CN102196817B - 具有全细胞百日咳的联合疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含用于针对疾病例如白喉、破伤风、全细胞性百日咳和脊髓灰质炎提供保护作用的抗原混合物的联合疫苗。本发明还涉及在所述联合疫苗中包含一种或多种抗原，用于针对由流感嗜血杆菌(Haemophilus？influenzae)、肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。

Description

具有全细胞百日咳的联合疫苗
发明领域
本发明涉及包含用于针对疾病例如白喉、破伤风、百日咳和脊髓灰质炎提供保护作用的抗原混合物的联合疫苗。本发明还涉及在所述联合疫苗中包含一种或多种抗原，用于针对由流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肝炎病毒和其他病原体引起的感染提供保护作用，以便疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。
发明背景
疫苗的抗原
白喉和破伤风抗原
白喉和破伤风是分别由白喉棒状杆菌(Cornyebacteriumdiphtheriae)和破伤风梭菌(Clostridiumtetani)引起的急性感染。这些细菌的毒素是相应疾病的主要病因。针对这些细菌提供保护作用的疫苗包含被弱毒化的失去其侵染性的类毒素。毒素使用化学物质例如甲醛或戊二醛进行处理以制造类毒素[白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)]。一种突变的白喉毒素CRM197，也用于某些疫苗中。
百日咳抗原
百日咳病或百日咳由百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)引起。这是使人虚弱的严重疾病，甚至可能导致死亡。对抗该疾病的最初疫苗是基于用化学物质例如甲醛处理以杀死细胞并使有毒物质失活后的完整细胞。开发失活的全细胞百日咳疫苗的尝试，始于1906年在纯培养中生长百日咳博德特氏菌后不久。在20世纪20年代，Dr.LouisW.Sauer开发出用于百日咳的疫苗。1925年，丹麦医生ThorvaldMadsen首次在较大规模上试验了全细胞百日咳疫苗。1942年，美国科学家PearlKendrick将全细胞百日咳疫苗与白喉和破伤风类毒素相组合，产生了第一种DTP联合疫苗。这些被称为“全细胞(wP)疫苗”的疫苗高度有效。
较晚的被称为“组分疫苗”的疫苗包含较少数量的高度纯化抗原。已经建议将许多毒力相关因子包含在“无细胞疫苗”中，其与组分疫苗相比成分确定性较低。只包含PT的疫苗具有部分保护性，而包含PT/FHA组合的疫苗更加有效，但是与wP疫苗相比免疫原性仍然较低。
脊髓灰质炎抗原
有两种不同类型的疫苗可用：
●活的减毒(弱化)口服脊髓灰质炎疫苗(OPV)，其由Dr.AlbertSabin在1961年开发。包含Sabin毒株的OPV通过口服给药。
●失活的(杀死的)脊髓灰质炎疫苗(IPV)，其由Dr.JonasSalk在1955年开发。包含Salk毒株的IPV作为注射剂给药。
活的减毒(OPV)和失活的(IPV)脊髓灰质炎疫苗两者在控制世界范围内的脊髓灰质炎疾病中都发挥了效力。脊髓灰质炎疫苗可以包含Salk或Sabin毒株。Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型是已经在对抗脊髓灰质炎疾病的疫苗中使用的Salk毒株。Sabin毒株包括Sabin1和Sabin2株。
流感嗜血杆菌(Hib)抗原
流感嗜血杆菌是一种革兰氏阴性球杆菌，其是上呼吸道菌群的正常组成部分。B型流感嗜血杆菌(Hibb)在幼儿中是脑膜炎侵入性血液传播感染的主要病因，并且在生命的前两年中是脑膜炎的主要病因。针对流感嗜血杆菌的免疫接种始于1987年在加拿大使用的多糖疫苗[聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)]。Hib的聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)荚膜是生物体的主要毒力因子。针对PRP的抗体是血清杀菌活性的首要促成者，并且抗体水平的增加与侵入性疾病的风险降低相关。PRP是不依赖于T-细胞的抗原，因此其具有下列特征：a)在小于18个月的婴儿和儿童中诱导不良的抗体应答，b)与使用T-细胞依赖性抗原相比具有可变和较小量的抗体应答，c)产生较高比例的免疫球蛋白M(IgM)，以及d)不能诱导加强应答。
最初的只基于PRP组分的疫苗被证明在婴儿中无效。进一步的尝试针对PRP结合疫苗，其中将PRP与被称为载体蛋白的蛋白质例如脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)的外膜蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素和CRM197相结合。
肝炎(Hep)抗原
存在各种不同的肝炎病毒毒株。乙型肝炎是由感染人科动物包括人类的肝脏并引起被称为肝炎的炎症的乙肝病毒(HBV)所引起的疾病。其严重性范围从持续数周(急性)的轻度疾病到严重的能够导致肝脏疾病或肝癌的长期(慢性)疾病。针对该疾病的疫苗包含病毒包膜蛋白中的一种——乙肝表面抗原(HBsAg)。FDA批准的含有HepB的疫苗是由Merck生产的RecombivaxHB和Comvax，由GlaxoSmithKlineBiologicals生产的Engerix-B和Pediarix。
其他抗原
人类所关心的其他抗原包括流感嗜血杆菌(a、c、d、e、f血清型和无包膜的菌株)、肝炎(A、C、D、E、F和G毒株)、脑膜炎A、B或C、流感、肺炎球菌、链球菌、炭疽、登革热、疟疾、麻疹、流行性腮腺炎、风疹、BCG、日本脑炎、轮状病毒、天花、黄热病、伤寒、Singles、水痘病毒等。
联合疫苗
尽管在疫苗领域进行了几十年的长期研究，但传染病仍然威胁人类。针对各种疾病进行保护的联合疫苗是非常合乎需要的，因为它减少了进行注射次数、降低了给药和生产成本，并且也提高了患者的顺从性。这样的联合疫苗一般更容易被接受。
然而，大量记载的抗原竞争现象使多价疫苗的开发变得复杂并受到阻碍。这种现象是指下述观察，即将多种抗原一起给药导致对某些抗原的应答与单独给药时针对这些抗原的免疫应答相比降低。
较早的研究聚焦于开发具有针对不同疾病和感染的多价的疫苗。这种熟知的疫苗组合之一包含白喉(D)、破伤风(T)和全细胞百日咳(wP)抗原，产生DTwP疫苗。
希望向这种联合疫苗添加将针对由肝炎病毒(Hep)、流感嗜血杆菌(Hib)和脊髓灰质炎病毒(IPV)引起的疾病提供保护的其他抗原。还希望将针对其他疾病提供保护的抗原添加到上面所述的联合疫苗中。
由GlaxoSmithKlineBiologicals生产的Quintanrix是包含DTwP、Hib和HepB抗原的联合疫苗，其含有乙基汞硫代水杨酸钠作为防腐剂。这种疫苗在上市前被撤销。由GlaxoSmithKlineBiologicals生产的ZilbrixTM包含DTwP和HepB。由GlaxoSmithKlineBiologicals生产的ZilbrixHibTM包含DTwP、HepB和Hib，其中Hib分装在不含其他抗原组分的单独小管中销售。
GreenCrossVaccine的PCT申请WO2002005846提供了四价联合疫苗，包括白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳和乙型肝炎表面抗原。所述方法涉及疫苗制剂，其将HepB与DTwP组合，但是没有说明包含其他抗原例如Hib或IPV。
GlaxoSmithKlineBiologicals的PCT申请WO2008028957涉及包含低剂量IPV的疫苗的制造方法。但是，它没有教导包含D、T、wP、IPV、Hib和Hep抗原全部一起在单一小管中、采取全液体形式的全液体疫苗的制备，其中Hib基本上不吸附在任何佐剂上。
SmithKlineBeechamBiologicals的美国专利No.6013264涉及包含HBsAg的多价疫苗。所述发明涉及其中HBsAg被吸附到磷酸铝上的联合疫苗。但是，没有具体公开全液体形式的包含DTwP-IPV以及其他抗原如Hib和Hep的联合疫苗。
ConnaughtLab的PCT申请WO1998000167A1提供了多价免疫原性组合物，其在宿主中针对由百日咳博德特氏菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、脊髓灰质炎病毒和/或流感嗜血杆菌感染引起的疾病提供保护作用。根据说明书，疫苗的Hibb组分是冻干组分，在与疫苗的其他组分混合之前必须加水重构。因此，在说明书中没有涉及包含所有所述抗原的全液体联合疫苗的教导。
冻干、也称为冷冻干燥，是高成本的过程，还引起对蛋白质的强烈胁迫。在疫苗的任何组分被冻干的情况下，在疫苗给药时，需要将冻干物与另一种液体或联合疫苗的液体组分混合。这代表了对从业人员的补充限制，并提供了其不能良好执行的风险。此外它提出了具有多个区室的注射器，其中冻干组分在一个区室中，疫苗的液体组分在另一个区室中。然而，这种可以在疫苗给药时将内含物混合的注射器，在降低生产成本的层面以及由从业人员执行的操作的层面上，表现不令人满意。
因此，希望避免该冷冻干燥步骤，并提供所有组分提供在一起并处于全液体形式的联合疫苗。这将便于疫苗的给药、使患者顺从并且也降低生产成本。因此，希望将Hib抗原添加到疫苗的液体组分中并因此获得全液体多价疫苗。
GlaxoSmithKlineBiologicals公司的PCT申请WO2004110480涉及包含Hibb多糖的疫苗。该申请陈述道，联合疫苗组分的简单混合由于不是所有抗原都能有效混合在一起这一事实而复杂化。它陈述道，在DTP疫苗的氢氧化铝与PRP之间存在干扰。WO’480中的发明的目的是在即时制备的联合疫苗中将这种干扰降到最低，其中将PRP预先吸附在磷酸铝上。该发明还提供了包含PRP的免疫原性组合物、疫苗和联合疫苗，所述PRP在某种程度上受到保护而免于免疫干扰。发明人发现，通过将聚阴离子聚合物赋形剂与包含PRP的疫苗掺合在一起，可以实现上述目标。
然而，在疫苗剂型中使用聚阴离子聚合物可能不是理想的，因为它可能增加配制疫苗的成本。此外，因为疫苗最终打算用于人类，因此理想情况下它应该具有尽可能最少的组分。使用附加的成分意味着向制剂添加身体可能与之反应并产生抗体的物质。由于与免疫制剂的这些组分接触而产生的这种身体应答，可能是不想要的。
PasteurMerieuxSerums的美国专利No.6333036涉及包含与破伤风变性毒素偶联的乙型流感嗜血杆菌的荚膜多糖或高分子量聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)以及基于铝的佐剂的疫苗组合物。在该发明中使用的基于铝的佐剂具有低于约7.2的零电荷点。但是，发明没有具体教导包含DTwP-IPV以及其他抗原如Hib和Hep的全液体形式的联合疫苗的制备。
尽管对于制造包含各种抗原、能够针对大量疾病提供保护作用的多价疫苗的研究一直在进行，但是它们不致力于提供包含DTwP和IPV抗原以及其他抗原例如Hib和Hep的全液体剂型的稳定的联合疫苗的需求。关于在用分离的和共给药的联合疫苗和Hib疫苗进行免疫的儿童中针对特定抗原的抗体应答，存在着可用的相反的报告。这种结果可能存在各种原因，包括疫苗在其抗原含量上不一致、制造类毒素的方法、添加佐剂的方法或使用的防腐剂。
目前已知并可用的联合疫苗，可能不包含采用适合的免疫原性形式的适合抗原的适合剂型，其在一次注射中就能在易感人群中获得对大量疾病的所需水平的效能和免疫原性。对于针对各种感染提供保护作用并采取液体形式以便提供给药的便捷性和适合的成本效益比的多组分疫苗，存在着需求。提供针对由白喉棒状杆菌、破伤风梭菌、百日咳博德特氏菌、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒和流感嗜血杆菌引起的感染所导致的疾病的稳定和有效的多价疫苗，将是合乎需要的。为了使疫苗有效，对于疫苗的每种抗原来说需要满足血清保护作用的标准。为此，需要克服由抗原竞争和干扰所提出的障碍和挑战。本发明通过提供针对多种疾病提供保护的全液体联合疫苗剂型，克服了现有技术的限制并解决了相关问题。
发明概述
本发明涉及包含白喉(D)、破伤风(T)、全细胞百日咳(wP)和IPV，并任选包含选自流感嗜血杆菌(Hib)和肝炎病毒(Hep)的一种或多种抗原的全液体稳定联合疫苗，以便所述疫苗的给药能够同时免疫对象以对抗一种以上病原体。具体来说，本发明涉及包含上面指出的抗原的全液体稳定联合疫苗及其制造方法。
本发明还涉及联合疫苗，其包含适合于预防、改善和治疗多种疾病状态的多种疫苗组分，其满足每种所述疫苗组分的血清保护作用标准。
发明详述
本发明涉及全液体的稳定的联合疫苗，其包含适合于预防、改善和治疗多种疾病状态的多种疫苗组分，其满足每种所述疫苗组分的血清保护作用标准。
本发明的优点包括能够以安全有效的方式提供针对广范围疾病和感染的保护作用的多价疫苗。本发明的疫苗提供针对各种疾病和感染的免疫原性，并且对疫苗中存在的任何抗原没有任何干扰。因此，单次注射即可提供针对各种疾病和感染的免疫原性，使疫苗的患者顺从性更高。由于单次注射即可提供针对多种感染和疾病的免疫，因此疫苗接种的成本将会降低。本发明的疫苗，在其减少为多种不同疾病和感染而前往预防接种中心的次数以及进行注射的次数的意义上说，将是有益的。本发明的这种特点使其特别是对于需要预防接种以提供针对大量感染和疾病的免疫的较年轻群体来说，更加有用和有利。因此，本发明提供了更易被接受的疫苗。
定义
当在本文中用于描述本发明的疫苗时，术语“全液体”是指这样的疫苗状态，即其中疫苗的所有组分都处于液体状态，并且疫苗的任何组分都不提供成在将疫苗给药于对象之前必须与疫苗的其他组分混合的冻干或任何其他形式。
当在本文中使用时，术语“载体蛋白”用于描述与疫苗中使用的荚膜多糖(Hib)偶联、以便将T-细胞不依赖性多糖转变成T-细胞依赖性抗原的蛋白质组分。
当在本文中使用时，术语“佐剂”用于描述疫苗的非抗原性组分，其通过促进抗原与免疫系统之间的接触，通过影响针对抗原而产生的免疫应答的类型和质量，来增强疫苗抗原的免疫应答。佐剂引起针对抗原的延长的免疫应答，并且也可用于降低某些抗原的毒性或为某些抗原提供溶解性。
当在本文中用于描述本发明的疫苗时，术语“稳定的”是指将疫苗在5±3℃下温育至少1、优选12、最优选24个月后，疫苗组合物的每种抗原具有超过设定为正常验收限度的效价/免疫原性。
当在本文中用于描述Hib在佐剂上吸附或结合的量时，在表述“Hib基本上不吸附到任何佐剂上”中，术语“基本上”是指Hib在任何佐剂上的吸附小于15％、优选小于10％。没有对Hib抗原执行任何故意将其吸附到任何佐剂上的步骤；可能发生的吸附的量可能是由于抗原与佐剂之间的接触，而不是有意为之的。
当在本文中用于描述本发明的疫苗中存在的每种组分的量时，术语“约”是指存在的所述疫苗组分的量，在量上为该特定组分的宣称量的优选±20％、更优选±10％、最优选±5％的范围内。
当在本文中用于描述本发明疫苗的制备方法过程中混合物的组分搅拌时间时，术语“约”是指在宣称值的优选±20％、更优选±10％、最优选±5％的范围内。
当在本文中用于指称本发明的联合疫苗时，术语“免疫活性”是指疫苗在给药于对象时能够引发针对所述组合的每种抗原的抗体，从而保护接种者抵抗相应的疾病或感染。
当在本文中用于指称本发明的联合疫苗的抗原时，术语“结合或吸附”是指抗原与佐剂之间的任何形式的物理结合。
本发明的疫苗
本发明提供了全液体的稳定的联合疫苗，其包含白喉(D)、破伤风(T)、全细胞百日咳(wP)和脊髓灰质炎病毒抗原(IPV)，并任选包含选自流感嗜血杆菌(Hib)和肝炎病毒(Hep)的一种或多种抗原。
一方面，本发明提供了联合疫苗组合物，其中疫苗的所有组分以液体形式一起存在于单一小管中。
另一方面，本发明涉及全液体的稳定的五价疫苗，其包含DTwP、Hib和IPV抗原。
另一方面，本发明提供了全液体的稳定的六价疫苗，其包含DTwP、Hib、Hep和IPV抗原。
本发明还提供了吸附到磷酸铝上的白喉(D)和破伤风(T)抗原。
根据本发明的另一方面，IPV毒株是一种或多种可以选自Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型的Salk毒株，或一种或多种选自Sabin1型和2型的Sabin毒株。
根据本发明的另一方面，Hib抗原与载体蛋白偶联，所述载体蛋白选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、CRM197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白或其任何等价物，或任何其他已知载体。
根据本发明的另一方面，Hib抗原基本上不吸附到任何佐剂上。
根据本发明的另一方面，本发明疫苗中的Hib抗原源自于Hibb株的荚膜多糖。
一方面，本发明提供了吸附到磷酸铝上的Hep抗原。
另一方面，本发明涉及源自于乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、即HepB毒株的表面抗原的Hep抗原。
另一方面，本发明提供了在制剂中包含2-苯氧乙醇作为防腐剂的本发明的疫苗。
根据本发明的另一方面，疫苗包含D、T、wP、Hibb和HepB抗原以提供五价疫苗，并且在制剂中使用2-苯氧乙醇作为防腐剂，前提是疫苗不包含IPV抗原。
此外，本发明的另一方面涉及制造本发明的联合疫苗的方法。
本发明的另一方面涉及本发明的联合疫苗的组成，使得疫苗中存在的每种抗原的量引发针对所述抗原的保护性免疫应答。
本发明的疫苗的抗原
白喉由白喉棒状杆菌、一种革兰氏阳性、不产芽胞的好氧细菌引起。该生物体表达原噬菌体编码的ADP-核糖基化外毒素(“白喉毒素”)，可以对其进行处理(例如使用甲醛)以产生类毒素。该类毒素不再具有毒性，但是仍保留抗原性，并能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。在本发明的疫苗中使用的白喉抗原制备物优选包含白喉类毒素。
破伤风由破伤风梭菌、一种革兰氏阳性、形成芽胞的杆菌引起。该生物体表达内肽酶(“破伤风毒素”)，可以对其进行处理以产生不再具有毒性的类毒素。但是它仍保留抗原性，并能够在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。在本发明的疫苗中使用的破伤风抗原制备物优选包含破伤风类毒素。
百日咳病或百日咳由百日咳博德特氏菌引起。本发明的全细胞百日咳(wP)抗原可以从可能引起感染的百日咳博德特氏菌菌株制备。本发明的wP抗原可以通过大量方式例如化学物质进行失活。但是，在本发明的疫苗组合物中使用的失活的百日咳博德特氏菌(wP)，优选在56±1℃下热失活30分钟。在本发明的疫苗中使用的wP抗原制备物优选从百日咳博德特氏菌134、509和10536制造。菌株10536、509和134的单一收获物优选根据其混浊度以1∶1∶1的比例混合。
流感嗜血杆菌是革兰氏阴性球杆菌，其引起侵入性血液传播的感染和脑膜炎。根据本发明的一个实施方案，源自于荚膜多糖的Hib抗原可以偶联或结合到载体蛋白上。用于偶联Hib抗原的载体蛋白可以选自破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、CRM197和脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白或其任何等价物。其他适合的载体蛋白包括但不限于合成的肽、热休克蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自于各种病原体衍生的抗原例如N19的多种人类CD4+T细胞表位的人造蛋白、来自流感嗜血杆菌的蛋白D、肺炎球菌表面蛋白PspA、肺炎球菌溶血素、摄铁蛋白、来自艰难梭菌(C.difficile)和无乳链球菌(S.agalactiae)蛋白的毒素A或B。在本发明的疫苗中使用的Hib抗原制备物包含优选与破伤风类毒素偶联或连接的Hib抗原。
多糖偶联物可以通过任何已知的连接技术来制备。例如，多糖可以通过硫醚键连接。这种偶联方法依靠使用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)活化多糖以形成氰酸酯。因此活化的多糖可以直接或经连接基团与载体蛋白上的氨基连接。偶联物也可以通过直接还原胺化方法来制备。另一种方法包括将溴化氰(CNBr)活化的多糖经己二酸酰肼(ADH)衍生后通过碳二亚胺缩合与蛋白载体相连。可以使用任何其他已知方法来制备本发明的疫苗中使用的多糖偶联物。
根据本发明的实施方案，Hib抗原基本上不吸附在任何佐剂上；优选情况下，Hib抗原与佐剂的吸附程度不超过15％；更优选情况下，Hib抗原与佐剂的吸附程度不超过10％。
根据另一个实施方案，本发明涉及没有进行在任何佐剂上的故意或有意吸附的Hib抗原。
根据本发明的另一个优选实施方案，Hib抗原源自于Hibb菌株的荚膜多糖。
肝炎由各种肝炎毒株例如A、B、C、D、E、F或G引起。乙肝病毒(HBV)是引起病毒性肝炎的主要因子。HBV病毒粒子包含由外部蛋白质外壳或衣壳包围的内部核心。衣壳的主要组分是被称为HBV表面抗原或更通常称为“HBsAg”的蛋白质。当该抗原给药于接种者时，它刺激抗HBsAg抗体的产生，其针对HBV感染提供保护。根据本发明的一个优选方面，在本发明的疫苗中使用的肝炎病毒(Hep)抗原制备物包含源自于乙型肝炎毒株表面抗原(HBsAg)的Hep抗原。
对于疫苗制造来说，HBsAg的制备可以通过以颗粒形式从慢性乙肝病毒携带者的血浆中纯化，因为在HBV感染期间大量HBsAg在肝脏中合成并释放到血流中，或者通过使用重组DNA方法表达蛋白。在本发明的疫苗中使用的HBsAg可以任一种方式制备。
脊髓灰质炎由脊髓灰质炎病毒引起。本发明的疫苗可以包含脊髓灰质炎病毒的Sabin(Sabin1和/或Sabin2)或Salk株。根据本发明的一个优选实施方案，本发明的疫苗包含Salk毒株。存在三种类型的能够引起脊髓灰质炎的Salk毒株。这三种类型相似并引起一致的症状，但是它们的抗原性非常不同，并且由一种类型引起的感染不能提供保护以对抗其他类型引起的感染。Salk脊髓灰质炎病毒包括3种毒株——1型(例如Mahoney株)、2型脊髓灰质炎病毒(例如MEF-I株)和3型脊髓灰质炎病毒(例如Saukett株)。根据本发明的优选实施方案，本发明的疫苗可以包含一种或多种所述Salk毒株。
脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长。Vero细胞系，一种源自于猴肾的连续细胞系，可用于生长脊髓灰质炎病毒。生长后，可以使用已知技术纯化病毒粒子。可以进行病毒的失活。脊髓灰质炎病毒的量典型地用“DU”单位(“D-抗原单位”)表示。在制造本发明的疫苗中使用的IPV抗原制备物，优选被制备成包含在疫苗制造中使用的一种或多种毒株。然后将该批量制备物用于配制本发明的疫苗。
疫苗的非抗原性组分
除了抗原性组分之外，疫苗可以包含大量非抗原性组分，它们是可药用赋形剂。它们包括但不限于pH调节剂、缓冲剂、佐剂、防腐剂、载体和渗涨度调节剂。
佐剂
最终制剂的抗原可以吸附或可以不吸附到佐剂上。佐剂的功能是刺激针对疫苗成分的免疫的产生，使疫苗更加有效。
佐剂可用于：
●使抗原与免疫系统接触并影响所产生的免疫的类型以及免疫应答的质量(幅度或持续时间)；
●降低某些抗原的毒性；以及
●为某些疫苗组分提供溶解性。
研究显示，许多含铝疫苗与不含佐剂的对比疫苗相比，引起更高和更长时间的抗体应答。通常在初始免疫系列而不是使用加强剂的过程中观察到佐剂的益处。
基于铝的佐剂是最常用的佐剂。这些佐剂已被FDA批准用于疫苗。存在三种通用类型的含铝佐剂：
●氢氧化铝
●磷酸铝
●硫酸钾铝(通常称为“明矾”)
本发明的一个实施方案涉及将疫苗的某些抗原吸附到磷酸铝上，并将疫苗的某些抗原吸附到氢氧化铝上。本发明的某些抗原可能不吸附或基本上不吸附到任何佐剂上。佐剂对所述抗原吸附的优选性提供了本发明的疫苗的特征。吸附的优选性在下面的“本发明疫苗的制造方法”一节中更详细描述。
防腐剂
疫苗易于被细菌污染。因此，为了避免可能在意外污染事件中掺入而引入疫苗中的有害微生物的潜在的威胁生命的污染，在配制疫苗时可以将防腐剂包含在疫苗的组成中。已经使用的防腐剂包括苯索氯铵(Phemerol)、乙基汞硫代水杨酸钠、苯酚和2-苯氧乙醇(2-POE)。
乙基汞硫代水杨酸钠是含汞的有机化合物(有机汞化合物)，其已经在许多疫苗中用作防腐剂。有报道述及针对乙基汞硫代水杨酸钠的某些过敏反应，其主要采取迟发型局部超敏反应的形式，包括注射位点处的发红和肿胀。关于孤独症与汞的关联，也存在冲突的报道。
2-苯氧乙醇(2-POE)也称为“1-羟基-2-苯氧基乙烷”、“2-羟基乙基苯基醚”、“乙二醇苯基醚”等。2-苯氧乙醇的安全性概况好于汞化合物防腐剂(例如乙基汞硫代水杨酸钠)。因此，在疫苗中需要避免乙基汞硫代水杨酸钠并使用2-苯氧乙醇。
因此，本发明的另一个优选实施方案涉及在疫苗组合物中使用2-苯氧乙醇作为防腐剂。根据本发明的另一个优选实施方案，2-苯氧乙醇的浓度为5mg/ml疫苗。
渗涨度调节剂
为了控制疫苗组合物的渗涨度，优选在疫苗配方中包含渗涨度调节剂。这些调节剂包括但不限于盐类(例如NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2)、糖类(例如葡萄糖、甘露糖醇、乳糖)、氨基酸(例如精氨酸、甘氨酸、组氨酸)和多元醇(例如蔗糖、甘油、山梨糖醇)。在更优选实施方案中，在疫苗配方中使用生理盐例如钠盐。最优选情况下将氯化钠(NaCl)包含在本发明的疫苗组合物中。
pH调节剂和/或缓冲剂
如果需要，本技术领域的专业人员已知的各种pH调节剂可用于调节疫苗组合物的pH，例如氢氧化钠或盐酸。各种缓冲剂例如磷酸钠、磷酸钾和柠檬酸盐缓冲液，可用于疫苗配方中。
本发明疫苗的组成
本发明疫苗的组合物，使得利用包含在疫苗中的每种抗原的量赋予本发明疫苗以免疫原性。本发明疫苗中每种抗原的量，优选使联合疫苗在给药于对象时，在对象中引发针对组合物的所述抗原的免疫应答。本发明的联合疫苗包含白喉(D)、破伤风(T)、全细胞百日咳(wP)和脊髓灰质炎(IPV)，并任选包含选自流感嗜血杆菌(Hib)和肝炎病毒(Hep)的其他抗原。
根据本发明的一个实施方案，疫苗包含D、T、wP、Hibb和IPV(Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型)，其中D的存在量约为1-40Lf，T的存在量约为1-25Lf，wP的存在量为每0.5ml约1-30IOU，Hibb的存在量为每0.5ml约1-20ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml约1-50DU、1-15DU和1-50DU，以形成稳定的、免疫原性的并采取全液体剂型形式的五价疫苗。
根据本发明的一个优选实施方案，本发明的五价疫苗包含D、T、wP、Hibb和IPV，其中D的存在量约为20Lf，T的存在量约为7.5Lf，wP的存在量为每0.5ml约16IOU，Hibb的存在量为每0.5ml约10ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml约40DU、8DU和32DU。配制这种疫苗以提供全液体联合疫苗，其在给药于对象时是稳定和免疫原性的。
根据本发明的另一个实施方案，六价疫苗包含D、T、wP、Hibb、HepB和IPV(Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型)，其中D的存在量约为1-40Lf，T的存在量约为1-25Lf，wP的存在量为每0.5ml约1-30IOU，Hibb的存在量为每0.5ml约1-20ug，HepB的存在量为每0.5ml约1-20ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml约1-50DU、1-15DU和1-50DU，以提供全液体的稳定的联合疫苗，其在给药于对象时是免疫原性的。
根据本发明的另一个优选实施方案，六价疫苗包含D、T、wP、Hibb、HepB，并且其中在每0.5ml中D的存在量约为20Lf，T的存在量约为7.5Lf，wP的存在量约为16IOU，Hibb的存在量约为10ug，HepB的存在量约为10ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml约40DU、8DU和32DU。这样的疫苗将是在给药于对象时能够引发针对组合物的所有抗原的保护性免疫应答的稳定的疫苗。
本发明的另一方面涉及包含DTwP、Hibb和HepB的五价疫苗，其中在每0.5ml中D的存在量约为1-40Lf，T的存在量约为1-25Lf，wP的存在量约为1-30IOU，Hibb的存在量约为2-20ug，并且HepB的存在量约为1-20ug，以提供全液体的稳定和免疫原性的联合疫苗。
根据本发明的一个优选方面，五价疫苗包含DTwP、Hibb和HepB，其中在每0.5ml中D的存在量约为20Lf，T的存在量约为7.5Lf，wP的存在量约为16IOU，Hibb的存在量约为10ug并且HepB的存在量约为10ug。这样的疫苗是稳定的并采取全液体剂型的形式。这样的疫苗将是在给药于对象时能够引发针对组合物的所有抗原的保护性免疫应答的稳定的疫苗。
本发明还涉及诱导针对选自D、T、P、Hib、Hep或IPV的任何抗原的免疫应答的方法，所述方法包含给药免疫活性量的本发明的疫苗。
根据本发明的另一方面，本发明的疫苗中的铝含量(Al+3)优选不超过每0.5ml2mg、更优选不超过每0.5ml1mg、最优选不超过每0.5ml0.6mg。
根据本发明的另一方面，本发明的联合疫苗中2-苯氧乙醇的优选量可以为5mg/ml。
本发明疫苗的制造方法
本发明的一个方面涉及本发明疫苗的制造方法。免疫原性组合物中抗原的免疫原性、稳定性和正确形式的维持，可能取决于配制组合物的方式。这可以包括添加抗原的顺序、用于某些抗原的特定佐剂的使用、各种参数包括搅拌、温度和pH的使用。
本发明的实施方案之一涉及全液体联合疫苗的制造方法，所述联合疫苗包含白喉(D)、破伤风(T)、全细胞百日咳(wP)和IPV，以及任选的选自流感嗜血杆菌(Hib)和肝炎病毒(Hep)的一种或多种抗原，所述制造方法包含下列步骤：
a)制备组分I，其包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)全细胞百日咳(wP)抗原的混合物，
b)任选地，制备组分II，其包含吸附到铝盐上的Hep，
c)任选地，将组分II与组分I混合以获得混合物，
d)向Hib添加上述混合物[在a)或c)中所获得的]，然后添加IPV抗原。
根据本发明的一个优选实施方案，D和T抗原吸附到磷酸铝上。
本发明的另一个优选实施方案涉及组分I的制备，所述制备包含下述步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将破伤风抗原制备物转移到上述容器中，
c)将白喉抗原制备物在搅拌下转移到所述容器中，
d)将2-苯氧乙醇转移到所述容器中，
e)将氯化钠溶液在恒定搅拌下转移到上述容器中，
f)检查pH并将其调整到6.0-6.5的范围内，
g)将wP抗原制备物在搅拌下转移到同一容器中，
h)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
方法还包含组分II的制备，所述制备包含下列步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将肝炎病毒抗原制备物在搅拌下转移到上述容器中，
c)将氯化钠溶液在搅拌下转移到同一容器中，
d)将2-苯氧乙醇制备物转移到上述容器中，
e)检查pH并将其调整到6.0-7.0的范围内。
方法还包括将组分I与组分II混合，其包含将组分II的内含物转移到组分I以获得混合物的步骤。
方法还包含将上述混合物与Hib和IPV抗原混合，其包含下列步骤：
a)将上述混合物在搅拌下转移到Hib抗原制备物中以获得另一种混合物，
b)将上述混合物转移到IPV抗原中，然后转移到盐水溶液中，
c)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
本发明的另一个优选实施方案涉及向Hib和IPV抗原添加组分I，其包含下列步骤：
a)将组分I在搅拌下转移到Hib抗原制备物中以获得混合物，
b)将上述混合物转移到IPV抗原制备物中，然后转移到盐水溶液中，
c)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
本发明的另一个优选方面涉及疫苗的制备，其包含下列步骤：
a)制备组分I，其包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)全细胞百日咳(wP)抗原的混合物，
b)制备组分II，其包含吸附到铝盐上的Hep，
c)将组分II与组分I混合以获得混合物，
d)向Hib抗原添加上述混合物。
方法还包含组分I的制备，其包含下列步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将破伤风抗原制备物在搅拌下转移到上述容器中，
c)将白喉抗原制备物转移到所述容器中，
d)将2-苯氧乙醇转移到所述容器中，
e)将氯化钠溶液在搅拌下转移到上述容器中，
f)检查pH并将其调整到6.0-6.5的范围内，
g)将wP抗原制备物转移到同一容器中，
h)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
方法还涉及组分II的制备，其包含下列步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将肝炎病毒抗原制备物转移到上述容器中，
c)将氯化钠溶液在搅拌下转移到同一容器中，
d)将2-苯氧乙醇制备物在搅拌下转移到上述容器中，
e)检查pH并将其调整到6.0-7.0的范围内。
方法还涉及组分I与组分II的混合，其包含将组分II的内含物转移到组分I以获得混合物的步骤。
方法还包含下列步骤：
a)将上述混合物转移到Hib抗原制备物中，
b)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
根据本发明的一个优选实施方案，在上述任何步骤中提到的搅拌在25±2℃下以150rpm进行约30分钟至2小时。
下面的实施例用于进一步说明本发明及其优点。提供下面的具体实施例时应该理解，它们打算用于说明而不是用于限制本发明的范围。
实施例I
本实施例给出了根据本发明的一种情况的六价疫苗的组成和制造方法
A、本发明的六价疫苗的组成如下：
每0.5ml疫苗包含下列组分：
表1：
*NMT-不超过。
B、本发明的六价疫苗的制造方法如下：
组分I的配制步骤
将磷酸铝凝胶转移到容器中，然后在搅拌下转入破伤风抗原和白喉抗原以获得混合物。然后将2-苯氧乙醇与上述混合物在所述容器中混合。然后向上述混合物加入氯化钠溶液。检查混合物的pH，并将其调整到落于6.0-6.5的范围内。然后将wP抗原转移到同一容器中。然后检查混合物的pH并将其调整到落于6.5-7.5的范围内。
组分II的配制步骤
将磷酸铝凝胶转移到容器中，然后向其中转入乙肝病毒抗原。然后将氯化钠溶液转移到同一容器中，然后转入2-苯氧乙醇。检查混合物的pH并将其调整到落于6.0-7.0的范围内。
组分I与组分II的混合
本步骤通过将组分II的内含物转移到组分I中来进行，以获得混合物。
添加Hibb和IPV部分
将上述组分I和II的混合物与Hibb抗原制备物进一步混合以获得混合物。将其进一步添加到IPV抗原中以获得混合物，并向上述混合物加入盐水溶液以获得六价疫苗，检查pH并将其调整到落于6.5-7.5的范围内。
实施例II
本实施例给出了根据本发明的一种情况的五价疫苗的组成和制造方法
A、本发明的五价疫苗的组成如下：
每0.5ml疫苗包含下列组分：
表2：
*NMT-不超过。
B、本发明的五价疫苗的制造方法如下：
组分I的配制步骤
将磷酸铝凝胶转移到容器中，然后在搅拌下转入破伤风抗原和白喉抗原以获得混合物。然后将2-苯氧乙醇与上述混合物在所述容器中混合。然后向上述混合物加入氯化钠溶液。检查混合物的pH，并将其调整到落于6.0-6.5的范围内。然后将wP抗原转移到同一容器中。然后检查混合物的pH并将其调整到落于6.5-7.5的范围内。
添加Hibb和IPV部分
向Hibb抗原加入组分I以获得混合物，然后将其与IPV抗原制备物和盐水溶液混合，以获得五价疫苗。将混合物的pH调整到落于6.5-7.5的范围内。
实施例III
本实施例给出了根据本发明的一种情况的五价疫苗的组成和制造方法
A、本发明的五价疫苗的组成如下：
每0.5ml疫苗包含下列组分：
表3：
*NMT-不超过。
B、本发明的五价疫苗的制造方法如下：
组分I的配制步骤
将磷酸铝凝胶转移到容器中，然后在搅拌下向其中转入破伤风抗原和白喉抗原以获得混合物。然后将2-苯氧乙醇与上述混合物在所述容器中混合。然后向上述混合物加入氯化钠溶液。检查混合物的pH，并将其调整到落于6.0-6.5的范围内。然后将wP抗原转移到同一容器中。然后检查混合物的pH并将其调整到落于6.5-7.5的范围内。
组分II的配制步骤
将磷酸铝凝胶转移到容器中，然后向其中转入HepB抗原制备物。然后将氯化钠溶液转移到同一容器中，然后转入2-苯氧乙醇制备物以获得混合物。将pH调整到落于6.0-7.0的范围内。
组分I与组分II的混合
本步骤包括将组分II的内含物转移到组分I中以获得混合物。
添加Hibb部分
然后将上述组分I和II的混合物与Hibb抗原制备物混合以获得五价疫苗。检查获得的混合物的pH并将其调整到落于6.5-7.5的范围内。
实施例IV
本实施例给出了对白喉、破伤风、全细胞百日咳、b型流感嗜血杆菌(Hib)、乙型肝炎和失活的脊髓灰质炎抗原进行的体内效价试验的简述及其稳定性数据或效价。
A、对白喉、破伤风、全细胞百日咳、b型流感嗜血杆菌(Hib)、乙型肝炎和失活的脊髓灰质炎抗原进行的体内效价试验
1.白喉类毒素
所需的动物物种：豚鼠
1批试验所需动物数量：116只(48只用于试验，48只用于参比，20只用于LD50)
疫苗给药途径：皮下
注射体积：1.0ml
动物饲养的天数：28
通过致死激惹方法在豚鼠中测定了白喉类毒素的效价。在该方法中，制备了每种测试和参比疫苗的三种稀释度，使得中间稀释度包含了挽救至少或超过50％的试验动物的ED50剂量。每种稀释度的测试疫苗和参比疫苗接种16只豚鼠，并在28天后用含有100LD50的白喉毒素皮下激惹试验动物。将一组20只豚鼠保持不预防接种用于白喉毒素的滴定，并将该组豚鼠用不同稀释度的白喉毒素接种，每个稀释度5只豚鼠。试验在33天内完成。进一步计算使用PROBIT进行。样品如果含有≥30IU/人类用单剂，则通过白喉效价测试。
-测试疫苗应该达到与参比疫苗的线性和平行性。
-估算的效价的置信限应该介于50至200％之间。
-估算的效价不应该低于每人类用单剂30I.U.。
-除非估算的效价的95％置信区间下限不高于每剂30I.U.，否则效价估算值的95％置信区间范围应该在50-200％之内。
2.破伤风类毒素
所需的动物物种：Swiss白化小鼠
1批试验所需动物数量：116只(48只用于试验，48只用于参比，50只用于LD50)
疫苗给药途径：皮下
注射体积：0.5ml
动物饲养的天数：28
通过致死激惹方法在Swiss小鼠中测定了破伤风类毒素的效价。在该测试中，制备了每种测试和参比疫苗的三种稀释度，使得中间稀释度包含了挽救至少或超过50％的试验动物的ED50剂量。每种稀释度的测试疫苗和参比疫苗接种16只Swiss小鼠，并在饲养28天后用含有100LD50的破伤风毒素激惹试验动物。将一组20只Swiss小鼠保持不预防接种用于破伤风毒素的滴定，并将4种LD50滴定稀释液各接种5只小鼠。试验在33天内完成。进一步计算使用PROBIT进行。样品如果含有≥60IU/人类用单剂，则其效价通过破伤风效价测试。
-测试疫苗应该达到与参比疫苗的线性和平行性。
-估算的效价的置信限应该介于50至200％之间。
-估算的效价不应该低于每人类用单剂60I.U.。
除非估算的效价的95％置信区间下限不高于每剂60I.U.，否则效价估算值的95％置信区间范围应该在50-200％之内。
3.全细胞百日咳抗原
所需的动物物种：Swiss小鼠
1批试验所需动物数量：194只(72只用于试验，72只用于参比，50只用于LD50)
疫苗给药途径：腹膜内
注射体积：0.5ml
饲养动物的天数：14
在Swiss小鼠中通过小鼠保护试验进行了百日咳抗原的效价测试。在该方法中，在正常盐水中制备了三种稀释度的每种测试和参比疫苗，使得中间稀释度包含了挽救至少或超过50％的试验动物的ED50剂量。每种稀释度预防接种一组24只Swiss小鼠，然后在第14天对所有预防接种过的动物用0.03ml的激惹剂量(每0.03ml约100,000个生物体)进行脑内激惹。在激惹后，对试验动物观察14天，并记录试验动物的死亡和存活。在激惹后前3天出现的死亡被取作非特异性的。进一步计算使用PROBIT进行。样品如果含有≥4IU/人类用单剂(SHD)并且置信下限不低于2IU/SHD，则通过百日咳效价测试。
4.b型流感嗜血杆菌(Hib)抗原
所需的动物物种：Swiss小鼠
1批试验所需动物数量：16只(8只用于预防接种，8只用作对照)
疫苗给药途径：皮下
注射体积：0.5ml
饲养动物的天数：35
Hibb抗原的效价测试在Swiss小鼠中通过ELISA方法进行。在该测试中，选择两组(测试和对照组)各8只Swiss小鼠。测试组的每只小鼠皮下注射0.5ml1∶4稀释的疫苗，对照组保持不接种。在第10天和第20天提供加强剂，最后在第35天收集血液。通过ELISA方法测试血清样品的抗Hib抗体。如果测试组中≥50％的小鼠发生血清转变，则样品通过Hib效价测试。
5.乙肝表面抗原
所需的动物物种：BalbC小鼠
1批试验所需动物数量：110只(50只用于样品，50只用于参比，10只用于安慰剂)
疫苗给药途径：腹膜内
注射体积：1.0ml
饲养动物的天数：28
乙肝表面抗原的效价测试在Balb/C小鼠中进行。在该测试中，制备了每种参比和测试疫苗的5种2倍稀释度，并用每种稀释度腹膜内接种10只小鼠。将10只小鼠用稀释剂接种并用作安慰剂组。将接种过的小鼠培育到接种的第28天并分离血清，注意不要发生溶血。通过ELISA测试血清样品的抗乙肝病毒抗体滴度。如果样品的相对效价上限≥1，则通过乙肝病毒效价测试。
6.失活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)
所需的动物物种：Wistar大鼠
1批试验所需动物数量：100只(50只用于测试疫苗，50只用于参比疫苗)
疫苗给药途径：肌肉内
注射体积：0.5ml
饲养动物的天数：21
IPV的效价测试在RIVMTOX大鼠中进行。制备了每种参比和测试疫苗的5种3倍稀释度，并用每种稀释度0.5ml肌肉内接种10只大鼠。在预防接种后育21天将试验动物取血并小心地收集血清样品，避免RBC裂解。通过血清中和试验测试每个血清样品的抗脊髓灰质炎病毒血清型1型、2型和3型的抗体滴度。
如果满足下列情况，测试有效：
—测试和参比疫苗两者的有效剂量中位数(ED50)介于给药动物的最小和最大剂量之间；
—统计学分析显示不显著偏离线性或平行性；
—估算的相对效价的置信限落于估算的效价的25％至400％之间。
B、本发明疫苗中的抗原的稳定性数据或效价
1)按照实施例IVA中给出的方法，对实施例I的六价疫苗的所有抗原进行测试。结果如下表中所示。
表4：
因此，可以看出，疫苗即使在5±3℃下长期储存后，疫苗抗原仍然有效力/具有高于验收限度的免疫原性。
2)按照实施例IVA中给出的方法，对实施例II的五价疫苗的所有抗原进行测试。结果如下表中所示。
表5：
因此，可以看出，疫苗即使在5±3℃下长期储存后，疫苗抗原仍然有效力/具有高于验收限度的免疫原性。

Claims (38)

1.一种联合疫苗，所述联合疫苗包含白喉(D)、破伤风(T)、全细胞百日咳(wP)、流感嗜血杆菌b(Hibb)和乙型肝炎病毒(HepB)的抗原，以及2-苯氧乙醇作为防腐剂，并且其中Hibb与载体蛋白偶联，所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197和脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)的外膜蛋白或任何其他已知载体，其中Hibb对任何佐剂的吸附程度小于15％，并且其中所有的所述组分为液体形式且是稳定的，并且Hibb抗原并不是通过在临施用前配制到所述疫苗中而临时使用的。
2.权利要求1的疫苗，其中D和T抗原吸附在磷酸铝上。
3.权利要求1的疫苗，其中Hibb抗原基本上不吸附到任何佐剂上。
4.权利要求1的疫苗，其中Hibb抗原源自于Hibb株的荚膜多糖。
5.权利要求1的疫苗，其中HepB抗原吸附到磷酸铝上。
6.权利要求1的疫苗，其中HepB抗原源自于HepB毒株的表面抗原。
7.权利要求1的疫苗，其包含D、T、wP和Hibb，其中D的存在量为1-40Lf，T的存在量为1-25Lf，wP的存在量为每0.5ml1-30IOU，Hibb的存在量为每0.5ml1-20ug。
8.权利要求7的疫苗，其包含D、T、wP和Hibb，其中D的存在量为20Lf，T的存在量为7.5Lf，wP的存在量为每0.5ml16IOU，Hibb的存在量为每0.5ml10ug。
9.权利要求1的疫苗，其包含D、T、wP、Hibb和HepB，其中D的存在量为1-40Lf，T的存在量为1-25Lf，wP的存在量为每0.5ml1-30IOU，Hibb的存在量为每0.5ml1-20ug，HepB的存在量为每0.5ml1-20ug。
10.权利要求9的疫苗，其包含D、T、wP、Hibb、HepB，并且其中D的存在量为20Lf，T的存在量为7.5Lf，wP的存在量为每0.5ml16IOU，Hibb的存在量为每0.5ml10ug，HepB的存在量为每0.5ml10ug。
11.白喉(D)、破伤风(T)、全细胞百日咳(wP)、流感嗜血杆菌b(Hibb)和乙型肝炎病毒(HepB)的抗原在制备用于诱导针对选自D、T、P、Hibb或HepB的任何抗原的免疫应答的疫苗中的应用，所述疫苗以2-苯氧乙醇作为防腐剂，并且其中Hibb与载体蛋白偶联，所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197和脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)的外膜蛋白或任何其他已知载体，其中Hibb对任何佐剂的吸附程度小于15％，并且其中所有的所述组分为液体形式且是稳定的，并且Hibb抗原并不是通过在临施用前配制到所述疫苗中而临时使用的。
12.权利要求1的疫苗，其中在每0.5ml中，D的存在量为1-40Lf，T的存在量为1-25Lf，wP的存在量为1-30IOU，Hibb的存在量为2-20ug，HepB的存在量为1-20ug。
13.权利要求1的联合疫苗的制造方法，所述方法包含下列步骤：
a)制备组分I，其在反应容器中包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)全细胞百日咳(wP)抗原的混合物，
b)制备组分II，其包含吸附到铝盐上的HepB，
c)将组分II与组分I混合以获得混合物，
d)向Hibb添加在c)中所获得的混合物。
14.权利要求13的方法，其中D和T抗原吸附到磷酸铝上。
15.权利要求13的方法，其中方法还包含向组分I添加作为防腐剂的2-苯氧乙醇(2-POE)的步骤。
16.权利要求13的方法，其中组分I的制备包含下述步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将破伤风抗原制备物在搅拌下转移到上述容器中，
c)将白喉抗原制备物转移到所述容器中，
d)将2-苯氧乙醇在搅拌下转移到所述容器中，
e)将氯化钠溶液转移到上述容器中，
f)检查pH并将其调整到6.0-6.5的范围内，
g)在搅拌下转移wP抗原制备物，
h)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
17.权利要求13的方法，其中组分II的制备包含下列步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将乙型肝炎病毒抗原(HepB)制备物在搅拌下转移到上述容器中，
c)将氯化钠溶液转移到同一容器中，
d)将2-苯氧乙醇制备物转移到上述容器中，
e)检查pH并将其调整到6.0-7.0的范围内。
18.权利要求13的方法，其中组分I与组分II混合包含将组分II的内含物转移到组分I以在反应容器中获得混合物的步骤。
19.权利要求13的方法，其中Hibb抗原的添加包含下列步骤：
a)将权利要求13的步骤c)中获得的混合物转移到Hibb抗原制备物中，以获得混合物，
b)然后转移到盐水溶液中，
c)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
20.权利要求1的联合疫苗，所述联合疫苗还包含IPV抗原。
21.权利要求20的疫苗，其中D和T抗原吸附在磷酸铝上。
22.权利要求20的疫苗，其中IPV抗原是选自Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型的Salk毒株，或选自Sabin1型或2型的Sabin毒株。
23.权利要求20的疫苗，其中Hibb抗原基本上不吸附到任何佐剂上。
24.权利要求20的疫苗，其中Hibb抗原源自于Hibb株的荚膜多糖。
25.权利要求20的疫苗，其中HepB抗原吸附到磷酸铝上。
26.权利要求20的疫苗，其中HepB抗原源自于HepB毒株的表面抗原。
27.权利要求20的疫苗，其包含D、T、wP、Hibb以及IPVMahoney1型、MEF2型和Saukett3型，其中D的存在量为1-40Lf，T的存在量为1-25Lf，wP的存在量为每0.5ml1-30IOU，Hibb的存在量为每0.5ml1-20ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml1-50DU、1-15DU和1-50DU。
28.权利要求27的疫苗，其包含D、T、wP、Hibb和IPV，其中D的存在量为20Lf，T的存在量为7.5Lf，wP的存在量为每0.5ml16IOU，Hibb的存在量为每0.5ml10ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml40DU、8DU和32DU。
29.权利要求20的疫苗，其包含D、T、wP、Hibb、HepB以及IPVMahoney1型、MEF2型和Saukett3型，其中D的存在量为1-40Lf，T的存在量为1-25Lf，wP的存在量为每0.5ml1-30IOU，Hibb的存在量为每0.5ml1-20ug，HepB的存在量为每0.5ml1-20ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml1-50DU、1-15DU和1-50DU。
30.权利要求29的疫苗，其包含D、T、wP、Hibb、HepB和IPV，其中D的存在量为20Lf，T的存在量为7.5Lf，wP的存在量为每0.5ml16IOU，Hibb的存在量为每0.5ml10ug，HepB的存在量为每0.5ml10ug，并且Mahoney1型、MEF2型和Saukett3型毒株的存在量分别为每0.5ml40DU、8DU和32DU。
31.白喉(D)、破伤风(T)、全细胞百日咳(wP)、IPV抗原、流感嗜血杆菌b(Hibb)和乙型肝炎病毒(HepB)的抗原在制备用于诱导针对选自D、T、wP、IPV、Hibb或HepB的任何抗原的免疫应答的权利要求20的疫苗中的应用，所述疫苗以2-苯氧乙醇作为防腐剂，并且其中Hibb与载体蛋白偶联，所述载体蛋白选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197和脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)的外膜蛋白或任何其他已知载体，其中Hibb对任何佐剂的吸附程度小于15％，并且其中所有的所述组分为液体形式且是稳定的，并且Hibb抗原并不是通过在临施用前配制到所述疫苗中而临时使用的。
32.权利要求20的联合疫苗的制造方法，所述方法包含下列步骤：
a)制备组分I，其在反应容器中包含i)白喉(D)、ii)破伤风(T)和iii)全细胞百日咳(wP)抗原的混合物，
b)制备组分II，其包含吸附到铝盐上的HepB，
c)将组分II与组分I混合以获得混合物，
d)向Hibb添加在c)中所获得的混合物，然后添加IPV抗原。
33.权利要求32的方法，其中D和T抗原吸附到磷酸铝上。
34.权利要求32的方法，其中方法还包含向组分I添加作为防腐剂的2-苯氧乙醇(2-POE)的步骤。
35.权利要求32的方法，其中组分I的制备包含下述步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将破伤风抗原制备物在搅拌下转移到上述容器中，
c)将白喉抗原制备物转移到所述容器中，
d)将2-苯氧乙醇在搅拌下转移到所述容器中，
e)将氯化钠溶液转移到上述容器中，
f)检查pH并将其调整到6.0-6.5的范围内，
g)在搅拌下转移wP抗原制备物，
h)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
36.权利要求32的方法，其中组分II的制备包含下列步骤：
a)将磷酸铝凝胶转移到容器中，
b)将乙型肝炎病毒抗原(HepB)制备物在搅拌下转移到上述容器中，
c)将氯化钠溶液转移到同一容器中，
d)将2-苯氧乙醇制备物转移到上述容器中，
e)检查pH并将其调整到6.0-7.0的范围内。
37.权利要求32的方法，其中组分I与组分II混合包含将组分II的内含物转移到组分I以在反应容器中获得混合物的步骤。
38.权利要求32的方法，其中Hibb和IPV抗原的添加包含下列步骤：
a)将权利要求32的步骤c)中获得的混合物转移到Hibb抗原制备物中，以获得混合物，
b)将上述混合物转移到IPV抗原制备物中，然后转移到盐水溶液中，
c)检查pH并将其调整到6.5-7.5的范围内。
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