KR101617464B1

KR101617464B1 - Ｉｐｖ―ｄｐｔ 백신

Info

Publication number: KR101617464B1
Application number: KR1020097007730A
Authority: KR
Inventors: 시노부 아베; 분시치 시미즈
Original assignee: 잇판사이단호진한다이비세이부쯔뵤우겐큐우카이; 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2016-05-02
Also published as: CA2664799A1; US20100021497A1; JP2011201913A; BRPI0717145A2; AU2007305595A1; NZ574776A; EP2075005B1; EP2075005A4; CN105126095A; CN103223163A; KR20150080643A; MX2009002909A; US8753646B2; KR20090057442A; AU2007305595B2; JP4874339B2; JPWO2008044611A1; CN101522209A; ZA200902155B; RU2009116273A

Abstract

본 발명은 고역가의 세이빈주 폴리오바이러스를 제조하는 공정을 포함하는, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스, 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드를 함유하는 혼합 백신의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를, 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양하는 공정을 포함하는 혼합 백신의 제조 방법은, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 함유하는 혼합 백신의 효율적인 제조 방법으로서 유용하다.

Description

ＩＰＶ―ＤＰＴ 백신{IPV-DPT VACCINE}

본 발명은 혼합 백신, 특히 불활화 세이빈주 폴리오바이러스 (sIPV) 를 함유하는 혼합 백신, 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

폴리오는 폴리오바이러스에 의한 감염증이다. 폴리오바이러스는 인간에게는 경구적으로 감염되어, 장관에서 증식하여, 혈액을 통하여 중추 신경계에 진입한다. 중추 신경계에 진입한 폴리오바이러스가 대형 운동 신경 세포에서 증식함으로써, 운동 신경 세포가 변성·괴사를 일으켜, 사지에 급성 이완성 마비를 일으킨다. 또, 폴리오바이러스가 연수 (延髓) 의 호흡 중추를 침입한 경우, 호흡 마비로 인해 죽음에 이르는 경우가 있다. 이와 같은 중독 (重篤) 한 증상을 일으키는 폴리오의 발증을 억제하기 위해서, 폴리오백신이 널리 사용되고 있다.

폴리오백신으로는, 경구 생폴리오백신과 불활화 폴리오백신의 2 종류가 사용되고 있다. 경구 생폴리오백신은, 폴리오바이러스의 약 (弱) 독주 (세이빈주) 를 사용한 백신이다. 경구 투여된 약독주 폴리오바이러스는 통상적인 감염을 일으킨다. 경구 생폴리오백신 유래의 폴리오바이러스는, 인간의 장관에서도 잘 증식하여, 그 결과 장관 국소에서의 면역을 형성한다. 또한, 경구 생폴리오백신 유래의 폴리오바이러스가 혈액 중에 진입하여 바이러스 혈증을 일으키는 것에 의해, 혈중 항체의 산생도 촉구한다. 그러나, 약독주 폴리오바이러스의 중추 신경계에서의 증식능은 매우 약하기 때문에, 통상적으로는 마비를 일으키는 경우는 없다. 또, 피접종자의 체내에서는, 접종 후 약 4 ∼ 6 주일, 경구 생폴리오백신 유래의 폴리오바이러스가 증식하여, 변으로 배출된다. 이 배출 바이러스가, 피접종자 주위의 폴리오에 대한 면역이 약하거나 또는 면역이 없는 인간에게 감염되어, 피접종자의 경우와 마찬가지로 면역 부여 또는 증강 효과를 나타낸다.

그런데, 경구 생폴리오백신 유래의 약독주 폴리오바이러스가, 피접종자의 체내에서 증식을 반복하는 동안, 또는 상기의 배출 바이러스에 감염된 인간의 체내에서 증식을 반복하는 동안에, 강 (强) 독성 방향에 대한 변이를 일으키는 경우가 있다. 그 변이주에 의해, 극히 드물게 백신 관련 마비를 일으키는 경우가 있다.

불활화 폴리오백신은, 폴리오바이러스를 포르말린에 의해 불활화하여 감염력을 잃게 한 백신이다. 불활화 폴리오백신은, 피접종자의 체내에서의 증식도, 피접종자 주위의 인간에 대한 감염도 하지 않기 때문에, 백신 관련 마비를 일으키는 경우는 없다. 불활화 폴리오백신의 제조에는, 종래부터 강독주가 사용되고 있지만, 최근에는 약독주 (세이빈주) 의 개발도 권장되어 왔다 (Biologicals 34 (2006) 151-154, Dev Bil. Basel. Karger, 2001, vol. 105, pp 163-169, 임상과 바이러스 Vol. 30 No.5 (2002.12) 336-343). 약독주 (세이빈주) 의 증식성은 강독주의 증식성보다 약간 나쁜 것이 단점으로 생각되어 왔다.

백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드를 함유하는 백신은, 백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신으로서 널리 사용되고 있다.

무세포성 백일해 백신, 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드 및 불활성화 폴리오바이러스로 이루어지는 다가 백신이 알려져 있다 (일본 공표특허공보 2000-504032호).

Vero 세포는, 긴꼬리 원숭이의 신장 유래의 계대 세포로서, 각종 바이러스에 대해 폭넓은 감수성을 갖기 때문에, 바이러스 배양에 널리 사용되고 있다. Vero 세포를 마이크로 캐리어 상에서 배양하고, 배양된 Vero 세포를 사용하여 엔테로바이러스 71 을 증식시키는 것을 포함하는 엔테로바이러스 71 백신의 제조 방법이 보고되어 있다 (Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development : Suh-Chin Wu, etc., Vaccine, 22, 3858-3864, 2004). 마이크로 캐리어를 사용한 일반적인 세포 배양 조건도 보고되어 있다 (Microcarrier cell culture principles & methods : Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988).

상기 상황에 있어서, 고역가 (高力價) 의 세이빈주 폴리오바이러스를 제조하는 공정을 포함하는 불활화 세이빈주 폴리오바이러스 (sIPV), 그리고 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드 (DPT) 를 함유하는 혼합 백신의 제조 방법이 요망되었다.

본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를, 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양함으로써, 고역가의 세이빈주 폴리오바이러스를 제조할 수 있는 것을 발견하였다. 이들의 견지에 기초하여 검토를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

(1) (A) 불활화 세이빈주 폴리오바이러스,

(B) 백일해균의 방어 항원,

(C) 디프테리아 톡소이드, 및

(D) 파상풍 톡소이드

를 함유하는 혼합 백신의 제조 방법으로서,

(a) 세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를, 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 ;

(2) 추가로

(b) 상기 Vero 세포에 세이빈주 폴리오바이러스를 감염시키는 공정,

(c) 그 폴리오바이러스를 증식시키는 공정,

(d) 그 폴리오바이러스를 함유하는 바이러스액을 회수하는 공정, 및

(e) 그 폴리오바이러스를 불활화시키는 공정을 포함하는 상기 (1) 에 기재된 방법 ;

(3) 상기 마이크로 캐리어의 농도가 약 5g/ℓ 인 상기 (1) 에 기재된 방법 ;

(4) 상기 마이크로 캐리어가 덱스트란제 마이크로 캐리어인 상기 (1) 에 기재된 방법 ;

(5) Vero 세포를 증식시키는 공정 (공정 (a)) 이 약 3ℓ 이상의 스케일로 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 방법 ;

(6) Vero 세포를 증식시키는 공정 (공정 (a)) 이 약 30ℓ 이상의 스케일로 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 방법 ;

(7) 추가로

(d-2) 상기 바이러스액을 정제하는 공정을 포함하는 상기 (2) 에 기재된 방법 ;

(8) 상기 정제 공정 (공정 (d-2)) 이,

(i) 상기 공정 (d) 에서 회수한 바이러스액의 초원심에 의한 펠릿화,

(ii) 그 펠릿의 재부유액에 대한 초음파 처리,

(iii) 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (7) 에 기재된 방법 ;

(9) 상기 (iii) 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제가 1 회만 실시되는 것을 특징으로 하는 상기 (8) 에 기재된 방법 ;

(10) 상기 (1) 에 기재된 방법으로 제조되는 백신

(11) Vero 세포를 배양하는 공정 (공정 (a)) 이 약 3ℓ 이상의 스케일로 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 방법 ;

(12) Vero 세포를 배양하는 공정 (공정 (a)) 이 약 30ℓ 이상의 스케일로 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 방법 ;

등을 제공한다.

세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를, 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양함으로써, 고역가의 세이빈주 폴리오바이러스를 얻을 수 있다. 고역가의 세이빈주 폴리오바이러스를 사용함으로써, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 효율적으로 제조할 수 있다. 따라서, 세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를, 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양하는 공정을 포함하는 혼합 백신의 제조 방법 (본 발명의 제조 방법) 은, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 함유하는 혼합 백신의 효율적인 제조 방법으로서 유용하다.

도 1 은 마이크로 캐리어법에 의한 Vero 세포의 배양에 있어서의, Vero 세포의 증식 곡선을 나타내는 그래프이다. 3L 은, 출발 세포수 약 2 × 10⁵cells/㎖ (저농도) 에서 마이크로 캐리어 3g/ℓ 를 나타낸다. 3H 는, 출발 세포수 약 10 × 10⁵cells/㎖ (고농도) 에서 마이크로 캐리어 3g/ℓ 를 나타낸다. 5L 은, 출발 세포수 약 2 × 10⁵cells/㎖ (저농도) 에서 마이크로 캐리어 5g/ℓ 를 나타낸다. 5H 는, 출발 세포수 약 10 × 10⁵cells/㎖ (고농도) 에서 마이크로 캐리어 5g/ℓ 를 나타낸다.

도 2 는, 여러 가지의 조건으로 배양한 Vero 세포에서 얻어진 I 형 폴리오바이러스의 감염가 (바이러스 역가) 를 나타내는 그래프이다. 3L 은, 출발 세포 수 약 2 × 10⁵cells/㎖ (저농도) 에서 마이크로 캐리어 3g/ℓ 으로 배양한 Vero 세포에서 얻어진 I 형 폴리오바이러스를 나타낸다. 5L 은, 출발 세포수 약 2 × 10⁵cells/㎖ (저농도) 에서 마이크로 캐리어 5g/ℓ 으로 배양한 Vero 세포에서 얻어진 I 형 폴리오바이러스를 나타낸다. 5H 는, 출발 세포수 약 10 × 10⁵cells/㎖ (고농도) 에서 마이크로 캐리어 5g/ℓ 으로 배양한 Vero 세포에서 얻어진 I 형 폴리오바이러스를 나타낸다. Ref. 는, 긴꼬리 원숭이 신장 세포를 사용하여 증식한 I 형 폴리오바이러스를 나타낸다.

본 발명은, 고역가의 세이빈주 폴리오바이러스를 제조할 수 있는 공정을 포함하는 불활화 세이빈주 폴리오바이러스 (sIPV), 그리고 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드 (DPT) 를 함유하는 혼합 백신의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.

1. 불활화 세이빈주 폴리오바이러스

(1) 세이빈주 폴리오바이러스

본 명세서에 있어서 세이빈주 폴리오바이러스란, 알버트 B. 세이빈 박사 (Dr. Albert B. Sabin) 에 의해 단리된 폴리오바이러스의 약독주에서 유래하는 폴리오바이러스주를 의미한다 (Sabin AB, Boulger LR. History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains. J. Biol. Standard 1973, 1, 115-118 등 참조).

세이빈주 폴리오바이러스에는, 세이빈 I 형주 폴리오바이러스, 세이빈 II 형주 폴리오바이러스 및 세이빈 III 형주 폴리오바이러스가 포함된다. 세이빈 I 형주 폴리오바이러스로서는, 예를 들어, LSc, 2ab 주 등을 들 수 있다. 세이빈 II 형주 폴리오바이러스로서는, 예를 들어, P712, Ch, 2ab 주 등을 들 수 있다. 세이빈 III 형주 폴리오바이러스로서는, 예를 들어, Leon, 12a₁b 주 등을 들 수 있다.

(2) 불활화

본 명세서에 있어서, 바이러스의「불활화」란, 바이러스의 감염 능력을 잃게 하는 것을 의미한다. 불활화 방법으로는, 물리적 방법 (예를 들어, X 선 조사, 열, 초음파 등을 사용한 방법), 화학적 방법 (예를 들어, 포르말린, 수은, 알코올, 염소 등을 사용한 방법) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

폴리오바이러스의 불활화는, 공지된 방법에 의해 실시할 수 있다 (예를 들어, Biologicals 34 (2006) 151-154 등 참조). 구체적으로는, 예를 들어, 폴리오바이러스를 포르말린으로 처리함으로써 불활화할 수 있다.

(3) 불활화 세이빈주 폴리오바이러스의 면역원성

불활화된 세이빈주 폴리오바이러스에는, 통상적으로, D 항원 및 C 항원이라고 불리는 2 개의 바이러스 항원이 혼재하고 있다. D 항원은 완전 바이러스 입자이다. D 항원에 대한 항체는 생 (生) 바이러스의 감염성을 중화시키는 능력이 있어, 방어 항체로서 기능한다. C 항원은 결손 입자라고 불리고, 완전 바이 러스 입자로부터 중심의 핵산 RNA 와 바이러스 단백의 일부가 빠진 입자이며, 중공상 입자이다. C 항원에 대한 항체에는 생바이러스의 감염성을 중화시키는 능력은 없거나, 있어도 매우 낮다. 따라서, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 백신으로서 사용하는 경우에는 D 항원이 필요하다.

폴리오바이러스에는, I 형, II 형, III 형의 3 가지 형이 있다. 폴리오바이러스의 감염에 대한 면역은, I 형, II 형, III 형의 3 가지 바이러스형에 특이적이며, 형간에서 교차 면역이 있었다고 해도 최소이다. I 형, II 형 및 III 형의 불활화 세이빈주 폴리오바이러스의 D 항원은, 각각 I 형, II 형 및 III 형의 야생주 (강독주) 폴리오바이러스에 대한 중화 항체를 산생시킬 수 있는 면역원성을 가지고 있다. 불활화 세이빈주 폴리오바이러스의 D 항원은, I 형, II 형 및 III 형 각각에 면역원성에 차이가 있고, I 형, II 형 및 III 형의 야생주 (강독주) 폴리오바이러스를 중화시키는 데에 충분한 항체를 산생시키기 위해서 필요한 D 항원량은 바이러스형에 따라 다르다.

상기 서술한 바와 같이, 폴리오바이러스에는 I 형, II 형, III 형의 3 가지 형이 있고, 어느 형에서도 동일한 폴리오를 일으킨다. 따라서, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 백신 (불활화 폴리오백신) 으로서 사용하는 경우에는, I 형, II 형 및 III 형 각각의 야생주 (강독주) 의 폴리오바이러스를 중화시키는 데에 충분한 항체를 산생시킬 수 있는 면역원성을 갖는 것이 필요하고, 또 종래부터 사용되고 있는 강독주 유래의 불활화 폴리오백신의 면역원성에 가까운 면역원성인 것이 바람직하다. 이와 같은 면역원성을 나타내기 위해서는, 백신은, I 형, II 형 및 III 형의 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를, D 항원량으로 2 ∼ 4 : 80 ∼ 120 : 80 ∼ 120 의 비율로 함유하는 것이 바람직하고, 특히, 약 3 : 약 100 : 약 100 의 비율로 함유하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 불활화 세이빈주 폴리오바이러스는, I 형, II 형 및 III 형이 상기와 같은 특정한 비율을 가짐으로써, 강독주 유래의 불활화 폴리오백신 (예를 들어, 소크백신) 과 동일한 면역원성을 나타낸다.

2. 불활화 세이빈주 폴리오바이러스의 제조

본 발명에서 사용되는 불활화 세이빈주 폴리오바이러스는, 하기 방법에 의해 제조할 수 있다.

먼저, Vero 세포를 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양하여, 폴리오바이러스 배양용 세포를 얻는다. 얻어진 폴리오바이러스 배양용 세포에 종바이러스 (세이빈주 폴리오바이러스) 를 접종하여, 바이러스를 배양함으로써 증식시킨 세이빈주 폴리오바이러스를 얻는다. 얻어진 세이빈주 폴리오바이러스를 불활화하여, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 얻는다. 사용되는 종바이러스 (세이빈 I 형주, 세이빈 II 형주 또는 세이빈 III 형주) 에 의해, 대응하는 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 얻을 수 있다. 바이러스의 불활화 전 또는 후에, 바이러스를 농축 및/또는 정제해도 된다.

상기 서술한 바와 같이, 불활화 폴리오백신에 있어서는, I 형, II 형 및 III 형 각각의 야생주 (강독주) 를 중화시키는 데에 충분한 항체를 산생시킬 수 있는 면역원성을 갖는 것이 필요하다. 그러나, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스의 D 항원은, I 형, II 형 및 III 형 각각에서 면역원성에 차이가 있다. 따라서, I 형, II 형 및 III 형 각각의 야생주 (강독주) 를 중화시키는 데에 충분한 항체를 산생시킬 수 있는 면역원성을 갖는 불활화 폴리오백신은, 함유하는 I 형, II 형 및 III 형의 불활화 폴리오바이러스량을 조절함으로써 얻을 수 있다.

(Vero 세포)

Vero 세포는, 긴꼬리 원숭이 (Cercopithecus aethiops) 의 신장 유래의 계대 세포로서, ATCC (American Type Culture Collection) 에 등록되어 있다. Vero 세포는 선유아 세포양의 형태를 나타내고, 각종 바이러스에 대해 폭넓은 감수성을 가지며, 계대 배양과 유지가 용이하기 때문에, 바이러스 배양에 널리 사용되고 있다. ATCC 로부터 입수 가능한 Vero 세포로는, 예를 들어, ATCC 번호 CCL-81, CRL-1587 등이 알려져 있다.

(마이크로 캐리어)

본 명세서에 있어서,「마이크로 캐리어」란, 표면에 세포를 부착시켜, 액체 배지 중에서 현탁 상태에서 세포 배양이 가능한 담체를 의미한다. 표면에 세포를 부착시켜, 액체 배지 중에서 현탁 상태에서 세포 배양이 가능한 담체이면, 재 질, 형상, 크기 등에 특별히 제한은 없다.

마이크로 캐리어의 재질로는, 덱스트란, 젤라틴, 콜라겐, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리아크릴아미드, 유리, 셀룰로오스 등을 들 수 있다. 마이크로 캐리어의 재질로는 덱스트란이 바람직하다.

마이크로 캐리어의 형상으로는 구상 (비즈), 원반상 등을 들 수 있다. 마이크로 캐리어의 형상으로는 구상이 바람직하다.

구상의 마이크로 캐리어의 크기는, 예를 들어 약 0.01 ∼ 1㎜, 바람직하게는 약 0.05 ∼ 0.5㎜, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 0.3㎜ 이다.

마이크로 캐리어는 다공성이어도 된다.

본 발명에서 사용되는 구상의 마이크로 캐리어로는, 예를 들어, Cytodex 1 (상품명), Cytodex 3 (상품명), Cytopore (상품명) (이상, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 등을 들 수 있다. 원반상의 마이크로 캐리어로는, 예를 들어, Cytoline 1 (상품명), Cytoline 2 (상품명) (이상, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 등을 들 수 있다. 다공성의 마이크로 캐리어로는, 예를 들어, Cytopore (상품명), Cytoline 1 (상품명), Cytoline 2 (상품명) (이상, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 등을 들 수 있다. 본 발명에서 사용되는 마이크로 캐리어로는, 특히 구상의 덱스트란제 마이크로 캐리어가 바람직하다. 구상의 덱스트란제 마이크로 캐리어로는, Cytodex 1 (상품명), Cytodex 3 (상품명) 및 Cytopore (상품명) 가 바람직하고, Cytodex 1 (상품명) 및 Cytodex 3 (상품명) 이 더욱 바람직하며, Cytodex 1 (상품명) 이 특히 바람직하다.

(Vero 세포의 배양)

본 발명에 있어서는, Vero 세포를 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양함으로써 증식시킨다. 마이크로 캐리어 농도는, 바람직하게는 약 4.5g/ℓ ∼ 약 5.5g/ℓ 이고, 보다 바람직하게는 약 5g/ℓ 이다.

상기의 Vero 세포를 증식시키는 공정은, 액량으로서 바람직하게는 3ℓ 이상, 보다 바람직하게는 30ℓ 이상, 특히 바람직하게는 150ℓ 이상의 스케일로 행해진다. 또, Vero 세포를 증식시키는 공정은, 통상적으로 1000ℓ 이하의 스케일로 행해진다.

Vero 세포를 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양하는 경우, 배지로서는, 예를 들어, ME 배지〔Science, 122 권, 501 (1952)〕, DME 배지〔Virology, 8 권, 396 (1959)〕, RPMI 1640 배지〔The Journal of the American Medical Association 199 권, 519 (1967)〕또는 199 배지〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 권, 1 (1950)〕(약 5 ∼ 약 20vol％ 의 송아지 혈청 또는 우태아혈청을 함유함) 가 사용된다. 배지로서는 DME 배지가 바람직하고, 송아지 혈청을 함유하는 DME 배지가 더욱 바람직하며, 약 5vol％ 의 송아지 혈청을 함유하는 DME 배지가 특히 바람직하다. 배지는 세포 배양 기간 중, 필요에 따라 교환한다. pH 는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하고, 약 6.5 ∼ 7.5 인 것이 더욱 바람직하며, 약 7 인 것이 특히 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 35℃ ∼ 40℃ 에서 약 5 ∼ 9 일간 실시하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다. 세포 배양시의 용존 산소 농도 (DO) 는, 약 60 ∼ 90％ 인 것이 바람직하고, 약 70 ∼ 80％ 인 것이 더욱 바람직하며, 약 75％ 인 것이 특히 바람직하다.

마이크로 캐리어 존재 하에서의 배양 개시시에 있어서의 배지 중의 Vero 세포의 세포수 (출발 세포수) 는, 배지나 마이크로 캐리어의 종류, 배양 스케일 등에 따라 적절히 설정할 수 있다. 출발 세포수는 2 × 10⁴개/㎖ ∼ 10 × 10⁵개/㎖ 인 것이 바람직하고, 특히 2 × 10⁵개/㎖ ∼ 10 × 10⁵개/㎖ 가 바람직하다.

(폴리오바이러스의 배양)

폴리오바이러스의 배양은, Vero 세포의 배양 세포에 세이빈주 폴리오바이러스 (종바이러스) 를 접종하여 감염시켜, 폴리오바이러스를 세포 내에서 배양함으로써 실시할 수 있다. 감염 세포의 배양은, 상기 서술한 Vero 세포의 배양과 동일하게 하여 실시할 수 있다. 폴리오바이러스의 배양에 사용되는 배지로서는, 199 배지가 바람직하고, 탄산수소나트륨을 첨가한 199 배지가 더욱 바람직하며, 0.3w/v％ 탄산나트륨을 첨가한 199 배지가 특히 바람직하다.

바이러스 배양시의 배양 온도는, 약 30℃ ∼ 38℃ 인 것이 바람직하고, 약 32℃ ∼ 36℃ 인 것이 더욱 바람직하며, 약 33℃ ∼ 35℃ 인 것이 특히 바람직하다. 바이러스 배양의 기간은, 바람직하게는 약 1 ∼ 5 일간, 보다 바람직하게는 약 2 ∼ 4 일간, 특히 바람직하게는 약 3 일간이다. 또한, 바이러스 배양은, 폴리오바이러스에 의한 세포 변성 효과 (폴리오바이러스 감염 세포가 세포의 원형화를 일으켜, 마이크로 캐리어로부터 이탈하는 것) 를 지표로 하여 종료시킬 수 있다.

종바이러스로는, 미리 긴꼬리 원숭이 초대 신장 배양 세포를 사용하여 배양한 세이빈주 폴리오바이러스를 사용해도 된다.

(폴리오바이러스를 함유하는 바이러스액의 회수)

바이러스 배양 종료 후, 마이크로 캐리어를 제거하고, 폴리오바이러스를 함 유하는 바이러스액 (폴리오바이러스액이라고 칭하는 경우가 있다) 을 회수한다.

마이크로 캐리어의 제거는, 예를 들어, 테플론 메시 (예를 들어, 구멍 직경 120㎛) 등을 사용하여 실시할 수 있다. 메시에 남은 마이크로 캐리어에는 폴리오바이러스가 잔존 (부착) 하고 있으므로, 바이러스 배양액 등으로 세정하여 폴리오바이러스를 회수해도 된다.

얻어진 폴리오바이러스액은, 여과막 (예를 들어, 0.2㎛ 의 여과막) 등으로 여과하여, 세포 잔해를 제거해도 된다.

폴리오바이러스액은, 불활화 전 또는 후에 농축 및/또는 정제해도 된다.

농축 방법으로는, 한외 여과법, 초원심법, 투석법 등을 들 수 있다. 농축 방법으로는, 한외 여과법, 초원심법이 바람직하고, 한외 여과법과 초원심법을 실시하는 것이 더욱 바람직하며, 또한 한외 여과법을 실시한 후, 초원심법을 실시하는 것이 바람직하다.

한외 여과법에서 사용되는 한외 여과막으로는, 바이러스의 농축에 통상적으로 사용되는 한외 여과막을 사용할 수 있다. 한외 여과막의 획분 분자량으로는 100kDa 정도가 바람직하다. 한외 여과막의 재질로는 폴리에테르술폰 등이 바람직하다.

초원심법에 의한 폴리오바이러스의 농축은, 예를 들어, 폴리오바이러스액을 4℃ 에서 100,000g, 4 시간의 초원심에 의해 펠릿화함으로써 실시할 수 있다. 펠릿은 인산 완충액 등에 재부유시켜도 된다. 펠릿의 재부유액을 초음파 처리함으로써, 응집 덩어리를 풀 수도 있다. 초음파 처리는, 시판되고 있는 장치, 예를 들어, INSONATOR MODEL 200M (쿠보타) 등을 사용하여 실시할 수 있다. 초음파 처리의 조건은, 응집 덩어리가 풀리는 정도이면 되고, 초음파 처리에 사용하는 용기, 초음파 출력, 재부유액의 농도 등에 따라 적절히 설정할 수 있다. 초음파 처리의 조건으로서는, 예를 들어, 200W 로 3 ∼ 10 분간의 초음파 처리 등을 들 수 있다. 이와 같은 초음파 처리를 실시해도, 세이빈주 폴리오바이러스의 면역원성은 없어지지 않고, 폴리오바이러스 백신으로서 바람직하게 사용할 수 있다.

정제 방법으로는, 예를 들어, 정제 대상물의 크기, 밀도, 침강 계수 등의 물리적 성질을 이용하는 방법, 화학 또는 물리 화학적 반응 (흡탈착 등) 을 이용하는 방법 등을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않는다. 정제 방법으로는, 보다 구체적으로는, 예를 들어, 밀도 구배 원심법, 여과 (한외 여과를 포함한다), 이온 교환 칼럼 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법, 겔 여과 크로마토그래피법, 염석법 등을 들 수 있다. 정제 방법으로는, 칼럼 크로마토그래피법이 바람직하고, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피법이 더욱 바람직하며, DEAE-이온 교환 칼럼 크로마토그래피법이 특히 바람직하다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 횟수는, 필요한 순도가 될 때까지 실시하면 되고, 특별히 제한은 없지만, 생산 효율 등의 점에서 최소한의 공정으로 실시하는 것이 바람직하다.

농축 및 정제로는, 폴리오바이러스액의 초원심에 의한 펠릿화, 그 펠릿의 재부유액에 대한 초음파 처리, 및 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제는, 1 회만 실시되는 것이 생산 효율 등의 점에서 바람직하다. 폴리오바이러스액의 초원심에 의한 펠릿화, 그 펠릿의 재부유액에 대한 초음파 처리 및 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제를 1 회만 실시함으로써, 폴리오바이러스액을 효율적으로, 또한 충분히 농축 및 정제할 수 있다.

(폴리오바이러스의 불활화)

폴리오바이러스의 불활화는, 통상적으로 이용되고 있는 방법에 의해 실시할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들어, 폴리오바이러스액에 불활화제를 첨가하여, 폴리오바이러스와 불활화제를 반응시킴으로써 폴리오바이러스를 불활화할 수 있다. 불활화제로서는 포르말린이 바람직하다. 불활화 조건은, 폴리오바이러스가 불활화되면 되고, 특별히 제한은 없다. 불활화 처리의 기간은, 불활화 불충분한 폴리오바이러스의 잔존을 피하기 위해서, 통상적으로, 폴리오바이러스의 불활화가 확인된 기간의 약 2 ∼ 4 배, 바람직하게는 약 2.5 ∼ 3.5 배, 보다 바람직하게는 약 3 배로 한다.

예를 들어, 불활화제로서 포르말린을 사용하는 경우, 그 첨가량은, 바람직하게는 약 0.001w/v％ ∼ 0.1w/v％, 더욱 바람직하게는 약 0.005w/v％ ∼ 0.05w/v％, 특히 바람직하게는 약 0.01w/v％ 이다. 불활화 온도는, 특히 바람직하게는 약 37℃ 이다. 불활화 기간은, 불활화제의 종류, 불활화제의 농도, 불활화 온도 등에 따라서도 다르다. 예를 들어, 불활화제로서 약 0.01w/v％ 의 포르말린을 사용하고, 불활화 온도가 약 37℃ 인 경우, 불활화 기간은, 바람직하게는 약 8 일 ∼ 16 일, 보다 바람직하게는 약 10 일 ∼ 14 일, 특히 바람직하게는 약 12 일이 다. 약 0.01w/v％ 의 포르말린을 사용하고, 불활화 온도가 약 37℃ 인 경우, 세이빈주 폴리오바이러스는, 통상적으로 4 일까지 불활화된다.

3. 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드 (DPT)

본 발명에서 사용되는 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드는, 특별히 한정되는 것은 아니다.

백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드는, 백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신으로서, 시판품으로서 입수할 수 있다 (예를 들어, 타케다 약품 공업 주식회사 제조, 오사카 미생물병 연구회 제조, 화학급 혈청 요법 연구소 제조 등). 또, 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드는, 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는, 백일해균의 방어 항원은, 예를 들어, 백일해균 I 상균 (토하마주) 의 배양액을 황산암모늄 획분법·자당 밀도 구배 원심 획분법 등의 물리 화학적 방법으로 감염 방어 항원 획분을 추출·분리·정제한 후, 잔존하는 독성을 포르말린으로 감독 (減毒) 시킴으로써 얻을 수도 있다. 디프테리아 톡소이드는, 예를 들어, 디프테리아균 (Park-Williams No.8 주) 이 생산하는 독소를 칼럼 크로마토그래피법 등의 물리 화학적 방법으로 정제 농축시킨 후, 포르말린으로 무독화시킴으로써 얻을 수도 있다. 파상풍 톡소이드는, 예를 들어, 파상풍균 (Harvard 주) 이 산생하는 독소를 칼럼 크로마토그래피법 등의 물리 화학적 방법으로 정제 농축시킨 후, 포르말린으로 무독화시킴으로써 얻을 수도 있다.

백일해균의 방어 항원에는, 백일해 독소 (PT 항원), 섬유상 적혈구 응집소 (FHA 항원), 외막 단백 (69KD 항원), 선모 (FB 항원, 응집원 (FGG) 이라고도 불린다) 가 포함된다. 백일해균의 방어 항원으로는, 반드시 상기 각 항원의 모두를 포함하고 있을 필요는 없고, 이들의 항원 중 1 종 이상, 바람직하게는 2 종 이상, 보다 바람직하게는 3 종 이상을 포함하고 있으면 된다. 상기 방어 항원에 대한 항체는, 백일해로부터 숙주를 방어한다.

4. 혼합 백신

본 발명의 혼합 백신은, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스, 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드를 함유한다. 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드는, 상기 서술한 바와 같이, 백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신으로서, 시판품으로서 입수할 수 있다. 따라서, 본 발명의 혼합 백신은, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스와, 백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신을 혼합함으로써 제조할 수도 있다.

불활화 세이빈주 폴리오바이러스는, 불활화 세이빈 I 형주 폴리오바이러스, 불활화 세이빈 II 형주 폴리오바이러스, 및 불활화 세이빈 III 형주 폴리오바이러스를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 상기 서술한 바와 같이, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스는, I 형, II 형 및 III 형의 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 D 항원량으로 2 ∼ 4 : 80 ∼ 120 : 80 ∼ 120 의 비율로 함유하는 것이 바람직하고, 특히, 약 3 : 약 100 : 약 100 의 비율로 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 혼합 백신에 있어서의 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드의 함유량은, 백일해, 디프테리아 및 파상풍의 예방에 유효 한 양이면 된다. 보다 구체적으로는, 상기 서술한, 시판품으로서 입수 가능한 백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신에 있어서의 함유량과 동일한 함유량으로 해도 된다. 또한, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스 그 밖의 성분에 의해 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드 또는/및 파상풍 톡소이드의 면역원성이 영향을 받는 경우에는, 적절히 함유량을 조절함으로써, 각 질환의 예방에 유효한 혼합 백신을 제조할 수 있다.

본 발명의 혼합 백신은, 통상적인 수단에 따라 제조하여 사용할 수 있다. 구체적으로는, 이하에 기재하는 바와 같이 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 혼합 백신은, 통상적인 수단에 따라, 주사제로서 제제화할 수 있다. 주사제는, 자체 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 상기 물질을 통상적으로 주사제에 사용되는 무균의 수성 혹은 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제한다. 주사용의 수성액으로는, 예를 들어, 생리 식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 함유하는 등장액 등이 사용된다. 조제된 주사액은, 통상적으로 적당한 앰플, 시린지 등에 충전된다.

본 발명의 혼합 백신은, 필요에 따라, 보존제, 항산화제, 킬레이트제 등의 제제 첨가제를 함유하고 있어도 된다. 보존제로는, 예를 들어, 티메로살, 2-페녹시에탄올 등을 들 수 있다. 킬레이트제로는, 에틸렌디아민 4 아세트산, 글리콜에테르디아민 4 아세트산 등을 들 수 있다.

본 발명의 혼합 백신은, 추가로 아쥬반트를 함유하고 있어도 된다. 아쥬반트화제로서는, 예를 들어, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 염화 알루미늄 등을 들 수 있다.

본 발명의 혼합 백신은, 추가로 불활화 세이빈주 폴리오바이러스, 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드 이외의 면역원성 성분을 함유하고 있어도 된다. 그러한 면역원성 성분으로는, 예를 들어, 폴리오바이러스, 백일해균, 디프테리아균 및 파상풍균 이외의 바이러스 또는 균에 대한 면역원성 성분을 들 수 있다. 면역원성 성분으로는, 예를 들어, 톡소이드, 약독화 바이러스, 불활화 바이러스, 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 리포펩티드, 또는 이들의 조합 등을 들 수 있다. 폴리오바이러스, 백일해균, 디프테리아균 및 파상풍균 이외의 바이러스 또는 균으로는, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 풍진 바이러스, 헤르페스 바이러스, 수두 바이러스, 광견병 바이러스, 인간 면역 부전 바이러스, 간염 바이러스, 폐렴 쌍구균, 수막염균, 티푸스균, 인플루엔자 b 균 등을 들 수 있다.

본 발명의 혼합 백신은, 예를 들어, 피하 주사 혹은 근육 주사에 의해, 바람직하게는 피하 주사에 의해, 비경구적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 혼합 백신의 1 회 투여량은, 투여 대상자의 연령, 체중 등 여러 가지의 조건에 따라 적절히 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 백일해균의 방어 항원을 4 국제 단위 이상, 디프테리아 톡소이드를 약 15Lf, 파상풍 톡소이드를 약 2.5Lf, 불활화 세이빈 I 형 폴리오바이러스를 D 항원으로서 약 2 ∼ 4 단위 (바람직하게는 약 3 단위), 불활화 세이빈 II 형 폴리오바이러스를 D 항원으로서 약 80 ∼ 120 단위 (바람직하게는 약 100 단위), 불활화 세이빈 III 형 폴리 오바이러스를 D 항원으로서 약 80 ∼ 120 단위 (바람직하게는 약 100 단위) 함유하고 있어도 된다.

본 발명의 혼합 백신의 투여 횟수는, 예를 들어, 첫회 면역으로서 3 ∼ 8 주의 간격으로, 2 ∼ 3 회 투여해도 된다. 첫회 면역으로서 본 발명의 혼합 백신을 2 회 투여한 경우에는, 추가로 3 ∼ 8 주의 간격으로 백일해 디프테리아 파상풍 혼합 백신 (DPT 백신) 을 1 회 투여하는 것이 바람직하다. 추가 면역으로서 첫회 면역 후 6 개월 이상의 간격을 두고 (예를 들어, 첫회 면역 종료 후 12 개월부터 18 개월까지의 사이에), 추가로 1 회 투여해도 된다.

다음으로 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 전혀 한정되지 않는다.

참고예 1 (폴리오백신바이러스 제조용 보존 세포 뱅크의 수립)

백신 바이러스 제조용의 보존 세포 뱅크는, ATCC 로부터 입수한 Vero 세포로부터, 하기의 순서에 의해 제조하였다.

(i) 종세포 뱅크 (MCB : Master Cell Bank) 의 조제

ATCC 로부터 수령한 앰플에 담긴 동결 세포 (CCL 81 Vero, F-6573, 계대수 : 124 대) 를 융해시켜, 빈 4 온스병 (용량 154㎖, 세포 증식 면적 54㎠ 의 배양병) 으로 옮겼다. 세포가 담긴 4 온스병에 세포 증식액 (5vol％ 송아지 혈청, 0.075％ 탄산수소나트륨, 20㎍/㎖ 에리트로마이신, 100㎍/㎖ 카나마이신 (최종 농도) 첨가 DME (Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium, 시그마, 카탈로그 No.D5523)) 을 적하하여, 약 5 분 정도에 걸쳐 15㎖ 첨가하였다. 세포와 세포 증식액을 넣은 병을 36℃ 에서 정치 (靜置) 배양하였다 (4 온스병 1 개, 125 대). 이튿날 아침 세포 증식액을 새로운 15㎖ 와 교환하여, 다시 36℃ 에서 정치 배양하였다. 정치 배양을 개시하고 나서 6 일째에 계대를 실시하였다 (4 온스병 1 개 내지 4 온스병 4 개, 126 대). 계대 방법은, 이하의 순서에 따라 실시하였다.

계대 방법

(1) 배양액을 버린다.

(2) 계대용 0.25％ 트립신액 5㎖ 를 4 온스병에 넣는다.

(3) 약 1 분간 세포면을 침지시켜 계대용 0.25％ 트립신액을 버린다.

(4) 4 온스병을 36℃ 에 정치시키고, 세포의 유리면에서의 박리를 기다린다.

(5) 세포가 박리되기 시작하면, 세포 증식액을 5㎖ 넣어 피펫팅으로 모든 세포를 박리시킨다.

(6) 추가로 피펫팅으로 세포를 균일하게 부유시켜, 세포 증식액을 원심관으로 옮긴다.

(7) 600rpm, 5 분간 원심을 실시하여, 상청을 버리고 침전물이 된 세포를 새로운 약 8㎖ 의 세포 증식액에 피펫팅으로 균일하게 부유시킨다.

(8) 새로운 4 개의 4 온스병 (새로운 세포 증식액이 13㎖ 씩 분배되어 있다) 에 1 개당 2㎖ 의 세포 부유액을 첨가한다.

(9) 4 개의 4 온스병을 36℃ 에 정치시켜 세포 배양을 실시한다.

계대용 0.25％ 트립신액의 조성은 이하와 같았다.

5％ 트립신^*1 50㎖/ℓ

5％ Polyvinyl pyrrolidone (90K) 20㎖/ℓ

0.247㏖ 에데트산 나트륨^*2 56㎖/ℓ

EK^*3 2㎖/ℓ

트립신 희석액^*4 872㎖/ℓ

*1 : 트립신은, 돼지 췌장 유래 1 : 300 활성인 것을 사용하였다.

*2 : 0.247㏖ 에데트산 나트륨의 조성은 이하와 같았다.

에데트산 나트륨-2 Na·2H₂O 91.95g/ℓ

NaOH 9.88g/ℓ

*3 : EK 의 조성은 이하와 같았다.

Erythromycin Lactobionate 10,000㎍/㎖

Kanamycin Sulfate 50,000㎍/㎖

*4 : 트립신 희석액의 조성은 이하와 같았다.

NaCl 8,000mg/ℓ

KCl 400mg/ℓ

Na₂HPO₄·12H₂O 150mg/ℓ

KH₂PO₄ 60mg/ℓ

이후도 동일한 방법 (배양 면적비로 1 회의 계대에서 약 3 ∼ 4 배로 하므로, 배양병과 취급하는 액량은 상이하다) 3 ∼ 6 일 간격으로 계대를 실시하여, 129 대의 세포를 제조하였다 (1 회 계대에 비해 계대수는 1 개 많아진다). SR 병 (Small Roux 병 : 용량 727㎖, 세포 증식 면적 156㎠ 의 배양병) 33 개에, 배양한 129 대의 세포를 계대시와 마찬가지로 트립신 처리, 원심을 실시하여, 침전물을 동결 보존 배지 (10％ DMSO (Dimethyl Sulfoxide), 10vol％ 송아지 혈청, 0.075％ 탄산수소나트륨, 20㎍/㎖ 에리트로마이신, 100㎍/㎖ 카나마이신 (최종 농도) 첨가 DME (Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium, 시그마, 카탈로그 No.D5523)) 에 약 1.5 × 10⁷개/㎖ 가 되도록 재부유시켰다. 앰플에 상기 세포 부유액을 1㎖ 분주하여, 슬로우 프리저 (약 1 분 동안 1℃ 저하된다) 로 -32℃ 까지 온도를 낮춘 후, 액체 질소 중으로 옮겨 보존하였다. 상기와 같이 하여 얻은 129 대의 세포를 종세포 뱅크 (MCB) 로서 사용하였다.

(ii) 제조용 보존 세포 뱅크 (MWCB : Manufacture＇s Working Cell Bank) 의 조제

상기 (i) 에서 조제하여 보존한 종세포 뱅크 (MCB) 를 사용하여, 상기 (i) 의 종세포 뱅크 (MCB) 의 조제 방법과 기본적으로는 완전히 동일한 방법으로, 앰플 중의 세포의 융해로부터 세포의 계대에 의한 증식을 134 대까지 실시하였다 (출발 세포수가 많기 때문에, 취급액량, 배양병종과 수는 상이하다). 상기의 134 대 의 세포도, 종세포 뱅크 (MCB) 와 마찬가지로 액체 질소 중에서 보존하였다. 상기와 같이 하여 얻은 134 대의 세포를 제조용 보존 세포 뱅크 (MWCB) 로서 사용하였다.

실시예 1 (폴리오백신바이러스 제조용 세포의 제조)

(i) 정치 배양 공정

상기 참고예 1 에서 조제하여, 보존한 제조용 보존 세포 뱅크 (MWCB) 의 1 앰플 (134 대의 세포) 을, 상기 참고예 1 의 종세포 뱅크 (MCB) 및 제조용 보존 세포 뱅크 (MWCB) 의 조제의 경우와 동일한 방법으로 해동시켜, 세포를 LR 병 (Large Roux 병, 용량 약 1540㎖, 세포 증식 면적 약 274㎠ 의 배양병) × 3 개에서 7 일간 정치 배양하였다 (135 대). 정치 배양을 개시하고 나서 7 일째에 계대를 실시하여, LR 병 18 개 (136 대) 로 배양 스케일을 확대하여 정치 배양하였다. 정치 배양과 그 계대는, 상기 참고예 1 의 종세포 뱅크 (MCB) 의 조제 및 제조용 보존 세포 뱅크 (MWCB) 의 조제와 동일한 방법으로 실시하였다.

다음으로, 40 단 셀 팩토리 (눈크, 카탈로그 No.139446) 에서 7 일간 정치 배양하였다 (137 대). 정치 배양을 개시하고 나서 7 일째에 계대하고, 다시 40 단 셀 팩토리 4 대에서 7 일간 정치 배양하였다 (138대).

(ii) 마이크로 캐리어 배양 공정

다음으로, 상기 (i) 의 정치 배양 공정에서 얻은 138 대의 세포를, 상기 (i) 의 계대시와 마찬가지로 트립신 처리, 원심하여, 침전물이 된 세포를 1,000㎖ 의 마이크로 캐리어 배양용 세포 증식액 (5vol％ 송아지 혈청 (Thermo Trace 사 제조 ), 0.11％ 탄산수소나트륨, 0.1％ 프룩토오스, 20㎍/㎖ 에리트로마이신, 100㎍/㎖ 카나마이신 (최종 농도) 첨가 DME (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 시그마, 카탈로그 No.D5523)) 에 피펫팅으로 균일하게 부유시켰다. 세포 부유액을 미리 PBS (Phosphate Buffered Saline) 로 팽윤시켜, 마이크로 캐리어 배양용 세포 증식액으로 평형화한 마이크로 캐리어 (Cytodex 1 (상품명), GE 헬스케어 바이오사이언스사) 와 혼합 (Cytodex 1 (상품명) 은, 팽윤 전의 중량으로 5g/ℓ 를 사용하였다) 하여, 50ℓ 용량 배양기 3 대에서 37℃, pH7.15 로 교반하면서 배양하였다. 배양 2 일째부터 1 일당 세포 증식액의 절반량을 새로운 세포 증식액과 계속적으로 교환하였다. 7 일간 배양한 세포를 폴리오백신바이러스 제조용 세포 (139 대) 로서 사용하였다.

실시예 2 (불활화 폴리오백신 I 형의 제조)

(i) 바이러스 배양 공정

실시예 1 에서 얻은 폴리오백신바이러스 제조용 세포 (139 대) 는, 종바이러스를 접종하기 직전에 교반을 멈추고 세포를 침전시켜, 0.075％ 탄산수소나트륨, 20㎍/㎖ 에리트로마이신, 100㎍/㎖ 카나마이신 (최종 농도) 첨가 EBSS (Earl's Balanced Salt Solution) 로 1 회 세정하였다. 마이크로 캐리어와 함께 채취한 세포 배양액 5㎖ 의 상청을 제거한 후, 0.25％ 트립신액을 첨가하여 다시 5㎖ 로 하고, 세포를 비즈로부터 박리하여 부유시키고, 세포수를 계측하여, 50ℓ 용량 배양기 전체의 세포수를 추정하였다. 세포 1 개당, 약독 Sabin 주의 I 형 (LSc, 2ab 주) 의 종바이러스를 약 10^-3CCID₅₀ 의 농도로 접종하였다. 종바이러스 접종 후, 즉시 바이러스 배양액 (0.3％ 탄산수소나트륨, 20㎍/㎖ 에리트로마이신, 100㎍/㎖ 카나마이신 (최종 농도) 첨가 M199 (Medium 199)) 50ℓ 를 배양기에 주입하였다. 또한, 종바이러스는, 미리 아프리카 긴꼬리 원숭이 초대 신장 배양 세포를 사용하여 약 33.3℃ 에서 배양한 후, 작게 나누어 -70℃ 에서 동결 보존한 것을 사용하였다.

바이러스 배양은 34℃ ± 1℃ 에서 3 일 동안 실시하였다. 폴리오바이러스에 의한 세포 변성 효과 (폴리오바이러스 감염 세포는 세포의 원형화를 일으켜, 그 후 마이크로 캐리어로부터 이탈한다) 를 지표로 하여, 세포가 마이크로 캐리어로부터 95 ∼ 100％ 이탈한 시점에서 바이러스 배양을 종료시켰다. 바이러스 배양 종료 후, 테플론 메시 (구멍 직경 120㎛) 를 통하여 마이크로 캐리어를 제거하고, 바이러스 부유액을 회수하였다. 메시에 남은 마이크로 캐리어는, 50ℓ 용량 배양기 1 대당 약 3ℓ 의 바이러스 배양액으로 1 회 세정하였다. 회수한 바이러스 부유액에 이 세정액을 첨가하여「I 형 폴리오바이러스액」으로 하였다.

(ii) 바이러스 농축·정제 공정

상기 (i) 에서 얻은 I 형 폴리오바이러스액 약 150ℓ 를, 0.2㎛ 의 여과막 (폴, SLK7002NRP) 으로 여과하여, 세포 잔해를 제거하였다. 여과액을 한외 여과막 (사르토리우스, PESU (Polyethersulfone) 100kDa, 0.1㎡, 3051466801E--SG) 으로 1.2ℓ 까지 농축시켰다. 농축된 바이러스액을 6℃ 에서 100,000g, 4 시간 의 초원심에 의해 펠릿화하여, PB (Phosphate Buffer, 0.1㏖/ℓ) 에 재부유하였다 (1 개의 원심관 (약 100㎖) 의 펠릿을 5㎖ 의 PB 에 재부유하였다). 펠릿의 재부유액을 4℃ 에서 하룻밤 진탕한 후, 200W 로 8 분간 초음파 처리 (쿠보타, INSONATOR MODEL 200M) 를 실시하여 응집 덩어리를 풀었다. 그리고, 15,000rpm, 30 분간의 원심 후, 상청을 채취하였다. 얻어진 상청을 DEAE Sepharose CL-6B (상품명, GE 헬스케어 바이오사이언스사, GE 17-0710-05) 에 의해 정제하였다. 용출액으로서 PB (Phosphate Buffer, 0.1㏖/ℓ) 를 사용하였다. 280㎚ 의 흡광도로 모니터하여, 최초의 피크를 회수하여,「정제 I 형 폴리오바이러스액」으로 하였다. 채취한 피크에 대해서는, 흡광도의 값으로 260/280㎚ 를 계산하여 1.5 이상인 것을 확인하였다 (폴리오바이러스 완전 입자의 260/280㎚ 는 1.6 ∼ 1.7 이다).

(iii) 불활화 공정

상기 (ii) 에서 얻은 정제 I 형 폴리오바이러스액을 불활화 전 희석액 (5％ 아미노아세트산 (최종 농도) 을 첨가한, Ca, Mg, Phenol Red, 탄산수소나트륨을 함유하지 않는 M199) 으로 약 10 배 희석하고, 0.2㎛ 의 여과막 (폴, SLK7002NRP) 으로 여과하여, 바이러스 응집 덩어리를 제거하였다. 여과액을 조제 후, 다시 바이러스가 응집되지 않도록 신속하게 불활화를 개시하였다. 불활화 개시 1 시간 전에, 여과액과 1 : 200 로 희석된 포르말린을 따로 따로 37℃ 에서 가온시켜 두었다. 여과액을 충분히 교반하면서, 포르말린을 최종 농도 1 : 4,000 이 되도록 첨가하고, 37℃ 로 가온시켜 불활화를 개시하였다. 포르말린 처리 중, 액의 교 반을 매일 오전 및 오후 2 회 실시함으로써 바이러스의 불활화를 한결같이 진행시켰다. 불활화 불충분한 바이러스가, 용기의 마개나 용기의 어느 특정한 장소에 부착되는 경우를 상정하여, 불활화 개시 2, 4 일째에는 마개의 교환을, 6 일째에는 용기의 교환을 실시하였다. 또, 불활화 공정 중에 바이러스가 응집될 가능성을 고려하여, 불활화 6 일째에 0.2㎛ 의 여과막 (폴, SLK7002NRP) 으로 여과를 실시하였다. 포르말린 처리 공정은 12 일간으로 종료하였다. 12 일째에 포르말린 처리 바이러스액의 유리 포르말린을 아황산 나트륨 (0.0264㏖/ℓ 가 되도록 첨가) 으로 중화 후, 안정제로서 에데트산 나트륨을 첨가 (0.0009㏖/ℓ) 하여「불활화 폴리오백신 I 형」의 원액으로 하였다.

(iv) D 항원량의 측정은 형 및 D 항원에 특이성이 높은 항체를 사용한 간접 ELISA 법에 의해 실시한다. 간접 ELISA 법은, 먼저, 1 차 항체로서 피검 항원과 동형의 D 항원 특이적 모노클로날 항체 (마우스 유래) 를 마이크로 플레이트에 코팅한다. 다음으로, 피검 항원을 희석하여 얹는다. 다음으로, 2 차 항체로서 피검 항원과 동형인 토끼 폴리클로날 항체를 얹고, 추가로, HRPO 표지 항토끼 IgG 항체를 얹고 반응시킨다. 반응 후, 오르토페닐렌디아민 용액을 사용하여 발색시킨 후, 492㎚ 의 흡광도를 측정한다. 피검 항체의 흡광도의 측정값과 대조 항원의 측정값의 평행선 정량법에 의한 비교에 의해, 피검 항원의 D 항원량을 구한다.

실시예 3 (불활화 폴리오백신 II 형의 제조)

종바이러스로서, 약독 Sabin 주의 I 형 (LSc, 2ab 주) 대신에 약독 Sabin 주 의 II 형 (P712, Ch, 2ab 주) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 2 와 마찬가지로 하여,「불활화 폴리오백신 II 형」의 원액을 제조하였다.

실시예 4 (불활화 폴리오백신 III 형의 제조)

종바이러스로서 약독 Sabin 주의 I 형 (LSc, 2ab 주) 대신에 약독 Sabin 주의 III 형 (Leon, 12a₁b 주) 을 사용한 것 이외에는, 실시예 2 와 마찬가지로 하여,「불활화 폴리오백신 III 형」의 원액을 제조하였다.

실시예 5 (백일해균의 방어 항원의 제조)

(1) 백일해균의 배양

백일해균 I 상균 (토하마주) 을 코엔윌러 배지에서 30 ∼ 34℃, 20 ∼ 24 시간 교반 배양하였다. 코엔윌러 배지에서 배양한 백일해균을, 다시 스테이너 숄트 배지에서 30 ∼ 34℃, 48 ∼ 68 시간 배양하였다.

배양액을 한외 여과법에 의해 1/10 양까지 농축을 실시하여, 원심 분리에 의해 상청액과 균체로 분리하였다.

(2) 백일해 독소의 조제

상기 (1) 에서 얻은 상청액에 1㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH8.0) 을 1/10 양으로 되도록 첨가하고, 25w/v％ 아세트산 칼슘 용액을 0.1 ∼ 2.0w/v％ 가 되도록 첨가하여 여과에 의해 백일해 독소 (감염 방어 항원) 를 함유하는 여과액을 얻었다. 여과액을 SP 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.1㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH6.0)) 에 의해 칼럼을 통과시키고, 흡착된 백일해 독소를 0.415㏖/ℓ 인산염 완 충액 (pH7.0) 으로 용출하여, 백일해 독소를 함유하는 액을 분획하였다. 이어서, 백일해 독소를 함유하는 액을 겔 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.25㏖/ℓ 염화 나트륨 첨가 0.025㏖/ℓ 인산 나트륨액 (pH8.7)) 에 의해 칼럼을 통과시킨 후, 여과 (구멍 직경 0.2㎛) 한 것을 정제 백일해 독소 (PT 항원) 액으로 하였다.

(3) 섬유상 적혈구 응집소의 조제

상기 (1) 에서 분리한 균체를 1㏖/ℓ 염화 나트륨 첨가 0.05㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH8.0) 으로 용해시키고, 이어서 원심 분리에 의해 상청액과 균체로 재분리하였다. 재분리한 상청액에 25w/v％ 아세트산 칼슘 용액을 0.1 ∼ 2.0w/v％ 가 되도록 첨가하여, 여과에 의해 섬유상 적혈구 응집소 (감염 방어 항원) 를 함유하는 액을 얻었다. 여과액을 황산 암모늄 농축시킨 후, 밀도 구배 원심법으로 정제하여, 정제 섬유상 적혈구 응집소 (FHA 항원) 를 분획하였다.

(4) 외막 단백의 조제

상기 (3) 에서 재분리한 균체를 0.145㏖/ℓ 염화 나트륨 첨가 0.01㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH7.0) 으로 용해시켜 60℃ 에서 90 분간 가열하고, 이어서 원심 분리에 의해 상청액과 균체로 다시 재분리하였다. 다시 재분리한 상청액에 1㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH8.0) 을 1/10 양이 되도록 첨가하고, 25w/v％ 아세트산 칼슘 용액을 0.1 ∼ 2.0w/v％ 가 되도록 첨가하고 여과하여, 외막 단백 (감염 방어 항원) 을 함유하는 여과액을 얻었다. 외막 단백 (감염 방어 항원) 을 함유하는 액을 SP 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.1㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH6.0)) 에 의해 통과액을 회수하였다. 이어서, 겔 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.25㏖/ℓ 인산 나트륨 첨가 0.025㏖/ℓ 인산 나트륨액 (pH8.7)) 에 의해 칼럼을 통과시킨 후, 여과 (구멍 직경 0.2㎛) 한 것을 정제 외막 단백 (69K 항원) 으로 하였다.

(5) 선모 (응집원 (AGG)) 의 조제

상기 (4) 에서 외막 단백을 함유하는 액을 채취한 후의 잔사에 1㏖/ℓ 염화 나트륨 첨가 0.1㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH8.0) 을 상청액의 1/10 양 첨가하고 여과하여, 선모 (감염 방어 항원) 을 함유하는 여과액을 얻었다. 얻어진 선모를 함유하는 액을 황산 암모늄 농축 후, 밀도 구배 원심법으로 정제하여, 정제 선모 (FB 항원) 를 분획하였다.

(6) 방어 항원의 조제 (감독)

상기 (2) ∼ (5) 에서 얻은 PT 항원, FHA 항원, 69KD 항원 및 FB 항원을, 하기 실시예 8 에서 조제하는 DPT 혼합 백신 0.5㎖ 당 PT 항원 1.89㎍, FHA 항원 3.00㎍, 69K 항원 0.76㎍ 및 FB 항원 0.36㎍ 의 항원 비율을 목표 품질로 혼합한 액을 정제 감염 방어 항원액으로 하였다. 정제 감염 방어 항원액에 포르말린을 0.2 ∼ 0.5vol％ 및 필요에 따라 염산 리신을 1w/v％ 이하가 되도록 첨가하여, 37 ∼ 41℃ 에서 7 일간 이상 가온시켜 감독시킨 것을 백일해 방어 항원액으로 하였다. 한외 여과법을 이용하여 여분의 포르말린 및 염산 리신을 제거하여, 백일해의 방어 항원의 원액으로 하였다.

실시예 6 (디프테리아 톡소이드의 제조)

(1) 디프테리아균의 배양

디프테리아균 (Park Williams No.8) 을 로플러 배지에서 32.0 ∼ 34.0℃, 5일간 배양하였다.

(2) 디프테리아 독소의 조제

상기 (1) 에서 얻어진 배양액에 황산 암모늄을 첨가한 후의 상청액을 여과 (구멍 직경 0.45㎛) 하여, 얻어진 액을 페닐 소수성 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 1.25㏖/ℓ 황산 암모늄 첨가 0.01㏖/ℓ 인산 나트륨액 (pH6.5)) 에 의해 칼럼을 통과시키고, 얻어진 독소액을 DEAE 이온 교환 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.01㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH7.0)) 에 의해 칼럼에 통과시키고, 이어서 겔 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.145㏖/ℓ 염화 나트륨 첨가 0.1㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH7.0)) 에 의해 칼럼에 통과시켜 디프테리아 독소를 분획하여, 이것을 정제 독소액으로 하였다.

(3) 디프테리아 독소의 톡소이드화

상기 (2) 에서 얻어진 정제 독소액에, 염산 리신을 1w/v％ 이하, 포르말린을 0.3vol％ 가 되도록 첨가하고 38.0 ∼ 40.0℃ 에서 21 일간 가온시켜 톡소이드화시켰다.

(4) 디프테리아 톡소이드의 조제

상기 (3) 에서 톡소이드화시킨 후, 한외 여과법을 이용하여 여분의 포르말린 및 염산 리신을 제거하여, 디프테리아 톡소이드액으로 하였다.

실시예 7 (파상풍 톡소이드의 제조)

(1) 파상풍균의 배양

파상풍균 (Harvard47-A) 을 간 부용(bouillon)에서 34.5℃ ∼ 36.5℃, 5 일간 배양하였다.

(2) 파상풍 독소의 조제

상기 (1) 에서 얻어진 배양액 1ℓ 당 1.25㏖/ℓ 가 되도록 황산 암모늄을 첨가하였다. 이어서, 페닐 소수성 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 1.25㏖/ℓ 황산 암모늄 첨가 0.01㏖/ℓ 인산 나트륨액 (pH6.5)) 에 의해 칼럼에 통과시키고, 얻어진 독소액을 DEAE 이온 교환 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.01㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH7.5)) 에 의해 칼럼에 통과시키고, 이어서 겔 칼럼 크로마토그래피법 (평형화 용액 : 0.145㏖/ℓ 염화 나트륨 첨가 0.004㏖/ℓ 인산염 완충액 (pH7.0)) 에 의해 칼럼에 통과시켜 파상풍 독소를 분획하여, 이것을 정제 독소액으로 하였다.

(3) 파상풍 독소의 톡소이드화

상기 (2) 에서 얻어진 정제 독소액에, 포르말린을 0.3vol％ 가 되도록 첨가하여 pH7.0 로 수정하고, 39℃ 에서 15 ∼ 23 일간 가온시켜 톡소이드화시켰다.

(4) 파상풍 톡소이드의 조제

상기 (3) 에서 톡소이드화시킨 후, 한외 여과법을 이용하여 여분의 포르말린 및 염산 리신을 제거하여, 파상풍 톡소이드액으로 하였다.

실시예 8 (혼합 백신의 제조)

(i) 혼합 불활화 폴리오백신의 조제

상기 실시예 2, 3 및 4 에서 얻은 불활화 폴리오백신 I 형, 불활화 폴리오백신 II 형 및 불활화 폴리오백신 III 형의 원액을, D 항원량이 각각 3, 100, 100 이 되도록, 199 배지 (M199), 최종 농도 0.5vol％ 의 2-페녹시에탄올, 및 최종 농도 0.09w/v％ 의 염화 알루미늄을 혼합하였다. 얻어진 혼합액을 수산화 나트륨 또는 염산으로 pH 를 7 로 조정하여, 혼합 불활화 폴리오백신으로 하였다.

(ii) DPT 혼합 백신의 조제

상기 실시예 5, 6 및 7 에서 얻은 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드 및 파상풍 톡소이드의 원액을, 199 배지 (M199), 최종 농도 0.5vol％ 의 2-페녹시 에탄올, 및 최종 농도 0.24w/v％ 의 염화 알루미늄과 혼합하였다. 얻어진 혼합액을 수산화 나트륨 및 염산으로 pH 를 7 로 조정하여, DPT 혼합 백신으로 하였다.

(iii) 혼합 백신의 제조

상기 (i) 에서 얻은 혼합 불활화 폴리오백신과, 상기 (ii) 에서 얻은 DPT 혼합 백신을 등량 혼합하여, 혼합 백신을 제조하였다.

실시예 9 (혼합 백신의 안정성)

실시예 8 에서 얻은 혼합 백신에 대해, 25℃ 에서 가속 시험을 실시하여, 안정성을 측정하였다. 안정성은, 각 바이러스에 대한 역가 시험에 의해 평가하였다.

(1) 침강 정제 백일해 백신의 역가 시험

검체, 표준 백일해 백신 및 백일해균 18323 주를 사용한다. 검체 및 표 준액을 각각 희석하고, 이것을 기초로 하여 각각 4 배 또는 다른 적당한 대수적 등간격으로 합계 3 단계 희석 이상의 희석을 만든다. 4 주령의 마우스 16 마리 이상을 1 군으로 하여, 각 희석에 1 군씩을 사용한다. 1 마리당 희석액 0.5㎖ 를 1 회 복강 내에 주사한다. 면역 주사의 21 일 후에, 1 마리당 공격용 균 부유액 0.025㎖ 를 뇌내에 주사하고, 14 일간 관찰하여, 사망 마리수를 산출한다. 시험의 성적을 통계학적으로 처리하여 비교할 때, 검체의 역가는 8 단위/㎖ 이상이어야 한다.

(2) 침강 디프테리아 톡소이드의 역가 시험

검체, 참조 침강 디프테리아 톡소이드 및 적당한 독소액을 사용한다. 검체 및 참조품의 희석은 생리 식염액에, 또한, 독소액의 희석은 0.2w/v％ 젤라틴 첨가 0.017㏖/ℓ 인산염 완충 염화 나트륨 용액 (pH7.0) 에 의한다. 검체 및 참조품을 각각 희석하여, 대수적 등간격의 단계 희석을 만든다. 5 주령의 마우스 10 마리 이상을 1 군으로 하고, 검체 및 참조품의 각 희석에 1 군씩을 사용하여 1 마리당 0.5㎖ 를 피하에 주사한다. 면역 주사의 4 ∼ 6 주일 후에 각각의 동물로부터 채혈하여, 혈중 항독소가를 측정한다. 시험의 성적을 통계학적으로 처리하여 비교할 때, 검체의 역가는 47 단위/㎖ 이상이어야 한다.

(3) 침강 파상풍 톡소이드의 역가 시험

검체, 참조 침강 파상풍 톡소이드 및 적당한 독소액을 사용한다. 검체 및 참조품의 희석은 생리 식염액에, 또한, 독소액의 희석은 0.2w/v％ 젤라틴 첨가 0.017㏖/ℓ 인산염 완충 염화 나트륨 (pH7.0) 에 의한다. 검체 및 참조품을 각 각 희석하여, 대수적 등간격의 단계 희석을 만든다. 5 주령의 마우스 10 마리 이상을 1 군으로 한다. 검체 및 참조품의 각 희석에 1 군씩을 사용하여 1 마리당 마우스에서는 0.5㎖ 를 1 회 피하에 주사한다. 면역 주사의 4 ∼ 6 주 후에 각각의 마우스를 약 100LD₅₀ 의 독소로 공격하여, 4 일간 관찰한다. 시험의 성적을 통계학적으로 처리하여 비교할 때, 검체의 역가는 27 단위/㎖ 이상이어야 한다.

(4) 래트 면역원성 시험

검체, IPV 역가 시험용 참조품, 각 형의 표준 혈청 및 중화 시험 공격용 세이빈주 폴리오바이러스 (Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 형) 를 사용한다. 검체 및 참조품을 각각 희석하여, 대수적 등간격의 희석을 만든다. Wister 계 8 주령, 암컷 래트 10 마리 이상을 1 군으로 하여, 각 희석에 1 군씩을 사용한다. 1 마리당 0.5㎖ 를 뒷다리 대퇴부에 근육 내 접종한다. 접종 21 일 후에, 개체별로 모든 동물로부터 채혈하여, 혈청을 뽑아 56℃ 30 분간 가열한다. 개체별 혈청 및 표준 혈청을 각 혈청에 대해 2 웰 이상 첨가하여, MEM 배지에서 2 배 단계 희석한다. 또한, 각 웰에 각 형의 중화용 바이러스 부유액을 약 100 CCID₅₀ 이 되도록 접종한다. 그 후, 모든 플레이트를 36±1℃ 의 CO₂ 인큐베이터에 3 시간 둔 후, 약 4℃ 에서 하룻밤 반응시킨다. 다음날, 각 웰에 1 × 10⁴cells 이 되도록 세포 부유액을 첨가하여, 36±1℃ 의 CO₂ 인큐베이터에서 7 일간 배양한다. 배양 종료 후, 각 웰의 CPE 를 관찰하고, 50％ 중화점의 혈청 희석 배수를 산출하여, 그 역수를 중화 항체가로 한다. 시험의 성적을 통계학적으로 처리하여 비교할 때, 검체의 역가는 참조품과 동등 이상이어야 한다.

가속 시험의 결과를 표 1 에 나타낸다. 참조 IPV 로는, 로트 04C (닛폰 폴리오 연구소 제조) 를 사용하였다.

실시예 10 (마이크로 캐리어법에 의한 Vero 세포의 배양 및 폴리오바이러스의 배양)

(i) Vero 세포의 배양

Vero 세포의 워킹 뱅크 (MWCB93) 로부터 출발하여, 정치 배양으로 계대 배양 한 세포를 트립신-EDTA 용액 (0.25％ 트립신, 0.014M EDTA) 을 사용하여 박리한 후, 600rpm, 10 분간의 원심 후, 세포 증식용 배지 (5vol％ 송아지 혈청, 0.11％ 탄산수소나트륨 (NaHCO₃), 0.1％ 프룩토오스, 20㎍/㎖ 에리트로마이신 및 100㎍/㎖ 카나마이신 첨가 Dulbecco＇s modified Eagle Medium (DME)) 에 부유시켰다.

마이크로 캐리어 (Cytodex 1 (상품명)) 는, PBS(-) 로 팽윤 후, 121℃, 15 분간 오토클레이브 멸균시켜, 세포 증식용 배지로 치환하여 사용하였다.

배양 장치는 New Brunswick Scientific 사 제조 셀리젠플러스 및 셀리젠을 사용하여, 마이크로 캐리어, 세포 부유액을 첨가한 후, 세포 증식용 배지에서 최종 4.8ℓ (셀리젠의 경우에는 3.5ℓ) 로 하여, 배양 온도 : 37.0℃, 용존 산소 농도 (DO) : 15％, PH : 7.15, 회전수 : 35 ∼ 50rpm 으로 실시하였다. 배지 교환은, 교환용 배지로서 NaHCO₃ 농도를 0.15％ 로 한 세포 증식용 배지를 사용하여 배양 2 일째부터 약 4ℓ/day 의 양을 연속적으로 실시하였다 (셀리젠의 경우에는 1 일 간격으로 전체량). 또, 세포수의 측정은 콜터카운터 (상품명) 를 사용하여 실시하였다.

세포 배양의 결과를 도 1 에 나타낸다 (3H 의 실험만 셀리젠을 사용하였다). 캐리어 3g/ℓ 에서는 저농도의 출발 세포수 (3ℓ, 약 2 × 10⁵cells/㎖) 에서 7 일째에, 고농도의 출발 세포수 (3H, 약 10 × 10⁵cells/㎖) 에서 8 일째에 세포수가 최대로 되고, 그 후 저하를 나타내었다. 또, 캐리어 5g/ℓ 에서는 저농도의 출발 세포수 (5ℓ, 약 2 × 10⁵cells/㎖) 에서는 11 일간 세포수의 증가가 관찰되었지만, 12 일째에 세포수는 저하되었다. 저농도의 출발 세포수의 경우, 캐리어 5g/ℓ 의 총세포수는 3g/ℓ 와 비교하면 10 일째에 우위로 되었지만, 그 차이는 크지는 않았다. 캐리어 5g/ℓ 에서의 고농도의 출발 세포수 (5H, 약 10 × 10⁵cells/㎖) 에서는 9 일째에서는 아직 세포수의 증가 단계이고, 이 시점에서 세포수는 약 2.8 × 10⁶cells/㎖ 로 되어, 출발 세포수의 약 2.7 배로 증식시켰다.

(ii) 폴리오바이러스의 배양

시드 바이러스는 1 형 폴리오바이러스 (IS-90C) 를 사용하였다. 세포수 계측의 마지막 날에, 배양 용량의 4 배량의 0.075％ NaHCO₃ 첨가 EBSS 로 세포를 세정 후, 0.3％ NaHCO₃, 20㎍/㎖ 에리트로마이신 및 100㎍/㎖ 카나마이신 첨가 M-199 (E) 배지 (바이러스 배양용 배지) 1ℓ 에 시드 바이러스를 희석 조제하였다. 이것을 세정 후의 세포에 접종하여, 바이러스 배양용 배지를 각각의 배양 장치의 배양 용량까지 첨가하였다. 바이러스 배양은, 배양 온도 : 33.3℃, DO : 15％, pH : 7.40, 회전수 : 35 ∼ 50rpm 으로 실시하였다. 바이러스의 CPE (cytopathic effect : 세포 변성 효과) 에 의해 세포가 완전하게 마이크로 캐리어로부터 이탈한 시점에서 바이러스 배양을 중지시켜, 바이러스액을 하베스트하였다. 하베스트된 바이러스액은 -80℃ 로 동결 보존하였다.

본 시험에서 바이러스 배양은 도 1 에 나타낸 세포 증식 곡선에서의 각각의 최종 계측일에 개시하였다.

바이러스 역가의 측정은 다음과 같이 하여 실시하였다. 롤러 튜브에 3 일간 배양한 GMK-2 세포를 0.075％ NaHCO₃, 200u/㎖ 페니실린, 200㎍/㎖ 스트렙토마이신 첨가 HBSS 1㎖ 로 2 회 세정 후, 세포 유지액 (0.1％ 소혈청 알부민, 0.225％ NaHCO₃, 200u/㎖ 페니실린, 200㎍/㎖ 스트렙토마이신 첨가 M-199 배지) 을 1㎖ 첨가하였다. 시험 바이러스액은 세포 유지액으로 0.5log₁₀ 계단 희석하여, 10^-7 ∼ 10^-8.5 의 바이러스액을 각 튜브당 0.2㎖, 각 희석당 5 개의 튜브에 접종하였다. 접종 후, 36℃ 푸란실에서 7 일간 배양하여, 7 일째의 CPE 관찰의 판정을 기초로 Reed ＆ Muench 법에 의해 감염가 (CCID₅₀/0.2㎖) 를 산출하였다.

각 조건에서 배양한 Vero 세포에서 얻어진 I 형 폴리오바이러스의 감염가 (바이러스 역가) 를 도 2 에 나타낸다. 바이러스 배양의 결과, 9 일째에 약 2.8 × 10⁶cells/㎖ 의 세포 밀도인 캐리어 5g/ℓ 의 고농도의 출발 세포수의 계 (5H) 에서 가장 높은 감염가가 얻어졌다. 감염가는 5H, 5L, 3L 의 순서였지만, 이것은 총세포수에 일치하는 성적이었다. 또, 대조한 긴꼬리 원숭이 신장 세포에서 배양하여 얻어진 바이러스액과 비교하여, 5H 의 계에서는 10 배 이상의 감염가가 얻어졌다. 도 2 에 나타낸 바이러스 역가 (log ₁₀ CCID₅₀/0.2㎖) 는, 구체적으로는, 3L 이 8.18, 5L 이 8.51, 5H 가 8.59, Ref. (대조) 가 7.50 이다.

세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양함으로써, 고역가의 세이빈주 폴리오바이러스를 얻을 수 있다. 고역가의 세이빈주 폴리오바이러스를 사용함으로써, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 효율적으로 제조할 수 있다. 따라서, 세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를 약 4g/ℓ ∼ 약 6g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존 재 하에서 배양하는 공정을 포함하는 혼합 백신의 제조 방법 (본 발명의 제조 방법) 은, 불활화 세이빈주 폴리오바이러스를 함유하는 혼합 백신의 효율적인 제조 방법으로서 유용하다. 또, 본 발명의 혼합 백신은, 폴리오, 백일해, 디프테리아 및 파상풍의 발증을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에, 폴리오, 백일해, 디프테리아 및 파상풍에 대한 백신으로서 유용하다.

Ⅷ-5-1	불리해지지 않는 개시 또는 신규성 상실의 예외에 관한 신청 불리해지지 않는 개시 또는 신규성 상실의 예외에 관한 신청 (규칙 4.17(v) 및 51 의 2.1(a)(v)) 성명(성명)	본 국제 출원 PCT/JP2007/069509 에 관하여, 재단 법인 닛폰 폴리오 연구소 JAPAN POLIOMYELITIS RESEARCH INSTITUE, 다케다 약품 공업 주식회사 TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED 는, 본 국제 출원의 청구항에 기재된 대상이 이하와 같이 개시된 것을 신청한다.
Ⅷ-5-1(ⅰ) Ⅷ-5-1(ⅱ) Ⅷ-5-1(ⅲ) Ⅷ-5-1(ⅳ)	개시 종류: 개시 일자: 개시 명칭: 개시 장소:	간행물 2006년 05월 05일 (05.05.2006) Biologicals 34(2006)151-154 인터넷

Claims

(A) 각각의 D 항원의 중량을 기준으로 2∼4 : 80∼120 : 80∼120 의 비율의 I 형, II 형 및 III 형 불활화 세이빈주 폴리오바이러스,

(B) 백일해균의 방어 항원,

(C) 디프테리아 톡소이드, 및

(D) 파상풍 톡소이드

를 함유하는 혼합 백신의 제조 방법으로서,

(a) 세이빈주 폴리오바이러스를 접종하는 Vero 세포를, 4.5g/ℓ 내지 5.5g/ℓ 의 마이크로 캐리어 존재 하에서 배양하는 공정으로, 상기 배양 공정이 5 ∼ 20 vol％ 의 송아지 혈청 또는 우태아 혈청을 함유하는, ME 배지, DME 배지, RPMI 1640 배지 또는 199 배지로부터 선택되는 배양 배지에서 수행되는 것인 공정,

(b) 마이크로 캐리어에 부착된 Vero 세포를 세이빈주 폴리오바이러스 I 형, II 형 및 III 형으로 별도로 감염시키는 공정,

(c) 상기 폴리오바이러스를 증식시키는 공정,

(d) 상기 폴리오바이러스를 함유하는 바이러스액을 회수하는 공정,

(e) 상기 폴리오바이러스를 불활화시키는 공정,

(f) 상기 (e)에서 수득된 불활화 폴리오 백신 I 형, 불활화 폴리오 백신 II 형 및 불활화 폴리오 백신 III 형을 각각의 D 항원의 상대적 비율이 2∼4 : 80∼120 : 80∼120 이 되도록 섞는 공정, 및

(g) 상기 (f)에서 수득된 섞은 불활화 폴리오 백신과 백일해균의 방어 항원, 디프테리아 톡소이드, 및 파상풍 톡소이드를 혼합하는 공정

을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서,

상기 마이크로 캐리어의 농도가 5g/ℓ 인 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 마이크로 캐리어가 구상의 덱스트란제 마이크로 캐리어인 방법.
제 1 항에 있어서,

Vero 세포를 배양하는 공정 (공정 (a)) 이 3ℓ 이상의 스케일로 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

Vero 세포를 배양하는 공정 (공정 (a)) 이 30ℓ 이상의 스케일로 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,

추가로,

(d-2) 상기 바이러스액을 정제하는 공정을 포함하는 방법.
제 8 항에 있어서,

상기 정제 공정 (공정 (d-2)) 이,

(i) 상기 공정 (d) 에서 회수한 바이러스액의 초원심에 의한 펠릿화,

(ii) 그 펠릿의 재부유액에 대한 초음파 처리,

(iii) 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,

상기 (iii) 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제가 1 회만 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
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