、12人の急性B型肝炎のHLA−A2陽性患者においてCTLの応答を刺激する能力を検査した。比較のために、6人の慢性肝炎のHLA−A2陽性患者および6人の未感染の正常の対照をペプチドの同一パネルに対する応答性について試験した。
Figure 0003616390
急性患者(A−1〜A−12)、慢性患者(C−1〜C−6)、および正常の被検者(N−1〜N−6)からのPBMCを次の合成ペプチド:1=HBcAg18−27、2=HBsAg201−210、3=HBsAg251−259、4=HBsAg260−269、5=HBcAg335−343、6=HBsAg338−347、7=HBsAg348−357、8=HBsAg378−387、で実施例1に記載するように2週間刺激し、そして同一ペプチドで一夜前パルスしたJY標的細胞に対する4時間の51Cr解放アッセイにおいて試験した。ペプチドで前パルスしなかったJY標的細胞による51Cr解放をペプチドで前パルスしたJY標的細胞による51Cr解放から減ずることによって、ペプチド特異的細胞障害性を測定した。示す結果(第3図)は4時間の51Cr解放アッセイにおける特異的溶解%を表す。
第3図理解できるように、急性肝炎の12人のHLA−A2陽性患者のうちの9人はパネルの中のペプチドの少なくとも1つに対して応答した。対照的に、6人のHLA−A2陽性の未感染の正常の対照のいずれも同一の生体外の刺激後にペプチドのいずれに対しても応答せず、患者によるこれらのペプチドに対する応答性が対応するHBV誘導エピトープによる生体内の活性化を反映することを示唆する。
重要なことには、9人のレスポンダーのうちの8人はパネル内の多数のエピトープを認識し、急性肝炎の間のHBVに対するCTLの応答がポリクローナルおよび多重特異性の両方であることを示す。さらに、9人のレスポンダーの間で認識されたエピトープのスペクトルにおいて実質的な変動が存在し、ある種のエピトープは他よりもいっそう頻繁に認識された。例えば、HBsAg18−27およびHBsAg335−343は、それぞれ、9人のレスポンダーのうちの7人および8人により個々に認識され、そして組み合わせたとき、それらはレスポンダーのすべての9人により認識された。対照的に、HBsAg348−357、HBsAg251−259およびHBsAg260−269は、それらを試験したレスポンダーの3/9、2/5および3/6のみにより認識された。
急性的に感染した患者において循環するヴィリオンDNAのヌクレオチド配列の分析は、生体外のCTLの拡張を刺激するために使用したプロトタイプのHBsAg335−343ペプチドの中に存在する正確なアミノ酸配列を発現するウイルスにより、CTLの非レスポンダーを包含する、すべての患者は感染することを示した。残基335−343は、伝子バンク−72のデータベース、ならびにここにおける研究した10人の患者において発表されているように、すべての4つのサブタイプから誘導されたすべての発表されたHBV配列の中に保存されることが知られているので、HBsAg335−343はHBVグループ特異的CTLエピトープであると結論することができる。しかしながら、同一のことはHBsAg348−357について真実ではない。なぜなら、生体外の刺激のために使用したプロトタイプの配列(GLSPTVWLSV)をエンコードするウイルスにより、10人の患者のうちの7人のみが感染されることが発見されたからである。残りの3人の患者(A−9、A−10、A−13)は、カルボキシ末端のバリンが位置357においてアラニンにより置換された変異型の配列を表示した。プロトタイプのウイルスにより感染された患者の間で、ちょうどHBsAg335−343についてのように、CTLのレスポンダーおよびHBsAg348−357に対する非レスポンダーが観察された。他方において、変異型ウイルスにより感染した3人の患者のいずれもプロトタイプのペプチドに対するCTLの応答を表示しなかった。
すべての9人のレスポンダーは引き続いてHBsAg陰性となり、そしてレスポンダーの肝臓疾患は完全に消散したことは注目に値する。対照的に、ウイルスを除去することができなかった、慢性肝炎のすべての6人の患者は、また、これらのエピトープのいずれに対する末梢血CTLの応答を獲得することができなかった。急性的に感染した患者のうちの3人(A−10、A−11、A−12)は、また、これらのペプチドのいずれに対しても応答することができなかった。さらに、非レスポンダーの1人(A−11)は慢性の活性肝炎を発生し、そしてまだ彼の急性疾患後13カ月HBsAg陽性であった。これらの組み合わせたデータはCTLの応答およびウイルスのクリアランスの間の関係を強く示唆する。しかしながら、非レスポンダーの患者A−12は疾患の発現後1〜4月の間にHBsAgに陰性的に血清変換した。
表IIおよび第3図に示すように、9人のレスポンダーのうちの4人はこの研究において使用したJY標的細胞系(HLA−A2、B7、Cw7)とHLA A2アレレのみを共有し、ペプチドのすべてに対する応答がこれらの個体においてHLA−A2制限されることを証明した。残りのレスポンダーは、また、A2に加えてJY標的細胞の中に存在するHLA B7および/またはCw7アレレを共有するので、ありそうに思われないが、これらのアレレは、また、これらの患者におけるこれらのエピトープのための制限要素として働くことができる。
7つのHBVエピトープのペプチドの異なる免疫原性についての分子の基礎は、それらの配列の比較から直ちに明らかではなかった。ホモ接合体HLA−A2.1陽性B細胞系(JY)への無関係のHLA−A2制限ヌクレオカプシドのエピトープ(HBsAg18−27)の結合と競合する7つのエピトープのペプチドの能力を決定することによって、HLA−A2.1に対するペプチドの相対的結合活性における潜在的差を検査した。
競合的結合の阻害アッセイは、エフェクター細胞源として患者A−4からのHBsAg18−27特異的CTLクローンを使用した。ブロッキングペプチド(1、10、100μM)を51Cr標識化、HLA−A2.1陽性JY標的細胞とエフェクター細胞との混合物(E:T=40:1、3000標的細胞/ウェル)に添加し、次いで40分後に飽和より低い濃縮(0.03μM)の標的ペプチド、HBsAg18-27 を添加した。各ペプチドが4時間の51Cr解放アッセイにおいて標的細胞の溶解をブロックする程度を計算することによって、各ペプチドの結合能力を評価した。
第4図に示すように、すべての4つの免疫原性ペプチドおよび3つの非免疫原性ペプチドのうちの2つをHLA−A2.1分子に結合したが、広く(100倍より大きく)変動可能な効率はそれらの相対的免疫原性と相関関係をもたなかった。重要なことには、このアッセイにおいてHLA−A2.1に結合しなかった唯一のペプチド(HBsAg337−348)は非免疫原性であった。しかしながら、他の2つの免疫原性ペプチドについて、HLA−A2.1の結合アフィニティーは免疫原性ペプチドのいくつかと同程度に高いか、あるいはそれより高かった。こうして、このクラスIの分子に結合するペプチドの能力は免疫原性のために要求されるが、それはそれを保証しない。これが示唆するように、抗原のプロセシングのレベルにおける追加の因子およびT細胞のレパートリーは、ウイルスのタンパク質内のどのHLA−A2.1結合性ペプチドがCTLの応答を誘発できるかの決定においてある役割を演ずることができる。
実施例III
ペプチド特異的CTLを内因性HBenv抗原を認識する
HBVのaywまたはadwサブタイプのクローニングされたHBVゲノムから誘導された大きい、中程度および主要なエンベロープのポリペプチドをエンコードする組換えワクシニアウイルスの2つのグループで感染した標的細胞を溶解するそれらの能力について測定することによって、内因的に合成される抗原を認識するHBsAg335-343 およびHBsAg348-357 特異的CTLの能力を検査した。
HBVの大きい、中程度および主要なエンベロープのポリペプチド(adwサブタイプ)を発現する組換えワクシニアウイルスおよび対応する対照の野生型ワクシニアを得た(Smithら、Nature 302:490(1983);Chengら、J.Virol.60:337(1986);ChengおよびMoss、J.Virol.61:1286(1987)、それらの各々をここに引用によって加える)。HBVのaywサブタイプの同一の3つのHBVエンベロープのポリペプチドを発現し組換えワクシニアウイルスの独立の系列を、次のようにして誘導した。HBsAgの発現のために、HBV配列のヌクレオチド1409−2514を含有するXhoI/SphI制限断片を、7.5Kの初期/後期のプロモーターから下流のワクシニアウイルスの発現ベクターの中にクローニングした。ワクシニアウイルスを発現するpreS1について、ヌクレオチド937−2514を含有するBg1II/SphI断片を使用した。preS2コーディング配列をクローニングするために、まず、ヌクレオチド1267(例えば、preS2開始コドンから6塩基対上流)に開始しそして位置1280におけるEcoRI部位をスパンする、短いアダプターのオリゴヌクレオチドを合成した。ワクシニアウイルスの発現ベクターの中にこのオリゴヌクレオチドをクローニングした後、EcoRI/SphI HBV断片(ヌクレオチド1280−2514)を中間の構成体の中に再クローニングすることによって、コーディング配列を完成させた。組換えワクシニアウイルスの発生は、Smithら、前掲、に記載されているような標準の手順に従い実施した。Guilhotoら、J.Virol.66:2670(1992)(ここに引用によって加える)に記載されているように、対応するHBV(aywサブタイプ)コーディング領域を含有する、EBVに基づく発現ベクターのパネルでB−LCLをトランスフェクションすることによって、HBVエンベロープタンパク質を発現する安定なトランスフェクション体(aywサブタイプ)を生成した。
それぞれ、ペプチド配列WLSLLVPFVおよびGLSPTVWLSVで刺激することによって、HBsAg335-343 特異的CTL系統(患者A−1)およびHBsAg348-357 特異的CTL系統(患者A−4)を発生させた。培地と、誘発ペプチドと、あるいは(HBsAg348-357 の場合において)変異型ペプチド(GLSPTVWLSA)と前インキュベーションした、51Cr標識化JY標的細胞とCTLをインキュベーションした。aywおよびadwHBVゲノムから誘導されたHBV主要な(V−HBs)、中程度(V−preS2)、および大きい(V−preS1)エンベロープポリペプチドを発現する、6つの組換えワクシニアウイルスのパネルで感染した51Cr標識化JY標的細胞と、また、CTLをインキュベーションした。野生型ワクシニアウイルス(V−wt)を対照として使用した。HBsAg335-343 特異的CTL系統(右のパネル)をE:T=40:1において使用した。HBsAg348-357特異的CTL系統(左のパネル)をE:1において使用した。示す結果は4時間の51Cr解放アッセイにおける溶解%を表す。
患者A−1およびA−4からの両方のHBsAg335-343 およびHBsAg348-357 特異的CTLは、すべての3つのHBVエンベロープタンパク質を合成する、組換えワクシニアウイルス感染標的細胞を溶解することができた(第5図)。これが示すように、これらの合成ペプチドの両方は、感染した細胞内の大きい、中程度および主要なHBVエンベロープポリペプチドの内因性プロセシングにより発生するエピトープを表す。
重要なことには、HBsAg335-343 特異的CTLは両方の組の組換えワクシニアウイルスにより感染した標的を等しい効率で溶解することができ、HBsAg348-357 特異的CTLはayw感染標的細胞のパネルをadw標的よりも非常に効率よく溶解することができた。
上の実施例に記載する結果が例示するように、ヒトにおけるHBVに対するCTL応答は非常に多価であり、多分この重大なウイルスの感染に対していっそう効率よい保護を与えるように思われる。さらに、データが示すように、ここにおいて使用するペプチドの刺激法は、多形性HLAクラスI位置によりそのまま制限された、多価の応答の同定および分析のために、効率よくかつ有効である。追加のHLAアレル特異的結合モチーフは同定されるので、これらのモチーフを含有するHBV誘導ペプチドはCTL手順の生体外の刺激について使用することができる。
この明細書の中に述べたすべての刊行物、特許および特許出願をこの明細書の中に、各個々の刊行物、特許および特許出願が特定的にかつ個々にここに引用によって加えると示されているように、ここに引用によって加える。
以上から理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更を行うことができる。したがって、本発明は添付する請求の範囲による以外限定されない。
配列のリスト
(1)一般的情報:
(i)出願人:チサリ、フランシス V.
(ii)発明の名称:B型肝炎のウイルスに対する細胞障害性Tリンパ球の応答を誘 発するペプチド
(iii)配列の数:27
(iv)通信の住所:
(A)受信人:タウンセンドおよびタウンセンド
(B)街路:ワン・マーケット・プラザ、ステウアート・ストリート・タワー
(C)市:サンフランシスコ
(D)州:カリフォルニア州
(E)国:米国
(F)郵便番号:94105
(v)コンピューター読取り可能なフォーム:
(A)媒質の型:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PC コンパティブル
(C)操作システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテント・イン・リリース#1.0、バージョン#1.25
(vi)現在の出願データ:
(A)出願番号:
(B)提出日:
(C)分類:
(viii)代理人の情報:
(A)名前:パルメリー、ステブン W
(B)登録番号:31,990
(C)参照/処理番号:14740−4
(ix)電気通信の情報:
(A)TEL:206−467−9600
(B)FAX:415−543−5043
(2)配列識別番号:1についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:1
Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1 5
(2)配列識別番号:2についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:13アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:2
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu
1 5 10
(2)配列識別番号:3についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:3
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu
1 5 10
(2)配列識別番号:4についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:4
Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu
1 5
(2)配列識別番号:5についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:5
Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu
1 5 10
(2)配列識別番号:6についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:6
Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu
1 5
(2)配列識別番号:7についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:7
Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
1 5
(2)配列識別番号:8についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:8
Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu
1 5 10
(2)配列識別番号:9についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:9
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val
1 5 10
(2)配列識別番号:10についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:10
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1 5
(2)配列識別番号:11についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:11
Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro Val
1 5 10
(2)配列識別番号:12についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:12
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu
1 5
(2)配列識別番号:13についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:9アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:13
Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu
1 5
(2)配列識別番号:14についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:14
Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu
1 5 10
(2)配列識別番号:15についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:15
Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1 5 10
(2)配列識別番号:16についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:16
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln
1 5 10
(2)配列識別番号:17についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:20ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:17
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro
20
(2)配列識別番号:18についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:20ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:18
Pro His His Tyr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
1 5 10 15
Met Tyr Leu Ala
20
(2)配列識別番号:19についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:20ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:19
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
1 5 10 15
Ile Glu Tyr Leu
20
(2)配列識別番号:20についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:15ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:20
Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
1 5 10 15
(2)配列識別番号:21についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:20ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:21
Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Ala Pro Ile
20
(2)配列識別番号:22についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:20ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:22
Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln
1 5 10 15
Trp Phe Val Gly
20
(2)配列識別番号:23についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:23
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
(2)配列識別番号:24についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:24
Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val
1 5 10
(2)配列識別番号:25についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:25
Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val
1 5 10
(2)配列識別番号:26についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:26
Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val
1 5 10
(2)配列識別番号:27についての情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:10ミノ酸
(B)型:アミノ酸
(C)鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ii)分子の型:ペプチド
(xi)配列の記載:配列識別番号:27
Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
1 5 10
HBsAg335−343、WLSLLVPFVがCTL刺激HBsAg329−348により認識される最小最適CTLエピトープであることを示す。HBsAg329−348の刺激により発生した、患者A−1からのCTLクローンおよび患者A−3からのCTLクローンド系統を、切形(上のパネル)またはHBsAg329−348をカバーするオーバーラッピング9マーまたは10マー(下のパネル)で前パルスしたJY標的細胞に対して試験した。 生体外CTLを誘発するのためのHBsAg329−348内の最適エピトープがHBsAg335−343であることをさらに確証する。 急性B型肝炎の感染、慢性B型肝炎の感染の患者、および正常の被検者におけるHBV特異的CTLの応答を示す。急性の患者(A−1〜A−12)、慢性の患者(C−1〜C−6)、および正常の被検者(N−1〜N−6)からのPBMCは次の合成ペプチドを使用して刺激した:1−HBcAg18−27、2=HBsAg201−210、3=HBsAg251−259、4=HBsAg260−269、5−HBcAg335−343、6=HBsAg338−347、7=HBsAg348−357、8=HBsAg378−387。 HLA−A2.1競合結合阻害アッセイの結果を示し、4時間の51Cr解放アッセイにおけるHBcAg18−17特異的溶解の阻害%として表されている。 HBcAg335−343およびHBsAg348−357に対するCTL応答が、それぞれ、グループ特異的およびサブタイプ特異的であること、および合成ペプチドが、また、感染細胞内の大きい、中程度および主要なHBVエピトープのポリペプチドの内因性処理により発生するエピトープを含有することを図解する。

Claims (16)

  1. HBenvのポリペプチドの9〜11個のアミノ酸を含んでなるCTL誘発ポリペプチドであって、下記の配列
    HBenv335−343(配列識別番号:10)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;
    を含んで成るCTL誘発ポリペプチド
  2. HBenv335−343(配列識別番号:10)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;
    HBenv334−343(配列識別番号:15)
    Ser−Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;または
    HBenv335−344(配列識別番号:16)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val−Gln;
    である、請求項1記載のCTL誘発ポリペプチド。
  3. 免疫原性リポタンパク質キャリヤーに接合された、請求項1記載のポリペプチド。
  4. リポソームを含んでなる製剤学的に許容されうる担体の中に懸濁された、請求項3記載のポリペプチド。
  5. HLA−A2ハプロタイプを有する宿主のB型肝炎感染症の処置または予防のための医薬組成物であって、医薬的に有効量のCTL誘発ポリペプチドを含んで成り、ここで前記ポリペプチドはHBenvのポリペプチドの8〜13個のアミノ酸を含んでなるCTL誘発ポリペプチドであって、下記の配列
    HBenv335−343(配列識別番号:10)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;
    を含んで成る、医薬組成物。
  6. CTL誘発ポリペプチドが、
    HBenv335−343(配列識別番号:10)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;
    HBenv334−343(配列識別番号:15)
    Ser−Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;または
    HBenv335−344(配列識別番号:16)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val−Gln;
    である、請求項5記載の医薬組成物。
  7. 宿主が慢性B型肝炎の感染を有する、請求項5記載の医薬組成物。
  8. CTL誘発ポリペプチドを予防的に投与する、請求項5記載の医薬組成物。
  9. CTL誘発ポリペプチドをHBVに対するTヘルパーの応答を誘発する第2ペプチドとともに宿主に投与する、請求項5記載の医薬組成物。
  10. CTL誘発ポリペプチドおよびTヘルパー誘発ペプチドが連鎖されている、請求項9記載の医薬組成物。
  11. HLA−A2ハプロタイプを有する宿主のB型肝炎感染症の処置または予防のための医薬組成物を製造する方法であって、医薬的に有効量のCTL誘発ポリペプチドを使用し、ここで前記ポリペプチドはHBenvのポリペプチドの8〜13個のアミノ酸を含んでなるCTL誘発ポリペプチドであって、下記の配列
    HBenv335−343(配列識別番号:10)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;
    を含んで成る、方法。
  12. CTL誘発ポリペプチドが、
    HBenv335−343(配列識別番号:10)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;
    HBenv334−343(配列識別番号:15)
    Ser−Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val;または
    HBenv335−344(配列識別番号:16)
    Trp−Leu−Ser−Leu−Leu−Val−Pro−Phe−Val−Gln;
    である、請求項11記載の方法。
  13. 宿主が急性B型肝炎の感染を有する、請求項11記載の方法。
  14. CTL誘発ポリペプチドを予防的に投与する、請求項11記載の方法。
  15. CTL誘発ポリペプチドをHBVに対するTヘルパーの応答を誘発する第2ペプチドとともに宿主に投与する、請求項11記載の方法。
  16. CTLポリ誘発ペプチドおよびTヘルパー誘発ペプチドが連鎖されている、請求項15記載の方法。
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6607727B1 (en) * 1991-08-26 2003-08-19 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus
US7611713B2 (en) * 1993-03-05 2009-11-03 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide compositions
US20110097352A9 (en) * 1992-01-29 2011-04-28 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US6689363B1 (en) 1992-01-29 2004-02-10 Epimmune Inc. Inducing cellular immune responses to hepatitis B virus using peptide and nucleic acid compositions
US6235288B1 (en) * 1992-08-26 2001-05-22 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus
DE69820486D1 (de) * 1998-01-19 2004-01-22 Mogam Biotechnology Res Inst Y Liposomen, enthaltend peptidantigene, welche vom x-protein aus hepatitis b virus abstammen
CA2685270C (en) * 1998-05-13 2014-07-29 Pharmexa Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20070020327A1 (en) * 1998-11-10 2007-01-25 John Fikes Inducing cellular immune responses to prostate cancer antigens using peptide and nucleic acid compositions
EP1244465A4 (en) * 1999-12-21 2005-01-12 Epimmune Inc INDUCTION OF CELLULAR IMMUNE RESPONSE TO PROSTATE CANCER BY MEANS OF PEPTIDE AND NUCLEIC ACID COMPOUNDS
KR100455902B1 (ko) * 2001-07-18 2004-11-12 주식회사 펩트론 B형 간염 바이러스 표면단백질 프리에스-1 유래의 펩타이드
CN1305527C (zh) * 2003-11-21 2007-03-21 薛平 乙型肝炎治疗疫苗及其制备方法
JP2008533114A (ja) * 2005-03-18 2008-08-21 ユーシーエル ビジネス パブリック リミテッド カンパニー メカノ成長因子ペプチドおよびその使用
US20090023895A1 (en) 2006-02-07 2009-01-22 Nec Corporation Hla-binding peptide, precursor thereof, and dna fragment and recombinant vector coding for said hla-binding peptide
EP2434014B1 (en) 2006-10-12 2014-12-10 Nec Corporation HLA-binding peptide, precursor thereof, DNA fragment and recombinant vector encoding the same
WO2009056535A2 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Genimmune N.V. Methods and kits for inducing a ctl response using a prime boost regimen
EP2391635B1 (en) 2009-01-28 2017-04-26 Epimmune Inc. Pan-dr binding polypeptides and uses thereof
NZ598000A (en) 2009-08-07 2013-10-25 Transgene Sa Composition for treating hbv infection
US10076570B2 (en) 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Hbv聚合酶突變體
WO2018069316A2 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816564A (en) * 1986-01-31 1989-03-28 Merck & Co., Inc. Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast
AU1668788A (en) * 1987-05-26 1988-12-01 Wistar Institute, The Method of vaccination for hepatitis b virus
EP0326111A3 (en) * 1988-01-29 1989-12-27 New York Blood Center, Inc. Peptide derivatives rendered immunogenic when administered with alum as an adjuvant
NZ263050A (en) * 1993-03-05 1997-11-24 Cytel Corp Compositions of immunogenic peptides with hla-a2.1 binding motifs
EP0708656B1 (en) * 1993-04-27 2002-07-31 United Biomedical, Inc. Immunogenic lhrh peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
AU7478394A (en) * 1993-08-06 1995-02-28 Cytel Corporation Methods for (ex vivo) therapy using peptide-loaded antigen presenting cells for the activation of ctl

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