ES2560452T3 - Vacuna de IPV-DPT - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de una vacuna combinada que contiene (A) cepas Sabin inactivadas tipo I, tipo II y tipo III de poliovirus en una proporción, en peso de los respectivos antígenos D, de (2 a 4) : (80 a 120) : (80 a 120), (B) un antígeno protector de Bordetella pertussis, (C) un toxoide de difteria, y (D) un toxoide del tétanos, el procedimiento que comprende (a) una etapa de cultivar, en presencia de 4 g/l a 6 g/l de un microportador, células Vero a ser inoculadas con una cepa Sabin de poliovirus, en el que la etapa de cultivo es conducida en un medio de cultivo que se selecciona del medio ME, medio DME, medio RPMI 1640, y medio 199, que contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en volumen de suero bovino o suero fetal bovino; (b) una etapa de infectar las células Vero que están unidas al microportador con tipo I, tipo II y tipo III de cepa Sabin de poliovirus, en forma separada; (c) una etapa de permitir que el poliovirus prolifere; (d) una etapa de recuperar un fluido de virus que contiene el poliovirus; (e) una etapa de inactivar el poliovirus; (f) mezclar la vacuna antipoliomielítica inactivada tipo I, vacuna antipoliomielítica inactivada tipo II y vacuna antipoliomielítica inactivada tipo III obtenibles en el punto (e) como para establecer los niveles relativos de los respectivos antígenos D en (2 a 4):(80 a 120):(80 a 120); y (g) combinar dicha vacuna antipoliomielítica inactivada mixta obtenida en el punto (f) y el antígeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide de tétanos.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Vacuna de IPV-DPT Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de una vacuna combinada que contiene una cepa Sabin inactivada de poliovirus (IPV).

Tecnica anterior

La poliomielitis es una enfermedad infecciosa causada por un poliovirus. Los poliovirus infectan a seres humanos por via oral, proliferan en el tracto intestinal y entran en el sistema nervioso central a traves de la sangre. La proliferacion dentro de los grandes neutrones motores de poliovirus que han ingresado al sistema nervioso central causa la degeneracion neuronal y necrosis, provocando paralisis flacida aguda en las extremidades. Por otra parte, cuando el poliovirus afecta el centro respiratorio medular, puede dar como resultado la muerte por paralisis respiratoria. Las vacunas contra la polio son ampliamente utilizadas para suprimir la aparicion de la polio que desencadena tales smtomas graves.

Se utilizan dos tipos de vacunas contra la polio: vacunas de poliovirus vivo oral y vacunas de poliovirus inactivado. Las vacunas de poliovirus vivo oral son las vacunas que utilizan cepas atenuadas del poliovirus (cepas Sabin). Las cepas atenuadas del poliovirus que se administraron por via oral causan infecciones normales. El poliovirus de vacunas de poliovirus vivo oral crece bien en los intestinos, lo que resulta en la formacion de inmunidad localizada dentro de los intestinos. Ademas, cuando los poliovirus de una vacuna antipoliomielttica viva oral entran en la sangre y causan viremia, esto tambien estimula la produccion de anticuerpos dentro de la sangre. Sin embargo, debido a que la capacidad de las cepas atenuadas de los poliovirus de proliferar dentro del sistema nervioso central es muy debil, por lo general no causan paralisis. En el cuerpo del inoculado, los poliovirus de la vacuna antipoliomielttica viva oral se multiplican y son excretados en las heces de 4 a 6 semanas despues de la inoculacion. Los virus excretados infectaran a las personas alrededor del inoculado que tienen una inmunidad debil o ninguna inmunidad contra la polio, confiriendo inmunidad o exhibiendo un efecto potenciador de la misma manera que en el inoculado.

Sin embargo, en el transcurso del crecimiento repetido dentro del cuerpo del inoculado o en el transcurso del crecimiento repetido en el cuerpo de una persona infectada por virus excretados, una cepa atenuada del poliovirus de una vacuna antipoliomielttica viva oral a veces da lugar a mutaciones en una direccion altamente virulenta. En casos muy raros, tales mutantes causan paralisis asociada con la vacuna.

Una vacuna antipoliomielttica inactivada es una vacuna que ha perdido su capacidad de infeccion por la inactivacion del poliovirus con formalina. Debido a que una vacuna antipoliomielftica inactivada ni se multiplica dentro del cuerpo del inoculado ni infecta a personas alrededor del inoculado, no causara paralisis asociada a la vacuna. Hasta ahora se han utilizado cepas altamente virulentas para preparar vacunas contra la polio inactivada, pero recientemente tambien se han realizado avances en el desarrollo de cepas atenuadas (cepas Sabin) (Biologicals 34, 151-154 (2006); Dev. Bil. Basel. Karger 105, 163-169 (2001), Clinical Virology 30, No. 5, 336-343 (diciembre de 2002)). El crecimiento algo mas pobre de cepas atenuadas (cepas Sabin) que las cepas altamente virulentas ha sido considerado un inconveniente. Las vacunas que contienen un antfgeno protector de Bordetella pertussis, un toxoide de difteria y un toxoide del tetanos son ampliamente utilizadas como vacunas combinadas de difteria-tetanos-tos ferina. Las vacunas polivalentes compuestas de una vacuna contra la tos ferina acelular, un toxoide de difteria, un toxoide del tetanos y el poliovirus inactivado son conocidas (traduccion japonesa publicada de una solicitud PCT No. 2000-504032; J. Dfez-Domingo, et al.: The Pediatric Infectious Disease Journal 34(3), 219-224 (2005)).

Las celulas Vero son celulas de paso de los rinones de los monos verdes. Debido a que estas celulas tienen una amplia sensibilidad a diversos tipos de virus, son ampliamente utilizadas en el cultivo de virus. Un procedimiento para preparar una vacuna contra el enterovirus tipo 71 que se ha reportado en la literatura incluye el cultivo de celulas Vero en un microportador y la utilizacion de las celulas cultivadas Vero para hacer crecer el enterovirus 71 ("Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development," by Suh-Chin Wu, et al.: Vaccine 22, 3858-3864 (2004)). La produccion de la cepa Sabin I del poliovirus usando celulas Vero cultivadas en un microportador se ha descrito en la literatura ("The new medium MDSS2N, free of any animal protein supports cell growth and production of various viruses", by O.-W. Merten, et al.: Cytotechnology 30, 191-201 (1999); "Examination of the serumfree medium MDSS2 for the production of poliovirus on Vero cells in bioreactors",

O.-W. Merten, et al: Cytotechnology 25, 35-44 (1997)). Tambien se han descrito las condiciones generales de cultivo celular usando un microportador (Microcarrier cell culture principles & methods: Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988).

Divulgacion de la invencion

Bajo tales circunstancias, ha existido un deseo de un procedimiento para producir una vacuna combinada Que contiene una cepa Sabin de poliovirus inactivada (sIPV), y tambien que contiene un antfgeno protector de B. pertussis, un toxoide de difteria y un toxoide del tetanos (DPT), cuyo procedimiento incluye la etapa de preparacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

de un poliovirus de cepa Sabin de alto tftulo.

Los inventores han llevado a cabo extensas investigaciones con el fin de resolver el problema anterior. Como resultado, los inventores han descubierto que poliovirus de cepa Sabin de alto tftulo se puede preparar mediante el cultivo, en presencia de 4 g/l a 6 g/l de un microportador, de celulas Vero inoculadas con una cepa Sabin de poliovirus. Despues de realizar investigaciones repetidas sobre la base de estos hallazgos, los inventores llegaron en ultima instancia, a la presente invencion.

La presente invencion proporciona asf:

(1) Un procedimiento para producir una vacuna combinada que contiene

(A) cepas Sabin inactivadas tipo I, tipo II y tipo III de poliovirus en una proporcion, en peso de los respectivos antigenos D, de (2 a 4):(80 a 120):(8o a 120),

(B) un antigeno protector de Bordetella pertussis,

(C) un toxoide de difteria, y

(D) un toxoide del tetanos, comprendiendo el procedimiento

(a) una etapa de cultivar, en presencia de 4 g/l a 6 g/l de un microportador, celulas Vero que deben ser inoculadas con una cepa Sabin de poliovirus, en el que la etapa de cultivo es conducida en un medio de cultivo que se selecciona del medio ME, medio DME, medio RPMI 1640, y medio 199, que contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en volumen de suero bovino o suero fetal bovino;

(b) una etapa de infectar the celulas Vero que estan unidas al microportador con tipo I, tipo II y tipo III de cepa Sabin de poliovirus, en forma separada;

(c) una etapa para permitir que el poliovirus prolifere;

(d) una etapa para recuperar un fluido de virus que contiene the poliovirus;

(e) una etapa para inactivar el poliovirus;

(f) mezclar la vacuna antipoliomielftica inactivada tipo I, vacuna antipoliomielftica inactivada tipo II y vacuna antipoliomielftica inactivada tipo III obtenibles en el punto (e) como para establecer los niveles relativos de los respectivos antfgenos D en (2 a 4):(80 a 120):(80 a 120); y

(g) combinar dicha vacuna antipoliomielftica inactivada mixta obtenida en el punto (f) y antfgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide de tetanos.

(2) El procedimiento de acuerdo al punto (1) mas arriba, en el que el microportador tiene una concentracion de aproximadamente 5 g/l.

(3) El procedimiento de acuerdo al punto (1) mas arriba, en el que el microportador es un microportador de dextrano.

(4) El procedimiento de acuerdo al punto (1) mas arriba, en el que la etapa de cultivo de la celula Vero (etapa (a)) se lleva a cabo en una escala de al menos aproximadamente 3 l.

(5) El procedimiento de acuerdo al punto (1) mas arriba, en el que la etapa de cultivo de la celula Vero (etapa (a)) se lleva a cabo en una escala de al menos aproximadamente 301.

(6) El procedimiento de acuerdo al punto (1) mas arriba, que ademas comprende (d-2) una etapa para purificar el fluido del virus.

(7) El procedimiento de acuerdo al punto (6) mas arriba, en el que la etapa de purificacion (etapa (d-2)) comprende:

(i) formar el fluido de virus recuperado en la etapa (d) en un pelet por ultracentrifugacion;

(ii) someter a sonicacion una re-suspension del pelet; y

(iii) purificar por cromatograffa en columna.

(8) El procedimiento de acuerdo al punto (7) mas arriba, en el que la purificacion por cromatograffa en columna (iii) se lleva a cabo una sola vez.

Mediante el cultivo, en presencia de 4 g/l de 6 g/l de un microportador, de las celulas Vero que deben ser inoculadas con una cepa Sabin de poliovirus, es posible obtener poliovirus de cepa Sabin de alto tftulo. Al utilizar el poliovirus de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

cepa Sabin de alto tftulo, un poliovirus de cepa Sabin inactivado se puede producir de manera eficiente. Por lo tanto, un procedimiento para producir una vacuna combinada que incluye la etapa de cultivo, en presencia de 4 g/l a 6 g/l de un microportador, de celulas Vero que deben ser inoculadas con una cepa Sabin de poliovirus (el procedimiento de produccion de la presente invencion) es util como un procedimiento para la produccion eficiente de vacunas combinadas que contienen una cepa Sabin de poliovirus inactivada

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 es un grafico que muestra las curvas de crecimiento de celulas Vero en el cultivo de celulas Vero por un procedimiento de microportador. Aqm, "3L" indica un numero de celulas de partida de aproximadamente 2x105 celulas/ml (baja concentracion) y 3 g/l de microportador. "3H" indica un numero de celulas de partida de aproximadamente 10x105 celulas/ ml (alta concentracion) y 3 g/l de microportador. "5L" indica un numero de celulas de partida de aproximadamente 2x105 celulas/ml (baja concentracion) y 5 g/l de microportador. "5H" indica un numero de celulas de partida de aproximadamente 10x105 celulas/ ml (alta concentracion) y 5 g/l de microportador.

La FIG. 2 es un grafico que muestra los tttulos de infectividad (titulos de virus) de poliovirus tipo I obtenidos en celulas Vero cultivadas bajo varias condiciones. Aqm, "3L" representa los poliovirus de tipo I obtenidos en celulas Vero cultivadas a partir de un numero de celulas de partida de aproximadamente 2x105 celulas/ml (baja concentracion) en 3 g/l de microportador. "5L" indica poliovirus de tipo I obtenido en celulas Vero cultivadas a partir de un numero de celulas de partida de aproximadamente 2x105 celulas/ml (baja concentracion) en 5 g/l de microportador. "5H" indica los poliovirus de tipo I obtenidos en celulas Vero cultivadas a partir de un numero de celulas de partida de aproximadamente 10x105 celulas/ ml (alta concentracion) en 5 g/l de microportador. "Referenda" indica poliovirus de tipo I cultivados utilizando celulas de rinon de mono verde.

La presente invencion proporciona un procedimiento para producir una vacuna combinada que contiene una cepa Sabin inactivada de poliovirus (sIPV) junto con un antfgeno protector de B. pertussis, un toxoide de difteria y un toxoide del tetanos (DPT), cuyo procedimiento comprende la etapa de producir una cepa Sabin de poliovirus de alto tftulo.

La invencion se describe con mas detalle a continuacion.

1. Poliovirus de cepa Sabin inactivada

(1) Poliovirus de cepa Sabin

En la presente memoria, "cepa Sabin de poliovirus" se refiere a una cepa de poliovirus derivada de una cepa atenuada de poliovirus aislado por el Dr. Albert B. Sabin (vease, por ejemplo, Sabin, AB, Boulger, LR: "History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains," J. Biol. Standard 1, 115-118 (1973)).

Los poliovirus de cepa Sabin incluyen el cepas Sabin tipo I de poliovirus, cepas Sabin tipo II del poliovirus y cepas Sabin tipo III de poliovirus. Los ejemplos de cepas Sabin tipo I de poliovirus incluyen las cepas LSc y 2ab. Los ejemplos de cepas Sabin tipo II de poliovirus incluyen las cepas P712, Ch y 2ab. Los ejemplos de cepas Sabin tipo III de poliovirus son la cepas Leon y 12a-ib.

(2) Inactivacion

En la presente memoria, "inactivacion" del virus se refiere a la eliminacion de la capacidad infecciosa de un virus. Los procedimientos de inactivacion incluyen, pero no se limitan a, procedimientos ffsicos (por ejemplo, procedimientos que implican el uso de irradiacion de rayos x, calor o ultrasonido) y procedimientos qmmicos (por ejemplo, procedimientos que implican el uso de formalina, mercurio, alcohol o cloro).

La inactivacion del poliovirus puede llevarse a cabo mediante un procedimiento conocido (vease, por ejemplo, Biologicals 34, 151-154(2006)) Por ejemplo, la inactivacion se puede llevar a cabo tratando el poliovirus con formalina.

(3) Inmunogenicidad de cepas Sabin inactivadas de poliovirus

Dos antfgenos virales conocidos como antfgenos D y antfgenos C estan presentes generalmente en mezcla dentro de las cepas Sabin inactivadas de poliovirus. Los antfgenos D son partfculas virales completas. Los anticuerpos contra antfgenos D tienen la capacidad de neutralizar la capacidad de infeccion de los virus vivos, y funcionan como anticuerpos protectores. Los antfgenos C, llamados partfculas defectuosas, son partfculas que no tienen el ARN acido nucleico central y parte de las protemas virales de una partfcula viral completa; estas partfculas son huecas en el centro. Los anticuerpos contra los antfgenos C tienen poca o ninguna capacidad de neutralizar la capacidad de infeccion de virus vivos. Por lo tanto, cuando una cepa Sabin inactivada de poliovirus debe utilizarse como una vacuna, se requieren los antfgenos D.

Hay tres tipos de poliovirus: tipo I, tipo II y tipo III. La inmunidad a la infeccion por poliovirus es espedfica de los tres tipos de virus tipo I, tipo II y tipo III; la inmunidad cruzada que puede existir entre los tipos es minima. Los antfgenos D de cepas Sabin inactivadas tipo I, tipo II y tipo III de poliovirus tienen inmunogenicidades capaces de producir

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

anticuerpos neutralizantes de, respectivamente, las cepas salvajes tipo I, tipo II y tipo III (altamente virulentas) del poliovirus. Las inmunogenicidades de los antigenos D de cepas Sabin inactivadas de poliovirus son diferentes para cada uno de los tipos I, II y III; por lo tanto, la cantidad de antigeno D necesaria para producir suficientes anticuerpos para neutralizar las cepas salvajes tipo I, tipo II y tipo III (altamente virulentas) de poliovirus difiere segun el tipo de virus.

Como se menciono anteriormente, hay tres tipos de poliovirus tipo I, tipo II y tipo III, cada uno de los cuales causa la misma polio. Por lo tanto, cuando una cepa Sabin de poliovirus inactivada se utiliza como una vacuna (vacuna antipoliomielftica inactivada), debe tener una inmunogenicidad capaz de producir anticuerpos suficientes para neutralizar las cepas salvajes (cepas altamente virulentas) de poliovirus de cada uno de los tipos I, II y III. Por otra parte, es deseable que la inmunogenicidad este cerca de la inmunogenicidad de las vacunas contra la polio inactivadas a partir de cepas altamente virulentas que hasta ahora se han utilizado. Para exhibir una inmunogenicidad tal, la vacuna preferentemente contiene cepas Sabin inactivadas tipo I, tipo II y tipo III de poliovirus en una proporcion, en peso de los respectivos antigenos D, de preferentemente (2 a 4):(80 a 120):(80 a 120), y mucho mas preferentemente (aproximadamente 3):(aproximadamente 100):(aproximadamente 100). Las cepas Sabin inactivadas de poliovirus usadas en la presente invencion, incluyendo los tipos I, II y III en una proporcion espedfica igual que lo anterior, presenta una inmunogenicidad similar a la de las vacunas contra la polio inactivadas a partir de cepas altamente virulentas (por ejemplo, la vacuna Sauk).

2. Produccion de cepas Sabin inactivadas de poliovirus

Las cepas Sabin inactivadas de poliovirus adecuadas para su uso en la presente invencion se pueden producir mediante el procedimiento descrito a continuacion.

En primer lugar, las celulas Vero se cultivan en presencia de 4 g/l a 6 g/l de microportador, proporcionando asf celulas para el cultivo de los poliovirus. Las celulas de cultivo de poliovirus resultantes se inoculan con virus simiente (poliovirus de cepa Sabin) y los virus se cultivan, produciendo poliovirus de cepa Sabin que han proliferado. Los poliovirus de cepas Sabin resultantes se inactivan para dar poliovirus de cepa Sabin inactivada. Pueden obtenerse poliovirus de cepa Sabin inactivada los cuales corresponden a los virus simiente utilizados (cepas Sabin de tipo I, cepas Sabin de tipo II o cepas Sabin de tipo III). Los virus pueden concentrarse y/o purificarse antes o despues de la inactivacion de virus.

Como se menciono mas arriba, la vacuna antipoliomielftica inactivada debe tener una inmunogenicidad capaz de producir suficientes anticuerpos para neutralizar las cepas salvajes (cepas altamente virulentas) de cada uno de los tipos I, II y III. Sin embargo, los antfgenos D de cepas Sabin de poliovirus inactivadas tienen inmunogenicidades que difieren entre los tipos I, II y III. En consecuencia, la vacuna antipoliomielftica inactivada que posee una inmunogenicidad capaz de producir suficientes anticuerpos para neutralizar las cepas salvajes (cepas altamente virulentas) de cada uno de los tipos I, II y III se puede obtener mediante el ajuste de las cantidades de poliovirus inactivados tipo I, tipo II y tipo III contenidos.

(Celulas Vero)

Las celulas Vero son celulas de paso de los rinones de monos verdes (Cercopithecus aethiops), y estan depositadas en la Coleccion de Cultivo de Tipo Norteamericano (ATCC). Las celulas Vero se utilizan ampliamente para cultivar virus debido a que presentan una morfologfa fibroblastica, tienen una amplia sensibilidad a diversos tipos de virus y son faciles de mantener como celulas de paso. Se sabe que las celulas Vero que estan disponibles en ATCC incluyen ATCC Nos. CCL-81 y CRL-1587.

(Microportador)

En esta especificacion, "microportador" se refiere a un portador que tiene superficies a las que se adhieren las celulas y permite que el cultivo de celulas se lleve a cabo en un estado suspendido dentro de un medio ftquido. El microportador no esta sujeto a ninguna limitacion particular con respecto al material, forma y tamano, siempre y cuando sea un portador para la superficie a la que se adhieren las celulas y que permita que el cultivo de celulas sea llevado a cabo en un estado suspendido dentro de un medio ftquido.

Los ejemplos de material de microportador incluyen dextrano, gelatina, colageno, poliestireno, polietileno, poliacrilamida, vidrio y celulosa. El dextrano se prefiere como material de microportador.

Los ejemplos de la forma el microportador incluyen formas esfericas (perlas) y discoidales. El microportador preferentemente tiene una forma esferica.

El microportador esferico tiene un tamano de, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 mm, preferentemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 mm, y mas preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,3 mm.

El microportador puede ser poroso.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Los ejemplos de microportadores esfericos que se pueden usar en la presente invencion incluyen Cytodex 1 (nombre comercial), Cytodex 3 (nombre comercial) y Cytopore (nombre comercial) (todos productos de GE Healthcare Biosciences). Los ejemplos de microportadores discoidales incluyen Cytoline 1 (nombre comercial) y Cytoline 2 (nombre comercial) (ambos productos de GE Healthcare Biosciences). Los ejemplos de microportadores porosos incluyen Cytopore (nombre comercial), Cytoline 1 (nombre comercial) y Cytoline 2 (nombre comercial) (todos productos de gE Healthcare Biosciences). El microportador utilizado en la presente invencion es mucho mas preferentemente un microportador esferico de dextrano. El microportador esferico de dextrano es preferentemente Cytodex 1 (nombre comercial), Cytodex 3 (nombre comercial) o Cytopore (nombre comercial), mas preferentemente Cytodex 1 (nombre comercial) o Cytodex 3 (nombre comercial), y mucho mas preferiblemente Cytodex 1 (nombre comercial).

(Cultivo de celulas Vero)

En la presente invencion, las celulas Vero se hacen crecer mediante el cultivo en presencia de 4 g/l a 6 g/l de microportador. La concentracion de microportador es preferentemente de aproximadamente 4,5 g/l a 5,5 g/l, y mas preferentemente 5 g/l.

La etapa de cultivo de celulas Vero descrita mas arriba se Lleva un cabo en una escala, en terminos del volumen de lfquido, de preferentemente al menos 3 litros, mas preferentemente al menos 30 litros, y mucho mas preferentemente al menos 150 litros. La etapa de cultivo de celulas Vero se lleva a cabo en una escala de generalmente no mas de 1.000 litros.

Cuando las celulas Vero se cultivan en presencia de un microportador, el medio de cultivo utilizado puede ser, por ejemplo, medio ME (Science, 122, 501 (1952)), medio DME (Virology, 8, 396 (1959)), medio RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)) o medio 199 (Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)), que contienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en volumen de suero bovino o suero fetal bovino. El medio de cultivo es preferentemente un medio DME, mas preferentemente un medio DME que contiene suero bovino, y mucho mas preferentemente un medio DME que contiene aproximadamente 5 % en volumen de suero bovino. El medio puede, si es necesario, cambiarse durante el penodo del cultivo de celulas. El pH es preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, mas preferentemente de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5, y mucho mas preferentemente aproximadamente 7. El cultivo tipicamente se lleva a cabo a de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 40°C durante un penodo de aproximadamente 5 a 9 dfas. Si es necesario, pueden llevarse a cabo aireacion y agitacion durante el cultivo. La concentracion de oxfgeno disuelto (DO) en el momento del cultivo celular es preferentemente de aproximadamente 60 a aproximadamente 90%, mas preferentemente de aproximadamente 70 a aproximadamente 80%, y mucho mas preferentemente aproximadamente 75%.

El numero de celulas Vero en el medio al inicio del cultivo en presencia del microportador (numero de celulas de partida) se puede ajustar segun sea apropiado para factores tales como el tipo de medio, el tipo de microportador, la escala de cultivo. El numero de celulas de partida es preferentemente de 2x104 celulas/ml a 10x105 celulas/ml, y mucho mas preferentemente de 2x105 celulas/ml a 10x105 celulas/ml.

(Cultivo de poliovirus)

El cultivo de poliovirus puede llevarse a cabo mediante la inoculacion y por lo tanto la infeccion de las celulas Vero cultivadas con una cepa Sabin de poliovirus (virus simiente), y el cultivo de los poliovirus dentro de las celulas. El cultivo de las celulas infectadas puede llevarse a cabo de la misma manera que el cultivo de celulas Vero descrito anteriormente. El medio utilizado para el cultivo de poliovirus es preferentemente un medio 199, mas preferentemente un medio 199 que contiene bicarbonato de sodio, y mucho mas preferentemente un medio 19 que contiene 0,3% p/v de carbonato de sodio.

La temperatura de incubacion durante el cultivo del virus es preferentemente de aproximadamente 30°C a aproximadamente 38°C, mas preferentemente de aproximadamente 32°C a aproximadamente 36°C, y mucho mas preferentemente de aproximadamente 33°C a aproximadamente 35°C. El penodo de cultivo del virus es preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 dfas, mas preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 dfas, y mucho mas preferentemente aproximadamente 3 dfas. El cultivo del virus puede ser llevado a su fin utilizando efectos citopaticos por el poliovirus (redondeo de las celulas infectadas por poliovirus y desprendimiento de las celulas del microportador) como indicador.

Una cepa Sabin de poliovirus que se ha cultivado utilizando celulas de rinon cultivadas primarias de mono verde pueden ser empleadas como el virus simiente.

(Recuperacion de fluido de virus que contiene poliovirus)

Tras la finalizacion del cultivo de virus, se retira el microportador y se recupera el fluido de virus que contiene el poliovirus (referido a veces aqrn como "fluido de poliovirus").

La eliminacion del microportador puede llevarse a cabo por medio de, por ejemplo, una malla de teflon (tal como una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

que tiene un tamano de poro de 120 pm). Dado que los virus de la polio siguen presentes (unidos) al microportador izquierdo en la malla, estos poliovirus restantes pueden ser recuperados mediante el enjuague con, por ejemplo, el medio de cultivo de virus.

El fluido de poliovirus resultante se puede filtrar usando una membrana de filtro (por ejemplo, una membrana de filtro de 0,2 pm) o similar para eliminar los desechos celulares.

El fluido de poliovirus puede concentrarse y/o purificarse antes o despues de la inactivacion.

Los ejemplos ilustrativos del procedimiento de concentracion incluyen ultrafiltracion, ultracentrifugacion y dialisis. El procedimiento de concentracion es preferentemente ultrafiltracion o ultracentrifugacion. Es mas preferible llevar a cabo la ultrafiltracion y la ultracentrifugacion, y aun mas preferible llevar a cabo la ultrafiltracion seguido por ultracentrifugacion.

La membrana utilizada en la ultrafiltracion puede ser una membrana de ultrafiltracion comunmente empleada para la concentracion de virus. La membrana de ultrafiltracion tiene un corte de peso molecular que es preferentemente aproximadamente 100 kDa. La membrana de ultrafiltracion preferentemente esta fabricada de un material tal como polieter sulfona.

La concentracion del poliovirus por ultracentrifugacion se puede llevar a cabo sometiendo el fluido de poliovirus a 4 horas de centrifugacion a 4 °C y 100.000 g para formar un pelet. El sedimento puede ser re-suspendido en, por ejemplo, un tampon de fosfato. Tambien es posible disolver la masa de virus agregados sometiendo a sonicacion la resuspension de pelets. La sonicacion puede llevarse a cabo utilizando un aparato disponible en comercios, tal como Insonator Modelo 200M (Kubota). Las condiciones de sonicacion deben ser suficientes para disolver la masa de los virus agregados, y se pueden seleccionar segun sea apropiado para factores tales como el recipiente utilizado en la sonicacion, la salida de ultrasonido, y la concentracion de la re-suspension. Las condiciones de sonicacion estan ejemplificadas por tratamiento a 200 W durante un peffodo de 3 a 10 minutos. Incluso cuando se lleva a cabo tal sonicacion, la cepa Sabin de poliovirus no pierde su inmunogenicidad, lo que le permite ser usada ventajosamente como una vacuna contra el poliovirus.

Los procedimientos de purificacion incluyen, pero no se limitan a, los procedimientos que utilizan las caracteffsticas ffsicas de la sustancia que se purifica, tal como tamano, densidad y coeficiente de sedimentacion, y los procedimientos que utilizan reacciones qmmicas o fisicoqmmicas (por ejemplo, e adsorcion-desorcion). Los ejemplos ilustrativos de procedimientos de purificacion incluyen centrifugacion en gradiente de densidad, filtracion (incluyendo ultrafiltracion), cromatograffa en columna de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de filtracion en gel y precipitacion salina. El procedimiento de purificacion es preferentemente cromatograffa en columna, mas preferentemente cromatograffa en columna de intercambio ionico, y mucho mas preferentemente cromatograffa en columna de DEAE-intercambio ionico.

El numero de veces que se lleva a cabo la purificacion por cromatograffa en columna no esta sujeto a ninguna limitacion particular. Es decir, la purificacion por cromatograffa en columna puede llevarse a cabo varias veces hasta que se consigue la pureza requerida. Sin embargo, desde el punto de vista de la eficiencia de la produccion y otras consideraciones, es preferible llevar a cabo dicha purificacion en el menor numero de etapas posible.

La concentracion y purificacion se llevan a cabo preferentemente mediante la formacion de fluido de poliovirus en un pelet por ultracentrifugacion, sonicacion de una re-suspension del pelet resultante, y luego la purificacion por cromatograffa en columna. Ademas, desde el punto de vista de la eficiencia de produccion, es preferible llevar a cabo la purificacion por cromatograffa en columna solo una vez. Al llevar a cabo la formacion del fluido de poliovirus en un pelet por ultracentrifugacion, sonicacion de una re-suspension del pelet y la purificacion por cromatograffa en columna solo una vez, el fluido de poliovirus puede concentrarse y purificarse de manera eficiente y adecuadamente.

(Inactivacion del poliovirus)

La inactivacion del poliovirus puede llevarse a cabo por un procedimiento comunmente empleado. Espedficamente, el poliovirus puede ser inactivado mediante la adicion de un inactivador al fluido de poliovirus y efectuando de ese modo una reaccion entre el poliovirus y el inactivador. El inactivador es preferentemente formalina. Las condiciones de inactivacion no estan sujetas a ninguna limitacion particular, siempre y cuando el poliovirus sea inactivado. Para evitar la presencia residual de poliovirus insuficientemente inactivados, el peffodo de tratamiento de inactivacion es generalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces, preferentemente de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3,5 veces, y mas preferentemente aproximadamente 3 veces, la duracion del peffodo durante la cual se ha confirmado la inactivacion del poliovirus.

Por ejemplo, cuando se utiliza formalina como inactivador, la cantidad de adicion es preferentemente de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,1 % p/v, mas preferentemente de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,05 % p/v, y mucho mas preferentemente aproximadamente 0,01 % p/v. La temperatura de inactivacion es mucho mas preferentemente aproximadamente 37°C. El peffodo de inactivacion puede variar tambien dependiendo del tipo de inactivador, la concentracion del inactivador, y la temperatura de inactivacion. Por ejemplo, cuando se utiliza aproximadamente 0,01 % p/v de formalina como inactivador y la temperatura de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

inactivacion es aproximadamente 37°C, el peffodo de inactivacion es preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 16 d^as, mas preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 dfas, y mucho mas preferentemente aproximadamente 12 dfas. Cuando se utiliza aproximadamente 0,01 % p/v de formalina y el tiempo de inactivacion es aproximadamente 37 °C, los poliovirus de cepa Sabin generalmente se inactivan dentro de los 4 dfas.

3. Toxoide de difteria, anffgeno protector de B. pertussis, y toxoide del tetanos (DPT)

El anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos utilizados en la presente invencion no estan sujetos a ninguna limitacion particular.

El anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos estan disponibles comercialmente como vacunas combinadas difteria-tos ferina-tetanos (tal como aquellas fabricadas por Takeda Chemical Industries, Ltd., la Fundacion de Investigacion de Enfermedades Microbianas de la Universidad de Osaka (Biken), y el Instituto de Investigacion de Chemo-Sero-Terapeutica (Kaketsuken )). Alternativamente, el anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos puede obtenerse por procedimientos conocidos. En concreto, el anffgeno protector de B. pertussis puede obtenerse, por ejemplo, por extraccion, aislamiento y purificacion de la fraccion de anffgeno profilactico de un caldo de cultivo de cepas de B. pertussis de fase I (cepa Tohama) utilizando un procedimiento ffsico-qmmico tal como fraccionamiento con sulfato de amonio/fraccionamiento centfffugo por gradiente de densidad de sacarosa, atenuando entonces la virulencia restante con formalina. El toxoide de difteria se puede obtener, por ejemplo, por purificacion y concentracion de la toxina producida por Corynebacterium diphtheriae (cepa Park-Williams No. 8) utilizando un procedimiento ffsico-qmmico tal como cromatograffa en columna, seguido por la desintoxicacion con formalina. El toxoide del tetanos puede obtenerse, por ejemplo, por purificacion y concentracion de la toxina producida por Clostridium tetani (cepa de Harvard) mediante un procedimiento ffsico-qmmico tal como cromatograffa en columna, seguido por la desintoxicacion con formalina.

El anffgeno protector de B. pertussis contiene la toxina de la tos ferina (anffgeno PT), hemaglutinina filamentosa (anffgeno FHA), protema de membrana externa (anffgeno 69 KD), y fimbrias (tambien llamado anffgeno FB, aglutinogeno (FGG)). El anffgeno protector de B. pertussis no necesita contener necesariamente cada uno de los anffgenos anteriores, siempre que contenga al menos uno, preferentemente al menos dos, y mas preferentemente al menos tres de estos anffgenos. Los anticuerpos para estos anffgenos protectores protegen al huesped de la tos ferina.

4. Vacuna combinada

La vacuna combinada producida por el procedimiento de la presente invencion contiene cepas Sabin inactivadas de poliovirus, anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos. Como se menciono mas arriba, el anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos estan disponibles comercialmente como vacunas combinadas de difteria-tetanos-tos ferina. Por lo tanto, la vacuna combinada tambien se puede preparar mezclando cepas Sabin inactivadas de poliovirus junto con una vacuna combinada de difteria-tetanos-tos ferina.

Las cepas Sabin inactivadas de poliovirus pueden prepararse mezclando cepas Sabin tipo I inactivadas de poliovirus, cepas Sabin tipo II inactivadas de poliovirus, y cepas Sabin tipo III inactivadas de poliovirus. Como se menciono mas arriba, las cepas Sabin inactivadas de poliovirus contienen las cepas Sabin inactivadas tipo I, tipo II y tipo III de poliovirus en una proporcion, en base a las cantidades de los respectivos anffgenos D de las mismas, de preferentemente (2 a 4):(80 a 120):(80 a 120), y mucho mas preferentemente (aproximadamente 3):(aproximadamente 100):(aproximadamente 100).

El anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos pueden incluirse dentro de la vacuna combinada en las cantidades que son eficaces para la prevencion de la tos ferina, difteria y tetanos. En concreto, estas cantidades respectivas pueden ser las mismas que las cantidades correspondientes en las vacunas combinadas contra la difteria tetanos-tos ferina disponibles comercialmente mencionadas mas arriba. En los casos en que las inmunogenicidades del anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y/o toxoide del tetanos son influenciadas por la cepa Sabin inactivada de poliovirus y otros ingredientes, se puede producir una vacuna combinada eficaz para prevenir cada una de las enfermedades diana ajustando adecuadamente los respectivos contenidos.

La vacuna combinada puede producirse y utilizarse por medios convencionales. Espedficamente, la produccion y el uso pueden llevarse a cabo como se describe a continuacion.

La vacuna combinada se puede preparar como una inyeccion por un procedimiento convencional. Tal inyeccion se prepara de acuerdo con un procedimiento que es en sf mismo conocido en la tecnica, tal como disolver, suspender o emulsionar las sustancias mencionadas anteriormente en un ffquido acuoso u oleaginosa esteril comunmente utilizado en las inyecciones. Los ejemplos de ffquidos acuosos para inyeccion que pueden usarse incluyen solucion salina fisiologica y soluciones isotonicas que contienen glucosa o algun otro adminiculum. La solucion inyectable que ha sido preparada ffpicamente se introduce en una ampolla o jeringa adecuada.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La vacuna combinada tambien puede incluir opcionalmente aditivos farmaceuticos tales como conservantes, antioxidantes y agentes quelantes. Los ejemplos ilustrativos de conservantes incluyen timerosal y 2-fenoxietanol. Los ejemplos ilustrativos de agentes quelantes incluyen acido etilendiaminotetraacetico y acido diaminotetraacetico de glicol eter.

La vacuna combinada puede contener ademas adyuvantes. Los ejemplos ilustrativos de adyuvantes incluyen hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio y cloruro de aluminio.

Ademas del poliovirus inactivado de cepa Sabin, antigeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos, la vacuna combinada tambien puede incluir otros ingredientes inmunogenicos. Los ejemplos ilustrativos de tales ingredientes inmunogenicos incluyen ingredientes inmunogenicos para virus o bacterias distintas del poliovirus, B. pertussis, C. diphtheriae y C. tetani. Los ejemplos de tales ingredientes inmunogenicos incluyen toxoides, virus atenuados, virus inactivados, protemas, peptidos, polisacaridos, lipopolisacaridos, lipopeptidos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de virus y bacterias distintas del poliovirus, B. pertussis, C. diphtheriae y C. tetani incluyen virus de la gripe, virus del sarampion, virus de las paperas, virus de la rubeola, virus del herpes, virus de la viruela, virus de la rabia, virus de inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis, Diplococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, bacilo de la tifoidea y Haemophilus influenzae tipo b.

la vacuna combinada se puede administrar parenteralmente, tal como mediante inyeccion subcutanea o inyeccion intramuscular, y preferentemente por inyeccion subcutanea.

La cantidad de una dosis simple de la vacuna combinada se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con varias condiciones, tal como la edad y peso corporal de la persona vacunada diana. En concreto, una dosis simple puede contener, por ejemplo, al menos 4 unidades internacionales del antfgeno protector de B. pertussis, aproximadamente 15 Lf de toxoide de difteria, aproximadamente 2,5 Lf de toxoide del tetanos, aproximadamente 2 a aproximadamente 4 unidades

(preferentemente aproximadamente 3 unidades) de poliovirus Sabin inactivado tipo I (base de antfgeno D), aproximadamente 80 a aproximadamente 120 unidades (preferentemente aproximadamente 100 unidades) de poliovirus Sabin tipo II inactivado (base de antfgeno D), y de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 unidades (preferentemente aproximadamente 100 unidades) de poliovirus Sabin tipo III inactivado (base de antfgeno D).

El numero de veces que la vacuna combinada se administra como una inmunizacion inicial puede ser, por ejemplo, dos o tres dosis en intervalos de 3 a 8 semanas. Cuando la vacuna combinada se administra dos veces como inmunizacion inicial, es deseable administrar tambien una vacuna combinada contra la difteria-tos ferina-tetanos (vacuna DPT) en un intervalo de 3 a 8 semanas. Como inmunizacion de refuerzo, la vacuna combinada puede administrarse una vez mas en un intervalo de al menos 6 meses despues de la inmunizacion inicial (por ejemplo, de 12 a 18 meses despues del final de la inmunizacion inicial).

Ejemplos

La presente invencion se ilustra mas detalladamente a continuacion por medio de ejemplos.

Ejemplo de referencia 1: Establecimiento de un Banco de Celulas de Trabajo de un Fabricante para Virus de Vacunas contra la Polio

Un banco de celulas conservadas para la produccion de virus de la vacuna antipoliomielftica se preparo mediante el procedimiento descrito a continuacion a partir de Celulas Vero adquiridas de ATCc.

(i) Preparacion del Banco de Celulas Madre (MCB)

Las celulas congeladas en una ampolla recibidas de ATCC (CCL 81 Vero, F-6573; numero de paso, 124) se descongelaron, y se transfirieron a un matraz de 118 ml vacfo (un matraz con una capacidad de 154 ml y un area de superficie de crecimiento de celulas de 54 cm2). Quince mililitros de un medio de crecimiento celular (DME (Medio Eagle Modificado de Dulbecco; Sigma, No. de catalogo D5523) que contema 5 % en volumen de suero bovino, 0,075% de bicarbonato de sodio, 20 pg/ml de eritromicina y 100 pg/ml de kanamicina (concentraciones finales)) se anadio gota a gota al matraz de 118 ml que contema las celulas durante un penodo de aproximadamente 5 minutos. El matraz que contema las celulas y el medio de crecimiento celular se cultivo en sistema estatico a 36 °C (un matraz de 118 ml, paso 125). A la manana siguiente, el cultivo de crecimiento de celulas se reemplazo con 15 ml de cultivo fresco y el cultivo estatico se llevo a cabo de nuevo a 36 °C. En el dfa 6 tras el inicio del cultivo estatico, un subcultivo se llevo a cabo (de un matraz de 118 ml a cuatro matraces de 118 ml, paso 126). El procedimiento de subcultivo se llevo a cabo de la siguiente manera.

Procedimiento de subcultivo

(1) Descartar el caldo de cultivo.

(2) Colocar 5 ml de solucion de tripsina al 0,25% para el subcultivo en un matraz de 4-oz.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(3) Sumergir las superficies celulares durante aproximadamente 1 minuto, luego descartar la solucion de tripsina al 0,25% para el subcultivo.

(4) Colocar el matraz de 118 ml en reposo a 36 °C, y esperar a que las celulas se desprendan de la superficie de vidrio.

(5) Cuando las celulas han comenzado a separarse, anadir 5 ml de medio de crecimiento celular e inducir a que todas las celulas se separen mediante pipeteo.

(6) Suspender las celulas uniformemente mediante pipeteado adicional, a continuacion, transferir el medio de crecimiento celular a un tubo de centnfuga.

(7) Centrifugar durante 5 minutos a 600 rpm, descarar el sobrenadante, y suspender uniformemente las celulas sedimentadas en aproximadamente 8 ml de medio de crecimiento celular fresco mediante pipeteo.

(8) Anadir 2 ml de suspension celular a cada uno de los cuatro matraces de 118 ml nuevos (en cada uno de los cuales se han distribuido 13 ml de medio de crecimiento celular fresco).

(9) Colocar cuatro matraces de 118 ml en reposo a 36 °C y llevar a cabo el cultivo de celulas.

La composicion de la solucion de tripsina al 0,25% para el subcultivo fue la siguiente.

5% de tripsina*1, 50 ml/l 5% de pirrolidona de polivinilo (90K), 20 ml/l 0,247 mol de edetato de sodio *2, 56 ml/l EK*3, 2 ml/l

Fluido de dilucion de tripsina *4, 872 ml/l

* 1: se utilizo tripsina de pancreas de porcino y que tiene una actividad de 1: 300.

* 2: La composicion de edetato de sodio 0,247 mol era la siguiente:

Edetato de sodio -2Na: 2H2O, 91,95 g/l

NaOH, 9,88 g/l

* 3: La composicion de EK fue la siguiente: lactobionato de eritromicina, 10.000 pg/ml Sulfato de kanamicina, 50 000 pg/ml

* 4: La composicion del fluido de dilucion de tripsina fue la siguiente:

NaCl, 8.000 mg/l

KCl, 400 mg/l Na2HPO4-12H2O, 150 mg/l KH2PO4, 60 mg/l

El subcultivo se llevo a cabo posteriormente mediante el mismo procedimiento (aunque, debido a que el area de superficie de cultivo se incrementa aproximadamente de 3 a 4 veces en un solo paso, los frascos de cultivo y el volumen de lfquido manipulados difenan) a intervalos de 3 a 6 dfas, produciendo de este modo celulas de paso 129 (el numero de paso se incrementa en uno cada vez que se lleva a cabo el subcultivo). Las celulas de paso 129 cultivadas fueron tratadas con tripsina en 33 matraces SR (matraces pequenos Roux: matraces de cultivo con un volumen de 727 ml y un area de superficie de crecimiento de celulas de 156 cm2) de la misma forma que durante el subcultivo y se llevo a cabo la centrifugacion, despues de la cual el sedimento se resuspendio hasta una concentracion de aproximadamente celulas 1,5x107/ml en un medio criopreservado (DME (Medio Eagle Modificado de Dulbecco ; Sigma, No. de catalogo D5523) que contema 10% de sulfoxido de dimetilo (DMSO), 10% en volumen de suero bovino , 0,075% de bicarbonato de sodio, 20 pg/ml de eritromicina y 100 pg/ml de kanamicina (concentraciones finales)). Un mililitro de la suspension de celulas anterior se dispenso a una ampolla, se bajo la temperatura a -32 °C en un congelador lento (a una velocidad de enfriamiento de aproximadamente 1 °C/minuto), despues se transfirio a nitrogeno lfquido y se conservo. Las celulas de paso 129 obtenidas como se describio anteriormente se utilizaron como Banco de Celulas Madre (MCB).

(ii) Preparacion del Banco de Celulas de Trabajo del Fabricante (MWCB)

Usando el Banco de Celulas Madre (MCB) preparado y conservado en la seccion (i) anterior, los pasos de descongelacion de las celulas en la ampolla hasta el crecimiento mediante el subcultivo de celulas hasta el paso 134 se llevaron a cabo basicamente de la misma manera que se utilizo para preparar el Banco de celulas madre (MCB) 5 en el punto (i) anterior (aunque, debido a que el numero de celulas de partida fue mayor, la cantidad de lfquido manipulado y el tipo y numero de matraces de cultivo difirio). Las celulas de paso 134 se conservaron en nitrogeno lfquido de la misma manera que el Banco de Celulas Madre (MCB). Las celulas de paso134 obtenidas de este modo se utilizaron como Banco de Celulas de Trabajo del Fabricante (MWCB).

Ejemplo 1: Preparacion de celulas ara la produccion de virus de vacuna antipoliomielftica

10 (i) Etapa de cultivo estatico

Una ampolla del Banco de Celulas de Trabajo del Fabricante (MWCB) preparada y conservada en el Ejemplo de Referencia 1 anterior (celulas de paso 134), se descongelo de la misma manera que en la preparacion del Banco de Celulas Madre (MCB) y Banco de Celulas de Trabajo del Fabricante (MWCB ) en el Ejemplo de Referencia 1, y las celulas se cultivaron en sistema estatico durante 7 dfas (paso 135) en tres matraces LR (matraces grandes de Roux, 15 que son matraces de cultivo que tienen una capacidad de aproximadamente 1540 ml y un area de superficie de crecimiento de celulas de aproximadamente 274 cm2). El subcultivo se llevo a cabo hasta el dfa 7 desde el comienzo del cultivo estatico, despues de lo cual la escala de cultivo se amplio hasta 18 matraces LR (paso 136) y se llevo a cabo el cultivo estatico. El cultivo estatico y subcultivo del mismo se llevaron a cabo mediante el mismo metodo que en la preparacion del Banco de Celulas Madre (MCB) y la preparacion del Banco de Celulas de Trabajo del 20 Fabricante (MWCB) en el Ejemplo de Referencia 1 anterior.

A continuacion, 7 dfas de cultivo estatico se llevo a cabo en una fabrica de celulas de bandeja 40 (Nunc, Catalogo No. 139446) (paso 137). El subcultivo a continuacion se llevo a cabo en el dfa 7 tras el comienzo del cultivo estatico, ademas de lo cual 7 dfas de cultivo estatico se llevo a cabo en cuatro Fabricas de Celulas de bandeja 40 (paso 138).

(ii) Etapa de cultivo de microportador

25 A continuacion, las celulas de paso 138 obtenidas en la etapa de cultivo estatico en el punto (i) anterior se trataron con tripsina y se centrifugaron de la misma manera que durante el subcultivo en el punto (i) anterior, y las celulas sedimentadas se suspendieron de manera uniforme mediante pipeteo en 1000 ml de un medio de crecimiento celular para el cultivo en microportador (DME (Medio Eagle Modificado de Dulbecco ; Sigma, numero de catalogo D5523) que contema 5 % en volumen de suero bovino (Thermo Trace), 0,11% de bicarbonato de sodio, 0,1% de 30 fructosa, 20 pg/ml de eritromicina, y 100 pg/ml de kanamicina (concentraciones finales)). La suspension celular se hincho previamente con solucion salina tamponada con fosfato (PBS), luego se mezclo con un microportador (Cytodex 1 (nombre comercial); GE Healthcare Biosciences) equilibrado con el medio de crecimiento celular para el cultivo en microportador (se utilizo 5 g/l de Cytodex 1 (nombre comercial), basado en el peso antes de la hinchazon), y el cultivo se llevo a cabo en tres recipientes de cultivo de 50 litros a 37 °C, pH 7,15 y bajo agitacion.

35 A partir del dfa 2 de cultivo, la mitad del medio de crecimiento celular fue reemplazado sucesivamente una vez al dfa con medio de crecimiento celular fresco. Las celulas cultivadas durante 7 dfas se utilizaron como celulas (paso 139) para la produccion de los virus de la vacuna antipoliomielftica.

Ejemplo 2: Produccion de la vacuna antipoliomielftica inactivada tipo I

(i) Etapa de cultivo de virus

40 Justo antes de la inoculacion de los virus simiente en las celulas para la produccion del virus de la vacuna antipoliomielftica obtenida en el Ejemplo 1 (paso 139), se detuvo la agitacion y se dejo que las celulas sedimenten, a continuacion se lavaron una vez utilizando solucion salina equilibrada de Earl (eBsS) que contema 0,075 % de bicarbonato de sodio, 20 pg/ ml de eritromicina y 100 pg/ml de kanamicina (concentraciones finales). Despues de retirar el sobrenadante de los 5 ml de medio de crecimiento celular recogido junto con el microportador, el volumen 45 se llevo de nuevo a 5 ml mediante la adicion de solucion de tripsina al 0,25%, separando de esta forma las celulas de las perlas y haciendo que estas sean suspendidas. A continuacion, se determino el recuento de celulas, sobre la base del que se estimo el numero de celulas para todo el recipiente de cultivo de 50 litros. Los virus simientes de Sabin atenuada tipo I (LSc, cepas 2ab) se inocularon en una concentracion de aproximadamente 10-3 DICC50 por celula. Despues de la inoculacion de los virus simiente, 50 L de un medio de cultivo de virus (M199 (Medio 199) que 50 contema 0,3% de bicarbonato de sodio, 20 pg/ml de eritromicina y 100 pg/ml de kanamicina (concentraciones finales)) fue vertido inmediatamente en el recipiente de cultivo. Los virus simiente utilizados fueron los virus que habfan sido cultivados previamente a aproximadamente 33,3 °C utilizando celulas de rinon cultivadas primarias de mono verde africano, y luego empaquetados en porciones pequenas y criopreservados a -70 °C.

El cultivo del virus se llevo a cabo a 34 °C ±1 °C durante 3 dfas. El uso de los efectos citopaticos por el poliovirus 55 (redondeo de celulas infectadas con poliovirus, seguido de la separacion de las celulas del microportador) como indicador, el cultivo del virus fue llevado a su fin cuando se habfan desprendido del 95 al 100% de las celulas del

microportador. Tras la finalizacion del cultivo de virus, el microportador se elimino con una malla de teflon (tamano de poro, 120 pm), y se recupero la suspension de virus. El microportador que quedaba en la malla se lavo una vez con aproximadamente 3 L de medio de cultivo de virus por 50 L de recipiente de cultivo. El fluido de lavado resultante se anadio a la suspension de virus recuperado, dando de este modo un " fluido de virus de la polio tipo I"

5 (ii) Etapa de concentracion/purificacion del virus

Aproximadamente 150 L de fluido de poliovirus tipo I obtenido en el punto (i) anterior se paso a traves de una membrana de filtro de 0,2 pm (Pall Corporation, SLK7002NRP) para eliminar los restos celulares. El filtrado se concentro hasta 1,2 l con una membrana de ultrafiltracion (Sartorius, PESU (polietersulfona) 100 kDa, 0,1 m 2, 3051466801E - SG). El fluido de virus concentrado se formo en un pelet mediante 4 horas de ultracentrifugacion a 10 6 °C y 100.000 g, y despues de lo cual se resuspendio el pelet en 0,1 mol/l de tampon de fosfato (PB) (el pelet de un

tubo de centnfuga (aproximadamente 100 ml) se resuspendio en 5 ml de PB). La re-suspension de pelet se agito durante la noche a 4 °C, a continuacion se sometio a ultrasonidos (Kubota, Insonator Modelo 200M) durante 8 minutos a 200 W, disolviendo de este modo la masa de virus agregados. A continuacion, despues de 30 minutos de centrifugacion a 15.000 rpm, se recogio el sobrenadante. El sobrenadante asf obtenido fue purificado con DEAE 15 Sefarosa CL-6B 3 (nombre comercial, GE Healthcare Biosciences; GE 17-0710-05). Tampon de fosfato (PB), 0,1 mol/ L, fue utilizado como eluato. La absorbancia a 280 nm se controlo y el primer pico se recupero como "fluido de poliovirus de tipo I purificado." Se calculo la absorbancia a 260/280 nm para el pico de la muestra y se confirmo que era mayor que 1,5 (260/280 nm de absorbancia para las partfculas de poliovirus completas es de 1,6 a 1,7).

(iii) Etapa de inactivacion

20 El fluido de poliovirus tipo I purificado obtenido en el punto (ii) anterior se diluyo aproximadamente 10 veces con una solucion de dilucion de pre-inactivacion (M199 que contema 5% de acido aminoacetico (concentracion final), pero que contema nada de calcio, magnesio, Fenol Rojo o bicarbonato de sodio), se paso a traves de una membrana de filtro de 0,2 pm (Pall Corporation, SLK7002NRP), y se elimino la masa de los virus agregados. Despues de la preparacion del filtrado, la inactivacion se inicio rapidamente de una manera tal para evitar la agregacion de virus de 25 nuevo. Una hora antes del inicio de la inactivacion, el filtrado y formalina que se diluyeron hasta 1: 200 se calentaron en forma separada a 37 ° C. Mientras se agitaba a fondo el filtrado, se anadio la formalina a una concentracion final de 1: 4000, la mezcla se calento hasta 37 °C, y se inicio la inactivacion. Durante el tratamiento con formalina, se realizo la inactivacion del virus para proceder agitando de manera uniforme la mezcla dos veces al dfa - una vez en la primera mitad del dfa, y una vez en la segunda mitad del dfa. Anticipando que los virus insuficientemente 30 inactivados se podnan adherir al tapon del recipiente y a ciertos lugares espedficos dentro del recipiente, el tapon se cambio en los dfas 2 y 4 siguientes al inicio de la inactivacion, y el propio recipiente fue cambiado en el dfa 6. Ademas, dada la posibilidad de que los virus podnan agregarse durante la etapa de inactivacion, el dfa 6 de la inactivacion, la filtracion se llevo a cabo usando una membrana de filtro de 0,2 pm (Pall Corporation, SLK7002NRP). La etapa de tratamiento con formalina fue llevada a su fin despues de 12 dfas. El dfa 12, la formalina libre en el 35 fluido de virus tratado con formalina se neutralizo con sulfito sodico (anadido a una concentracion de 0,0264 mol/ L), despues de lo cual se anadio edetato sodico (0,0009 mol/ L) como un estabilizador, dando asf un material a granel del "tipo inactivada mevacuna antipoliomielftica tipo I inactivada”

(iv) La cantidad de anftgeno D se mide por un metodo ELISA indirecto utilizando anticuerpos que tienen una alta especificidad para el tipo y el antfgeno D. El metodo ELISA indirecto se inicia mediante el recubrimiento de una

40 microplaca con, como anticuerpo primario, un anticuerpo monoclonal (derivado de raton) especftico para los anftgenos D del mismo tipo que el antfgeno a ensayar. El anftgeno a ensayar a continuacion, se diluye y se coloca sobre la misma. A continuacion, un anticuerpo policlonal de conejo del mismo tipo que el antfgeno a ensayar se coloca sobre la misma como anticuerpo secundario, ademas de lo cual el anticuerpo IgG anti-conejo marcado con HRPO se coloca sobre la misma, efectuando una reaccion. Despues de la reaccion, el desarrollo del color se lleva 45 un cabo utilizando una solucion de o-fenilenodiamina, y se mide la absorbancia a 492 nm. La cantidad de anftgeno D (antfgeno ensayado) se determina comparando la absorbancia medida para el anticuerpo ensayado y la absorbancia medida para un anftgeno de referencia por analisis cuantitativo de lmea paralela.

Ejemplo 3: Produccion de vacuna antipoliomielftica inactivada tipo II

Aparte de usar cepas Sabin atenuadas tipo II (P712, Ch, cepas 2ab) en lugar de cepas Sabin atenuadas tipo I (LSc, 50 cepas 2ab), un material a granel de la "vacuna antipoliomielftica inactivada tipo II" se produjo de la misma manera que en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4: Produccion de vacuna antipoliomielftica inactivada tipo III

Aparte de usar cepas Sabin atenuadas tipo III (Leon, cepas 12a-ib) en lugar de cepas Sabin atenuadas tipo I (LSc, cepas 2ab), un material a granel de la "vacuna antipoliomielftica tipo III inactivada" se produjo de la misma forma que 55 en el Ejemplo 2.

Ejemplo 5: Produccion de antigeno protector de B. pertussis

(1) El cultivo de Bordetella pertussis

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Las cepas de B. pertussis de fase I (cepa Tohama) se cultivaron con giro a 30 a 34°C durante 20 a 24 horas en un medio de Cohen-Wheeler. El B. pertussis cultivado en el medio de Cohen-Wheeler a continuacion se cultivo en un medio de Stainer-Scholte a 30 y 34 °C durante 48 a 68 horas.

El cultivo se concentro hasta 1/10 veces el volumen original por ultracentrifugacion, y el sobrenadante y las celulas bacterianas se separaron mediante separacion centnfuga.

(2) Preparacion de toxina pertussis

A continuacion, 1 mol/l de tampon de fosfato (pH 8,0) se anadio al sobrenadante obtenido en el punto (1) anterior con el fin de llevar el volumen hasta 1/10 veces el volumen original, a continuacion, una solucion de acetato de calcio al 25% p/v se agrego para llevar la concentracion de 0,1 a 2,0% p/v, y un filtrado que contema toxina pertussis (anffgeno profilactico) se obtuvo por filtracion. El filtrado se hizo pasar a traves de una columna mediante cromatograffa en columna SP (solucion equilibrada: 0,1 mol/l de tampon de fosfato (pH 6,0) y la toxina de pertussis adsorbida se eluyo con 0,415 mol/l de tampon de fosfato (pH 7,0), fraccionando con ello una solucion que contema toxina de pertussis. A continuacion, la solucion que contema toxina de pertussis se paso a traves de una columna por cromatograffa en columna de gel (solucion equilibrada: 0,025 mol/l de solucion de fosfato de sodio (pH 8,7) que contema 0,25 mol/l de cloruro de sodio), despues se filtro (tamano de poro, 0,2 mm), dando una solucion de toxina pertussis pura (anffgeno PT).

(3) Preparacion de hemaglutinina filamentosa

Las celulas bacterianas aisladas en el punto (1) anterior se dispersaron en 0,05 mol/ L de tampon fosfato (pH 8,0) que contema 1 mol/l cloruro de sodio, despues de lo cual la separacion centnfuga fue llevada a cabo para separar de nuevo el sobrenadante y las celulas bacterianas. Una solucion de acetato de calcio 25% p/v se anadio al sobrenadante re-separado hasta una concentracion de 0,1 a 2,0% p/v, tras lo cual se llevo a cabo la filtracion, dando una solucion que contema hemaglutinina filamentosa (anffgeno profilactico). El filtrado se concentro con sulfato de amonio, despues se purifico por centrifugacion en gradiente de densidad, fraccionando con ello la hemaglutinina filamentosa pura (anffgeno FHA).

(4) Preparacion de protema de membrana externa

Las celulas bacterianas que se separaron nuevamente en el punto (3) anterior se dispersaron en 0,01 mol/l de tampon de fosfato (pH 7,0) que contema 0,145 mol/l de cloruro de sodio y se calentaron a 60 ° C durante 90 minutos, tras lo cual el sobrenadante y celulas bacterianas de nuevo se separaron por separacion centnfuga. A continuacion,

1 mol/l de tampon de fosfato (pH 8,0) se anadio al sobrenadante de nuevo reseparado para llevar el volumen hasta 1/10 veces, tras lo cual se anadio una solucion de acetato de calcio 25% p/v hasta concentraciones de 0,1 a 2,0% p/v y se llevo a cabo la filtracion, dando asf un filtrado que contema protema de membrana externa (anffgeno profilactico). La solucion que contema protema de membrana externa (anffgeno profilactico) se sometio a cromatograffa en columna SP (solucion equilibrada: 0,1 mol/l de tampon de fosfato (pH 6,0)), y se recogio el ffquido que paso a traves de la columna. A continuacion, el ffquido se paso a traves de una columna por cromatograffa en columna de gel (solucion equilibrada: 0,025 mol/l de solucion de fosfato de sodio (pH 8,7) que contema 0,25 mol/ L de fosfato de sodio), despues se filtro (tamano de poro, 0,2 mm), dando asf una protema de membrana externa pura (anffgeno 69 K).

(5) Preparacion de fimbrias (aglutinogenos (AGG))

0,1 mol/l de tampon de fosfato (pH 8,0) que contema 1 mol/ L de cloruro de sodio se anadio al residuo dejado despues de la recoleccion de la solucion que contema protema de membrana externa en el punto (4) anteriormente en una cantidad 1/10 veces la cantidad de sobrenadante, despues de lo cual se llevo a cabo la filtracion, produciendo un filtrado que contema fimbrias (anffgeno profilactico). La solucion que contema fimbrias resultante se concentro con sulfato de amonio, y luego se purifico por centrifugacion por gradiente de densidad, fraccionamiento con ello las fimbrias puras (anffgeno FB).

(6) Preparacion del anffgeno protector (atenuacion)

Una solucion que contema el anffgeno PT, anffgeno FHA, anffgeno 69 KD y anffgeno FB obtenidos en las secciones

(2) a (5) anteriores mezclada de tal manera que la vacuna combinada DPT preparada en el Ejemplo 8 a continuacion incluira niveles de anffgeno de 1,89 |jg de anffgeno PT, 3,00 |jg de anffgeno fHa, 0,76 |jg de anffgeno 69K y 0,36 |jg de anffgeno FB por 0,5 ml de la vacuna se preparo como una solucion de anffgeno profilactico puro. La formalina (de 0,2 a 0,5% en volumen) y, si es necesario, clorhidrato de lisina a una concentracion de no mas de 1% p/v se anadieron a la solucion de anffgeno profilactico puro, despues de lo cual la solucion se calento a 37 a 41 °C durante al menos 7 dfas para efectuar la atenuacion, dando asf una solucion de anffgeno protector contra la tos ferina. La formalina y clorhidrato de lisina en exceso se retiraron por ultrafiltracion, dando un material a granel de anffgeno protector de pertussis.

Ejemplo 6: Produccion del toxoide de difteria

5

10

15

20

25

30

35

40

45

(1) Cultivo de Corynebacterium diphtheriae

C. diphtheriae (cepa Park-Williams No. 8) se cultivo en medio de Loefflera 32,0 a 34,0°C durante 5 dfas.

(2) Preparacion de la toxina de difteria

Se anadio sulfato de amonio al fluido de cultivo obtenido en el punto(1) anterior, tras lo cual el sobrenadante se filtro (tamano de poro, 0,45 pm). El filtrado resultante se paso a traves de una columna por cromatograffa en columna hidrofobica de fenilo (solucion equilibrada: solucion de fosfato de sodio 0,01 mol/ L (pH 6,5) que contema 1,25 mol/l de sulfato de amonio). La solucion de la toxina obtenida de este modo se paso a traves de una columna por cromatograffa en columna de intercambio ionico DEAE (solucion equilibrada: 0,01 mol/ L de tampon de fosfato (pH 7,0)), a continuacion, se paso a traves de una columna por cromatograffa en columna de gel (solucion equilibrada: 0,1 mol/ L de tampon de fosfato (pH 7,0) que contema 0,145 mol/ L de cloruro de sodio), fraccionando con ello la toxina de la difteria. Esto se utilizo como una solucion de toxina pura.

(3) Conversion de la toxina de difteria a toxoide

A continuacion, se anadio clorhidrato de lisina a la solucion de toxina pura obtenida en el punto (2) anterior a una concentracion de no mas de 1% p/v, se anadio formalina a una concentracion de 0,3% en volumen, y la solucion se calento a 38,0 a 40,0 °C durante 21 dfas, convirtiendo de este modo la toxina al toxoide.

(4) Preparacion de toxoide de difteria

Despues de la conversion a toxoide en el punto (3) anterior, la formalina y clorhidrato de lisina en exceso se elimino por ultrafiltracion, dando asf un toxoide de difteria.

Ejemplo 7: Produccion de toxoide del tetanos

(1) Cultivo de Clostridium tetani

C. tetani (Harvard 47-A) se cultivo en caldo de tftgado a 34,5 °C a 36,5 °C durante 5 dfas.

(2) Preparacion de la toxina del tetanos

Se anadio sulfato de amonio al cultivo obtenido en el punto (1) anterior hasta una concentracion de 1,25 mol/ L por litro de cultivo. A continuacion, el cultivo se paso a traves de una columna por cromatograffa en columna hidrofobica de fenilo (solucion equilibrada: 0,01 mol/l de fosfato de sodio que contema 1,25 mol/l de sulfato de amonio (pH 6,5)). La solucion de toxina resultante se paso a traves de una columna por cromatograffa de intercambio ionico DEAE (solucion equilibrada: 0,01 mol/l de tampon de fosfato (pH 7,5)), tras lo cual la solucion se paso a traves de una columna por cromatograffa en columna de gel (solucion equilibrada: 0.004 mol/l de tampon fosfato (pH 7,0) que contema 0,145 mol/l de cloruro de sodio), fraccionando con ello la toxina del tetanos. Esto se utilizo como una solucion de toxina pura.

(3) Conversion de la toxina del tetanos a toxoide

A continuacion, se anadio formalina a la solucion de toxina pura obtenida en el punto (2) anterior hasta una concentracion de 0,3% en volumen, el pH se corrigio a 7,0, y la solucion se calento a 39 °C durante 15 a 23 dfas, convirtiendo de este modo la toxina en toxoide.

(4) Preparacion de toxoide del tetanos

Despues de la conversion a toxoide en el punto (3) anterior, el exceso de formalina y clorhidrato de lisina se elimino por ultrafiltracion, dando asf un toxoide del tetanos.

Ejemplo 8: Produccion de la vacuna combinada

(i) Preparacion de vacuna antipoliomielftica inactivada combinada

Los materiales a granel de la vacuna antipoliomielftica inactivada tipo I, vacuna antipoliomielftica inactivada tipo II y vacuna antipoliomielftica inactivada tipo III obtenidos en los Ejemplos 2, 3 y 4 anteriores se mezclaron con medio 199 (M199), 2-fenoxietanol (concentracion final, 0,5 % en volumen) y cloruro de aluminio (concentracion final, 0,09 % p/v) de tal manera para establecer los niveles relativos de los respectivos antfgenos D en 3: 100: 100. La mezcla resultante se ajusto a un pH de 7 con hidroxido sodico o acido clortftdrico, dando asf una vacuna antipoliomielftica inactivada combinada.

(ii) Produccion de vacuna combinada DPT

Los materiales a granel de antfgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide del tetanos obtenidos en los Ejemplos 5, 6 y 7 anteriores se mezclaron con medio 199 (M199), 2-fenoxietanol (concentracion final, 0,5 % en volumen) y cloruro de aluminio (concentracion final,, 0,24 % p/v). La mezcla resultante se ajusto a un pH de 7 con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

hidroxido de sodio y acido clortftdrico, dando as^ una vacuna DPT combinada.

(iii) Produccion de vacuna combinada

La vacuna antipoliomielftica inactivada combinada obtenida en el punto (i) anterior y la vacuna combinada DPT obtenida en el punto (ii) anteriores se mezclaron en cantidades iguales, produciendo de este modo una vacuna combinada.

Ejemplo 9: Estabilidad de la vacuna combinada

La vacuna combinada obtenida en el Ejemplo 8 se midio mediante la realizacion de un ensayo acelerado a 25 °C. La estabilidad se evaluo mediante pruebas de potencia en cada uno de los virus.

(1) Prueba de potencia de vacuna contra la tos ferina pura precipitada

Se utilizan una muestra de ensayo, una vacuna contra la tos ferina estandar y cepa 18323 de B. pertussis. La muestra de ensayo y la vacuna estandar se diluyeron cada una, a partir de las cuales se prepararon a continuacion diluciones de cada una en un total de al menos 3 diluciones en serie en intervalos logantmicamente apropiados iguales de 4 veces o mas. Un grupo de al menos dieciseis ratones de 4 semanas se utiliza para cada dilucion. A cada animal se le da 0,5 ml de dilucion en una sola inyeccion intraperitoneal. Veintiun dfas despues de las inyecciones inmunes, se inyecta 0,025 ml de una suspension de celulas bacterianas para el desaffo en el cerebro de cada animal, despues de lo cual se observan los animales durante 14 dfas y se anoto el numero de muertes. A partir del tratamiento estadfstico y la comparacion de los resultados de prueba, la muestra de ensayo debe tener una potencia de al menos 8 unidades/ml.

(2) Prueba de potencia de toxoide de difteria precipitado

Se utilizan una muestra de ensayo, un toxoide de difteria precipitado de control y una solucion adecuada toxina. La dilucion de la muestra de ensayo y el control se lleva un cabo con solucion salina fisiologica; la dilucion de la solucion de toxina se lleva un cabo con una solucion de cloruro de de sodio/ tampon de fosfato 0,017 mol/l (pH 7,0) que contiene 0,2% p/v de gelatina. La muestra de ensayo y el control se diluyen cada uno, creando diluciones seriadas en intervalos logantmicamente iguales. Utilizando un grupo de al menos diez ratones de 5 semanas para cada dilucion de la muestra de ensayo y el control, cada uno de los animales es inyectado por via subcutanea con 0,5 ml. Cuatro a seis semanas despues de las inyecciones inmunologicas, se extrae sangre de cada animal, y se mide el tftulo de antitoxina en sangre. A partir del tratamiento estadfstico y la comparacion de los resultados de la prueba, la muestra de ensayo debe tener una potencia de al menos 47 unidades/ml.

(3) Prueba de potencia del toxoide del tetanos precipitado

Se utilizan una muestra de ensayo, un toxoide del tetanos precipitado de control y una solucion adecuada toxina. La dilucion de la muestra de ensayo y el control se lleva a cabo con solucion salina fisiologica; la dilucion de la solucion de toxina se lleva a cabo con una solucion de cloruro de sodio/tampon de fosfato 0,017 mol/l (pH 7,0) que contiene 0,2% p/v de gelatina. La muestra de ensayo y el control se diluyen cada uno, creando diluciones seriadas en intervalos logantmicamente iguales. Utilizando un grupo de al menos diez ratones de 5 semanas, para cada dilucion de la muestra de ensayo y el control, a cada animal se le da una unica inyeccion subcutanea de 0,5 ml. Cuatro a seis semanas despues de las inyecciones inmunes, cada raton se expone a aproximadamente 100 DL50de toxina y se observa durante 4 dfas. A partir del tratamiento estadfstico y la comparacion de los resultados de prueba, la muestra de ensayo debe tener una potencia de al menos 27 unidades/ml.

(4) Ensayo de inmunogenicidad de ratas

Se utiliza una muestra de ensayo, un control para una prueba de potencia IPV, sueros estandar para cada tipo, y cepas Sabin de poliovirus (tipo I, II y III) para los desaffos de prueba de neutralizacion. La muestra de ensayo y control se diluyen cada uno, creando diluciones en intervalos logantmicamente iguales. Se utiliza un grupo de al menos diez ratas hembra Wister de 8 semanas de edad para cada dilucion. Cada animal se inocula por via intramuscular con 0,5 ml en la region femoral de la pata trasera. Veintiun dfas despues de la inoculacion, se extrae sangre de forma individual de cada animal y se recoge el suero a continuacion se calienta a 56 °C durante 30 minutos. El suero para cada animal y el suero estandar se colocan en al menos dos pocillos para cada suero, y se diluyen en serie 2 veces con medio MEM. Ademas, los pocillos respectivos se inoculan a aproximadamente 100 CCID 50 con neutralizacion de suspensiones de virus de los tipos respectivos. A continuacion, todas las placas se colocan en una incubadora de CO2 a 36±1 °C durante 3 horas, despues se deja reaccionar durante la noche a 4 °C aproximadamente. La suspension celular que contiene 1x104 se agrega al dfa siguiente a cada pocillo, y se cultiva en una incubadora de CO2 a 36±1 °C durante 7 dfas. Despues de la terminacion del cultivo, se examina el CPE para cada pocillo, se calcula la relacion de dilucion de suero en el momento de 50% de neutralizacion, y el numero redproco del mismo se trata como el tftulo de anticuerpo neutralizante. A partir del tratamiento estadfstico y la comparacion de los resultados de prueba, la muestra de ensayo debe tener una potencia igual a o superior que el control.

5

10

15

20

25

30

35

Los resultados para el ensayo acelerado se muestran en la Tabla 1. El Lote 04C (Instituto de Investigacion de Polio de Japon) fue utilizado como IPV de control.

Tabla 1

Especificacion Al comienzo del ensayo 1 mes 2 meses 3 meses

Vacuna antipoliomielftica inactivada tipo I

Igual a o mayor que el control 1,7 1,7 1,5 2,1

Vacuna antipoliomielftica inactivada tipo II

Igual a o mayor que el control 2,1 2,0 1,6 1,5

Vacuna antipoliomielftica inactivada tipo III

Igual a o mayor que el control 20,3 12,3 5,9 6,0

Pertussis puro precipitado

8 unidades/ml 15,8 13,8 14,6 27,3

toxoide de difteria precipitado

47 unidades/ml 97,9 109,3 85,9 102,9

toxoide del tetanos precipitado

27 unidades/ml 72,3 88,6 105,5 79,4

Ejemplo 10: Cultivo de celulas Vero por procedimiento de microportador, y cultivo de poliovirus

(i) Cultivo de celulas Vero

Las celulas que habfan sido subcultivadas en un cultivo estatico a partir de un banco de trabajo de celulas Vero (MWCB93) fueron separadas con una solucion de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, 0,14 M EDTA), a continuacion, se centrifugaron a 600 rpm durante 10 minutos y posteriormente se suspendieron en un medio de crecimiento celular (Medio Eagle modificado de Dulbecco (DME) que contema 5% en volumen de suero bovino, 0,11% de bicarbonato de sodio (NaHCOa), 0,1% de fructosa, 20 pg/ml de eritromicina y 100 pg/ml de kanamicina).

Un microportador (Cytodex 1 (nombre comercial) se hincho en PBS (-), se esterilizo por autoclave a 121 °C durante 15 minutos, a continuacion se sustituyo con medio de crecimiento celular y se utilizo.

Se utilizaron bioreactores Celligen Plus y CelliGen fabricados por New Brunswick Scientific como aparatos cultivo. El microportador y la suspension celular se anadieron al biorreactor, tras lo cual se anadio el medio de crecimiento celular hasta un volumen final de 4,8 l (en el caso del biorreactor Celligen, 3,5 l) y el cultivo se llevo a cabo a una temperatura de 37,0 °C , una concentracion de oxfgeno disuelto (DO) de 15%, un pH de 7,15 y una velocidad de rotacion de 35 al 50 rpm. El intercambio de medio usando medio de crecimiento celular que tema NaHCO3 en la concentracion de 0,15% como medio de intercambio se llevo a cabo de forma continua desde el dfa 2 de cultivo a una velocidad de aproximadamente 4 l/dia (en el caso del bioreactor Celligen, toda la cantidad del medio se intercambio una vez cada dos dfas). El recuento de celulas se midio usando un contador Coulter (nombre comercial).

Los resultados de cultivo celular se muestran en la FIG. 1 (se utilizaron biorreactores CelliGen solo en las pruebas 3H). En una concentracion de portador de 3 g/l, el recuento de celulas alcanzo un maximo en el dfa 7 en un numero de celulas de partida de baja concentracion (3L, aproximadamente 2x105 celulas/ml) y alcanzo un maximo en el dfa 8 en un numero de celulas de partida de alta concentracion (3H, aproximadamente 10x105 celulas/ml), tras lo cual disminuyo. En una concentracion de portador de 5 g/l, el recuento de celulas se incremento durante un penodo de 11 dfas en un numero de celulas de partida de baja concentracion (2x105 celulas, aproximadamente 5l/ ml), pero el recuento de celulas disminuyo en el dfa 12. En el caso de un numero de celulas de partida de baja concentracion, el recuento total de celulas en una concentracion de portador de 5 g/l fue mayor en el dfa 10 que el recuento total de celulas en un nivel de portador de 3 g/l, pero la diferencia no era grande. En una concentracion de portador de 5 g/l y un numero de celulas de partida de alta concentracion (5H, aproximadamente 10x105 celulas/ml), el recuento celular segrna aumentando en el dfa 9, siendo el recuento de celulas en ese punto aproximadamente 2,8x106 celulas/ml , lo que representa un incremento del aproximadamente 2,7 veces el numero de celulas de partida.

(ii) Cultivo de poliovirus

Un poliovirus de tipo I (IS-90C) se utilizo como virus simiente. En el ultimo dfa de las mediciones de recuento de celulas, las celulas se lavaron con un volumen de 4 veces (segun la capacidad de cultivo de bioreactor) de EBSS que contema 0,075% de NaHCO3. El virus simiente despues se diluyo en 1 litro de medio M-199 (E) que contema 0,3% de NaHCO3, 20 pg/ml de eritromicina y 100 pg/ml de kanamicina (medio de crecimiento de virus). A

continuacion, la dilucion de virus resultante se inoculo en las celulas lavadas, y el medio de cultivo de virus se anadio hasta las capacidades de cultivo de los respectivos biorreactores. El cultivo del virus se realizo a una temperatura de cultivo de 33,3 °C, 15% de oxfgeno disuelto (OD), un pH de 7,40 y una velocidad de rotacion de 35 al 50 rpm. El cultivo del virus se detuvo cuando las celulas se habfan separado completamente del microportador debido a los 5 efectos citopaticos (CPE) del virus, momento en el que se cosecho el fluido de virus. El fluido de virus cosechado se crioconservo a -80 °C.

En esta prueba, el cultivo de virus se inicio en el ultimo dfa de la medicion de las curvas de crecimiento de celulas respectivas que se muestran en la FIG. 1.

La medicion de la concentracion de virus se llevo a cabo de la siguiente manera. Las celulas GMK-2 cultivadas 10 durante 3 dfas en un tubo de rodillo se lavaron dos veces con 1 ml de HBSS que contema 0,075% de NaHC3, 200 u/ ml de penicilina y 200 pg/ml de estreptomicina, despues de lo cual se anadio 1 ml de un fluido de mantenimiento de celulas (M -medio 199 que contema 0,1% de albumina de suero bovino, 0,225% de NaHCO3, 200 ug/ml de penicilina y 200 pg/ml de estreptomicina). El fluido de virus de ensayo se diluyo en serie 0,5 log-10 con el fluido de mantenimiento de celulas, y 0,2 ml de 10-7 a 10-8 fluido de virus por tubo se inoculo en 5 tubos en cada nivel de 15 dilucion. Despues de la inoculacion, el cultivo se llevo a cabo durante 7 dfas en una incubadora a 36 °C. El tftulo de infectividad (CCID50/0,2 ml) se calculo por el metodo de Reed y Muench basado en un juicio de observacion de los efectos citopaticos (CPE) en el dfa 7.

La FIG. 2 muestra los tftulos de infectividad (tftulos de virus) de poliovirus de tipo I obtenidas en las celulas Vero cultivadas bajo varias condiciones. Como resultado del cultivo de virus, el tftulo de infectividad mas alta se obtuvo en 20 el sistema que tema una concentracion de portador de 5 g/l y un numero de celulas de partida de alta concentracion (5H); este sistema alcanzo una densidad celular en el dfa 9 de 2,8x106 celulas/ml. Los sistemas, dispuestos segun el tamano de los tftulos de infectividad de los mismos en orden descendente, fueron 5H, 5L y 3L. Estos resultados estaban de acuerdo con los recuentos de celulas totales. Ademas, en comparacion con el fluido de virus obtenido por el cultivo en celulas de rinon de mono verde como control, se obtuvo un tftulo de infectividad mas de 10 veces 25 mas alto en el sistema de 5H. Los tftulos de virus que se muestran en la FIG. 2 (log 10 DICC50/0,2 ml) fueron 8,18 en el sistema 3L, 8,51 en el sistema 5L, 8,59 en el sistema 5H, y 7,50 en la Ref. (control).

Aplicabilidad industrial

Las cepas Sabin de alta potencia de los poliovirus pueden ser obtenidas por cultivo, en presencia de 4 g/l a 6 g/l de un microportador, de celulas Vero inoculadas con poliovirus de la cepa Sabin. Los poliovirus de cepa Sabin 30 inactivada se pueden producir de manera eficiente mediante el uso de poliovirus de cepa Sabin de alta potencia. Por lo tanto, un procedimiento para producir una vacuna combinada que incluye la etapa de cultivo, en presencia de 4 g/l de 6 g/l de microportador, de celulas Vero inoculadas con poliovirus de cepa Sabin (el procedimiento de produccion de la presente invencion) es util como un procedimiento para producir eficazmente vacunas combinadas que contienen poliovirus de cepa Sabin inactivada. Ademas, debido a que la vacuna combinada producida por el 35 procedimiento de la presente invencion es capaz de suprimir efectivamente la aparicion de la polio, tos ferina, difteria y tetanos, es util como una vacuna para la poliomielitis, tos ferina, difteria y el tetanos

40

45

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de produccion de una vacuna combinada que contiene

   (A) cepas Sabin inactivadas tipo I, tipo II y tipo III de poliovirus en una proporcion, en peso de los respectivos anffgenos D, de (2 a 4) : (80 a 120) : (80 a 120),

   (B) un anffgeno protector de Bordetella pertussis,

   (C) un toxoide de difteria, y

   (D) un toxoide del tetanos,

   el procedimiento que comprende

   (a) una etapa de cultivar, en presencia de 4 g/l a 6 g/l de un microportador, celulas Vero a ser inoculadas

   con una cepa Sabin de poliovirus, en el que la etapa de cultivo es conducida en un medio de cultivo que se

   selecciona del medio ME, medio DME, medio RPMI 1640, y medio 199, que contienen de aproximadamente 5 a

   aproximadamente 20 % en volumen de suero bovino o suero fetal bovino;

   (b) una etapa de infectar las celulas Vero que estan unidas al microportador con tipo I, tipo II y tipo III de cepa Sabin de poliovirus, en forma separada;

   (c) una etapa de permitir que el poliovirus prolifere;

   (d) una etapa de recuperar un fluido de virus que contiene el poliovirus;

   (e) una etapa de inactivar el poliovirus;

   (f) mezclar la vacuna antipoliomielftica inactivada tipo I, vacuna antipoliomielftica inactivada tipo II y vacuna antipoliomielftica inactivada tipo III obtenibles en el punto (e) como para establecer los niveles relativos de los respectivos anffgenos D en (2 a 4):(80 a 120):(80 a 120); y

   (g) combinar dicha vacuna antipoliomielftica inactivada mixta obtenida en el punto (f) y el anffgeno protector de B. pertussis, toxoide de difteria y toxoide de tetanos.
2. 2. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1, en el que el microportador tiene una concentracion de aproximadamente 5 g/l.
3. 3. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1, en el que el microportador es un microportador de dextrano.
4. 4. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1, en el que la etapa de cultivo de las celulas Vero (etapa (a) se lleva a cabo en una escala de al menos aproximadamente 3 L.
5. 5. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1, en el que la etapa de cultivo de las celulas Vero (etapa (a)) se lleva a cabo en una escala de al menos aproximadamente 30 L.
6. 6. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1, que ademas comprende (d-2) una etapa para purificar el fluido de virus.
7. 7. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 6, en el que la etapa de purificacion (etapa (d-2)) comprende:

   (i) formar el fluido de virus recuperado en la etapa (d) en un pelet por ultracentrifugacion,

   (ii) someter a sonicacion una re-suspension del pelet; y

   (iii) purificar por cromatograffa en columna.
8. 8. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 7, en el que la purificacion por cromatograffa en columna (iii) se lleva a cabo una sola vez.