CN1305527C - 乙型肝炎治疗疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乙型肝炎治疗疫苗及其制备方法，包括将乙型肝炎表面抗原和一蛋白载体进行偶联形成结合物，该结合物中的乙型肝炎表面抗原与蛋白载体发生化学共价偶联。本发明可以采用绿脓杆菌制剂为佐剂。本发明中乙型肝炎面抗原和蛋白载体偶联后形成的结合物可诱导机体产生针对乙型肝炎表面抗原较高且特异的细胞免疫和体液免疫反应，由此结合物制备的新型偶联治疗疫苗可用于临床上治疗乙型肝炎患者和健康人预防乙型肝炎病毒感染。

Description

乙型肝炎治疗疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种乙型肝炎治疗疫苗。具体而言，本发明涉及一种乙型肝炎表面抗原和一蛋白载体偶联的治疗疫苗。更具体而言，本发明涉及一种含有乙型肝炎表面抗原与破伤风类毒素经化学偶联而成的结合物，再经适宜配制成为治疗疫苗。本发明还涉及这种治疗疫苗的制备方法。

技术背景

乙型肝炎是严重影响人类健康的传染性疾病之一，全世界约有3.5亿人为慢性携带者(Lee，W.M.等人，N Engl J Med，337：1733-45，1997)。我国是乙型肝炎高发流行区，约有1亿人口携带乙肝表面抗原，慢性乙肝病人约2000～3000万。慢性乙肝是引起肝硬化、肝癌的最主要原因(Wright，T.L.等人，Lancet，342：1340-4，1993)。目前为止，尚无有效的治疗药物和治疗手段，乙型肝炎成为重大的社会卫生问题。

抗病毒治疗是清除乙肝病毒，减少并发症，防止肝纤维化的措施之一。目前抗病毒药物疗效明确的有干扰素和拉米夫啶，其他药物如胸腺素、白介素-12、泛昔洛韦等也有一定的抗病毒作用。干扰素既能抑制病毒复制，又能调节宿主免疫功能。但干扰素的持续有效率仅为20％，且治疗费用昂贵，难以推广应用，尤其对ALT正常的病人效果较差(Hoonfnagle，J.H.等人，N Engl J Med，336：347-356，1997)。拉米夫啶口服吸收好，在肝细胞内磷酸化为三磷酸拉米夫啶，通过抑制HBV-DNA逆转录酶和DNA多聚酶的活性而起到抗病毒作用，但拉米夫啶停药后复燃及长期用药后耐药株的出现是急待解决的问题(Dienstag，J.L.等人，N Engl J Med，333：1657-1661，1995)。

乙型肝炎慢性化机制十分复杂，其中免疫耐受是形成慢性化的机制之一。乙型肝炎慢性化为HBV抗原和感染宿主相互作用的结果，特异性免疫治疗是打破免疫耐受的方法之一。治疗性乙肝疫苗可通过改变抗原提呈和加工途径，激活耐受机体的免疫应答，从而打破免疫耐受，改变慢性乙肝的临床过程。研究表明乙肝疫苗或乙肝疫苗合用免疫调节剂可打破转基因小鼠的免疫耐受，具有较好的治疗前景(Mancini.M.等人，J Med Virol，39：67-74，1993)。

目前，葛兰素史克公司和美国Cytel等公司均已有治疗性疫苗进入临床考核阶段。近年来，国内治疗性乙肝疫苗发展迅速，乙肝表面抗原和乙肝免疫球蛋白复合物制剂，已经I期临床证明安全性好，正在进行II期临床考核；多肽表位疫苗已批准进入I期临床，此外作为免疫调节剂使用的60μg剂乙肝疫苗也进入审评阶段。

乙肝抗原作为治疗性乙肝疫苗的主要成分，在临床应用具有良好的前景：具实用性，多年来已积累了丰富的临床经验，证明安全性好，价格低廉，治疗方案较易接受，但疗效仍无定论，可能与选择疫苗的种类、剂量、佐剂成分以及治疗对象的选择等因素有关。研究方向应从疫苗剂量的增加、免疫调节剂的配合，给药途径，或与干扰素抗病毒药物联合应用，特别是新型疫苗佐剂等方面深入研究。

乙肝缺乏动物模型，药效学评价困难。单用乙肝疫苗不易打破免疫耐受，必须辅助以能增加乙肝疫苗的细胞免疫反应免疫增强剂，而如何选择和使用免疫增强剂是治疗性乙肝疫苗研究的难点。近期研究表明，早期诱导特异性的TH1类细胞反应是治疗乙肝的关键，因此研究的重点应为寻找能增加特异性细胞免疫反应的免疫增强剂或类似物(佐剂)。

免疫实践证明，细菌荚膜多糖属于T细胞非依赖性抗原，其免疫效果与接种对象的年龄明显相关，婴幼儿的免疫系统发育尚不完善，接种多糖疫苗后不能有效激活T辅助细胞和T记忆细胞，不能诱导产生免疫回忆反应，因而，免疫保护时间短暂，再次免疫接种也不能产生加强免疫效应。例如，脑膜炎球菌多糖抗原虽能诱导产生IgM和IgG抗体，但人类所产生的IgG主要是：IgG2亚类，而人血清IgG2亚类抗体出现较迟，一般要到8～12岁才能上升至成人水平。这可能与分泌IgG2亚类抗体的B淋巴细胞发育迟缓有关。故此，婴幼儿接种多糖疫苗后，产生只有短暂作用的IgM抗体为主。为提高多糖疫苗的免疫效果，主要办法是将多糖抗原与蛋白载体结合，使多糖抗原由T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原。研究表明，多糖与蛋白载体结合后，T细胞能识别载体，刺激B细胞对多糖产生应答，并能诱导T细胞介导的免疫回忆反应使更多的B细胞产生特异性抗体。

已经发现，细菌多糖和一蛋白载体偶联后的效果在Hib(b型流感嗜血杆菌)结合疫苗和C群脑膜炎球菌结合疫苗中得到了验证。多糖和蛋白载体偶联后，T细胞能识别载体，刺激B细胞对多糖产生抗体应答，并能诱导T细胞免疫记忆反应。上述结合疫苗均能产生足够.高水平的抗荚膜IgG抗体和有免疫记忆的B细胞。目前已有4种蛋白载体用于结合疫苗，破伤风类毒素、突变无毒白喉毒素(CRM197)、白喉类毒素和B群脑膜炎球菌外膜蛋白。

破伤风梭菌在适宜培养基上生长繁殖的过程中所产生的破伤风毒素是一种由1,315个氨基酸所组成的、分子量为150,700的单纯蛋白质。破伤风毒素是一种外毒素，最初是在菌体内形成单一多肽链，当从菌体释放出后便形成具有轻链和重链的以双硫键相连的多肽链。破伤风毒素经甲醛脱毒处理后转变成类毒素，依然保留良好的破伤风抗原的免疫原性，而其毒力降低并不引起相应症状(Gapta，R.K.et al，J.of Biol.Stand.，1985，13：355～359)。

鉴于上述原因，本发明采用蛋白载体和乙肝表面抗原经化学共价偶联。该蛋白载体作为免疫增强剂诱导机体产生对乙肝表面抗原的细胞免疫反应，从而达到打破乙肝病人的免疫耐受，改变慢性乙肝的临床过程的目的。

目前最常用的人用疫苗佐剂仍为氢氧化铝和磷酸铝。而APC佐剂、T细胞佐剂，可选择性诱导T细胞免疫，有效控制和杀伤细胞内病原体和肿瘤细胞，故为研究的重点。近年来，TH1极化佐剂的研究已成为研究热点。一些佐剂配方包括微生物来源的FCA、MDP、MPL、细胞因子如IL-12、r-IFN、脂质体等均可刺激小鼠产生TH1应答，可望成为用于免疫治疗的新型疫苗佐剂或免疫调节剂。

鉴于上述原因，本发明将乙肝表面抗原与破伤风类毒素为代表的蛋白载体经化学偶联行成的结合物，以绿脓杆菌制剂作为佐剂，再经适宜配制成为乙型肝炎治疗疫苗。该治疗疫苗用于临床上治疗乙型肝炎患者和健康人预防乙型肝炎病毒感染。

发明内容

为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种新的疫苗，特别是，本发明提供了一种乙型肝炎表面抗原和一蛋白载体化学共价偶联而成的乙型肝炎治疗疫苗。优选的是，含有以破伤风类毒素为载体的并与乙型肝炎表面抗原经化学偶联形成的共价结合物为主要成份的乙型肝炎治疗疫苗，用以临床上治疗乙型肝炎患者和健康人预防乙型肝炎病毒感染。

本发明还提供了一种制备乙型肝炎治疗疫苗的方法，该方法包括：

(A)将2.5～90微克乙型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白载体偶联结合形成偶联物；

(B)将乙型肝炎表面抗原和蛋白载体的偶联物经配制而成一种乙型肝炎治疗疫苗。

其中所述的蛋白载体是选自破伤风类毒素、白喉类毒素、无毒性白喉变异株CRM197毒素和B群脑膜炎球菌外膜蛋白群组的任何一种。优选的是，所述的蛋白载体是破伤风类毒素。本发明的疫苗可以用铝佐剂和/或缓冲生理盐水配制。

在本发明，乙型肝炎表面抗原可以与作载体的破伤风类毒素经化学偶联形成共价结合物，再将此共价结合物配制成一种新的乙型肝炎治疗疫苗的方法。

本发明所用乙型肝炎表面抗原为商品化的基因工程乙肝抗原，其来源包括酵母细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等表达系统。乙型肝炎表面抗原的制备方法见《中国生物制品制品规程》(化学工业出版社，2000年，175～183页)。

本发明所用破伤风类毒素是指商品化破伤风类毒素，如精制破伤风类毒素。破伤风类毒素的制备方法见《中国生物制品制品规程》(化学工业出版社，2000年，213～218页)

本发明的一个实施方案中，作为载体的蛋白可以是破伤风类毒素、突变无毒白喉毒素(CRM197)、白喉类毒素和B群脑膜炎球菌外膜蛋白中的任何一个。这里给出的破伤风类毒素仅仅是为了例示性说明本发明，如果满足需要也可采用其它蛋白载体。

本发明采用溴化氰(CNBr)活化乙型肝炎表面抗原，以虎铂酰亚胺(SPDP)为双功能亲核间隔基，是之形成乙型肝炎表面抗原虎铂酰亚胺衍生物。进一步通过碳二亚胺(EDAC)介导的缩合作用与破伤风类毒素共价结合，获得乙型肝炎表面抗原-破伤风类毒素偶联结合物。再经超滤浓缩，柱层析纯化获得的高分子偶联结合物，经除菌过滤、配制、稀释分装成为治疗疫苗。

如上所述，在乙型肝炎表面抗原和破伤风类毒素形成偶联物的过程中，可以由单个乙型肝炎表面抗原经活化后可能有多个位点同时结合多个破伤风类毒素。同样也可以由活化后的单个破伤风类毒素的多个位点同时结合多个乙型肝炎表面抗原。乙型肝炎表面抗原和破伤风类毒素的结合并不限定于1∶1，也就是一个乙型肝炎表面抗原分子上可以偶联上1个或者多个破伤风类毒素分子；同样地，一个破伤风类毒素分子上可以偶联上1个或者多个乙型肝炎表面抗原分子。在乙型肝炎表面抗原和破伤风类毒素的偶联中，优选发生乙型肝炎表面抗原和破伤风类毒素的一一对应的结合。但是如上所述，乙型肝炎表面抗原和破伤风类毒素的各种结合只要并不影响本发明的治疗疫苗所能达到的效果，那么所有这些偶联中的细节变化均应包括在本发明范围之内。

本发明所述的乙型肝炎表面抗原与破伤风类毒素的偶联方法仅仅是用于说明，所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的偶联过程，因此任何用于蛋白分子偶联的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。

在本发明的治疗疫苗中，乙型肝炎表面抗原每剂免疫剂量为2.5～90微克之间，蛋白载体，例如破伤风类毒素，含量在5～60微克之间，至于用量的上限，本领域的技术人员可以根据治疗疫苗临床使用的常规实践灵活掌握。

本发明的治疗疫苗中可以进一步添加绿脓杆菌制剂作为佐剂，增强治疗疫苗的免疫应答水平。

在本发明的治疗疫苗中可以进一步添加吸附佐剂，例如氢氧化铝和/或磷酸铝等铝佐剂。使用时，可以对本发明的治疗疫苗进行稀释，合适的稀释液的不限定的实例有缓冲生理盐水稀释液。

总之，目前还没有一种新的利用乙型肝炎表面抗原与一种蛋白载体经化学偶联而成的治疗疫苗。本发明通过将乙型肝炎表面抗原和蛋白载体进行化学偶联，以绿脓杆菌制剂作为佐剂，得到新型的乙型肝炎治疗疫苗。该治疗疫苗可特异性的诱导细胞免疫和体液免疫，用于临床上治疗乙型肝炎患者和健康人预防乙型肝炎病毒感染。

本发明的另一重点是，采用绿脓杆菌制剂为佐剂，优选的是以绿脓杆菌MSHA菌毛株制剂。本发明首次将绿脓杆菌MSHA菌毛株制剂(PA)作为佐剂加入乙型肝炎治疗疫苗中。用MSHA菌毛株制备的绿脓杆菌制剂已作为治疗肿瘤的药物上市，该制品能调整人体体液免疫和细胞免疫的不平衡状态，增加巨噬细胞和NK细胞的活性，维持T细胞的数量与比例，调节白细胞介素-2、干扰素与抗体的协同作用(中国生物制品规程，化学工业出版社，2000年，265页)。

本发明治疗性乙肝疫苗具有较高的安全性，理由如下：

1.乙肝表面抗原：乙肝表面抗原作为预防性疫苗的主要成分已在世界范围内经数亿人次、近20年的大量应用，应用效果充分证明了其安全性。

2.破伤风类毒素：破伤风类毒素已作为常规疫苗在全世界范围内使用，其良好的安全和保护效果早已公知。

3.绿脓杆菌制剂作为佐剂应用的安全性：绿脓杆菌制剂是中国食品药品监督管理局批准的治疗肿瘤的上市品种，其制造检定规程已列入《中国生物制品制品规程》(2000年版)。绿脓杆菌制剂临床应用的安全性已被证实。

4.乙肝表面抗原与破伤风毒素偶联后的安全性：在整个偶联过程中采用了透析、超滤、柱层析等综合措施，有效地去除了化学试剂的残余物和小分子量物质，保证了制品的安全性。

5.乙肝治疗疫苗的安全验证：经异常毒性实验证实乙肝治疗疫苗在动物体内有良好的安全性。

附图说明

图1：乙肝抗原与TT偶联后免疫小鼠体液免疫反应，其中：ED50单位为稀释度，HbsAg+TT：乙肝抗原与TT偶联，HbsAg+AL-TT：乙肝疫苗(含铝佐剂)与TT混合，HbsAg+Al：乙肝疫苗(含铝佐剂)，HbsAg-TT：乙肝抗原与TT混合。

图2：乙型肝炎表面抗原偶联TT与与PA混合组诱导体液免疫反应，其中，HBsAg+TT：乙肝抗原与TT偶联，HBsAg+TT+PA：乙肝抗原与TT偶联混合PA，HBsAg+Al：乙肝疫苗(含铝佐剂)。

图3：乙型肝炎治疗疫苗诱导抗体的IGg2a/IGg1比值，其中G1：乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合组；G2：乙肝疫苗组；G3：乙型肝炎表面抗原偶联TT组。

图4：治疗性乙肝疫苗免疫小鼠脾细胞ELISPOT检测γ-IFN结果。

图5治疗性乙肝疫苗免疫小鼠脾细胞ELISPOT检测IL-2结果。

图6治疗性乙肝疫苗不同剂量HBsAg免疫小鼠脾细胞ELISPOT检测γ-IFN结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例描述本发明以破伤风类毒素为蛋白载体与乙型肝炎表面抗原通过化学偶联形成共价结合物，经配制成治疗疫苗，并经动物试验证明该治疗疫苗具有可靠的安全性和显著的免疫原性。

实施例1

乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和精制破伤风类毒素(TT)共价偶联物的制备

取浓度为1～2mg/ml的HBsAg，加0.5～1.0mg/ml溴化氰(CNBr)活化，在23±3℃下作用0.5～1小时，维持PH8.2～10。加N-琥铂酰亚胺-3-(2-硫代吡啶)丙酸(SPDP)2.5～4mg/ml活化物，维持PH8.2～10.0，作用10～30分钟。于2～8℃搅拌10～20小时，透析去除小分子物质。加浓度为2～4mg/ml的等体积TT混合均匀，加入碳二亚胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5～15℃作用0.5～1小时，调PH5～7。偶联原液经300KD透析膜在0.2M NaCl溶液透析12～15小时。收集透析后结合物，经Sephacryl S 400柱层析，用0.15～0.2M NaCl洗脱，收集V₀峰附近高分子量结合物。除菌过滤后无菌保存于2～8℃。

实施例2乙型肝炎治疗疫苗配制和稀释分装(无佐剂)

根据乙型肝炎表面抗原和破伤风类毒素偶联物中乙型肝炎表面抗原含量测定结果，用缓冲生理盐水无菌稀释分装，使每剂治疗疫苗为；≥0.5ml分装量、含有乙型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破伤风类毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克。

实施例3

乙型肝炎治疗疫苗配制和稀释分装(含佐剂)

根据乙型肝炎表面抗原和破伤风类毒素偶联物中乙型肝炎表面抗原含量测定结果，用氢氧化铝稀释液无菌稀释分装，使每剂治疗疫苗为；≥0.5ml分装量、含有乙型肝炎表面抗原2.5～90微克、含有破伤风类毒素5～60微克、pH 5.5～7.2、硫柳汞30～70微克、氢氧化铝0.35～0.70毫克。

实施例4

乙型肝炎治疗疫苗安全性研究：

对乙型肝炎治疗疫苗的安全性进行考核，分别采用小鼠、豚鼠异常毒性试验法，考核其安全性。

选用豚鼠、腹腔接种5ml乙型肝炎治疗疫苗，分别于免前、免后7天称体重，并每日观察接种反应。

选用SPF级Balb/C小鼠，腹腔接种0.5ml乙型肝炎治疗疫苗，分别于免前、免后7天称体重，并每日观察接种反应。

实验结果列于表1、表2。

            表1.乙型肝炎治疗疫苗豚鼠安全性试验

疫苗批号

接种前体

接种后7天体重

观察期接种反应

结论

	重(克)	(克)
					HB200201	268272	355343	健存，体重增加无异常反应	合格
HB200202	302298	378369	健存，体重增加无异常反应	合格
					HB200203	290285	360349	健存，体重增加无异常反应	合格

           表2.乙型肝炎治疗疫苗小鼠安全性试验

疫苗批号	接种前体重(克)	接种后7天体重(克)	观察期接种反应	结论
					HB200201	19.518.819.319.020.5	24.023.823.323.724.0	健存体重增加无异常反应	合格
HB200202	18.720.320.521.019.1	24.525.324.625.424.7	健存体重增加无异常反应	合格
					HB200203	20.919.618.619.719.9	25.023.924.125.124.5	健存体重增加无异常反应	合格

异常毒性试验表明乙型肝炎治疗疫苗具有可靠的安全性。

实施例5

乙型肝炎表面抗原偶联TT诱导动物体液免疫的研究-ED₅₀测定

将乙肝表面抗原与破伤风类毒素偶联物，乙肝表面抗原与破伤风类毒素(TT)混合物，乙肝疫苗与破伤风类毒素混合物和乙肝疫苗分别稀释4、16、64、256倍后，腹腔注射BALB/e小鼠，原倍抗原为含10μg HbsAg，每组10只小鼠。免疫后4周时，采集血清，应用RIA试剂检测乙肝表面抗体。应用Reed-Munch法计算ED50。由图1可见乙肝疫苗-TT偶联组抗体效力最高(6.68)，显著高于乙肝疫苗与TT混合组(2.59)，乙肝疫苗与TT混合组(0)和乙肝疫苗组(4)(P＜0.01)。其次为乙肝疫苗与TT混合组和乙肝疫苗组，而乙肝表面抗原与TT混合组免疫小鼠后检测不到抗体反应。

实施例6

乙型肝炎表面抗原偶联TT与绿脓杆菌制剂(PA)混合诱导体液免疫的研究：

将乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合后，稀释4、16、64、256倍后腹腔注射BALB/c小鼠。每组10只，对照组为表面抗原混合PA组，氢氧化铝佐剂疫苗组。免疫、采集血清、检测乙肝表面抗体和ED50统计方法同前。

由图2可见乙肝疫苗-TT偶联组和乙肝疫苗-TT偶联混合PA组抗体效力显著高于乙肝疫苗组(19.0；28.9；5.0，P＜0.01)；而乙肝疫苗-TT偶联混合PA组诱导抗体反应又明显高于乙肝疫苗-TT偶联组，提示混合PA可进一步增高乙型肝炎表面抗原偶联TT的抗体反应。

实施例7

乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合组诱导体液免疫抗体亚型的研究：

将乙型肝炎表面抗原偶联TT组及乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合组，稀释4、16、64、256倍后腹腔注射BALB/c小鼠。每组10只，对照组为氢氧化铝佐剂疫苗组。免疫、采集血清等方法同前，应用酶联免疫方法分别检测抗-HBs IgG、IGg2a和IGg1。结果见图3。

由图3可见乙肝治疗性疫苗组免疫小鼠诱导IGg2a/IGg1比例(1.1412)显著高于乙型肝炎表面抗原偶联TT组(0.421)和乙肝疫苗组(0.235)(P＜0.01)，表明乙肝治疗性疫苗可诱导高水平IGg2a，即可诱导较强的TH1细胞反应。

实施例8

乙型肝炎表面抗原偶联破伤风类毒素(TT)与PA混合组诱导特异性细胞因子的研究：

将乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合后，背部皮下免疫小鼠，其中HBsAg的含量均为3μg/只，分别按实验组和对照组每组10只小鼠，共5组。分别于第5日、10日、15日放血处死。按常规制备脾悬液并经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(MNC)，用完全培养基(含15％胎牛血清的RPMI-1640培养液)调整细胞浓度至2×10⁶ml^-1，，于24孔培养板上每孔加入1000μl该悬液，200μl HBsAg多肽，HBsAg的终浓度为50μg·ml^-1，培养板置37℃、5％CO₂条件下培养5天，收集上清。分别用ELISPOT试剂盒检测细胞因子γ-IFN和IL-2。

由图4，5、6可见，在小鼠免后5、10和20天时，诱导CTL效应细胞因子γ-IFN或IL-2产生的能力均以乙肝治疗性疫苗与PA混合组最高，其次为乙肝治疗性疫苗组，均显著高于疫苗对照组。

应用含1、3和6μg HBsAg的乙肝治疗性疫苗与PA混合组、乙肝治疗性疫苗组、疫苗对照组分别免疫小鼠，在免后10天时处死，应用ELISPOT试剂盒检测γ-IFN。结果表明随免疫HBsAg含量增加，乙肝治疗性疫苗组和乙肝治疗性疫苗与PA混合组诱导γ-IFN细胞数明显升高，3和6μg HBsAg的乙肝治疗性疫苗组及与PA混合组显著高于1μg组(P＜0.05)；而6μg乙肝治疗性疫苗组及与PA混合组与3μg组间无显著差异(P＞0.05)。

实施例9

HBsAg转基因小鼠打破免疫耐受的研究

分别应用乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合组、乙肝治疗性疫苗组、乙肝疫苗对照组，免疫HBsAg转基因小鼠，其中HbsAg含量均为3ug，免疫3次后1周时处死，检测HBsAg、抗-HBs。

 表3治疗性乙肝疫苗免疫转基因小鼠后打破免疫耐受的研究

组别	免前阳性数		免后阳性数
					HBsAg	抗-HBs	HBsAg	抗-HBs
	乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合组	10	0	3					7
乙型肝炎表面抗原偶联TT					10	0	5	5
	乙肝疫苗组	10	0	9					1

参见表3，结果表明，乙型肝炎表面抗原偶联TT组和乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合组均能显著增强打破转基因小鼠的免疫耐受，而对照乙肝疫苗组10只小鼠免疫3次后，仍有9只HBsAg阳性，提示乙肝治疗性疫苗的治疗前景。

综上：从诱导体液免疫，抗体亚型；特异性CTL效应细胞因子测定、转基因小鼠打破免疫耐受的研究等方面证明了乙型肝炎表面抗原偶联TT(HBsAg+TT)的治疗作用；同时研究发现，乙型肝炎表面抗原偶联TT与PA混合组(HBsAg+TT+PA)组免疫效果更优。

Claims (12)

1.一种乙型肝炎治疗疫苗，由基因工程乙型肝炎表面抗原和一蛋白载体化学共价偶联而成，其中所述的蛋白载体是选自破伤风类毒素、白喉类毒素、无毒性白喉变异株毒素CRM197和B群脑膜炎球菌外膜蛋白群组的任何一种。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，所述的基因工程乙型肝炎表面抗原来源包括酵母细胞和中国仓鼠卵巢细胞表达系统制备的乙型肝炎表面抗原。

3.根据权利要求1所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，所述化学偶联由单个乙型肝炎表面抗原经活化后的多个位点同时结合多个蛋白质载体实现的。

4.根据权利要求1所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，所述的化学偶联由单个蛋白质载体经活化后的多个位点同时结合多个乙型肝炎表面抗原实现的。

5.根据权利要求1所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，所述的乙型肝炎表面抗原的含量在每毫升2.5～90微克之间，蛋白载体含量在5～60微克之间。

6.根据权利要求1-5之一所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，用铝佐剂和/或缓冲生理盐水配制。

7.根据权利要求1-5之一所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，以绿脓杆菌制剂为佐剂。

8.根据权利要求7所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，所述的绿脓杆菌制剂为绿脓杆菌MSHA菌毛株制剂。

9.根据权利要求1-5之一所述的乙型肝炎治疗疫苗，其特征在于，其制剂包括脂质体、纳米级颗粒以及它们的冻干粉形式的制剂。

10.权利要求1所述的乙型肝炎治疗疫苗的制备方法，该方法包括：

(A)将2.5～90微克乙型肝炎表面抗原和5～60微克的蛋白载体偶联结合成偶联物；

(B)将乙型肝炎表面抗原和蛋白载体的偶联物经配制而成一种乙型肝炎治疗疫苗。

11.根据权利要求10所述的制备乙型肝炎治疗疫苗的方法，其特征在于，所述的蛋白载体是选自破伤风类毒素、白喉类毒素、无毒性白喉变异株毒素CRM197和B群脑膜炎球菌外膜蛋白群组的任何一种。

12.根据权利要求11所述的制备乙型肝炎治疗疫苗的方法，其特征在于，所述的蛋白载体是选自破伤风类毒素。

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