CN1118573A - 诱导细胞毒t淋巴细胞应答乙型肝炎病毒的肽类 - Google Patents

Abstract

肽类被用来限定刺激抗乙型肝炎病毒的HLA限制性细胞毒T淋巴细胞的抗原决定簇。所述肽由HBV外壳区衍生出，且特别用于治疗或防治HBV感染，包括刺激应答于HBV抗源的慢性感染个体的免疫应答的方法。

Description

诱导细胞毒T淋巴细胞应答 乙型肝炎病毒的肽类

根据国家卫生学会的授意，美国政府享有本发明的某些权利。

细胞毒T淋巴细胞(CTLs)在对抗被病毒、细胞内的细菌和寄生虫感染的细胞以及肿瘤细胞时起到重要作用。它们能这样做是通过直接的细胞毒性以及通过给其它免疫细胞如巨噬细胞、B细胞和其它T细胞提供特异性和非特异性的帮助。经感染的细胞或肿瘤细胞通过包括蛋白酶的细胞内物质来加工抗原，经加工的抗原以与CTLsT细胞受体的人类白细胞抗原(HLA)I类分子结合的肽的形式呈现于细胞表面。MHCI类分子也可不经细胞内加工而与外源肽结合并将它们提供给CTLs。

目前难以精确预测从抗原蛋白质和序列中如何加工蛋白质，以及肽的哪一部分会与HLAI类分子结合并呈现于CTLs。根据洗脱自这些分子的肽序列分析已预测出一些HLAI类分子的结合动机(Falk等人，Nature351：290(1991))。然而仍不能预测那些经加工，并与HLAI类结合，含有可识别CTL抗原决定簇的肽类。

乙型肝炎病毒(“HBV”)是非裂解病毒，目前在世界上已感染了大约二亿五千万人。成人的HBV感染通常在大多数场合下导致急性病，对少数病人会导致慢情病状态。当此感染在接近出生期时发生，急性对慢性的比例则颠倒过来。在慢性HBV感染中，肝细胞癌的发病率上升。在成年期经HBV感染的低百分比的个体会出现与强烈免疫应答相关的高致死性的突发性肝炎。

近年来当对HBV感染时没有有效的疗法，已开发出疫苗以防治HBV感染。疫苗或者使用纯化自慢性HBV携带者血浆中的HBV表面抗原(HBsAg)，或者使用通过重组DNA技术产生的HBsAg。已建议合成基于肽的HBsAg疫苗。其例见美国专利Nos.4,599,230和4,599,231。然而抗—HBsAg疫苗仅对约90％经免疫的个体提供保护。那些未经免疫、或经免疫但未被保护的个体则提供了有意义的潜在感染的贮主。

难以估计CTLs对HBV抗原免疫的贡献。Chisari等人(Microbial Pathogen.6：31(1989))认为肝细胞损伤是由HLAI类限制的、应答HBV编码抗原的CD8⁺细胞毒T细胞介导的。对于不同种其它病毒，如流感病毒，已鉴定出I类主要的组织相容性(MHC)限制性的细胞毒T淋巴细胞应答。例如，Tounsend等人在Cell44：959(1986)中报道了经细胞毒T淋巴细胞识别的流感病毒核蛋白质的抗原决定簇可通过合成的肽类来详细说明。在尝试详细说明HBV的细胞毒T淋巴细胞应答时，带有急性和慢性HBHV的病人外周血淋巴细胞显示出可在体外杀死自身肝细胞，但还不能确定细胞裂解活性的特异性、其HLA限制性因素以及细胞的表型。Mondelli等人，J.Immunol129：2773(1982)和Mon—delli等人，Clin.Exp.Immunol.6：311(1987)，Moriyama等人，Science248：361—364(1990)报道了HBV主要的外壳抗原能以可被外壳特异性的抗体和MHC I类限制的CD8⁺细胞毒T淋巴细胞识别的方式在肝细胞表面表达。

由于有大量经HBV慢性感染的个体贮主，故有必要刺激这些个体的免疫应答以应答适当的HBV抗原，从而排除它们的感染。也有必要防止遭受急性期感染的个体发展成为慢性HBV感染。而且由于现行的经许可HBV疫苗在约10％的经免疫个体中不能产生保护性免疫，故有必要产生更加有效的免疫，例如通过增加或改变疫苗的致免疫性。十分出人意料地，本发明完成了这些以及其它相关的需要。

本发明提供了肽类，它可诱导抗HBV抗原的MHCI类限制性的细胞毒T淋巴细胞应答。所感兴趣的肽类衍生于HBV外壳。在某些实施方案中CTL诱导肽可具有序列HBenv183—191Phe—Leu—Leu—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile(Seq.ID No.1)；HBenv248—257Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu(Seq.ID No.3)；HBenv249—257Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu(Seq.ID No.4)；HBenv249—258Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu(Seq.ID No.5)；HBenv250—258Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu(Seq.ID No.6)；HBenv251—259Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val(Seq.ID No.7)，HBenv251— 260Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu(Seq.ID No.8)，HBenv260—269Leu—Leu—Asp—Tyr—Gln—Gly—Met—Leu—Pro—Val(Seq.ID No.9)，HBenv335—343Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val(Seq.ID No.10)，HBenv152—161Ser—Ile—Leu—Ser—Lys—Thr—Gky—Asp—Pro—Val(Seq.ID No.11)，；

  HBenv177—185Val—Leu—Gln—Ala—Gly—Phe—Phe—Leu—Leu(Seq.ID No.12)；HBenv204—212Phe—Leu—Gly—Gly—Thr—Pro—Val—Cys—Leu(Seq.ID No.13)，或HBenv370—379Ser—Ile—Val—Ser—Pro—Phe—Ile—Pro—Leu—Leu(Seq.ID No.14)；或者具有与上述序列中的一个大致同源性的序列。按照需要，此肽可任选在N—和C—末端的一端或两端侧面连接和/或被修饰。在经选择的肽中的非关键性残基位置处可进行保守的替换，缺失和添加对它的生物活性不会有实质性的不利影响。

应理解在不同肽的实施方案中，肽类可以聚合物化，互相之间聚合形成较大的同聚物，或与不不的肽类聚合形成杂聚物。在一些情况下肽类在组合物中结合成混合物而并不相连接。所述肽也可与能加强T淋巴细胞应答的含脂分子结合，或与能诱导T—辅助细胞应答的不同肽结合。

所提供的组合物含有本发明的肽，与之一起配制的还有另外的肽，脂质体、佐剂和/或药物可接受的载体。因此此药物组合物可用于治疗急性HBV感染的方法，尤其是可致力于防治此感染发展成慢性或携带者的状态。同时还提供了治疗慢性HBV感染和HBV携带者状态的方法，其时应给感染个体施用足够剂量的药用组合物以致免疫地刺激抗HBc抗原决定簇的有效细胞毒T细胞应答。为了治疗这些感染，尤其需要将可诱导抗HBV抗原的MHCI类限制性细胞毒T淋巴细胞应答的肽类与可诱导抗其它HBV抗原，如HBV核心免疫应答的其它肽类或蛋白质相结合。为治疗慢性或携带者状态感染下的个体，必需将组合物在延长的时间期限内以重复的剂量施用以消除或根本上缓和感染和/或病毒的排出。

同时还提供了防治HBV感染、尤其是慢性HBV感染的疫苗组合物。此疫苗组合物含有上述可诱导MHC I类限制性细胞毒T淋巴细胞应答的致免疫有效量的HBV外壳肽，例如HLA—A2，典型地进一步含有辅剂，例如不完全的弗氏辅剂或氢氧化铝。为了达到抗HBV的加强保护，此疫苗可进一步含有可产生保护抗体以应答HBV外壳抗原的成分。

本发明的另一个实施方案涉及到疹断方法，其中本发明的肽类被用来鉴定能对HBV外壳抗原产生细胞毒T细胞应答的个体中淋巴细胞的存在。缺失这类细胞即可确定是否所感兴趣的个体对发展成慢性HBV感染是敏感的。典型地，淋巴细胞是外周血淋巴细胞，所感兴越的个体患了急性HBV感染。

图1表明HBsAg335—343，WLSLLVPFV，是可被经HBsAg3329—348刺激的CTL识别的最低限度最适CTL抗原决定簇。经用HBsAg329—348刺激产生的来自病人A—1的CTL克隆与来自病人A—3的CTL克隆系对JY靶细胞进行试验，靶细胞或通过截断(上片)或通过重叠的包被HBsAg329—348的9—mers或10—mers进行预脉冲(下片)。

图2进一步确证了在HBsAg329—348中体外引入CTL的最适抗原决定基是HBsAg335—343。

图3表明经急性乙型肝炎病毒感染、慢性乙型肝炎病毒感染的病人中，以及正常的个体中HBV特异性的CTL应答。来自急性病人(A—1至A—12)、慢性病人(C—l至C—6)、以及正常个体的PBMC经用下列合成肽刺激：1＝HBcAg18—27，2＝HBsAg201—210，3＝HBsAg251—259，4＝HBsAg260—269，5＝HBcAg335—343，6＝HBsAg338—347，7＝HBsAg348—357，8＝HBsAg378—387.

图4所示为HLA—A2.1竞争性结合抑制测定的结果，表示为4小时⁵⁰Cr释放测定中HBsAg18—27特异性裂解的抑制百分数。

图5表明对HBsAg335—343和HBsAg348—357的CTL应答分别是簇特异性的和亚型特民间性的，合成肽类所含的抗原决定簇也是通过在感染细胞中内源加工大的、中等大小的和较大的HBV外壳多肽而产生的。

本发明提供了衍生于HBV外壳蛋白质的肽类，可用于组合物以及治疗、防止和诊断HBV感染的方法。此肽类可刺激抗HBV感染细胞的MHC HLAI类限制性细胞毒T淋巴细胞应答。经刺激的细胞毒T淋巴细胞可杀死感染细胞或抑制病毒的复制。因此可阻断或实际上可防治感染，包括慢性HBV感染。可有效产生细胞毒T细胞应答的肽也可与能产生T—辅助应答的免疫原结合。

本发明所使用的肽衍生于HBenv183—191(Seq.IDNo.1)，HBenv248—260(Seq.ID No.2)，HBenv260—269(Seq.ID No.9)，HBenv335—343(Seq.ID No.10)，HBenv152—161(Seq.ID No.11)，HBenv177—185(Seq.ID No.12)，HBenv204—212(Seq.ID No.13)，以及HBenv370—379(Seq.ID No.14)的区域，其中的编号是参照Galibert等人，文献同上。

本发明的HBV细胞毒T淋巴细胞诱导“肽”或“寡肽”的意思是从HBc序列中衍生出至少为4个HBV氨基酸序列残基的链，优选至少6个，更优选8或9个，有时为10至12个残基，通常少于约50个残基，更经常地少于约35个残基，而优选少于25个，例如8至17个氨基酸残基。有必要使本发明肽类最优化至8至12个氨基酸残基长等，大小与结合于细胞表面的MHCI类分子上的内源加工的病毒肽类相同。一般可见Schumacher等人，Nature350：703—706(1991)；Van Bleek等人，Nature348：213—216(1990)；Rotzschke等人，Nature348：252—254(1990)；以及Falk等人，Nature351：290—296(1991)，它们已在此作为参考文献。以下更详细公开的是：通常肽类至少应含有大多数氨基酸与这里所鉴定的、含有可诱导CTL的抗原决定基的HBV序列邻近残基的相应部分同源。

肽类可如下文所述“合成”制备，或通过重组DNA技术制备。尽管此肽优选为实际上已摆脱其它自然生成的HBV蛋白质及其片段，但在一些实施方案中，肽类可被合成地与自然片段或颗粒结合。在本说明书中肽这一词与多肽可替换使用，一系列氨基酸通过相邻氨基酸的α—氨基和α—羧基之间的键互相连接即可称作多肽。多肽或肽类的长度不同，不论是以它们的中性(不带电的)形式或以盐的形式，不论是没有如糖基化、侧链氧化或磷酸化的修饰或含有这些修饰，所遇到的情况是修饰不会破坏此处所描述的多肽的生物活性。

有必要使肽尽可能地小而同时仍能保持大肽实质上所有的生物活性。生物活性是指与适当MHC分子结合并诱导抗HBV抗原或抗原类似物的细胞毒T淋巴细胞应答的能力。细胞毒T淋巴细胞应答是对所感兴趣的HBV抗原特异性的CD8⁺T淋巴细胞应答，其中CD8⁺，MHCI类限制的T淋巴细胞被激活，被激活的T淋巴细胞分泌淋巴因子(例如Y—干扰素)释放产物(例如丝氨酸酯酶)，它可抑制经感染的自身细胞或经转染细胞中病毒的复制，带有或不带有细胞杀伤。

“同源的”，“实质上同源的”，以及“实质上同源性”这类词用在这里是指氨基酸序列至少有50％相同，其中将一个序列与氨基酸的对照序列相比较。序列相同的百分比或同源性可通过当相应于对照序列的部分排列成线时互相比较来计算。

来自核壳体区域的本发明的可诱导CTL的HBV肽实例包含6至35个氨基酸并含有至少一个来自HBenv183—191(Seq.LD No.1)肽区域的HLA限制的CTL抗原决定簇的位点。此肽的大多数氨基酸与自然生成的HBenv183—191区域的相应部分的氨基酸相同或实质上同源，HBen-v183—191具有以下序列：

HBenv183—191(Seq.ID No.1)

Phe—Leu—Len—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile

此HBenv183—191区域的肽实例可按需要被包括HBc的HBV序列的氨基酸任选地在N—和C—末端的一端或两端侧面连接和/或修饰，并连接到载体上等等，氨基酸的加入有利于连接及其他的N—和C—末端修饰，以下将进一步描述。肽HBenv183—191可诱导至少由MHCI类分子HLA—A₂介导的细胞毒T淋巴细胞应答。

本发明其他HBenv肽的实例是从HBenv248—260区域中制备的，衍生于此区域的肽类至少含有一个可诱导CTL的HLAI类限制的抗原决定簇位点，典型的为至少7个氨基酸，更常见为9个、10个或11个氨基酸或更多。此肽的大部分氨基酸与自然生成的HBenv248—260序列的相应部分的氨基酸相同或基本上同源，HBenv248—260具有序列(HBV亚型ayw)：

HBenv248—260(Seq.ID No.2)

phe—Ile—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu

如本文所述HBenv248—260区域的肽可在一端或两端侧面连接和/或修饰。

典型的制备于HBenv248—260区域的可诱导CTL的肽类包括下面的9—和10—mer肽类：

            HBenv248—257(Seq.ID No.3)

 Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；

            HBenv249—257(Seq.ID No.4)

 Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；

            HBenv249—258(Seq.ID No.5)

  Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；

            HBenv250—258 (Seq.ID No.6)

  Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；

            HBenv251—259(Seq.ID No.7)

  Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val；

            HBenv251—260(Seq.ID No.8)

  Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu；

上述肽类含有HLA限制的可诱导CTL的抗原决定簇，典型地至少为HLA—A2限制性的，如上述肽I所提到，可在一个或两个末端侧面连接和/或修饰。

在进一步的实施方案中，本发明的肽含有10—mer肽HBenv260—269，此肽类衍生于HBenv260—269，后者含有至少为7个相邻氨基酸的可诱导CTL的HLAI类限制抗原决定簇位点。此肽的大部分氨基酸与自然生成的HBen—v260—269序列的相应部分的氨基酸相同或基本上同源，HBenv260—269具有序列：

      HBenv260—269(Seg.ID No.9)Leu—Leu—Asp—Tyr—Gln—Gly—Met—Leu—Pro—Val.

如本文所述制备于此区域的肽可在一端或两端侧面连接和/或修饰。肽HBenv260—269(Seg.ID No.4)可诱导至少由MHCI类HLA—A2分子介导的细胞毒T淋巴细胞应答。

本发明其他可诱导CTL的肽类衍生于HBenv335—343区域(Seg.ID No.10)，经包括衍生于HBenv335—343(Seg.ID No.10)的肽类，此HBenv335—343含有一个或多个至少为7个相邻氨基酸的可诱导CTL的HLAI类限制性抗原决定簇位点。此肽的大部分氨基酸与自然生成的HBen—v335—343序列的相应部分的氨基酸相同或实质上同源，HBenv335—343具有序列：

          HBenv335—343(Seg.ID No.10)

Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val.

如本文所述，其中经选择的肽可在一端或两端侧面连接和/或修饰。

本发明其他可诱导CTL的肽类衍生于HBenv152—161区域(Seg.ID No.11)，它包括衍生于HBenv152—161(Seg.ID No.11)的肽类，此HBenv152—161含有一个或多个至少为7个相邻氨基酸的可诱导CTL的HLAI类限制性抗原决定簇位点。此肽的大部分氨基酸与自然生成的HBenv152—161序列的相应部分的氨基酸相同或实质上同源，HBenv152—161具有序列(adw亚型)：

      HBenv152—161(Seg.ID No.11)Ser—Ile—Leu—Ser—Lys—Thr—Gly—Asp—Pro—Val，

如本文所述，其中经选择的肽可在一端或两端侧面连接和/或修饰。

本发明的其他可诱导CTL的肽类衍生于HBenv177—185区域的肽类(Seq.ID No.12)，它包括衍生于HBenv177—185区域(Seq.ID No.12)，HBenv177—185含有一个或多个至少为7个相邻氨基酸的可诱导CTL的HLAI类限制性抗原决定簇位点。此肽的大部分氨基酸与自然生成的HBenv177—185序列的相应部分的氨基酸相同或实质上同源，HBenv177—185具有序列(adw亚型)：

          HBenv177—185(Seq.ID No.12)

Val—Leu—Gln—Ala—Gly—Phe—Phe—Leu—Leu，

如本文所述，其中经选择的肽可在一端或两端侧面连接和/或修饰。

本发明另外的可诱导CTL的肽类衍生于HBenv204—212(Seq.ID No.13)区域，它包括衍生于HBenv204—212(Seq.ID No.13)的肽类，此HBenv204—212含有一个或多个至少为7个相邻氨基酸的可诱导CTL的HLA I类限制性抗原决定簇位点。此肽的大部分氨基酸与自然生成的HBenv204—212序列相应部分的氨基酸相同或实质上同源，HBenv204—212具有序列(adw亚型)：

    HBenv204—212(Seq.ID No.13)Phe—Leu—Gly—Gly—Thr—Pro—Val—Cys—Leu，

如本文所述，其中经选择的肽可在一端或两端侧面连接和/或修饰。

本发明另外的可诱导CTL的肽类衍生于HBenv370—379区域(Seq.ID No.14)，它包括衍生于HBenv370—379区域(Seq.ID No.14)的肽类，HBenv370—379含有一个或多个至少为7个相邻氨基酸的可诱导CTL的HLAI类限制性抗原决定簇位点。此肽的大部分氨基酸与自然生长的HBenv370—379序列的相应部分的氨基酸相同或实质上同源，HBenv370—379具有序列(adw亚型)：

        HBenv370—379(Seq.ID No.14)

Ser—Ile—Val—Ser—Pro—Phe—Ile—Pro—Leu—Leu，

如本文所述，其中所选择的肽可在一端或两端侧面连接和/或修饰。

如上所述，鉴于本文所讨论的理由，附加氨基酸可加在寡肽或末端以给肽类互相之间的连接，其与载体，支持物或较大肽的连接提供方便，或可修饰肽或寡肽的物理或化学性质等等。如酪氨酸，半胱氨酸，赖氨酸，谷氨酸或天冬氨酸等等的氨基酸可被引入肽或寡肽的C—或N—末端。另外肽或寡肽的序列经末端—NHz酰化作用的修饰而与自然序列区分开来，例如乙酰化作用、或疏基乙酰胺化作用、末端—羧基酰胺化作用，如氨、甲胺等。某些情况下这些修饰可提供与支持物或其他分子连接的位点。

应理解具有细胞毒T淋巴细胞剌激活性的本发明的HBV肽类或其类似物可按需要修饰以提供某种其他所需的属性，例如改进的药物特性，而同时可提高或至少实质上维持未经修饰的肽的生物活性。例如，在肽序列中可通过氨基酸的延长、减少或替换来修饰肽类，例如可通过在衍生于本文公开序列的肽类的氨基端或羧基端或两端加入或减少氨基酸来修饰。此肽类可被修饰至实质上可加强诱导CTL的活性以致经修饰的肽类似物所具有的CTL活性比野生型序列肽要高。例如有必要加强肽N—末端的疏水性，尤其是N—末端的第二个残基为疏水性的地方，这同与HLA限制性分子的结合有关连。通过在N—末端增强疏水性，T细胞所显现的效力也有所增加。从其他与抗原相关的疾病中制备的肽类，尤其是那些含有可诱导CTL的抗原决定基而宿主对此没有显著的CTL活性的肽类，可通过在第二个残基为正常疏水性的肽的N—末端替换疏水性残基来使之成为可诱导CTL的肽类。

在本目的发明中使用的肽类无需与下列肽类相同：

HBenv183—191(Seq.ID No.1)，

HBenv248—257(Seq.ID No.3)，

HBenv249—257(Seq.ID No.4)，

HBenv249—258(Seq.ID No.5)，

HBenv250—258(Seq.ID No.6)，

HBenv251—259(Seq.ID No.7)，

HBenv251—260(Seq.ID No.8)，

HBenv260—269(Seq.ID No.9)，

HBenv335—343(Seq.ID No.10)，

HBenv152—161(Seq.ID No.11)，

HBenv177—185(Seq.ID No.12)，

HBenv204—212(Seq.ID No.13)，

或HBenv370—379(Seq.ID No.14)，只要目的化合物可提供至少抗HBV四种主要亚型中的一种的细胞毒T淋巴细胞活性。尽管存在HBV的不同株，它们每个都享有至少一个共同外壳决定簇，被称为“a”每个病毒株也有另外两个外壳决定簇，其中一个是“d”或“y”，而另一个是“W”或“r”。因此有四种可能的病毒亚型：adw，ayw，adr和ayr。在GB 2034323，EP13828，U.S.4,935,235中描述了HBV的克隆，测序和表达，Galibert等人在Nature281：646(1979)中也描述了HBV外壳区域的完整序列，上述每一种在本文中被列入参考文献。在GenBank—72数据库中描述了20种不同HBV株的氨基酸序列，包括7株adw亚型，5株ayw亚型，7株adr亚型和1株ayr亚型，Gen-Bank序列在本文中也被列入参考文献。

因此，此肽类可经受不同的变化，或为保守的或为非保守的，例如插入，缺失和替换，这种变化对于它们的使用提供了某种优点。保守的替换指的是用另一个生物和/或化学上相似的氨基酸残基替代这个氨基酸残基，例如一个疏水性残基换成另一个，或一个极性残基换成另一个。替换包括组合诸如Gly，Ale；Val，Ile，Leu；Asp.Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Cys，Arg；以及Phe，Tyr。通常，趋于实质上模仿HBV细胞毒T淋巴细胞剌激性的抗原决定簇的序列部分与否少一种HBV亚型的序列的不同不超过的20％，除了在任一末端加入附加的氨基酸以修饰此肽的物理或化学特性，例如简化连接或结合等等。已发现在HBV亚型中肽序列的区域是多型的，故有必要改变一或多个特殊的氨基酸以更有效地模仿不同HBV株或亚型的不同的细胞毒—淋巴细胞抗原决定簇。

在包括有上述代表肽的由本发明鉴定的肽序列中，有残基(或那些实质功能等同物)可使肽维持它们的生物活性，例如刺激I类限制性细胞毒T淋巴细胞应答HBV感染细胞或表达HBV抗原的细胞的能力。这些残基可通过单个氨基酸替换，缺失或插入来鉴定。另外通过特异氨基酸的(如，Ala)系统扫描可观察到侧残基的贡献。经多种替换的肽类通常将这种替换结合成小的，相对中性的分子，例如Ala，Gly，Pro或类似残基。可被替换、增加或减少的残基的数目和类型要依据必需抗原决定簇点与所寻找的某种结构和功能属性(如疏水性对亲水性)之间必要的分隔，如有必要，通过这种变化也可使得肽类似物与其MHC分子结合亲和力增加以供给细胞毒T淋巴细胞。通常在抗原决定簇和/或结构重要的残基之间间隔序列的替换，增加或缺失所选择使用的氨基酸或成分应能避免可能会阻断结合的空间结构和电荷的影响。

经多种取代而保留生物活性的肽可合成含肽的D—氨基酸。这样的肽可合成为“倒位”或“反倒位”形式，即，通过替换带有D—氨基酸序列的L—氨基酸或通过颠倒氨基酸序列并取代带有D—氨基酸的L—氨基酸。因为D—肽类实际上更能抵制肽酶，因此和L—肽类比较在血清和组织中更稳定。在生理条件下D—肽类的稳定性和对应的L—肽类比较更能弥补亲和力的差异。进一步，带或不带取代基含肽类的L—氨基酸可被D—氨基酸包裹，以抑制外肽酶抗原性肽的破坏。

除了此处所述说的例子肽外，本发明提供了识别与所述肽区域相关的其它抗原决定簇区的方法。所说肽区能诱导MHC—抑制性细胞毒淋巴细胞对抗HBV的反应。方法包括从感染或非感染个体获取外周血淋巴细胞及用源于肽区

 HBenv183—191(Seq.ID No.1)，HBenv248—260(Seq.ID No.2)，

 HBenv260—269(Seq.ID No.9)，HBenv335—343(Seq.ID No.10)，

 HBenv152—161(Seq.ID No.11)，HBenv177—185(Seq.ID No.12)，

HBenv204—212(Seq.ID No.13)，或HBenv370—379(Seq.ID No.14)，

的多肽片段暴露(刺激)带合成肽的细胞。

交叉的合成肽库，典型地每个肽约8—20个残基长度，优选的9—12个残基，可用于剌激细胞。活性肽可从诱导细胞毒T淋巴细胞活性的库中筛选。肽类诱导特异性细胞毒性的能力通过培养剌激过的有自体标记(如¹⁵Cr)的靶细胞(如HLA匹配巨噬细胞、T细胞、纤维母细胞或B淋巴纤维母细胞)决定。这些细胞用HBV亚基因组片段感染或转染，结果目的抗原由细胞内源性合成(或用有意义肽脉冲细胞)，并测定特异性标记的释放。

一且识别了含刺激细胞毒T淋巴细胞反应的抗原决定簇区的多肽，就能确定反应的MHC抑制因子。这包括培养刺激过的PBL或短期细胞系，后者为一群已知HLA型(标记)靶细胞，它们用有意义肽或合适对照脉冲过。被CTL溶解的群体中HLA等位基因细胞被比作未溶解细胞，识别了对有意义抗原产生细胞毒T淋巴细胞反应的HLA抑制因子。

Carbone等人(J.Exp.Med.167：1767，1988)报道，用多肽刺激可诱导产生对相应的内源性蛋白质亲和力低的细胞毒T淋巴细胞，结果用肽反复刺激可产生识别肽而不识别天然抗原的细胞毒T淋巴细胞。由于剌激过细胞毒淋巴细胞没有能力识别天然的HBC蛋白质，开发HBV肽类药物和疫苗组合物无望，但是使用了围绕这种潜在限制的方法。此发明连续重复刺激细胞毒T细胞，旨在识别和选择对自然处理的抗原而不是合成肽有较高亲和力的T细胞。通过重复剌激活化的PBL建立了短期细胞毒性T淋巴细胞系。用肽和重组的或天然的HBV抗原，如HBsAg重新刺激用肽刺激过的细胞，有活性的细胞也用合适的T细胞分裂素，如植物凝血素(PHA)剌激。重新刺激的细胞和照射过的异源PBLs一起作为抗原非特异性辅助T细胞、HBV抗原的来源。为选择性地扩大细胞毒T淋巴细胞的群体，识别天然HBV抗原，建立长期细胞系，来自病人的PBL首先用肽和重组或天然HBV抗原剌激，接着用HLA—匹配的能稳定表达相应HBV抗原多肽的B淋巴母细胞重复刺激，使用自体和异源的B—淋巴母细胞或其它转染，用合适抗原感染的细胞，为识别内源性合成抗原的能力，重新确定了细胞系。

已识别了在一或更多患者或HLA类型诱导抗HBV细胞毒T淋巴细胞反应的本发明不同的肽类。一些例子有希望在一个组合物中连接两个或更多个肽。这种组合物中的肽类可以相同或不同，它们一道提供相同的或比亲本肽更大的生物活性。例如，用这里所述的方法，两个或更多肽可以限定在源于一个特殊区如

HBenv248—257(Seq.ID No.3)，HBenv249—257(Seq.ID No.4)，

HBenv249—258(Seq.ID No.5)，HBenv250—258(Seq.ID No.6)，

HBenv251—259(Seq.ID No.7)，和/或HBen-v251—260(Seq.ID No.8)，不同或交叉细胞毒T淋巴细胞抗原决定簇。能和肽类结合在“鸡尾中”的肽类为细胞毒T淋巴细胞反应提供了增强的免疫原性。而且，一个区的肽类能和另一个HBV区的肽类结合，后者来自于同样的或不同的HBV蛋白质，特别是第二或次要肽有不同于第一肽的MHC限制因子。

其它诱导CTL HBV类已在共待批使用说明书USSN07/935，898中阐述了，此处作为参考文献。这种多肽组合物能有效地用于拓宽由药物、疫苗或诱治方法及不同群体中本发明的组合物带来的免疫覆盖程度。例如，在兴盛的人种群(高加索人、亚洲人种非黑人)，HLA等位基因的不同频度如下表I所示。可制定本发明的药物或疫苗组合物配方，以便提供潜在的免疫疗法或对尽可能高百分率的人群提供免疫性。

表I兴盛人种HLA等位基因频度HLA Allele      EUC         NAC         AFR          JPN

 A2         45.3        46.6        27.3         43.2

 A29         7.4         8.1        12.3          0.4

 A31         5.4         6.2         4.4         15.3

 A32         8.8         7.1         3            0.1

 A33         3.3         3.4         9           13.1

 A28^*       7.7         9.9         16.6         1.1缩写：EUC，欧洲高加索人；NAC，北美高加索人；AFR，非洲黑人；JPN，日本人

*A28代表两个等位基因AW68和AW69。

本发明中的肽类可由连接键形成聚合物(多聚物)或不通过连接键配成混合物的组合物成分，同种肽自身连接形成同源聚合物，产生了许多重复的抗原决定簇。当肽不同时，如混合物，代表不同的HBV亚型，不同亚型的抗原决定簇不同，不同的HLA抑制特异性，提供了含有辅助T细胞抗原决定簇的肽、带有重复单位的异源聚合物。除共价键外，能形成交叉分子或内部结构键的非共价键也含括在内。

同源或异源聚合物或载体偶联的键能以各种各样的方式提供。例如，半胱氨酸残基能加在氨基和羧基末端，此处肽类通过控制半胱氨酸残基的氧化而共价结合。而且有用的是大量异质双功能试剂，在有官能基团端产生一个二硫键，而在另一端产生一个肽键，包括N—琥珀酰亚胺基—3—(2—吡啶基—二硫基)丙酸酯(SPDP)，此试剂在其本身及一个蛋白质的半胱氨基残基之间产生一个二硫键，通过一个赖氨酸上的氨基或另一个氨基酸上的自由氨基基团形成酰胺键。已知各种各样如此二硫键或酰胺键形成剂。见如Imm.Rev.62：185(1982)，此内容作为参考。其它的双官能偶联剂形成硫醚键而不是二硫键。许多种硫醚键形成剂可从市售获得包括6—顺式丁烯酰亚胺己酸、2—溴醋酸，2—碘醋酸、4—(N—顺式丁烯酰亚胺—甲基)环己烷—1—羧酸等的反应酯。羧基基团可通过其与琥珀酰亚胺或1—羟基—2—硝基—4—磺酸、钠盐结合而活化。一个特别优选的偶联剂是琥珀酰亚胺基—4—(N—顺式丁烯酰胺甲基)环己烷—1—羧酯(SMCC)。可理解的是键不应彻底干扰上述任一有功能的连接基团，如HBV细胞毒T细胞决定剂、肽类似物或辅助T细胞决定剂。

另一方面本发明的肽类能与有HBV辅助T细胞抗原决定簇的其它肽类结合或偶联，即与HBC诱导细胞毒性T细胞合作，剌激T细胞的抗原决定簇。辅助T细胞可能是辅助T细胞1或辅助T细胞2表型，如源于HBV序列的辅助T细胞抗原决定簇在HBcl—20已鉴定了，此序列为：Met—Asp—Ile—Asp—Pro—Tyr—Lys—Glu—Phe—Gly—Ala—Thr—Val—Glu—Leu—Leu—Ser—Phe—Leu—Pro(Seq.ID No.17)。另一个辅助细胞抗原决定簇由源于HBc50—69区的肽提供，此序列为：Pro—His—His—Tyr—Ala—Leu—Arg—Gln—Ala—Ile—Leu—Cys—Trp—Gly—Glu—Leu—Met—Tyr—Leu—Ala(Seg.ID No.18)，源于HBc100—139区的，包括HBc100—119区，此序列为：Leu—Leu—Trp—Phe—His—Ile—Ser—Cys—Leu—Thr—Phe—Gly—Arg—Glu—Thr—Val—Ile—Glu—Tyr—Leu(Seg.ID No.19)(此处异亮氨酸116在HBVadw亚基中是亮氨酸)。HBc117—131含此序列Glu—Tyr—Leu—Val—Ser—Phe—Gly—Val—Trp—Ile—Arg—Thr—Pro—Pro—Ala(Seg.ID No.20)，HBc120—139肽序列为：Val—Ser—Phe—Gly—Vla—Trp—Ile—Arg—Thr—Pro—Pro—Aal—Tyr—Arg—Pro—Pro—Asn—Ala—Pro—Ile(Seg.ID No.21).见Ferrari等J.Clin.Invest.88：214—222(1991).和U.S.Pat.4,882,145，此处都作为参考。

本发明中的肽可用各种各样的方法制备，由于它们的大小相当短，所以可以在溶液中或固体支持物上按常规技术合成。各种各样供商用的自动合成仪可按已知方法使用。见，如Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pievce化学公司1984年版；Tam等，J.Am.Chem.Soc.105：6442(1983)；Merrifield，科学，232：341—347(1986)；Barany和Merrifield，肽类，Gross和Meienhofer编Aca-demic Press New York，ppl—284(1979)，它们在此都作为参考。

或者，可用重组DNA技术，将编码一有意义肽的核苷酸序列插入到一表达载体中，转化或转染合适的宿主细胞，在适于表达的条件下培养。这些方法一般是已知技术，例如通常描述在Sambrook等人的Molecular Cloning，A Labo-ratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York(1982)，及Ausubel等人(编)的CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Inc.，New York(1987)和U.S.Pat.Nos.4,237,224，4,273,875，4,431,739，4,363,877和4,428,941，它们的公开此都作为参考。因此，含本发明一或更多肽序列的融合蛋白质可用作HBV细胞毒T细胞决定剂。如本发明中一种重组的外壳蛋白通过将HBen氨基酸序列变化以更有效地呈现出上述多肽区的抗原决定簇来刺激产生一种细胞毒T淋巴细胞应答制备。用这种手段，多肽通过结合几种T细胞抗原决定簇得到应用。

期望长度肽类的编码序列可经化学技术合成，例如，Matteucci等人的磷酸三酯法，(J.Am，Chem.Soc，103：3185(1981))，简单地通过修饰取代编码天然肽序列的适当碱基。编码序列通过合适的接头连接到现有技术中常用的表达载体上，这些表达载体通常转化合适的宿主细胞产生期望的融合蛋白质。目前许多这样的载体和合适的宿主体系是可利用的。为了表达融合蛋白质，提供了能操作连接的起始和终止密码、启动区和终止区，及提供一个在期望细胞宿主中表达的表达载体复制体系。例如，和细菌宿主相容的启动子序列，以包含利于目的编码序列插入的限制位点的质粒方式提供。结果产生的表达载体可转化进合适的宿主细胞。使用合适的载体和对照序列，酵母或哺乳动物细胞宿主也可利用。

本发明中的肽类和药物及疫苗组合物，施药给哺乳动物，尤其人类，对治疗和/或预防HBV传染是有用的。由于肽类用作刺激HBV感染的细胞产生细胞毒T—淋巴细胞应答，所以这种成分可用来治疗或预防急/或慢性HBV感染。

作为药物组合物，本发明中上述的肽类可以给已感染HBV的个体用药。接种期或急性感染期的个体可分别用免疫原性肽治疗或结合别的合适疗法。在治疗应用中，组合物以有效剂量用药给患者以产生对HBV有效的细胞毒T淋巴细胞应答，治愈或至少部分抑制其症状或综合症。足够达到此效果的量称为“治疗有效剂量”。

此应用的有效量依赖如肽组合物、给药方式、被治疗疾病的阶段和严重度，患者的体重和一般健康状态及开处方医生的判断，但对70公斤的患者通常范围是约1μg—2000mg肽，更常用的肽剂量约从1μg—100mg，超过数周至数月用较高剂量，约1μg—1mg肽，这依赖于患者的CTL反应，由测定从患者获取的PBLs中的HBV特异CTL活性确定。必须牢记，此发明的肽类和组合物通常用于严重疾病状态，即威胁生命的或有潜在性生命威胁的状况。在这些情况下，根据外源物质的最小量和肽的相对无毒性，尽可能的，在治疗医生的指导下施用实际过量的这些肽。由治疗医生选择的剂量和给药方式确定本发明组合物是单一还是多次给药。为有效地治疗患者，在任何情况下药物制剂，药物制剂都应提供足够的本发明细胞毒T—淋巴细胞刺激的肽。

治疗使用时，HBV感染症状一产生就应用药或在急性感染病例的诊断后不久用药，持续到至少全部消除症状，再继续用药一段时后不久。在彻底确诊的和慢性的病例，需要接着用维持量或提供高量。在急性肝炎的治疗过程中，对HBV有效的细胞毒T淋巴细胞应答的产生，使继续发展成慢性肝炎、HBV携带者期及产生肝细胞癌的可能性最小。

用本发明的组合物治疗感染性个体，可加快解决急性感染个体的急性感染，大约可自然解决约90％。对患(感染)渐进性慢性感染的个体，这些组合物对预防从急性产生慢性感染的方法特别有用。患病个体证实在先于或感染期，例如此处所述，那些组合物可定位在他们身上，对较大的人群对用药需要最小。

肽组合物也能用于治疗慢性肝炎，刺激携带者的免疫系统彻底减少或甚至消除病毒感染的细胞。感染后大约3—6个月，患慢性肝炎者可证实病毒试验阳性。在其急性感染期，由于不够(或缺乏)细胞毒T淋巴细胞应答，这些个体可能发展为慢性HBV感染，所以为有效地刺激细胞毒T细胞应答，在制剂中供应有潜在免疫性肽的量，提供有效的用药方法是重要的。

因此，为治疗慢性肝炎，对70公斤体重的患者代表性剂量是约1μg—1000mg，优选剂量约5μg—100mg。给药应至少持续至临床体征或实验指标表明HBV感染消除了或实质性降低了，及其后一段时期。在确症期，如1—4周，需要通过维持或较高剂量提供免疫剂量，为必要地去除感染，可能一个延长期。为治疗慢性和携带者HBV感染，需要将CTL肽类同能诱导其它HBV抗原产生免疫应答的其它肽类或蛋白质结合起来。

治疗用药物组合物，可用非肠道、体表、口服或局部给药。优选地，药物组合物可经非肠道给药，如经静脉内、皮下、真皮内、或肌肉内给药。因此，本发明提供了非肠道给药的组合物，包括溶解或悬浮在可接受的载体，最好是水溶性载体中细胞毒T淋巴细胞刺激肽类的溶液。各种各样的水溶性载体可以利用，如水、缓冲水、0.4％的盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可通过常规的已知消毒技术消毒，或经过滤消毒。所得的水溶液可包装如上使用或冻干，冻干制品给药前和消毒液混合。

这种组合物包括药物上可接受的在近于生理条件下的辅助物，如pH调节剂和缓冲试剂，增强调节剂、润湿剂等，如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、月桂酸山犁聚糖、油酸三乙胺等。

在一些实施方案中，药物组合物中至少包含一种和CTL接触的成分是必要的。据证实脂类在体内能和CTL接触，以对抗病毒抗原，如三棕榈酰—硫—甘氨酰半胱氨酰—丝氨酰—丝氨酸(P₃CSS)和一适合的肽类共价结合时能有效地和病毒特异细胞毒T淋巴细胞接触。见Deres等，Na-ture342：561—564(1989)，在此作为参考。本发明中的肽类能和P₃CSS偶联，如对个体给药使其对HBV，特异地接触细胞毒T—淋巴细胞应答的脂肽。进一步，诱导中和抗体也能与结合肽类的P₃CSS接触，此肽有合适的抗原决定簇，如HB_sAg决定簇。这两种组合物结合在一起，结果更有效地产生对HBV感染的体液和细胞调节反应。

本发明药物制剂中细胞毒T—淋巴细胞刺激肽的浓度可广泛地致变，即根据体重从约少于1％，通常约在或至少约10％到20％至50％或更多。此浓度，根据特殊选择的给药类型主要通过流体容积，粘滞度而选定。

因此静脉内溶入的典型药物组合物制成250ml灭菌Ringer溶液，100mg肽。制备非肠道给药组合物的实际对本领域技术人员是已知或显而易见的，如Remington’s Phar-maceutical Science，17ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1985)，在此作为参考。

本发明中的肽类也可通过脂质体给药，此方法是由多肽以特定的组织为靶标，如淋巴组织或感染了HBV的肝细胞。脂质体也用来增加肽类组合物的半衰期。用于本发明中的脂质体包括乳液，泡沫胶，胶束，不溶的单分子层，液态晶体，磷脂分散液，薄片层等。在这些制品中被运送的肽类结合为脂质体的部分，单独或与结合的分子相结合，如在旺盛的淋巴细胞中的受体，如单克隆抗体，它连接在CD45抗原上，或与其它治疗性或免疫原性组合物结合。因此，本发明所望肽的脂质体能直接达到淋巴或肝细胞位点，然后脂质体运这可选择的治疗用或免疫原肽组合物。本发明中使用的脂质体由标准的形成囊泡的类脂形成，它通常包括中性的和带负电的磷脂和固醇类，如胆固醇。类脂的选择通常要考虑下列因素进行，如脂质体大小及其在血流中的稳定性。各种各样的方法可用于制备脂质体，记述在如Szoka等的Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，U.S.Patent Nos.4,235,871,4,501,728，4,837,028，和5,019,369，在此作为参考。为定位在免疫细胞上，连接进脂质体的配体包括如，特异细胞表面的抗体或片段，想要的免疫系统细胞决定剂。含肽类的脂质体悬液通过静脉内、局部地、表面地等途经给药，剂量随着给药方法、运送的肽、治疗的疾病所属阶段而变化。

对固体组合物，可以使用常规非毒性固体载体，其中包括如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对口服，可药用无毒组合物通过结合常用受体形成，如以前列举的那些载体，通常含10—95％的活性成分，即本发明中的一个或多个肽类，更优选浓度为25％—75％。

通过气雾给药，细胞毒T淋巴细胞刺激肽最好同表面活性剂及推进剂一道，经细分形式使用。典型肽的百分率是体重的0.01％—20％，最好在1％—10％。当然表面活性剂必须无毒、最好溶于推进剂中。此种试剂的代表物是含6到22个碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、合成树脂酸及油酸，它们都带有脂肪族多元醇或其环化酐。可以使用混合酯，如混合或天然甘油酯。表面活性剂占组合物重的0.1％—20％，最好在0.25—5％。这种组合物的平衡物是推进剂。载体也可含如所述的用于鼻内传运的卵磷酯。

本发明的另一方面是疫苗，它包含此处所述的作为活性成分的免疫原有效量的细胞毒T—淋巴细胞刺激肽。肽类可引入宿主，包括人类，和其自身载体连接或作为活性肽单位的同源聚合物或异源聚合物。这种聚合物有利于增强免疫应答。不同的肽用于构建聚合物，这种增强能力诱导抗体和/或细胞毒性T细胞和不同的HBV抗原决定簇反应。有用的载体技术已众所周知，包括如锁眼帽贝血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、白蛋白，如血清白蛋白，破伤风类毒素，聚合氨基酸如聚合(D—赖氨酸：D—谷氨酸)等。疫苗也包括生理上可耐受的(可接受的)稀释剂，如水，磷酸盐缓冲的盐水或盐水，进一步典型地包括辅剂。辅剂，如不完全的Freund辅剂，磷酸铝、氢氧化铝或明矾都是现有技术中已知材料。如上所述，细胞毒T淋巴细胞应答通过将本发明中的肽类接合到类脂上，如P₃CSS上启动。一旦如此处所述通过注射、气雾、口服、经皮肤或其它途径用肽组合物免疫，宿主免疫系统通过产生大量对HBV抗原特异性的细胞毒T—淋巴细胞进行应答。宿主至少部分地对HBV感染有免疫性，或抵抗渐进性慢性HBV感染。

以含本发明肽类的疫苗组合物给患HBV感染或有HBV感染危险性的患者给药，以增强患者自身免疫力。这样的量称为“免疫原效有剂量”。在此应用中，精确量还是依赖于患者的健康状况和体重、用药方式、制剂特性等，但常规范围是从约1.0μg—约500mg，这对70公斤患者而言，更常用的是对70公斤体重患者，从约50μg—约200mg。这些肽类对合适的HLA型个体给药，如来自于

HBenv183—191(Seq.ID No.1)，HBenv248—260(Seq.ID No.2)，

HBenv260—269(Seq.ID No.9)，HBenv335—343(Seq.ID No.10)，

HBenv152—161(Seq.ID No.11)，HBenv177—185(Seq.ID No.12)，

HBenv204—212(Seq.ID No.13)，和/或HBenv370—379(Seq.ID No.14)，

区的肽类疫苗组合物，对至少HLA—A2个体给药。

在某些实例中，理想的是把本发明中的肽类疫苗和对HBV诱导中和抗体应答的疫苗结合起来，特别是对HBV外壳抗原，如重组HBV编码的外壳抗原或从HBV感染的个体获得了纯化血浆制品制备的疫苗。各种各样的HBV疫苗制品已描述了，主要根据其中的HBsAg和多肽片段。如可用本发明中多肽配制的疫苗例子，通常见EP154,902和EP 291,586，U.S.Pat.Nos.4,565,599，4,624,145，4,599,230，4,599,231，4,803,164，4,882,145，4,977,092，5,017,588和5,019,386，此处都为参考。这些疫苗能结合在一起同时给药，或各自给药。

为了治疗和免疫目的，本发明的肽类也可以衰减病毒宿主，如牛痘表达。此方法涉及牛痘病毒的使用，牛痘病毒在本发明中作为表达编码HBV肽类核苷酸序列的载体。一旦重组牛痘病毒引入急性或慢性HBV感染的宿主或非感染的宿主，就表达HBV肽，由此产生对HBV的宿主细胞毒性T淋巴细胞应答。在免疫方法中有用的牛痘载体和方法记载在如U.S.Patent No.4,722,848，此处作为参考。另一个载体是BCG(bacille Calmette Guerin)。BCG载体记载在Stover等的Nature351：456—460(1991)，此处作为参考。用于本发明肽类治疗给药或免疫的各种其它媒介物，如Salmonellatyphi媒介物等，对所述的本领域技术人员来说是显而易见的。

有权利要求的本发明的组合物及方法可用作活体外治疗。活体外治疗意思是在体外进行治疗和免疫原操作，如可从患者去除淋巴细胞或其它靶细胞，用高剂量的目标肽治疗，在细胞培养基中提供一种刺激肽浓度，远远超过患者达到或耐受的水平。接着治疗是刺激CTLs，细胞仅用于宿主治疗HBV感染，宿主的细胞也可暴露于带有编码上述多肽的基因的载体。一旦用载体转染，细胞便可在体外增殖并反用到患者。达到一个预定细胞密度体外增殖的细胞可反用于患者。

肽类也可作用诊断试剂，如本发明的肽类可用于确定特定个体对治疗过程的易感性，此治疗过程使用了肽或相关肽类，所以是对感染个体，改善其现有治疗条件或缺定预后有帮助的。此外，肽类也可用于预测个体在发展成慢性HBV感染的实际危险期。

下列实施例只作说明，而不是限制。

实施例1

CTL特异性HBenv抗原决定簇的鉴定

本实施例描述刺激HLA限制性CTL特异性应答HBV外壳抗原的HBenv肽的鉴定。

用于本实验的病人为HLA—2阳性。研究了13个处于急性肝炎过程中的病人(A—1到A—13，表II)，6个被HBV慢性感染的病人(C—1到C—6)，和6个用作正常对照的来感染的健康自愿者(N—1到N—6)。病人及其HLA单型样品用PBMC在HLA分型盘中的微量细胞毒性试验来鉴定，如表II所示。

急性肝火的诊断以基本诊断标准为根据。诊断参数包括肝损伤的临床(黄疸)和生化证据(ALT活性至少比正常的上限高20倍)，以及急性HBV感染(存在HBV表面抗原(HBsAg)和IgG抗HBc抗体)的血清学证据，在肝炎δ和肝炎C病毒感染时无血清学证据(Abbott Laboratories，North Chcago.IL)。

所有病人在出现黄疸后头4周期间进行实验，此时他们的血清为HBsAg阳性而且其ALT水平明显反常。13个病人中11人随后康复，在开始诊断后的4个月内血清转氨酶正常化且HBsAg被清除。1个病人(A—11，表Ⅱ)发展成慢性发作肝炎而且在开始诊断后的13个月内保持HBsAg阳性。1个病人(A—10)在初次诊断会面后失去了联系。携带慢性肝炎B的病人在超过6个月的时间内为重复的血清学HBsAg阳性而且表现出血清ALT活性轻微地到中等程度地升高。正常对照没有HBV感染的临床病史且对HBV标记物血清学反应为阴性。所有病人和正常对照对HIV抗体为血清学阴性。

            表II实验对象的特征对象    性别   诊断    HLA单型分类A—1    男     急性    A2，A30，B35，B44，Cw4，cw7A—2    男      ″    A2，A31，8w58(5Y)，B51，Cw3A—3    男      ″    A2，Bw41，Bw71，Cw4，Cw7A—4    男      ″    A2，A32，Bw41，Bw71，Cw4，Cw7A—5    男      ″    A2，A1，B8，8w58(5Y)，Cw7A—6    女      ″    A2，Aw68，B35，Cw3，Cw4A—7    男      ″    A2，A1，B8，Bw73，Cw3，Cw4A—8    女      ″    A2，Aw69，Bw53，Cw4A—9    男      ″    A2，A24，B7，B27，Cw2，Cw7A—10   男      ″    A2，A3，Bw62，Bw71，Cw3，Cw4A—11   男      ″    A2，A24，B35，Cw4A—12   男      ″    A2，A3，Cw5A—13   男      ″    A2，A3，B7，Bw60，Cw3，Cw7C—1    男     慢性   A2，B27，B35，Cw2，Cw4C—2    男      ″    A2，A1，B8，B44C—3    男      ″    A2，A24，B44，Bw67C—4    男      ″    A2，Aw69，Bw41，Bw52C—5    男      ″    A2，B5，Bw62，Cw4C—6    男      ″    A2，A26，B36，Cw4N—1    男     正常   A2，A11，B44，cw4N—2    男      ″    A2，Bw56，B35N—3    男      ″    A2，A11，B8，Bw62，Cw4N—4    男      ″    A2，A23，B5，Bw58，Cw2，Cw6N—5    男      ″    A2，B44，Bw63N—6    女      ″    A2，A11，Bw58

在Ficoll—Hypaque密度梯度(sigma，st，Louis，Mo)中分离病人和正常供血者的PBMC，在Hanks平衡盐溶液(HBSS)(Gibco，Grand Island，NY)中洗三次，重悬于含L—谷氨酰胺(2mM)，庆大霉素(10μg/ml)，青(50U/ml)，链霉素(50μg/ml)，HEPES(5mM)，10％热灭活的人AB血清之RPMI1640培养基(Gibco，Grand Island，NY)(完全培养基)中，在24孔平板上以4×10⁶细胞/孔涂板。向细胞培养物中以终浓度为10μg/ml加入合成肽，除非另有提示。在剌激的第一周内以1μg/ml加入rHBcAg。在第3天，向每孔中加入1ml含rIL2(Hoffman—La Roche，Nutley，N.Y)终浓度为10U/ml的完全培养基。在第7天，用肽，rIL₂和辐射过(3000rads)的自体或HLA—A2相配的饲养细胞再剌激培养物，在第14天，对培养的PBMC测CTL活性。经每周用1×10⁶辐射过的(6000rads)异源PBMC和1×10⁵辐射过的(18000rads)JY细胞(异源EBV—B转化的细胞系，HLA—A_2.1，B7，Cw7)(14)在1ml含1μg/ml肽，20U/ml IL2和1μg/ml植物凝集素(PHA)(Sigma，st，Louis.Mo)的完全培养基中再刺激来扩散挑选出的表现出肽特异性细胞溶融活性的培养物。

由a)以10μg/ml的合成肽培养过夜的自体PHA剌激过的胚细胞和异源HLA相配或不相配的EBV转化的B淋巴母细胞细胞系(B—LCL)；b)上述稳定B—LCL转染体；或C)以重组疫苗病毒(在下面描述)感染的B—LCL中任一组成靶细胞用于细胞毒性评估。B—LCL从美国组织亲合性和免疫遗传学组织(Boston，MA)购买或按在同时待审批的申请07/935，898中所述由我们自己从病人和正常供血者中汇集而产生。细胞在含L—谷氨酰胺(2mM)，庆大霉素(10μg/ml)，青霉素(50U/ml)，链霉素(50μ/ml)，HEPES(5mM)，和10％(体积/体积)加热灭活的FCS(Gibco，Grand Island，NY)之RPMI1640培养基中保持。自体PBMC胚细胞的短期细胞系在用作靶细胞前，经过用1μ/mlPHA在含L—谷氨酰胺(2mM)，庆大霉素(10μm/ml)，青霉素(50U/ml)，链霉素(50μg/ml)，HEPES(5mM)，10％(体积/体积)加热灭活的FCS，和10U/ml rIL2的RPMI1640中刺激外周血PBMC7天来产生。在振荡盘中以50噬菌斑形成U/细胞室温感染1×10⁶个细胞1小时，然后洗一次并37C培养过夜以制备疫苗感染的靶细胞。

用100μCi的⁵¹Cr(Amersham，Arlington Heights，IL)标记靶细胞1小时并用HBSS洗涤3次。使用含5000靶细胞/孔的U型底96孔板在标准4小时时⁵¹Cr释放试验来测定细胞溶融活性。所有试验一式二份。细胞性百分数按公式：100×[(实验释放—自发释放)/(最大释放—自发释放)]来测定。用加去污剂(1％Triton X—100，Sigma)后靶细胞的裂解来测定最大释放。在所有试验中，自发释放不到最大释放的25％。

最初挑选了两个HLA—A₂阳性的急性肝炎病人，分析CTL应答含有2个重迭的HLA2.1等位特异性结合靶(WLSLLVPFV和LLVPFVQWFV)的HBsAg329—348(ASARFSWLSLLVPFVQWFVG(序列ID号：22))。从前面的的实验已知。其中一个病人(A—3)表现出HLA A2限制性CTL应答，代表—HLA A2.1等位特异性结合靶(FLPSOFFRSV)的10个残基HBV病毒粒子抗原决定簇(HBcAg18—27)。认为这个病人对HBsAg329—348中的1个或两个靶位点具有潜在的应答力。研究另一已知对HBcAg18—27不具应答力的病人用于比较。

按上面所述以肽刺激两个病人的PBMC产生HB-sAg329—348特异性CTL细胞系。刺激2～3周后，两个病人对预先以HBsAg329—348肽脉冲过的纯合性HLA A2.1阳性EBV细胞系(JY)表现出强烈的细胞毒性反应。挑选病人A—1的HBsAg329—348特异性细胞系用于克隆。

在96孔微滴定板上开始1，10，和100个细胞/孔克隆细胞系，再以0.3或1个细胞每孔亚克隆。细胞在存在有肽(1μg/ml)，PHA(1μg/ml)，rIL—2(20U/m)，辐射过(6000rads)的异源PBMC(10⁵细胞/孔)，和辐射过(18000rads)JY细胞(10⁴细胞/孔)的系件F涂板。按上面所述，除了不用肽而且以能稳定表达HBV大型外壳抗原(EBO preS1，参考文献10)的质粒化过的已辐射的JY细胞以10⁵细胞每孔加入外，在24孔平板上再刺激HBV特异性克隆。

使用病人A—1的HBsAg329—348特异性细胞系从以1个细胞每孔(克隆B13，B16，B17)或0.3个细胞每孔(克隆B3)涂板的细胞中得到4个克隆。以一组在HLAI型等位基因水平与效应器部分匹配的异源靶细胞克隆B3。由于在肽上存在2个HLA—A2.1结合靶位点，使用在HLAI型水平与病人A₁部分匹配的异源靶细胞，发现克隆B₁的细胞溶融活性为HLA—A2限制性。以同样方式鉴定得自病人A—3的HBsAg329—348特异性多克隆CTL细胞系为HLA—A2限制性。由于病人的HLA—A2亚型尚束鉴别，因此不知CTL应答肽是仅为HLA—A2·1等位基因限制性的还是延伸到其它的HLA—A₂亚型。

为测定HBsAg329—348上最小的优选HLA—A2限制性CTL抗原决定簇，以HBsAg329—348序列生产一组氨基末端截短并重叠的9残基部分和10残基部分来测量含有2个重叠的理想HLA—22·1结合靶的20残基肽上之HLA—A2限制性CTL抗原决定簇。经过上述起始细胞系和HB-sAg329—348重复刺激，从病人A—1产生出HLA—A2限制性CTL克隆，以病人A—3产生出多克隆CTL细胞系1B9，用作效应细胞，以形成CTL应答HBsAg329—348的灵敏的特异性。经过以起始20残基或以截短肽培养HLA—A2·1阴性B细胞系(JY)产生靶细胞。

如图1所示，结果表明2个HLA—A2·1结合靶(HB-sAg335—343)中仅第一个被CTL识别。而且资料表明该肽(WLSLLVPFV)是被HBsAg329—348刺激的CTL所识别的最小的优选HLA—A2限制性抗原决定簇，由于HB-sAg335—343上氨基末端或羧基末端残基的丢失导致CTL识性的丧失。

当用肽刺激来自病人A—1的PBMC之CTL应答时，HBsAg335—343在效应器水平的优势是重复的。代表与HBsAg329—348亚基相配的合成肽用于以10μM剌激病人A—1的PBMC。刺激两周后，按E：F为60∶1用以10μM的相同肽预先脉冲辐射过的JY靶细胞和以10μM HBsAg335—343预先脉冲辐射过的JY靶细胞试验这些细胞系的细胞毒性。图2所示在4小时⁵¹Cr释放试验结果代表溶胞％。在图2中可见，尽管HBsAg335—343和其延伸的变异体证实能诱导CTL应答，但氨基末端和羧基末端的氨基酸丢失导致肽刺激CTL应答的能力完全丧失，因此支持了在HBsAg的329—348残基间，HBsAg335—343是最小的优选HLA—A₂限制性抗原决定簇这一结论。

                实施例II

HBVenv中对7个HLA—A2·1结合靶位点的CTL应答

HBV外壳蛋白的HBsAg区存在7个理想的HLA—A2·1等位特异性结合靶位点(表III)，这些位点定义为长度为9—10个残基，在第二位含亮氨酸，羧基末端残基为缬氨酸。根据实施例I得到的结论，检查了12个携带急性肝炎B的HLA—A2阳性病人这7个外壳肽，加上已知的HLA—A2限制性HBV病毒粒子抗原决定簇(HBcAg18—17)刺激CTL应答的能力。作为比较，试验了6个携带慢性肝炎的HLA—A2阴性病人和6个未感染的正常对照者对相同的一组肽的应答。

表III，来自HBV的HLA—A2·1结合靶位点和肽

	肽	序列	Seq.ID No.
				1	HBcAg18—27	FLPSDFFPSV	23
2	HBsAg201—210	SLNFLGGTTV	24
				3	HBsAg251—259	LLCLIFLLV	7
4	HBsAg260—269	LLDYQGMLPV	9
				5	HBsAg335—343	WLSLLVPFV	10
6	HBsAg338—347	LLVPFVQWFV	25
				7	HBsAg348—357	GLSPTVWLSV	26
8	HBsAg378—387	LLPIFFCLWV	27

按实施例I所述，以下列合成肽：1＝HBcAg18—27，2＝HBsAg201—210，3＝HBsAg21—257，4＝HBsAg260—269，5＝HBcAg335—343，6＝HBsAg338—347，7＝HBsAg348—357，8＝HBsAg378—387，刺激来自急性病人(A—1到A—12)，慢性病人(C₁到C₆)，和正常对象(N—1到N—6)的PBMC2周，检测对以相同肽预先脉冲过夜的JY靶细胞在4小时内的⁵¹Cr释放。通过从预先以该肽脉冲过的JY靶细胞⁵¹Cr释放量中减去未用肽预先脉冲的JY靶细胞⁵¹Cr释放量来测定肽特异性细胞毒性。结果如图3所示，4小时内⁵¹Cr释放试验代表特异性溶胞％。

如图3所见，12个携带急性肝炎的HLA—A₂阳性病人中有9个至少对这一组多肽中的一个产生应答。作为对照，按同样的体外剌激方法，在6个HLA—A₂阳性未感染的正常对照者没有一个对其中的任一肽产生应答，这表明通过病人的体内反射对这些肽的应答由相应的来自HBV的抗原决定簇引发。

重要的是在9个应答者中有8个识别这一组肽中的多个抗原决定簇，表明在急性肝炎期间对HBV的CTL应答既是多克隆的，又是多特异性的。而且，在9个应答者中被识别的抗原决定簇谱存在很大的变化，有些抗原决定族比其它更频繁地被识别。例如，HBcAg18—27和HBcAg335—343分别被9个应答者中的7个和8个所识别，而且当它们组合起来后9个应答者都能识别。作为对照，HBsAg348—357，HBsAg251—259和HBsAg260—269在其所试验的应答者中分别只被319，215和316的应答者所识别。

急性感染病人的环状病毒DNA核苷酸序列分析表明，包括CTL非应答者的所有病人被表达以原型HBsAg335—343肽存在用于刺激体外CTL扩散的精确氨基酸序列之病毒所感染。由于已知在所有公开的来自全部4种HBV亚型的HBV序列中，如在GenBank—72数据库中公开的，以及此处所研究的10个病人中，残基335—343的保守的，可推断HBsAg335—343是HBV组—特异性的CTL抗原决定簇。然而，对HBsAg348—357却不是这样，因为在10个病人中发现只有7个被编码原型序列用于体外刺激(GLSPTVWLSV)的病毒所感染。制下的3个病人(A—9，A—10，A—13)表现为变异序列，其中在357位的羧基末端缬氨酸被丙氨酸代替。在被原型病毒感染的病人中，与对HB-sAg335—343的应答一样，观察了对HBsAg348—357的CTL应答者和非应答者。与此相反，在3个被变异病毒感染的病人中没有一个表现出对原型肽的CTL应答。

值得注意的是，所有9个应答者后来变为HBsAg阴性而且其肝脏疾病完全康复。相反，携带慢性肝炎的6个病人都不能清除病毒，也不能引发对这些抗原决定簇中任何一个的外周血CTL应答。3个急性感染的病人(A—10，A—11，A—12)也不能对这些肽中的任何一个发生应答。而且一个非应答者(A—11)发展成慢性发作肝炎而且在其急性疾病后的13个月时仍为HBsAg阴性。综合这些资料有力地证实了CTL应答与病毒清除之间的相关性。然而，非应答者病人A—12在疾病出现后的1—4个月内血清转化为HBsAg阴性。

如表II和图3所示，本实验用JY靶细胞时，9个应答者中有4个只共用HLA A等位基因(HLA—A2，B₇，Cw7)，证实在这些个体中对所有肽的应答为HLA—A2限制性。由于存在JY靶细胞时剩余的反应者除A2外也共用HLA B7和/或Cw7等位基因，所以可能在这些病人中(尽管靠不住)，这些等位基因可能也用作这些抗原决定簇的限制性单元。

7种HBV外壳肽不同免疫原性的分子基础不能从其序列的比较中直接得到证据。通过测定7种外壳肽与一种无关的HLA—A2限制性病毒粒子抗原决定簇(HBcAg18—27)竞争结合纯合HLA—A2.1阳性B细胞系(JY)的能力来检查肽对HLA—A2.1有关的结合亲合性之潜在区别。

使用来自病人A—4的HBcAg18—27特异性CTL克隆作为效应细胞来源分析竞争性结合抑制。在加入一不饱和浓度(0.03μM)的目标肽(HBcAg18—27)之前，向⁵¹Cr标记的HLA—2.1阴性JY靶细胞和效应器细胞(E∶T＝40∶1,3000靶细胞/孔)混合物中加入封闭肽(1，10，100μM)封闭40分钟。通过计算封闭的靶细胞4小时内⁵¹Cr的释放水平来分析每个肽的结合能力。

如图4所示，4个免疫原性肽的全部和3个非免疫原性肽中的2个与HLA—A2.1分子结合，但具有与其相应的免疫原性无关联的大范围(超过100倍)可变效率。重要的是，在这一试验中唯一的一个不与HLA—A2.1结合的肽(HB-sAg337—348)是非免疫原性的。然而，另外两个非免疫原性肽对HLA—A2.1的结合亲和力与一些免疫原性肽相比一样高或更高。因此，尽管肽结合该I型分子的能力为免疫原性所必需，但这种能力并不保证其免疫原性。这暗示在抗原加工水平上的其它因子和T细胞的所有成份可能在决定病毒蛋白质中的那一个HLA—A2.1结合肽能诱导CTL应答时发挥作用。

            实施例III

肽特异性CTL识别内源性HBenV抗原

通过测量HBsAg335—343和HBsAg348—357特异性CTL溶融被2组编码来自克隆的HBVayw或adw亚型的HBV基因组之大型、中型和主要外壳多肽的重组牛痘病毒感染过的靶细胞之能力来检查它们识别内源性的合成抗原的能力。

获得表达HBV大型、中型和主要外壳多肽(adw亚型)的重组牛痘病毒和相应的对照野生型牛痘(Smith et al.，Nature302：490(1983)；Cheng et al.，J.Virol.(1986)；andCheng and Moss，J.Virol，61：1286(1987)，此处的每一篇以参考文献编写)。按下面所述得到一系列独立表达HBVayw亚型同样的三种HBV外壳多肽的重组牛痘病毒。为表达HBsAg，含HBV序列核苷1409—2514的XhoI/SphI限制性片段克隆到牛痘病毒表达载体7.5K早期/晚期启动子下游。为构preS1表达牛痘病毒，使用含核苷937—2514的BglII/SphI片段。为克隆preS2编码序列，先合成一段从核苷1267起(例如，preS2编码序列，先合成一段从核苷1267起(例如，preS2起始密码子上游6个碱基对)跨越1280位的EcoRI位点的短衔接寡核苷。将该寡聚核苷克隆到牛痘病毒表达载体上后，以将EcoRI/SphI HBV片段(核苷1280—2514)克隆到该中介构建体来完成编码序列的克隆。按Smith等(出处同上)所述的标准程序产生重组牛痘病毒。按Guilhot等所述(J.Virol，66：2670(1992)，此外以参文献来描述)，经过用一组以EBV为基础的含有相应的HBV(ayw亚型)编码区的表达载体转染B—LCL来产生表达HBV外壳蛋白质(ayw亚型)稳定转染细胞。

分别以肽序列WLSLLVPFV和GLSPTVWLSV剌激来产生—HBsAg335—343特异性CTL细胞系(病人A—1)和—HBsAg348—357特异性CT L细胞系(病人A—4)。CTL与经⁵¹Cr—标记的预先与培养基，或诱导肽或(对于HBsAg348—357)变异肽(GLSPTVWLSA)一起培养过的JY靶细胞一起保温。CTL也与经⁵¹Cr—标记过的，以一组表达来自ayw和adw HBV基因组的HBV主型(V—HBs)，中型(V—preS2)和大型(V—preS1)外壳多肽的6个重组牛痘病毒感染过的JY靶细胞一起保温。野生型牛痘病毒(V—wt)用作对照。HBsAg335—343特异特CTL细胞系(右组)以E：T＝40∶1使用。HBsAg348—357特异性CTL细胞系(左组)以E∶T＝3∶1使用。所示的结果以4小时内⁵¹Cr的释放试验代表溶胞％。

来自病人A—1和A—4的HBsAg335—343和HB-sAg348—357特异性CTL能溶融重组牛痘病毒感染的合成所有3种HBV外壳蛋白的靶细胞(图5)。这表明，这两个合成的肽代表由感染的细胞对大型，中型和主型HBV外壳多肽进行内源性加工产生的抗原决定簇。

重要的是：HBsAg335—343特异性CTL能溶融被两套具有相同效力的重组牛痘病毒所感染的靶细胞，而且HB-sAg348—357特异性CTL对ayw感染的靶细胞组的溶胞效力比对adw靶细胞要高。

上面实施例所述的结果表明：人HBV的CTL反应表现为相当多价的，可能承担对这一系列的病毒感染更有效的保护。而且资料表明此处所用的肽刺激策略对由多态的HLAI型基因座位所限制的多价反应之鉴定和分析既是有效的，也是有力的。由于另外的HLA等位特异性结合靶位点被鉴别，含有这些靶位点来自于HBV的肽可用CTL前体的体外刺激。

本说明书提到的所有出版物，专利和专利申请按相同范围以参考文献的形式编入说明书。如特别是每个单独的出版物，专利或专利申请分别以参考文献的形式被编入。

从上所述应懂得：尽管为说明本发明的目的而描述了本发明的具体实施例，对此的各种修改可能不会偏离本发明的实质和范围。因此，本发明不受从属权利要求的限制。

序列表一般信息(ⅰ)申请人：Chisari，Fancis V.(ⅱ)发明题目：诱导细胞毒T淋巴细胞应答肝炎B病毒的肽类(ⅲ)序列号：27(ⅳ)通信地址

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  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑：线型(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：12：Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu1              5(2)SEQ ID NO：13信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：9个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑：线型(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：13：Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1               5(2)SEQ ID NO：14信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑：线型(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：14：Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leul               5                   10(2)SEQ ID NO：15信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：15：Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val1               5                   10(2)SEQ ID NO：16信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：16：Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln1               5                   10(2)SEQ ID NO：17信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：20个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

   (C)链型：单链

   (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：17：Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala1               5                   10Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro

        15                  20(2)SEQ ID NO：18信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：20个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：18：Pro His His Tyr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu1               5                   10Cys Trp Gly Glu Leu Met Tyr Leu Ala

        15                  20(2)SEQ ID NO：19信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：20个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性  (ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：19：Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly1               5                    1OArg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu

    15                  20(2)SEQ ID NO：20信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：15个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：20：Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro1               5                   10Pro Ala

15(2)SEQ ID NO：21信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：20个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：21：Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg1               5                   10Pro Pro Asn Ala Pro Ile15                  20(2)SEQ ID NO：22信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：20个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：22：Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro1               5                   10Phe Val Gln Trp Phe Val Gly

15                  20(2)SEQ ID NO：23信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：23：Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val1               5                   10(2)SEQ ID NO：24信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：24：Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val1               5                   10(2)SEQ ID NO：25信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：单链(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：25：Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val1               5                   10(2)SEQ ID NO：26信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：26：Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val1              5                   10(2)SEQ ID NO：27信息：(ⅰ)序列特征：

  (A)长度：10个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：单线(ⅱ)分子类型：肽  (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：27：Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val1               5                   10

Claims (20)

1.含有以下序列的可诱导CTL的肽：

HBenv183—191(Seq.ID No.1)

Phe—Leu—Leu—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile.

2.如权利要求1的可诱导CTL的肽，其中此肽也含有T助抗原决定簇。

3.如权利要求1的肽，与致免疫的脂载体结合。

4.可诱导CTL的肽，含有8到13个氨基酸，其中至少大部分氨基酸与具有序列

HBenv248—260(Seq.ID No.2)

Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu

的HBenv的相应部分同源。

5.如权利要求4的可诱导CTL的肽，它含有9到11个氨基酸。

6.如权利要求4的可诱导CTL的肽，它含有：

HBenv248—257(Seq.ID No.3)

Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；

HBenv249—257(Seq.ID No.4)

Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；

HBenv249—258(Seq.ID No.5)

  Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；

  HBenv250—258(Seq.ID No.6)

  Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；

  HBenv251—259(Seq.ID No.7)

  Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val；或

HBenv251—260(Seq.ID No.8)

Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu.

7.含有9到11个氨基酸的可诱导CTL的肽，其中至少大多数氨基酸与具有序列

HBenv334—344(Seq.ID No.)

Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val

的HBenv相应部分同源。

8.如权利要求7的可诱导CTL的肽，含有：

HBenv335—343(Seq.ID No.10)

Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val ；

HBenv334—343(Seq.ID No.15)

Ser—Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val；或

  HBenv335—344(Seq.ID No.16)

  Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val—Gln.

9.如权利要求8的肽，与致免疫的脂蛋白质载体结合。

10.如权利要求9的肽，悬浮于含有脂质体的药物可接受的载体中。

11.治疗或防治乙型肝炎病毒感染的方法，包括给具有HLA—A2单型的宿主以有效剂量的肽给药，其中的肽是含有以下序列的可诱导CTL的肽：

HBenv183—191(Seq.ID No.1)

Phe—Leu—Leu—Thr—Arg—Ile—Leu—Thr—Ile.

12.治疗或防治乙型肝炎病毒感染的方法，包括给具有HLA—A2单型的宿主以有效剂量的肽给药，其中的肽是含有8至13个氨基酸可诱导CTL的肽，其中至少大部分氨基酸与具有序列

  HBenv248—260(Seq.ID No.2)

  Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu，或

  HBenv335—343(Seq.ID No.10)

  Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val的HBenv的相应部分同源。

13.如权利要求12的方法，其中可诱导CTL的肽是：

  HBenv248—257(Seq.ID No.3)

  Phe—Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；

  HBenv249—257(Seq.ID No.4)

  Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu；

  HBenv249—258(Seq.ID No.5)

  Ile—Leu—Leu—Leu—Cys—Ieu—Ile—Phe—Leu—Leu；

  HBenv250—258(Seq.ID No.6)

  Leu—Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu；

  HBenv251—259(Seq.ID No.7)

  Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val；或

HBenv251—260(Seq.ID No.8)

Leu—Leu—Cys—Leu—Ile—Phe—Leu—Leu—Val—Leu。

14.如权利要求13的方法，基中宿主经慢性乙型肝炎病毒感染或是乙型肝炎病毒的携带者。

15.如权利要求12的方法，其中可诱导CTL的肽是：

HBenv335—343(Seq.ID No.10)

Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val；

HBenv334—343 (Seq.ID.No.15)

Ser—Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val；或

HBenv335—344(Seq.ID.No.16)

Trp—Leu—Ser—Leu—Leu—Val—Pro—Phe—Val—Gln.

16.如权利要求12的方法，其中宿主经急性乙型肝炎毒感染。

17.如权利要求12的方法，其中可诱导CTL的肽被预防性地给药。

18.如权利要求13的方法，其中宿主经慢性乙型肝炎感染或是乙型肝炎病毒的携带者。

19.如权利要求12的方法，其中可诱导CTL的肽与可产生对HBVT助应答的第二肽一起给药于宿主。

20.如权利要求19的方法，基中可诱导CTL的肽与可诱导T助的肽相连接。

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