CN1228086C - 联合疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种联合疫苗的制备方法，所述联合疫苗能同时预防多种疾病，例如，预防应该在婴儿中预防的白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎。根据本发明，联合疫苗的制备方法包括以下步骤：将针对各种疾病，如应在婴儿中预防的白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎的每种保护性抗原独立地吸附到氢氧化铝凝胶吸附剂上；和吸附后使吸附到吸附剂上的各种保护性抗原联合。在本发明中，可以使用本发明制备的联合疫苗来同时预防多种疾病，例如，预防应该在婴儿中预防的白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎。

Description

联合疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及联合疫苗的制备方法，所述联合疫苗能同时预防婴儿的各种疾病，例如，预防应该在婴儿中预防的白喉、破伤风、百日咳、乙型肝炎和其它疾病。
背景技术
联合疫苗是指通过联合对于其它多种感染性疾病而言的每种疾病的保护性抗原而制成的疫苗或通过联合预防某种感染性疾病的多种相关抗原而制成的疫苗。
前者的例子包括能提高对白喉、破伤风和百日咳的免疫力的DTP疫苗，能提高对麻疹、流行性腮腺炎和风疹的免疫力的MMR疫苗等。上述疫苗已经使用了20年。后者的例子包括通过联合14或23种肺炎球菌多糖制成的能提高对肺炎的免疫力的肺炎球菌疫苗，和通过联合4种脑膜炎球菌多糖制成的能提高预防脑膜炎的免疫力的脑膜炎球菌疫苗等等。上述疫苗已经使用了几年。
因为公认上述疫苗对于各种感染性疾病具有高度致免疫能力和较低的副作用，而且对预防各种疾病具有很好的适应性，上述疫苗已经使用了许多年。由于上述同样原因，疫苗开发者最近正在研制多种联合疫苗。作为上述联合疫苗，通过联合DTP疫苗、细菌性脑脑膜炎疫苗(Hib疫苗)、灭活的脊髓灰质炎疫苗和乙型肝炎疫苗制得了疫苗(国际公布号：WO99/13906)。某种联合疫苗是通过联合与蛋白接合的肺炎球菌和脑膜炎球菌多糖制得的。不久将会研制出能预防由霍乱、伤寒、痢疾和腹泻的各种致病细菌引起的肠道感染的疫苗。
通过联合各种抗原制备的用以预防各种其它感染性疾病的联合疫苗有利于减少接种次数、简化疫苗供应从而降低成本。根据儿科协会(Pediatrics Association)推荐的婴儿疫苗接种程序(1997)，婴儿在出生后1年内要接受多次注射，因为便利或生病的原因，疫苗的注射有时与不同的疫苗重叠。因此，以正确的方法为基础接种婴儿从而给接种者和被接种者提供某种便利是非常重要的。特别地，作为标准化的疫苗接种程序，接种DTP和乙型肝炎疫苗要在婴儿第一年中进行三次基础注射并要加强注射。另外，由于推荐的疫苗接种程序相似，所以会发生重叠注射的问题。
为了给接种者和被接种者的疫苗接种提供某种便利，本发明的发明者通过研究开发了DTP和乙型肝炎疫苗的联合疫苗，并稳定了该疫苗的供应，从而为更多人提供疫苗接种的益处。
由于联合疫苗的研究主要是联合来自具有免疫性和稳定性的疫苗产品的各种组分抗原，因此，上述研究中联合方法的研制对于使因各保护性抗原和吸附剂间相互作用而产生的反应和免疫性的变化降至最小是重要的。随着研制的完成，评估了本发明的联合疫苗制剂的均一性和稳定性。在本发明中，研究是以已被证实了具有免疫性和稳定性的DTP疫苗和乙型肝炎疫苗为基础进行的。
联合各种组分疫苗的方法包括将各种组分疫苗简单联合的方法(国际公布号：WO 99/13906和WO 00/7623)，在进行疫苗接种时用特殊设计的容器同时施用的方法(国际公布号：WO 99/13906)和通过将疫苗的各种组分和配料混合到一个制剂中来联合疫苗的制备方法。考虑到疫苗的供应，由前两种方法制备的联合疫苗的用法与每种单价疫苗独立使用相似，它比每种单价疫苗更需要注意疫苗的操作，因此使用这种形式的联合疫苗并没有什么好处。另外，不可能针对免疫性变化和副作用的产生进行研究。因此，在联合疫苗的研究中，作为一种产品优选将每种疫苗组分混合到一个制剂中。
发明内容
本发明的目的是提供一种联合疫苗的制备方法，所述联合疫苗能预防婴儿的各种疾病，例如，预防应该在婴儿中预防的白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎。
相应地，本发明的一个目的是提供联合疫苗的制备方法，所述联合疫苗能同时预防婴儿的多种疾病，例如，预防应该在婴儿中预防的白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎。
为达到上述目的，提供了一种联合疫苗的制备方法，该方法包括：
将针对各种疾病的每种保护性抗原独立地吸附到吸附剂上的吸附步骤；和
将上述吸附到吸附剂上的每种保护性抗原混合的联合步骤。
本发明还提供了下述方法，其中保护性抗原是从包括白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原、乙型肝炎抗原或其中的两种或多种组合中选择出的抗原。
本发明还提供了其中吸附剂是氢氧化铝凝胶的方法。
为达到上述目的，本发明提供一种根据上述任一方法生产的联合疫苗。
更特别地，本发明提供一种联合疫苗的制备方法，该方法包括针对各种疾病，如应在婴儿中预防的白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎，将每种保护性抗原独立地吸附到氢氧化铝凝胶吸附剂上的步骤；和吸附后使吸附到吸附剂上的各种保护性抗原联合的步骤。
本发明的抗原并不局限于提到过的疾病而是适用于各种疾病的各种抗原。
附图说明
参考附图将可更好地理解本发明，附图只是用来说明本发明，因此不能限定本发明，其中：
图1显示以吸附剂浓度为基础各种组分抗原的吸附比率。白喉类毒素、破伤风类毒素和乙型肝炎病毒表面抗原是白喉抗原、破伤风抗原和乙型肝炎抗原的组分，百日咳类毒素和百日咳FHA抗原(百日咳丝状血凝集素微粒)是纯化的百日咳抗原的各种组分。
图2a到2d显示以吸附方法为基础的抗原性和免疫性，其中样品1是在各种组分疫苗的联合完成之后加入过量的氢氧化铝凝胶，样品2是在联合完成之前预先加入同样浓度的上述吸附剂；图2a和2b分别显示样品1和2的相对抗原性，图2c和2d分别显示与样品1和2中每种抗原对应的抗体形成的相对水平。
图3显示以每只猴子收集的血液样品数据为基础，与猴子来源的血清中每种抗原对应的抗体形成的水平，其中这些猴子已被施用了根据本发明制备的联合疫苗或同时施用了DTP和乙型肝炎的各种疫苗产品。指定组1同时施用DTP和乙型肝炎的各种疫苗，指定组2施用联合疫苗。
具体实施方式
制备包括各种疫苗组分的联合疫苗的方法分为两步：作为一种产品使形成各种组分疫苗的抗原联合并用吸附剂进行吸附的步骤；和在所述方法中吸附剂作为一种组分的情况下，使预先被吸附的抗原联合的步骤。然而，在预先混合各种组分抗原的情况下，由于溶液中抗原和配料之间的相互作用，各种抗原吸附剂的吸附能力可能下降。另外，在各个独立的条件下优化吸附剂和组分抗原间的吸附。如果上述吸附过程同时进行，由于各种组分抗原吸附条件的不同，吸附比率可能下降。因为组分抗原的吸附剂的吸附比率和疫苗的免疫性之间的相互关系成反比，因此，与每种单价疫苗的免疫性相比，通过同时进行的过程制备的联合疫苗的免疫性可能会下降。
因此，本发明的发明者认为通过制备每种组分抗原的本体溶液、独立地进行每种抗原的吸附，再将吸附的抗原联合的方法制备的联合疫苗是合适的。
另外，在将各组分抗原以各种吸附形式联合的情况下，为了比较疫苗产品中疫苗抗原的免疫性和特性，在联合疫苗中各组分抗原的终浓度应该与各种传统的单价疫苗中各组分抗原的浓度相同。因此，为制备联合疫苗，要吸附并联合比单个疫苗浓度更高的组分抗原。DTP疫苗是以用浓缩了1.5～2倍的抗原的吸附为基础制备的，乙型肝炎疫苗是用浓缩了2～3倍的抗原制备的。根据本发明，通过调节每种抗原的联合比率，联合疫苗的各种组分抗原的终浓度与各种单个疫苗的浓度是一致的。
在本发明中，发明者为开发联合疫苗进行了各种联合的研究。在这种情况下，疫苗产品中各种免疫组分的最终含量是和单价疫苗的含量一样的。另外，每种抗原吸附比率的变化通过控制吸附剂和其它组分的含量来监控。给小动物接种免疫吸附比率有很少变化的每种样品以比较抗体形成的水平。通过评估小动物中抗体形成的结果选出合适的联合方法。
另外，对当前商购的DTP疫苗和乙型肝炎疫苗的吸附剂的评估结果显示，主要使用氢氧化铝凝胶和磷酸铝凝胶。已知蛋白在每种铝凝胶上的吸附是各蛋白和胶组分的表面电荷造成的。也已知氢氧化铝凝胶在生理学pH范围具有正表面电荷，而磷酸铝凝胶具有负表面电荷(“疫苗设计—亚基和佐剂的探讨”(“Vaccine Design-The subunit andadjuvant approach”M.F.Powell&M.J.Newman编辑，1995，页229-239)。在同时使用上述两类铝凝胶的情况下，产生某种相互作用，所以溶液中颗粒大小可能增加，对蛋白的吸附能力可能下降。另外，乙型肝炎疫苗和联合疫苗的各组分抗原的表面电荷在生理学pH范围一般具有负表面电荷。因此，氢氧化铝凝胶适合作为吸附剂。
在传统技术中，吸附剂如氢氧化铝凝胶和磷酸铝凝胶的组分是共同使用的(国际公布号：WO 93/24148)，但基于上述原因，本发明的发明者认为联合疫苗的吸附剂应该有相同的盐类型，作为吸附剂使用的氢氧化铝凝胶是获得各组分抗原某一吸附比率的重要因素。
但是，显然，在本发明中吸附剂涵盖的不仅是氢氧化铝凝胶还有它的等效物。
另外，由本发明制备的联合疫苗中，作为主要组分，除乙型肝炎抗原外，其它组分抗原包括蛋白，而在乙型肝炎疫苗中，抗原一般以包含磷脂层的粒子形式存在。因此，当为本发明制备的联合疫苗制备乙型肝炎疫苗时，为减少其它抗原对包含磷脂层的乙型肝炎疫苗抗原的磷脂组分的某种干扰，优选加入一种中性表面活性剂如聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯80(吐温80)和曲通(Triton)X-100。
因为在中性表面活性剂含量高的情况下，乙型肝炎疫苗的效价有下降的趋势，因此优选加入低于乙型肝炎表面抗原蛋白量的50％质量比的中性表面活性剂，但上述量并不限定于此。
在本发明中，制备白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)PWNo.8作为白喉的抗原并培养于适当的培养基中。优选白喉类毒素，其通过使利用传统方法纯化的白喉毒素脱毒而获得。抗原含量基于儿童剂量优选为10～25Lf。对于破伤风抗原，破伤风梭菌(Clostridium tetanii)，Harvard，在厌氧条件下培养于适当的培养基中。通过使利用传统方法纯化的破伤风毒素脱毒而获得破伤风类毒素是适用的。抗原含量基于儿童剂量优选为1～5Lf。另外，百日咳抗原用百日咳博德特氏菌(BordetellaPertussis)Tohama phase 1培养于适当的培养基中，在培养物上清中多种抗原蛋白包括百日咳类毒素用传统方法提纯并脱毒。纯化的百日咳抗原或全细胞百日咳抗原是适用的。这里，提供联合疫苗的制备方法，其中在多种抗原的情况下，基于儿童剂量，抗原总量低于20μgPN，在全细胞百日咳抗原的情况下，基于儿童剂量，抗原含量优选低于20 OU。本发明还涉及一种联合疫苗的制备方法，其中纯化的多种抗原蛋白包含脱毒的百日咳类毒素和丝状血细胞凝集素(FHA)抗原。
优选地，本发明涉及一种联合疫苗的制备方法，其中重组乙型肝炎表面抗原基于儿童剂量为5～10μg，重组乙型肝炎表面抗原作为乙型肝炎抗原是用遗传工程方法制成的。更优选地，本发明涉及一种制备方法，其中以2～8℃搅拌3～20小时使乙型肝炎表面抗原吸附到吸附剂上。为了找到用以制备联合疫苗的最佳的吸附剂含量，在吸附剂的每个浓度，分析每种抗原组分的吸附比率。结果，在最终联合完成的时候，铝离子的最终浓度低于0.5mg/ml时，每种抗原的吸附比率相对下降(如图1所示)。另外，规章规定用于疫苗的铝凝胶中铝离子浓度在1.25mg/ml以下(WHO，在技术报告系列号800(Technical Report Series No.800)1990，页87～179中“对白喉、破伤风、百日咳和联合疫苗的要求(Requirementsfor diphtheria，tetanus，pertussis，and combined vaccine)”)。因此，对于氢氧化铝凝胶，铝离子的终浓度优选在0.5～1.25mg/ml的范围内，更优选为0.7mg/ml。
另外，甚至是在各组分联合完成之后，为了避免由于各组分抗原间产生的斥力而使得各组分抗原吸附比率下降的可能性，各组分抗原的抗原性和抗体形成水平被转化为相对百分比，以比较以下两种样品中的那些数值：一种样品，除氢氧化铝凝胶外的其它组分被预先联合，然后另外加入过量的氢氧化铝凝胶；和一种样品，在联合完成前预先加入相同浓度的吸附剂。甚至是在各组分的联合完成之后加入过量的吸附剂，抗原性和抗体形成水平的变化也下降(如图2所示)。
另外，在样品中加入聚山梨醇酯80(吐温80)时，仍保持对乙型肝炎的抗原性和效价(如图2所示)。预计甚至当中性表面活性剂如吐温20和曲通X-100以适当的浓度使用时也可获得相似的结果。如图2所示，样品1和2分别是通过在各组分联合完成之后另外加入过量氢氧化铝凝胶的方法和在联合完成之前预先加入相同浓度的吸附剂的方法制备的。
优选地，本发明涉及一种联合疫苗的制备方法，其中氢氧化铝凝胶中铝离子的浓度在0.5～1.25mg/ml的范围内。更优选地，本发明涉及一种联合疫苗的制备方法，其中包括在吸附到吸附剂上的保护性抗原联合后，在铝离子的浓度不超过0.5～1.25mg/ml的范围内加入过量吸附剂的步骤。在本发明的一个优选实施方式中，可以保持联合疫苗中每种组分抗原固有的吸附并提高免疫性。
对于百日咳抗原，韩国和几个其它国家一般使用纯化的百日咳抗原。而一些美洲国家和第三世界国家使用脱毒的全细胞百日咳抗原。因此，在本发明中，联合疫苗的适用范围通过对使用全细胞百日咳抗原的联合方法的研究而扩展。在这种情况下，使用与提及的纯化的百日咳抗原的方法一样的方法进行联合，以获得能保持各组分免疫性的样品(如表1所示)。
在包括全细胞百日咳抗原的DTP疫苗的情况中，一般使用磷酸铝凝胶作为吸附剂。然而，为制备关于乙型肝炎抗原的联合疫苗，DTP疫苗使用氢氧化铝凝胶制备。在这种情况下，对于百日咳的免疫性下降，但是当在各组分联合完成之后另外加入过量的氢氧化铝凝胶时(样品A)，可以保持理想的免疫性。作为参考，样品B通过在联合完成之前预先加入相同浓度的吸附剂的方法制备的。
根据本发明制备的联合疫苗的安全性和效力根据以下方法验证。首先，在啮齿动物身上施用过量的联合疫苗，作为活组织检查的结果没有观察到损害(没有提供该结果)。另外，在对猴子施用联合疫苗的小组(组2)和同时施用DTP和乙型肝炎的每种疫苗的小组(组1)中测量对应于抗原的抗体水平。作为两组间对于抗体数量的t-试验的结果，当将组2的结果与组1的结果比较时，联合疫苗比每种疫苗同时注射的试验组显示出相等或更好的对应于抗原的免疫原性(如图3所示，没有提供统计学结果)。
总之，本发明中发展了联合方法，该方法将不同免疫组分间的相互作用减至最小，而没有减少各种致免疫的效果。当基于物理和化学特性对用于联合疫苗的各种免疫组分分类时，致免疫组分可分为蛋白抗原(白喉抗原、破伤风抗原、纯化的百日咳抗原)，由蛋白和磷脂层组成的抗原(乙型肝炎抗原)，和由灭活的全细胞组成的抗原(全细胞百日咳抗原)等等。因此，可以预测基于组分的物理和化学特性，可实现与其它单一疫苗的抗原的联合。对于疾病(嗜血杆菌流感、脊髓灰质炎)来说另外的疫苗的联合是可能的，这些疾病应该通过根据本发明制备的联合疫苗在婴儿中预防。
本发明的联合疫苗试剂的人体疫苗接种时期可以在DTP疫苗或乙型肝炎疫苗接种时期之前。对于母体内存在乙型肝炎抗原的情况，优选在第二、四和六月接种三次。对于母体内不存在乙型肝炎抗原的情况，作为适当的疫苗接种时期，乙型肝炎疫苗在出生后单独接种，然后用联合疫苗进行加强接种。对于婴儿适合的疫苗接种能通过肌肉或皮下注射的方法进行。本发明的联合疫苗中白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎抗原的剂量分别与用于婴儿的各单一疫苗抗原的剂量相同。
实施例1
乙型肝炎抗原的制备
集约培养通过遗传工程方法可以表达乙型肝炎表面抗原的酵母细胞。通过离心获得的1kg酵母细胞沉淀以1∶2的比例稀释到缓冲液中(0.5M氯化钠，10mM EDTA，0.01％硫柳汞，0.1M磷酸盐，pH7.0)。稀释的溶液流过玻璃珠搅拌器(或Dynomil)破碎细胞壁等。获得的溶液加入0.5％的中性表面活性剂(吐温类或曲通类)，4℃搅拌混合均匀。得到的溶液中加入氢氧化钠至pH11，然后在4℃搅拌混合5小时。得到的溶液中加入稀释的盐酸至pH4。使用离心机(ROTOR：JA-14，Beckman Inc.美国)在6000rpm离心15分钟，除去沉淀，获得含有乙型肝炎表面抗原的上部溶液。上部溶液的pH调至7，然后在其中加入硅石并在4～25℃混合3～16小时，由此将乙型肝炎表面抗原吸附到硅石上。本发明中优选使用的硅胶是含有精细水合硅石或无水硅石的有效表面积为100～500mm2/g的气硅胶380(Degussa，美国)。为除去吸附上乙型肝炎表面抗原的硅石中的杂质，将得到的溶液用pH7的磷酸钠-氯化钠缓冲液冲洗两次。冲洗过的硅石在pH9.6的碳酸钠缓冲液中接触大约2小时从而使表面抗原解吸附。这样分离的表面抗原在溶液中的蛋白纯度超过90％。得到的溶液流过用上述钠盐缓冲液平衡的DEAE-琼脂糖凝胶(PHAMACIA，瑞典)从而特异性附着表面抗原并用上述缓冲液除去柱中分离的物质。轻微附着在柱上的杂质用含有0.05～0.1M氯化钠的缓冲液洗脱。其后，乙型肝炎表面抗原用含有0.2M氯化钠的上述缓冲液洗脱。这样洗脱的溶液用能分离分子量超过100,000的物质的超滤膜浓缩，离心分离并除去沉淀，收集上部溶液，对收集的上部溶液进行凝胶渗透层析(SepharoseCL-4B，PHAMACIA，瑞典)。含有纯化的表面抗原的部分通过电泳验证并用作乙型肝炎抗原。另外，为减少各肝炎表面抗原的相互作用，加入吐温80至每1毫升0、5、10μg，然后观察吐温80的效果(如图2所示)。
实施例2
白喉类毒素的制备
白喉棒状杆菌PW No.8在营养型琼脂培养基(DIFCO，美国)中35℃培养24小时，并传代培养两次。单菌落于35℃在2毫升脑心浸液培养基(DIFCO，美国)中培养24小时，取1.2毫升接种到300毫升的改良的Muller培养基中(参照：Stainer等，Canadian J.Microbiol.，14：155，1968)，并在35℃培养36小时。培养后，从培养液中除去细胞，收集毒素溶液并在4℃加入硫酸铵。制成终浓度为25(w/v)％，pH为8.0的培养液。已经调整pH和盐浓度的培养液滴入已预先用含25(w/v)％的硫酸铵、pH8.0的10mM的tris缓冲液平衡的苯基-琼脂糖凝胶柱中。与柱平衡溶液相同的缓冲液和含有15(w/v)％的硫酸铵的10mM的tris缓冲液(pH8.0)顺序流过柱子从而除去杂质。毒素用不含盐的10mM的tris缓冲液(pH8.0)洗脱。收集洗脱下来的白喉毒素溶液并透析到含150mM氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液中(pH7.4)。在透析过程完成后，加入甲醛液至终浓度为0.05(w/v)％，得到的溶液在37℃反应1小时，加入赖氨酸从而获得0.05M的终浓度，然后得到的溶液在37℃脱毒4周。类毒素溶液透析到含有氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中从而完全除去甲醛液，然后加入硫柳汞使终浓度为0.01(w/v)％。得到的溶液用作白喉类毒素溶液。
实施例3
破伤风类毒素的制备
破伤风梭菌(Harvard菌株)用无菌肝胆琼脂培养基(DIFCO，美国)通过熔化琼脂方法培养。从上述培养物中取一些菌落接种到2ml含0.3(w/v)％酵母提取物的低氧的脑心浸液培养基(DIFCO，美国)中，厌氧状态35℃培养24小时。然后培养液接种到500ml含0.3(w/v)％酵母提取物的氮饱和的脑心浸液培养基(DIFCO，美国)中，厌氧状态35℃培养7天。培养后，从培养液中除去细胞，收集毒素溶液并在4℃加入硫酸铵，从而获得60(w/v)％的终浓度，混合至少24小时，充分混合从而通过离心获得沉淀。这种沉淀溶解在少量蒸馏水中，除去不溶物质。得到的溶液滴入已预先用含0.5M氯化钠的10mM的tris缓冲液(pH8.0)平衡的Sephagrill S-100柱中。流过相同的缓冲液从而洗脱分离的毒素。收集破伤风毒素溶液并透析到含150mM氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中。透析后，加入甲醛液，至终浓度为0.025(w/v)％，在37℃反应1小时。其后，加入赖氨酸和碳酸氢钠至终浓度分别为0.05mM和0.04M，在37℃成熟4周并脱毒。脱毒之后，类毒素溶液透析到含150mM氯化钠的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，完全除去甲醛液。加入硫柳汞至终浓度为0.01(w/v)％，然后用作破伤风类毒素溶液。
实施例4
纯化的百日咳抗原蛋白的制备
百日咳博德特氏菌Tohama phase 1在含15％兔血的Bodet-Gengo琼脂培养基(DIFCO，美国)中35℃培养72小时并传代两次。接种一些菌落到50ml的stanor-sholte培养基中，35℃培养48小时。这样培养的溶液重新接种到500ml的更换的stanor-shoote培养基中(参照Imazumi等INFECT.-IMMUN.，1983，卷41，页1138)，35℃培养36小时。加入10％的硫柳汞水溶液到培养液中，得到0.01％的终浓度从而阻止百日咳细菌的生长，然后通过离心除去细胞。将三倍体积的蒸馏水加入得到的溶液中，混合均匀。用1N硫酸将当前pH值降至pH6.0。得到的溶液滴入已预先用pH6.0的10mM的磷酸钠缓冲液平衡的CM-琼脂糖凝胶柱中。用与柱平衡溶液相同的缓冲液过柱从而除去不与柱结合的物质，与柱轻微结合的杂质用与柱平衡溶液相同的含有100mM氯化钠的缓冲液除去。当不再有杂质从柱上洗脱下来时，结合物质用由含有相同体积的100mM氯化钠和600mM氯化钠的柱平衡溶液形成的线性梯度洗脱，因此分离了含有百日咳抗原蛋白如百日咳毒素和FHA(丝状血细胞凝集素)的部分。抗原部分用两倍体积的10mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)稀释到pH8.0。得到的溶液滴入已预先用pH8.0的10mM的磷酸钠缓冲液平衡的羟磷灰石柱中。用与柱平衡溶液相同的含有100mM氯化钠的缓冲液过柱从而除去不与柱结合的物质。含有100mM氯化钠pH8.0的80mM的磷酸钠缓冲液以滴定速率相同的速率过柱，从而分离百日咳毒素部分。当分离完百日咳毒素，含有100mM氯化钠pH8.0的250mM的磷酸钠缓冲液以滴定速率相同的速率过柱，从而分离FHA(丝状血细胞凝集素)部分。分离的百日咳毒素和FHA(丝状血细胞凝集素)在含有0.15％氯化钠的10mM的磷酸钠缓冲液(pH7.4)中4℃透析。将甘油和戊二醛(glutal aldehyde)加入到透析过的百日咳毒素样品溶液中至终浓度为50(w/v)％和0.05(w/v)％，37℃脱毒4小时。加入天冬氨酸钠至终浓度为0.025M，从而完成脱毒过程。将甘油和甲醛液加入到透析过的FHA(丝状血细胞凝集素)样品溶液中至终浓度为50(w/v)％和0.025(w/v)％，37℃脱毒24小时。加入赖氨酸至终浓度为0.025M，从而完成脱毒过程。各样品溶液在室温下透析到含0.15％氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中。加入硫柳汞至终浓度为0.01(w/v)％。其后，脱毒的百日咳毒素样品溶液和FHA(丝状血细胞凝集素)样品溶液以1∶4的比率混合，然后用作百日咳抗原蛋白。
实施例5
全细胞百日咳抗原的制备
百日咳细菌，百日咳博德特氏菌Tohama phase 1在含15％兔血的Bodet-Gengo琼脂培养基(DIFCO，美国)上35℃培养72小时并传代两次。接种一些菌落到50ml的Stanor-sholte培养基中，35℃培养48小时。得到的培养液重新接种到500ml更换的stanor-sholte培养基中(参照Imazumi等INFECT.-IMMUN.，1983，卷41，页1138)，35℃培养36小时。加入10％的硫柳汞水溶液到培养液中得到0.01％的终浓度从而阻止百日咳细菌的生长并通过离心收集菌体。收集的菌体溶液在含0.15％氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中4℃透析。加入甲醛液到已透析的百日咳菌体溶液中至终浓度为0.025(w/v)％，37℃脱毒4周。加入赖氨酸至终浓度为0.025M，从而完成脱毒过程。样品溶液透析到含0.15％氯化钠的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中。加入硫柳汞至终浓度为0.01(w/v)％，然后用作全细胞百日咳抗原。
实施例6
含有纯化的百日咳抗原的联合疫苗的制备
步骤1.乙型肝炎疫苗的制备
用实施例1中制备的乙型肝炎表面抗原制备乙型肝炎疫苗。氢氧化铝溶液通过将氢氧化铝凝胶加到磷酸盐缓冲液中而制得。得到的溶液缓慢混合，滴入上述抗原溶液并在4℃缓慢搅拌15小时从而制备乙型肝炎疫苗。此时，肝炎表面抗原含量是60μg/ml，与一般的乙型肝炎表面抗原含量相比高度浓缩了三倍。第一个样品中，氢氧化铝凝胶中铝离子含量为0.9mg/ml。第二个样品中，氢氧化铝凝胶中铝离子含量为1.5mg/ml(如图2所示)。
步骤2.DTP联合疫苗的制备
DTP联合疫苗用实施例2、3、4中制备的各抗原制备。在传统方法中氢氧化铝溶液通过将氢氧化铝凝胶加到磷酸盐缓冲液中而制备。当缓慢混合得到的溶液时，将各抗原溶液滴入其中并缓慢搅拌混合，从而实现均匀吸附，因此制备了DTP联合疫苗。此时，各抗原含量与一般的DTP疫苗的各组分抗原含量相比浓缩了1.5倍。氢氧化铝凝胶中铝离子含量为0.3mg/ml。
步骤3.DTP-乙型肝炎联合疫苗的制备
在步骤1和2中制备的每种DTP疫苗和乙型肝炎疫苗以体积比2∶1的比率缓慢混合。在第一个样品中，加入过量的氢氧化铝凝胶，因此氢氧化铝凝胶中铝离子含量最终为0.7mg/ml，25℃连续搅拌混合1小时从而制成一种不与其它组分作用的稳定的联合疫苗。在第二个样品中，不加入过量的氢氧化铝凝胶，25℃连续搅拌混合1小时从而制成联合疫苗。第一个样品和第二个样品的联合疫苗的氢氧化铝凝胶中铝离子的含量为0.7mg/ml。对于抗体效价试验，联合疫苗的组分为每毫升20μg乙型肝炎表面抗原、25Lf白喉类毒素、3Lf破伤风类毒素、2.5μgPN百日咳类毒素和10μgPN百日咳FHA抗原(百日咳FHA(丝状血细胞凝集素)抗原)(如图2所示)。
实施例7
含有全细胞百日咳抗原的联合疫苗的制备
步骤1.乙型肝炎疫苗的制备
用实施例1中制备的乙型肝炎表面抗原制备乙型肝炎疫苗。将氢氧化铝凝胶加到磷酸盐缓冲液中从而制成氢氧化铝溶液。当溶液缓慢混合时，滴入上述抗原溶液并在4℃充分混合15小时从而制成乙型肝炎疫苗。此时，乙型肝炎表面抗原含量是60μg/ml，与一般的乙型肝炎表面抗原含量相比浓缩了三倍。第一个样品中，氢氧化铝凝胶中铝离子含量为0.9mg/ml。第二个样品中，氢氧化铝凝胶中铝离子含量为1.5mg/ml(如图2所示)。
步骤2.DTP联合疫苗的制备
DTP联合疫苗用实施例2、3和5中制备的各抗原制备。以传统方法将氢氧化铝凝胶加到磷酸盐缓冲液中从而制成氢氧化铝溶液。当缓慢混合得到的溶液时，滴入上述抗原溶液并充分混合。完成均匀吸附从而制成DTP联合疫苗。此时，各抗原含量与一般的DTP疫苗的各组分抗原含量相比浓缩了1.5倍。氢氧化铝凝胶中铝离子含量为0.3mg/ml。
步骤3.DTP-乙型肝炎联合疫苗的制备
在步骤1和2中制备的DTP疫苗和乙型肝炎疫苗以体积比2∶1的比率缓慢混合。在第一个样品中，加入过量的氢氧化铝凝胶，因此氢氧化铝凝胶中铝离子含量最终为0.7mg/ml，得到的溶液在25℃连续混合1小时从而制成一种不与其它组分作用的稳定的联合疫苗。在第二个样品中，不加入过量的氢氧化铝凝胶，溶液在25℃连续混合1小时从而制成联合疫苗。样品1和2的联合疫苗的氢氧化铝凝胶中铝离子的含量是0.7mg/ml。对于抗体效价试验，联合疫苗的组分为每毫升20μg乙型肝炎表面抗原、50 Lf白喉类毒素、10 Lf破伤风类毒素、20 OU全细胞百日咳抗原(如图2所示)。
实施例8.联合疫苗中抗原性试验
实施例6和7制备的联合疫苗中抗原性试验是通过与对应于各抗原含量的各抗原标准比较，利用单克隆抗体和多克隆抗体的酶免疫测定法(EIA)进行。
另外，通过离心除去吸附到铝盐的抗原以检测各抗原的吸附比率，并用上部溶液检测分离的抗原的含量。
图1和2中显示的各结果的平均值表明各抗原的相对抗原性。
实施例9.联合疫苗抗体形成试验
乙型肝炎表面抗原的抗体形成试验
将实施例6和7中制备的联合疫苗和乙型肝炎疫苗接种到ICR小鼠上，其中16只小鼠组成组1，18天后从ICR小鼠收集血液。从血液中分离血清。以IU/ml单位为基础用EIA(酶免疫测定法)获得对应于乙型肝炎表面抗原的抗体水平并用几何均数抗体效价计算。计算联合疫苗对于乙型肝炎疫苗的效价。
图2c和2d显示联合疫苗对于各抗原的相对抗体效价，表1显示各效价的数值。
白喉抗原的抗体形成试验
将实施例6和7中制备的联合疫苗和DTP疫苗接种到ICR小鼠上，其中16只小鼠组成组1。28天后从ICR小鼠收集血液。从血液中分离血清。以IU/ml单位为基础用EIA(酶免疫测定法)测量对应于血清中百日咳抗原的抗体水平并用几何均数抗体效价计算。其后，与DTP疫苗比较，检测联合疫苗的效价。
图2c和2d显示联合疫苗对于各抗原的相对抗体效价，表1显示各效价的数值。
破伤风抗原的抗体形成试验
将实施例6和7中制备的联合疫苗和DTP疫苗被种到ICR小鼠上，其中16只小鼠组成组1。28天后从ICR小鼠收集血液。从血液中分离血清。以IU/ml的单位为基础用EIA(酶免疫测定法)测量对应于血清中百日咳抗原的抗体水平并用几何均数抗体效价计算。其后，与DTP疫苗比较，检测联合疫苗的效价。
图2c和2d显示联合疫苗对于各抗原的相对抗体效价，表1显示各效价的数值。
百日咳抗原的抗体形成试验
将实施例6和7中制备的联合疫苗和DTP疫苗接种到ICR小鼠上，其中16只小鼠组成组1。28天后从ICR小鼠收集血液。从血液中分离血清。以IU/ml单位为基础用EIA(酶免疫测定法)测量对应于血清中百日咳抗原的抗体水平并用几何均数抗体效价计算。其后，与DTP疫苗比较，检测联合疫苗的效价。
图2c和2d显示联合疫苗对于各抗原的相对抗体效价，表1显示各效价的数值。
表1
 DTwP疫苗(磷酸铝作为吸附剂)  DTwP疫苗(氢氧化铝作为吸附剂)  DTwP-HepB联合疫苗(样品A)   DTwP-HepB联合疫苗(样品B)   效价标准
  白喉效力(IU/ml)   ＞800   249.7   601.1   128.1   超过30 IU/ml
  破伤风效力(IU/ml)   176.5   196.0   216.9   230.7   超过40 IU/ml
  百日咳效力(IPU/ml)   20.2   3.2   25.4   5.5   超过8 IPU/ml
  乙型肝炎相对效力(IU/ml)   -   -   196.8   103.9   同等或超过标准样品值
实施例10
猴的比较性效力试验
通过验证在灵长类动物体内联合疫苗的免疫原性并与传统的单一疫苗比较来进行试验。将实施例6中制备的联合疫苗接种到由相同数量雄猴和雌猴组成的六只猴子(组2)上，同时将每种组分疫苗接种到由相同数量雄猴和雌猴组成的六只猴子(组1)上。在第30和60天再次接种与接种到各组的产品同样的产品。在初次接种日期算起的第1、29、58和86天从各实验动物身上收集血液，根据适合于猴血清的ELISA方法检测抗每种疾病的抗体效价。
图3显示抗各组的各抗原的几何均数抗体效价。
本发明涉及一种联合疫苗的制备方法，所述联合疫苗用于同时预防应该在婴儿中预防的如白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎等疾病。通过本发明，可以利用根据本发明制备的联合疫苗来同时预防应在婴儿中预防的如白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎等疾病。
由于本发明以不离开其精神或本质特征的多种形式体现出来，因此除非另外指出，应理解上述实施方式并不受前面叙述的任何细节的限制，而是如在附加的权利要求中定义的那样在其精神和范畴内广泛解释，因此所有属于权利要求中的集合和范围或这种集合和范围的等效物的改变和修正都包含于附加的权利要求中。

Claims (12)

1.一种联合疫苗的制备方法，该方法包括：
将针对各种疾病的每种保护性抗原分别独立地吸附到作为吸附剂的氢氧化铝凝胶上的吸附步骤；和
将上述吸附到吸附剂上的每种保护性抗原混合的联合步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的保护性抗原是从包括白喉抗原、破伤风抗原、百日咳抗原、乙型肝炎抗原或其中的两种或多种组合中选择出的抗原。
3.如权利要求2所述的方法，其中在联合疫苗制成后所述氢氧化铝凝胶中的铝离子浓度在0.5～1.25mg/ml的范围内。
4.如权利要求3所述的方法，该方法还包括以下步骤：
加入额外的氢氧化铝凝胶，其中氢氧化铝凝胶中铝离子的最终浓度在0.5～1.25mg/ml的范围内。
5.如权利要求2所述的方法，其中基于儿童剂量，作为乙型肝炎抗原的重组的乙型肝炎表面抗原以5～10μg的量联合。
6.如权利要求5所述的方法，该方法还包括以下步骤：
加入中性表面活性剂，该中性表面活性剂选自吐温20、吐温80或曲通X-100。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述的乙型肝炎抗原在2～8℃与吸附剂一起搅拌混合3～20小时。
8.如权利要求2所述的方法，其中基于儿童剂量，作为白喉抗原的脱毒白喉类毒素以10～25Lf的量联合。
9.如权利要求2所述的方法，其中基于儿童剂量，作为破伤风抗原的脱毒破伤风类毒素以1～5Lf的量联合。
10.如权利要求2所述的方法，其中基于儿童剂量，含有纯化抗原的百日咳抗原以低于20μgPN的量联合；或基于儿童剂量，全细胞百日咳抗原以低于20OU的量联合。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述纯化的百日咳抗原包含百日咳类毒素和百日咳丝状血细胞凝集素。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法制备的联合疫苗。
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