EA010057B1

EA010057B1 - Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма сейбина вируса полиомиелита

Info

Publication number: EA010057B1
Application number: EA200700496A
Authority: EA
Inventors: Раджеш Джаин; Анил Чавла; Ганеш Кумрадж
Original assignee: Панацея Биотек Лтд.
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2008-06-30
Also published as: RS20070078A; EP1793852A1; US20080193478A1; BRPI0419023A; WO2007007344A1; EA200700496A1; MX2007002372A

Abstract

Предложена инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, для безопасной и эффективной иммунизации против полиомиелита. Также предложен способ получения такой вакцины и ее композиций. Введение вакцины согласно изобретению вместе с другими антигенами обеспечивает иммунизацию не только против полиомиелита, но и против других возбудителей инфекций, вызывающих гепатит C, гепатит D, гепатит E, менингит А, менингит В, менингит С, менингит W, менингит Y, пневмококк (23- или более валентный), оспу, брюшной тиф, бациллу Кальметта-Герена, туберкулез, вирус иммунодефицита человека, сибирскую язву и т.п., к которым восприимчивы ранее не иммунизированные дети или взрослые, особенно тем, к которым восприимчивы дети.

Description

Настоящее изобретение относится к полиомиелитной вакцине, предпочтительно в инактивированной форме, полученной из штамма Сейбина, для безопасной и эффективной иммунизации против полиомиелита, способу получения такой вакцины и ее композиции.

Композиции полиомиелитной вакцины согласно изобретению могут использоваться вместе с одним или более другими антигенами, чтобы обеспечить иммунизацию не только против полиомиелита, но также и против других возбудителей инфекций, таких как инфекции, вызывающие гепатит С, гепатит Ό, гепатит Е, менингит А, менингит В, менингит С, менингит ^, менингит Υ, пневмококковую инфекцию (23- или более валентную), оспу, брюшной тиф, бациллу Кальметта-Герена, туберкулез, вирус иммунодефицита человека, сибирскую язву и т.п., к которым восприимчивы ранее не иммунизированные дети или взрослые, особенно такие, к которым восприимчивы дети.

Композиция полиомиелитной вакцины, полученная согласно изобретению, очень выгодна для первичной иммунизации детей, потому что она предотвращает не только полиомиелит, но и другие типы инфекции, к которым восприимчивы ранее не иммунизированные дети или взрослые, особенно такие, к которым восприимчивы дети.

Уровень техники

Полиомиелит (обычно называемый также «полио») является острой инфекцией, которая поражает желудочно-кишечный тракт и, иногда, центральную нервную систему. Заражение происходит фекальнооральным путем. До внедрения вакцинации инфекция, вызванная вирусом полиомиелита, была широко распространенной, в областях с умеренным климатом эпидемии возникали летом и осенью. После выдачи разрешений на инактивированную полиомиелитную вакцину в 1955 г. и пероральную полиомиелитную вакцину в 1960-х годах, заболеваемость полиомиелитом быстро снизилась. В США последние случаи полиомиелита, вызванного местными штаммами вируса, возникли в 1979 г. Хотя программа искоренения полиомиелита привела к исчезновению полиомиелита в Западном полушарии, где последний случай, вызванный диким штаммом вируса полиомиелита, был обнаружен в 1991 г., вспышки полиомиелита, вызванного вакцинным штаммом вируса типа 1, возникли в Доминиканской Республике и Гаити в июле 2000 г. и на Филиппинах в 2001 г. Несмотря на эти недавние вспышки, общая инициатива по искоренению полиомиелита снизила количество зарегистрированных случаев полиомиелита во всем мире на более чем 99%, начиная с середины 1980-х годов, и представляется возможным достичь международного искоренения заболевания в ближайшем будущем. Клинические проявления инфекции, вызванной вирусом полиомиелита, варьируют от бессимптомного течения (большая часть инфекций) до клинических проявлений, начиная от острого периферического паралича одной конечности и заканчивая квадриплегией, дыхательной недостаточностью и, редко, смертью.

Полиомиелит вызывается тремя типами высокостабильных вирусов, а именно типом 1, типом 2 и типом 3, принадлежащим к семейству энтеровирусов. Существуют различные полиомиелитные вакцины, которые имеются в продаже. Эти вакцины трехвалентные, содержат смесь всех трех типов вируса полиомиелита, чтобы создать иммунитет против их всех.

Одним типом доступной полиомиелитной вакцины является инактивированная полиомиелитная вакцина (ГРУ) на основе штамма Солка (8а1к ГРУ). Вакцина содержит все три типа вируса полиомиелита, инактивированные формалином. Главное преимущество 8а1к ГРУ заключается в том, что ее можно сочетать с другими иммунизациями детей, например, с ΌΡΤ. Тем не менее, у 8а1к ГРУ есть несколько недостатков, например, строгие стандарты для выращивания штамма Солка вируса полиомиелита и потенциальный риск, обусловленный случайным выбросом живых вирулентных вирусов полиомиелита в окружающую среду при работе с вирулентным штаммом вируса полиомиелита в процессе производства вакцины. Кроме того, цена вакцинных композиций, содержащих штамм Солка вируса полиомиелита, высока, а их активность относительно низка.

Вторым типом доступной полиомиелитной вакцины является пероральная полиомиелитная вакцина (ОРУ) на основе штамма Сейбина. Данная перорально вводимая полиомиелитная вакцина состоит из живого инактивированного штамма вируса полиомиелита. Такие вакцинные композиции, содержащие живой инактивированный штамм Сейбина вируса полиомиелита, дешевле инактивированной полиомиелитной вакцины (ГРУ) на основе штамма Солка.

ОРУ обычно используется из-за легкой доступности моновалентных масс, большего количества производственных мощностей, легкости введения и, что наиболее значимо, из-за того, что изготовление ОРУ не представляет никакого риска, обусловленного случайным выбросом вирулентных вирусов полиомиелита в окружающую среду. Тем не менее, ОРУ имеет некоторые недостатки: порча ОРУ при температурах приблизительно выше минус 20°С, превращение в вакцинной композиции аттенуированного штамма в вирулентный штамм и паралитическая форма полиомиелита, вызванная вакцинным штаммом.

Патент США № 5639649, выданный А1тоиб с1 а1., относится к конструированию вакцин против риновирусов и энтеровирусов, в частности, вирусов полиомиелита, путем введения определенных мутаций в их геномы. Эти мутации уменьшают вирулентность штаммов вирусов дикого типа и могут дополнительно ослабить существующие живые аттенуированные вакцинные штаммы вируса, тем самым снижая вероятность их обратного превращения в вирулентный штамм.

- 1 010057

Патент США № 5618539, выданный ΌοΓναΙ е1 а1., относится к стабилизированным вирусным вакцинам, в частности, к живым вирусным вакцинам против полиомиелита, которые содержат водный раствор живого вируса и стабилизирующее количество соединения, содержащего по меньшей мере две аминогруппы или иминогруппы, такого как основные аминокислоты, например лизин.

В патенте США № 4525349, выданном МоШадпоп е1 а1., описан способ крупномасштабного производства полиомиелитной вакцины. Однако в нем не упоминается способ стабилизации вируса полиомиелита перед стадией инактивации.

Следовательно, остается неудовлетворенная потребность в разработке более дешевых вакцинных композиций, содержащих живой аттенуированный вирус полиомиелита, который можно вводить с помощью инъекции и который лишен токсичности или обладает сниженной токсичностью без ухудшения иммуногенности.

Кроме того, хотя в данной области известны различные типы полиомиелитных вакцин, в уровне техники нет раскрытия стабильной и эффективной композиции, содержащей инактивированную полиомиелитную вакцину, полученную из штамма Сейбина, и другие антигены, эффективные против инфекционных агентов, вызывающих инфекции у детей или взрослых, особенно у детей, которая была бы лишена токсичности или была бы менее токсична и при этом иммуногенна.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения служит создание инактивированной полиомиелитной вакцины, полученной из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита.

Целью настоящего изобретения служит также разработка способа получения инактивированной полиомиелитной вакцины, полученной из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита, отличающегося тем, что штамм Сейбина вируса полиомиелита сначала стабилизируют, добавляя стабилизатор, и затем инактивируют инактиватором.

По способу настоящего изобретения моновалентную массу вируса полиомиелита сначала стабилизируют, добавляя стабилизатор, затем следует инактивация, включающая в себя следующие стадии:

ί) начальную стабилизацию массы вируса полиомиелита путем добавлении стабилизатора, ίί) добавление инактиватора, такого как формальдегид (формалин) или бета-пропиолактон, к каждому профильтрованному и очищенному моновалентному пулу, или только нагревание пула, ϊϊΐ) инкубацию приблизительно при 37°С продолжительностью до 48 ч и затем при 2-8°С продолжительностью до 12 дней в единственном цикле перед дальнейшей обработкой, ίν) проверку на содержание свободного формальдегида или концентрацию инактиватора, выполняемую каждые 12 ч во время процесса инактивации, при поддержании желаемого уровня концентрации путем периодической коррекции,

ν) необязательное выполнение второй фильтрации после процесса инактивации.

Согласно другому способу настоящего изобретения моновалентную массу вируса полиомиелита сначала стабилизируют, добавляя стабилизатор, затем следует инактивация, включающая в себя следующие стадии:

ί) начальную стабилизацию основной массы вируса полиомиелита путем добавления стабилизатора, ίί) добавление инактиватора, такого как формальдегид или бета-пропиолактон, или только нагревание, ϊϊΐ) инкубацию примерно при 37°С в течение 4 ч, с последующим охлаждением до 2-8°С в течение 20 ч, ίν) повтор цикла инкубации и охлаждения до 12 раз, с тем, чтобы общее время выдержки при 37°С не превышало 48 ч в течение 12 дней инкубации,

ν) проверку на содержание свободного формальдегида или концентрацию инактиватора, выполняемую через каждые 12 ч во время процесса инактивации, при поддержании желаемого уровня концентрации путем периодической коррекции, νί) необязательно выполняемую вторую фильтрацию после процесса инактивации.

Еще одной целью настоящего изобретения служит получение композиции, содержащей инактивированную полиомиелитную вакцину, полученную из штамма Сейбина, для иммунизации против полиомиелита, отличающееся тем, что штамм вируса полиомиелита сначала стабилизируют, добавляя стабилизатор, и затем инактивируют инактиватором.

Кроме того, целью настоящего изобретения служит получение стабильных и эффективных композиций полиомиелитной вакцины с другими антигенами, которые после введения обеспечивают иммунизацию не только против полиомиелита, но и против других инфекционных агентов, вызывающих гепатит С, гепатит Ό, гепатит Е, менингит А, менингит В, менингит С, менингит ^, менингит Υ, пневмококковую инфекцию (23- или более валентных), оспу, брюшной тиф, бациллу Кальметта-Герена, туберкулез, вирус иммунодефицита человека, сибирскую язву и т.п., к которым восприимчивы дети или взрослые, особенно тех, к которым восприимчивы дети.

- 2 010057

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к инактивированной полиомиелитной вакцине, полученной из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита.

Настоящее изобретение относится к инактивированной полиомиелитной вакцине, полученной из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита, полученной из основного объема моновалентных суспензий исходного штамма Сейбина или штамма Сейбина, использованных для смешивания трехвалентной пероральной полиомиелитной вакцины, или путем выращивания вирусов полиомиелита штамма Сейбина в клеточной линии уего или любой подходящей культуре клеток, отличающейся тем, что полученная полиомиелитная вакцина вначале стабилизирована стабилизатором, как описано в настоящем документе, и затем инактивирована путем добавления формальдегида (формалина) согласно конкретному варианту осуществления изобретения.

Полиомиелитная вакцина согласно изобретению лишена недостатков известных полиомиелитных вакцин - ОРУ и 8а1к 1РУ.

В варианте осуществления инактивации полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, является трехвалентной вакциной, содержащей смесь всех трех типов вируса полиомиелита, а именно типа 1, типа 2 и типа 3.

В другом варианте осуществления инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, является двухвалентной вакциной, содержащей смесь любых двух из трех типов вируса полиомиелита, выбранных из типа 1, типа 2 и типа 3.

В основном варианте осуществления настоящего изобретения перед инактивированием вирусов вирусы полиомиелита стабилизируют, чтобы сохранить их форму, поскольку пространственная форма вирусов очень важна для их антигенности (иммуногенности). Процесс стабилизации, проводимый перед инактивацией, защищает уже слабый штамм Сейбина от деформации или повреждения во время процесса инактивации.

Процесс стабилизации моновалентной массы вируса полиомиелита включает в себя добавление стабилизатора (стабилизаторов), выбранного, без ограничения, из группы, включающей в себя сахарозу, трегалозу, гидрохлорид аргинина, желатин, хлорид магния, хлорид алюминия и динатриевую соль ЭДТА, используемых по отдельности или в комбинации, чтобы сохранить антигенность вакцины во время процесса инактивации.

В варианте осуществления процесс инактивации каждого профильтрованного и очищенного моновалентного пула включает в себя добавление инактиватора, такого, без ограничения, как формальдегид (формалин) или бета-пропиолактон или их смеси, предпочтительно в концентрации приблизительно 0,001-0,1%, более предпочтительно в концентрации 0,025%, и/или нагревание и инкубацию приблизительно при 37°С в течение оптимизированного количества дней.

Настоящее изобретение относится к способу получения инактивированной полиомиелитной вакцины, полученной из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита.

В варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения полиомиелитной вакцины из моновалентных суспензий исходного штамма Сейбина или штамма Сейбина, используемых для смешивания трехвалентной пероральной полиомиелитной вакцины, или путем выращивания вирусов полиомиелита штамма Сейбина в клеточной линии уего или любой подходящей культуре клеток для получения пероральной полиомиелитной вакцины, отличающемуся тем, что полученную полиомиелитную вакцину стабилизируют стабилизатором и затем инактивируют инактиватором.

В предпочтительном варианте осуществления полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, как указано выше, может быть стабилизирована и инактивирована согласно изобретению одним из следующих двух способов.

Способ I.

Процесс стабилизации: моновалентную массу вируса полиомиелита вначале стабилизируют, добавляя стабилизатор, такой как сахароза, трегалоза или гидрохлорид аргинина, чтобы сохранить антигенность вакцины в процессе инактивации.

Процесс инактивации: процесс инактивации начинают немедленно. Инактивацию каждого профильтрованного и очищенного моновалентного пула осуществляют, добавляя формальдегид (формалин) в концентрации 0,025% или бета-пропиолактон и инкубируя приблизительно при 37°С продолжительностью до 48 ч и затем при 2-8°С продолжительностью до 12 дней в единственном цикле перед дальнейшей обработкой. Для инактивации может использоваться любая обработка. Пробу на содержание свободного формальдегида берут каждые 12 ч в процессе инактивации, и желаемый уровень концентрации поддерживают путем периодической коррекции. Вторую фильтрацию выполняют после процесса инактивации. Соответствующую инактивацию вируса контролируют путем мониторинга и выверяют.

Способ II.

Процесс стабилизации: основной объем моновалентных вакцин стабилизируют, используя ту же самую процедуру, которая описана для способа I.

Процесс инактивации: инактивацию осуществляют, добавляя формальдегид (формалин) в концентрации 0,025% или бета-пропиолактон и инкубируя при 37°С в течение 4 ч, с последующим охлаждени

- 3 010057 ем до 2-8°С в течение 20 ч. Данный цикл инкубации и охлаждения можно повторять до 12 раз так, чтобы общее время выдержки при 37°С не превысило 48 ч в течение 12 дней инкубации. Пробу на содержание свободного формальдегида выполняют каждые 12 ч во время процесса инактивации, и желаемый уровень концентрации поддерживают за счет периодической коррекции. Вторая фильтрация должна быть выполнена после процесса инактивации. Соответствующую инактивацию вируса контролируют путем мониторинга и выверяют.

Обеспечивается поддержание активности/антигенной целостности термолабильных вирусов Сейбина. Способы инактивации стандартизируются таким образом, что живой инактивированный вирус каждого типа полностью инактивируется, и процесс гарантирует неповрежденность антигенной структуры штамма Сейбина. Инактивированная вакцина в состоянии создать адекватную иммунность вакцин, по сравнению со стандартной вакциной. В настоящем изобретении вирус полиомиелита штамма Сейбина стабилизируют перед инактивацией, используя такой стабилизатор, как сахароза, трегалоза, гидрохлорид аргинина, хлорид магния, хлорид алюминия и динатриевая соль ЭДТА, чтобы избежать деградации нативности и антигенной структуры. Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная согласно изобретению в моновалентной, двухвалентной или трехвалентной форме, имеет требуемое количество эквивалентного Ό-антигена или антигенной формы, которую можно сравнить с установленным стандартом инактивированной полиомиелитной вакцины, и/или обеспечивает сероконверсию и требуемую защиту.

Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина (81РУ), полученная согласно изобретению, обладает преимуществами над ОРУ и 8а1к 1РУ. Процесс изготовления не требует выращивания вирулентных штаммов вируса полиомиелита, и, следовательно, шансы на случайный выброс живых вирулентных вирусов полиомиелита очень малы. К тому же штаммы вируса полиомиелита сохраняют свою форму даже в композициях, что препятствует снижению иммуногенности, поскольку пространственная форма вирусов очень важна для их эффективности. Кроме того, 81РУ лишена таких недостатков, как паралитическая форма полиомиелита, вызванная вакцинным штаммом. Кроме того, 81РУ согласно изобретению можно эффективно комбинировать с другими антигенами, тем самым обеспечивая эффективную иммунизацию против нескольких заболеваний в одно и то же время.

Полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, используемая в композициях согласно изобретению, может быть трехвалентной, содержащей смесь всех трех типов, а именно типа 1, типа 2 и типа 3 вируса полиомиелита, или может быть смесью любых двух упомянутых типов вируса полиомиелита.

Введение композиций полиомиелитной вакцины, полученных согласно изобретению, позволит устранить или, по меньшей мере, уменьшить проблемы, связанные с многократными инъекциями различных антигенов. Композиции, полученные согласно изобретению, стабильны и высокоиммуногенны, и подходят для введения детям или взрослым, особенно подходят для введения детям.

В варианте осуществления настоящего изобретения полиомиелитная вакцина, полученная стандартизованными способами, используется для получения композиции поливалентной вакцины, содержащей инактивированную полиомиелитную вакцину, полученную из штамма Сейбина (81РУ).

В другом варианте осуществления полиомиелитная вакцина, полученная стандартизованными способами, используется для получения композиции поливалентной вакцины, содержащей инактивированную полиомиелитную вакцину, полученную из штамма Сейбина (81РУ), и «п» других антигенов, необязательно в сочетании с адъювантом, содержащим одну и более солей алюминия, в котором значение «п» равно 1 или более 1. Более предпочтительно, чтобы значение «п» было равно 2, 3, 4, 5 или 6. Термин «поливалентная», используемый в данном документе, означает вакцинную композицию, содержащую по меньшей мере два антигена или более.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции, в которой инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, является трехвалентной и содержит смесь всех трех типов вируса полиомиелита, а именно типа 1, типа 2 и типа 3, или является двухвалентной и содержит смесь любых двух типов вируса полиомиелита, выбранных из типа 1, типа 2 и типа 3.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции, в которой вакцина является поливалентной.

Другие антигены, присутствующие в композициях полиомиелитной вакцины согласно изобретению, выбраны, без ограничения, из таких антигенов, которые создают иммунитет против одного и более инфекционных агентов, вызывающих такие инфекции, как гепатит С, гепатит И, гепатит Е, менингит А, менингит В, менингит С, менингит А, менингит Υ, пневмококк (23- и более валентный), оспу, брюшной тиф, бациллу Кальметта-Герена, туберкулез, вирус иммунодефицита человека, сибирскую язву и т.п., к которым восприимчивы дети или взрослые, особенно тех, к которым восприимчивы дети.

Адъювант(ы), используемый в настоящем изобретении, включает в себя, без ограничения, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, масляные эмульсии, такие как эмульгированные масляные адъюванты Фрейнда (полные и неполные), Аг1асе1 А, минеральное масло, эмульгированный адъювант из масла арахиса (адъювант 65), продукты, полученные из бактерий (их синтетические произ

- 4 010057 водные, а также липосомы) или грамотрицательных бактерий, эндотоксины, холестерин, жирные кислоты, алифатические амины, парафиновые и растительные масла, А1дашти1т и 08-21. Предпочтительно, чтобы в качестве адъюванта использовались гидроксид алюминия и фосфат алюминия, по отдельности или в сочетании.

В варианте осуществления композиции согласно изобретению дополнительно содержат, без ограничения, консерванты, или фиксаторы ткани, или и то, и другое.

Консерванты, используемые в композициях согласно изобретению, выбраны, без ограничения, из этилртути, тимеросала, мертиолята и 2-феноксиэтанола, используемых по отдельности или в сочетании.

Фиксатор ткани, используемый в композициях согласно изобретению, является, без ограничения, формальдегидом.

Другой аспект изобретения относится к вакцинной композиции, содержащей инактивированную полиомиелитную вакцину, полученную из штамма Сейбина (81РУ), адсорбированную на фосфате алюминия (АР), и антигену, адсорбированному на АР, или гидроксиде алюминия (АН), или любом другом подходящем адъюванте, выбранному из антигена, обеспечивающего иммунитет к одному и более из следующих возбудителей инфекций, а именно, к гепатиту С, гепатиту Ό, гепатиту Е, менингиту А, менингиту В, менингиту С, менингиту ^, менингиту Υ, пневмококковой инфекции (23- или более валентный), оспе, брюшному тифу, бацилле Кальметта-Герена, туберкулезу, вирусу иммунодефицита человека, сибирской язве и т. п.

Следующий аспект изобретения относится к стабильной и эффективной вакцинной композиции, направленной на профилактику по меньшей мере двух заболеваний, содержащей 81РУ и по меньшей мере один другой антиген, выбранный из гепатита С, гепатита Ό, гепатита Е, менингита А, менингита В, менингита С, менингита ^, менингита Υ, пневмококка (23- или более валентного), оспы, брюшного тифа, бациллы Кальметта-Герена, туберкулеза, вируса иммунодефицита человека, сибирской язвы и т.п.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит также совместимые с 81РУ антигены, например, антигены против менингита В, менингита А и С или среднего отита.

Еще в одном варианте осуществления инактивированные моновалентные вирусы смешаны, без ограничения, со стабилизатором или/и консервантом, для создания моновалентной, двухвалентной, трехвалентной или поливалентной инактивированной вакцины. Окончательная вакцина может быть высушена путем распыления и ресуспендирована в пригодных для инъекции жидкостях, например, перфторуглеродах, не требуя для хранения охлаждения или подготовки перед инъекцией.

Композиции, полученные согласно изобретению, могут вводиться, без ограничения, такими путями, как пероральный, чрескожный, парентеральный, назальный, через слизистую оболочку и т. п.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция вводится в форме инъекции парентеральным путем, в частности, подкожным или внутримышечным путем.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют варианты осуществления настоящего изобретения. Однако они не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1.

Использовали вакцинный штамм того же типа и пассажа, который использовался для (пероральной) полиомиелитной вакцины; пероральную полиомиелитную вакцину (ОРУ) размножают, чтобы получить моновалентную суспензию для инактивации.

Культура клеток.

ί) Различные клеточные субстраты для размножения вируса включают в себя линию диплоидных клеток человека, клетки почки обезьяны, клеточную линию Уего или любую другую подходящую культуру клеток.

ίί) Крупномасштабное производство клеток.

1. Получение рабочего клеточного банка изготовителя (М^СВ): М^СВ в случае первичных культур клеток (клетки, полученные из нормальной ткани и хранившиеся замороженными при минус 70°С) или любой другой разрешенной непрерывной клеточной линии получают из клеток и клеток, объединенных после последовательных субкультур, в пределах указанного количества культур клеток.

2. Для пошагового увеличения объема клеток может использоваться любая подходящая из следующих систем.

Вращающиеся флаконы: рост во вращающихся флаконах отличается от роста в стационарных культурах распределением клеток на стеклянной поверхности и максимально достижимой плотностью клеток. Культуры во вращающихся флаконах не вырождаются менее быстро, поскольку они могут переносить плотность почти в два раз выше, чем стационарные культуры. Лучше всего к методике вращающихся флаконов приспосабливаются клетки млекопитающих, выращенные в однослойной культуре.

Клеточные фабрики: это комплект лотков для культивирования, имеющих общее впускное и выпускное отверстие. Они предоставляют клеткам поверхность для роста такого же размера, как внутренняя поверхность вращающегося флакона, но занимают меньше места в термостате. Клеточные фабрики идеальны для культур прикрепленных клеток, они отличаются низким риском контаминации и компактны.

Колбы Ру.

Система микроносителя.

- 5 010057

3. Пробы для контролирования культур клеток инкубируют отдельно в течение по меньшей мере двух недель и их исследуют их на наличие цитопатических изменений.

Размножение вируса полиомиелита в культурах клеток.

ί) Система маточной серии:

a) Уровень пассажа такой же, как для пероральной полиомиелитной вакцины ОК.

b) Следующий уровень пассажа получен из моновалентной суспензии, которая могла бы использоваться для изготовления пероральной полиомиелитной вакцины.

1. Вакцину изготовляют на основе системы маточной серии вирусов. Маточная серия вирусов - количество вирусов, обрабатываемых вместе и имеющих однородный состав, полученных из маточной серии.

2. Субкультивирование маточного вируса не следует производить более 10 раз, считая от маточной серии, использованной для получения вакцины, на которой были произведены первоначальные лабораторные и полевые тесты.

Однократный сбор и моновалентные пулы.

Вирус размножают в культурах клеток и собирают из клеточных культур, полученных из одной партии клеток и обрабатываемых вместе. Это называют однократным сбором. Однократные сборы вирусной суспензии одного типа обрабатывают одновременно, чтобы получить неочищенную форму моновалентного пула.

Фильтрация или очистка моновалентного пула.

Неочищенную вирусную суспензию каждого моновалентного пула очищают, поэтапно пропуская через фильтры с уменьшающейся пористостью. Цель стадии фильтрации состоит в том, чтобы удалить материал в виде частиц и другие вещества, которые могут нарушить процесс инактивации, поскольку такие агрегаты склонны увеличиваться с каждой последующей стадией.

Концентрация моновалентного пула.

Каждый профильтрованный моновалентный пул концентрируют путем ультрафильтрации.

Очистка моновалентного пула.

Для очистки моновалентного пула используют хроматографию на колонке ЭЕЛЕсефарозы/иммунобилизованной ДНКазы/иммуносорбционной колонке. В процессе очистки уровень клеточной ДНК последовательно снижается от начального (при сборе вируса), по меньшей мере, на множитель 10⁸. Концентрацию Ό-антигена определяют с помощью ЕЬ18А, и она сопоставима с иммуногенностью у крыс. Соответственно регулируют активность. Моновалентные пулы вируса полиомиелита смешивают, чтобы получить конечный трехвалентный продукт.

Стабилизация вируса Сейбина перед инактивацией.

Антигенность вакцины тесно связана со стабильностью природных вирусных антигенов в процессе инактивации. Антигенная структура вирусов полиомиелита должна быть вначале стабилизирована путем добавления стабилизаторов, таких как сахароза, трегалоза или аргинина гидрохлорид.

Инактивация с использованием формальдегида.

ί) Предпочтительно процесс инактивации начинают в пределах от 24 до 72 ч после фильтрации.

и) Инактивацию каждого профильтрованного и очищенного моновалентного пула осуществляют путем добавления формальдегида (формалина) в концентрации 0,025% и инкубации при 37°С в течение определенного периода, который был описан ранее. С интервалами берут пробу на свободный формальдегид, и желаемый уровень концентрации поддерживают путем периодической коррекции.

ш) Вторую фильтрацию выполняют после процесса инактивации.

ίν) Соответствующую инактивацию вируса контролируют путем мониторинга и выверяют.

ν) Для определения степени инактивации формалин нейтрализуют, добавляя бисульфит натрия, а затем удаляют его посредством диализа.

Получение и производство вакцины.

Очищенную инактивированную массу предпочтительно фильтруют через фильтр с размером 0,22 или 0,45 мкм. Инактивированные моновалентные вирусы необязательно смешиваются со стабилизатором и/или консервантом для получения моновалентной, двухвалентной, трехвалентной или поливалентной инактивированной вакцины.

Испытание эффективности вакцины.

Установлено, что эффективность вакцины, которая изготовлена выше, сопоставима с эффективностью установленной стандартной вакцины в способе ίη νίΐτο и/или ίη νίνο.

С вакциной, изготовленной выше, были выполнены различные другие пробы на основе стандартных методов, таких как определение рН, проба на стерильность, проба на эффективную инактивацию, изучение необычной токсичности, измерение объема, определение активности ίη νίΐτο, эндотоксиновая проба, проба на идентичность, определение содержания белкового азота и определение содержания стабилизатора и содержания формальдегида, чтобы убедиться в ее эффективности, безопасности и активности.

Активность 81РУ, изготовленной выше, определяли ίη νίΐτο, используя твердофазный иммуноферментный сэндвич-метод.

- 6 010057

Использовали два первичных антитела, выработанных у различных видов против одного и того же вируса полиомиелита, и второе антитело, конъюгированное с НКР, использовали против второго первичного антитела. Результаты анализировали, сравнивая со стандартом.

Пробу на идентичность вакцины выполняли с использованием прямого метода ЕЬ18А. Антигеном покрывали 96-луночные планшеты для ЕЬ18А, и типоспецифичные антитела использовали для выявления присутствия всех трех типов вируса полиомиелита в вакцине.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита, являющаяся трехвалентной или двухвалентной, содержащей смесь всех трех типов или смесь любых двух типов вируса полиомиелита, а именно типа 1, типа 2 и типа 3, полученная из основной массы моновалентной суспензии штамма Сейбина или суспензии исходного штамма Сейбина, используемых для смешивания трехвалентной или двухвалентной оральной полиомиелитной вакцины, или путем выращивания вирусов полиомиелита штамма Сейбина в клеточной линии уего или любой подходящей клеточной культуре для получения оральной полиомиелитной вакцины, отличающаяся тем, что полученная полиомиелитная вакцина сначала стабилизирована стабилизатором и затем инактивирована инактиватором.
2. Полиомиелитная вакцина по п.1, где стабилизатор выбран из группы, состоящей из трегалозы, гидрохлорида аргинина, желатина, хлорида алюминия и динатриевой соли ЭДТА, используемых по отдельности или в сочетании.
3. Полиомиелитная вакцина по п.1, где инактиватор выбран из группы, состоящей из формальдегида, или бета-пропиолактона, или их смесей.
4. Способ получения полиомиелитной вакцины из основной массы моновалентной суспензии штамма Сейбина или исходного штамма Сейбина, используемых для смешивания трехвалентной или двухвалентной пероральной полиомиелитной вакцины, или путем выращивания вирусов полиомиелита штамма Сейбина в клеточной линии уего или любой подходящей клеточной культуре для получения оральной полиомиелитной вакцины, отличающийся тем, что полученная полиомиелитная вакцина сначала стабилизирована стабилизатором и затем инактивирована инактиватором.
5. Способ по п.4, где моновалентную массу вируса полиомиелита сначала стабилизируют с последующей инактивацией, включающий в себя следующие стадии:

ί) начальную стабилизацию массы вируса полиомиелита путем добавления стабилизатора, ίί) добавление инактиватора, такого как формальдегид или бета-пропиолактон, к каждому профильтрованному и очищенному моновалентному пулу, или только нагревание пула, ϊϊΐ) инкубацию примерно при 37°С продолжительностью до 48 ч и затем при 2-8°С продолжительностью до 12 дней, в однократном цикле перед дальнейшей обработкой, ίν) проверку на содержание свободного формальдегида или концентрацию инактиватора, выполняемую каждые 12 ч во время процесса инактивации, и поддержание желаемого уровня концентрации периодической коррекцией,

ν) необязательное выполнение второй фильтрации после процесса инактивации.
6. Способ по п.4, где моновалентную массу вируса полиомиелита сначала стабилизируют с последующей инактивацией, включающий в себя следующие стадии:

ί) начальную стабилизацию основной массы вируса полиомиелита путем добавления стабилизатора, ίί) добавление инактиватора, такого как формальдегид или бета-пропиолактон, или только нагревание, ϊϊΐ) инкубацию примерно при 37°С в течение 4 ч с последующим охлаждением до 2-8°С в течение 20 ч, ίν) повтор цикла инкубации и охлаждения до 12 раз с тем, чтобы общее время выдержки при 37°С не превышало 48 ч в течение 12 дней инкубации,

ν) проверку на содержание свободного формальдегида или концентрацию инактиватора, выполняемую каждые 12 ч во время процесса инактивации, и поддержание желаемого уровня концентрации периодической коррекцией, νί) необязательное выполнение второй фильтрации после процесса инактивации.
7. Способ по п.4, где стабилизатор выбран из группы, состоящей из трегалозы, гидрохлорида аргинина, желатина, хлорида алюминия и динатриевой соли ЭДТА, используемых по отдельности или в сочетании.
8. Способ по п.4, где инактиватор представляет собой формальдегид, или бета-пропиолактон, или их смеси.
9. Способ по п.4, который включает в себя адсорбцию инактивированной полиомиелитной вакцины, полученной из смеси штаммов Сейбина, на стандартном адъюванте, с количеством «п» других антигенов, где значение «п» приблизительно составляет от 1 до 30.
10. Способ по п.9, где указанные другие антигены выбраны из группы, включающей в себя гепатит

- 7 010057

С, гепатит Ό, гепатит Е, менингит А, менингит В, менингит С, менингит ^, менингит Υ, пневмококк (23или более валентный), оспу, брюшной тиф, бациллу Кальметта-Герена, туберкулез, вирус иммунодефицита человека, сибирскую язву, используемых по отдельности или в сочетании.
11. Способ по п.4, где инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, является трехвалентной, содержащей смесь из всех трех типов вируса полиомиелита, а именно типа 1, типа 2 и типа 3.
12. Способ по п.4, где инактивированная полиомиелитная вакцина, полученная из штамма Сейбина, является двухвалентной, содержащей смесь из любых двух из трех типов вируса полиомиелита, выбранных из типа 1, типа 2 и типа 3.
13. Композиция инактивированной полиомиелитной вакцины, полученной из штамма Сейбина, для эффективной иммунизации против полиомиелита, где вакцина получена из основной массы моновалентной суспензии штамма Сейбина или исходного штамма Сейбина, используемых для смешивания трехвалентной или двухвалентной пероральной полиомиелитной вакцины, или путем выращивания вирусов полиомиелита штамма Сейбина в клеточной линии уего или любой подходящей клеточной культуре для получения пероральной полиомиелитной вакцины, отличающаяся тем, что полученную полиомиелитную вакцину сначала стабилизируют стабилизатором и затем инактивируют инактиватором и, необязательно, адсорбируют на адъюванте с количеством «п» других антигенов, где значение «п» приблизительно составляет от 1 до 30.
14. Композиция по п.13, где указанные другие антигены выбраны из группы, включающей в себя гепатит С, гепатит Ό, гепатит Е, менингит А, менингит В, менингит С, менингит ^, менингит Υ, пневмококк (23- и более валентный), оспу, брюшной тиф, бациллу Кальметта-Герена, туберкулез, вирус иммунодефицита человека, сибирскую язву, используемых по отдельности или в сочетании.
15. Композиция по п.13, которая содержит адъювант(ы), выбранный из группы, содержащей гидроксид алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, масляные эмульсии, такие как эмульгированные масляные адъюванты Фрейнда (полные и неполные), Аг1асе1 А, минеральное масло, эмульгированный адъювант из масла арахиса (адъювант 65) , продукты, полученные из бактерий (их синтетических производных, а также липосом) или грамотрицательных бактерий, эндотоксинов, холестерина, жирных кислот, алифатических аминов, парафиновых и растительных масел, А1даттц1т и 08-21, используемые по отдельности или в сочетании.
16. Композиция по п.13, которая дополнительно содержит консервант, или фиксатор ткани, или и то, и другое.
17. Композиция по п.16, где консервант выбран из группы, состоящей из этилртути, тимеросала, мертиолята и 2-феноксиэтанола, используемых по отдельности или в сочетании.
18. Композиция по п.16, где используемый фиксатор ткани является формальдегидом.
19. Полиомиелитная вакцина, способ получения полиомиелитной вакцины и композиция полиомиелитной вакцины, полученные из штамма Сейбина, по существу, как описано и проиллюстрировано в данном документе.