MX2007002372A - Vacuna para la poliomielitis inactivada derivada de la cepa sabin del virus de la polio. - Google Patents

Abstract

Se provee una vacuna inactivada contra la polio, derivada de la cepa Sabin para la inmunizacion segura y eficaz contra la poliomielitis; se provee tambien un procedimiento de preparacion para tal vacuna y formulaciones de la misma; la administracion de la vacuna de la presente invencion junto con otro antigenos provee inmunizacion no solamente contra la infeccion de la polio, sino tambien contra otros patogenos que causan hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, meningitis A, meningitis B, meningitis C, meningitis W, meningitis Y, nemocoquico (de valencia 23 o mas), el virus de la viruela, tifoidea, bacilo de Calmette-Guerin, tuberculosis, inmunodeficiencia humana, antrax o similares a los cuales son susceptibles los ninos o adultos no inmunizados previamente, particularmente a los cuales son susceptibles los ninos.

Description

VACUNA PARA LA POLIOMIELITIS INACTIVADA DERIVADA DE LA CEPA SABIN DEL VIRUS DE LA POLIO CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona con una Vacuna para la Polio, inactivada preferentemente de la cepa Sabin para una inmunización efectiva contra la Poliomielitis, un procedimiento para la preparación de dicha vacuna, y formulación de la misma. Las formulaciones de Vacuna para la Polio de la presenten invención pueden usarse junto con uno o más antígenos para proporcionar inmunización no solo contra la infección sino también contra otros patógenos tales como los que ocasionan la Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Meningitis A, Meningitis C, Meningitis W, Meningitis Y, Neumococo (23 valente o mayor), viruela, tifoidea, Bacillo Calmette Guerin, Tuberculosis, Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Ántrax, o similar, a las cuales son susceptibles los niños o adultos cuando no son inmunizados tempranamente, particularmente a las que son susceptibles los niños. La vacuna de la polio preparada conforme a la presente invención es muy benéfica para la inmunización primaria de niños debido a que no solo evita la infección de la polio sino de otros tipos de infección a las cuales son susceptibles los niños o adultos cuando no se inmunizan con anterioridad, particularmente a las que son susceptibles los niños.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La poliomielitis (también llamada comúnmente como "Polio") es una infección aguda que involucra el tracto gastrointestinal y, ocasionalmente, el sistema nervioso central. Se adquiere por transmisión fecal-oral. En la era previa a la vacunación, la infección con el virus de la polio era común, ocurriendo epidemias en el verano y en otoño en áreas templadas. La incidencia de la poliomielitis declinó rápidamente después de otorgarse la vacuna de la polio inactivada en 1955 y la vacuna de la polio oral en los años 60. Los últimos casos de polio adquirida autóctonamente en los Estados Unidos ocurrió en 1979. A pesar de que un programa de erradicación de la polio dio lugar a la eliminación de la polio en el Hemisferio Occidental, en donde el último caso asociado con el poliovirus salvaje se detectó en 1991 , en julio de 2000 en República Dominicana y en Haití ocurrió un brote del poliovirus I derivado de la vacuna y en Filipinas en 2001. A pesar de estos brotes recientes, la iniciativa de erradicación global de la Polio ha reducido el número de casos de polio reportados mundialmente en >99% desde mediados de los 80, y la erradicación mundial de la enfermedad parece factible en el futuro cercano. Las manifestaciones clínicas de la infección por poliovirus van desde asintomáticas (la mayoría de infecciones) hasta sintomática, incluyendo parálisis flácida aguda desde una simple extremidad hasta cuadriplegia, falla respiratoria, y rara vez, la muerte.

La polio es ocasionada por tres tipos de virus bastante estables denominados Tipo 1 , Tipo 2, y Tipo 3 que pertenecen a la familia de los endovirus. Existen diferentes tipos de vacunas disponibles en el mercado.

Estas vacunas son trivalentes que contienen una mezcla de los tres tipos de poliovirus con el fin de conferir inmunidad contra todos ellos. Un tipo de vacuna del poliovirus es la Vacuna de la Polio Inactivada (VPI) basada en la cepa Salk (Salk VPI). La vacuna contiene los tres tipos de virus de la polio, inactivados por formalina. La ventaja principal de Salk VPI es que puede incorporarse con otras inmunizaciones en la niñez como DPT. Sin embargo Salk VPI tiene varias desventajas tales como el requerimiento de estándares estrictos para desarrollar la cepa Salk del poliovirus, el riesgo potencial debido a la liberación accidental al ambiente de virus de polio virulentos vivos al manejar la cepa virulenta de los virus de la polio durante su procedimiento de producción. Además las formulaciones de vacunas que comprenden la cepa Salk son costosas, y tienen una potencia comparativamente menor. Otro tipo de Vacua para la Polio disponible es la Vacuna para la Polio Oral (VPO) basada en la cepa Sabin. Esta vacuna administrada oralmente consiste de cepas inactivadas vivas de virus de la polio. Dichas composiciones de vacuna que comprenden cepas Sabin inactivadas del virus de la polio son comparativamente más baratas que la Vacuna de la Polio Inactivada (VPI) basada en la cepa Salk.

La VPO se usa comúnmente debido a la fácil disponibilidad de masas monovalentes, mayor número de instalaciones de elaboración, facilidad de administración, y más significativamente, la manufactura de VPO no posee ningún riesgo de liberación accidental al ambiente de virus de polio virulento. Sin embargo, algunas de las desventajas asociadas con la VPO son la destrucción de la PVO a temperaturas menores de 20°C, a la inversión de cepas atenuadas a cepas virulentas en la composición de la vacuna, y poliomielitis paralítica asociada con la vacuna. La patente de EUA 5,639,649 de Almond et al se relaciona con la construcción de vacunas contra los rinovirus y enterovirus, particularmente poliovirus, por la introducción de mutaciones definidas en sus genomas. Estas mutaciones atenúan la virulencia de los virus de tipo salvaje y pueden atenuar adicionalmente las cepas de virus de vacunas atenuadas, haciéndolas así menos probable a revertir la virulencia. La patente de EUA número 5,618,539 de Dorval et al se refiere a vacunas virales estabilizadas, particularmente vacunas virales vivas para poliomielitis, que comprenden una solución acuosa de virus vivo y una cantidad estabilizadora de un compuesto que contiene al menos dos grupos amino o ¡mino, tales como aminoácidos básicos, por ejemplo, lisína. La patente de EUA número 4,525,349 de Montagnon et al describe un procedimiento para la producción a gran escala de vacuna de poliomielitis. Sin embargo, no menciona el procedimiento de estabilización del virus de la polio antes de la etapa de inactivación.

Aquí, existe una necesidad no cubierta para desarrollar composiciones de vacunas más baratas que comprendan virus de la polio atenuados vivos, que puedan administrarse por inyección y que estén libres de toxicidad o tengan una toxicidad reducida, sin comprometer la inmunogenicidad. Además, a pesar de que en la técnica se conocen diferentes tipos de vacunas para la polio, no existe ninguna descripción en la técnica anterior acerca de una formulación estable y eficaz que comprenda la vacuna de la polio inactivada derivada de la cepa Sabin y de otros antígenos efectivos contra patógenos que causan infecciones entre niños o adultos, particularmente niños, que no posean toxicidades o sean menos tóxicas, y sean inmunogénicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es proporcionar una Vacuna para la Polio Inactivada derivada de la cepa Sabin para la inmunización efectiva contra la Poliomielitis. También un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de una Vacuna de la Polio Derivada de la cepa Sabin para la inmunización efectiva contra la Poliomielitis caracterizada porque la cepa Sabin del virus de la Polio es estabilizada primero por la adición de un estabilizador, y después inactivada por un inactivador.

De conformidad con un procedimiento de la presente invención, la masa monovalente del virus de la polio se estabiliza inicialmente agregando estabilizador seguido por la inactivación que comprende las siguientes etapas: i) estabilización inicial de la masa del virus de la polio por la adición de estabilizador, ¡i) la adición de inactivador tal como formaldehído (formalina) o beta-propiolactona a cada una de los acumulados de monovalentes purificados o solo calentamiento del acumulado, iii) incubación a aproximadamente 37°C hasta 48 horas y después a 2°C hasta 8°C hasta 12 días en un ciclo sencillo antes de un procesamiento adicional, iv) probar el contenido de formaldehído o la concentración de inactivador realizada cada 12 horas durante el procedimiento de inactivación y el nivel de concentración deseada es mantenido por reajustes intermitentes, v) opcionalmente realizar una segunda filtración después del procedimiento de inactivación, De conformidad con otro procedimiento de la presente invención, la masa monovalente del virus de la polio es estabilizada inicialmente por la adición de un estabilizador seguido por la inactivación que comprende las siguientes etapas: i) estabilización inicial de la masa del virus de la polio por la adición de un estabilizador, ¡i) adición de inactivador tal como formaldehído (formalina) o beta-propiolactona o solo calentamiento. iii) incubación a 37°C durante 4 horas seguido por enfriamiento a 2°C hasta 8°C durante 20 horas, iv) repetición de la incubación y del ciclo de enfriamiento hasta 12 veces de tal manera que la exposición a 37°C no exceda 48 horas durante 12 días de incubación, v) probar el contenido de formaldehído libre o la concentración del inactivador realizado cada 12 horas durante el procedimiento de inactivación y el nivel de concentración deseada se mantiene por reajustes intermitentes, vi) opcionalmente efectuar una segunda filtración realizada después del procedimiento de inactivación. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una formulación que comprende una Vacuna de Polio Inactivada derivada de la cepa Sabin para inmunización contra la Poliomielitis caracterizada porque las cepas del virus de la Polio se estabilizan primero agregando un estabilizador y después son inactivadas por medio de un inactivador. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar formulaciones de vacunas de Polio estables y efectivas con otros antígenos que al administrarse proporcionan inmunización no solo contra la infección de la polio sino también contra otros patógenos que ocasionan la Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Meningitis A, Meningitis B. Meningitis C, Meningitis W, Meningitis Y, Neumococo (23 valente o más), viruela, tifoidea, Bacilo Calmette Guerin, tubercolosis, Virus de la inmunodeficiencia humana, ántrax, o similar, a los cuales son susceptibles los niños o los adultos, particularmente los niños son susceptibles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una Vacuna de la Polio Inactivada derivada de la cepa Sabin para inmunización efectiva contra la Poliomielitis. La presente invención proporciona una Vacuna de la Polio derivada de la cepa Sabin para la inmunización efectiva contra la Poliomielitis preparada a partir de la cepa de semilla de Sabin o suspensiones másicas monovalentes de la cepa Sabin para mezclar vacuna oral trivalente para polio o por crecimiento de virus de la Polio de la cepa Sabin (a partir de masa monovalente usada para PVO trivalente) en la línea celular vero o en cualquier cultivo celular adecuado caracterizado porque el virus de la Polio se estabiliza primero agregando un estabilizador, tal como aquí se describe, y después inactivado por la adición de formaldehído (formalina) de conformidad con una modalidad específica de la invención. La vacuna de la Polio de la presente invención elimina las desventajas asociadas con vacunas de la Polio conocidas, PVO y Salk VPI.

En una modalidad, la vacuna de la polio inactivada derivada de la cepa Sabin es trivalente conteniendo una mezcla de los tres tipos de polio es decir tipo 1 , tipo 2 y tipo 3. En una modalidad esencial de la presente invención, los virus de la polio se estabilizan antes de inactivar los virus para retener su forma, dado que la forma tridimensional de los virus es muy importante para su antigenicidad (inmunogenicidad). El procedimiento de estabilización antes de la inactivación protege las ya débiles cepas de Sabin de que se deformen o dañen durante el procedimiento de inactivación. El procedimiento de estabilización de la masa monovalente de poliovirus incluye la adición de estabilizador(es) seleccionados pero sin limitarse al grupo que comprende sucrosa, trehalosa, arginina, hidrocloruro, gelatina, cloruro de magnesio, cloruro de aluminio, y EDTA disódica, utilizada sola o en combinación con los mismos, para retener la antigenicidad de la vacuna durante el procedimiento de inactivación. En una modalidad, el procedimiento de inactivación de cada uno de los acumulados monovalentes purificados incluye la adición de inactivador tal como, pero sin limitarse a formaldehído (formalina) o betapropiolactona, o una mezcla de los mismos, preferentemente a una concentración de aproximadamente 0.001 % a 0.1 %, más preferentemente a 0.025%, y/o calentamiento e incubación de aproximadamente 37°C para un número optimizado de días.

La presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de una vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin para la inmunización efectiva contra la poliomielitis. En una modalidad, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de una vacuna para la polio a partir de de la cepa de la semilla Sabin o de suspensiones de masa monovalente de la cepa Sabin usadas para el mezclado de la vacuna de para la polio oral trivalente o por desarrollo de virus de la cepa Sabin en la línea de células vero o cualquier cultivo celular adecuado para la preparación de la vacuna para la polio oral caracterizado porque la vacuna de la polio preparada es estabilizada por medio de un estabilizador y después son inactivadas por un inactivador. En una modalidad preferida, la vacuna de la polio preparada de la cepa Sabin, como se estableció anteriormente, puede estabilizarse e inactivarse, de acuerdo con la presente invención, por medio de uno de los siguientes dos procedimientos.

Procedimiento I Procedimiento de estabilización: La masa monovalente del poliovirus es estabilizado inicialmente por la adición de un estabilizador como la sucrosa, trehalosa o hidrocloruro de arginina, para retener la antigenicidad de la vacuna durante el procedimiento de inactivación. Procedimiento de Inactivación: El procedimiento de inactivación se inicia inmediatamente. La inactivación de cada uno de los acumulados monovalentes filtrados y purificados se lleva a cabo por la adición de formaldehído (formalina) a una concentración de 0.025% o beta-propiolactona e incubación de aproximadamente 37°C hasta 48 horas y después de 2°C a 8°C hasta 12 días en un solo ciclo antes de un procesamiento adicional. Cualquiera de los tratamientos podría usarse para inactivación. La prueba para el contenido de formaldehído libre se realiza después de cada 12 horas durante el procedimiento de inactivación y el nivel de concentración deseada es mantenido por reajustes intermitentes. Una segunda filtración se realiza después del procedimiento de inactivación. La inactivación consistente del virus es monitoreado y verificado.

Procedimiento II: Procedimiento de Estabilización. Las vacunas másicas monovalentes son estabilizadas usando el mismo procedimiento como se describió para el procedimiento I. Procedimiento de Inactivación: la inactivación se lleva a cabo por la adición de formaldehído (formalina) a 0.025% de concentración o beta-propiolactona e incubación a 37°C durante 4 horas seguido por enfriamiento a 2°C hasta 8°C durante 20 horas. Esta incubación y enfriamiento puede repetirse hasta 12 veces de tal manera que la exposición total a 37°C no excede 48 horas durante 12 días de incubación. La prueba para el contenido de formaldehído libre se realizará después de cada 12 horas durante el procedimiento de inactivación y el nivel de concentración deseada se mantiene por reajustes intermitentes. Una segunda filtración se realiza después del procedimiento de inactivación. La inactivación consistente del virus es monitoreado y verificado. Se asegura el mantenimiento de la integridad de potencia/antigénica de los virus de Sabin altamente lábiles al calor. Los procedimientos de inactivación son estandarizados en tal forma que el virus inactivado vivo de cada tipo es inactivado completamente y el procedimiento asegura una estructura antigénica intacta de la cepa Sabin. La vacuna inactivada es capaz de impartir una inmunidad adecuada en vacunas cuando se compara con la vacuna estándar. El poliovirus de la cepa de Sabin, en la presente invención, es estabilizado antes de la inactivación usando estabilizador como sucrosa, trehalosa, hidrocloruro de arginina, cloruro de magnesio, cloruro de aluminio, y EDTA disódica para evitar la degradación de la cualidad nativa y estructura antigénica. La vacuna para la polio ¡nactivada, preparada de conformidad con la presente invención en forma monovalente, bivalente o trivalente ha requerido una cantidad antígeno D equivalente o forma de antígeno que podría compararse con un estándar de referencia establecida de vacuna para la polio ¡nactivada y/o proporcionar sero-conversión y protección requerida. La vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin (VPIS) preparada de conformidad con la presente invención, posee las ventajas tanto de la VPO como de la VPI Salk. El procedimiento de manufactura no requiere desarrollar cepas virulentas de poliovirus y por lo tanto los cambios de liberación accidental de los virus de la polio virulentos vivos al ambiente es muy baja. Asimismo las cepas del virus de la polio retienen su forma aún en las formulaciones que previenen un compromiso en la inmunogenícidad, dado que la forma tridimensional de los virus es muy importante para su efectividad. Además, la VPIS no tiene desventajas como vacunas de poliomielitis paralítica asociada con la vacuna. Asimismo, la VPIS de la presente invención puede combinarse efectivamente con otros antígenos proporcionando así una inmunización efectiva contra varias enfermedades al mismo tiempo. La cepa Sabin derivada de la vacuna de la Polio usada en las formulaciones de conformidad con la presente invención puede ser trivalente conteniendo una mezcla de los tres tipos a decir Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3 de virus de la Polio o puede ser una mezcla de cualquiera de dos de esos tipos. La administración de las formulaciones de la Vacuna de la Polio preparadas de conformidad con la presente invención superaría o al menos mitigarían los problemas asociados con las múltiples inyecciones de los diferentes antígenos. Las formulaciones proporcionadas por la presente invención son estables y altamente inmunogénícas lo cual es adecuado para la administración a niños o adultos. Particularmente adecuadas para la administración a niños. En una modalidad de la presente invención, la vacuna para la polio obtenida por los métodos estandarizados se usan para proporcionar una formulación de vacuna multivalente que comprende vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin (VPIS). En otra modalidad, se usa la vacuna para la polio obtenida por los métodos estandarizados para proporcionar una formulación de vacuna multivalente que comprende vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin (VPIS) y un número "n" de otros antígenos, opcionaimente en combinación con un adyuvante que comprende una o más sales de aluminio, en las cuales el valor de "n" es 1 o mayor que 1. Preferentemente el valor de "n" es de aproximadamente 1 a 30. Más preferentemente el valor de "n" es 2, 3, 4, 5 ó 6. El término "multivalente" se usa aquí para referirse a la formulación de vacuna que comprende al menos dos o más antígenos. En aún otra modalidad de la presente invención, se proporciona una formulación, en donde la vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin es trivalente conteniendo una mezcla de los tres tipos de polio virus s saber Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3, o bivalente conteniendo una mezcla de cualquiera de dos tipos de poliovirus seleccionados del Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3. En aún otra modalidad de la presente invención, una formulación se provee en donde la vacuna es multivalente. Los otros antígenos presentes en las formulaciones de la Vacuna de la Polio de conformidad con la presente invención se seleccionan de, pero no se limitan a aquellos que proporcionan inmunidad contra uno o más antígenos de los patógenos que ocasionan infecciones como Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Meningitis A, Meningitis B, Meningitis C, Meningitis W.

Meningitis Y, Neumococo (23 valente o más), viruela, tifoidea, tuberculosis, virus de la inmunodeficiencia humana, ántrax o similares, a las cuales son susceptibles los niños o adultos, particularmente a las cuales son susceptibles los niños. El adyuvante o los adyuvantes usados en la presente invención incluyen pero no se limitan a hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, emulsiones de aceite tales como adyuvantes de aceite emulsionado de Freund (completos o incompletos), Arlacel A, aceite mineral, adyuvante de aceite de maní emulsionado (adyuvante 65), productos de bacterias (sus derivados sintéticos así como liposomas) o bacterias gram negativas, endotoxinas, colesterol ácidos grasos, aminas alifáticas, aceites parafínicos y vegetales, algamulina, y QS-21. Preferentemente, el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio se usan como adyuvantes ya sean solos o en combinaciones de los mismos. En una modalidad, las formulaciones de la presente invención comprenden adicionalmente, pero no se limitan conservadores o fijativos para tejidos o ambos. Los conservadores usados en las formulaciones de la presente invención se seleccionan de, pero no se limitan a etil mercurio, timerosal, mertiolate, y 2-fenoxi etanol, usados ya sean solos o en combinación de los mismos. El fijativo de tejidos usado en las formulaciones de la presente invención es pero no se limita a formaldehído.

En otro aspecto, la invención proporciona una formulación de vacuna que comprende vacuna para la polio inactivada derivada de Sabin (VPIS) adsorbida a fosfato de aluminio y un antígeno adsorbido a AP o a hidróxido de aluminio (AH) o cualquier otro adyuvante seleccionado de un antígeno que proporciona inmunidad contra uno o más de los siguientes patógenos es decir Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Meningitis A, Meningitis B. Meningitis C, Meningitis W, Meningitis Y, Neumococo (23 valente o más), viruela, tifoidea, Bacilo Calmette Guerin, tuberculosis, Virus de la inmunodeficiencia humana, ántrax, o similares. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una formulación de vacuna estable y efectiva dirigida a la prevención de al menos dos enfermedades que comprenden VPIS y al menos algún otro antígeno seleccionado de Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Meningitis A, Meningitis B. Meningitis C, Meningitis W, Meningitis Y, Neumococo (23 valente o más), viruela, tifoidea, Bacilo Calmette Guerin, tuberculosis, Virus de la inmunodeficiencia humana, ántrax, o similares. En otra modalidad de la presente invención, las formulaciones también incluyen antígenos compatibles con VPIS como los antígenos contra Meningitis B. Meningitis A y C, o medios de otitis. En una modalidad adicional, los virus monovalentes inactivados se mezclan con, pero no se limitan a estabilizador y/o conservador para hacer una vacuna monovalente, bivalente, trivalente o multivalente. La vacuna final puede secarse por aspersión y volverse a suspender en líquidos listos para inyectarse como perfluorocarbonos, que no requieren refrigeración para almacenaje o preparación antes de la inyección. Las formulaciones preparadas de conformidad con la presente invención pueden administrarse a través de, pero no se limitan a las rutas tales como oral, transdérmica, parenteral, nasal mucosa, y similares. En una modalidad preferida de la presente invención, la formulación es administrada como una inyección a través de la vía parenteral, particularmente la vía subcutánea o intramuscular. El ejemplo que se proporciona a continuación ilustra las modalidades de la presente invención. Sin embargo, no pretende limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLO 1 Cepa de semilla del mismo tipo y pasaje como el utilizado para la vacuna de la poliomielitis (oral): La Vacuna para la Polio Oral (VPO) es propagada para producir una suspensión monovalente para inactivación.

Cultivo Celular i) Los diferentes substratos celulares para propagación de virus incluyen línea celular diploide humana, células de riñon de mono, línea celular Vero o cualquier otro cultivo celular adecuado. ii) Producción a gran escala de células: 1. Preparación del banco celular de trabajo del fabricante (MWCB, por sus siglas en inglés): MWCB en el caso de cultivos de células primarias (células derivadas de tejido normal y almacenadas congeladas a menos 70°C) o de cualquier otra línea celular continua permitida preparada de células y de células acumuladas después de un subcultivo en serie en el número especificado de cultivos celulares. 2. Cualquiera de los siguientes sistemas se puede usar cualquiera que sea adecuado, para el aumento gradual en el volumen de las células. - Botellas de rodadura: El crecimiento en botellas de rodadura difiere de los cultivos estacionaros en la distribución de células en la superficie del vidrio y la densidad de células máxima alcanzable. Los cultivos en botellas de rodadura nos se deterioran menos rápido porque pueden tolerar una densidad cerca de dos veces mayor que los cultivos estacionarios. Las células de mamíferos desarrolladas en cultivo de monocapas se adaptarán mejor a la técnica de botella de rodadura. - Fábricas de Células: Éstas son pilas de bandejas de cultivo que comparten un puerto de entrada y de salida común. Éstas proporcionan células con una superficie de crecimiento tan grande como el interior de una botella de rodadura, pero ocupan menos espacio dentro de la incubadora. Éstas son ideales para cultivos celulares adherentes, tienen bajo riesgo de contaminación y son compactos. - Matraces Roux - Sistema microportador 3. Las muestras para control de cultivos celulares son incubados durante al menos dos semanas y éstas son examinadas para evidencias de cambios citopáticos.

Propagación del Virus de la Polio en Cultivos Celulares: i) Sistema de lotes de semillas: a) Nivel de pasaje seguido para la Vacuna para la Polio Oral OR b) Su siguiente nivel de pasaje se deriva de la suspensión másica monovalente que podría usarse para elaborar la vacuna para la polio oral. 1. La vacuna es elaborada con base en el sistema de lotes de semillas de virus. El lote de semillas de virus es una cantidad de virus procesado conjuntamente y de composición uniforme preparado a partir de un lote de semillas. 2. El subcultivo del virus de semilla no deberá hacerse más de 10 veces, contados de un lote de semillas usado para la producción de la vacuna en el cual se realizaron pruebas originales de laboratorio y de campo.

Cosecha Simple y Acumulados Monovalentes: El virus es propagado en cultivos celulares y cosechado a partir de los cultivos celulares derivados de un solo lote de células y procesados conjuntamente. Esto se conoce como cosecha simple. Las cosechas simples de un tipo de suspensión de virus son procesadas al mismo tiempo para obtener la forma cruda del acumulado monovalente.

Filtración o Clarificación del Acumulado Monovalente: La suspensión de virus crudo de cada acumulado monovalente es purificada gradualmente a través de filtros de porosidad decreciente. El propósito de la etapa de filtración es remover material en forma de partículas y otra substancia que puede afectar el procedimiento de inactivación al tender tales agregados a aumentar al estar en reposo.

Concentración del Acumulado Monovalente: Cada acumulado monovalente filtrado se concentra por ultra filtración.

Purificación del Acumulado Monovalente Se emplea cromatografía con DEAE sefarosa / columna de ADNasa inmovilizada / columna de inmuno-adsorción para la purificación del acumulado monovalente. El procedimiento de purificación reduce consistentemente el nivel del ADN celular del de la cosecha de virus inicial por un factor de por lo menos 108. La concentración de antígeno D se determina por ELISA y presentación de inmunogenicidad comparable en ratas. La potencia se ajusta de manera correspondiente. Los acumulados monovalentes de poliovirus se mezclan para formar el producto másico trivalente final.

Establecimiento del Virus Sabin antes de la Inactivación: La antigenicidad de la vacuna está cercanamente asociada con la estabilidad de sus antígenos de virus nativo durante el procedimiento de inactivación. La estructura antigénica del poliovirus se estabilizará inicialmente agregando un estabilizador como sucrosa, trehalosa, o hidrocloruro de arginina.

Inactivación Usando Formaldehído: i) El procedimiento de inactivación se inicia preferentemente en 24 horas y no después de 72 horas después de la filtración. ii) La inactivación de cada uno de los acumulados monovalentes filtrados y purificados se lleva a cabo por la adición de formaldehído (formalína) a 0.025% e incubación a 37°C durante el tiempo específico como se describió anteriormente. La prueba para formaldehído libre se realiza a intervalos y el nivel de concentración deseada se mantiene por reajustes intermitentes. iii) Una segunda filtración se realiza por reajustes intermitentes, iv) La inactivación consistente del virus es monitoreada y verificada. v) Para probar el grado de inactivación, el formaldehído es neutralizado por la adición de bisulfito de sodio y su dializacón subsiguiente.

Formulación v manufactura de la Vacuna: La masa ¡nactivada purificada es filtrada, preferentemente a través de un filtro de 0.22 micrones o 0.45 micrones. Los virus monovalentes inactivados se mezclan opcionalmente con el estabilizador y/o conservador para hacer vacuna inactivada monovalente, bivalente, trivalente o multivalente.

Pruebas de Eficacia de la Vacuna: La eficacia de la vacuna elaborada de acuerdo a lo anterior, en comparación con la vacuna de referencia establecida, resulta ser similar en el método in-vitro y/o in-vivo. Se llevaron a cabo varias otras pruebas basadas en los métodos estándar aceptados en la vacuna elaborada anteriormente tales como determinación del pH, prueba de esterilidad, prueba para determinar la inactivación efectiva, estudio de toxicidad anormal, medición del volumen, determinación de potencia ¡n vitro, prueba de endotoxina, prueba de identidad, estimación del contenido de nitrógeno de proteínas, y determinación del contenido de estabilizador y de formaldehído para asegurar su efectividad, seguridad y potencia. La potencia ¡n vitro de la VPIS manufacturada líneas arriba se determinó usando ELISA Intercalada. Dos anticuerpos surgidos en diferentes especies contra el virus de la polio se utilizaron para lo mismo y un segundo anticuerpo conjugado con HRP se usa nuevamente como el segundo anticuerpo primario. Los resultados se analizaron comparando con la referencia estándar. La prueba de identidad para la vacuna se llevó a cabo usando ELISA directa. El antígeno se recubrió bien en 96 placas de ELISA y se emplea suero antipolio de tipo específico para determinar la presencia de los tres tipos de virus de la polio en la vacuna.

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una Vacuna para la Polio Inactivada derivada de la cepa

Sabin para la inmunización efectiva contra la Poliomielitis es trivalente o bivalente conteniendo una mezcla de os tres tipos o una mezcla de cualesquiera de dos tipos de virus de la polio a decir Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3, preparada a partir de la cepa semilla de Sabín o de suspensiones másicas monovalentes de la cepa Sabin usadas para mezclar vacuna para la polio oral trivalente o bivalente o desarrollando virus de la polio de la cepa Sabin en una línea celular Vero o cualquier cultivo celular adecuado para la preparación de vacuna para la polio oral, caracterizada porque la vacuna para la polio es estabilizada inicialmente por medio de un estabilizador y después inactivada por medio de un inactivador. 2 - La vacuna para polio de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el estabilizador se selecciona del grupo que comprende trehalosa, hidrocloruro de arginina, gelatina, cloruro de aluminio, y EDTA disódica, usados solos o combinaciones de los mismos.

3.- La vacuna para la polio de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el inactivador se selecciona del grupo que comprende formaldehído o beta-propiolactona o mezclas de los mismos.

4.- Un procedimiento para la preparación de una vacuna para la polio a partir de la cepa semilla de Sabin o de suspensiones másicas monovalentes de la cepa Sabin usadas para mezclar vacuna para la polio oral trivalente o bivalente o desarrollando virus de la polio de la cepa Sabin en una línea celular Vero o cualquier cultivo celular adecuado para la preparación de vacuna para la polio oral, caracterizado porque dicho procedimiento comprenden la estabilización del virus de la polio por medio de un estabilizador seguido por un inactivador.

5.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la masa monovalente del virus de la polio es estabilizado inicialmente seguido por inactivación que comprende las siguientes etapas: i) estabilización inicial de la masa del virus de la polio por la adición de estabilizador, ii) la adición de inactivador tal como formaldehído o beta-propiolactona a cada una de los acumulados de monovalentes purificados o solo calentamiento del acumulado, iii) incubación a aproximadamente 37°C hasta 48 horas y después a 2°C hasta 8°C hasta 12 días en un ciclo sencillo antes de un procesamiento adicional, iv) probar el contenido de formaldehído o la concentración de inactivador realizada cada 12 horas durante el procedimiento de inactivación y el nivel de concentración deseado es mantenido por medio de reajustes intermitentes, v) opcionalmente realizar una segunda filtración después del procedimiento de inactivación.

6.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la masa monovalente del virus de la polio es estabilizada inicialmente seguido por la inactivación que comprende las siguientes etapas: i) estabilización inicial de la masa del virus de la polio por la adición de un estabilizador, ii) adición de inactivador tal como formaldehído (formalina) o beta-propiolactona o solo calentamiento; iii) incubación a 37°C durante 4 horas seguido por enfriamiento a 2°C hasta 8°C durante 20 horas, iv) repetición de la incubación y del ciclo de enfriamiento hasta 12 veces de tal manera que la exposición a 37°C no exceda 48 horas durante 12 días de incubación, v) probar el contenido de formaldehído libre o la concentración del inactivador realizado cada 12 horas durante el procedimiento de inactivación y el nivel de concentración deseado se mantiene por medio de reajustes intermitentes, vi) opcionalmente efectuar una segunda filtración después del procedimiento de inactivación.

7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el estabilizador se selecciona del grupo que consiste de trehalosa, arginina, hidrocloruro, gelatina, cloruro de magnesio, cloruro de aluminio, y EDTA disódica, utilizada sola o en combinación con los mismos.

8.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el inactivador es formaldehído o beta-propiolactona o mezclas de los mismos.

9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende mezclar vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin absorbida en un adyuvante convencional con un número "n" de otros antígenos en donde el valor de "n" es de aproximadamente 1 a 30.

10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque los otros antígenos se seleccionan de un grupo que comprende Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Meningitis A, Meningitis B. Meningitis C, Meningitis W, Meningitis Y, Neumococo (23 valente o más), viruela, tifoidea, Bacilo Calmette Guerin, tuberculosis, Virus de la inmunodeficiencia humana, ántrax, usados solos o en combinaciones de los mismos.

11.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la vacuna para la polio ¡nactivada derivada de la cepa Sabin es trivalente conteniendo una mezcla de los tres tipos de virus de la polio a decir Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3.

12.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin es bivalente conteniendo una mezcla de los tres tipos de virus de la polio a decir Tipo 1 , Tipo 2 y Tipo 3.

13.- Una formulación de vacuna para la polio inactivada derivada de la cepa Sabin para la inmunización efectiva contra la poliomielitis, en donde la vacuna es preparada a partir de la cepa semilla de Sabin o de suspensiones másicas monovalentes de la cepa Sabin usadas para mezclar vacuna para la polio oral trivalente o bivalente o desarrollando virus de la polio de la cepa Sabin en una línea celular Vero o cualquier cultivo celular adecuado para la preparación de vacuna para la polio oral, caracterizada porque la vacuna para la polio preparada es estabilizada inicialmente por medio de un estabilizador y después ¡nactivada por medio de un inactivador y es adsorbida sobre un adyuvante opcionalmente con un número de "n" antígenos de otros antígenos en donde el valor de "n" es de aproximadamente 1 a 30.

14.- La formulación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque los antígenos se seleccionan de un grupo que comprende Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Meningitis A, Meningitis B. Meningitis C, Meningitis W, Meningitis Y, Neumococo (23 valente o más), viruela, tifoidea, Bacilo Calmette Guerin, tubercolosis, Virus de la inmunodeficiencia humana, ántrax, usados solos o en combinaciones de los mismos.

15.- La formulación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque comprende adyuvantes seleccionados de un grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, emulsiones de aceite tales como adyuvantes de aceite emulsionado de Freund (completos o incompletos), Arlacel A, aceite mineral, adyuvante de aceite de maní emulsionado (adyuvante 65), productos de bacterias (sus derivados sintéticos así como liposomas) o bacterias gram negativas, endotoxinas, colesterol ácidos grasos, aminas alifáticas, aceites parafínicos y vegetales, algamulina, y QS-21 usados solos o en combinaciones de los mismos.

16.- La formulación de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque comprende adicionalmente, un conservador o fijativo para tejidos o ambos.

17.- La formulación de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el conservador se selecciona del grupo que comprende etil mercurio, timerosal, mertiolate, y 2-fenoxi etanol, usados ya sean solos o en combinación de los mismos.

18.- La formulación de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el fijativo de tejidos usado es formaldehído.

19.- Una vacuna para la polio, un procedimiento para la preparación de la vacuna para la polio y la formulación de la vacuna para la polio derivada de la cepa Sabin substancialmente como se describió e ilustró en la presente.