DK158743B - Fremgangsmaade til fremstilling af et levende, svaekket hepatitis a virus og diagnostisk praeparat opnaaet ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 158743B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et levende, svækket hepatitis A virus og et diagnostisk præparat opnået ved fremgangsmåden.

5 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l’s kendetegnende del anførte, og præparatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det i krav 8's kendetegnende del anførte.

10 I US-A-3 105 011 påstås det, at der tilvejebringes fremgangsmåder til propagering af såvel hepatitis A virus som hepatitis B virus i vævskultur. Den påståede lære er imidlertid blevet modbevist af nyere, yderst pålidelige undersøgelser af forskere med særligt kendskab til hepa-15 titis. Der henvises i denne forbindelse til følgende artikler: - Science, bind. 182, dec. 1973, pp. 1026-1028, især side 1027, anden spalte, sidste sætning af det fuldstændige 20 afsnit; - Purcelle et al.. Am. J. Med. Sci., bind. 270, nr. 1, 1975, side 61-62; 25 - Cabasso et al., udg. Developments in Biological Stan dardization, bind. 30, pp. 390, 391 og 464, S. Karger Basel, 1975; og - Lenette et al., udg. Diagnostic Procedures for: Viral, 30 Rickettsial and Chlamydial Infections, 5. udg., side 907, American Public Health Assoc. 1979.

Disse artikler modbeviser den påståede lære fra US patentskrift nr. 3 105 011 og viser utvetydigt, at den på-35 ståede propagering af hepatitis A virus som anført i denne reference er ukorrekt.

2

DK 158743 B

Det er endvidere kendt, at hepatitis A har en diameter på ca. 27 nm (Feinstone et al., J. Virology, juni 1974, pp. 1412-1414). I US patentskrift nr. 3 105 011 anføres, at levende virus blev passeret gennem en række filtre med en 5 porediameter beliggende i intervallet 5,0 til 0,45 mu, som er det samme som en porediameter på 5,0 til 0,45 nm.

Da hepatitis A virus har en partikelstørrelse på 27 nm, er det fysisk umuligt for det at passere gennem filtre, hvis største porediameter er 5,0 nm. Det er derfor indly-10 sende, at hvilket materialet, der end er opnået ved den i US patentskriftet beskrevne proces, var det helt indlysende ikke hepatitis A virus.

Det har vist sig, at hepatitis A virus, som er blevet 15 adapteret ved mindst én passage i leveren af en modtagelig sub-human primat, f.eks. egernabe, ugleabe, afrikansk grøn abe, rhesusabe eller chimpanse, med held kan passeres i cellekultur. Der foretages foretrukkent mindst fem passager i den modtagelige sub-humane primat. Det fore-20 trækkes også, at der anvendes mindst to sub-humane prima tarter, og at der anvendes mindst to passager i hver art.

Efter den sidste passage fjernes den inficerede lever, og 25 den homogeniseres og klares og anvendes til inokulering af cellekulturer.

Cellekulturerne kan være primære egernabe-levercellekul-turer, primære afrikansk grøn åbe-nyrecellekulturer, pri-30 mære rhesusabe-nyrecellekulturer, primære cynomolgus abe-nyrecellekulturer, rhesusabefoster-nyrecellekulturer, cercopithecus-abefoster-nyrecellekulturer, rufiventer-egernabefoster-nyrecellekulturer, eller en vilkårlig, kontinuert eller transformeret nyre- eller levercellekul-35 tur afledt fra et menneske eller en sub-human primat, som er modtagelig for hepatitis A virus-infektion. Cellekulturerne kan også bestå af primære hele kyllingefostre el-

DK 158743 B

3 ler andefosterceller eller celler afledt fra nyrerne af nyfødte kyllinger eller ællinger.

Cellekulturen inkuberes ved ca. 33 °C til ca. 39 °C, fo-5 retrukkent ved ca. 35 °C til ca. 37 °C, indtil hepatitis A antigen kan påvises enten i cellelaget eller i vævskulturvæsken. Typisk kræves ca. 7 til ca. 35 dage for udvikling af påviseligt hepatitis A antigen. Antigenet påvises hensigtsmæssigt i cellelaget ved fluorescens-antistofme-10 toder, og i vævskulturvæsken enten ved immun-adhærens-hæ-magglutinationsprøve eller ved radioimmun prøve.

Seriepassager in vitro kan udføres ubegrænset. Med efterfølgende passager opnås der bedre adaption af virus til 15 in vitro dyrkning, hvilket sandsynliggøres ved hurtigere forekomst af hepatitis A antigen og produktionen af større mængder af det virale antigen.

Efter fem eller flere seriepassager in vitro af hepatitis 20 A virus i de i det foregående nævnte celletyper viser det sig, at viruset modificeres således, at det let kan dyrkes i yderligere celletyper som følger: humane føtale di-ploide lungefibroblastceller, føtale rhesus-diploide lungeceller og føtale cercopithecus-diploide lungeceller.

25 Disse celletyper er alle hensigtsmæssige til anvendelse ved fremstillingen af levende svækkede humane viralvacci-ner.

Det humane hepatitis A virus kan således modificeres ved 30 seriepassager i levere fra sub-humane primater og påfølgende seriepassager i cellekulturen og kan anvendes til tilvejebringelse af en levende, svækket human viralvacci-ne og kan desuden dyrkes på økonomisk måde i så stor mængde i cellekultur, at det muliggør produktion af en 35 tilstrækkelig mængde viralantigen til fremstilling af en antigen, immunogen viralvaccine og også til fremstilling af hepatitis A antigen til diagnostiske præparater. Hel

DK 158743B

4 virus er fordelagtigt frem for virale underenheder ved diagnose og påvisning af hepatitis. Det er endvidere en fordel ved præparatet ifølge opfindelsen, at man undgår at anvende det farlige, patogene virus i diagnostiske la-5 boratorier.

Hepatitis A antigenet kan inaktiveres til anvendelse som vaccine mod hepatitis A virus. Inaktivering af infektivi-tet kan opnås ved behandling med formalin. Den mængde 10 formalin, der anvendes, er effektiv til at inaktivere in-fektiviteten af antigenet, mens det beholder immunogeni-teten, så at materialet er effektivt som vaccine. Typisk fortyndes formalin, 37%'s formaldehydopløsning, i ca.

1000 til ca. 10 000 dele af antigenpræparatet, og der om-15 røres ved ca. 4 °C til ca. 60 “C i ca. 2 timer til ca. 30 dage, idet formalinen fortrinsvis fortyndes i ca. 2000 til ca. 6000 dele viruspræparat ved ca. 20 °C til ca. 45 “C i ca. 2 dage til ca. 6 dage, særligt foretrukkent ved ca. 37 “C i ca. 3 dage.

20

Vaccinen kan anvendes til at immunisere mod hepatitis A virus i modtagelige pattedyrearter, som f.eks. egernaber og chimpanser.

25 De efterfølgende eksempler forklarer opfindelsen nærmere. EKSEMPEL 1

Seriepassage af hepatitis A virus i egernaber til frem-30 stilling af en viral stamme til in vitro dyrkning (1) Human hepatitis A virus, stamme CR326, overføres til en gruppe på 6 Saguinus mystax egernaber ved intravenøs inokulering af blod fra et akut sygt menneske 35 med hepatitis A efter proceduren af Mascoli et al., P.S.E.B.M. 142, 276-282, 1973.

DK 158743 B

5 (2) Disse inokulerede egernaber udvikler forøgelse af serum-isocitrin-dehydrogenase (ICD) enzymværdier inden for 30-50 dage efter inokulationen såvel som histologiske ændringer i leveren på grund af viral he- 5 patitis.

(3) En anden passage af CR326-midlet udføres i mystax egernaber ved intravenøs inokulering af serum taget fra dyr fra første passage i den periode, hvor ICD- 10 forøgelsen finder sted, til en anden gruppe mystax egernaber. Denne procedure øger yderligere ICD-dan-nelsen og leverændringerne som angivet i det foregående.

15 (4) Tredje, fjerde og femte passage af CR326-midlet i mystax egernaber udføres på lignende måde. Ekstensive serumneutraliseringsprøver udføres for at bevise, at CR326-midlet som propageret i egernaberne faktisk er humant hepatitis A virus efter proceduren beskre- 20 vet af Provost et al., P.S.E.B.M. 142, 1267, 1973.

(5) Efter det femte passageniveau udtages levervæv fra en inficeret mystax egernabe på det tidspunkt, hvor den første igangsætning af serum-ICD-forøgelsen fin- 25 der sted.

(6) En 1:1500 fortynding af den homogeniserede lever anvendes til at overføre CR326-infektionen til S. la-biatus (rufiventer) egernaber ved intravenøs inoku- 30 lering. Dette udgør den sjette seriepassage i egern aber, og den første passage i rufiventer egernaber. Levervæv udtages på det tidspunkt, hvor ICD-forøgelsen indtræder, efter den procedure, der beskrives af Provost et al., P.S.E.B.M, 155, 283-286, 1977.

35 (7) En 1:100 opløsning af den homogeniserede lever anvendes til at udføre en anden seriepassage af CR326- 6

DK 158743 B

midlet i en gruppe på 24 rufiventer-egernaber. Der udtages lever af disse dyr som angivet i det foregående.

5 (8) Der udføres ialt 26 seriepassager af CR326-midlet i rufiventer-egernaber ved gentagelse af leverudtagelse, homogenisering, fortynding og intravenøs injektion.

10 (9) CR326-midlet seriepasseres således ialt fem gange i mystax egernaber og yderligere ialt 26 gange i rufi-venter egernaber som beskrevet i trin 1-8.

(10) Levervæv fra inficerede rufiventer egernaber ved den 15 24. til 31. egernabe-passage homogeniseres og kla res. Dette homogeniserede og klarede levervævsprodukt tjener som podemedium til in vitro dyrkning af hepatitis A virus.

20 EKSEMPEL 2

Dyrkning af hepatitis A virus i egernabe levercellekulturer 25 (1) En rufiventer egernabe inokuleres intravenøst med 1 ml af en 1:100 fortynding af homogeniseret, klaret, inficeret levervæv i form af en vandig ekstrakt fremstillet som i eksempel 1.

30 (2) 24-48 timer efter inokulering, før sygdom indtræder, fjernes en del af leveren fra dyret kirurgisk.

(3) Levervævet hakkes fint på en plastoverflade med et barberblad med enkelt kant. Stykkerne vaskes omhyg- 35 geligt med celledyrkningsmedium indeholdende 20% kalvefosterserum. De vaskede stykker lægges på dyrkningsbeholdere af plast eller glas og tilføres tre

DK 158743 B

7 gange pr. uge et dyrkningsmedium indeholdende Williams medium E (indeholdende uorganiske salte, aminosyre, vitaminer, D-glucose, glutathion, methyllin-oleat, phenolrødt og natriumpyruvat) plus 20% normal 5 egernabeserum plus 10”^ molær glucagon plus glut- amin, penicillin og streptomycin i de sædvanligt anvendte mængder. Dexamethason, 9-fluor-ll/J, 17,21-tri-hydroxy-16a-methylpregna-l,4-dien-3,20-dion og insulin kan eventuelt være til stede i en koncentration 10 på ca. 10” molær. Mediet anvendes i tynde lag, 2 f.eks. 2 ml pr. 25 cm dyrkningskolbe. Inkubering foretages ved 35 0C på en vippeplatform for at give maksimal luftning. Gasatmosfæren består af 5% carbondioxid i luft.

15 (4) I løbet af 7 dage begynder en voldsom udgroning af hepatocyt-lignende epitelceller. Denne udvækst af store øer af hepatocyt-lignende celler fra vævsstykkerne fortsætter langsomt i flere uger. Der kan ved-20 ligeholdes kulturer i yderligere mange uger. Hepato- cyt-funktion identificeres ved iagttagelse af albumin-produktion og produktion af tyrosinaminotransfe-rase.

25 (5) Beskrivelsen af egernabe levercellekulturer i 3 og 4 gælder, hvad enten leveren opås fra normale eller med hepatitis A inokulerede egernaber.

(6) Hepatitis A viral antigen bestemmes i de kulturer, 30 der er fremstillet ud fra med virus inokulerede dyr, begyndende ca. 7 dage efter fremstillingen af kulturen. En sådan iagttagelse muliggøres ved påføring af fluorescein-mærket humant globulin fremstillet ud fra human sera fra hepatitis A rekonvalescent på 35 acetone-fikserede dækglas-kulturer. Disse præparater undersøges i et lodret fluorescens-Zeiss mikroskop med et 63X planapochromat objektiv og 10X okularer.

8

DK 158743 B

(7) Hepatitis A viral antigen bestemmes som lysende grønne fluorescerende granuler lokaliseret i celle-cytoplasmaet i hepatocyt-lignende celler. Både antallet af granuler og deres størrelse forøges i lø- 5 bet af et tidsrum på ca. 10 uger efter kulturstart.

Store mængder af antigenet forefindes i mindst 16 uger efter kulturstart.

(8) Forholdet mellem granulerne og hepatitis A virus 10 bevises med de fakta, at a) leverkulturer fremstil let fra normale egernaber og ikke udsat for virus viser aldrig udvikling af den granulære fluorescens, og b) den granulære fluorescens blokeres specifikt ved forudgående tilførsel til de fikserede 15 præparater af human konvalesens hepatitis A sera, men ikke ved sera fra samme patienter før sygdommen.

(9) Det vises også, at disse leverkulturer tilvejebrin-20 ger in vitro mangfoldiggørelse af hepatitis A virus

som følger, a) 4 uger efter etablering af kulturerne producerer såvel overliggende væsker som cellekulturekstrakter hepatitis A infektion ved intravenøs inokulering i rufiventer egernabe, b) efter 3 ugers 25 forløb og senere kan der vises typiske hepatitis A

viralpartikler, der har de egenskaber, der er beskrevet af Provost et al., P.S.E.B.M. 148, 532-533, 1975 i kulturekstrakter ved immun-elektronmikrosko-pi, og c) efter 3 ugers forløb og mere kan hepatitis 30 A viral antigen bestemmes ved immun-adhærenshæmag- glutination kulturekstrakter efter proceduren af Miller et al., P.S.E.B.M., 149, 254-261, 1975.

35

DK 158743 B

9 EKSEMPEL 3

Dyrkning og seriepassage af hepatitis A virus i egernabe-levercellekulturer inokuleret in vitro 5 (1) Levervæv kirurgisk fjernet fra en normal rufiventer egernabe pakkes, og der fremstilles cellekulturer ved samme metode som anvendt for inficeret levervæv i eksempel 2.

10 (2) Ca. 7 dage efter fremstillingen af cellekulturerne, når udvæksten af hepatocyter er begyndt, inokuleres 2 kulturerne i 25 cm kolber med hepatitis A virus i form af 0,1 ml af en 4%'s vandig ekstrakt af infice- 15 ret egernabelever fremstillet som i eksempel 1.

(3) De med virus inokulerede levercellekulturer og som kontrol anvendte uinokulerede kulturer inkuberes ved 35 °C og behandles tre gange pr, uge som i eksempel 20 2.

(4) Dækglas fjernes, der acetone-fikseres, farves med fluorescein-mærket hepatitis A antistof-holdigt globulin og undersøges ved fluorescens-mikrokskopi som 25 angivet i eksempel 2.

(5) Hepatitis A viral antigen bestemmes i virus-inokule-rede kulturer, men ikke i kontrolkulturer, fra ca. 7 dage efter inokulering og i stigende grad en 3 ugers 30 periode til 28 dage. Som i eksempel 2 er antigenet synligt som lysende grønne fluorescerende cytoplas-magranuler. Specificitet bevises som i eksempel 2.

(6) Celler og væsker fra såvel kontrolkulturer som vi- 35 rus-inokulerede kulturer høstes 3-4 uger efter in okulering ved frysning og tørring af kulturerne tre gange. Blandingen af brudte celler og dyrkningsvæske 10

DK 158743 B

klares ved centrifugering ved lav hastighed.

(7) En sådan kulturhøst vises yderligere at indeholde hepatitis A ved a) intravenøs inokulering og opnåel-5 se af infektion på egernabe, b) elektronmikroskopi og c) immunadhærens-hæmagglutination som i eksempel 2. I alle tilfælde er høstede kontrolkulturer negative for hepatitis A virus aktivitet.

10 (8) En anden in vitro passage af viruset i levercelle kultur foretages ved inokulering af 0,2 ml af høsten fra passage 1 (trin 6) i det foregående) i nye cel- 2 lekulturer i 25 cm kolber fremstillet ud fra normal abenyrelever. Et mønster af viral vækst og bestem-15 melse opnås, som i meget høj grad svarer til det, der skitseret i trin 5-7.

(9) En sådan seriepassage in vitro af viruset i egern-abeleverkulturer udføres fem gange og kan udføres 20 uendeligt. Med øget antal passager opnås bedre adap tion af viruset til in vitro vækst med hurtigere tilsynekomst af store mængder cytoplasmiske fluorescerende granuler.

25 (10) Der anvendes også et yderligere kriterium for at vi se, at det i denne cellekultur dannede stof rent faktisk er human hepatitis A virus. Høsten fra fjerde seriepassage får lov at reagere med serum fra human hepatitis A patienter på præsygdomsstadiet og 30 ved rekonvalescensstadiet før inokulation af celle kulturer. Viruset neutraliseres, dvs. det overfører ikke infektion til cellekulturen, af rekonvalen-scenssera, men ikke af præsygdomssera.

35

DK 158743 E

11 EKSEMPEL 4

Dyrkning og seriepassage af hepatitis A virus i primære afrikansk grøn abe-nyrecellekulturer 5 (1) Nyrer fjernes kirurgisk fra hepatitis A antistoffrie afrikanske grønne aber. Ved standardteknologi hakkes nyrerne og trypsiniseres, og der fremstilles enkeltlagscellekulturer.

10 (2) Cellekulturerne vokser næsten sammen i løbet af 5-7 dage på et medium bestående af Eagle minimal essential medium indeholdende 10% kalvefosterserum.

tao 15 (3) Ved næsten sammenvoksning erstattes kulturmediet med samme medium, men kun med 0,5% kalvef osterserum.

2

Hver 25 cm kolbekultur indeholdende 5 ml medium in-okuleres med 0,2 ml af en 4%’s vandig ekstrakt af egernabelever fremstillet som de i eksempel 1.

20 (4) Kulturerne inkuberes ved 35 °C og behandles en gang om ugen. Dækglas fjernes, der fikseres og undersøges ved immunofluorescens som i eksempel 2 med periodiske intervaller.

25 (5) Hepatitis A viral antigen bestemmes således i virus-inokuleret, men ikke i uinokuleret kontrolkultur, begyndende ca. 7 dage efter inokulering og stigende i løbet af en 3 ugers periode til 28 dage. Som i 30 eksempel 2 og 3 er antigenet synligt som lysende grønne fluorescerende cytoplastiske granuler. Specificitet bevises som i eksempel 2 og 3.

(6) Cellekulturer høstes som i eksempel 3.

35 (7) Tilstedeværelsen af hepatitis A virus vises yderligere i cellekulturhøst ved a) inokulering af egern- 12

DK 158743 B

aber med sygdom til følge, b) immun-elektronmikro-skopi og c) immun-adhærenshæmagglutination som i eksempel 2 og 3. I alle tilfælde er produkter høstet fra uinokulerede kontrolkulturer frie for hepatitis 5 A virus.

(8) Seriepassage in vitro af hepatitis A virus i primære grøn abe nyrecellekulturer udføres på samme måde som beskrevet for egernabe-leverkulturer i eksempel 3.

10 Sådan seriepassage kan udføres uendeligt.

EKSEMPEL 5

Dyrkning og seriepassage af hepatitis A virus i andre 15 cellekulturer (1) Under anvendelse af metoder som beskrevet i eksempel 4 viser det sig, at hepatitis A virus også kan dyrkes og seriepasseres i cellekulturer af følgende ty- 20 per: a) føtal rhesusabe-nyrecellelinie (FRhK-6), b) primære kyllingefoster-cellekulturer og c) føtal ru-, fiventer egernabe-nyrecellelinie. Positive resulta ter i alle disse kulturer er baseret på inokulering af kulturerne med hepatitis A virus afledt som i 25 eksempel 1.

(2) Hepatitis A virus seriepasseres fem gange i FRhK-6 cellelinie som i det foregående. Virushøsten fra femte passageniveau viser sig positivt at inficere 30 humane diploide lungefibroblast-cellekulturer, ba seret på kriterier som i eksempel 2, 3 og 4. Hepatitis A virus infektionen kan derefter seriepasseres i den humane diploide linie.

35 (3) Hepatitis A virus seriepasseres fem gange i FRhK-6 cellelinie som i (1). Den ved femte passageniveau opnåede virushøst findes positivt at inficere føtale

DK 158743 B

13 diploide rhesusabe-lungecellekulturer (FRhL-2), baseret på kriterier som i eksempel 2, 3 og 4. Hepatitis A virusinfektionen kan derefter seriepasseres i rhesus-diploidlinien.

5 EKSEMPEL 6

Fremstilling af vævskulturdyrket, levende, svækket hepatitis A viral vaccine 10 (1) Hepatitis A virus fremstillet som i eksempell seriepasseres in vitro i primære afrikansk grøn abe-nyrecellekulturer som angivet i eksempel 4. Cellekulturhøst af viruset ved passageniveau 5 og derover 15 vises at inducere hepatitis A antistof ved intrave nøs inokulering i rufiventer egernaber i en mængde på 1000 50%'s vævskultur-infektionsdoser som fremstillet ved fortynding af høsten i fysiologisk saltvand, men ikke at bevirke åbenbar sygdom i dyrene 20 som målt ved serum-isocitrindehydrogenase-værdier (ingen overskred 1500 sigmaenheder) og leverhistopa-thologien (der blev kun noteret mindre ændringer).

De dyr, hvori hepatitis A antistof dannes mod det vævskulturdyrkede virus, bliver resistente over for 25 infektion, hvilket infektionsforsøg med 1000 50%’s egernabe-infektionsdoser af hepatitis A virus injiceret intravenøst viser. Det vævskultur-passerede hepatitis A virus er modificeret således ved fremgangsmåden, at det udgør en levende, svækket hepati-30 tis A viralvaccine.

(2) Hepatitis A virus, der på tilsvarende måde blev passeret in vitro i kulturer af føtale rhesusabe-nyre-celler (FRhK-6) eller føtale rhesusabe-diploid lun- 35 geceller (FRhK-6) eller primære kyllingefosterceller eller humane diploide lungefibroblastceller (MRC5, WI-38) eller føtale rufiventer egernabe-nyrecel-

DK 158743 B

' 14 lelinier, blev -tilsvarende svækket efter 5 eller flere seriepassager og kunne anvendes som en levende, svækket vaccine.

5 EKSEMPEL 7

Fremstilling af vavskulturdyrket, formalin-inaktiveret hepatitis A viral vaccine 10 (1) Hepatitis A virus fremstillet som i eksempel 1 og 6 udsættes for 5 seriepassager in vitro i cellekulturer i primære abenyreceller som i eksempel 4 og 5.

(2) Ved det femte passageniveau eller ved højere passa- 15 geniveauer høstes cellekulturerne efter 3 ugers in kuber ing ved 35 °C, eller på et sådant tidspunkt, hvor indholdet af hepatitis A viral antigen fra den homogeniserede kultur er på ca. 8 eller flere enheder målt ved immun-adhærenshæmagglutination.

20 (3) Cellekulturhøst opnås ved frysetørring af de hele kulturer to gange, afstrygning af cellelagene over i kulturvæsken og homogenisering af hele blandingen ved udsættelse for ultralyd i 15 sekunder.

25 (4) Produktet klares ved centrifugering ved lav hastighed, opvarmes ved 60 °C i 1/2 time, og gencentrifugeres ved lav hastighed til yderligere klaring af væsken.

30 (5) Væsken filtreres derpå gennem 0,45 mikron kalve-in-fusionsbehandlet Millipore-filtre. Dette produkt behandles med 1:4000 formalin i 4 dage ved 35 °C under kontinuerlig omrøring. Formalinen neutraliseres del- 35 vis efter endt behandling med natriumbisulfit, hvil ket giver et restformalinindhold på 10 Ag/ml produkt.

15

DK 158743 B

(6) Produktet indstilles med phosphatpufret saltvand til 10 at indeholde 10 27 nm hepatitis A virus partikler pr. ml og opbevares ved 4 °C.

5 (7) Produktet er fri for infektiøs hepatitis A virus, når det prøves ved intravenøs inokulering i rufiven-ter egernaber.

(8) Produktet er potent som hepatitis A viral vaccine, 10 idet en eller flere subcutane injektioner på 1 ml i ---------------------rvifivervtef egernaber bevirker dannelsen af påviseligt hepatitis A antistof, og dyrene gøres immune for udsættelse for 1000 50%'s egernabe-infektionsdoser af hepatitis A virus.

15 (9) Hepatitis A virus behandlet på tilsvarende måde, bortset fra, at det føres gennem 5 seriepassager in vitro i cellekultur i trin 1 i føtal rhesusabenyre-cellelinie (FRhK-6) eller i primære kyllingefoster- 20 celler, eller i humane diploide lungefibroblastcel- ler (MRC5 eller Wi-38), eller i føtale rhesusabe-di-ploid lungefibroblaster (FRhL-2) giver et tilsvarende produkt, der er frit for infektiøs hepatitis A virus, men er potent som hepatitis A viral vaccine.

25 EKSEMPEL 8

Et diagnostisk antigen omfattende enten levende hepatitis A virus fremstillet som i eksempel 1-7 eller samme virus 30 efter formalininaktivering anvendes i serologiske tests (f.eks. radioimmunoprøven med hel virus som angivet i Purcelle et al., J. Immunol. 116, 349 (1976)) til diagnose af hepatitis A sygdom.

35

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et levende, svækket 5 hepatitis A virus ved modificering og dyrkning af hepatitis A viruset i cellekultur, kendetegnet ved, at man modificerer viruset ved mindst én passage deraf i en modtagelig sub-human primat, fjerner den inficerede lever, inokulerer en in vitro cellekultur med den infice-10 rede lever, dyrker ved inkubering af cellekulturen, indtil hepatitis A antigen kan påvises i kulturcellerne eller -væsken, og passerer viruset yderligere mindst én gang in vitro i cellekultur.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den sub-humane primat er en egernabe, en ugleabe, en rhesusabe, en afrikansk grøn abe, en cynomolgus abe eller en chimpanse.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at egernaben er Saguinus mystax eller S. labiatus (rufiventer).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at man anvender mindst fem passager af hepatitis A virus i sub-humane primater.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at viruset passeres mindst to gange i hver af to 30 forskellige arter af modtagelige sub-humane primater.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at cellekulturerne består af primære, kontinuerligt dyrkede eller transformerede celler afledt fra primat- 35 lever eller -nyre. DK 158743 B

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at hepatitis A viruset seriepasseres mindst fem gange i en cellekultur, der er egnet til brug i forbindelse med human vaccine, hvilken cellekultur er valgt 5 blandt humane diploide lungefibroblaster, primære afrikansk grøn abe nyreceller, primære kyllingefoster-fi-broblaster eller føtale rhesus-diploide lungeceller.

8. Diagnostisk præparat omfattende et levende, svækket 10 hepatitis A virus, kendetegnet ved, at viruset er opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

9. Præparat ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det er inaktiveret ved kontakt med et middel, der er i 15 stand til at inaktivere viruset. 20 25 30 35